Arrêté du 6 décembre 1994 relatif à la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre

MINISTÈRE DE L'AGRICULTURE ET DE LA PÊCHE Arrêté du 6 décembre 1994 relatif à la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre NOR: AGRG9402345A Le ministre de l'agriculture et de la pêche, Vu la directive n° 93/85/C.E.E. du conseil du 4 octobre 1993 concernant la lutte contre le nétrissemenl bactérien de la pomme de terre: Vu le code rural, et notamment ses articles 342 à 364 ; Vu le décret n° 93-1259 du 10 novembre 1993 relatif aux mesures de protection contre les organismes nuisibles aux végétaux, pro<luits végétaux et autres objets : Vu l'arrêté du 2 septembre 1993 relatif aux exigences sanitaires des végétaux. produits végétaux et autres objets. Arrête: Art. I". - La lutte contre l'agent du nétrissement bactérien de la pomme de terre, Clavihacler michif?anensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann el Kotthoff) Davis el al., dénommé ci après organisme au sens du présent arrêté, est obligatoire Art. 2. - Les agents chargés de la protection des végétaux. pro cèdent à des recherches systématiques de cet organisme sur des tubercules et, le cas échéant, sur des cultures de pnmmes de terre (Solanum luherosum L.) afin: a) De confirmer l'absence dudit organisme, ou, s'il esl détecté: h) De le localiser et de détenniner l'étendue de la contamination probable; c) De prévenir son apparition et sa propagation et de le combattre en vue de son éradication ; d) De rechercher son origine probable, Les recherches sont effectuées sur la base d'analyses d'échantil lons réalisées par les laboratoires de la protection des végétaux ou par les laboratoires placés sous son contrôle, selon la méthode décrite à l'annexe 1 <lu présent arrêté. Les échan1illons sont principalement constitués <le tubercule~ de pomme de terre prélevés en cours de stockage. Le cas échéant, ces analyses de tubercules peuvent être complé tées par la coupe et l'examen visuel d'autres échantillons de tuber cules ou encore par des analyses de plantes. Le nombre, rorigine. la stratification et le calendrier de prélève ment des échantillons sont établis tous les ans par la direction géné rale de l'alimentation (sous-direction de la protection des végétaux). Art. 3. - Toule apparition suspectée ou toute présence confirmée de rorganisme dans les pommes de terre en cours de végétation ou dans les tubercules récoltés, entreposés ou commercialisés, doil être immédiatement signalée au directeur régional de r agriculture et de la forêt (service régional de la protection des végétaux) ou au direc teur de l'agriculture et de la forêt (service de la protection des végé> taux) pour les départements d'outre-mer. Art. 4. - 1. - Lorsque des cas d'apparition suspectée ont été signalés, les tests sonl effectués par les lahoratoires de la protection des végétaux: ou dans les laboratoires placés sous son contrôle, selon la méthode décrite à rannex:e 1 du présent arrêté et conformément aux conditions énumérées au point I de l'annexe Il de ce même arrêté, afin de confirmer ou d' Infirmer ladite apparition. Si la présence de l'organisme est confirmée, les dispositions du poinl 2 de l'annexe Il précitée s'appliquent. IL - Dans l'attente de la confinnatioh ou de lïnfinnation d'une suspicion de contamination constituée par des symptômes visuels suggérant la présence de la maladie ou par une réaction positive au Lest d'immunonuorescence décrit à J'annexe I du présent arrêté ou encore par tout autre test approprié. les agents chargés de la protec tion des végétaux: : a) Interdisent le mouvement de tous les lots ou envois ayant donné lieu à des prélèvements d'échantillons, sauf !,OUS \eur contrôle el pour autan! qu'il ail été établi qu'il n'existe aucun risque idemi fiable de propagation de l'organisme; h) Prennent les mesures nécessaires pour déterminer l'origine de l'apparition suspectée; c) Introduisent des mesures de précautions supplémentaires appropriées, fondées sur le degré de risque estimé, en vue de préve nir toute propagation de l'organisme. Parmi ces mesures, peuvent faire l'objet de contrôle par les agents chargés de la protection des végétaux., les installations, matériels el véhicules à usage professionnel ayant eu un contact avec les tuher cules et plantes sur lesquels l'apparition de l'organisme est suspec~ tée. Art. 5. - 1. - Si les résultats des tests réalisés selon la méthode décrite à l'annexe I du présent arrêté confirment la présence de l'or ganisme dans un échantillon de· tubercules. de plantes ou de parties de plantes, les agents chargés de la protection des végétaux. compte tenu des systèmes particuliers de production, de commercialisation et de transformation utilisés: a) Déclarent contaminés les tubercules ou plantes, l'envoi et/ou le lot ainsi que le matériel, le véhicule, le récipient. l'entrepôt ou des parties de ceux-ci el tout autre objet, y compris les embaJlages, d'oit l'échantillon a été prélevé, mais aussi, le cas échéanl, le(s) lieu(x) de production ainsi que le(s) champ(s) où les tubercules ou plantes ont été récoltés : b) Déterminent, compte Lenu des dispositions du point I de l'annexe Ill du présent arrêté. l'étendue de la contamination pro bable par contact avant ou après la récolte avec des éléments décla rés contaminés ou par un lien avec ceux-ci dans le système de pro duction; cJ DélimiLenL la zone de contamination possible sur la base de la déclaratinn de contamination visée au point a. sur celle de l'étendue de la contamination probable visée au point h, et de la propagation possible de l'organisme compte tenu des dispositions du point 2 de l'annexe Ill du présent arrêté. Il, - Le ministère de l'agriculture et <le la pèche (direction géné rale de l'alimentation, sous-direction de la protection des végétaux.) notifie immédiatement aux autres Etats membres et à la commission. selon la procédure prévue au point 3 de J'annexe Ill du présent arrêté, toute contamination déclarée confonnément au paragraphe 1, point a ci-dessus, ainsi que les infonnations détaillées concernant la délimitation de la zone visée au paragraphe 5, point c, ci-dessus. Le Jétail de cette notificalinn est confidentiel. Art. 6. - Lorsque des tubercules ou des plantes ont été déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1. point a. du présent arrêté, les Lests visés à l'article 4, paragraphe 1, de l'arrêté sont effectués sur tous les stocks de pommes de terre qui possèdent une relation clonale avec ceux impliqué:. dans la contamination. Les tests sont effectués sur le nombre de tubercules ou de plantes nécessaires pour déterminer la source probable d'infection primaire el l'étendue probable de la contamination. A l'issue de ces tests, les disposition~ de l'article 5, paragraphe 1, du présent :mêlé s'appliquen\·. Art. 7. - 1. - Les tubercules ou les plantes déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1, point a, du présent arrêté he peuvent pas être plantés. Ils sont détruits ou éliminés sous le contrôle des agent.