Real Decreto Nº 1.533/1991 - Métodos oficiales de análisis de leche y productos lácteos

REAL DECRETO 1533/1991, DE 18 DE OCTUBRE, POR EL QUE SE APRUEBAN LOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. Anterior-Ref: DE CONFORMIDAD CON EL CODIGO ALIMENTARIO APROBADO POR DECRETO 2484/1967, DE 21 DE SEPTIEMBRE (BOE NUM. 248, DE 17 DE OCTUBRE, DISP. 1226). EL DECRETO DE LA PRESIDENCIA DEL GOBIERNO NUMERO 2484/1967, DE 21 DE SEPTIEMBRE (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DEL 17 AL 23 DE OCTUBRE), QUE APRUEBA EL CODIGO ALIMENTARIO ESPAÑOL, PREVE QUE PUEDAN SER OBJETO DE REGLAMENTACIONES ESPECIALES LAS MATERIAS EN EL REGULADAS. LAS ORDENES DE 31 DE ENERO DE 1977 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 14 A 27 DE JULIO); 31 DE JULIO DE 1979 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 29 Y 30 DE AGOSTO); 17 DE SEPTIEMBRE DE 1981 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 14 DE OCTUBRE); 1 DE DICIEMBRE DE 1981 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 20 DE ENERO DE 1982), Y 26 DE ENERO DE 1989 (<BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO> DE 4 DE FEBRERO), ESTABLECIERON DIVERSOS METODOS OFICIALES DE ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS, SIENDO NECESARIO COMPLEMENTARLOS CON OTROS NUEVOS QUE ATIENDAN AL CONTROL DE LAS MEZCLAS DE LECHES CITADAS ANTERIORMENTE. EL PRESENTE REAL DECRETO SE DICTA EN VIRTUD DE LO DISPUESTO EN EL ARTICULO 149.1.16. DE LA CONSTITUCION ESPAÑOLA, EN CUANTO ATRIBUYE AL ESTADO LA COMPETENCIA EXCLUSIVA SOBRE LAS BASES Y COORDINACION GENERAL DE LA SANIDAD. EN SU VIRTUD A PROPUESTA DE LOS MINISTROS DE SANIDAD Y CONSUMO, DE INDUSTRIA, COMERCIO Y TURISMO Y DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION, OIDOS LOS SECTORES AFECTADOS, PREVIO INFORME PRECEPTIVO DE LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA, DE ACUERDO CON EL CONSEJO DE ESTADO Y PREVIA DELIBERACION DEL CONSEJO DE MINISTROS EN SU REUNION DEL DIA 18 DE OCTUBRE DE 1991, DISPONGO: ARTICULO 1. SE APRUEBAN COMO OFICIALES LOS METODOS DE ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS QUE SE DETALLAN EN EL ANEXO. ART. 2. PARA LA DETECCION DE LA PRESENCIA DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y LECHE DE CABRA, EN PRODUCTOS PROCEDENTES DE OTROS ESTADOS MIEMBROS SE RECONOCEN COMO METODOS DE CONTROL EQUIVALENTES LOS LEGALMENTE ESTABLECIDOS EN LOS MISMOS HASTA TANTO SE APRUEBE UN METODO UNICO DE REFERENCIA APLICABLE EN LA COMUNIDAD ECONOMICA EUROPEA. DISPOSICION ADICIONAL EL PRESENTE REAL DECRETO SE DICTA AL AMPARO DE LO DISPUESTO EN EL ARTICULO 149.1.16. DE LA CONSTITUCION ESPAÑOLA. DISPOSICION DEROGATORIA QUEDAN DEROGADAS LAS DISPOSICIONES DE IGUAL O INFERIOR RANGO EN LO QUE SE OPONGAN AL PRESENTE REAL DECRETO. DADO EN MADRID A 18 DE OCTUBRE DE 1991. JUAN CARLOS R. EL MINISTRO DE RELACIONES CON LAS CORTES Y DE LA SECRETARIA DEL GOBIERNO, VIRGILIO ZAPATERO GOMEZ ANEXO METODOS OFICIALES DE ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS INDICE LECHE 21. DETECCION DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA. 22. SANGRE SOLUBLE. 23 (A) DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (POR ELECTROFORESIS). 23 (B) DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (POR INMUNODIFUSION RADIAL). 24 (A) DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (POR ELECTROFORESIS). 24 (A) DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (POR INMUNODIFUSION RADIAL). MANTEQUILLA 10. EXTRACCION DE LA GRASA. QUESO 7. NITRATOS Y NITRITOS. 8. DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN QUESO DE OVEJA O DE CABRA (POR ELECTROFORESIS). 9. DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN QUESO DE OVEJA (POR ELECTROFORESIS). 21. DETECCION DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA 21.1 PRINCIPIO. SE PUEDE DETECTAR LA LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA O CABRA MEDIANTE EXTRACCIONES DE LA CASEINA Y POSTERIOR SEPARACION POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. LA CASEINA A SL DE LECHE DE VACA PRESENTA UNA MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LAS CASEINAS A S DE LECHES DE OVEJA O CABRA. 21.2 MATERIAL Y APARATOS. 21.2.1 CENTRIFUGA. 21.2.2 EQUIPO DE ELECTROFORESIS. 21.2.3 FUENTE DE ALIMENTACION. 21.2.4 TUBOS PARA ELECTROFORESIS DE 11 CM DE LONGITUD Y 0,7 CM DE DIAMETRO. 21.2.5 PH-METRO. 21.2.6 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN EL LABORATORIO DE PIPETAS, TUBOS, MICROPIPETAS, ETCETERA. 21.3 REACTIVOS. 21.3.1 SOLUCION DE ACIDO ACETICO 1N. 21.3.2 SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1N. 21.3.3 SOLUCION DE UREA 7M. 21.3.4 SOLUCION A. TAMPON PH 8,9. DISOLVER 48 ML DE HC1 1N, 36,3 G DE TRISHIDROXIMETILAMINOMETANO Y 0,46 ML DE TEMED EN AGUA HASTA 100 ML. 21.3.5 SOLUCION B DE ACRILAMIDA. DISOLVER 60 G DE ACRILAMIDA Y 1,6 G DE NN' METILENBISACRILAMIDA (BIS) EN AGUA HASTA 200 ML. 21.3.6 SOLUCION TAMPON PARA DEPOSITOS DE LOS ELECTRODOS PH 8,4. DISOLVER 0,60 G DE TRISHIDROXIMETILAMINOMETANO Y 2,88 G DE GLICINA EN AGUA HASTA 100 ML. SE PUEDE PREPARAR UN TAMPON CONCENTRADO 10 VECES Y GUARDAR EN NEVERA DILUYENDOLO EN EL MOMENTO DE SU UTILIZACION. 21.3.7 SOLUCION DE PERSULFATO AMONIO. DISOLVER 0,56 G DE PERSULFATO AMONICO EN AGUA HASTA 100 ML. ESTE REACTIVO DEBE PREPARARSE NUEVO CADA SEMANA. 21.3.8 SOLUCION DE TINCION. DISOLVER 0,56 G DE NEGRO DE AMIDO EN UNA MEZCLA DE 250 ML DE METANOL, 650 ML DE AGUA Y 100 ML DE ACIDO ACETICO GLACIAL. 21.3.9 SOLUCION DE LAVADO. MEZCLAR 400 ML DE METANOL, 50 ML DE ACIDO GLACIAL Y 550 ML DE AGUA. 21.3.10 SOLUCION DE AZUL DE BROMOFENOL. DISOLVER 1 MG DE AZUL DE BROMOFENOL EN 100 ML DE AGUA. 21.4 PROCEDIMIENTO. 21.4.1 PREPARACION DE LA MUESTRA: DILUIR LA LECHE, PREVIAMENTE DESNATADA POR CENTRIFUGACION, A 1/5 CON AGUA DESTILADA. CALENTAR A 35 GRAD. C Y LLEVAR A PH 4,6 MEDIANTE ADICION DE ACIDO ACETICO 1N. SEPARAR LA CASEINA PRECIPITADA POR CENTRIFUGACION Y LAVAR VARIAS VECES CON AGUA DESTILADA. DISOLVER LA CASEINA EN UN VOLUMEN DE AGUA IGUAL A LA MITAD DEL VOLUMEN DE LA LECHE ORIGINAL, AÑADIENDO SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1N HASTA PH7. INMEDIATAMENTE ANTES DE LA ELECTROFORESIS, DISOLVER UN VOLUMEN IGUAL DE UREA 7M. PREPARADA RECIENTEMENTE. PARA LA ELECTROFORESIS ES SUFICIENTE APLICAR DE 100 A 200 UG DE CASEINA DISUELTA. 21.4.2 PREPARACION DEL GEL: MEZCLAR 5 ML DE SOLUCION A (21.3.4), 10 ML DE SOLUCION B (21.3.5) Y 11,5 G DE UREA EN UNA PROBETA DE 50 ML. AÑADIR AGUA CON AGITACION HASTA 35 ML DE DISOLUCION. DESAIREAR MEDIANTE VACIO Y AÑADIR 5 ML DE LA SOLUCION DE PERSULFATO. AGITAR LA SOLUCION E INMEDITAMENTE LLENAR CON LA MISMA LOS TUBOS (PREVIAMENTE TAPADOS POR SU PARTE INFERIOR) HASTA 1 CM DEL EXTREMO SUPERIOR, EVITANDO LA FORMACION DE BURBUJAS DE AIRE. COMPLETAR EL LLENADO DE LOS TUBOS CON UNA PEQUEÑA CANTIDAD DE AGUA QUE ASEGURA LA SUPERFICIE PLANA DEL GEL, A LA VEZ QUE EVITA LA POSIBLE INHIBICION DE LA POLIMERIZACION POR EL OXIGENO ATMOSFERICO. LA POLIMERIZACION TIENE LUGAR EN VEINTE-TREINTA MINUTOS. 