National standard No. ISO 20776-1:2019 Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth microdilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases, IDT)

1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» (Ассоциация «ФЛМ») на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 «Клинические лабораторные ис­ следования и диагностические тест-системы ин витро»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 ноября 2022 г. № 1266-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20776-1:2019 «Определение чувствительности возбудителей инфекционных болезней к антимикробным препаратам и оценка функциональных характеристик изделий для ее определения. Часть 1. Референтный метод микроразведений в бульоне для исследования активности in vitro антимикробных препаратов в отношении быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни» (ISO 20776- 1:2019 «Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth microdilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases», IDT). Международный стандартразработанТехническим комитетом TK212 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro» Международной организации по стандартизации (ИСО). Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5— 2012 (пункт 3.5). Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала

5 ВЗАМЕН ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2010 Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об из­ менениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в ин­ формационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru) © ISO, 2019 © Оформление. ФГБУ «РСТ», 2022 Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и рас­ пространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническо­ му регулированию и метрологии ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Содержание

1 Область прим енения..................................................................................................................................................1

2 Нормативные ссылки..................................................................................................................................................1

3 Термины и определения........................................................................................................................................... 1

4 Проведение и с с л е д о в а н и я .................................................................................................................................... 3

5 Контроль качества......................................................................................................................................................6 Приложение А (справочное) Требования к бульону Мюллера— Х и н то н .........................................................8 Приложение В (справочное) Растворители и разбавители для приготовления базовых растворов для отдельных антимикробных п р епаратов .............................................................................10 Приложение С (справочное) Подготовка рабочих растворов антимикробных препаратов для исполь­ зования при определении чувствительности методом разведений в бульоне...............17 Приложение D (справочное) Особые случаи при проведении исследования..............................................18 Б ибл иограф ия............................................................................................................................................................... 19 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Введение Чувствительность к антимикробным препаратам in vitro определяют для микроорганизмов, которые являются предполагаемыми возбудителями заболевания, особенно если есть подозрение, что они принадлежат к виду, который мог бы проявлять резистентность (устойчивость) к часто исполь­ зуемым антимикробным препаратам. Данные испытания также важны для эпидемиологического на­ блюдения за антибиотикорезистентностью, эпидемиологических исследований чувствительности и сравнения новых и существующих антибактериальных препаратов. Методы разведения используют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных препаратов с целью определения чувствительности микроорганизмов к анти­ микробным средствам. Методы определения МПК используют для эпидемиологического наблюдения за антибиотикорезистентностью, выявления и определения фенотипов дикого типа, сравнительных ис­ следований новых препаратов, определения чувствительности микроорганизмов, для которых рутин­ ные исследования дают результаты, которые нельзя интерпретировать однозначно или которые могут быть ненадежными, а также в случаях, когда количественный результат требуется для клинического применения. Методами разведений проверяют способность микроорганизмов образовывать видимый рост в бульоне (или бульонной среде), содержащем последовательные разведения антимикробного препарата, или на ряде чашек с агаром (разведение в агаре). Наименьшую концентрацию антимикробного препарата (выраженную в мг/л), которая при задан­ ных условиях in vitro подавляет появление видимого роста микроорганизма в пределах заданного проме­ жутка времени, называют минимальной подавляющей концентрацией (МПК). МПК служит руководством для клинициста относительно чувствительности организма к антибактериальному агенту и помогает в принятии решений о проведении лечения. Необходимы тщательный контроль и стандартизация внутри- и межлабораторной воспроизводимости, поскольку результаты могут значительно различаться в зависимости от используемого метода. Значения МПК для контрольных штаммов должны находиться в допустимом интервале значений (обычно два-три двукратных разведения); предпочтительнее, если они соответствуют целевому значению допустимого интервала. Метод разведений в бульоне — метод, при котором контейнеры, содержащие равные объемы растворов бульона с антибактериальными средствами в возрастающих (обычно в геометрической прогрессии) концентрациях, инокулируют известным количеством микроорганизмов. Методы последовательных (серийных) разведений — выполнение разведений в бульоне на планшетах для микроразведения. Метод, описанный в настоящем стандарте, предназначен для определения чувствительности чистых культур аэробных бактерий, быстрорастущих на агаре в течение 12— 18 ч инкубации и в бульоне Мюллера— Хинтон (объемом <200 мкл), модификация которого может потребоваться в зависимости от исследуемого антимикробного препарата. Метод микроразведений в бульоне, описанный в настоящем стандарте, в общем и целом аналогичен методам, используемым во многих странах, и методу, приведенному в [1] и [2]. Данные методы основаны на принципах, описанных в [3]. IV ГОСТ Р ИСО 20776-1—2022 Н А Ц И О Н А Л Ь Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т Р О С С И Й С К О Й Ф Е Д Е Р А Ц И И ИС С ЛЕДО В А Н ИЕ Ч УВ С ТВ И ТЕЛЬН О СТИ И Н Ф ЕКЦ И О Н Н Ы Х АГЕНТО В И ОЦЕНКА Ф У Н КЦ И О Н А Л Ь Н Ы Х Х А Р А КТЕ РИ С ТИ К ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Ч УВ С ТВ И ТЕЛЬН О С ТИ К А Н ТИ М И КР О Б Н Ы М СРЕДСТВАМ Часть 1 Референтный метод микроразведений в бульоне для лабораторного исследования активности антимикробных агентов по отношению к быстрорастущим аэробным бактериям, вызывающим инфекционные заболевания Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices. Part 1. Broth microdilution reference method for laboratory testing of the activity of antimicrobial agents against rapidly growing infectious disease-causing aerobic bacteria Дата введения — 2023—10—01 ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Применение настоящего стандарта может быть связано с исполь­ зованием опасных материалов, операций и оборудования. Настоящий стандарт не затрагивает решения проблем безопасности, связанных с его использованием. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за установление соответствующих мер безопасности, условий охраны здоровья и определение применимости регулирующих ограничений перед использова­ нием стандарта.

1 Область применения Настоящий стандарт устанавливает референтный метод микроразведения в бульоне для опреде­ ления МПК. МПК отражает активность препарата в приведенных в настоящем стандарте условиях про­ ведения теста и может быть использована клиницистами для целей лечения, принимая в расчет другие факторы, такие как фармакология препарата или механизмы резистентности бактерий. Это позволяет классифицировать бактерии как «чувствительные» (S), «умеренно резистентные» (I) и «резистентные» (R). Кроме того, распределения МПК могут использоваться для определения дикого или недикого типа бактериальной популяции. Несмотря на то, что клиническая интерпретация значения МПК не является предметом настоящего стандарта, для облегчения клинической интерпретации при исследовании не­ которых комбинаций антимикробных препаратов и бактерий требуется модификация основного метода. Эти модификации приведены в приложении А. Чтобы гарантировать сопоставимость и достоверность результатов при использовании других методов исследования чувствительности как без применения приборов (например, диск-диффузионных), так и с использованием диагностических анализаторов, не­ обходимо использовать для их валидации данный референтный метод.