~ chargés de la protection des végétaux, conformé ment aux mesures prévues au point 1 de r annexe IV du présent arrêté, pour autant qu'il soit établi qu'il n'y a aucun risque identi tiahle de propagation de l'organisme. • 2022 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 5 février 1995 IL - Les tubercules ou plantes déclarés probablement contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe l, point h, du présent arrêté ne peuvent être plantés. Sans préjudice du résullal des tests visés à l'article 6 du présent arrêté, les stocks ayant une relation clonale avec eux sont utilisés ou éliminés de manière appropriée. conformément au point 2 de l'annexe IV du présent arrêté, sous le contrôle des agents chargés de la protection des végétaux m. - Le matériel, les véhicules. les récipients, les enrrepôts ou des parties de ceux-ci, ainsi que tout autre objet, y compris les emballages, déclarés contaminés en vertu de l'article 5. paragraphe 1, point a, du présent arrêté. ou considérés comme probablement contaminés en vertu du paragraphe 1. point h, de l'article 5, doivenl être détruits ou nettoyés et désinfectés selon les méthodes appro priées visées au point 3 de l'annexe IV du présent arrêté Après désinfection, ces objets ne sont plus considérés comme contal,llinés. IV. - Dans la zone de contamination possible délimitée en vertu de l'article 5, paragraphe 1. point c. du présent arrêté, sans préjudice des mesures mises en œuvre en application des paragraphes 1, 2 et 3. les agents chargés de la protection des végétaux ordonnent la mise en œuvre des mesures de protection et de prévention décrites au point 4 de 1 · annexe IV du présent arrêté. Art. 8. ~ Les tubercules destinés à la plantation doivent satisfaire aux exigences de l'arrêté du 2 septembre 1993 et provenir directe ment d'un matériel qui a été obtenu dans le cadre d'un programme établi par le ministère de l'agriculture et de la pêche (direction géné rale de ralîmenlation, sous-direction de la protection des végétaux) et qui a été déclaré indemne de l'organisme à la suite de tests effec tués par les laboratoires de la protection des végétaux ou des labora toires placés sous son contrôle, selon la méthode décrite à l'annexe I du présent arrêté Dans le cas où la contamination affecte la production de tuber cules destinés à la plantation, des tests doivent être effectués sur les plantes de la sélection clonale initiale. Dans les autres cas. ces tests sont effectués soit sur les plantes de sélection clonale initiale, soit sur des échantillons représentatifs des tubercules destinés à la plantation de base ou de générations anté rieures. Art. 9. - La détention et la manipulation de l'organisme est interdite. Art. 10. - Des dérogations aux articles 6, 7 et 9 du présent arrêté peuvent être accordées par le ministre de l'agriculture et de la pêche à des fins expérimentales ou scientifiques et pour des travaux de sélection variétale. dans la mesure où ces dérogations ne nuisent pas aux mesures de lutte contre l'organisme et ne créent aucun risque de propagation de ce dernier. Art. l 1. - Des mesures complémentaires ou plus rigoureuses pour lutter contre l'organisme ou pour prévenir de sa propagation peuvent être prises en application de !"article 352 du code rural. Art. 12. - L'arrêté du 20 février 1981 relatif à la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre est abrogé. Art 13. - Le directeur général de l'alimentation est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française. Fait à Paris, le 6 décembre 1994. Pour le ministre et par délégation : Le directeur général de /'alimentation. P. Gu~RIN ANNEXE MÉTHODE PERMETTANT DE DÉTECTER ET DE DIAGNOSTIQUER LA PRÉSENCE DE LA BACTÉRIE RESPONSABLE DU FLÉTRISSE MENT BACTÉRIEN DE LA POMME DE TERRE, CI.AVTBACTER MlCHTGANENSTS (SMITH) DA VIS ET AL. SPP. SEPEDONTCUS (SPIECKERMANN ET KOTIHOFF) DAVIS ET AL. DANS LES LOTS DE TUBERCULES DE POMMES DE TERRE 1. Prélèvement des échantillons eu talon 1.1. Laver 200 tubercules à l'eau courante et peler le talon de chaque tubercule en utilisant un scalpel ou un éplucheur à pommes de terre régulièrement désinfecté ; la désinfection peut s'effectuer en trempant l'éplucheur dans de l'éthanol à 70 p. 100 avant de le passer à la flamme. I .2 Prélever soigneusement des cônes de tissu au talon avec un scalpel ou un éplucheur à pommes de terre. Prélever aussi peu que possible de tissu non vasculaire. Après leur prélèvement, les cônes doivent être traités dans les 24 heures (point 3) ou conservés à - 20 "C'. pendant un maximum de deux semaines. 2. Recherche visuelle des symptômes du Oétrissement bactérien Après avoir prélevé les échantillons, couper transversalement chaque tubercule et rechercher la présence de symptômes du flé trissement bactérien. Presser les tubercules et regarder si le tissu vasculaire laisse exsu der des tissus décomposés. Les premiers symptômes sont, surtout près du talon, un aspect légèrement vitreux ou translucide du tissu, sans ramollissement autour du système vasculaire. L'anneau vasculaire peut présenter. au talon. une couleur légèrement plus foncée que la normale. Les pre miers symptômes aisément identifiables sont une coloration jaunâtre de l'anneau vasculaire et le fait que, lorsqu·on presse doucement le tubercule. des colonnes de matière ressemblant à du fromage sortent des vaisseaux, Cet exsudat contient des millions de bactéries. Le brunissement du tissu vasculaire peut apparaître à ce stade Dans un premier temps. ces symptômes peuvent n'être présents que sur une partie de l'anneau, pas nécessairement proche du talon. avant de se propager graduellement à l'ensemble de l'anneau. Au fur et à mesure de la progression de l'infection, les tissus vasculaires sont détruits. Le cortex extérieur peut se séparer du cortex intérieur. Aux stades avancés de l'infection. des fissures, aux bords souvent rouge brun, apparaissent à la surface du tubercule. Une invasion fongique ou bactérienne secondaire peut masquer les symptômes et il peut être malaisé. voire impossible. de distinguer les symptômes avancés du flétrissement bactérien de ceux d'autres pounitures des pommes de terre. 3. Préparation d'échantillons pour la coloration de Grem, le test d'immunonuorescence et le test sur aubergines 3.1 Homogénéiser les cônes provenant du talon dans un diluant connu pour ne pas être toxique pour le C. m. subsp. sepedoni cus (par exemple : un tampon au phosphate 0,05 M [TP] de pH 7,0) à une température inférieure à 30°C jusqu'au moment où l'homogénéisation complète vient tout juste d'êrre obtenue; il est conseillé d'ajouter un agent dispersant non toxique et il peut être nécessaire d'ajouter un agent antimousse non toxique (appendices l et 2). 11 y a lieu d'éviter tout broyage excessif 3.2. Extraire la bactérie du liquide homogénéisé par l'une des méthodes suivantes ( 1) : A. - a) Centrifuger à 180 g au maximum pendant IO minutes; b) Centrifuger le liquide surnageant à au moins 4 000 g pen dant IO minutes; décanter, puis éliminer le liquide surnageant; B. - a) Laisser reposer pendanc trente minutes le broyat pour permettre aux débris tissulaires de se déposer; décanter le liquide surnageant sans remuer le sédiment ; h) Filtrer le liquide surnageant au moyen d'un papier filtre (Whatman n° 1) placé dan,s un filtre en verre fritté (n° 2 = 40-IO0 µm) en utilisant une trompe à eau: recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger ; laver le filtre avec du tampon au phosphate stérile jusqu'à obtention d'une quantité maximale de filtrat de 35 ml ; c) Centrifuger le filtrat à au moins 4 000 g pendant vingt minutes. 3.3. Remettre le culot (extrait concentré) en suspension dans un tampon au phosphate 0,01 M stérile de pH 7.2 (appendice 2) jusqu'à obtention d'environ 1 ml d'extrait concentré. Le diviser en deux parties égales et en conserver une à titre de référence en la congelant à - 20 °C (2) ou en la lyophilisant. Diviser l'autre moitié en deux parties égales destinées, l'une, au test d'immunofluorescence et à la réaction de Gram, et l'autre au test sur aubergines. 3-4. Afin d'éviter toutes contaminations, il est impératif de traiter séparément les échantillons et les témoins positifs de C. m. subsp. sepedonirns, aussi bien pour les tests d'immuno fluorescence que pour les tests sur aubergines. 5 février 1995 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 2023 4. Réaction de Gram 4, I Préparer des colorations de Gram pour toutes les dilutions de l'extrait concentré (point 5.2.l) et pour tout tubercule coupé (point 2) présentant un aspect vitreux, une pourriture ou tout autre symptôme suspect. Les échantillons doivent être prélevés à la limite des tissus malades. 