Regulation concerning the conditions under which waste can be recognized as not harmful

Na podstawie art. 4 ust. 1 pkt 2 ustawy z dnia 27 kwietnia 2001 r. o odpadach (Dz. U. Nr 62, poz. 628, z póên. zm.2)) zarzàdza si´, co nast´puje: § 1. Rozporzàdzenie okreÊla: 1) warunki, w których uznaje si´, ˝e odpady wymie nione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie po siadajà w∏aÊciwoÊci lub sk∏adników i w∏aÊciwoÊci powodujàcych, ˝e odpady te stanowià odpady niebezpieczne; 2) sposób ustalenia spe∏nienia warunków, o których mowa w pkt 1. § 2. 1. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏a ÊciwoÊci wybuchowych (H1), sà negatywne wyniki ba daƒ wra˝liwoÊci termicznej, wra˝liwoÊci na uderzenie oraz wra˝liwoÊci na tarcie, przeprowadzonych w wa runkach testowych. 2. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊci woÊci szkodliwych (H5) albo toksycznych (H6), jest brak efektów szkodliwych lub toksycznych w warunkach prowadzonych testów przesiewowych z u˝yciem odpa dów lub standardowego wyciàgu wodnego z odpadów. 3. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊci woÊci rakotwórczych (H7), jest brak wystàpienia no wotworów u badanych zwierzàt nara˝onych na od dzia∏ywanie tych odpadów w warunkach testowych. 4. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na li Êcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà szkodliwe go dzia∏ania na rozrodczoÊç (H10), jest brak ich wp∏ywu na rozwój rozwielitek w warunkach testowych lub brak oddzia∏ywania na rozrodczoÊç zwierzàt doÊwiadczal nych w warunkach testu jedno- lub dwupokoleniowego. 5. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊci woÊci mutagennych (H11), jest brak zmian mutagen nych u organizmów nara˝onych na oddzia∏ywanie od padów w warunkach testowych. 6. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊci woÊci ekotoksycznych (H14), jest brak efektów tok sycznych w warunkach prowadzonych testów przesie wowych z u˝yciem standardowego wyciàgu wodnego z odpadów. 7. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊci woÊci, z powodu których odpady te zosta∏y umieszczo ne na tej liÊcie, jest brak w∏aÊciwoÊci wymienionych w ust. 1—6 oraz brak przekroczeƒ parametrów granicz nych, okreÊlonych w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia. § 3. Ustalenie spe∏nienia warunków, o których mo wa w § 2, nast´puje na podstawie przeprowadzonych badaƒ, które prowadzà laboratoria akredytowane lub laboratoria posiadajàce wdro˝ony system jakoÊci w zakresie badania w∏aÊciwoÊci i sk∏adników odpa dów niebezpiecznych, okreÊlonych w za∏àczniku nr 2 do rozporzàdzenia. § 4. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà sk∏adników i w∏aÊciwoÊci, z powodu których odpady te zosta∏y umieszczone na tej liÊcie, jest: 1) brak przekroczeƒ st´˝eƒ sk∏adników okreÊlonych w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia lub 2) brak przekroczeƒ parametrów granicznych okre Êlonych w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia oraz brak cech okreÊlonych w § 2 ust. 1—6. § 5. Je˝eli wystàpi chocia˝ jedna z cech, o których mowa w § 2 ust. 1—6, i przekroczenie parametrów, o których mowa w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia, odpad jest odpadem niebezpiecznym. § 6. Spe∏nienie warunku, o którym mowa w § 4 pkt 1, ustala si´ w nast´pujàcych etapach: 1) etap pierwszy — ustalenie listy substancji, których wyst´powanie w odpadzie jest spodziewane; 2) etap drugi — przeprowadzenie wst´pnych badaƒ, których celem jest ustalenie, czy faktycznie wyst´ pujà substancje, o których mowa w pkt 1; 3) etap trzeci — przeprowadzenie szczegó∏owych ba daƒ w celu okreÊlenia st´˝eƒ substancji ustalo nych w etapie drugim. § 7. Je˝eli wyniki badaƒ, o których mowa w § 6 pkt 3, wykazujà, ˝e st´˝enia substancji sà ni˝sze ni˝ wymienione w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia, od pad uznaje si´ za nieposiadajàcy sk∏adników i w∏aÊci woÊci powodujàcych, ˝e odpady te stanowià odpady niebezpieczne. § 8. Je˝eli w wyniku ustaleƒ, o których mowa w § 6, zostanie ustalone wyst´powanie sk∏adników wymienionych w za∏àczniku nr 3 do ustawy z dnia 27 kwietnia 2001 r. o odpadach innych ni˝ wymienio ne w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia, to w celu stwierdzenia, czy odpad nie stanowi odpadu niebez piecznego, przeprowadza si´ badania w∏aÊciwoÊci, o których mowa w § 2. § 9. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie 14 dni od dnia og∏oszenia. Minister Ârodowiska: J. Swatoƒ Dziennik Ustaw Nr 128 — 9034 — Poz. 1347 1347 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ÂRODOWISKA1) z dnia 13 maja 2004 r. w sprawie warunków, w których uznaje si´, ˝e odpady nie sà niebezpieczne ——————— 1) Minister Ârodowiska kieruje dzia∏em administracji rzàdo wej — Êrodowisko, na podstawie § 1 ust. 1 pkt 2 rozporzà dzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 4 maja 2004 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Âro dowiska (Dz. U. Nr 106, poz. 1130). 2) Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U. z 2002 r. Nr 41, poz. 365, Nr 113, poz. 984 i Nr 199, poz. 1671, z 2003 r. Nr 7, poz. 78 oraz z 2004 r. Nr 96, poz. 959 i Nr 116, poz. 1208. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9035 — Poz. 1347 Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Ârodowiska z dnia 13 maja 2004 r. (poz. 1347) Za∏àcznik nr 1 PARAMETRY GRANICZNE Lp. Ozna czenia w∏aÊci woÊci Nazwa w∏aÊciwoÊci Parametr graniczny nazwa parametru jedno stka wartoÊci, dla których uznaje si´, ˝e odpad nie posiada w∏aÊciwoÊci 1 H2 utleniajàce maksymalna pr´dkoÊç spalania mm/s maksymalna pr´dkoÊç spalania mniejsza od maksymalnej pr´dkoÊci spalania mieszanki kontrolnej celulozy i azotanu baru 2 H3-A wysoce temperatura zap∏onu °C powy˝ej 21 dla odpadów ∏atwopalne ciek∏ych czas spalania substancji sta∏ej s powy˝ej 45 3 H3-B ∏atwopalne temperatura zap∏onu °C powy˝ej 55 4 H4 dra˝niàce odczyn odpadu ciek∏ego lub wycià gu wodnego odpadu sta∏ego pH powy˝ej 3,0 oraz poni˝ej 11,5 dzia∏anie na skór´ — rumieƒ skóry — 01) dzia∏anie na skór´ — obrz´k skóry — 01) dzia∏anie na oczy — 02) uczulenie skóry — 03) 5 H8 ˝ràce odczyn odpadu ciek∏ego lub wycià gu wodnego odpadu sta∏ego pH powy˝ej 2,0 oraz poni˝ej 12,5 opór elektryczny przez skór´ szczura om >5 g´stoÊç optyczna w teÊcie z mode lowà skórà ludzkà % 1004) 6 H9 zakaêne5) Clostridium perfringens >0,0001 Salmonella sp. obecnoÊç brak Grupa coli, Eschericia coli miano >0,001 Pseudomonas aeruginosa obecnoÊç brak inne organizmy — stosowanie do rodzaju organizmów 7 H12 uwalniajàce pr´dkoÊç wydzielania gazu dm3/kg <1 toksyczne na go i wysoko dzin´ toksyczne gazy ca∏kowita iloÊç wydzielonej % masy <3,0 substancji toksycznej odpadu ca∏kowita iloÊç wydzielonej % masy <0,1 substancji wysoce toksycznej odpadu toksyczne oddzia∏ywanie — brak wydzielonego gazu na organizmy testowe 8 H13 wydzielajàce parametry stosowane dla po- stosowanie do badanych substancje szczególnych w∏aÊciwoÊci od H1 parametrów stosowanych o w∏aÊci- do H12 do oceny poszczególnych woÊciach w∏aÊciwoÊci od H1 do H12 ObjaÊnienia: 1) Brak zaczerwienienia oraz brak obrz´ku (ocena „0” w skali od 0 do 4). 