2 Нормативные ссылки В настоящем стандарте нормативные ссылки отсутствуют.

3 Термины и определения В настоящем стандарте применены термины по ИСО 15189, а также следующие термины с соот­ ветствующими определениями. Издание официальное 1 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Терминологические базы данных ИСО и МЭК доступны по следующим интернет-адресам: - платформа онлайн-просмотра ИСО по адресу: http://www.iso.org/obp; - электропедия МЭК по адресу: http://www.electropedia.org/. 3.1 антимикробный препарат (antimicrobial agent): Вещество биологического, полусинтетиче- ского или синтетического происхождения, которое ингибирует рост бактерий или убивает их и таким образом может быть использовано для лечения инфекций. Примечание 1 — Дезинфицирующие средства, антисептики и консерванты не включены в это определение. 3.2 активность (potency): Мера противомикробного действия препарата, выраженная в его коли­ честве, необходимом для получения эффекта заданной интенсивности. П р и м е ч а н и е 1 — Активность выражают в виде массовой концентрации в миллиграммах на грамм, или в виде содержания активности в международных единицах (ME) на грамм, или в виде объемной или массовой доли в процентах, или в виде концентрации количества вещества (молярная доля) в молях на литр компонентов в тестируемом препарате. 3.3 концентрация (concentration): Количество антимикробного препарата в определенном объ­ еме жидкости. П р и м е ч а н и е 1 — Концентрацию выражают в мг/л. П р и м е ч а н и е 2 — мг/л — единица, рекомендуемая ИСО. 3.4 базовый [основной] раствор (stock solution): Первоначальный раствор, используемый для дальнейших разведений. 3.5 минимальная подавляющая концентрация; МПК (minimum inhibitory concentration; MIC): Наименьшая концентрация, которая при определенных условиях in vitro предотвращает видимый рост бактерий в течение определенного промежутка времени. Примечание 1 — МПК выражают в мг/л. 3.6 пограничное значение; BP (breakpoint, ВР): Определенные значения параметров, например МПК, на основе которых бактерии могут быть отнесены по клиническим категориям к «чувствитель­ ным», «умеренно резистентным» и «резистентным». П р и м е ч а н и е 1 — Действующие пограничные значения для интерпретации результатов приведены в актуальных публикациях организаций, использующих данный референтный метод (таких, как CLSI и EUCAST). 3.7 дикий тип (wild type): Отсутствие приобретенных механизмов резистентности к антимикроб­ ному препарату у данного штамма. 3.8 референтный [контрольный] штамм (reference strain): Каталогизированные, охарактеризо­ ванные бактерии со стабильными определенными фенотипами и/или генотипами чувствительности к антимикробным препаратам. П р и м е ч а н и е 1 — Контрольные штаммы хранят в качестве исходных культур, из которых получают рабо­ чие культуры. Их получают из признанных коллекций культур и можно использовать для контроля качества. 3.9 разведение в бульоне (broth dilution): Техника, при которой емкости заполняют соответству­ ющими объемами раствора антимикробного препарата в возрастающих (обычно вдвое) концентрациях и соответствующими объемами бульона с определенным инокулюмом. Примечание 1 — Цель данного метода — определение МПК. 3.10 микроразведение (microdilution): Выполнение разведения среды в планшетах для микро­ разведения вместимостью 200 мм3 (мкл) на лунку. 3.11 бульон (broth): Жидкая среда, используемая для роста бактерий in vitro. П р и м е ч а н и е 1 — Для выполнения референтного метода используют стандартный бульон Мюллера— Хинтон (см. приложение А). 3.12 инокулюм (посевной материал/инфекционный материал) (inoculum): Число бактерий в су­ спензии, рассчитанное относительно окончательного объема. Примечание 1 — Инокулюм выражают в колониеобразующих единицах в миллилитре (КОЕ/мл). 2 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 3.13 инокулюм-эффект (inoculum effect): Изменение МПК, связанное с изменением концентра­ ции инокулюма, выраженном в КОЕ/мл.

4 Проведение исследования 4.1 Общие положения Рабочие растворы распределяют в планшеты для микроразведения по 50 мкл на лунку с удво­ енной предполагаемой окончательной концентрацией антимикробного препарата (и последующим до­ бавлением бактериального инокулюма в объем 50 мкл в каждую лунку) или по 100 мкл на лунку с пред­ полагаемой окончательной концентрацией антимикробного препарата (и последующим добавлением инокулюма в объеме не более 10 мкл). По крайней мере одна лунка, содержащая 50 мкл или 100 мкл питательной среды без антимикробного препарата, должна быть использована как контроль роста для каждого проверяемого штамма. Аналогично одна лунка, содержащая 100 мкл среды без антимикробно­ го препарата, должна быть оставлена неинокулированной и использована для отрицательного контро­ ля для каждого проверяемого штамма. 4.2 Питательная среда Следует использовать бульон Мюллера— Хинтон (более подробное описание — см. приложе­ ния А и D). 4.3 Антимикробные препараты 4.3.1 Общие положения Антимикробные препараты должны быть получены непосредственно от изготовителя или из на­ дежных коммерческих источников*; использование лекарственных средств неприемлемо. Антимикроб­ ные препараты должны поставляться в виде порошка с указанием номера партии, активности, срока действия и подробным описанием рекомендованных условий хранения. Субстанции следует хранить в плотно закрытых контейнерах в темном месте с влагопоглотителем при рекомендованной изготовите­ лем температуре. Гигроскопические препараты должны быть распределены на аликвоты, при каждом проведении исследования используют одну из них. Чтобы избежать конденсации, контейнеры перед вскрытием согревают до комнатной темпе­ ратуры. 