4,2 Préparer des colorations de Gram pour des cultures connues de C. m. subsp. sepedonicus et, si possible, pour des tissus naturellement infectés (point 5.1). 4.3. Déterminer quels échantillons contiennent des cellules Gram posilives coryneformes typiques. En général, les cellules de C. m. subsp. sepedonicus ont une longueur de 0,8 à 1,2 µm et une largeur de 0,4 à 0,6 µm. Une procédure appropriée de coloration de Gram figure à l'appendice 3. Les échantillons préparés à partir de tissu naturellement infecté ou de cultures récemment isolées présentent souvent une prédominance de bâtonnets coccoïdes qui sont généralement légèrement plus petits que les cellules provenant de cultures sur gélose plus anciennes. Da.ns la plupart des milieux de culture. les cellules de C. m subsp. sepedonicus sont des bâtonnets pléomorphes corynemorphes qui peuvent réagir diversement à la coloration de Gram. Les cellules sont isolées, en paires avec des «coudes)) caractéristiques de la division de~ corynebacté ries ou, occasionnellement, en groupes irrégulier~ souvent qua lifiés de palissades et de caractères chinois. 5. Tests d'immunofiuorescence 5.1. Utiliser un antisérum d'une souche connue C. 1'11. subsp. sepe don;cus ATCC 33113 (NCPPB 2137) ou NCPPB 2140. Il devra avoir un titre d'iminunofluorescence d'au moins 1 : 600. Inclure du tampon au phosphate sur la lame de test à titre de témoin, pour détenniner si l'immunoglobuline anti-lapin conju guée avec l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) se combine non spécifiquement avec les cellules bactériennes. Le C. m. subsp. sepedo11icus [ATCC 33113 (NCPPB 2137). NCPPB 2140] devrait être utilisé comme témoin antigène homologue sur une lame séparée. Du tissu naturellement infecté (conservé par lyophilisation ou congélation à - 20 °C) devrait. dans la mesure du possible, être utilisé à titre de témoin simi laire sur la même lame (figure 2). 5 2 Procédure. 5.2.1. Préparer trois dilutions successives au dixième (10 1, 102 et 103) de l'extrait concentré final dans l'eau distillée (figure 1 ). 5.2.2. Déposer à la pipette dans les puits d'une lame multifenêtre un volume standard suffisant pour couvrir le puits ( environ 25 µ.I) de chaque dilution de l'extrait concentré ou de la suspension de C. m. subsp sepedonicus (environ )(Yi cellules/ml), comme il est indiqué sur la figure l. Figure J Lame de l'échantillon et du puits témoin au tampon phosphate E ,crn,t con,,;c-ntrc 1 :10 1:100 1:1000 00000 00000 ' Tampon Anti~rum .à la dilution choi1ic '" double Figure 2 Lame de témoin positif 00000 C.m \uh,p. s,r,,dmfll IIJ (,n.,irnn lll"lmll 00000 Eiur:1i1 dc p-,mmc-s de- IC'rrc infc-ct'n narurc-llc-mffll ' 1:200 ' 1:400 ' 1:800 ' ' 1:1600 1:3200 Dilu11nn de- 1"1nti~rum 5.2.3. Laisser sécher à l'air à une température d'environ 37 "C: et fixer avec de l'éthanol à 95 p. 100 ou en passant à la flamme. 5.2-4 Couvrir les puits appropriés, comme indiqué sur la figure 1, avec de l'antisérum de C. m. subsp. sepedonicus dilué dans les proportions recommandées (dilution de travail) dans un tampon au phosphate 0,01 M de pH 7,2 (appendice 2) (utiliser un tam pon au phosphate à titre de témoin pour le FITC). La dilution de travail de l'antisérum devrait être approximativement égale à la moitié du litre d'immunofluorescence. S'il faut inclure d'autres dilutions de l'antisérum, il y a lieu de préparer des lamer> séparées pour chaque dilution à utiliser, 5.2.5. Laisser incuber trente minutes eri chambre humide à tempéra ture ambiante. 5.2.6 Rincer soigneusement avec le tampon au phosphate 0,01 M de pH 7 ,2. Faire trois lavages successifs de cinq minutes avec le tampon de phosphate 0,01 M de pH 7,2. Changer la solution de lavage à chaque fois. 5.2.7. Enlever soigneusement toute moisissure excessive. 5.2.8. Couvrir chaque puits avec du conjugué FITC à la même dilu tion utilisée lors du titrage et laisser incuber trente minutes en chambre noire humide à température ambiante. 5.2 9 Rincer et laver comme précédemment 5.2.10. Appliquer environ 5 à IO µ,I de solution de glycérine tam ponnée au phosphate 0,1 M de pH 7,6 (ou un support simîlaîre d'un pH d'au moins 7,6) sur chaque puits et recouvrir d'une lamelle couvre-objets (appendice 2). 5.2.11. Examiner avec un microscope équipé d'une source lumi neuse épifluorescente et de filtres adaptés pour travailler avec le FITC. Un grossissement de 400 à l 000 fois est approprié. Balayer chaque puits selon deux diamètres perpendiculaires et en suivant le pourtour. Rechercher les cellules fluorescentes dans les témoins posi tifs et titrer. Rechercher les cellules fluorescentes dans le contrôle tampon FITC et, s'il n'y en a pas, passer aux puits échantillons. Déterminer sur un minimum de dix champs microscopiques le nombre moyen de cellules fluorescentes mor phologiquement typiques par champ et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d'extrait concentré non dilué (appen dice 4). Il existe un certain nombre de problèmes inhérents aux tests d'immunofluorescence : . - des populations de bactéries saprophytes peuvent montrer des cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et provoquer des réactions croisées. D'autres peuvent être similaires par la taille et la morphologie au C. m. subsp. sepedonicus. Seules les cellules fluorescentes dont la taille et la morphologie sont typiques doivent être prises en considération. En raison de la possibilité de réactions croisées, les échantillons réagissant positivement au test d'immuno fluorescence devraient être une nouvelle fois soumis au test, avec un antisérum différent. la limite technique de détection de cette méthode se situe entre l03 et 104 cellules par millilitre d'extrait concentré non dilué. Les échantillons pour lesquels le décompte de cellules fluorescentes typiques est à la limite de détection sont généralement indemnes de C. m. subsp, sepedonicus mais peuvent être soumis au test sur aubergines. Le test d'immunofluorescence est négatif pour tous les échantillons dans lesquels on n'a trouvé aucune cellule 2024 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 5 février 1995 fluorescente morphologiquement typique. On considère que ces échantillons ne sont « pas contaminés )) par le C. m. subsp. sepedonicus. Il n'est pas nécessaire de les soumettre au test sur auber gines. Le test d'immunofluorescence est positif pour tous les échan tillons dans lesquels des cellules fluorescentes morpholo giquement typiques sont décé1ées. On considère que les échantillons pour lesquels le test d'im munofluorescence est positif avec les deux antisérums sont « potentiellement contaminés» par le C. m.subsp. sepedoni cus. Il est nécessaire d'effectuer un tesl sur aubergines pour tout échantillon considéré comme potentiellement contaminé. 6. Test sur aubergines Pour les détails de la culture, voir l'appendice 5. 6.1. Répartir l'extrait concentré obtenu au point 3.3 entre au moins vingt-cinq aubergines au stade trois feuilles (appendice 5) par une des méthodes e:,i;posées ci-dessous (points 6.2, 6.3 ou 6.4). 6.2. Inoculation par incision l. 6.2.1 Poser chaque pot horizontalement sur un support (un bloc de mousse de polystyrène de la surface duquel on a retiré un mor ceau de 5 cm de profondeur, 10 cm de largeur et 15 cm de lon gueur (figure 3) convient pour un pot de 10 cm). Pour chaque échantillon testé, une bande de feuille d'aluminium stérile doit être placée entre la tige el le bloc de mousse de polystyrène. La plante peut être tenue en place par un élastique entourant le bloc. 6.2.2. Avec un scalpel, pratiquer entre les cotylédons et la première feuille une incision longitudinale ou légèrement diagonale d'une longueur de 0,5 à I centimètre et d'une profondeur égale approximativement aux trois quarts du diamètre de la tige .. 