2) Brak zm´tnienia rogówki, spojówki i t´czówki oraz brak obrz´ku powieki, oceny „0” (w skali: zm´tnienie rogówki: 0—4; uszkodzenie t´czówki: 0—2, przekrwienie spojówki: 0—3, obrz´k powieki: 0—4). 3) Brak reakcji skórnych (ocena „0” w klasyfikacji Magnussona/Kligmana w skali od 0 do 3). 4) Odsetkowa wartoÊç graniczna musi jednak zostaç zdefiniowana w modelu prognostycznym, zanim metoda zostanie uznana za odpowiednià. 5) Odpady zawierajàce ˝ywe mikroorganizmy lub ich toksyny, o których wiadomo lub co do których istniejà wiarygodne podstawy do przyj´cia, ˝e powodujà choroby cz∏owieka lub innych ˝ywych organizmów. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9036 — Poz. 1347 Za∏àcznik nr 2 BADANIA W¸AÂCIWOÂCI Lp. Nazwa w∏aÊciwoÊci Nazwa metody1) 1 2 3 1 wybuchowe H2) 1.1. Badanie wra˝liwoÊci termicznej wg PN-92/C-86006 (Materia∏y wybuchowe — Oznaczenie deflagracyjnoÊci — Metoda ogrzewa nia w ∏usce stalowej) lub wg pkt 1.6.1 cz´Êci A.14 za∏àcznika3) 1.2. Badanie wra˝liwoÊci na uderzenie wg PN-EN 13631-4:2004 (Materia∏y wybuchowe do u˝ytku cywilnego. Materia∏y wybu chowe kruszàce. Cz´Êç 4: Oznaczanie wra˝liwoÊci na uderzenie) lub wg pkt 1.6.2 cz´Êci A.14 za∏àcznika3) 1.3. Badanie wra˝liwoÊci na tarcie wg PN-C-86019:1994 (Materia ∏y wybuchowe — Oznaczanie wra˝liwoÊci na tarcie) lub wg pkt 1.6.3 cz´Êci A.14 za∏àcznika3) 2 utleniajàce H2 2.1. Badanie w∏aÊciwoÊci utleniajàcych (substancji sta∏ych/prepa ratów chemicznych) wg cz´Êci A.17 za∏àcznika3) 3 wysoce ∏atwopalne H3A 3.1. Metody badania odpadów ciek∏ych4) 3.1.1. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla za mkni´tego wg Abela wg PN-EN ISO 13736:2002 (U) (Przetwory naftowe i inne ciecze — Oznaczanie tem peratury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego wed∏ug Abela) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3) 3.1.2. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà zamkni´te go tygla Pensky‘ego—Martensa wg PN-EN ISO 2719:2003 (Oznaczanie temperatury zap∏onu. Pomiar metodà zamkni´tego tygla Pensky‘ego—Martensa) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3) 3.1.3. Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´ tym TAG wg PN-V-04043:2002 (Przetwory naftowe — Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´tym TAG) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3) 3.1.4. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla za mkni´tego Abla—Pensky‘ego wg PN-EN 57:1999 (Pro dukty naftowe — Oznaczanie temperatury zap∏onu — Pomiar metodà zamkni´tego tygla Abla—Pensky‘ego) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3) 3.2. Metody badania odpadów sta∏ych — Oznaczanie palnoÊci (substancji i parametrów chemicznych sta∏ych) wg PN-EN 61300-2-36:2002 (Âwiat∏owodowe z∏àcza i ele menty bierne — Podstawowe procedury badaƒ i pomiarów — Cz´Êç 2-36: Badania — PalnoÊç (niebezpieczeƒstwo zap∏onu)) lub wg cz´Êci A.10 za∏àcznika3) 4 ∏atwopalne H3B4) 4.1. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego wg Abela jak w pkt 3.1.1 4.2. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà zamkni´tego tygla Pensky‘ego—Martensa jak w pkt 3.1.2 4.3. Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´tym TAG jak w pkt 3.1.3 4.4. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego Abla—Pensky‘ego jak w pkt 3.1.4 5 dra˝niàce H4 5A. Testy przesiewowe — Badanie pH odpadu ciek∏ego lub wycià gu wodnego z odpadu sta∏ego wg PN-90/C-04540.01 (Woda i Êcieki. Badania pH, kwasowoÊci i zasadowoÊci. Oznaczanie pH wód i Êcieków o przewodnoÊci elektrolitycznej w∏aÊciwoÊci 10 mikrosekund/cm i powy˝ej metodà elektrometrycznà) Dziennik Ustaw Nr 128 — 9037 — Poz. 1347 1 2 3 5B. Badanie dzia∏ania dra˝niàcego: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach szczególnie uprawnionych5) 5B.1. ToksycznoÊç ostra (dzia∏anie dra˝niàce na skór´) wg cz´Êci B.4 za∏àcznika3) 5B.2. ToksycznoÊç ostra (dzia∏anie dra˝niàce na oczy) wg cz´Êci B.5 za∏àcznika3) 5B.3. ToksycznoÊç ostra (uczulenie skóry) wg cz´Êci B.6 za∏àcznika3) 6 szkodliwe H56) 6A. Testy przesiewowe: 6A.1. Test toksycznoÊci na bakteriach Vibrio fischeri wg in strukcji zawartych w dost´pnych testach komercyjnych 6A.2. Oznaczanie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L.7) 6A.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) wg cz´Êci C.2 za∏àcznika3) 6A.4. ToksycznoÊç — Hamowanie wzrostu glonów wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3) 6A.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3) 6A.6. ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badania w sztucznej glebie wg cz´Êci C.8 za∏àcznika3) 6B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach szczególnie uprawnionych 6B.1. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda ustalonej dawki wg cz´Êci B.1.BIS za∏àcznika3) 6B.2. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda klas ostrej toksycznoÊci wg cz´Êci B.1.TRIS za∏àczni ka3) 6B.3. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àczni ka3) 6B.4. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) wg cz´Êci B.3 za∏àcznika3) 6B.5. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokar mowa) wg cz´Êci B.7 za∏àcznika3) 6B.6. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhala cyjna) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3) 6B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skór´) wg cz´Êci B.9 za∏àcznika3) 7 toksyczne H66) 7A. Testy przesiewowe: 7A.1. Test toksycznoÊci na bakteriach Vibrio fischeri wg in strukcji zawartych w dost´pnych testach komercyjnych 7A.2. Oznaczanie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L.7) 7A.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) wg cz´Êci C.2 za∏àcznika3) 7A.4. Hamowanie wzrostu glonów wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3) 7A.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3) 7A.6. ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badania w sztucznej glebie wg cz´Êci C.8 za∏àcznika3) 7B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach szczególnie uprawnionych 7B.1. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda sta∏ej dawki wg cz´Êci B.1.BIS za∏àcznika3) 7B.2. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda klas ostrej toksycznoÊci wg cz´Êci B.1.TRIS za∏àcznika3) 7B.3. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àczni ka3) 7B.4. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) wg cz´Êci B.3 za∏àcznika3) 7B.5. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokar mowa) wg cz´Êci B.7 za∏àcznika3) Dziennik Ustaw Nr 128 — 9038 — Poz. 1347 1 2 3 7B.6. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyj na) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3) 7B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skór´) zgodnie z cz´Êcià B.9 za∏àcznika3) 8 rakotwórcze H7 8.1. Obserwacja dzia∏ania rakotwórczego na zwierz´tach testo wych wg cz´Êci B.32 za∏àcznika3) 8.2. Obserwacja toksycznoÊci przewlek∏ej i dzia∏ania rakotwórcze go na zwierz´tach testowych lub metoda równowa˝na wg cz´Êci B.33 za∏àcznika3) 9 ˝ràce H8 9A. Testy przesiewowe — Badanie pH odpadu ciek∏ego lub wycià gu wodnego z odpadu wg PN-90/C-04540.01 (Woda i Êcieki — Badania pH, kwasowoÊci i zasadowoÊci. Oznaczanie pH wód i Êcieków o przewodnoÊci elektrolitycznej w∏aÊciwej 10 mikro sekund/cm i powy˝ej metodà elektrometrycznà) 9B. Badanie dzia∏ania ˝ràcego 9B.1. Dzia∏anie ˝ràce na skór´ (test TER z u˝yciem skóry szczura) wg pkt 1.5 cz´Êci B.40 za∏àcznika3) lub 9B.2. Dzia∏anie ˝ràce na skór´ (test na modelu skóry ludzkiej) wg pkt 1.7 cz´Êci B.40 za∏àcznika3) 10 zakaêne H98) 10.1. Oznaczanie bakterii z rodzaju Clostridium wg PN-EN 26461 1:2001 (JakoÊç wody. Wykrywanie i oznaczanie iloÊciowe przetrwalników beztlenowców redukujàcych siarczyny (clo stridia). Cz´Êç 1: Metoda namna˝ania w pod∏o˝u p∏ynnym) 10.2. Oznaczanie bakterii z rodzaju Pseudomonas aeruginosa wg PN 81/C-04615.26 (Woda i Êcieki. Badania mikrobiologicz ne. Oznaczanie bakterii Pseudomonas aeruginosa metodà hodowli na po˝ywkach p∏ynnych) 10.3. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella wg PN-EN ISO 6579:2003 (Mikrobiologia ˝ywnoÊci i pasz. Horyzontalna me toda wykrywania Salmonella spp). 10.4. Oznaczanie bakterii z grupy coli, Escherichia coli wg PN 75/C-04615.05 (Woda i Êcieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodà fermentacyjnà pro bówkowà), PN 77/C-04615.07 (Woda i Êcieki. Badania mikro biologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli typu ka∏owego (fekalnego) metodà fermentacyjnà probówkowà), PN-EN ISO 9308-1:2004 (JakoÊç wody. Wykrywanie i ozna czanie iloÊciowe Escherichia coli i bakterii z grupy coli. Cz´Êç 1: Metoda filtracji membranowej) 10.5. Oznaczanie innych mikroorganizmów metodami specyficz nymi dla ich rodzajów 11 dzia∏ajàce szkodliwie 11A. Test przesiewowy — Badanie wp∏ywu na rozwój rozwielitek10) na rozrodczoÊç H109) 11B. Badania na zwierz´tach: wykonywane wy∏àcznie w przy padkach szczególnie uprawnionych 11B.1. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu jednopokoleniowego wg cz´Êci B.34. za∏àcznika3) lub 11B.2. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach te stu dwupokoleniowego wg cz´Êci B.35. za∏àcznika3) 12 mutagenne H1111) 12A. Testy na organizmach ni˝szych i komórkach ssaków: 12A.1. MutagennoÊç (test rewersji mutacji na bakteriach) wg cz´Êci B.13/14 za∏àcznika3) 12A.2. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) wg cz´Êci B.15 za∏àcznika3) 12A.3. MutagennoÊç (test rekombinacji mitotycznych na ko mórkach Saccharomyces cerevisiae) wg cz´Êci B.16 za ∏àcznika3 Dziennik Ustaw Nr 128 — 9039 — Poz. 1347 1 2 3 12A.4. Recesywne mutacje letalne zwiàzane z p∏cià u Droso phila melanogaster wg cz´Êci B.20 za∏àcznika3) 12A.5. MutagennoÊç — (test mutacji genowych na komór kach ssaków) wg cz´Êci B.17 za∏àcznika3) lub 12A.6. Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro wg cz´Êci B.19 za∏àcznika3), lub 12A.7. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych in vi tro na komórkach ssaków) wg cz´Êci B.10 za∏àcznika3) 12A.8. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych na ko mórkach szpiku kostnego ssaków) wg cz´Êci B.11 za ∏àcznika3) 12A.9. MutagennoÊç (test mikrojàdrowy na erytrocytach ssa ków in vivo) wg cz´Êci B.12 za∏àcznika3) 12B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach szczególnie uprawnionych 12B.1. Dominujàce mutacje letalne u gryzoni wg cz´Êci B.22 za∏àcznika3) lub 12B.2. Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków wg cz´Êci B.23 za∏àcznika3), lub 12B.3. Test plamkowy u myszy wg cz´Êci B.24 za∏àcznika3), lub 12B.4. Test dziedzicznych translokacji u myszy wg cz´Êci B.25 za∏àcznika3) 13 uwalniajàce toksyczne Metoda badania dwuetapowa: i wysoko toksyczne gazy H12 13.A. I etap — Badanie palnoÊci (w kontakcie z wodà) wg cz´Êci A.12 za∏àcznika3) 13.B. II etap — tylko wówczas, gdy w etapie I nie jest mo˝liwe ustalenie nazwy chemicznej wydzielajàcego si´ gazu 13.B.1. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àcznika3) lub 13.B.2. ToksycznoÊç dawki powtarzalnej (28 dni, droga inhalacyj na) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3) 14 H13 — wydzielajàce substancje Jak dla w∏aÊciwoÊci od H1 do H12 o w∏aÊciwoÊciach od H1 do H12 15 ekotoksyczne H1412) 15.1. Testy ekotoksycznoÊci wg instrukcji zawartych w poszczegól nych testach komercyjnych z wykorzystaniem bakterii lumi nescencyjnych, glonów, pierwotniaków, wrotków i skorupia ków dost´pnych w handlu w formie Toxkitów 15.2. Hamowanie wzrostu glonów wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3) 15.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) wg cz´ Êci C.2 za∏àcznika3) 15.4. ToksycznoÊç ostra (dla rz´sy wodnej — Lemna minor)13) 15.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3) ObjaÊnienia: 1) Wykonanie badania wed∏ug opisu metody okreÊlonej w: a) za∏àczniku do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏a ÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 232, poz. 2343), b) normach polskich (europejskich), c) innych udokumentowanych procedurach (patrz: objaÊnienia w odnoÊnikach 7, 10 i 13). W testach, w których metodyki opisane w za∏àczniku, o którym mowa w lit. a, lub innych procedurach przewidujà u˝y cie wodnych roztworów badanych substancji, w badaniach odpadów stosuje si´ standardowe wyciàgi wodne z odpa dów, wykonane zgodnie z PN-Z-15009:1997 (Odpady sta∏e — Przygotowanie wyciàgu wodnego) lub PN-Z-15012:1997 (Odpady sta∏e — Przygotowanie wyciàgu wodnego z odpadów zaolejonych). We wszystkich badaniach, a w szczególnoÊci w badaniach toksykologicznych, nale˝y stosowaç w pierwszej kolejnoÊci metody przesiewowe, tj. analizy chemiczne oraz mikrobiologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów oraz organizmów ni˝szych, z uwzgl´dnieniem podanych ni˝ej zasad. Metody te oznaczone sà symbolem A w opisie metod badania po szczególnych w∏aÊciwoÊci. 