4.3.2 Приготовление базовых (основных) растворов Для взвешивания антимикробных препаратов следует использовать калиброванные аналитиче­ ские весы. Количество действующей субстанции антимикробного препарата с учетом ее активности или объема разбавителя, необходимого для приготовления стандартного раствора, вычисляют по форму­ лам: V p т = — —, (1) Р .. т ■Р V= (2) Р где т — масса антимикробного препарата (порошка), г; V — объем разбавителя, л; р — концентрация базового раствора, мг/л; Р — активность антимикробного препарата (порошка), мг/г. Концентрация базовых растворов должна составлять 1000 мг/л или больше, вместе с тем раст­ воримость некоторых препаратов может не обеспечивать данную концентрацию. Фактические концент­ рации базовых растворов зависят от метода подготовки рабочих растворов (последовательных разве­ дений). Препараты растворяют и разводят стерильной дистиллированной водой, если изготовителем * В Российской Федерации в качестве антимикробных препаратов применяют зарегистрированные в установленном порядке медицинские изделия для диагностики ин витро. 3 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 не установлено иное. Для некоторых препаратов следует использовать альтернативные растворители (см. приложение В). П р и м е ч а н и е — Информация о наиболее подходящих растворителе и разбавителе новых антимикроб­ ных препаратов, не приведенных в приложении, должна быть указана в информации, предоставленной изгото­ вителем. Стерилизация растворов обычно не требуется. При необходимости стерилизацию проводят с помощью мембранной фильтрации; образцы до и после стерилизации сравнивают методом количественного анализа для исключения адсорбции. Если нет информации о стабильности базовых растворов при определенных условиях хранения, то свежий базовый раствор следует готовить для каждой исследуемой партии. 4.3.3 Приготовление рабочих растворов Диапазон концентраций, выбранных исследователем для тестирования, зависит от микроорганиз­ ма и антимикробного препарата и должен обеспечивать определение требуемых диапазонов значений МПК для соответствующих контрольных штаммов микроорганизмов. Серию двукратных разведений антимикробного препарата готовят в бульоне Мюллера— Хинтон из расчета 1 мг/л. Разведения следует готовить только согласно процедурам, изложенным в приложе­ нии С. Рабочие растворы должны быть использованы в тот же день, если нет информации о стабиль­ ности растворов при определенных условиях хранения. 4.3.4 Подготовка планшетов для микроразведений В лунки планшета для микроразведений вносят по 50 мкл рабочего раствора с удвоенной к требу­ емой конечной концентрацией антимикробного препарата или по 100 мкл раствора с конечной требуе­ мой концентрацией. Для контроля роста каждого исследуемого штамма должна использоваться как минимум одна лунка, содержащая 50 или 100 мкл питательной среды без антимикробного препарата. Также не менее одной лунки, содержащей 100 мкл питательной среды без антимикробного препарата, оставляют без внесения инокулюма и используют в качестве отрицательного контроля каждого исследуемого штамма. 4.3.5 Хранение планшетов для микроразведений Заполненные планшеты могут быть использованы немедленно или храниться в течение трех ме­ сяцев, или до тех пор, пока отраженные в документах результаты контроля качества или другие дока­ зательства не укажут на деградацию антимикробного препарата. Для хранения заполненные планшеты должны быть запечатаны в полиэтиленовые пакеты и немедленно помещены в морозильную камеру при температуре, не превышающей минус 60 °С, если нет информации относительно стабильности антимикробного препарата при более высоких температурах. Не допускаются хранение планшетов в морозильной камере с функцией саморазмораживания, а также повторная заморозка размороженных антимикробных препаратов, так как повторные циклы замораживания — оттаивания ускоряют деградацию некоторых антимикробных препаратов, особенно (3-лактамов. Замороженным планшетам дают оттаять в течение не более 2 ч и инокулируют в течение 4 ч по­ сле изъятия из морозильной камеры. 4.4 Подготовка инокулюма 4.4.1 Общие положения Стандартизация инокулюма является необходимой процедурой для обеспечения точности и вос­ производимости процедуры определения чувствительности методом микроразведений в бульоне. В связи с этим контроль чистоты и подсчет жизнеспособных колоний должны быть выполнены для каждо­ го изолята, исследуемого данным методом. 4.4.2 Методы приготовления инокулюма в бульонной культуре Инокулюм может быть подготовлен путем разбавления бульонной культуры или суспендирования в бульоне нескольких морфологически сходных (если возможно) колоний культуры, выращенной в те­ чение 12— 18 ч инкубации на неселективной агаровой среде, с помощью нанесения стерильной петлей или тампоном. При суспендировании колоний следует отбирать морфологически сходные колонии, что­ бы избежать контаминации другими видами или атипичными формами того же вида. Используемый бульон не должен влиять на действие антимикробного препарата. Бульон инкуби­ руют при температуре (35 ± 1) °С, пока рост не достигнет мутности, равной или превышающей 0,5 по стандарту МакФарланда [4]. При необходимости культура может быть доведена до мутности, эквива­ лентной 0,5 по стандарту МакФарланда, с помощью физиологического раствора или бульона. Измере- 4 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 ние плотности инокулюма может быть проведено как с помощью фотометрического устройства (исполь­ зуют длину волны 625 нм и кювету с длиной пути световой волны 1 см, абсорбция составит 0,08— 0,13), так и с помощью должным образом откалиброванного нефелометра. Такой же результат может быть достигнут путем визуального сравнения четкости линий черного цвета при просмотре их через иноку- люм и суспензию с мутностью, эквивалентной 0,5 по МакФарланду (инокулюм и стандарт МакФарланда должны находиться в пробирках одного и того же размера) или любым другим методом, который дает воспроизводимую концентрацию КОЕ/мл. Конечный инокулюм должен содержать 5 * 105 КОЕ/мл (це­ левой диапазон от 2 х 105 до 8 * 105 КОЕ/мл). П р и м е ч а н и е 1 — 0,5 стандарта МакФарланда можно приготовить путем добавления к 0,5 мл раствора ВаС12 концентрацией 0,048 моль/л (1,175 %-ный раствор ВаС12 • 2Н20) медленно при тщательном перемешивании 99,5 мл раствора серной кислоты (H2S 04) концентрацией 0,18 моль/л (1 %-ный раствор) до получения гомогенной суспензии. 