21.4.3 ELECTROFORESIS: COLOCAR LOS GELES, UNA VEZ POLIMERIZADOS Y DESPUES DE ELIMINAR EL AGUA, EN LOS MODULOS DEL APARATO DE ELECTROFORESIS EN POSICION VERTICAL Y LLENAR LAS DOS CAMARAS DE LOS ELECTRODOS CON EL TAMPON PH 8,4. APLICAR CON MICROPIPETA EN LA SUPERFICIE DEL GEL UNA CANTIDAD DE LA SOLUCION DE CASEINA EN UREA QUE CONTENGA DE 100 A 200 UG DE CASEINA. AÑADIR UNA GOTA DE AZUL DE BROMOFENOL Y COMPLETAR EL LLENADO DE LOS TUBOS CON UNA PEQUEÑA CANTIDAD DE TAMPON. UTILIZAR EL DEPOSITO SUPERIOR COMO CATODO Y EL INTERIOR COMO ANODO. CONECTAR LA CORRIENTE Y APLICAR UNA INTENSIDAD CONSTANTE DE 1 MA POR TUBO DURANTE 1,5 A DOS HORAS (HASTA QUE EL AZUL DE BROMOFENOL LLEGUE AL EXTREMO DEL GEL). 21.4.4 SEPARACION, TEÑIDO Y DESTEÑIDO DE LOS GELES: PARA DESPRENDER EL GEL DEL TUBO DE VIDRIO SE PUEDE UTILIZAR UNA JERINGA CON UNA AGUJA SIN PUNTA, COLOCANDOLA ENTRE EL GEL Y EL TUBO. INYECTAR AGUA A PRESION Y ROTAR EL TUBO, CON LO QUE ENTRA ESTA Y SE DESPRENDE EL GEL. UNA VEZ DESPRENDIDO, COLOCAR CADA GEL EN UN TUBO CON SOLUCION COLORANTE DE NEGRO DE AMIDO DURANTE UNA HORA. ELIMAR LA SOLUCION DE TEÑIDO Y AÑADIR SOLUCION DE LAVADO, QUE DEBE RENOVAR HASTA QUE SE OBSERVE LAS BANDAS DE NITIDEZ. LOS GELES SE PUEDEN CONSERVAR DURANTE MESES EN SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 7 POR 100. 21.5.1 IDENTIFICACION DE LAS BANDAS: EL DIAGRAMA ELECTROFORETICO DE LAS CASEINAS DE LECHE DE OVEJA CONTIENE DOS GRUPOS DE BANDAS DE PROTEINAS. EL PRIMER GRUPO, DE DOS BANDAS, CORRESPONDE A LAS B CASEINAS, Y EL SEGUNDO, CONSISTENTE EN TRES BANDAS, A LAS A S CASEINAS, QUE SE DESIGNAN COMO A S1, A S2 Y A S3 LA LECHE DE VACA SE PUEDE DETECTAR EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA O CABRA, DEBIDO A LA MAYOR MIGRACION ELECTROFORETICA DE LA CASEINA A S1 DE VACA, QUE SE HACE VISIBLE POR ENCIMA DE LAS BANDAS DE CASEINA DE OVEJA O CABRA. LA INTENSIDAD DE LA BANDA A S1 DE VACA AUMENTA CUANDO ES MAYOR EL PORCENTAJE DE MEZCLA. 21.5.2 DETERMINACION CUANTITATIVA: LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA PROPORCION DE LECHE DE VACA AÑADIDA A LA LECHE DE OVEJA O CABRA SE PUEDE REALIZAR POR EL ANALISIS DENSITOMETRICO DE LAS BANDAS OBTENIDAS EN LAS ELECTROFORESIS, MIDIENDO EN LA MEZCLA EL CONTENIDO DE CASEINA A S1 DE LECHE DE VACA Y COMPARANDO ESTE VALOR CON EL CONTENIDO MEDIO DE CASEINA A S DE LECHE DE VACA PURA. ES NECESARIO EFECTUAR UNA CURVA PATRON. 21.5.3 LIMITE DE DETECCION: LA TECNICA DESCRITA PERMITE DETECTAR UN 2% DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O EN LECHE DE CABRA. 21.6 OBSERVACIONES. 21.6.1 LA ELECTROFORESIS EN GEL DE ACRILAMIDA SE PUEDE EFECTUAR TAMBIEN EN UN EQUIPO PARA ELECTROFORESIS EN GEL PLANO. 21.6.2 TODAS LAS SOLUCIONES SE DEBEN PREPARAR CON AGUA DESTILADA RECIENTE O HERVIDA, YA QUE EL OXIGENO INHIBE LA POLIMERIZACION Y SE PUEDEN FORMAR BURBUJAS EN EL GEL. 21.6.3 TODAS LAS SOLUCIONES SE DEBEN ALMACENAR EN BOTELLAS OSCURAS EN EL FRIGORIFICO. 21.6.4 LA ACRILAMIDA ES NEUROTOXICA, POR LO QUE SE DEBE MANEJAR CON CUIDADO. 21.7 BIBLIOGRAFIA. 21.7.1 PIERRE, A., Y PORTMANN, A., 1970. ANN TEECHNOL. AG. 19, 107-130. 21.7.2. RAMOS, M.; MARTINEZ-CASTRO, I., Y JUAREZ, M. 1977. J. OF DAIRY SCI. 60, 870 877. 21.7.3 ADROID, P. (1968) <SEPARATION OF MILK PROTEINS>, EN SMITH <CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROPHORETIC TECNIQUES>. VOL. II, PAG. 399. WILLIAM HEINEIMANN MEDICAL BOOKS, LTD. LONDON. 22. SANGRE SOLUBLE 22.1 PRINCIPIO. DISOLUCION DE LA HEMOGLOBINA EN UNA MEZCLA ACETICO-AGUA Y POSTERIOR DETERMINACION DE SU ABSORBENCIA A 396 NANOMETROS. ESTE METODO ES APLICABLE A MUESTRAS DE LECHE O SUERO DE LECHE EN POLVO QUE CONTENGAN MENOS DEL 5 POR 100 DE GRASA. 22.2 MATERIAL Y APARATOS. 22.2.1 ESPECTROFOTOMETRO Y ACCESORIOS (CUBETA PARA 1 CM DE ESPESOR DE LIQUIDO). 22.2.2 AGITADOR ELECTROMAGNETICO. 22.2.3 CENTRIFUGA Y TUBOS DE 10 ML. 22.3 REACTIVOS. 22.3.1 MECLA ACIDO ACETICO-AGUA (1:1) VN. 22.4 PROCEDIMIENTO. PESAR CON PRECISION DE 0,001 G, 10 G DE LECHE O SUERO DE LECHE EN POLVO E INTRODUCIR EN UN VASO DE PRECIPITADOS DE 250 ML. AÑADIR 150 ML DE AGUA DESTILADA PREVIAMENTE CALENTADA A 40-50 GRAD. C Y AGITAR HASTA QUE SE FORME UNA EMULSION; A CONTINUACION, TRASVASAR ESTA EMULSION A UN MATRAZ AFORADO DE 250 ML, LAVAR EL VASO REPETIDAS VECES CON AGUA DESTILADA, ENFRIAR Y ENRASAR A 250 ML. TOMAR 20 ML DE LA EMULSION Y VERTER EN UN MATRAZ AFORADO DE 100 ML, ENRASAR CON LA MEZCLA DE ACETICO GLACIAL-AGUA DESTILADA. SI LA SOLUCION RESULTA TURBIA, CENTRIFUGAR 10 ML DURANTE 15 MINUTOS A UNAS 5.700 REVOLUCIONES; RETIRAR A CONTINUACION CON AYUDA DE UNA ESPATULA LA PELICULA SOBRENADANTE; FILTRAR EL CENTRIFUGADO Y REPETIR LAS OPERACIONES SI ES NECESARIO DE FORMA QUE LA SOLUCION QUEDE FINALMENTE TRANSPARENTE. A CONTINUACION MEDIR LA ABSORBANCIA EN CUBETA DE 1 CM A 396 NM, USANDO COMO BLANCO LA SOLUCION ACETICO-AGUA. 22.5 CALCULOS. EL PORCENTAJE DE SANGRE SOLUBLE SE DEDUCE POR APLICACION DE LA SIGUIENTE FORMULA: S = (A/E 1) X (1.250/P) SIENDO: S = PORCENTAJE DE SANGRE SOLUBLE PRESENTE EN LA MUESTRA. A = ABSORBANCIA LEIDA DE LA MUESTRA. P = PESO EN GRAMOS DE LA LECHE O SUERO DE LECHE EN POLVO. E 1 = ABSORBANCIA ESPECIFICA DE LA SANGRE. 22.6 OBSERVACIONES. 22.6.1 EN EL CASO DE DISPONER DE LA HARINA DE SANGRE UTILIZADA COMO DESNATURALIZANTE, EL VALOR DE E 1 SE OBTENDRA COMO SE INDICA A CONTINUACION: PESAR CON PRECISION DE 0,0001 G, 100 MG DE HARINA DE SANGRE, E INTRODUCIRLA EN UN VASO DE PRECIPITADO DE 250 ML. AÑADIR 150 ML DE AGUA DESTILADA, AGITAR DURANTE CINCO MINUTOS LA SOLUCION, TRANSFERIR A UN MATRAZ AFORADO DE 250 ML. A CONTINUACION, TOMAR 20 ML DE ESTA SOLUCION, LLEVAR A UN MATRAZ AFORADO DE 100 ML Y ENRASAR CON LA MEZCLA DE ACIDO ACETICO GLACIAL-AGUA. CENTRIFUGAR 10 ML DE ESTA SOLUCION Y MEDIR SU ABSORBANCIA EN CUBETA DE 1 CM A 396 NANOMETROS USANDO COMO BLANCO LA SOLUCION ACETICO-AGUA. SIENDO: E 1 = ABSORBANCIA ESPECIFICA. A = ABSORBANCIA LEIDA. P = PESO EN GRAMOS DE LA HARINA DE SANGRE. LA ABSORBANCIA ESPECIFICA E NO DEBERA SER INFERIOR A 50. EN CASO 1 CONTRARIO, LA HARINA DE SANGRE NO DEBE SER UTILIZADA COMO DESNATURALIZANTE. 22.6.2 SI NO SE HA PODIDO DETERMINAR ESTE VALOR PREVIAMENTE A LA ADICION DE LA HARINA DE SANGRE A LA LECHE O SUERO SE TOMARA COMO VALOR MEDIO DE REFERENCIA E 1 = 52,4. 23(A) DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (METODO ELECTROFORETICO) 23(A)1. PRINCIPIO. LA FRACCION SERICA DE LA MUESTRA SE EXTRAE POR ADICION DE SOLUCION TAMPON A PH 4,6 Y POSTERIOR CENTRIFUGACION. LAS PROTEINAS DE SUERO SON SEPARADAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA A PH 8,3. LAS B LACTOGLOBULINAS DE LECHE DE VACA PRESENTAN UNA MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LAS A LACTOALBUMINAS Y LAS B LACTOGLOBULINAS DE LA LECHE DE OVJEA Y DE LA LECHE DE CABRA. EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA O PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 90 GRAD. C, DURANTE TREINTA SEGUNDOS, FRESCA O CONSERVADA MEDIANTE CONGELACION O ADICION DE DICROMATO POTASICO. 