2) Badania wykonuje si´ wszystkimi wymienionymi metodami. 3) Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊci woÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych. 4) Wykonuje si´ badanie przynajmniej jednà z wymienionych metod. 5) Wybór metody powinien byç dostosowany do przewidywanej drogi nara˝enia. 6) Do ustalenia, czy odpad posiada w∏aÊciwoÊci H5 lub H6, nale˝y w pierwszej kolejnoÊci wykonaç testy przesiewowe na bakteriach oraz takich organizmach, jak Lepidium sativum L., Daphnia sp., Eisenia foetida, ryby. Model badawczy powi nien sk∏adaç si´ minimum z dwóch testów, z których jednym powinien byç test na rybach. W przypadku gdy w testach przesiewowych zostanie wykazana szkodliwoÊç lub toksycznoÊç badanego wyciàgu wodnego z odpadów, wyniki mogà zostaç dalej potwierdzone, o ile istnieje taka koniecznoÊç, w badaniach na ssakach. 7) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Oznaczenie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L. 1. Wst´p 1.1. Cel Celem badania jest okreÊlenie, czy odpad wykazuje aktywnoÊç cytotoksycznà na rze˝usze ogrodowej Lepidium sa tivum L. 1.2. Zakres stosowania metody Metod´ nale˝y stosowaç do wst´pnej oceny majàcej za zadanie okreÊlenie, czy badany odpad wykazuje w∏aÊci woÊci mitodepresyjne, objawiajàce si´ hamowaniem podzia∏ów komórkowych organizmu testowego. 1.3. OkreÊlenia: a) widoczna toksycznoÊç — ogólne okreÊlenie opisujàce wyraêne objawy toksycznoÊci wyst´pujàce po podaniu badanej substancji. Powinny one byç wystarczajàce do oszacowania zagro˝enia i powinny byç takie, by mo˝na by∏o oczekiwaç, ˝e wzrost podanej dawki spowoduje zmiany intensywnoÊci objawów toksycznoÊci i prawdopo dobnie ÊmiertelnoÊç, b) NER5 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 5 % w sto sunku do kontroli, c) NER50 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 50 % w stosunku do kontroli, d) NER90 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 90 % w stosunku do kontroli, e) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie. 1.4. Wytyczne ogólne Naczynia do hodowli i szk∏o laboratoryjne nale˝y myç wodnym roztworem detergentu, a nast´pnie dok∏adnie p∏u kaç i sterylizowaç. 1.5. Zasada metody Oznaczenie aktywnoÊci cytotoksycznoÊci na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L. polega na obserwacji reak cji organizmów testowych umieszczonych w badanych wyciàgach wodnych odpadów. W etapie pierwszym okre Êlanym jako test wst´pny ustalany jest rzàd toksycznoÊci wykorzystywany w etapie drugim zwanym testem w∏a Êciwym, na podstawie którego okreÊlane sà wartoÊci nast´pujàcych parametrów: NER5, NER50, NER90, LID. 1.6. Odczynniki i roztwory: a) woda destylowana lub zdemineralizowana, b) wodny roztwór detergentu, c) salicylan sodowy, d) siarczan cynkowy, e) fenol, f) czerwieƒ rutenowa (lub czerwieƒ oboj´tna). 1.7. Aparatura i przyrzàdy: a) urzàdzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieƒczania po˝ywki, b) êród∏o wody demineralizowanej lub destylowanej, c) autoklaw, d) pH-metr, e) lupa binokularowa z przyrzàdem mikrometrycznym o dok∏adnoÊci 0,1 mm, f) termostat, g) ezy lub inne narz´dzia u˝ywane do przenoszenia nasion rze˝uchy, h) naczynia z czystego szk∏a lub plastiku (najlepsze naczynie to szalka Petriego o Êrednicy 10 cm). 2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych 2.1. Charakterystyka organizmu testowego RoÊlina o wysokoÊci 30—60 cm, naga, posiada bia∏e kwiaty. ¸uszczynki szeroko oskrzydlone, opatrzone bardzo krótkà szyjkà, nieprzewy˝szajàcà wyci´cia szczytowego ∏uszczynki. 2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego Nasiona rze˝uchy ogrodowej Lepidium sativum L. lub roÊlina mogà byç uzyskane ze êróde∏ komercyjnych lub la boratoriów badawczych. Organizm testowy musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie przed u˝yciem. 2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych 2.3.1. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów Nasiona rze˝uchy nale˝y wysiaç na bibu∏´ zwil˝onà wodà destylowanà lub wodà zdemineralizowanà. Inku bowaç w cieplarce w temperaturze 25±0,5 °C przez 17—24 h. 2.3.2. Selekcja organizmów do testów Do badaƒ stosowane sà tylko te organizmy w iloÊci 25 sztuk na jedno st´˝enie, u których wzrost korzeni po 17—24 h kie∏kowania wynosi oko∏o 1 mm. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9040 — Poz. 1347 2.3.3. Woda do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy Do przygotowania roztworów do analizy wykorzystywana jest woda destylowana (zdemineralizowana). 2.3.4. OÊwietlenie Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazany jest brak oÊwietlenia. 2.3.5. Temperatura Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazane jest utrzymywanie temperatury na poziomie 25±0,5 °C. 3. Metodyka wykonania testu 3.1. Wytyczne ogólne W testach przesiewowych nale˝y u˝yç ustalonych z góry st´˝eƒ, by ustaliç, czy próbka jest toksyczna w porów naniu z roztworem kontrolnym; je˝eli próbka jest toksyczna, nale˝y wykonaç test wst´pny, który ma na celu usta lenie rz´du toksycznoÊci badanych wyciàgów wodnych odpadów. Do testu nale˝y u˝ywaç naczyƒ z czystego szk∏a lub tworzywa sztucznego; najlepszym naczyniem jest szalka Pe triego o Êrednicy 10 cm; przed u˝yciem ka˝de naczynie nale˝y dok∏adnie umyç wodnym roztworem detergentu, a nast´pnie dok∏adnie 3 razy p∏ukaç wodà wodociàgowà, 1 raz wodà destylowanà; ezy lub inne narz´dzie u˝ywa ne do przenoszenia nasion rze˝uchy powinny zostaç usuni´te po u˝yciu lub starannie umyte i wysterylizowane przed ponownym u˝yciem. Parametry testu — warunki Êrodowiskowe powinny odpowiadaç tym, jakie panujà podczas przygotowania orga nizmów testowych (ust. 2). Utrwalanie i wybarwianie strefy korzeniowej — po inkubacji w celu utrwalenia badanego materia∏u skie∏kowane nasiona rze˝uchy nale˝y przenieÊç do utrwalacza o nast´pujàcym sk∏adzie: — salicylan sodowy — 2,0 g — siarczan cynkowy — 2,0 g — fenol — 0,5 g — woda destylowana — 100,00 cm3 czas utrwalania wynosi 1/2 godziny lub d∏u˝ej; po tym czasie kie∏ki nale˝y przemyç w wodzie, a nast´pnie w∏o˝yç do roztworu czerwieni rutenowej w stosunku 1:5 000 na szkie∏ku przedmiotowym, w celu wybarwienia strefy ko rzeniowej; do wybarwienia mo˝e byç równie˝ zastosowana czerwieƒ oboj´tna, ale daje gorsze rezultaty. Pomiarów d∏ugoÊci korzeni dokonuje si´ pod lupà binokularowà przy u˝yciu przyrzàdu mikrometrycznego z do k∏adnoÊcià do 0,1 mm. 3.2. Test wst´pny Test ten powinien byç przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to, aby okreÊliç rozcieƒczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rz´du toksycznoÊci wykonuje si´ próby wst´pne, sporzàdzajàc szereg rozcieƒczeƒ badanych wyciàgów wodnych z zastosowaniem ilorazu post´pu geo metrycznego równego 5. 