4.4.3 Метод прямого суспендирования колоний Стерильной петлей касаются нескольких морфологически сходных колоний, выросших на несе­ лективной питательной агаровой среде, инкубированной при температуре (35 ± 1) °С в течение 12— 18 ч (если более длительная инкубация не требуется), переносят в стерильный бульон или физио­ логический раствор. Суспензию доводят до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда (см. 4.4.2). Для всех микроорганизмов точная концентрация жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в окончатель­ ном инокулюме зависит от фазы роста культуры. Этот эффект наиболее выражен у прихотливых микро­ организмов, таких как Streptococcus pneumoniae, когда при использовании старых культур может значи­ тельно сократиться число жизнеспособных клеток в суспензии. При использовании любого метода точно доведенная до нужной плотности суспензия должна со­ держать от 1 х ю 8 до 2 х ю 8 КОЕ/мл для широко распространенных значимых бактерий. Доведенный до необходимой плотности инокулюм, приготовленный, как указано выше, разводят в бульоне до получения окончательной концентрации клеток 5 х Ю 5 КОЕ/мл (диапазон — от 2 х ю 5 до 8 х ю 5 КОЕ/мл). Необходимое разведение зависит от исследуемого микроорганизма и метода, исполь­ зуемого для подготовки инокулюма. При добавлении 0,1 мл стандартизированной суспензии микроор­ ганизма в пробирку, содержащую 9,9 мл бульона (разведение 1:100), получают суспензию с концентра­ цией клеток 1 х ю 6 КОЕ/мл, которую в объеме 50 мкл добавляют к равному объему (50 мкл) раствора антимикробного препарата, и получают окончательную плотность инокулюма 5 х Ю 5 КОЕ/мл для боль­ шинства грамотрицательных бактерий (например, Escherichia coli). Если лунки уже содержат по 100 мкл бульона с антимикробным препаратом, соответствующее разведение, необходимое для обеспечения требуемой окончательной концентрации инокулюма, должно быть приготовлено перед добавлением разведенной суспензии в объеме не более 10 мкл в каждую лунку. В соответствии с результатом под­ счета колоний при проведении предварительных исследований [5] могут применяться альтернативные разведения суспензии плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда. 4.5 Инокулирование планшетов для микроразведений Суспензию следует инокулировать в планшеты не позднее чем в течение 30 мин после ее приго­ товления для сохранения числа жизнеспособных клеток в КОЕ/мл. В каждую лунку, содержащую 50 мкл раствора антимикробного препарата, разведенного в бульоне (см. 4.3), добавляют 50 мкл бактериаль­ ной суспензии (см. 4.4). В лунки планшета, содержащие по 100 мкл бульон с раствором антимикробного препарата, должно быть добавлено не более чем по 10 мкл разведенной суспензии инокулюма. Для контроля содержания необходимого числа клеток — около 5 х Ю 5 КОЕ/мл — в лунке следу­ ет выполнить подсчет жизнеспособных клеток в исследуемой суспензии. Для этого немедленно после инокулирования из лунки для контроля роста берут 10 мкл содержимого и переносят в пробирку с 10 мл бульона или физиологического раствора. 100 мкл этого разведения распределяют по поверх­ ности соответствующего агара в чашке, которую затем инкубируют с вечера и всю ночь (12— 18 ч). При достижении в исследуемой суспензии плотности 0,5 по стандарту МакФарланда ожидается рост от 20 до 80 колоний. При получении другого результата необходимо предпринять корректирующие действия для обеспечения подготовки инокулюма необходимой плотности. 5 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 4.6 Инкубация планшетов для микроразведений Для предотвращения высушивания перед инкубацией планшеты для микроразведений должны быть запечатаны в полиэтиленовые пакеты или закрыты плотной крышкой или клейкой пленкой. Для предотвращения неравномерного нагревания планшетов стопки, в которые их складывают, должны со­ стоять не более чем из четырех планшетов; стопка планшетов должна быть плотно закрыта сверху единой герметичной крышкой. Если не указано другое, планшеты для микроразведений инкубируют при температуре (35 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч при исследовании большинства комбинаций антимикробных препаратов и бакте­ рий. Не должно осуществляться инкубирование планшетов в атмосфере, обогащенной С 0 2. 4.7 Интерпретация результатов исследования Учет результатов исследования проводят только при наличии достаточного роста исследуемого микроорганизма (т. е. при явном осадке или определяемом помутнении в лунке положительного кон­ троля роста), отсутствии роста в лунке, не содержащей инокулюма или отрицательного контроля роста (при наличии), и при установленной чистоте культуры и соответствующей концентрации инокулюма. Степень роста в каждой лунке сравнивают со степенью роста в лунке положительного контроля роста. Наименьшую концентрацию препарата, которая полностью подавляет видимый рост, регистрируют как МПК. Существуют некоторые исключения из этого правила, на которые пользователю следует обратить особое внимание (например, постепенное угнетение роста линезолидом, частичное подавление суль­ фаниламидами, неполное подавление некоторыми бактериостатическими препаратами). 4.8 Особые случаи при исследовании, при которых результат определения МПК может быть ненадежным В некоторых случаях значение МПК может не отражать истинную активность. Поэтому в целях клинического использования может возникнуть необходимость изменения интерпретации результатов исследования некоторых антимикробных препаратов. В этих случаях референтный метод должен быть модифицирован, например путем изменения условий инкубации или введением добавок в среду. Кроме того, при использовании стандартного метода разведений не всегда могут быть обнаружены опреде­ ленные механизмы резистентности, например экспрессия некоторых (3-лактамаз, эффлюксных насосов или модификация мишеней для препарата. В таких случаях МПК следует интерпретировать с осторож­ ностью или использовать другую информацию для принятия клинических решений. В приложении D приведены некоторые комбинации антимикробных препаратов и бактерий, требующие особого внима­ ния.