6.2.3. Maintenir ouverte l'incision avec la pointe de la lame du scalpel et la badigeonner d'inoculum avec un pinceau trempé dans l'extrait concentré. RéPartir l'ex.trait concentré entre les aubergines. 6.2.4. Refenner l'incision avec de la vaseline en utilisant une seringue d'une capacité de 2 millilitres. Figure 3 6.3. Inoculation par incision li. 6.3.1 Tenir la plante entre deux doigts et déposer à la pipette une goutte (environ 5 à 10 µ,) de l'e:urait concentré en suspension sur la tige entre les cotylédons et la première feuille. 6.3.2. Avec un scalpel stérile, pratiquer, en partant de la goutte d'extrait concentré une incision diagonale (à un angle d'envi ron 5°) d'une longueur de I centimètre el d'une profondeur égale approximativement aux dem: tiers de l'épaisseur de la tige. 6.3.3. Refenner l'incision avec de la vaseline stérile en .utilisant une seringue. 6.4. Inoculation par injection. 6.4.l. Avant l'inoculation, ne pas arroser les aubergines pendant une journée afin de réduire la pression de turgescence. 6.4.2. Avec une seringue munie d'une aiguille hypodennique (pas moins de 23G), pratiquer l'inoculation dans les tiges d'auber gine juste au-dessus des cotylédons. Répartir l'exlrait concentré entre les aubergines. 6.5. Par la même méthode d'inoculation (points 6.2, 6.3 ou 6.4), inoculer vingt-cinq plantes avec une culture connue de C. m. subsp. sepedonicus et, si possible, avec de l'extrait de tubercule naturellement infecté (point 5.1). 6.6. Par la même méthode d'inoculation (points 6.2, 6.3 ou 6.4), inoculer vingt-cinq plantes avec un tampon au phosphate 0,05 M stérile. 6. 7. Laisser incuber les plantes quarante jours dans des conditions appropriées (appendice 5). Après les huit premiers jours, e xa miner régulièrement pour déceler l'apparition de symptômes. Compter combien de plantes présentent des symptômes. Le C. m. subsp. sepedonicus provoque chez l'aubergine un flé trissement des feuilles qui peut commencer par une flaccidité au bord des feuilles ou entre les nervures. Au départ, le tissu flétri peut prendre une couleur vert foncé ou être tacheté, mais il pâlit avant de se nécroser. Les flétrissures entre les nervures ont souvent un aspect graisseux et gorgé d'eau. Le lissu nécrosé présente souvent un bord jaune vif. Les plantes ne meurent pas nécessairement. Plus les symptômes tardent à apparaître, plus les chances de survie sont élevées. Les plantes peuvent sunnonter l'infection. Les jeunes aubergines sensibles réagissent beaucoup plus à de faibles populations de C. m. subsp. sepedonicus que les plantes plus âgées, ce qui explique qu'il y a lieu d'utiliser des plantes qui sont au stade 3 feuilles ou vont l'atteindre. Des flétrissements peuvent également être provoqués par des populations d'autres bactéries ou de champignons présentes dans l'extrait concentré de lissu tuberculaire. 11 s'agit par exemple de Erwinia carotovora subsp. carotovora et de E. caro tovora subsp. atroseprica, de Phoma exigua var. foveata, ainsi que de fortes populations de bactéries saprophytes. Ces flé trissements se distinguent de ceux causés par le C. m. subsp. sepedonicus car des feuilles entières ou des plantes entières fanent rapidement. 6.8. Préparer une coloration de Gram (point 4) pour tous les lots d'aubergines présentant des symptômes, en utilisant des sec tions de tissu provenant des feuilles flétries ou de la tige des plantes et procéder à l'isolement sur un milieu nutritif appro prié (point 7). Désinfecter la surface des feuilles el des tiges d'aubergine en les frottant avec de l'éthanol à 70 p. 100. 6.9. Dans certaines circonstances, surtout si les conditions de culture ne sont pas optimales, du C. m. subsp. sepedonicus peut être présent dans les aubergines à l'état d'infection latente même après une incubation de quarante jours. Une telle infec tion peut entraîner chez les plantes inoculées un retard de crois sance el un manque de vigueur. Si le test d'immunofluores cence est considéré comme positif, on peut es1imer qu'il y a lieu de poursuivre l'analyse. Il est dès lors essentiel de compa rer le taux de croissance de toutes les plantes du test sur auber gines avec les témoins inoculés avec un tampon au phosphate 0,05 M stérile el de surveiller les conditions environnementales dans la serre. En cas de poursuite de l'expérimentation, il est recommandé de procéder comme indiqué ci-après. 6.9.1. Couper les tiges au-dessus du point d'inoculation et enlever les feuilles. · 6.9.2. Broyer les tiges dans un tampon au phosphate 0,05 M à pH 7 ,0, comme indiqué aux points 3.1 et 3.2. 6.9.3. Utiliser la moitié de l'extrait concentré pour une réaction de Gram (point 4) et un test d'immunofluorescence (point 5). 6.9.4. Utiliser l'autre moitié pour effectuer un nouveau test sur aubergines (point 6) si la réaction à la coloration de Gram et/ou au test d' immunofluorescence est positive. Utiliser comme témoins une culture connue de C. m. subsp. sepedoniciu et un tampon au phosphate 0,05 M stérile. Si des symptômes n'appa raissent pas lors de ces tests complémentaires, on considère que l'échantillon est négatif. 7. Isolement du C. m. subsp. sepedonicus· Le diagnostic ne peut être confinné que par l'isolement et l'iden tification (point 8) du C. m. subsp . . 'iepedonicus. Bien qu'il s'agisse d'un organisme difficile à isoler, il est possible de le faire à partir de tissu présentant des symptômes d'infection. Toutefois, des bacté ries saprophytes à croissance rapide peuvent l'étouffer et, dès lors, il n'est pas recommandé de l'isoler directement à partir de l'extrait concentré de tissu tuberculaire (obtenu au point 3.3). Les aubergines représentent un excellent milieu sélectif de multiplication pour la culture de C. m. subsp. sepedonicus et permetlenl donc de réaliser un excellent test de confinnation sur hôte. Les isolements doivent être pratiqués sur tous les tubercules de pommes de terre et toutes les aubergines présenlant des symptômes 5 février 1995 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 2025 (points 4 et 6). Le cas échéant, les tiges d'aubergines doivent être broyées selon la méthode décrite aux points 3 et 6.9. 7. I. Purifier par un nouvel ensemencement en stries avec les sus pensions un des milieux suivants (les fonnules figurent à l'appendice 6): gélose nutritive avec dextrose (uniquement pour les repi quages); gélose avec levure, peptone et glucose ; gélose nutritive avec levure et dextrose ; gélose avec extraits de levure et sels minéraux. Laisser incuber jusqu'à 20 jours à 21 °C. Le C. m. subsp. sepedonicus a une croissance lente et produit généralement en dix jours des colonies de la taille et de la forme d'une tête d'épingle, dê couleur crème, et convexes. Ensemencer à nouveau en stries pour obtenir des cultures pures. Les taux de croissance sont meilleurs pour les repiquages. Les colonies typiques sont de couleur blanc crème ou iv oire, arrondies, lisses, dressées, présentant un dôme convexe, de consistance muqueuse à fluide, avec des bords nets ou réguliers et d'un diamètre généralement de I à 3 millimètres. ldentificarion, Beaucoup de bactéries corynefonnes Gram positives dont les colonies présentent des caractéristiques similaires à celle de C. m. subsp. sepedonicus peuvent être isolées à partir de pommes de terre ou d'aubergines saines ou malades. Dans ce contexte, il est possible d'identifier C. m. subsp. sepedonicus à l'aide des tests suivants : test dlmmunofluorescence (point 5.1); test sur aubergines ; tests nutritionnels et physiologiques (appendice 7) : test d'oxydation/fermentation (0/F); le.