3.3. Test w∏aÊciwy Celem tego testu jest okreÊlenie NER5, NER50, NER90, LID dla wzrostu korzenia rze˝uchy. 3.3.1. Metodyka wykonania testu: a) do testu nale˝y przygotowaç, na bazie uzyskanych wyników z testu wst´pnego, 5 rozcieƒczeƒ próbki (nie liczàc kontroli) o malejàcym rozcieƒczeniu, przy zastosowaniu ilorazu post´pu geometrycznego rozcieƒ czeƒ od 0,5 do 2,0; w analizie uwzgl´dnia si´ te rozcieƒczenia wyciàgu wodnego, które w sposób staty stycznie istotny (L = 0,05) hamujà wzrost (wyd∏u˝enie si´) korzeni w stosunku do prób kontrolnych; (naj lepiej przygotowaç seri´ rozcieƒczeƒ, w których Êrodkowe powoduje oko∏o 50 % inhibicj´ wzrostu, a naj ni˝sze i najwy˝sze skutkujà oko∏o 90 i 10 % efektem inhibicji), b) dla ka˝dego rozcieƒczenia i kontroli powinny byç wykonane co najmniej 3 powtórzenia, ka˝de zawierajà ce 10 cm3 badanego roztworu, c) wprowadziç kontrol´ negatywnà zawierajàcà jedynie wod´ lub 1 % metyloceluloz´. 3.3.2. Wyniki testu Pod wp∏ywem zwiàzków cytotoksycznych wyst´puje inhibicja procesów podzia∏owych komórek merysto matycznych, co prowadzi do zahamowania wzrostu organów rze˝uchy ogrodowej Lepidium sativum L. W teÊcie bierze si´ pod uwag´ d∏ugoÊç korzeni badanego organizmu. Je˝eli w wysokich rozcieƒczeniach wyst´puje stymulacja, a nie inhibicja wzrostu rze˝uchy, nale˝y zanotowaç to zjawisko, je˝eli ma miejsce. 4. Obliczanie wyników oznaczenia 4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulujàca w porównaniu z próbà kontrolnà. 4.2. ToksycznoÊç (lub stymulacj´) nale˝y okreÊliç jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu do kontroli: % I = 100 · (Lk – Lt)/Lk, gdzie: Lk i Lt sà Êrednimi d∏ugoÊciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej; otrzymane wyniki s∏u˝à do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID. 4.3. Mi´dzy logarytmami rozcieƒczeƒ zwiàzków i efektem dzia∏ania wyst´puje w przybli˝eniu rozk∏ad normalny, do ob liczeƒ stosuje si´ przybli˝onà metodà statystycznà wg Kad∏ubowskiego; wyniki dzielone sà na dwie grupy o inhi bicji mniejszej i wi´kszej od 50 %, po czym obliczane sà Êrednie dla tych grup. 4.4. Nale˝y okreÊliç NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20 za pomocà metody statystycznej lub graficznej; nachy lenie zale˝noÊci rozcieƒczenie-reakcja jest specyficzne dla danego odpadu i dlatego mo˝e byç cennà informacjà. 5. Kontrola jakoÊci Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jakoÊci. Test jest nie do zaakceptowania, je˝eli wi´cej ni˝ 10 % kontrolnych osobników wykazuje zmiany patologiczne. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9041 — Poz. 1347 8) Dla odpadów, co do których istnieje podejrzenie, ˝e zawierajà czynniki zakaêne, nale˝y wytypowaç mikroorganizmy wskaênikowe reprezentujàce grup´ organizmów odpowiedzialnych za t´ w∏aÊciwoÊç odpadów. W badaniach tych zale ca si´, zgodnie z wybranà grupà wskaênikowà, wykorzystanie testów dotyczàcych jakoÊciowej analizy bakterii. Decyzja o wyborze grupy poszukiwanych drobnoustrojów powinna byç podejmowana z udzia∏em laboratorium rekomendujà cego si´ doÊwiadczeniem w mikrobiologicznych badaniach Êrodowiskowych. 9) Podstawowy jest test z rozwielitkami. 10) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Badanie wp∏ywu na rozród rozwielitek (Daphnia magna) 1. Wst´p 1.1. Cel Celem badania jest okreÊlenie wp∏ywu wyciàgu wodnego badanych odpadów na rozród rozwielitek (Daphnia ma gna). 1.2. Zasada metody Rozwielitki umieszcza si´ w wyciàgu wodnym badanego odpadu w ró˝nych rozcieƒczeniach. Notowana jest licz ba urodzonych osobników w przeliczeniu na jednà samic´, która prze˝y∏a kontakt z badanà próbkà. T́ liczb´ na st´pnie porównuje si´ z potencja∏em rozrodczym rozwielitek z próbek kontrolnych. 2. Charakterystyka organizmu testowego Dafnie sp. sà ma∏ymi s∏odkowodnymi skorupiakami o ciele sp∏aszczonym bocznie, okrytym, z wyjàtkiem g∏owy, przezroczystym pancerzem, zakoƒczonym kolcem. Na g∏owie znajdujà si´ ciemno pigmentowane, ruchliwe oko oraz krótkie czu∏ki pe∏niàce funkcj´ lokomotorycznà. Dzi´ki przeêroczystoÊci pancerza widoczne sà niektóre narzà dy wewn´trzne. 2.1. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego Daphnia sp. mo˝e byç uzyskana ze êróde∏ komercyjnych, laboratoriów badawczych lub z terenu naturalnego. Od 20 do 30 rozwielitek wystarczy do za∏o˝enia hodowli. Organizm musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwier dzony taksonomicznie przed u˝yciem. 2.2. OkreÊlenia a) NER — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, które dzia∏a szkodliwie na rozrodczoÊç, b) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie. 2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych Hodowle nale˝y prowadziç zgodnie z metodykà zawartà w rozdz. C.2 za∏àcznika (patrz: objaÊnienia w odnoÊniku 1 pkt a). 2.4. Pokarm i sposób karmienia organizmów testowych Rozwielitki nale˝y karmiç mieszaninà zielonych glonów i dro˝d˝ami. Najlepiej, jeÊli w sk∏ad glonów wchodziç b´ dà Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus i ewentualnie Chlorella sp. 2.4.1. Mieszanina glonów z dro˝d˝ami; aby przygotowaç mieszanin´ glonów, nale˝y je odwirowaç, przep∏ukaç w przefiltrowanej wodzie ze zbiornika naturalnego (wod´ przepuÊciç przez filtr 0,22 µ m) lub w przefiltro wanej po˝ywce, na której rosnà glony, i ponownie odwirowaç; nale˝y pami´taç, ˝e podawanie pokarmu w nadmiarze mo˝e powodowaç wyczerpywanie si´ tlenu, a nast´pnie Êmierç organizmów; rozwielitki nale˝y karmiç, u˝ywajàc sterylnej pipety Pasteura, dodajàc: — do organizmów ≤ 9 do 10 dni — 2 krople ka˝dych glonów i dro˝d˝y, — do organizmów 9- ÷ 10-dniowych — 1 kropl´ ka˝dych glonów i dro˝d˝y, na dwa doros∏e osobniki, zaokràglajàc, je˝eli jest nieparzysta iloÊç rozwielitek; na koniec tygodnia pracy (np. w piàtek) dodaç 1 dodatkowà kropl´ ka˝dych glonów i dro˝d˝y na ka˝dà zlewk´ z hodowlà; je˝eli tyl ko 2 z 3 gatunków glonów sà wykorzystywane do karmienia, nale˝y dodaç proporcjonalnie wi´cej z tych 2 glonów. 2.4.2. Karmienie jednym gatunkiem glonów; 7-dniowa hodowla glonów np. Selenastrum capricornutum powin na zawieraç 4—5 mln komórek w 1 cm3; nale˝y zmieszaç 7-dniowà hodowl´ glonów z hodowlà 3-dniowà w stosunku obj´toÊciowym 2:1; wirowaç komórki glonów, a nast´pnie zawiesiç je w wodzie wodociàgowej Êrednio twardej lub twardej tak, aby w 1 cm3 by∏o w przybli˝eniu 10 mln komórek; dziennie nale˝y dostar czyç rozwielitkom w przybli˝eniu 300 000 komórek glonów na 1 cm3 hodowli, czyli dodaç ok. 30 cm3 zawie siny komórek do 1 dm3 hodowli. 