5 Контроль качества Достоверность результатов исследования должна отслеживаться с проведением одновременного исследования контрольных штаммов. Банк контрольных штаммов следует хранить в лиофилизирован- ном или замороженном виде (при температуре минус 60 °С или ниже). Рабочие культуры готовят с помощью субкультивирования из банка контрольных штаммов на неселективной питательной агаро­ вой среде. Дальнейшие субкультуры могут быть приготовлены из первой рабочей культуры только в течение одной недели. Каждый день при проведении исследования следует тестировать как минимум два соответствующих контрольных штамма, если такое возможно. Работу с исследуемыми колониями контрольных культур проводят таким же образом, как и с обычными культурами. МПК антимикробных препаратов для контрольных организмов должны быть в пределах диапазонов, приведенных в послед­ них версиях [15] или [16]. Единую таблицу контроля качества составить невозможно. Различия в разре­ шенных питательных средах*, справочных материалах, применении сред разных изготовителей и т. д. могут быть причиной некоторых различий в допустимых диапазонах значений МПК для контрольных штаммов микроорганизмов и сказываться на результатах исследований. Кроме того, в результате воз­ можной коррекции диапазонов контроля качества вследствие поступления новых данных, могут быть установлены новые диапазоны, которые не отражены в настоящем стандарте. Наконец, могут появить- * Для медицинских целей в Российской Федерации применяют зарегистрированные в установленном по­ рядке питательные среды, относящиеся к медицинским изделиям для диагностики ин витро. 6 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 ся новые противомикробные препараты, которые не включены в настоящий стандарт. Стандартизация процедуры микроразведений в бульоне для определения чувствительности к антимикробным препа­ ратам должна нивелировать большинство различий в диапазонах контроля качества, но сотрудникам лабораторий и изготовителям изделий для метода микроразведений следует обращаться к выше упо­ мянутым документам, чтобы убедиться в соблюдении указанных диапазонов. 7 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Приложение А (справочное) Требования к бульону Мюллера— Хинтон А.1 Общие положения Добавки, помимо двухвалентных катионов или других дополнительных компонентов, не должны использо­ ваться, если они не являются необходимыми для роста исследуемых организмов. А.2 Исследование неприхотливых микроорганизмов в бульоне Мюллера—Хинтон А.2.1 Общие положения Стандартной средой для исследования неприхотливых микроорганизмов является бульон Мюллера— Хинтон. Формула его приготовления следующая [6]: - мясной гидролизат из 300 г говядины; - кислотный гидролизат казеина 17,5 г; - крахмал 1,5 г; - дистиллированная вода до 1000 мл; - pH 7,2—7,4. Практически весь используемый бульон Мюллера—Хинтон выпускается промышленным способом. Приго­ товление бульона из порошка всех изготовителей аналогично и соответствует оригинальной рецептуре среды. А.2.2 Регулирование количества и содержание катионов Бульон должен содержать достаточную концентрацию катионов, чтобы обеспечить рост, позволяющий поль­ зователю определить значение МПК для контрольных штаммов в пределах, указанных в [1] и [2]. Для новых партий бульона Мюллера—Хинтон может потребоваться определение приемлемого содержания катионов. Это исследование может быть выполнено с помощью спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP) или плазменной атомно-абсорбционной спектрометрии (FAAS) [7]. Для регулирования количества ионов кальция и магния готовят растворы, содержащие по 10 мг/л хлорида кальция (3,68 г СаС12 • 2Н20 в 100 мл деионизированной воды) и хлорида магния (8,36 g MgCI2 ■6Н20 в 100 мл деионизированной воды), стерилизуют с помощью мембранного фильтра и хранят при температуре от 2 °С до 8 °С. Каждые 0,1 мл объема раствора катионов с концентрацией 10 мг/л, добавленные к 1 л бульона, повышают содер­ жание катионов на 1 мг/л. Растворы солей добавляют, помешивая, при температуре от 2 °С до 8 °С. В [8]. [9] указано, что для большинства комбинаций антимикробных препаратов и бактерий добавление ионов кальция и магния до окончательной концентрации от 20 до 25 мг/л и от 10 до 12,5 мг/л, соответственно, обеспечивало получение точных результатов контроля качества. В настоящем стандарте под «исследованием в бульоне Мюллера—Хинтон» подразумевают исследование в бульоне Мюллера—Хинтон со сбалансированным количеством катионов. Случаи, в которых требуется дополнительная корректировка содержания катионов в бульоне Мюллера— Хинтон для обеспечения воспроизводимости результатов определения чувствительности к антимикробным пре­ паратам, приведены ниже. А.2.3 Коррекция состава среды по сравнению с эталонной средой Мюллера—Хинтон для метода микроразведений в бульоне при исследовании некоторых видов бактерий и других микроорганизмов А.2.3.1 Род Streptococcus При исследовании стрептококков к бульону Мюллера—Хинтон должна быть добавлена лизированная (или дефибринированная) лошадиная кровь до окончательной концентрации от 2,5 % до 5,0 %. Кровь должна быть получена от надежного поставщика. Должно быть определено значение гематокрита (не менее 30 %). Для при­ готовления лизированной крови в стерильных условиях смешивают равные объемы дефибринированной крови и стерильной дистиллированной воды. Замораживают при температуре минус 20 °С и размораживают до оконча­ тельного лизирования клеток (может потребоваться пять — семь циклов замораживания — оттаивания). Центри­ фугируют для осветления раствора. Прозрачность раствора относится к значимым критериям для интерпретации результатов. Недостаточный лизис или центрифугирование могут быть причиной того, что раствор не удается полу­ чить прозрачным. Повторное центрифугирование может повысить прозрачность раствора. Полученный препарат лизированной крови является базовым раствором с объемной концентрацией 50 % [10]. А.2.3.2 Сульфаниламиды и триметоприм Среда должна иметь массовую концентрацию тимидина менее чем 0,03 мг/л. Такая среда не исключает воз­ можность исследования других антимикробных препаратов [11]. 8 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 А.2.3.3 Тигециклин Тигециклин должен быть добавлен в бульон Мюллера—Хинтон не позднее чем через 12 ч после приготовле­ ния бульона. Приготовленные планшеты для микроразведений должны быть заморожены, если не предусмотрено их использование в течение 12 ч после приготовления [12]. А.2.3.4 Липогликопептиды (далбаванцин, телаванцин и оритаванцин) Для исследования далбаванцина, телаванцина и оритаванцина следует в бульон Мюллера—Хинтон доба­ вить полисорбат-80 (объемная доля 0,002 %) [13]. А.2.3.5 Цефидерокол Для исследования данного сидерофорного цефалоспоринового препарата из бульона Мюллера—Хинтон сначала выводят железо с помощью хелатирующего соединения. Затем среду восстанавливают путем добавления стандартных растворов кальция, магния и цинка [14]. А.2.3.6 Определение чувствительности стафилококков к оксациллину Метод микроразведений в бульоне не может надежно выявить тесА- или тесС-опосредованную резистент­ ность. Для того чтобы улучшить возможность обнаружения резистентности, следует использовать следующие мо­ дификации метода: - включение NaCI в конечной концентрации 20 г/л в бульон при исследовании оксациллина; - инкубация в течение 24 ч; - температура инкубации не более 35 °С; - использование прямого метода приготовления суспензии для получения инокулюма. Для некоторых типов штаммов, даже при использовании этих рекомендаций, резистентность проявляется настолько слабо, что не отражается на полученных значениях МПК. Это особенно характерно для изолятов, име­ ющих ген тесС. Обнаружение гена тесА или тесС является референтным методом выявления устойчивости к оксациллину. А.2.3.7 Даптомицин Бульон Мюллера—Хинтон должен быть дополнен ионами Са++ до конечной концентрации 50 мг/л [18]. А.2.3.8 Карбапенемы При исследовании в бульоне Мюллера—Хинтон имипенема и меропенема, относящихся к препаратам груп­ пы карбапенемов, установлено, что конечная концентрация цинка должна быть менее 3 мг/л [19]. Массовые кон­ центрации цинка, необходимые для оптимальной активности других карбапенемов, до настоящего времени не определены, но должны находиться в том же диапазоне. А.2.3.9 Гликопептиды Для получения более точных и надежных результатов МПК следует учитывать после 24-часовой инкубации. А.2.3.10 Полимиксины (Колистин) Несмотря на ранее общепринятую практику, полисорбат-80 или другие поверхностно-активные вещества не следует добавлять в среду при исследовании препаратов класса полимиксинов: колистина и полимиксина В. А.2.4 Дополнительные аспекты, касающиеся среды, не регулируемые международными стандартами А.2.4.1 Общие положения В настоящее время невозможно определить все вопросы, которые могут возникнуть при контроле качества и определении референтным методом чувствительности аэробных и факультативно-анаэробных видов бактерий к антимикробным препаратам. Некоторые данные о влиянии качества питательной среды содержатся в матери­ алах, не прошедших рецензирование экспертами или изготовителями. Для новых антимикробных препаратов ис­ пользуемые в настоящее время методы подготовки среды могут оказаться неподходящими. Пользователи должны обеспечить соблюдение контроля качества и сообщать на международном уровне о возникающих вопросах для регулярного обновления данного стандарта. Известные конкретные проблемы, возникающие при проведении ис­ следования (например, исследование прихотливых видов бактерий или специфические дополнительные требо­ вания к стандартному бульону Мюллера—Хинтон при вариациях среды в различных частях мира), включены в приложение D для ознакомления. П р и м е ч а н и е — Для уточнения информации о других новых препаратах, не включенных в текущую версию этого документа, можно обратиться к последним версиям [15]—[17], а также к информации изготовителя. 9 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Приложение В (справочное) Растворители и разбавители для приготовления базовых растворов для отдельных антимикробных препаратов Таблица В.1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Амикацин Вода Вода Амоксициллин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Ампициллин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0 Арбекацин Вода Вода Авибактам Вода Вода Азитромицин Этанол, объемная доля 95 % или ледяная Бульон уксусная кислота3 Азлоциллин Вода Вода Азтреонам Насыщенный раствор бикарбоната натрия Вода Бесифлоксацин Метанол Вода Биапенем NaCI, массовая доля 0,85 % NaCI, массовая доля 0,85 % Кадазолид Д иметил сульфоксид (ДМСО) Вода или бульон Карбенициллин Вода Вода Цефаклор Вода Вода Цефадроксил Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефамандол Вода Вода Цефазолин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Цефкапен Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Цефдинир Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефдиторен Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефепим Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Цефетамет Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефидерокол Физиологический раствор Вода Цефиксим Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Цефменоксим Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,8 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,8 Цефметазол Вода Вода Цефодизим Вода Вода Цефоницид Вода Вода Цефоперазон Вода Вода 10 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Продолжение таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Цефотаксим Вода Вода Цефотетан Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Цефотиам Вода Вода Цефокситин Вода Вода Цефозопран Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Цефпиром Вода Вода Цефподоксим Раствор бикарбоната натрия, массовая Вода концентрация 0,1 % Цефроксадин 0,1 нормальный раствор HCI Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Цефпрозил Вода Вода Цефтароллин ДМСО, до 30 % общего объема Физиологический раствор Цефтазидим Насыщенный раствор бикарбоната натрия5 Вода Цефтерам Фосфатный буфер 1/15 моль/л, pH 7,0 Фосфатный буфер 1/15 моль/л, pH 7,0 Цефтибутен 1/10 объема диметилсульфоксида Вода Цефтизоксим Вода Вода Цефтобипрол ДМСО и ледяная уксусная кислота0 Вода, при тщательном перемешивании Цефтолозан Вода или физиологический раствор Вода или физиологический раствор Цефтриаксон Вода Вода Цефуроксим Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Цефалотин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефалексин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефапирин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Цефрадин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода Хлорамфеникол Этанол, объемная доля 95 % Вода Циноксацин 1/2 объема воды, затем добавляют 0,1 моль/л Вода NaOH до полного растворения Ципрофлоксацин Вода Вода 11 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Продолжение таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Кпаритромицин Метанол или ледяная уксусная кислота3 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,5 Кпавулановая Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 кислота Кпинафлоксацин Вода Вода Кпоксациллин Вода Вода Кпиндамицин Вода Вода Колистинй Вода Вода Далбаванцин Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода и ДМСОе Даптомицин Вода Вода Делафлоксацин 1/2 объема воды, затем добавляют покапельно Вода 0,1 моль/л NaOH до полного растворения Дибекацин Вода Вода Диритромицин Ледяная уксусная кислота3 Вода Дорипенем NaCI, массовая доля 0,85 % NaCI, массовая доля 0,85 % Доксициклин Вода Вода Эноксацин 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода 0,1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Эравациклин Вода Вода Эртапенем Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Эритромицин Этанол, объемная доля 95 % или ледяная Вода уксусная кислота Фаропенем Вода Вода Фидаксомицин Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Финафлоксацин Вода Вода Флероксацин 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода 0,1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Фломоксеф Вода Вода 12 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Продолжение таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Флуклоксациллин Фосфатный буфер 0,05 моль/л, pH 7,0 Вода Фосфомицин Вода Вода Фузидовая кислота Вода Вода Гареноксацин Вода (с перемешиванием) Вода