~I de l'oxydase : croissance à 37 °C ; production d'uréase ; hydrolyse de l'esculine; hydrolyse de l'amidon; tolérance d'une solution de chlorure de sodium à 7 p. 100; test de l'indole ; test de la catalase ; production de H1S ; utilisation du citrate ; hydrolyse de la gélatine ; production d'acide à partir de glycérol, de lactose, de rhamnose et de ~alicinoside ; coloration de Gram. li faut inclure dans chaque test une souche connue de C. m. subsp. sepedonicus à titre de témoin. Les tests nutritionnels et physiologiques doivent être effectués sur de l'inoculat prove nant de repiquages sur gélose nutritive. Les comparaisons mor phologiques doivent se faire à partir de cultures sur gélose nutritive avec dextrose. Pour le test d'immunonuorescence, les populations de cel lules doivent être ajustées à 106 ce11ules/mîllilitre. Le titre d'im munofluorescence doit être similaire à celui de la culture connue de C. m. subsp. sepedonicus. Pour le test sur aubergines, les populations de cellules doivent être amenées à environ 107 cellules/millilitre. Ces Lests doivent se faire sur dix plantes pour chacun des organismes à tester ; on utilisera également ici une culture connue de C. m. subsp. sepedonicus el de l'eau stérile à titre de témoins. Avec des cultures pures, un flétrissement typique devrait apparaître dans les vingt jours, mais les plantes ne présentant pas de symptômes à l'issue de cette période devraient continuer à incuber pendant un total de trente jours à des températures favorables à la croissance Jes aubergines mais ne dépassant pas 30 "C (appendice 5). Si des symptômes ne sont pas apparus après trente jours, on ne peut pas confinner qu'il s'agisse d'une culture d'une forme pathogène de C. m. subsp. sepedonicu.'i. Tes/ C. m. subsp. sepedonicus Test d'oxydation/fermentation (O/F) . inerte ou faiblement oxydant Test de l'oxydase. Test de la catalase.. + Réduction des nitrates. Activité uréasique. Production de H1S. Production d'indole. • Utilisation du citrate ... Hydrolyse de l'amidon.. - ou faible Croissance à 37 °C . Croissance dans du NaCI à 7 p. 100 .. Hydrolyse de la gélatine .... Hydrolyse de l'esculine... + Acide à partir de : glycérol .. lactose.... - ou faible rhamnose. salicinoside .. Appendice l FORMULE OU LIQUIDE D'HOMOGÉNÉISATION RECOMMANDÉ PAR LELLIOTI ET SELLAR, 1976 Composé DC silicone antimousse MS A (Hopkins et Williams Ltd, Cat n° 9964-25, Chadwell Heath, Essex, Angleterre): IO ml. Flocons de Lubrol W (ICI Ltd) : 0,5 g. Pyrophosphate tétrasodique : 1 g. Tampon au phosphate 0,05 M de pH 7 ,0 (appendice 2) : 1 1. Appendice 2 TAMPONS Tampon au phosphate 0,05 M à pH 7 ,0 : Ce tampon peut être utilisé pour l'homogénéisation de tissu tuber culaire (point 2.1 ). Na.,HPO, : 4,26 g. KH1P04 : 2, 72 ,g. NaCI: 8,0 g. Eau distillée jusqu'à 1 1. Tampon au phosphate 0,01 M à pH 7,2 : Ce tampon est utilisé pour diluer les antisérums et laver les lames des tests d' immunofluorescence. Na.,HPO, 12 H,0: 2,7 g. NaH2P04 2 H20: 0,4 g. NaCI: 8,0 g. Eau distillée jusqu'à 1 1. Solution de glycérine tamponnée au phosphate 0,1 M à pH 7,6: Ce tampon est utilisé comme support pour renforcer la fluores cence dans le test d'immunofluorescence. Na.,HPO, 12 H,0 : 3,2 g NaH 2P04 2 HP: 0,15 g. GI ycérol : 50 ml. Eau distillée: 100 ml. Appendice 3 PROCÉDURE POUR LA RÉACTION DE GRAM (MODIFICATION DE HUCKER) (OOETSCH, 198() Solution de violet cristallisé : Dissoudre 2 g de violet cristallisé dans 20. ml d'éthanol à 95 %. Dissoudre 0,8 ,g d'oxalate d'ammonium dans 80 ml d'eau distil lée. Mélanger les deux solutions. Soluté iodo-ioduré de Lugol : Iode: 1 g. Iodure de potassiuin : 2 g. Eaù distillée : 300 ml. Broyer les solides ensemble à l'aide d'un pilon et d'un mortier. Ajouter à l'eau et mélanger dans un récipient fenné pour dissoudre. Solution colorante de safranine : Solulion mère. Safranine 0 ; 2,5 g. Ethanol 95 % : 100 ml. Mélanger et stocker. Diluer à 1: 10 pour obtenir une solution de travail. 2026 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 5 février 1995 Procédure de coloration : 1. Préparer les frottis, les sécher à l'air et les fixer à la chaleur. 2 .. Plonger la lame dans la solution de cristal violet pendant mmute. 3. Laver rapidement- à l'eau courante. 4. Plonger dans le soluté iodo-ioduré de Lugol pendant I minute. 5. Laver à l'eau courante et sécher au buvard. 6. Décolorer en ajoutant gouue à goultc de l'éthanol à 95 % jus qu'à ce qu'il ne modifie plus la couleur ou en plongeant dans l'étha nol pendant 30 secondes tout en agitant légèremenl. 7. Laver à l'eau coutante et sécher au buvard. 8. Plonger dans la solution de safranine pendant 10 secondes. 9. Laver à l'eau courante et sécher au buvard. Les bactéries Gram positives ont une couleur violet-bleu ; les bac léries Gram négatives ont une couleur rose-rouge. Appendice 4 DÉTERMINATION DE LA POPULATION DE CELLULES POSITTVES AU TEST D'fMMUNOFLUORESCENCE Superficie (S) d'un puits d'une lame multipuits: 1t 02 4 où D = diamètre du puits Superficie(s) du champ de l'objectif: nd' 4 où d = diamètre du champ (1) (2) Calculer le diamètre du champ (d) par mesure directe ou en appli quant les fonnules suivantes : 1ti2 s = --·· G2 K2 X 4 (3) où 1 = coefficient du champ (dépend du type d'oculaire et varie deSà24). coefficient du tube (1 ou 1,25), où K oû G grossissement (100 fois, 40 fois, etc ) de l'objectif. [4s De (2), on tire : d = V 7( 1ti2 De (3), on tire: <l 4 X a2 K 2 x 4 n GK Compter le nombre de cellules fluorescenles typiques champ (c). Calculer le nombre puils (C) de cellules fluorescenles typiques cS C = . (4) par par Calculer le nombre de cellules fluorescentes typiques par millililre d'extrait concenlré (N): 1 000 N=Cx xP y où y volume d'extrait concentré sur le puits, où F facteur de dilution de l'extrait concentré. Appendice 5 CULTIJRE DES AUBERGINES &mer des graines d'aubergines (Solanum melongena cv. Black Beauty) dans une terre de semis pasteurisée. Repiquer les plantules dans de la terre de rempotage pasteurisée lorsque les cotylédons sont entièrement développés (10 à 14 jours). Utiliser des aubergines au stade 3 feuilles lorsque au moins 2, mais pas plus de 3 feuilles sont entièremenl ouvertes (élalées). Les aubergines doivent être cultivées en serre dans les conditions suivantes: longueur du jour : 14 heures ou durée naturelle de la journée si elle est supérieure ; température diurne: 21 à 24 '>C; température nocturne : 15 ,,C Nota. - Le C m. subsp. sepedonicus ne .~e développera pa~ à des tempé ratures supérieures à 30 ,,c, Si la température nocturne ne descend pas à 15 •C, des nécroses argentées peuvent survenir. L'application d'un insecticide approprié pennel de prévenir les dégâts aux racines causés par les larves de sciarides. Les auhergines de la variété Black Beauty peuvent être commandées auprès de 1. AB Hammenhôgs Fro, 270 50 HammcnbOg (Suède). 2, Hurst Seeds Ltd, Avenue Road, Witham, Es.~ex CM8 2DX (Angle terre). 3. Asgro ftalia SpA, Corso Lodi 23, Milan. 4. Küppcr, Mitteldeutsche Sarnen GmbH, Hes.~enring 22, D-37269 Esch wcge. Appendice 6 MILIEUX À UTfUSER POUR LA CRŒSSANCE ET L'fSOLEMENT DE CL.A VJBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDON!CUS Gélose nutritive : La gélose nutritive de Difco Bacto dans de l'eau distillée à la concentration indiquée par le fabricant. Stériliser à l'autoclave à 12 l ,,C pendant I S m1nutes Gi!lose nutritive avec dextrose : La gélose nutritive de Difco Bacto contenant 1 % d-glucose (monohydraté). Stériliser à l'autoclave à 115 "C pendant 20 minutes G~lose avec levure, peptone et glucose : Extrait de levure de Difco Bacto (n° 0127) : 5 g. Peptone de Difco Bacto (n° 0118): 5 g. D-glucosc (monohydraté): JO g. Gélose purifiée de Difco Bacto (n° 0560): 15 g. Eau distillée : 1 L Stériliser par demi-litre à l'autoclave à 115 °C pendant 20 minutes. Milieu de culture avec extrait de levure el sels minéraux : Extrait de levure de Difco Bacto : 2,0 g. D-glucose (monohydralé): 2,5 g. K,HPO,: 0,25 g KH,PO, : 0,25 g MgSO,. 