23(A)2. MATERIAL Y APARATOS. 23(A)2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 23(A)2.2 MICROJERINGA. 23(A)2.3 PH METRO. 23(A)2.4 CENTRIFUGA. 23(A)2.5 EQUIPO DE ELECTROFORESIS. 23(A)2.6 FUENTE DE ALIMENTACION. 23(A)2.7 DENSITOMETRO. 23(A)3. REACTIVOS. 23(A)3.1 REACTIVOS PARA LA OBTENCION DE LA FRACCION SERICA. 23(A)3.1.1 SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10%. 23(A)3.1.2 SOLUCION DE ACETADO SODICO 1N. 23(A)3.2 REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS. 23(A)3.2.1 TAMPON DE LOS GELES PH 8,9. TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 46 G. ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO: 4 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 1.000 ML. 23(A)3.2.2 SOLUCION DE ACRILAMIDA BISACRILAMIDA (T = 9,4%; C = 4,2). ACRILAMIDA: 9 G. N N' METILENBISACRILAMIDA: 0,4 G. TAMPON DE LOS GELES: 100 ML. 23(A)3.2.3 TAMPON DE LOS ELECTRODOS PH 8,3. TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 1,2 G. GLICINA: 5,8 G. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 23(A)3.2.4 SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10% (ESTE REACTIVO DEBE PREPARARSE CADA SEMANA). 23(A)3.2.5 NNN'N' TETRAMETILETILENDIAMINA (TEMED). 23(A)3.2.6 SOLUCION DE AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000. 23(A)3.2.7 SOLUCION DE GLICEROL AL 40%. 23(A)3.3 REACTIVOS PARA LA TINCION. 23(A)3.3.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. 23(A)3.3.1.1 SOLUCION FIJADORA. ACIDO SULFOSALICILICO: 17,3 G. ACIDO TRICLOROACETICO: 57,5 G. AGUA DESTILADA: HASTA 500 ML. 23(A)3.3.1.2 SOLUCION DECOLORANTE. ETANOL: 500 ML. ACIDO ACETICO GLACIAL: 160 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 23(A)3.3.1.3 SOLUCION DE TINCION. AZUL COOMASSIE BRILLANTE R-250: 0,46 G. SOLUCION DECOLORANTE (23(A)3.3.1.2): 400 ML. 23(A)3.3.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. 23(A)3.3.2.1 SOLUCION UNICA DE FIJACION Y TINCION. AZUL COOMASSIE G-250: 1 G. AGUA DESTILADA: 500 ML. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2 N: 500 ML. SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10 N. ACIDO TRICLOROACETICO. DISOLVER EL AZUL DE COOMASSIE G-250 EN AGUA DESTILADA Y AÑADIR LA SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2 N. MEZCLAR BIEN AGITANDO DURANTE UNA HORA Y FILTRAR POR PAPEL WHATMAN NUMERO 1. MEDIR EL VOLUMEN DE FILTRADO Y AÑADIR 1/9 DE ESTE VOLUMEN DE LA SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10 N. AÑADIR ACIDO TRICLOROACETICO A ESTA DISOLUCION HASTA QUE LA CONCENTRACION FINAL SEA DE 12%. ESTA SOLUCION DE TEÑIDO ES ESTABLE DURANTE VARIOS MESES SI EL PH SE MANTIENE POR DEBAJO DE 1. SE PUEDE UTILIZAR VARIAS VECES PERO ES CONVENIENTE FILTRARLA ANTES DE CADA USO. 23(A)4. PROCEDIMIENTO. 23(A)4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SOLUBLE A PH 4,6. AÑADIR A 10 ML DE LECHE, 5 ML DE SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10% (23(A)3.1.1) Y 5 ML DE SOLUCION DE ACETATO SODICO 1 N (23(A)3.1.2), MEZCLAR Y COMPROBAR CON PH METRO QUE EL PH DE LA MEZCLA ES EXACTAMENTE 4,6. CENTRIFUGAR A 3.000 R.P.M. DURANTE DIEZ MINUTOS Y FILTRAR EL SOBRENADANTE A TRAVES DE UN PAPEL DE FILTRO DE VELOCIDAD MEDIA. 23(A)4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. DEPENDIENDO DEL TIPO DE MUESTRA QUE SE DESEE ANALIZAR, PREPARAR PATRONES PUROS DE LECHE DE OVEJA O DE LECHE DE CABRA Y DE LECHE DE VACA Y MEZCLAS DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE LECHE DE VACA EN LECHE DE CABRA EN CONCENTRACIONES DEL 5%, 10% Y 20%. LA LECHE UTILIZADA PARA LA PREPARACION DE ESTOS PATRONES PODRA SER CRUDA O PASTERIZADA, EN ESTE ULTIMO CASO LA LECHE DEBERA SER PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE L 74 C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO DE TREINTA SEGUNDOS. LA FRACCION SOLUBLE DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 23(A)4.1. 23(A)4.3 INMEDIATAMENTE ANTES DE SU APLICACION EN EL GEL MEZCLAR: 1 VOLUMEN DE LA FRACCION SOLUBLE OBTENIDA SEGUN (23(A)4.1). 1 VOLUMEN DE LA SOLUCION DE GLICEROL AL 40% (23(A)3.2.7). 1/2 VOLUMEN DE LA SOLUCION AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000 (23(A)3.2.6). 23(A)4.4 PREPARACION DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. PREPARAR EL GEL LAMINAR DE ESPESOR COMPRENDIDO ENTRE 0,5 MM Y 1 MM. PARA 50 ML DE LA SOLUCION DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA, AÑADIR 0,5 ML DE SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10% (23(A)3.2.4), DESAIREAR EN UN KITASATO MEDIANTE VACIO Y AÑADIR COMO AGENTE POLIMERIZANTE 50 ML DE TEMED (23(A)3.2.5). 23(A)4.5 ELECTROFORESIS. COLOCAR EL GEL EN EL APARATO DE ELECTROFORESIS Y LLENAR LAS CAMARAS DE LOS ELECTRODOS CON EL TAMPON PH 8,3 (23(A)3.2.4). APLICAR CON MICROJERINGA EN CADA UNO DE LOS POCILLOS DEL GEL UN VOLUMEN COMPRENDIDO ENTRE 10 MICROL. Y 20 MICROL. DE LAS SOLUCIONES OBTENIDAS SEGUN 23(A)4.3, TANTO DE LA MUESTRA COMO DE LOS PATRONES. LA ELECTROFORESIS SE REALIZA A 60 MA (220 V) DEJANDO CORRER EL FRENTE HASTA QUE LA LINEA DEL AZUL DE BROMOFENOL ESTE A 0,5 MM DEL EXTREMO INFERIOR DEL GEL. LA DURACION ES APROXIMADAMENTE DE TRES HORAS. 23(A)4.6 METODOS DE TINCION. 23(A)4.6.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION FIJADORA (23(A)3.3.1.1): UNA HORA. 2. LA SOLUCION DECOLORANTE (23(A)3.3.1.2): DIEZ MINUTOS. 3. LA SOLUCION DE TINCION (23(A)3.3.1.3): DOCE HORAS. 4. LA SOLUCION DECOLORANTE (23(A)3.3.1.2), QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA, HASTA ELIMINAR EL FONDO. 23(A)4.6.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION DE FIJACION/TINCION (23(A)3.3.2.1): DOCE HORAS. 2. AGUA DESTILADA QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA: UNA HORA. 23(A)5 INTERPRETACION DE RESULTADOS. 23(A)5.1 IDENTIFICACION DE LAS BANDAS. EN EL DIAGRAMA SE OBSERVA EL ORDEN DE LAS BANDAS DE LAS PROTEINAS DE MENOR A MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA EN CADA UNA DE LAS ESPECIES (DIAGRAMA OMITIDO) 23(A)5.2 DENSITOMETRIA. MEDIR LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CON DENSITOMETRO A UNA LONGITUD DE ONDA DE 560 NM SI SE UTILIZA COOMASSIE R-250 EN LA TINCION Y DE 600 NM SI SE UTILIZA EL METODO DEL COOMASSIE G-250. 23(A)5.3 CUANTIFICACION. COMO SE PUEDE OBSERVAR EN EL DIAGRAMA, LAS B LACTOGLOBULINAS A Y B EN LECHE DE VACA PRESENTAN UNA MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LAS DE LAS OTRAS DOS ESPECIES. AL AUMENTAR EL PORCENTAJE DE LECHE DE VACA PRESENTE EN LA MUESTRA, AUMENTA LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CORRESPONDIENTES A DICHAS B LACTOGLOBULINAS Y POR TANTO AUMENTA LA ALTURA DE LOS PICOS OBTENIDOS EN EL DESINTOGRAMA. MEDIR LAS ALTURAS DE LOS PICOS DE LAS B LACTOGLOBULINAS A Y B DE LECHE DE VACA Y DEL PICO DE LA SEROALBUMINA (BSA). A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA LOS PATRONES, RESULTA LA RECTA DE REGRESION Y = AX + B, DONDE (FORMULAS OMITIDAS) 23(A)6. EXPRESION DE RESULTADOS. EXPRESAR EL CONTENIDO EN LECHE DE VACA SEGUN LOS SIGUIENTES INTERVALOS: MENOR DEL 5 POR 100. ENTRE EL 5 Y EL 10 POR 100. ENTRE EL 10 Y EL 20 POR 100. MAYOR DEL 20 POR 100. SIENDO EL LIMITE DE DETECCION PRACTICO DEL 2 POR 100 DE LECHE DE VACA, EN LECHE DE OVEJA O EN LECHE DE CABRA. 