3. Metodyka wykonania testu 3.1. Test trwa 21 dni, czyli 5 wyl´gów. 3.2. Liczba zwierzàt u˝ywanych do badania wynosi 60 sztuk. 3.3. Osobniki umieszcza si´ pojedynczo w 100 cm3 zlewce z 60—80 cm3 testowanego roztworu; wykonuje si´ 10 po wtórzeƒ dla pi´ciu testowanych st´˝eƒ oraz 10 prób kontrolnych; co 2 lub 3 dni nale˝y policzyç osobniki, które prze˝y∏y, i nowo narodzone; potem doros∏e osobniki przenosi si´ do Êwie˝ego roztworu testowanej substancji, a m∏ode usuwa si´. 4. Obliczanie wyników oznaczenia Danych uzyskanych w wyniku badania reprodukcji u˝ywa si´ do okreÊlenia najwi´kszego rozcieƒczenia wyciàgu wod nego odpadu potrzebnego do wywo∏ania szkodliwego efektu (NER) oraz najmniejszego rozcieƒczenia niepowodujà cego mo˝liwego do zaobserwowania efektu (LID). Porównuje si´ liczb´ urodzonych osobników w przeliczeniu na sa mic´, która prze˝y∏a kontakt z testowanà substancjà, z potencja∏em rozrodczym osobników u˝ytych do badania kon trolnego. 11) Podstawowe testy przesiewowe nale˝y wykonaç na bakteriach, liniach komórkowych ssaków lub komórkach dro˝d˝y. Model badawczy powinien sk∏adaç si´ z dwóch testów, tj. jednego na komórkach prokariotycznych i jednego na komór kach eukariotycznych. 12) Nale˝y wykonaç testy na bakteriach, na formach m∏odocianych bezkr´gowców i glonów (zestawy komercyjne), oraz na ˝ywych organizmach roÊlinnych Lemna minor i zwierz´cych, takich jak Daphnia sp., ryby. Model badawczy powinien sk∏adaç si´ z testów dla organizmów na ró˝nych poziomach troficznych. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9042 — Poz. 1347 13) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Oznaczenie toksycznoÊci ostrej na rz´sie wodnej Lemna minor. 1. Wst´p 1.1. Cel Celem badania jest okreÊlenie wysokoÊci st´˝eƒ toksycznych wyciàgu wodnego badanych odpadów na rz´sie wodnej Lemna minor. 1.2. Zakres stosowania metody Metod´ nale˝y stosowaç do badania fitotoksycznoÊci badanych odpadów na rz´sie, która jest idealnym organi zmem do tego typu badania. Poniewa˝ wi´kszoÊç wyciàgów wodnych jest barwnych i/lub m´tnych, przez co sprawiajà trudnoÊci w badaniu toksycznoÊci z u˝yciem glonów bez uprzedniego przesàczenia, które obni˝a inte gralnoÊç próbki. W dodatku niektóre próbki zawierajà labilne sk∏adniki i wymagajà metod odnawialnych lub prze p∏ywowych. Testy na glonach mogà byç nieodpowiednie do takich próbek, podczas gdy toksycznoÊç badana na rz´sie mo˝e byç ∏atwo modyfikowana innymi metodami. Test toksycznoÊci na rz´sie wodnej jest przydatny, szczególnie do okreÊlania fitotoksycznoÊci na powierzchni roz dzia∏u powietrze-woda, gdzie substancje powierzchniowo czynne, oleje i t∏uszcze oraz toksyczne organiczne zwiàzki mogà si´ gromadziç. Test ten jest te˝ u˝yteczny do okreÊlania toksycznoÊci metali, zwiàzków organicz nych, Êcieków przemys∏owych i miejskich. Ogólnie jest okreÊlany jako prosty, czu∏y i wydajny test. 1.3. OkreÊlenia: a) toksycznoÊç ostra — obejmuje szkodliwe skutki wyst´pujàce w okreÊlonym czasie po podaniu pojedynczej dawki wyciàgu, b) widoczna toksycznoÊç — ogólne okreÊlenie opisujàce wyraêne objawy toksycznoÊci; powinny one byç wystar czajàce do oszacowania zagro˝enia i powinny byç takie, by mo˝na by∏o oczekiwaç, ˝e obni˝enie rozcieƒczenia spowoduje zmiany intensywnoÊci objawów toksycznoÊci i prawdopodobnie ÊmiertelnoÊç, c) NER5 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 5 % w stosunku do kontroli, d) NER50 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 50 % w stosunku do kontroli, e) NER90 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 90 % w stosunku do kontroli, f) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie, g) S20 — najwi´ksza wartoÊç czynnika rozcieƒczajàcego, dla którego stwierdza si´ 20 % efekt stymulacji. 1.4. Wytyczne ogólne 1.4.1. Naczynia do hodowli i szk∏o laboratoryjne nale˝y myç wodnym roztworem detergentu, a nast´pnie dok∏ad nie p∏ukaç. 1.4.2. U˝ywaç statycznych, odnawialnych lub przep∏ywowych metod. Zwykle, jeÊli roztwór jest stabilny (np. roz twór z ma∏à iloÊcià mikroorganizmów, wysokim st´˝eniem toksycznych metali lub ma∏ej lotnoÊci), u˝ywa si´ testu statycznego. Je˝eli próbki sà niestabilne, u˝yç odnawialnej (codziennie) lub przep∏ywowej metody. 1.5. Zasada metody Oznaczenie fitotoksycznoÊci na rz´sie wodnej Lemna minor polega na obserwacji reakcji organizmów testowych umieszczonych w wyciàgu wodnym badanych odpadów. W etapie pierwszym okreÊlanym jako test wst´pny ustalany jest rzàd toksycznoÊci wykorzystywany w etapie drugim zwanym testem w∏aÊciwym, na podstawie któ rego okreÊlane sà wartoÊci nast´pujàcych parametrów: NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20. 1.6. Odczynniki i roztwory: a) roztwór podstawowy A: — NaNO3 — NaHNO3 — K2HPO4, b) roztwór podstawowy B: — CaCl2*2H2O — MgCl2 — Na2EDTA*2H2O — MnCl2, c) roztwór podstawowy C: — MgSO4*7H2O — H3BO3 — Na2MoO4*2H2O — ZnCl2 — CoCl2 — CuCl2, d) woda demineralizowana lub destylowana, e) wodny roztwór detergentu. 1.7. Aparatura i przyrzàdy: a) urzàdzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieƒczania po˝ywki, b) êród∏o wody demineralizowanej lub destylowanej, c) autoklaw, d) pH-metr, e) r´czny obiektyw lub mikroskop selektywny, f) akwaria hodowlane — 15 l naczynia (np. akwarium) lub nierdzewna stalowa miska, g) lodówka, h) oÊwietlenie zapewniajàce sta∏e bia∏e jarzeniowe Êwiat∏o (2 150—4 300 luksów), i) ezy lub inne narz´dzia u˝ywane do przenoszenia rz´sy, Dziennik Ustaw Nr 128 — 9043 — Poz. 1347 j) 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmayera (doÊç du˝e, aby zmieÊciç 150 cm3 roztworu testowego i kolo nie rz´sy); uwaga: wszystkie naczynia powinny byç tego samego typu i wielkoÊci; k) aparatura do pomiarów fizykochemicznych testowanych substancji chemicznych lub ich mieszanin. 2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych 2.1. Charakterystyka organizmu testowego Drobna roÊlina wodna o p∏askich, bezlistnych kolistych p´dach lub odwrotnie jajowatych Êrednicy 2—3 mm z∏o ˝onych z cz´Êci tzw. po∏ci z korzonkami. Rzadko spotykane — kwiaty jednop∏ciowe bez okwiatu; m´ski z jednego pr´cika, ˝eƒski z jednego s∏upka. 2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego Rz´sa wodna Lemna minor mo˝e byç uzyskana ze êróde∏ komercyjnych, laboratoriów badawczych lub z terenu naturalnego. Organizm musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie przed u˝yciem. In nym, preferownym przez niektórych biologów gatunkiem rz´sy jest L. gibba, L. perpusilla, L. pencicostata, L. po lyrrhiza, które mogà byç u˝ywane z sukcesem po modyfikacjach procedury. 