7H,0 : 0, 1 g. MnSO,. H,O : 0.015 g NaCl: 0,05 g. FeSO,. 7H,O : 0,005 g. Gélose purifiée de Difco Bacto : 18 g. Eau distillée : 1 1. Stériliser par demi-litre à l'autoclave à 115 "C pendant 20 minutes. Appendice 7 TESTS NUTRITfONNELS ET PHYSIOLOGfQUES D'fDENTIFICATION DE ClA VIBACTER MJCHIGANENSJS SUBSP. SEPEDONJCUS Tous les milieux doivent incuber à 21 "C et êlre examinés après 6 jours. Si on ne décèle aucune croissance, laisser incuber jusqu'à 20 jours. Test d'oxydation et de fermentation (0/F) (Hugh et Leifson. 1953). Milieu de cu1ture: KCI: 0,2 g. MgSO,. 7H,O : 0,2 g. NH,H,P04 : 1,0 g. Pepto~e de Difco Bacto : 1.0 g. Gélose purifiée de Difco Bactn: 3,0 g. D-g1ucosc (monohydraté): 10,0 g. Bleu de bromothymol : 0,03 g. Eau di.~tillée : 1 1. Mélanger el ajuster le pH à 7,0-7,2 avec du IN KOH. Répartir dans les tubes à culture en pyrex de 16 mm x 100 mm (d'une capacité de 12 ml). à raison de 5 et 10 ml par tube. Slériliser à l'autoclave à 115 "C pendant 10 minutes. Inoculer chaque culture par piqûre profonde dans des tubes de 5 et 10 ml. Ajouter aseptiqucmenl I à 2 ml de paraffine liquide stérile aux tubes de 10 ml. Laisser incuber. 5 février 1995 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 2027 Réaction po.1·ifiw TUBE COULEUR INTERPRÊTATION Ouvert .. Jaune Fermentation. Fermé ... Jaune Ouvert Jaune Fermé ... Bleu-vert Oxydation. Ouvert .. Verdâtre Oxydation ou inerte. Fermé Bleu-vert Test de l'oxydase (Kovacs. 1956). Réactif de Knvacs pour tester de l"oxyJase: Solution aqueuse à l % de dihydrochlorure de tétraméthyle para phénylènediamine ŒDH n" 30386) dans de l'eau distillée Le réactif doil être fraîchement préparé en volumes de 1 ml ou peut être stocké dans une houteille en verre brun à 5 "C pendant I à 4 semaines Dans une boîte de Petri propre, mettre une goutte de réactir sur un papier filtre. A l'aide d"une anse en platine, frotter immédiate ment sur celui-ci un peu Je culture du test provenant Je la gélose nutritive Réacrion po.ütive: apparition d'une coloration pourpre dans les 10 secondes. Les cultures pour lesquelles la coloration apparait dans un délai de 10 à 30 secondes sont considérées comme faihlement positives. Notr1. - Il est essentiel d'utiliser une anse en platine cl des -:u\tures faites sur gélose nutritive. car des traces de fer ou des teneurs élevée.~ en sucre dans k mihcu de culture peuvent donner des résultats faussement positif~ Production d'acide à pal'tir de lactose, de rhamnose, de salici noside et de glycérol : Préparer du milieu de culture pour test d'oxydation et de fer mentation de Hugh et Lcifson sans glucose Répartir Jans des tubes à raison Je 5 ml par tube. Stériliser à l'autoclave à 115 "C pendant 10 minutes. A la base fondue portée à 45 ~c, ajouter asepliquemenl 0,5 ml de solution aqueuse ù 10 °k de glycérol. de lactose, de rham nose ou de salicinm,ide, stérilisée par filtration. Mélanger soigneuse ment. Réaction positive: la coloration virant du bleu-vert au jaune indique la production cr acide. Test de la catalase : Placer une goutte de peroxyde d'hydrogène 00 volumes) sur une lame propre et ajouter le contenu d"une anse <le platine de la culture, en émulsionnant. Réaction po,l"itive: la production de huiles d'oxygène dans la goutte témoigne de la présence Je catalase. Activité de l'éduction des nitrates el dénitrilication (Brad bury. 1970). Milieu de culture: KNO, (exempt de nitrites) · 1 g. Extrait de levure de Difco Bach): g. KJ1PO,: 5 g Eau distillée· 1 1. Répartir dans des bouteilles <l'une capacité de 20 ml. à raison de 10 ml par hnmeille Stériliser à l'autoclave i1 121 "C' pendant 15 minutes. Réactif A: H,SO4 • 8 g Acide acétique 5N · 1 1. Réactif B : Naphtylamine : 5 g. Acide acétique SN: 1 l. Inoculer le milieu nitrate en douhle. Tester après 10 el 20 jours, en ajoutant une goutte de soluté iodo-ioduré de Lugo!, 0,5 ml de réactir A et 0.5 ml Je réactif B. Si le milieu ne devient pas rou gefüre, ajouter environ 50 mg de poudre Je zinc. Observer la cou leur RÉACTION POSITIVE Pas de réaction du nitrate .. Réduction du nitrate en nitrite !unique ment réductase des nitrates) .. COULEUR Stade 1 Stade 2 Incolore Rouge Rouge COULEUR RÉACTION POSITIVE Stade 1 T s,,d, 2 Réduction du nitrate au-delà du stade du nitrite (dénitrification - réductase des nitrates et nitrites) .. Production d'ul'éase (Lelliott, 1966). Milieu de culture. Incolore Incolore Bose de gélose avec urée d'Oxoid (CM53): 2,4 g. Eau distillée: 95 ml Slériliscr à !"autoclave à 115 "C pendant 20 minutes. Refroidir jusqu"à 50"C la hase fondue et ajouter aseptiqucment 5 ml Je solu tion aqueuse d'urée i:1 40 p. 100 (Oxoid SR20) .stérilisée par filtra tion. Bien mélanger. Répartir dans des tubes stériles (16 x 100 mm) à raison de 6 ml par tuhe et laisser prendre dans les tuhes inclinés. Réadion po,1·iliw: le milieu, de couleur jaune orangé, vire au rouge cerise ou au muge magenta s'il y a eu activité uréasique Utilisation du citrate (Christenscn) (Skem1an, 1967). Rase Je gélose avec citrate (Merck 2501): 23 g. Eau distillée : 1 1. Mélanger et dissoudre en chauffant. Répartir à rai.son de 6 ml par tube, comme pour le milieu du lest de production J'uréase, Stériliser à l'autoclave ~1 121 "C pendant 15 minutes et laisser prendre les tubes indinés. Réaefio11 positivP. l'utilisation du -:itrate est indiquée par un changement de la couleur du milieu qui de l'orange vire au rouge. Production d'hydrniène sulfuré (Pamamurthi, 1959). Milieu: Tryptone Je Difco Bacto (n° 0123): 10 g. K,HPO1 : 1 g. NaCI: 5 g. Eau distillée : 1 1. Dissoudre el répartir dans des tuhes de 16 x 100 mm à raison de 6 ml par tuhc. Stériliser à r autodave i:1 115 "C pendant l O minute.~. Inoculer el suspendre aseptiquement un papier à l'acétate de plomh (Merck 9511) au rehqrJ du tube, Le maintenir avec le cou vercle. Laisser incuber jusqu'à 20 jour.s. Réaction positive: la production de H ,S à partir de tryptone est indiquée par l'apparition sur le papier de lest d'une coloration noir brun. Production d'indole (Ramamurthi. 1959). Milieu : identique à celui du lest de H2S Enlever le papier à l'acétate de plomb, a jouter I à 2 ml d'éther éthylique et secouer légèrement. Laisser décanter (5 minutes). Ajou ter doucement 0.5 ml de rt~actif de Kovacs (Merck 9293) à l'inté rieur du tuhe incliné. Rl'aclion positive : la présence dïndole est indiquée par I' appari tion d'une coloration rouge dans la couche jaune entre la phase éther et la phase aqueuse. Croissance à 37 "C (Ramarnurthi, 1959). Milieu: Bouillon de culture Je Difco Racto (n° 0003): 8 g. Eau distillée: 1 1. Mélanger, dissoudre et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube Stériliser à !"autoclave à 121 "C pendant 15 minutes. Inoculer et lai.sser incuher à 37 "C. Réaction posilive · croissance. Crois~ance dans du chlorure de sodium à 7 p. 100 (Ramamur 1h;, 1959) Milieu: Rouillon de culture de Difco Raclo · 8 g. NaCI • 70 g. Eau distillée: 1 1. Mélanger, dissoudre et répartir dans des tuhes à raison de 6 ml par tube, S(ériliser à J',rntoclave à 121 "C pendant 15 minutes. Réaction positive: croissance. Hydrolyse de la gélatine (Ldlimt, Rilling cl Hayward. 1966). Milieu: Gélatine Je Difco Racto (n° 0143): 120 g. 2028 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 5 février 1995 Eau distillée , 1 1. Mélanger, dissoudre en chauffant et répartir dans des lubes ;) rai son de 6 ml par lube, Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes Réaction po.