Гатифлоксацин Вода (с перемешиванием) Вода Гемифлоксацин Вода Вода Гентамицин Вода Вода Гепотидацин Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Грепафлоксацин Вода с добавлением 0,1 моль/л NaOH Вода покапельно до растворения Икпаприм Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Изепамицин Вода Вода Имипенем Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Джозамицин Метанол Вода Канамицин Вода Вода Лефамулин Вода Вода Левофлоксацин 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода 1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Левонадифлоксацин Раствор L-аргинина в воде, 27,5 мг/л Вода Линкомицин Вода Вода Линезолид Вода Вода Линопристин- Диметилформамид (ДМФ) до 25 % от конечного Вода флопристин объема/вода для растворения Ломефлоксацин Вода Вода Локарбеф Вода Вода Мециллинам Вода Вода Меропенем Вода Вода Метициллин Вода Вода 13 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Продолжение таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Метронидазол Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Мезлоциллин Вода Вода Миноциклин Вода Вода Моксалактам (диам- 0,04 моль/л NaCI (настаивают в течение 1,5— Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 мониевая соль/ 2,0 ч) Моксифлоксацин Вода Вода Мупироцин Вода Вода Накубактам Вода Вода Нафциллин Вода Вода Нафитромицин 1/2 объема воды, добавляют ледяную Вода уксусную кислоту покапельно до растворения (содержание уксусной кислоты не должно превышать 2,5 мг/л) Налидиксовая 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода кислота 1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Нетилмицин Вода Вода Нитазоксанид Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Нитроксолин Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Нитрофурантоин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0; или Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0 Диметилсульфоксид (ДМСО) Норфлоксацин 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода 1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Офлоксацин 1/2 объема воды, затем добавляют минимум Вода 0,1 моль/л NaOH до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Омадацикпин Вода Вода Оритаванцин 0,002 % полисорбата-80 в воде 0,002 % полисорбата-80 в воде Оксациллин Вода Вода Озеноксацин NaOH 0,1 моль/л Вода Панипенем Вода Вода Пазуфлоксацин Вода Вода Пексиганам Вода Вода Пенициллин Вода Вода Пиперациллин Вода Вода Плазомицин Вода Вода 14 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Продолжение таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Полимиксин В Вода Вода Прулифлоксацин Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Хинупристин- Вода Вода дальфопристин Рамопланин Вода Вода Разупенем Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Релебактам Вода Вода Рифампицин Метанол Вода Рифаксимин Метанол Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,4 + + 0,45 % натрия додецилсульфоната Рокситромицин Метанол Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0 Секнидазол Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Ситафлоксацин NaOH 0,1 моль/л Вода Солитромицин Ледяная уксусная кислота Вода Спарфлоксацин Вода Вода Спектиномицин Вода Вода Стрептомицин Вода Вода Сульбактам Вода Вода Сульфаниламиды Минимальный объем 0,1 моль/л NaOH Вода до растворения, затем доводят водой до окончательного объема Сульфаметоксазол Половина объема горячей воды и минимум Вода 2,5 моль/л NaOH до растворения Сульфизоксазол 1/2 объема горячей воды и минимум 2,5 моль/л Вода NaOH до растворения Сультамициллин Метанол Вода Сулопенем Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2, пере­ Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 мешивают до растворения Суротомицин Вода Вода Тазобактам Вода Вода Тебипенем Вода Вода Тедизолид Диметилсульфоксид (ДМСО)9 Диметилсульфоксид (ДМСО) Тейкопланин Вода Вода Телаванцин Диметилсульфоксид (ДМСО) Диметилсульфоксид (ДМСО) Телитромицин Ледяная уксусная кислота3 Вода 15 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Окончание таблицы В. 1 Антимикробный Растворитель Разбавитель препарат Темоциллин Вода Вода Тетрациклин Вода Вода Тикарциллин Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Тигецикпин Вода Вода Тинидазол Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Тизоксанид Диметилсульфоксид (ДМСО) Диметилсульфоксид (ДМСО) Тобрамицин Вода Вода Тосуфлоксацин NaOH 0,1 моль/л Вода Триметоприм 0,05 моль/л молочной кислоты или 0,05 моль/л Вода HCI, 10 % от конечного объема с водой Триметоприм (если Вода Вода лактат) Троспектомицин Вода Вода Ваборбактам Диметилсульфоксид (ДМСО) Вода Ванкомицин Вода Вода П р и м е ч а н и е 1 — Информация относительно растворителей и разбавителей приведена из [15] с разреше­ ния Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), Уэйн, штат Пенсильвания. Данная информация периодически обновляется. См. последнюю версию документа М100 в CLSI, 950 Вест Воплей Роад, офис 2500, Уэйн, штат Пенсильвания 19087, США. П р и м е ч а н и е 2 — Дальнейшую информацию относительно примеров растворителей и разбавителей для приготовления базовых растворов некоторых антимикробных препаратов можно получить в Европейской Фарма­ копее или Фармакопее США, государственной Фармакопее Российской Федерации, XIV издание. Москва, 2018. а При работе с ледяной уксусной кислотой берут половину объема воды и добавляют в нее капельно ледяную уксусную кислоту до растворения, не превышая концентрацию 2,5 мг/л, после этого доводят раствор водой до полного объема. Приготовленная таким образом ледяная уксусная кислота эквивалентна уксусной кислоте с объемной фракцией не более 99 %. ь Количество безводного карбоната натрия должно составлять точно 10 % от используемого цефтазидима. Карбонат натрия растворяют в большей части необходимого для растворения объема воды. Антимикробный препарат разводят в этом полученном растворе карбоната натрия и добавляют воду до нужного объема. Раствор следует использовать как можно скорее, но его можно хранить не более 6 ч при температуре не более 25 °С. с На каждые 1,5 мг цефтобипрола добавляют 110 мкл смеси диметилсульфоксида и ледяной уксусной кис­ лоты в соотношении 10:1. Энергично перемешивают в течение 1 мин, затем — периодически в течение 15 мин. Разводят дистиллированной водой до 1 мл. d Соединение колистина, используемое для определения чувствительности, представляет собой сульфат ко- листина, а не метилсульфонат колистина (сульфометата). е Основной раствор далбаванцина должен быть приготовлен с концентрацией не выше 1600 мг/л. Промежу­ точный раствор с концентрацией *100 должен быть затем разведен в ДМСО. Окончательные разведения 1:100 следует выполнить непосредственно в бульоне Мюллера—Хинтон с добавленным раствором полисорбата-80, в объемной доле 0,002 %, таким образом, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 1 %. f Диаммониевая соль моксалактама характеризуется высокой стабильностью, но является почти чистым R-изомером. Моксалактам для клинического применения представляет собой смесь R- и S-изомеров в соотно­ шении 1:1. Поэтому соль растворяют в 0,04 моль/л HCI и оставляют на 1,5—2 ч для взаимодействия, с тем чтобы установилось равное соотношение обоих изомеров.