23(A)7. OBSERVACIONES. UN RESULTADO NEGATIVO DEBE OBLIGATORIAMENTE SER CONFIRMADO POR LA TECNICA ELECTROFORETICA DE LAS CASEINAS (21. DETECCION DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA). 23(A)8. REFERENCIAS. 23(A)8.1 RAMOS, M.; JUAREZ, M. (1986): <CHROMATOGRAPHIE, ELECTROPHORETIC AND IMMUNOLOGICAL METHODS FOR DETECTING MIXTURES OF MILKS FROM DIFFERENT SPECIES>. BULLETIN OF INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION NUMERO 202, PAGINAS 175-187. 23(A)8.2 AMIGO, L.; SANTAMARIA, G.; GONZALEZ DEL LLANO, D.; RAMOS, M. (1986): <POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS OF WHEY PROTEINS IN CHEESES MADE FROM MILK OF DIFFERENT SPECIES. MILK THE VITAL FORCE>, XII INTERNAT. DAIRY CONGRESS, THE HAGUE, 152. 23(A)8.3 AMIGO, L.; CALVO, M.; RAMOS, M. (1987): <QUANTITATIVE DETERMINATION COW'S MILK IN GOAT'S AND EWE'S MILK BY PAGE USING A INTERNAL STANDARD>. II CONGRESO MUNDIAL DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, BARCELONA, 151. 23(A)8.4 CALVO, M. M.; AMIGO, L.; OLANO MARTIN, P. J.; RAMOS, M. (1989): <EFFECT OF THERMAL TREATMENTS ON THE DETERMINATION OF BOVINE MILK ADDED TO OVINE OR CAPRINE MILK>. FOOD CHEMISTRY 32 (99-108). 23(B) DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (METODO INMUNOLOGICO) 23(B)1 PRINCIPIO. EL METODO ESTA BASADO EN LA PRECIPITACION DE LAS INMUNOGLOBILINAS DE LA LECHE DE VACA POR LA ACCION DE UN ANTISUERO ESPECIFICO. LA MUESTRA ES DEPOSITADA EN LOS POCILLOS PRACTICADOS EN UNA CAPA DE AGAR QUE CONTIENE EL ANTISUERO ESPECIFICO DE LA LECHE DE VACA. CUANDO LA MUESTRA CONTIENE LECHE DE VACA SE PRODUCE UNA REACCION QUE SE OBSERVA EN FORMA DE HALO ALREDEDOR DEL PICOLLO DONDE SE HABIA DEPOSITADO DICHA MUESTRA. EL DIAMETRO DE ESTE HALO ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION. EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA O PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 74 GRAD. C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO DE TREINTA SEGUNDOS, FRESCA O CONSERVADA MEDIANTE CONGELACION O ADICION DE DICROMATO POTASICO. 23(B)2 MATERIAL Y APARATOS. 23(B)2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 23(B)2.2 CENTRIFUGA. 23(B)2.3 MICROJERINGA. 23(B)2.4 PLACAS PETRI PREPARADAS CON AGAR CONTENIENDO EL ANTISUERO ESPECIFICO DE LECHE DE VACA. EN LA CAPA DE AGAR SE HAN PRACTICADO 10 POCILLOS CILINDRICOS. 23(B)2.5 ESTUFA REGULADA A 37 GRAD. C. 23(B)2.6 AGITADOR MAGNETICO O EQUIVALENTE. 23(B)2.7 DISPOSITIVO DE LECTURA: LUPA EQUIPADA CON MICROMETRO O UN RETROPROYECTOR. EN SU DEFECTO SE PUEDE UTILIZAR UN DOBLE DECIMETRO GRADUADO AL MEDIO MILIMETRO. 23(B)3 REACTIVOS. 23(B)3.1 CUAJO DE TITULO 1/10.000. 23(B)3.2 SOLUCION DE CLORURO SODICO AL 9/1.000. 23(B)3.3 SOLUCION ACUOSA DE GLICEROL AL 5% (V/V). 23(B)3.4 SOLUCION ACUOSA DE ACIDO ACETICO AL 2% (V/V). 23(B)3.5 SOLUCION DE TINCION. NEGRO AMIDO: 1 GR. SOLUCION ACUOSA DE ACIDO ACETICO AL 2% (V/V): 1.000 ML. 23(B)3.6 SOLUCION ACETICA DE GLICEROL: GLICEROL: 5 ML. ACIDO ACETIDO GLACIAL: 2 M. AGUA DESTILADA: HASTA 100 ML. 23(B)4 PROCEDIMIENTO. 23(B)4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SERICA. AÑADIR A 10 ML DE LECHE UNA GOTA DE CUAJO DE TITULO 1/10.000 (23(B)3.1), MEZCLAR, INCUBAR A 37 GRAD. C DURANTE CINCO A DIEZ MINUTOS Y CENTRIFUGAR A 3.000 R.P.M. DURANTE DIEZ MINUTOS. TOMAR CON CUIDADO EL LACTOSUERO EVITANDO ARRASTRAR MATERIA GRASA. 23(B)4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. PREPARAR MEZCLAS DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O EN LECHE DE CABRA A CONCENTRACIONES DEL 2%, 5%, 10% Y 20%. LA FRACCION SERICA DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 23(B)4.1. 23(B)4.3 INMUNODIFUSION. DEPOSITAR CON LA AYUDA DE UNA MICROJERINGA, 10 ML DE LA FRACCION SERICA PREPARADA SEGUN 23(B)4.1 DE CADA UNO DE LOS PATRONES Y DE LA MUESTRA A ANALIZAR EN LOS POCILLOS DE UNA MISMA PLACA. DEJAR DIFUNDIR DE DOCE A VEINTICUATRO HORAS A 37 GRAD. C EN UNA CAMARA HUMEDA (ESTUFA HERMETICA REGULADA A 37 GRA. C EN CUYO FONDO SE COLOCA UN PLIEGO DE PAPEL DE FILTRO HUMEDECIDO CON AGUA). PARA UNA VALORACION RAPIDA, TRANSCURRIDO ESTE TIEMPO, SE PUEDE PROCEDER A LA LECTURA SEGUN 23(B)4.5. 23(B)4.4 TRATAMIENTO DE LA PLACA. LAVAR LA PLACA DENTRO DE LA SOLUCION DE CLORURO SODCO AL 9/1.000 (23(B)3.2) BAJO AGITACION DURANTE OCHO A DOCE HORAS. LLENAR LA PLACA CON LA SOLUCION ACUOSA DE GLICEROL AL 5% V/V (23(B)3.3) Y MANTENERLA LLENA DIEZ MINUTOS. DEPOSITAR EN LA SUPERFICIE DE LA SOLUCION UN DISCO DE PAPEL DE FILTRO DEL MISMO DIAMETRO QUE EL DE LA PLACA, DEJANDOLO DESLIZAR HASTA EL FONDO. MANTENER EL DISCO DE PAPEL DE FILTRO CONTRA EL AGAR MIENTRAS SE ELIMINA LA SOLUCION DE GLICEROL. VERIFICAR QUE NO HAYA PRESENCIA DE BURBUJAS DE AIRE. DEJAR SECAR VEINTICUATRO HORAS O ACELERAR EL PROCESO CON LA AYUDA DE UN SECADOR DE AIRE, MANTENIENDO LA DISTANCIA QUE PERMITA NO SOBREPASAR LOS 45 GRAD. C A 50 GRAD. C AL NIVEL DE LA PLACA. CUANDO LA PLACA ESTE PERFECTAMENTE SECA, RECUBRIRLA CON AGUA DURANTE ALGUNOS MINUTOS PARA PERMITIR QUE EL PAPEL DE FILTRO SE DESPEGUE PROGRESIVAMENTE. UNA VEZ DESPEGADO RETIRARLO CON UNAS PINZAS. TEÑIR, DURANTE QUINCE MINUTOS, CON LA SOLUCION DE TINCION 23(B)3.5. LAVAR, DURANTE UNOS MINUTOS CADA VEZ, TRES O CUATRO VECES, CON LA SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 2% (23(B)3.4) PARA ELIMINAR EL FONDO. ENJUAGAR DURANTE CINCO MINUTOS EN LA SOLUCION ACETICA DE GLICEROL (23(B)3.6). VACIAR Y DEJAR SECAR. 23(B)4.5 LECTURA DE LOS RESULTADOS. MEDIR LOS DIAMETROS DE LOS HALOS CON LA AYUDA DE UN DOBLE DECIMETRO GRADUADO AL MEDIO MILIMETRO O MEJOR CON UNA LUPA EQUIPADA CON MICROMETRO O CON UN RETROPROYECTOR. 23(B)5 INTERPRETACION DE RESULTADOS. 23(B)5.1 CURVA DE CALIBRADO. EN UN PAPEL MILIMETRADO TRAZAR LA CURVA, LLEVANDO EN ORDENADAS LOS DIAMETROS DE LOS HALOS OBTENIDOS CON LAS MEZCLAS PREPARADAS PARA LA CURVA PATRON Y EN ABSCISAS LAS RAICES CUADRADAS DE LAS CONCENTRACIONES EN LECHE DE VACA. 23(B)5.2 DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE LECHE DE VACA EN LA MUESTRA. LLEVAR SOBRE LA CURVA DE CALIBRADO EL DIAMETRO MEDIDO PARA LA MUESTRA. ELEVAR AL CUADRADO EL DATO OBTENIDO PARA EXPRESAR EL RESULTADO EN PORCENTAJE DE LECHE DE VACA. 23(B)5.3 LIMITE DE DETECCION. LA TECNICA DESCRITA PERMITE DETECTAR UN 1% DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O EN LECHE DE CABRA. 23(B)6 OBSERVACIONES. 23(B)6.1 UNA REACCION NEGATIVA DEBE OBLIGATORIAMENTE SER CONFIRMADA POR LA TECNICA ELECTROFORETICA DE LAS CASEINAS (21.DETECCION DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA). 23(B)6.2 EN EL CASO DE UNA REACCION POSITIVA, SE TENDRA EN CUENTA QUE EL RESULTADO OBTENIDO PUEDE SER INFERIOR AL VALOR REAL, DADO EL EFECTO DE UN TRATAMIENTO TERMICO EFECTUADO EN CONDICIONES DE TEMPERATURA Y/O DE TIEMPO SUPERIORES A LOS FIJADOS EN 23(B)1. 23(B)7 REFERENCIA. 