ütive: liquéfaction de la gélatine même en mainte nant la température à 5 °C pendant 30 minutes. Hydrolyse de l'amidon. Milieu. Gélose nutritive de Difco Bac10 (fondue): 1 1 Amidon soluble de Difco Bacto (11° 0178) · 2 g. Mélanger et stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes. Verser dans les boîtes. Inoculer les boîtes par tâches. Après une croissance suffisante ( 10 à 20 jours). prélever une par tie du produit et le plonger dans du soluté io<lo-ioduré de Lugol. Réaction po,.,itive : des zones claires sous ou autour de la crois sance bactérienne inùiquent quïl y a eu hydrolyse de l'amidon. Le reste du milieu reste pourpre. Hydrolyse de l'esculine (Sneath et Collins, 1974). Milieu: Peptone de Difco Bacto : 10 g. Esculine: 1 g. Citrate de fer (Merck 3862): 0,05 g. Citrate Je sodium: 1 g. Eau distillée : I l. Dissoudre en mélangeant et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes. Le milieu est clair, avec une fluorescence bleuâtre Réaction po:.itive: J'hydrolyse de l'esculine est révélée par le virage au brun et la disparition de la fluorescence. Pour la contrôler, utiliser une lampe à rayonnement ultraviolet. RÉFÉRENCES Bradbury. J.F., 1970. Isolation and preliminary stuùy of hacreria from plants. Rev, Pl. Path .. 49, 2l3-218. Dinesen. I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corw1ehacte rium sepedonicwn from diseased potato tubers. EPPO - Bull. 14 (2J, 147-152. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy, In : Manu al of methods for general hacteriology. American Society for Microbiology. Washington. 21-23. Hugh, R. and Leifson. F., 1953. The taxonomie significance of fer mentative versus oxidative metabolism of carbohydratcs by varie.ms gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26. Janse, J, D. and Van Vaerenhergh, J. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Coryne hacteriwn seriedonicwn) in potato. EPPO Bu]\ , n" 17. 1987. p. 1-10 Kovacs, N .. 1956, Identification of Pseudomonas p roc wmca by the oxidase reaction. Nature, Lonù., 178, 703. Lelliott. R. A.. 1966. The plant pathog:cnic coryneform bactcria. J. ap[Jl. Bact., 29. 114-118. Lelliott. R. A.. Billing. E. and Hayward, A. C.. 1966. A dctcm1ina tive schemc for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489. Lelliott, R. A., and Sellar. P. W .. 1976. The detection of latent ring rot (CorJ·11ebacteriwn sepedonicwn [Spiek. et Kotth.] Skapt. et Burkh.) in polato slOcks EPPO Bull., 6 (2J. 101-106, Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram positive phytopathogenic bacreria and their relationship 10 the Corynebacteria. Mem Comell agric. Exp. Sta., 366. 52 p. Skennan, V. B. D., 1967, A guide Lo the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkim, Company, Baltimore. Sneath, P. H. A. and Collin), V, G .. 1974. A study in test reproduc tibility between ]aboratories: report of Pse11domn11a,1 working party. Antonic van Leeuwenhoek, 40, 481-527. (1) Une aulre méthode d"extraction esl donnée par Dinesen. 1984. (2) Il est prouvé (Janse et Van Vacrenbergh: 1987) que la congélation peut réduJre la viahililé de C. m. sub,p. sepedm11rns. Employer une solut1on de gly cérol à JO p. 100 pour y mettre en su~pension l'exlrail concentré pourrall consllluer la solurion à ce problème ANNEXE li 1. Dans tous les cas d"apparition suspectée pour laquelle on a constaté. au te~t d' immunof1uoresccnce pratiqué selon la méthode décrite à r annexe 1. une réaction po~itivc devant êlre confirmée ou infirmée par l'achèvement de cette méthode, il convient de garder et <le conserver dans des conditions appropriées jusqu'à l'achèvement de la méthode en question : tous les tubercules ou plantes faisan t partie de l'échantillon, dans la mesure du possible ; tout extrail résiduel et les lames supplémentaires préparées en vue des tests dïmmunonuorescence. 2. En cas de confinnalion de la présence de l'organisme, il convient de garder et de conserver dans des conditions appropriées, pendant au moins un mois après la procédure de notification prévue à l'article 5, paragraphe 2: les éléments visés au point 1 ; un échantillon d'aubergin,e infecté par l'inoculation d'extrait de tubercule ou de plante ; la culture isolée de l'organisme. ANNEXE III 1. Pour déterminer l'étendue de la contamination probable visée à 1 l'article 5, paragraphe 1. point b. il convient de prendre en considé ration les éléments suivants : les tubercules ou les plantes cultivés en un lieu de production déclaré contaminé en vertu de l'article 5, paragraphe J, polnt a: le(s) lieu(x) de production ou les installations ayant, dans le sy,stème de production, un lien avec les tubercules ou les plante,s qui ont été déclarés contaminés en vertu de l'article 5. paragraphe l. point a, y compris ceux partageanl l"équipement et les installations de production directement ou par le biais d'un entrepreneur commun; les tubercules ou les plantes produits dans le(s) lieu(x) de pro duction visé(s) au tirel précédent, ou présents dans ledit (les dits) lieu(x) pendant la période où les tubercules ou plantes déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe f, poim a. étaient présents dans les installations ou les lieux de production visés au premier tiret ; les entrepôts centraux où sont manipulées des pommes de terre provenant des lieux de production susvisés ; cout matériel. véhicule. récipient. entrepôt ou partie de ceux-ci. ainsi que tout autre objet, y compris remballage, qui peut, au cours des douze mois précédents ou à tout autre moment appro prié, avoir été en contact avec les tubercules ou plantes décla rés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1. point a; tout tubercule ou plante entreposé dans ou en contact avec un des éléments ou objets visés au tiret précédent, avant le net toyage et la dési~fection de ceux-ci, et à la suite des tests visés à 1' article 6, les tubercules ou les plantes ayant la même origine clonale que les tubercules ou les plantes qui ont été déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe l, point a, et pour lesquels les tests indiquent qu'une contamination est probable. 2, Pour déterminer la propagation possible visée à l'article 5, paragraphe 1, point c, il convient de prendre en considération les éléments suivants: la proximité des autres lieux de production où sont cultivées des pommes de terre ou d'autres plantes hôtes; l'origine commune des stocks de pommes de terre de semence. 3. Les modalités de la notification visée à l'article 5, para graphe 2. comprennent : pour tout envoi ou lot de pommes de terre déclaré contaminé, le cenificac prescrit à l'article IO de l'arrêté du 16 ao0t 1994. le numéro de passeport ou d'enregistrement, selon le cas: la dénomination variétale pour les stocks de pommes de terre de semence et, si possible. dans tous Jes autres cas ; une description des éléments de la contamination déclarée et de la zone délimitée ; l'existence d'un extrail. de lames préparées en vue de tests d'immunofluorescence, ct·un échantillon d'aubergine infectée et d·une culture isolée de l'organisme provenant du test par lequel la présence de l'organisme a été confinnée. ANNEXE IV 1. Les mesures sous contrôle officiel visées à l'article 7, para graphe 1, pour l'élimination de tubercules ou de plantes déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1. point a, sont: la transformation industrielle par livraison directe et immédiate à une entreprise de transformation disposant d'installations appropriées d'élimination des déchets dont il a été établi qu'elles ne présentaient aucun risque identifiable de propaga 5 février 1995 JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE 2029 tion de l'organisme, ainsi que d'un système penneltant de désinfecter les aires de stockage et les véhicules quittant 1' entreprise ; d'autres mesures, pour autant qu'il soit établi qu'elles ne pré sentent pas de risque identifiable de propagation de l'orga nisme ; ces mesures doivent être notifiées à la commission et aux autres Etats membres. 