2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych 2.3.1. Hodowla organizmów testowych Ârodowisko wzrostu roÊlin w warunkach kontrolnych powinno byç prowadzone w odpowiednich pomiesz czeniach lub na zamkni´tych obszarach umo˝liwiajàcych utrzymanie odpowiedniej iloÊci pojemników te stowych. Nale˝y aklimatyzowaç nowà hodowl´ rz´sy do otoczenia testowego co najmniej przez 2 tygodnie przed rozpocz´ciem badaƒ. Ta hodowla roÊnie energicznie i zapewnia prawie niewyczerpany zapas dla testów prowadzonych w odpowiednich warunkach. Hodowla uzyskana z jednej wyizolowanej roÊliny powinna po s∏u˝yç do zaszczepienia wszystkich kolb u˝ytych w opisywanym teÊcie. Aby przygotowaç 10 dm3 roztworu do hodowli, nale˝y dodaç 100 cm3 ka˝dego roztworu podstawowego sk∏adników pokarmowych A, B i C (tabela 1) do demineralizowanej lub innej odpowiedniej wody (np. wo dy destylowanej). Dodaç rozcieƒczony (1/4 mocy) roztwór do hodowli raz w tygodniu. G∏´bokoÊç wody po winna wynosiç co najmniej 40 mm. Raz w miesiàcu przenieÊç zapasowà hodowl´ do Êwie˝o przygotowanego roztworu sk∏adników od˝yw czych. 2.3.2. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów Szczepy hodowlane powinny byç rozmna˝ane w akwariach przez okres dwóch tygodni (z koniecznym prze rzedzaniem) przed u˝yciem w teÊcie. RoÊliny u˝yte w teÊcie powinny byç okresowo selekcjonowane z akwariów hodowlanych. Zaszczepienie powinno byç wykonane roÊlinami pochodzàcymi z hodowli m∏od szych ni˝ dwutygodniowe. 2.3.3. Selekcja organizmów do testów Wybraç okazy rz´sy z hodowli, które ros∏y w tych samych warunkach. Uciàç wszystkie korzenie, by zredu kowaç ska˝enie glonami, jeÊli jest taka koniecznoÊç. Nale˝y posegregowaç roÊlinki o podobnej wielkoÊci, a liczba roÊlinek i listków powinna byç taka sama lub mo˝liwie taka sama w ka˝dym naczyniu. U˝ywaç je dynie zdrowych roÊlin zawierajàcych dwa liÊcie o takich samych lub podobnych rozmiarach. Alternatyw nie 4 roÊliny 3-listne lub 3 roÊliny 4-listne. Zalecane jest, by w ka˝dym naczyniu znalaz∏o si´ co najmniej 12, ale nie wi´cej ni˝ 16 listków. RoÊlinki sà eksponowane w zamkni´tych naczyniach na równe obj´toÊci ka˝dego rozcieƒczenia badanej próbki na okres 7 dni. 2.3.4. Choroby i drapie˝niki Choroby, roÊlino˝erne owady lub inne szkodniki zwykle nie sprawiajà problemów w hodowlach rz´sy. Je ˝eli w hodowli wystàpià jakiekolwiek zmiany chorobowe, nale˝y jà zniszczyç i rozpoczàç nowà. Wskazane jest utrzymywanie kilku hodowli izolowanych od siebie. 2.3.5. Woda do hodowli (po˝ywka) i do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy Woda do rozcieƒczeƒ i woda do prób kontrolnych jest identyczna z roztworem substancji od˝ywczych do hodowli rz´sy. Ten roztwór nale˝y przygotowaç wed∏ug tabel nr 1 i nr 2. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9044 — Poz. 1347 Tabela nr 1 Odczynnik St´˝enie Roztwór A Roztwór B NaNO3 25,5 g/dm 3 NaHCO3 15,0 g/dm 3 K2HPO4 1,04 g/dm 3 CaCl2*2H2O 4,41 g/dm 3 MgCl2 5,7 g/dm 3 FeCl3 0,096 g/dm 3 Na2EDTA*2H2O 0,3 g/dm 3 MnCl2 0,264 g/dm 3 Tabela nr 2 Dziennik Ustaw Nr 128 — 9045 — Poz. 1347 Odczynnik St´˝enie Roztwór C Pierwiastek St´˝enie koƒcowe Roztwór A Roztwór B MgSO4*7H2O 14,7 g/dm 3 H3BO3 0,186 g/dm 3 Na2MoO4*2H2O 7,26 mg/dm 3 ZnCl2 3,27 mg/dm 3 CoCl2 0,78 mg/dm 3 CuCl2 0,009 mg/dm 3 N 42,0 mg/dm3 Na 110,0 mg/dm3 C 21,4 mg/dm3 K 4,69 mg/dm3 P 1,86 mg/dm3 Roztwór C Ca 12,0 mg/dm3 Mg 29,0 mg/dm3 Fe 0,33 mg/dm3 Mn 1,15 mg/dm3 S 19,1 mg/dm3 B 325 µg/dm3 Mo 28,8 µg/dm3 Zn 15,7 µg/dm3 Co 3,54 µg/dm3 Cu 0,04 µg/dm3 Uwagi: Do przygotowania po˝ywki dodaç 1 cm3 ka˝dego roztworu do 100 cm3 dejonizowanej wody. Ustaliç pH na poziomie 7,5—8,0. Aby przygotowaç 10 dm3 roztworu do hodowli, dodaç 100 cm3 ka˝dego roztworu podstawowego sk∏adni ków pokarmowych A, B i C (tabela nr 1) do demineralizowanej lub innej odpowiedniej wody (np. wody de stylowanej). Po˝ywka powinna zostaç zrobiona przed ka˝dym transferem kultur rz´sy i do przygotowania nowych roz tworów podczas prowadzenia testów. Je˝eli jest przygotowywana z wyprzedzeniem, powinna byç trzyma na w lodówce. 2.3.6. OÊwietlenie Nale˝y zapewniç sta∏e ch∏odne, bia∏e jarzeniowe Êwiat∏o (2 150—4 300 luksów) na powierzchni wody. Na t´˝enie Êwiat∏a powinno byç mierzone w ca∏ym obszarze inkubacji i nie powinno si´ ró˝niç wi´cej ni˝ 15 % od wybranego nat´˝enia Êwiat∏a. 2.3.7. Temperatura Hodowl´ nale˝y prowadziç w pomieszczeniu o czystym powietrzu, w którym utrzymywana b´dzie tempe ratura 25±2 °C. 2.3.8. Naczynia do hodowli Nale˝y hodowaç rz´s´ w 15 l naczyniu, np. akwarium lub nierdzewnej stalowej misce: a) po za∏o˝eniu hodowli nale˝y ka˝de naczynie czyÊciç czystà gàbkà w celu usuni´cia martwej rz´sy i p∏u kaç dsetylowanà lub demineralizowanà wodà, b) raz w miesiàcu, podczas wymiany wody, nale˝y umyç ka˝de naczynie wodnym roztworem detergentu; po umyciu dok∏adnie wyp∏ukaç 3 razy wodà wodociàgowà, a nast´pnie wodà do hodowli w celu usu ni´cia resztek detergentu, c) ezy lub inne narz´dzie u˝ywane do przenoszenia rz´sy powinny zostaç usuni´te po u˝yciu lub staran nie umyte i wysterylizowane przed ponownym u˝yciem. 3. Metodyka wykonania testu 3.1. Wytyczne ogólne W testach przesiewowych nale˝y u˝yç ustalonych z góry rozcieƒczeƒ do ustalenia, czy próbka jest toksyczna w porównaniu z roztworem kontrolnym; je˝eli próbka jest toksyczna, nale˝y wykonaç test wst´pny, który ma na celu ustalenie rz´du toksycznoÊci badanych wyciàgów wodnych odpadów. Naczynia u˝ywane w testach to 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmeyera, doÊç du˝e, by zmieÊciç 150 cm3 roztworu testowego i kolonie rz´sy, bez st∏oczenia w czasie trwania testu; wszystkie naczynia powinny byç tego samego typu i wielkoÊci; pomimo ˝e wykonuje si´ co najmniej 3 powtórzenia, czasami mogà byç konieczne wi´k sze naczynia, by pomieÊciç dodatkowe kolonie i obj´toÊci badanych roztworów; stosunek obj´toÊci badanego roztworu do obj´toÊci naczynia nie powinien przekroczyç 2:5; dla ka˝dego badanego rozcieƒczenia i kontroli na le˝y wykonaç tyle samo powtórzeƒ. Warunki Êrodowiskowe powinny odpowiadaç tym, jakie panujà podczas hodowli organizmów testowych (ust. 2). 3.2. Test wst´pny Test ten powinien byç przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to, aby okreÊliç rozcieƒczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rz´du toksycznoÊci wykonuje si´ próby wst´pne, sporzàdzajàc szereg rozcieƒczeƒ badanych wyciàgów wodnych z zastosowaniem ilorazu post´pu geo metrycznego równego 10, np. 10 %, 1 %, 0,1 %. Je˝eli test wst´pny pokaza∏, ˝e najni˝sze rozcieƒczenie wyciàgu wodnego z badanej próbki odpadu nie wp∏yn´ ∏o niekorzystnie na rz´s´, oznacza to, ˝e wyciàg wodny badanego odpadu nie jest fitotoksyczny. 3.3. Test w∏aÊciwy Celem tego testu jest okreÊlenie NER5, NER50, NER90, LID, S20 dla wzrostu rz´sy, bazujàc na okreÊleniu ca∏kowi tej liczby listków, tempie wzrostu i/lub ÊmiertelnoÊci listków. 