23(B)7.1 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANCAISE (1 DE JUNIO DE 1978). 24(A) DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (METODO ELECTROFORETICO) 24(A).1 PRINCIPIO. LA FRACCION SERICA DE LA MUESTRA SE EXTRAE POR ADICION DE SOLUCION TAMPON A PH 4,6 Y POSTERIOR CENTRIFUGACION. LAS PROTEINAS DE SUERO SON SEPARADAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA A PH 8,3. LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA PRESENTA UNA MENOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LA A LACTOALBUMINA Y LA B LACTOGLOBULINA DE LA LECHE DE OVEJA. 24(A).2 MATERIAL Y APARATOS. 24(A).2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 24(A).2.2 MICROJERINGA. 24(A).2.3 PH METRO. 24(A).2.4 CENTRIFUGA. 24(A).2.5 EQUIPO DE ELECTROFORESIS. 24(A).2.6 FUENTE DE ALIMENTACION. 24(A).2.7 DENSITOMETRO. 24(A).3 REACTIVOS. 24(A).3.1 REACTIVOS PARA LA OBTENCION DE LA FRACCION SERICA: 24(A).3.1.1 SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10 POR 100. 24(A).3.1.2 SOLUCION DE ACETATO SODICO 1N. 24(A).3.2 REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS. 24(A).3.2.1 TAMPON DE LOS GELES PH 8,9: TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 46 G. ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO: 4 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 1.000 ML. 24(A).3.2.2 SOLUCION DE ACRILAMIDA BISACRILAMIDA: (T = 9,4%; C = 4,2) ACRILAMIDA: 9 G. N N' METILENBISACRILAMIDA: 0,4 G. TAMPON DE LOS GELES: 100 ML. 24(A).3.2.3 TAMPON DE LOS ELECTRODOS PH 8,3: TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 1,2 G. GLICINA: 5,8 G. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 24(A).3.2.4 SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10% (ESTE REACTIVO DEBE PREPRARSE CADA SEMANA). 24(A).3.2.5 NNN'N' TETRAMETILETILENDIAMINA (TEMED). 24(A).3.2.6 SOLUCION DE AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000. 24(A).3.2.7 SOLUCION DE GLICEROL AL 40%. 24(A).3.3 REACTIVOS PARA LA TINCION: 24(A).3.3.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. 24(A).3.3.1.1 SOLUCION FIJADORA: ACIDO SULFOSALICILICO: 17,3 G. ACIDO TRICLOROACETICO: 57,5 G. AGUA DESTILADA: HASTA 500 ML. 24(A).3.3.1.2 SOLUCION DECOLORANTE: ETANOL: 500 ML. ACIDO ACETICO GLACIAL: 160 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 24(A).3.3.1.3 SOLUCION DE TINCION: AZUL COOMASSIE BRILLANTE R-250: 0,46 G. SOLUCION DECOLORANTE (24(A).3.3.1.2): 400 ML. 24(A).3.3.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250: 24(A).3.3.2.1 SOLUCION UNICA DE FIJACION Y TINCION: AZUL COOMASSIE G-250: 1 G. AGUA DESTILADA: 500 ML. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2N: 500 ML. SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10N. ACIDO TRICOLORACETICO. DISOLVER EL AZUL DE COOMASSIE G-250 EN AGUA DESTILADA Y AÑADIR LA SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2 N. MEZCLAR BIEN AGITANDO DURANTE UNA HORA Y FILTRAR POR PAPEL WHATMAN NUMERO 1. MEDIR EL VOLUMEN DE FILTRADO Y AÑADI 1/9 DE ESTE VOLUMEN DE LA SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10 N. AÑADIR ACIDO TRICLOROACETICO A ESTA DISOLUCION HASTA QUE LA CONCENTRACION FINAL SEA DEL 12%. ESTA SOLUCION DE TEÑIDO ES ESTABLE DURANTE VARIOS MESES SI EL PH SE MANTIENE POR DEBAJO DE 1. SE PUEDE UTILIZAR VARIAS VECES PERO ES CONVENIENTE FILTRARLA ANTES DE CADA USO. 24(A).4 PROCEDIMIENTO. 24(A).4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SOLUBLE PH 4,6. AÑADIR A 10 ML DE LECHE, 5 ML DE SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10% (24(A).3.1.1) Y 5 ML DE SOLUCION DE ACETATO SODICO 1N (24(A).3.1.2), MEZCLAR Y COMPROBAR CON PH METRO QUE EL PH DE LA MEZCLA ES EXACTAMENTE 4,6. CENTRIGUAR A 3.000 R.P.M. DURANTE 10 MINUTOS Y FILTRAR EL SOBRENADANTE A TRAVES DE UN PAPEL DE FILTRO DE VELOCIDAD MEDIA. 24(A).4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. PREPARAR PATRONES PUROS DE LECHE DE OVEJA Y DE LECHE DE CABRA Y MEZCLAS DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA EN CONCENTRACIONES DEL 5%, 10% Y 20%. LA LECHE UTILIZADA PARA LA PREPARACION DE ESTOS PATRONES PODRA SER CRUDA O PASTERIZADA, EN ESTE ULTIMO CASO LA LECHE DEBERA SER PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 74 GRAD. C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO 30 SEGUNDOS. LA FRACCION SOLUBLE DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 24(A).4.1. 24(A).4.3 INMEDIATAMENTE ANTES DE SU APLICACION EN EL GEL MEZCLAR: 1 VOLUMEN DE LA FRACCION SOLUBLE OBTENIDA SEGUN 24(A).4.1. 1 VOLUMEN DE SOLUCION DE GLICEROL AL 40% (24(A).3.2.7). 1/2 VOLUMEN DE SOLUCION AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000 (24(A).3.2.6). 24(A).4.4 PREPARACION DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. PREPARAR EL GEL LAMINAR DE ESPESOR COMPRENDIDO ENTRE 0,5 MM Y 1 MM. PARA 50 ML DE LA SOLUCION DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA, AÑADIR 0,5 ML DE SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10% (24(A).3.2.4), DESAIREAR EN UN KITASATO MEDIANTE VACIO Y AÑAIR COMO AGENTE POLIMERIZANTE 50ML DE TEMED (24(A).3.2.5). 24(A).4.5 ELECTROFORESIS. COLOCAR EL GEL EN EL APARATO DE ELECTROFORESIS Y LLENAR LAS CAMARAS DE LOS ELECTRODOS CON EL TAMPON PH 8,3 (24(A).3.2.3). APLICAR CON MICROJERINGA EN CADA UNO DE LOS POCILLOS DEL GEL UN VOLUMEN COMPRENDIDO ENTRE 10 ML Y 20 ML DE LAS SOLUCIONES OBTENIDAS SEGUN 24(A).4.3, TANTO DE LA MUESTRA COMO DE LOS PATRONES. LA ELECTROFORESIS SE REALIZA A 60 MA (220 V) DEJANDO CORRER EL FRENTE HASTA QUE LA LINEA DE AZUL DE BROMOFENOL ESTE A 0,5 ML DEL EXTREMO INFERIOR DEL GEL. LA DURACION ES APROXIMADAMENTE DE TRES HORAS. 24(A).4.6 METODOS DE TINCION. 24(A).4.6.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION FIJADORA 24(A).3.3.1.1: UNA HORA. 2. LA SOLUCION DECOLORANTE 24(A).3.3.1.2: DIEZ MINUTOS. 3. LA SOLUCION DE TINCION 24(A).3.3.1.3: DOCE HORAS. 4. LA SOLUCION DECOLORANTE 24(A).3.3.1.2, QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA, HASTA ELIMINAR EL FONDO. 24(A).4.6.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION DE FIJACION/TINCION 24(A)3.3.2.1: DOCE HORAS. 2. AGUA DESTILADA, QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA: UNA HORA. 24(A)5. INTERPRETACION DE RESULTADOS. 24(A)5.1 IDENTIFICACION DE LAS BANDAS. EN EL DIAGRAMA SE OBSERVA EL ORDEN DE LAS BANDAS DE LAS PROTEINAS DE MENOR A MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA EN LA LECHE DE CABRA Y EN LA LECHE DE OVEJA. (DIAGRAMA OMITIDO) 24(A)5.2 DENSITOMETRIA. MEDIR LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CON DENSITOMETRO A UNA LONGITUD DE ONDA DE 560 NM SI SE UTILIZA COOMASSIE R-250 EN LA TINCION Y DE 600 NM SI SE UTILIZA EL METODO DEL COOMASSIE G-250. 