2. L'utilisation ou l'élimination appropriée, sous le contrôle des agents chargés de la protection des végétaux, des tubercules ou des plantes considérés comme probablement contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1, point b. et visés à l'anicle 7, paragraphe 2, comportem: leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la consommation, en emballages prévus pour une livraison et une utilisation directes ne nécessitant aucun réem ballage, el destinées à une telle livraison et utilisation directes, ou leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la transfonnation industrielle après livraison directe et immédiate à une entreprise de transfonnation disposant d'installations appropriées d'élimination des déchets el de désinfection, ou une quekonque autre utiforntion ou élimination, pour autant qu'il soit établi qu'il n'existe pas de risque identifiable de pro pagation de l'organisme. 3. Les méthodes appropriées de nettoyage et de désinfection des objets visés à l'article 7, paragraphe 3, sont celles dont il a été établi qu'elles ne présentaient aucun risque identifiahle de propagation de l'organisme; elles sont appliquées sous la surveillance des agents chargés de la protection de végétaux. 4. Les mesures à meure en œuvre dans la zone délimitée érnblie en vertu de J'article 5, paragraphe 1, point c. et visées à !"article 7, paragraphe 4, comprennent les mesures suivantes : 4.1. Sur les lieux de production déclarés contaminés en vertu de l'article 5, paragraphe 1, point a. a) Dans un champ déclaré contaminé en vertu de l'article 5. paragraphe 1, point a : i) pendant au moins les trois campagnes suivant la campagne de la conlamination déclarée : des mesures sont prises en vue d'éliminer les plantes de pommes de terre spontanées et les autres plantes hôtes de l'organisme spontanément présentes; aucun tubercule, plante ou graine de pommes de terre, aucune aulre plante hôte de l'organisme spontanément pré sente el aucune culture pour laquelle il existe un risque identifié de survie ou de propagation de l'organisme n'est planté ni semé tant qu'il n'a pas été constaté, pendant deux campagnes consécutives au moins. que le champ ne contient pas de plantes de pommes de terre spontanées ; durant la première saison de récolte des pommes de terre suivant la période indiquée au tiret précédent, des pommes de terre de semence officiellement cenifiées sont plantées exclusivement en vue de la production de pommes de terre de com,ervaliun et des recherches officielles sont effec tuées confonnément à l'article 2 ; durant la saison de récolte des pommes de terre suivant celle visée au tiret précédent et après un cycle approprié de rotation, des pommes de terre de semence officielle ment certifiées sont plantées pour la production de semence ou de pommes de terre de conservation el des recherches officielles sont effectuées confonnément à l'article 2, ou ii) pendant les quatre campagnes suivant celle de la contami nation déclarée : des mesures sont prises en vue d'éliminer les plantes de pommes de terre spomanées et les autres plantes hôtes de l'organisme spontanément présentes, et le champ est mis et maintenu soit en jachère nue, soit en pâturage permanent et, dans ce cas, il esl fréquemment fauché ras ou mis en pâlurage intensif; durant la première saison de récolte des pommes de terre suivant la période visée au tiret précédent, des pommes de terre de semence officiellement certifiées sont plantées pour la production de semence ou de pommes de terre de conservation et des recherches officielles sont effectuées conformément à l'article 2; b) Dans les autres champs. au cours de la campagne suivant la contamination décla rée: ou bien aucun tubercule, plante ou graine de pommes de terre, et aucune autre plante hôte de l'organisme spontané ment présente n'est planté ni semé et des mesures sont prises en vue d'éliminer les plantes spontanées, le cas échéant; ou bien des pommes de, terre de semence officiellement certifiées peuvent être plantées exclusivement en vue de la production de pommes de terre de conservation. à condi tion que les agents chargés de la production des végétaux. acquièrent la certitude que le risque constitué par les plantes de pommes de terre spontanées et les autres plantes hôtes de l'organisme spontanément présentes a été élimlné; pendant au moins les deux campagnes suivant celle visée au tiret précédent, seules des pommes de terre de semence officiellement certifiées sont plantées, en vue de la produc tion de semence ou de pommes de terre de conservation ; au cours de chacune des campagnes visées aux points pré cédents, des mesures sont prises pour éliminer les plantes spontanées de pommes de terre el les plantes hôtes de l'or ganisme spontanément présentes et des recherches offi cielles sont effectuées confonnément à l'article 2; lorsque des pommes de terre de semence officiellement certifiées sont plantées pour la production de pommes de lerre de conservation au cours de la campagne -suivant celle de la contamination déclarée. la récolte sur pied est inspectée à des moments appropriés et des plantes sponta nées sont soumises à des lests visant à détecter la présence de l'organisme; c) Jmmédi;itement après la déclaration de la contamination en vertu de l'article 5, paragraphe 1, point a, et au cours de chacune des campagnes suivantes, jusques el y compris la pre mière saison de culture des pommes de terre autorisée selon les modalilés exposées au point a dans les champs déclarés conta minés. tout le malériel el les installations de stockage présents sur le lieu de production et impliqués dans la production de pommes de terre sont nettoyés et désinfectés en tant que de besoin par des méthodes appropriées, conformément au point 3; d) Dans les systèmes de production pennettant le remplace ment total du milieu de culture: aucun tubercule, plante ou graine n'est planté ni semé sauf si l'unité de production a été soumise à des mesures sous cnntrôle officiel visant à l'élimination de l'organisme et de toute pomme de terre ou autre végétal de la famille des sola nacées, y compris au moins le remplacement complet du milieu de culture ainsi que le nettoyage et la désinfection de l'unité de production el de tout l'équipement, et si elle a par la suite été agréée pour la production de pommes de terre par le ministère de l'agriculture el de la pêche: la production de pommes de terre est issue de pommes de terre de semence officiellement certifiées ou de minituber cules ou de microplante-s provenant de sources lestées. 4.2. A l'intérieur de la zone délimitée, sans préjudice des mesures énumérées au point 4.1, les agents chargés de la protection des végétaux : a) Immédiatement après la contamination déclarée et pen dant au moins lrois périodes de végétation : font surveiller par leurs organismes officiels responsables les installations pratiquant la culture, le stockage et la manuten tion de tubercules de pommes de terre, ainsi que les locaux des enlreprises exploitant sous contrat du matériel utilisé dans le secteur de la pomme de terre ; exigent, en tanl que de besoin, le nettoyage et la désinfection du matériel et des entrepôts de ces installations, par les méthodes appropriées visées au point 3 ; exigent que seules les semences certifiées soient plantées pour toutes les cultures de pommes de terre dans ladite zone; exigent. dans toutes les entreprises de la zone, la. manuten tion séparée des pommes de terre de semences el des pommes de terre de conservation ; procèdent à des recherches officielles conformément à l'article 2 : b) Etablissent, en tant que de besoin, un programme de rem placement de tous les stocks de pommes de terre de semence sur une période appropriée. Les mesures mises en œuvre en vertu du point 4.2 ainsi que les numéros d'enregistrement des producteurs, des entrepôts collectifs el des centres d'expédition situés dans la zone délimi tée sont notifiés chaque année aux autres Etats membres et à la commission.