3.3.1. Metodyka wykonania testu: a) do testu nale˝y przygotowaç, na bazie uzyskanych wyników z testu wst´pnego, 5 rozcieƒczeƒ próbki wyciàgu wodnego (nie liczàc kontroli) o malejàcym rozcieƒczeniu, przy zastosowaniu ilorazu post´pu geometrycznego rozcieƒczeƒ od 0,5 do 2,0, np. 10 %, 5 %, 2,5 %: — zakres rozcieƒczeƒ badanego wyciàgu powinien byç dobrany tak, aby w najmniejszym rozcieƒcze niu mia∏o to wp∏yw na co najmniej 90 % listków rz´sy wodnej, a w najwy˝szym na nie wi´cej ni˝ 5 % listków, w porównaniu z kontrolami, — zakres rozcieƒczeƒ powinien zostaç dobrany tak, aby mo˝na by∏o wykreÊliç krzywà odpowiedzi na rozcieƒczenia, pomi´dzy NER5 a NER90, b) dla ka˝dego rozcieƒczenia i kontroli powinny byç wykonane co najmniej 3 powtórzenia, ka˝de zawiera jàce 150 cm3 badanego roztworu lub tyle, by wystarczy∏o do uzyskania wyniku przy stosunku wielkoÊci naczyƒ 2:5; mo˝na zastosowaç mniej powtórzeƒ zawierajàcych wi´kszà liczb´ kolonii, ale pojemniki te stowe i obj´toÊci roztworów muszà zostaç odpowiednio przystosowane, c) wprowadziç kontrol´ negatywnà zawierajàcà jedynie roztwór substancji pokarmowych lub zmodyfiko wany roztwór, d) po˝ywka i badane roztwory czasem muszà byç wymieniane w 3. lub 5. dniu prowadzenia testu lub je Êli zaistnieje taka potrzeba cz´Êciej, by zapobiec brakom substancji od˝ywczych lub wyczerpaniu bada nej substancji chemicznej; okresowe odnowienie pomo˝e zachowaç sta∏e ekspozycyjne st´˝enia bada nej substancji przez czas trwania testu dla sk∏adników, które sà niestabilne w wodzie. 3.3.2. Wyniki testu: a) najpowszechniej u˝ywanà i pozornie wiarygodnà metodà oceniania jest wzrost listków; aby zmierzyç wzrost listków, nale˝y policzyç ka˝dy dostrzegalny sterczàcy pàczek, podczas oglàdania pod r´cznym obiektywem lub sekcyjnym mikroskopem; ta nieniszczàca metoda zezwala na powtarzanie obserwacji tego samego roztworu; obserwacje wyglàdu i liczby listków nale˝y wykonywaç w dniach 0., 3., 5. i 7.; w dniu 7. okreÊlana jest ca∏kowita liczba ˝ywych i/lub martwych listków; mikroskop sekcyjny u∏atwi ob serwacje; nale˝y wykreÊliç krzywe odpowiedzi na st´˝enia; krzywe odpowiedzi na st´˝enie sà kreÊlone dla ca∏kowitej liczby listków, tempa wzrostu (jako liczba listków na dzieƒ) i ÊmiertelnoÊci (procent mar twych listków); te krzywe mogà stanowiç podstaw´ do okreÊlania NER5, NER50, NER90, LID, S20; nale˝y zapisaç jakiekolwiek zmiany w rozwoju lub wyglàdzie listków, takie jak: — wzrost ich iloÊci (listek jest liczony bez wzgl´du na rozmiar) — zmniejszenie si´ rozmiaru — chloroz´ (utrat´ pigmentu/˝ó∏kni´cie) — nekrozy (martwe miejsca) — zniszczenie korzenia — utrat´ p∏ywalnoÊci — wypuk∏oÊci (w kszta∏cie ∏uku lub opuchlizna) — toni´cie listków — rozpad kolonii porównanie chorych listków z okazami w próbie kontrolnej pos∏u˝y do ustalenia LID (rozcieƒczenia nie wywo∏ujàcego zauwa˝alnego efektu), b) inne metody, które mogà byç oszacowane w tym teÊcie i które wskaza∏yby na inhibicj´ wzrostu: — pobór w´gla C14 — zawartoÊç chlorofilu a, b, c — zawartoÊç biomasy Dziennik Ustaw Nr 128 — 9046 — Poz. 1347 — powierzchnia listków — liczba kolonii, liczba korzeni — d∏ugoÊç korzeni, c) powinny byç te˝ zapisane ka˝de dodatkowe obserwacje, takie jak sedymentacja roztworu testowego lub inne anomalia, d) niektóre substancje zawarte w wyciàgu wodnym raczej stymulujà, ni˝ inhibitujà wzrost rz´sy; zanoto waç taki efekt, je˝eli wyst´puje. 4. Obliczenie wyników oznaczenia 4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulujàca w porównaniu z próbà kontrolnà. 4.2. ToksycznoÊç (lub stymulacj´) nale˝y okreÊliç jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu do kontroli: % I = 100 · (Lk – Lt)/Lk, gdzie: Lk i Lt sà Êrednimi d∏ugoÊciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej; otrzymane wyniki s∏u˝à do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID. 4.3. Wyniki badaƒ rozstrzygajàcych mogà byç zobrazowane przy u˝yciu liniowych, pó∏logarytmicznych lub logaryt micznych wykresów. Typowa relacja rozcieƒczenie-efekt jest esowata. 4.4. Nale˝y okreÊliç NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20 (rozcieƒczenie powodujàce 20 % efekt stymulacji) za pomocà metody statystycznej lub graficznej; nachylenie zale˝noÊci rozcieƒczenie-reakcja jest specyficzne dla da nego odpadu i dlatego mo˝e byç cennà informacjà. 5. Kontrola jakoÊci Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jakoÊci. Test jest nie do zaakceptowania, je˝eli wi´cej ni˝ 10 % kontrolnych osobników umrze lub oka˝e niekorzystne symptomy. W normalnych warunkach czas podwojenia si´ dla rz´sy wynosi mniej ni˝ 2 doby. Je˝eli próbka kontrolna wykazuje mniej ni˝ dwukrotny wzrost listków w 96 godzin, test jest nie do przyj´cia. Dziennik Ustaw Nr 128 — 9047 — Poz. 1347 Za∏àcznik nr 3 ST¢˚ENIA SK¸ADNIKÓW Lp. Substancje St´˝enie, dla którego uznaje si´ ˝e odpad nie posiada sk∏adników 1 Jedna lub wi´cej substancji wysoce toksycznych1) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 0,1 % 2 Jedna lub wi´cej substancji toksycznych1) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 3 % 3 Jedna lub wi´cej substancji szkodliwych1) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 25 % 4 Jedna lub wi´cej substancji ˝ràcych okreÊlonych jako R351) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 1 % 5 Jedna lub wi´cej substancji ˝ràcych okreÊlonych jako R341) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 5 % 6 Jedna lub wi´cej substancji dra˝niàcych okreÊlonych jako R411) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 10 % 7 Jedna lub wi´cej substancji dra˝niàcych okreÊlonych jako R36, R37 i R381) ∏àczne st´˝enia — poni˝ej 20 % 8 Jedna substancja rakotwórcza kategorii 1 lub 21) st´˝enie — poni˝ej 0,1 % 9 Jedna substancja rakotwórcza kategorii 31) st´˝enie — poni˝ej 1 % 10 Jedna substancja szkodliwa na rozrodczoÊç kategorii 1 lub 2 okreÊlona jako R60, R611) st´˝enie — poni˝ej 0,5 % 11 Jedna substancja szkodliwa na rozrodczoÊç kategorii 3 okreÊlona jako R62, R631) st´˝enie — poni˝ej 5 % 12 Jedna substancja mutagenna kategorii 1 lub 2 okreÊlona jako R461) st´˝enie — poni˝ej 0,1 % 13 Jedna substancja mutagenna kategorii 3 okreÊlona jako R401) st´˝enie — poni˝ej 1 % ObjaÊnienie: 1) OkreÊlone na podstawie rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 2 wrzeÊnia 2003 r. w sprawie wykazu substancji niebez piecznych wraz z ich klasyfikacjà i oznakowaniem (Dz. U. Nr 199, poz. 1948) oraz rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 2 wrzeÊnia 2003 r. w sprawie kryteriów i sposobu klasyfikacji substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 171, poz. 1666).