24(A)5.3 CUANTIFICACION. COMO SE PUEDE OBSERVAR EN EL DIAGRAMA, LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA PRESENTA UNA MENOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LA A LACTOALBUMINA Y LA B LACTOGLOBULINA DE OVEJA. AL AUMENTAR EL PORCENTAJE DE LECHE DE CABRA PRESENTE EN LA MUESTRA, AUMENTA LA INTENSIDAD DE LA BANDA CORRESPONDIENTE A LA B LACTOGLOBULINA DE LA LECHE DE CABRA Y, POR TANTO, AUMENTA LA ALTURA DEL PICO OBTENIDO EN EL DENSITOGRAMA. MEDIR LA ALTURA DEL PICO DE LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA Y DEL PICO DE LA SEROALBUMINA (BSA). A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA LOS PATRONES, RESULTA LA RECTA DE REGRESION Y = AX + B, DONDE (FORMULAS OMITIDAS) 24(A)6 EXPRESION DE RESULTADOS. EXPRESAR EL CONTENIDO EN LECHE DE CABRA SEGUN LOS SIGUIENTES INTERVALOS: MENOR DEL 5 POR 100. ENTRE EL 5 Y EL 10 POR 100. ENTRE EL 10 Y EL 20 POR 100. MAYOR DEL 20 POR 100. SIENDO EL LIMITE DE DETECCION PRACTICO DEL 2 POR 100 DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA. 24(A)7 REFERENCIAS. 24(A)7.1 RAMOS, M.; JUAREZ, M. (1986): <CHROMATOGRAPHIE, ELECTROPHORETIC AND IMMUNOLOGICAL METHODS FOR DETECTING MIXTURES OF MILKS FROM DIFFERENT SPECIES>. 24(A)7.2 AMIGO, L.; SANTAMARIA, G.; GONZALEZ DEL LLANO, D.; RAMOS, M. (1986): <POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS OF WHEY PROTEINS IN CHEESES MEDE FROM MILK OF DIFFERENT SPECIES. MILK THE VITAL FORCE>, XII INTERNAT. DAIRY CONGRESS, THE HAGUE, 152. 24(A)7.3 AMIGO, L.; CALVO, M.; RAMOS, M. (1987): <QUANTITATIVE DETERMINATION COW'S MILK IN GOAT'S AND EWE'S MILK BY PAGE USING A INTERNAL STANDARD>. II CONGRESO MUNDIAL DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, BARCELONA, 151. 24(A)7.4 CALVO, M. M.; AMIGO, L.; OLANO A.; MARTIN, P. J.; RAMOS, M. (1989): <EFFECT OF THERMAL TREATMENTS ON THE DETERMINATION OF BOVINE MILK ADDED TO OVINE OR CAPRINE MILK>. FOOD CHEMISTRY 32 (99-108). 24(B) DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (METODO INMUNOLOGICO) 24(B)1 PRINCIPIO. EL METODO ESTA BASADO EN LA PRECIPITACION DE LAS INMUNOGLOBULINAS DE LA LECHE DE CABRA POR LA ACCION DE UN ANTISUERO ESPECIFICO. LA MUESTRA ES DEPOSITADA EN LOS POCILLOS PRACTICADOS EN UNA CAPA DE AGAR QUE CONTIENE EL ANTISUERO ESPECIFICO DE LA LECHE DE CABRA. CUANDO LA MUESTRA CONTIENE LECHE DE CABRA SE PRODUCE UNA REACCION QUE SE OBSERVA EN FORMA DE HALO ALREDEDOR DEL POCILLO DONDE SE HABIA DEPOSITADO DICHA MUESTRA. EL DIAMETRO DE ESTE HALO ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE LECHE DE CABRA. EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA O PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 74 GRAD. C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO DE TREINTA SEGUNDOS, FRESCA O CONSERVADA MEDIANTE CONGELACION O ADICION DE DICROMATO POTASICO. 24(B)2 MATERIAL Y APARATOS. 24(B)2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 24(B)2.2 CENTRIFUGA. 24(B)2.3 MICROJERINGA. 24(B)2.4 PLACAS PETRI PREPARADAS CON AGAR CONTENIENDO EL ANTISUERO ESPECIFICO DE LECHE DE CABRA. EN LA CAPA DE AGAR SE HAN PRACTICADO 10 POCILLOS CILINDRICOS. 24(B)2.5 ESTUFA REGULADA A 37 GRAD. C. 24(B)2.6 AGITADOR MAGNETICO O EQUIVALENTE. 24(B)2.7 DISPOSITIVO DE LECTURA: LUPA EQUIPADA CON MICROMETRO O UN RETROPROYECTOR. EN SU DEFECTO SE PUEDE UTILIZAR UN DOBLE DECIMETRO GRADUADO AL MEDIO MILIMETRO. 24(B)3 REACTIVOS. 24(B)3.1 CUAJO DE TITULO 1/10.000. 24(B)3.2 SOLUCION DE CLORURO SODICO A 9/1.000. 24(B)3.3 SOLUCION ACUOSA DE GLICEROL AL 5% (V/V). 24(B)3.4 SOLUCION ACUOSA DE ACIDO ACETICO AL 2% (V/V). 24(B)3.5 SOLUCION DE TINCION: NEGRO AMIDO: 1 G. SOLUCION ACUOSA DE ACIDO ACETICO AL 2% (V/V): 1.000 ML (24(B)3.4). 24(B)3.6 SOLUCION ACETICA DE GLICEROL: GLICEROL: 5 ML. ACIDO ACETICO GLACIAL: 2 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 100 ML. 24(B)4 PROCEDIMIENTO. 24(B)4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SERICA. AÑADIR A 10 MICROL. DE LECHE, UNA GOTA DE CUAJO DE TITULO 1/10.000 (24(B)3.1), MEZCLAR, INCUBAR A 37 GRAD. C DURANTE CINCO A DIEZ MINUTOS Y CENTRIFUGAR A 3.000 R.P.M. DURANTE DIEZ MINUTOS. TOMAR CON CUIDADO EL LACTOSUERO EVITANDO ARRASTRAR MATERIA GRASA. 24(B)4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. PREPARAR MEZCLAS DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA EN CONCENTRACIONES DEL 2%, 5%, 10% Y 20%. LA FRACCION SERICA DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 24(B)4.1. 24(B)4.3 INMUNODIFUSION. DEPOSITAR CON LA AYUDA DE UNA MICROJERINGA, 10 ML DE LA FRACCION SERICA PREPARADA SEGUN 24(B)4.1 DE CADA UNO DE LOS PATRONES Y DE LA MUESTRA A ANALIZAR EN LOS POCILLOS DE UNA MISMA PLACA. DEJAR DIFUNDIR DE DOCE A VEINTICUATRO HORAS A 37 GRAD. C EN UNA CAMARA HUMEDA (ESTUFA HERMETICA REGULADA A 37 GRAD. C EN CUYO FONDO SE COLOCA UN PLIEGO DE PAPEL DE FILTRO HUMEDECIDO CON AGUA). 24(B)4.4 TRATAMIENTO DE LA PLACA. LAVAR LA PLACA DENTRO DE LA SOLUCION DE CLORURO SODICO AL 9/1.000 (24(B)3.2) BAJO AGITACION DURANTE OCHO A DOCE HORAS. LLENAR LA PLACA CON LA SOLUCION ACUOSA DE GLICEROL AL 5% V/V (24(B)3.3) Y MANTENERLA LLENA DIEZ MINUTOS. DEPOSITAR EN LA SUPERFICIE DE LA SOLUCION UN DISCO DE PAPEL DE FILTRO DEL MISMO DIAMETRO QUE EL DE LA PLACA, DEJANDOLO DESLIZAR HASTA EL FONDO. MANTENER EL DISCO DE PAPEL DE FILTRO CONTRA EL AGAR MIENTRAS SE ELIMINA LA SOLUCION DE GLICEROL. VERIFICAR QUE NO HAYA PRESENCIA DE BURBUJAS DE AIRE. DEJAR SECAR VEINTICUATRO HORAS O ACELERAR EL PROCESO CON LA AYUDA DE UN SECADOR DE AIRE, MANTENIENDO LA DISTANCIA QUE PERMITA NO SOBREPASAR LOS 45 GRAD. C A 50 GRAD. C AL NIVEL DE LA PLACA. CUANDO LA PLACA ESTE PERFECTAMENTE SECA, RECUBRIRLA CON AGUA DURANTE ALGUNOS MINUTOS PARA PERMITIR QUE EL PAPEL DE FILTRO SE DESPEGUE PROGRESIVAMENTE. UNA VEZ DESPEGADO RETIRARLO CON UNAS PINZAS. TEÑIR, DURANTE QUINCE MINUTOS, CON LA SOLUCION DE TINCION 24(B)3.5. LAVAR, DURANTE UNOS MINUTOS CADA VEZ, TRES O CUATRO VECES, CON LA SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 2% (24(B)3.4) PARA ELIMINAR EL FONDO. ENJUAGAR DURANTE CINCO MINUTOS EN LA SOLUCION ACETICA DE GLICEROL (24(B)3.6). VACIAR Y DEJAR SECAR. 24(B)4.5 LECTURA DE LOS RESULTADOS. MEDIR LOS DIAMETROS DE LOS HALOS CON LA AYUDA DE UN DOBLE DECIMETRO GRADUADO AL MEDIO MILIMETRO O MEJOR CON UNA LUPA EQUIPADA CON MICROMETRO O CON UN RETROPROYECTOR. 24(B)5 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS. 24(B)5.1 CURVA DE CALIBRADO. EN UN PAPEL MILIMETRADO TRAZAR LA CURVA, LLEVANDO EN ORDENADAS LOS DIAMETROS DE LOS HALOS OBTENIDOS CON LAS MEZCLAS PREPARADAS PARA LA CURVA PATRON Y EN ABSCISAS LAS RAICES CUADRADAS DE LAS CONCENTRACIONES EN LECHE DE CABRA. 24(B)5.2 DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE LECHE DE CABRA EN LA MUESTRA. LLEVAR SOBRE LA CURVA DE CALIBRADO EL DIAMETRO MEDIDO PARA LA MUESTRA. ELEVAR AL CUADRADO EL DATO OBTENIDO PARA EXPRESAR EL RESULTADO EN PORCENTAJE DE LECHE DE CABRA. 24(B)5.3 LIMITE DE DETECCION. LA TECNICA DESCRITA PERMITE DETECTAR UN 1% DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA. 24(B)6 OBSERVACIONES. 24(B)6.1 UNA REACCION NEGATIVA DEBE OBLIGATORIAMENTE SER CONFIRMADA POR LA TECNICA ELECTROFORETICA DE LAS PROTEINAS DEL SUERO (24(A). DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (METODO ELECTROFORETICO)). 