9 Основной раствор тедизолида должен быть приготовлен с концентрацией не выше 1600 мг/л. Промежуточ­ ный раствор с концентрацией *100 должен быть затем разведен в ДМСО. Окончательные 1:100 разведения должны быть выполнены непосредственно в бульоне Мюллера—Хинтон со стандартизированным содержанием катионов таким образом, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 1 %. 16 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Приложение С (справочное) Подготовка рабочих растворов антимикробных препаратов для использования при определении чувствительности методом разведений в бульоне Концентрация антимикробного Полученная концентрация препарата в базовом растворе, Объем базового раствора, мл Объем бульона3, мл антимикробного препарата, мг/л мг/л 512 0 1 9 512 512 1 1 256 512 1 3 128 512 1 7 64 64 1 1 32 64 1 3 16 64 1 7 8 8 1 1 4 8 1 3 2 8 1 7 1 1 1 1 0,5 1 1 3 0,25 1 1 7 0,125 а Бульон, используемый для растворения, тот же, что и для определения чувствительности. Любая добавка должна быть введена перед разведением антимикробного препарата для сохранения требуемой концентрации. Приготовление рабочих разведений приведено в [8]. 17 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Приложение D (справочное) Особые случаи при проведении исследования D.1 Общие положения В настоящем приложении перечислены некоторые случаи, возникающие при проведении исследования ме­ тодом микроразведений в бульоне, которые не были полностью стандартизированы на международном уровне, или при которых результаты исследования методом микроразведений в бульоне Мюллера—Хинтон могут быть ненадежными. Тем не менее важно, чтобы лаборатории были осведомлены об этих случаях, что позволит собирать данные для их последующего включения в основной текст международного стандарта. Во всех случаях в качестве основы для исследования этих препаратов используют среду Мюллера—Хинтон. Со временем могут возникнуть и другие случаи при проведении исследований, которые потребуют валидации для включения в между­ народный стандарт. D.2 Особые случаи при проведении исследования D.2.1 Прихотливые аэробные и факультативно-анаэробные виды бактерий (например, Haemophilus) В настоящее время используют два метода, которые не были полностью сопоставлены. Требования к сре­ де для исследования Haemophilus приведены в [1], требования к бульону Мюллера—Хинтон для прихотливых бактерий (МН-П) приведены в [16]. Информация о приготовлении среды, проведении исследований и результатах контроля качества приведена в документах CLSI и EUCAST. После завершения вышеуказанных исследований на­ стоящий стандарт будет обновлен: в него будут включены референтный метод или методы определения чувстви­ тельности вышеуказанных микроорганизмов к антимикробным препаратам. D.2.2 Мециллинам Исследования показали, что при определении чувствительности к мециллинаму методом микроразведений в бульоне Мюллера—Хинтон получаются некорректные результаты, поэтому использование данного метода не рекомендуется [20]. Стабильные воспроизводимые результаты обеспечивают метод разведений в агаре (рефе­ рентный метод) или диско-диффузионный метод. D.2.3 Фосфомицин Метод микроразведений в бульоне может не обеспечить получение достоверных результатов. В качестве референтного метода следует использовать метод разведений в агаре. Для проведения исследования в агар не­ обходимо добавить 25 мг/л глюкозо-6-фосфата. 18 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 Библиография [1] Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically 7th ed. Approved Stan­ dard M7-A7, Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA [2006] [2] Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth microdilution. Euro­ pean Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Discussion Document E.Def 5.1. Clin Microbiol Infect, (2003), vol. 9 (issue 7 insert), pp. 1— 10 (see http://www.eucast.org/documents/publications_inJournals/) [3] Ericcson H.M., Sherris J.C., Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study, Acta Pathol Microbiol Scand. (1971), sect. В 217 (suppl), pp. 1—90 [4] McFarland J. The nephelometer: An instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for cal­ culating the opsonic index and for vaccines. J. Amer Med Assoc. (1907), vol. 49, pp. 1176—1178 [5] Moosdeen E, Williams J.D., Seeker A. Standardization of inoculum size for disc susceptibility testing: a preliminary report of a spectrophotometric method. J Antimicrob Chemother. (1988), vol. 21, pp. 439—443 [6] Mueller J.H., Hinton J. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc Soc Exper Biol Med. (1941), vol. 48, p. 330 [7] Morrison G.H. In Critical Reviews in Analytical Chemistry. (1969), vol. 14(28A), CRC Press, Boca Raton, Florida [8] Barry A.L., Miller G.H., Thornsberry C. et al. Influence of cation supplements on activity of netilmicin against Pseu­ domonas aeruginosa in vitro and in vivo. Antimicrob Agents Chemother. (1987), vol. 31, pp. 1514— 1518 [9] Barry A.L., Reller L.B., Miller G.H. et al. Revision of standards for adjusting the cation content of Mueller-Hinton broth for testing susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides. J. Clin Microbiol. (1992), vol. 30, pp. 585—589 [10] D’Amato R.F., Swensen J.M., McKinley G.A. et al. Quantitative antimicrobial susceptibility test for Streptococcus pneumoniae using inoculum supplemented with whole defibrinated sheep blood. J Clin Microbiol. (1987), vol. 25, pp. 1753— 1756 [11] Swensen J.M., Thornsberry C. Susceptibility tests for sulfamethoxazole-trimethoprim by broth microdilution proce­ dure. Curr Microbiol. (1978), vol. 1, pp. 189— 193 [12] Bradford P.A., Petersen P.J., Young M. et al. Tigecycline MIC testing by broth dilution requires Use of fresh medium or addition of the biocatalytic oxygen-reducing reagent oxyrase to standardize the test method. Antimicrob Agents Chemother. (2005), vol. 49, pp. 3903—3909 [13] Rennie R.P, Koeth L., Jones R.N. et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test re­ sults for dalbavancin, a new glycopeptide agent. J. Clin. Microbiol. (2007), vol. 45, pp. 3151—3154 [14] Akinobu I., Torn Nishikawa T., Matsumoto S. et al. Siderophore cephalosporin cefiderocol utilizes ferric iron trans­ porter systems for antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. (2016), vol. 60, pp. 7396—7401 [15] Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 28th ed. Informational Supplement M100-S28, Wayne, PA Clinical and Laboratory Standards Institute (2018) [16] Routine internal quality control as recommended by EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). (for the latest version see; http://www.eucast .org/ast_of_bacteria/qc_ tables) [17] Media preparation for EUCAST disc diffusion testing and for determination of MIC values by the broth microdilution method. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). (for the latest version see: http:// www.eucast.org/ast_of_bacteria/media_preparation/) [18] Fuchs PC., Barry A.L., Brown S.D. Daptomycin susceptibility tests: interpretive criteria, quality control and effect of calcium on in vitro tests. Diag Microbiol Infect Dis. (2000). vol. 38, pp. 51—58 [19] Daly J.S., Dodge R.A., Glew R.H. et al. Effect of zinc concentration in Mueller-Hinton agar on susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to imipenem. J. Clin Microbiol. (1997), vol. 35, pp. 1027— 1029 [20] Skov R., Frimot-Moller N., Menday P. et al. Susceptibility testing of urinary isolates of Escherichia coli to mecillinam using NCCLS methodology. International J. Antimicrob Agents. (2005), vol. 25, pp. 198—202 19 ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2022 УДК 579.61:006.354 ОКС11.100.20 Ключевые слова: исследование чувствительности к антимикробным препаратам, референтный ме­ тод, инокулюм, питательная среда, Мюллер— Хинтон, микроразведение, бульон, бактерии, инфекци­ онные заболевания Редактор Л.В. Коретникова Технический редактор И.Е. Черепкова Корректор М.И. Першина Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой Сдано в набор 11.11.2022. Подписано в печать 16.11.2022. Формат 60х841/8. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 2,79. Уч.-изд. л. 2,51. Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта Создано в единичном исполнении в ФГБУ «РСТ» для комплектования Федерального информационного фонда стандартов, 117418 Москва, Нахимовский пр-т, д. 31, к. 2. www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022