24(B)6.2 EN EL CASO DE UNA REACCION POSITIVA, SE TENDRA EN CUENTA QUE EL RESULTADO OBTENIDO PUEDE SER INFERIOR AL VALOR REAL, DADO EL EFECTO DE UN TRATAMINTO TERMICO EFECTUADO EN CONDICIONES DE TEMPERATURA Y/O DE TIEMPO SUPERIORES A LOS FIJADOS EN 24(B)1. 24(B)7 REFERENCIA. JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRAN.CAISE (1 DE JUNIO DE 1978). 10. EXTRACCION DE LA GRASA EN MANTEQUILLA 10.1 PRINCIPIO. SEPARACION DE LAS FASES ACUOSA Y GRASA MEDIANTE FUSION, DECANTACION Y FILTRACION. 10.2 MATERIAL Y APARATOS. 10.2.1 ESTUFA DE DESECACION. 10.3 PROCEDIMIENTO. TOMAR APROXIMADAMENTE 50 G DE LA MUESTRA DE MANTEQUILLA EN UNA CAPSULA DE PORCELANA E INTRODUCIRLA EN UNA ESTUFA DE DESECACION A UNA TEMPERATURA ENTRE 45 GRAD. C Y 50 GRAD. C HASTA SEPARACION DE LAS FASES ACUOSA Y GRASA. SEPARAR LA CAPA GRASA POR DECANTACION Y FILTRAR A TRAVES DE PAPEL DE FILTRO SECO, EVITANDO QUE PASE LA FASE ACUOSA, MANTENIENDO UNA TEMPERATURA DE UNOS 40 GRAD. C. 10.4 REFERENCIAS. 1. NORMA INTERNACIONAL FIL-IDF 32: 1965. 7. NITRATOS Y NITRITOS EN QUESOS 7.1 PRINCIPIO. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA CON AGUA CALIENTE, PRECIPITACION DE LA GRASA Y PROTEINA Y FILTRACION. REDUCCION EN UNA PORCION DEL FILTRADO DEL NITRATO A NITRITO, POR MEDIO DE UNA COLUMNA DE CADMIO. DESARROLLO DE UNA REACCION COLOREADA EN ALICUOTAS DEL FILTRADO NO REDUCIDA, POR ADICION DE SULFANILAMIDA Y CLORURO DE N-1 NAFTILETILENDIAMINA. MEDICION DE LA ABSORBANCIA DE LA SOLUCION OBTENIDA A 538 NM. 7.2 MATERIAL Y APARATOS. 7.2.1 APARATO APROPIADO PARA TRITURAR LA MUESTRA. 7.2.2 MEZCLADOR-HOMOGENEIZADOR CON RECIPIENTE DE VIDRIO DE 250 Y 400 ML. 7.2.3 PAPEL DE FILTRO DE PORO MEDIO, DE 15 CM DE DIAMETRO, EXENTO DE NITRATOS Y NITRITOS. 7.2.4 COLUMNA DE REDUCCION SIMILAR A LA DE LA FIGURA. 7.2.5 COLORIMETRO FOTOELECTRICO O ESPECTROFOTOMETRO QUE PERMITA LECTURAS A UNA LONGITUD DE ONDA DE 538 NM. 7.3 REACTIVOS. 7.3.1 GRANULOS DE CADMIO DE DIAMETRO APROXIMADO 0,3 A 0,8 MM. 7.3.2 SOLUCION DE SULFATO DE COBRE (II). DISOLVER 20 G DE SULFATO DE COBRE (II) PENTAHIDRATADO EN AGUA Y DILUIR A 1.000 ML. 7.3.3 SOLUCION TAMPON PH 9,6 A 9,7. DILUIR 50 ML DE ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (D = 1,19 G/ML) CON 600 ML DE AGUA DESTILADA. DESPUES DE MEZCLAR AÑADIR 140 ML DE SOLUCION DE AMONIACO AL 25% (P/P). DILUIR A 1.000 ML CON AGUA Y MEZCLAR. AJUSTAR EL PH A 9,6-9,7 SI ES NECESARIO. 7.3.4 ACIDO CLORHIDRICO 2 N. DILUIR 160 ML DE ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (D = 1,19 G/ML) A 1.000 ML CON AGUA. 7.3.5 ACIDO CLORHIDRICO 0,1 N. DILUIR 50 ML DE LA SOLUCION 7.3.4 A 1.000 ML CON AGUA. 7.3.6 SOLUCION DE SULFATO DE ZINC. DISOLVER 53,5 G DE SULFATO DE ZINC (ZNSO 4 H 2 O) EN AGUA Y DILUIR A 100 ML. 7.3.7 SOLUCION DE FERROCIANURO POTASICO. DISOLVER 17,2 G DE FERROCIANURO POTASICO (K 4 FE (CN) 6 H 2 O) EN AGUA Y DILUIR A 100 ML. 7.3.8 SOLUCION EDTA. DISOLVER 33,5 G DE EDTA (NA 2 C 10 H 14 N 2 O 8 H 2 O) EN AGUA Y DILUIR A 1.000 ML. 7.3.9 SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO (SOL.I). DILUIR 540 ML DE ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (D = 1,19 G/ML) A 1.000 ML CON AGUA. 7.3.10 SOLUCION DE SULFANILAMIDA (SOL.II). DISOLVER, CALENTANDO EN BAÑO DE AGUA 0,5 G DE SULFANILAMIDA (NH 2 C 6 H 4 SO 2 NH 2 ) EN UNA MEZCLA DE 75 ML DE AGUA Y 5 ML DE ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (D = 1,19 G/ML). ENFRIAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y DILUIR A 100 ML CON AGUA. FILTRAR SI ES NECESARIO. 7.3.11 SOLUCION DE NAFTILETILENDIAMINA (SOL.III). DISOLVER 0,1 G DE CLORURO DE N1 NAFTILENDIAMINA (C 10 H 7 NHCH 2. NH 2. 2HCL) EN AGUA. DILUIR A 100 ML CON AGUA. FILTRAR SI ES NECESARIO. ESTA SOLUCION SE PUEDE CONSERVAR HASTA UNA SEMANA EN REFRIGERADOR EN UN RECIPIENTE OSCURO BIEN CERRADO. 7.3.12 SOLUCION PATRON DE NITRATO DE SODIO. DISOLVER EN AGUA 0,150 G DE NITRITO DE SODIO DESECADO A PESO CONSTANTE A 110-120 GRAD. C, DILUIR A 1.000 ML CON AGUA Y MEZCLAR. EN EL MOMENTO DE SU EMPLEO DILUIR 10 ML DE ESTA SOLUCION CON 20 ML DE SOLUCION TAMPON (7.3.3) Y DILUIR A 1.000 ML CON AGUA. 1 ML DE ESTA SOLUCION FINAL CONTIENE 1,00 G DE NO 2 7.3.13 SOLUCION PATRON DE NITRATO DE POTASIO. DISOLVER EN AGUA 1,468 G DE NITRATO DE POTASIO DESECADO A PESO CONSTANTE A 110-120 GRAD. C Y DILUIR A 1.000 ML CON AGUA. EN EL MOMENTO DE SU EMPLEO DILUIR 5 ML DE LA SOLUCION TAMPON (7.3.3) Y DILUIR A 1.000 ML CON AGUA. 1 ML DE ESTA SOLUCION FINAL CONTIENE 4,5 G DE NO 3 7.4 PROCEDIMIENTO. 7.4.1 PREPARACION DE LA COLUMNA DE CADMIO. 7.4.1.1 LLEVAR LOS GRANULOS DE CADMIO (APROXIMADAMENTE 40-60 G PARA CADA COLUMNA) A UN ERLENMEYER DE 250 ML. AÑADIR SUFICIENTE SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 2 N (7.3.4) PARA CUBRIR EL CADMIO. AGITAR DURANTE UNOS MINUTOS. DECANTAR LA SOLUCION Y LAVAR EL CADMIO EN EL MATRAZ CON AGUA HASTA QUE ESTE LIBRE DE CLORUROS. AÑADIR LA SOLUCION DE SULFATO DE COBRE (II) (APROXIMADAMENTE 2,5 ML POR G DE CADMIO) Y AGITAR DURANTE UN MINUTO. DECANTAR LA SOLUCION Y LAVAR EL CADMIO CUPRIZADO INMEDIATAMENTE CON AGUA, TENIENDO CUIDADO DE QUE EL CADMIO ESTE CUBIERTO CON AGUA EN TODO MOMENTO. TERMINAR EL LAVADO CUANDO EL AGUA ESTE EXENTA DE COBRE PRECIPITADO. 7.4.1.2 LLENAR LA COLUMNA CON AGUA (VER FIGURA) Y LLEVAR EL CADMIO CUPRIZADO A LA MISMA, CON LA MINIMA EXPOSICION AL AIRE. LA ALTURA DEL CADMIO DEBE SER DE 15 A 20 CENTIMETROS. SE DEBE EVITAR QUE QUEDEN ATRAPADAS BURBUJAS DE AIRE ENTRE LOS GRANULOS DE CADMIO Y QUE EL NIVEL DEL LIQUIDO QUEDE POR DEBAJO DE LA PARTE SUPERIOR DEL CADMIO. 7.4.1.3 ACONDICIONAR LA COLUMNA HACIENDO PASAR UNA MEZCLA DE 750 ML DE AGUA, 225 ML DE SOLUCION PATRON DE NITRATO DE POTASIO (7.3.1.2), 20 ML DE SOLUCION TAMPON (7.3.3) Y 20 ML DE SOLUCION EDTA (7.3.8) A UN FLUJO NO SUPERIOR A 6 ML/MIN. LAVAR LA COLUMNA CON 50 ML DE AGUA. 7.4.2 COMPROBACION DE LA CAPACIDAD DE REDUCCION DE LA COLUMNA. 7.4.2.1 PIPETEAR 20 ML DE SOLUCION PATRON DE NITRATO DE POTASIO (7.3.1.2) Y LLEVARLOS AL DEPOSITO SUPERIOR DE LA COLUMNA. AÑADIR INMEDIATAMENTE 5 ML DE SOLUCION TAMPON (7.3.3). ELUIR A UN FLUJO NO SUPERIOR A 6 ML/MIN Y RECOGER EL ELUIDO EN UN MATRAZ AFORADO DE 100 ML. CUANDO EL DEPOSITO SE HA VACIADO CASI COMPLETAMENTE, LAVAR LAS PAREDES DEL MISMO CON 15 ML DE AGUA Y REPETIR ESTA OPERACION CON OTROS 15 ML DE AGUA. CUANDO ESTA SEGUNDA PORCION DE AGUA HA PASADO A LA COLUMNA, LLENAR COMPLETAMENTE EL DEPOSITO CON AGUA Y ELUIR CON LA MAXIMA VELOCIDAD DE FLUJO POSIBLE. CUANDO SE HAYAN RECOGIDO CASI 100 ML RETIRAR EL MATRAZ, COMPLETAR HASTA EL AFORO Y MEZCLAR BIEN. 7.4.2.2 PIPETEAR 10 ML DEL ELUIDO A UN MATRAZ AFORADO DE 100 ML. AÑADIR AGUA HASTA UN VOLUMEN APROXIMADO DE 60 ML Y PROCEDER DE LA FORMA ESPECIFICADA EN (7.4.8). SI LA CONCENTRACION DE NITRITO EN EL ELUIDO DETERMINADA A PARTIR DE LA CURVA DE CALIBRACION (7.4.9) ESTA POR DEBAJO DE 0,63 G DE NO 2 POR ML (95 POR 100 DEL VALOR TEORICO), SE DEBE DEGENERAR LA COLUMNA, 100 POR 100 DEL RENDIMIENTO CORRESPONDE A 0,66 G DE NITRITOS POR ML. 7.4.3 REGENERACION DE LA COLUMNA: LA COLUMNA SE DEBE REGENERAR CADA DIA DESPUES DE SU EMPLEO, O MAS FRECUENTEMENTE SI SE OBSERVA UNA PERDIDA DE EFICACIA, DE LA SIGUIENTE MANERA: AÑADIR 5 ML DE LA SOLUCION EDTA (7.3.8) Y 2 ML DE ACIDO CLORHIDRICO 0,1 N (7.3.5) A 100 ML DE AGUA. PASAR LA MEZCLA A TRAVES DE LA COLUMNA A UN FLUJO APROXIMADO DE 10 ML/MIN. CUANDO EL DEPOSITO SE HA VACIADO, LAVAR LA COLUMNA CON AGUA, SOLUCION DE HCI 0,1 N Y AGUA SUCESIVAMENTE. SI LA COLUMNA NO MUESTRA TODAVIA UNA EFICACIA SATISFACTORIA, REPETIR EL PROCEDIMIENTO ESPECIFICADO EN 7.4.1.3. 7.4.4 PREPARACION DE LA MUESTRA: ANTES DEL ANALISIS QUITAR LA CORTEZA O LA CAPA SUPERFICIAL, DE MODO QUE SE OBTENGA UNA MUESTRA REPRESENTATIVA DEL QUESO TAL Y COMO SE CONSUME HABITUALMENTE. TRITURAR LA MUESTRA CON UN TRITURADOR U OTRO APARATO APROPIADO Y MEZCLAR CUIDADOSAMENTE, EVITANDO LAS PERDIDAS POR EVAPORACION. LA MUESTRA ASI PREPARADA SE CONSERVARA EN UN RECIPIENTE CERRADO HASTA EL MOMENTO DEL ANALISIS, QUE SE REALIZARA TAN PRONTO COMO SEA POSIBLE. SI EL RETRASO ES INEVITABLE SE DEBEN TOMAR TODAS LAS PRECAUCIONES PARA ASEGURAR LA CONSERVACION DE LA MUESTRA Y PARA PREVENIR LA CONDENSACION DE HUMEDAD EN LA SUPERFICIE INTERIOR DEL RECIPIENTE. 7.4.5 EXTRACCION Y DESPROTEINIZACION: PESAR CON PRECISION DE 1 MG, 10 G DE MUESTRA Y LLEVARLOS AL RECIPIENTE DE VIDRIO DEL MEZCLADOR-HOMOGENEIZADOR. AÑADIR GRADUALMENTE 164 ML DE AGUA A 50-55 C. MEZCLAR HASTA QUE EL QUESO ESTE BIEN SUSPENDIDO. AÑADIR EN EL SIGUIENTE ORDEN: 6 ML DE SOLUCION DE SULFATO DE ZINC (7.3.6), 6 ML DE SOLUCION DE FERROCIANURO POTASICO (7.3.7) Y 20 ML DE SOLUCION TAMPON (7.3.3) A LA SUSPENSION DE QUESO, AGITANDO CUIDADOSAMENTE DESPUES DE CADA ADICION. DESPUES DE TRES MINUTOS FILTRAR A TRAVES DEL PAPEL DE FILTRO, RECOGIENDO EL FILTRADO EN UN ERLENMEYER DE 250 ML. ES NECESARIO OBTENER UN FILTRADO TRANSPARENTE. POR ESTA RAZON, EN ALGUNOS QUESOS PUEDE SER NECESARIO AÑADIR UNA CANTIDAD MAYOR DE REACTIVOS DE PRECIPITACION, DISMINUYENDO EN ESTE CASO LA CANTIDAD DE AGUA EN LA MISMA PROPORCION. 7.4.6 REDUCCION DE NITRATO A NITRITO: PIPETEAR 20 ML DEL FILTRADO OBTENIDO EN EL APARTADO ANTERIOR Y OPERAR DE LA MISMA FORMA QUE EN EL APARTADO (7.4.2.1). 7.4.7 PREPARACION DE LA SOLUCION PARA LA DETERMINACION DE NITRITO EN LA MUESTRA: PIPETEAR 20 ML DEL FILTRADO DEL APARTADO 7.4.5 EN UN MATRAZ AFORADO DE 100 ML Y COMPLETAR CON AGUA. MEZCLAR BIEN. 7.4.8 DETERMINACION COLORIMETRICA: PIPETEAR ALICUOTAS IGUALES DEPENDIENDO DEL CONTENIDO PROBABLE EN NITRITOS, DE LA SOLUCION 7.4.7 Y DEL ELUIDO DEL APARTADO 7.4.6 EN MATRACES AFORADOS DE 100 ML. AÑADIR AGUA HASTA UN VOLUMEN APROXIMADO DE 60 ML. AÑADIR 5 ML DE SOLUCION I (7.4.9) Y 5 ML DE LA SOLUCION II (7.3.10). MEZCLAR CUIDADOSAMENTE Y DEJAR REPOSAR LA SOLUCION DURANTE CINCO MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE PROTEGIENDOLA DE LA LUZ SOLAR DIRECTA. AÑADIR 2 ML DE SOLUCION III. MEZCLAR CUIDADOSAMENTE Y DEJAR REPOSAR CINCO MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE AL ABRIGO DE LA LUZ SOLAR DIRECTA. COMPLETAR HASTA 100 ML CON AGUA Y MEZCLAR BIEN. MEDIR EN EL PLAZO DE QUINCE MINUTOS LA ABSORBANCIA DE LA SOLUCION FRENTE AL ENSAYO EN BLANCO (7.4.10) A UNA LONGITUD DE ONDA DE 538 NM. 7.4.9 CURVA DE CALIBRACION: PIPETEAR 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 Y 20 ML DE LA SOLUCION PATRON DE NITRITO DE SODIO (7.3.11.) EN MATRACES AFORADOS DE 100 ML. AÑADIR AGUA HASTA UN VOLUMEN APROXIMADO DE 60 ML. LLEVAR A CABO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN (7.4.8). REPRESENTAR LAS ABSORBANCIAS OBTENIDAS FRENTE A LAS CONCENTRACIONES DE NITRITO, EN MICROGRAMOS POR MILILITRO. 7.4.10 ENSAYO EN BLANCO: LLEVAR A CABO UN ENSAYO EN BLANCO USANDO TODOS LOS REACTIVOS, PERO SUSTITUYENDO LOS 10 G DE MUESTRA POR 4 ML DE AGUA. 7.5 CALCULO. 7.5.1 CONTENIDO EN NITRITOS: CONTENIDO EN NO 2 (MG/KG) = (100.000 X C 1) / (M X V) SIENDO: M = PESO EN GRAMOS DE LA MUESTRA. C 1 = CONCENTRACION EN MICROGRAMOS DE NO 2 POR ML, OBTENIDOS A PARTIR DE LA CURVA DE CALIBRACION, CORRESPONDIENTE A LA ABSORBANCIA DE LA SOLUCION OBTENIDA USANDO EL FILTRADO DILUIDO (7.4.7). V = VOLUMEN EN ML DE LA ALICUOTA TOMADA EN (7.4.8) SOBRE EL FILTRADO DILUIDO (7.4.7). 7.5.2 CONTENIDO EN NITRATO: (FORMULA OMITIDA) 7.6 REFERENCIAS. 1. NORMA INTERNACIONAL L FIL-IDF 84 A: 1984. 8. DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN QUESO DE OVEJA O DE CABRA (METODO ELECTROFORETICO) 8.1 PRINCIPIO. LA FRACCION SERICA DE LA MUESTRA SE EXTRAE POR ADICION DE SOLUCION TAMPON A PH 4,6 Y POSTERIOR CENTRIFUGACION. LAS PROTEINAS DE SUERO SON SEPARADAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA A PH 8,3. LAS B LACTOGLOBULINAS DE LECHE DE VACA PRESENTAN UNA MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA DE LAS A LACTOALBUMINAS Y LAS B LACTOGLOBULINAS DE LA LECHE DE OVEJA Y DE LA LECHE DE CABRA. EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA O PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 90 C, DURANTE TREINTA SEGUNDOS, FRESCA O CONSERVADA MEDIANTE CONGELACION O ADICION DE DICROMATO POTASICO. 8.2 MATERIAL Y APARATOS. 8.2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 8.2.2 MICROJERINGA. 8.2.3 PH METRO. 8.2.4 CENTRIFUGA. 8.2.5 EQUIPO DE ELECTROFORESIS. 8.2.6 FUENTE DE ALIMENTACION. 8.2.7 DENSITOMETRO. 8.3 REACTIVOS. 8.3.1 REACTIVOS PARA LA OBTENCION DE LA FRACCION SERICA. 8.3.1.1 SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10 POR 100. 8.3.1.2 SOLUCION DE ACETATO SODICO 1 N. 8.3.2 REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS. 8.3.2.1 TAMPON DE LOS GELES PH 8,9. TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 46 G. ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO: 4 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 1.000 ML. 8.3.2.2 SOLUCION DE ACRILAMIDA BISACRILAMIDA (T = 9,4 POR 100, C = 4,2). ACRILAMIDA: 9 G. N N METILENBISACRILAMIDA: 0,4 G. TAMPON DE LOS GELES: 100 ML. 8.3.2.3 TAMPON DE LOS ELECTRODOS PH 8,3. TRISIDROXIMETIL AMINOMETANO: 1,2 G. GLICINA: 5,8 G. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 8.3.2.4 SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10 POR 100 (ESTE REACTIVO DEBE PREPARARSE CADA SEMANA). 8.3.2.5 NNNN TETRAMETILETILENDIAMINA (TEMED). 8.3.2.6 SOLUCION DE AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000. 8.3.2.7 SOLUCION DE GLICEROL AL 40 POR 100. 8.3.3 REACTIVOS PARA LA TINCION. 8.3.3.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. 8.3.3.1.1 SOLUCION FIJADORA. ACIDO SULFOSALICILICO: 17,3 G. ACIDO TRICLOROACETICO: 57,5 G. AGUA DESTILADA: HASTA 500 ML. 8.3.3.1.2 SOLUCION DECOLORANTE. ETANOL: 500 ML. ACIDO ACETICO GLACIAL: 160 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 8.3.3.1.3 SOLUCION DE TINCION. AZUL COOMASSIE BRILLANTE R-250: 0,46 G. SOLUCION DECOLORANTE (8.3.3.1.2): 400 ML. 8.3.3.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. 8.3.3.2.1 SOLUCION UNICA DE FIJACION Y TINCION. AZUL COOMASSIE G-250: 1 G. AGUA DESTILADA: 500 ML. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2 N: 500 ML. SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10 N. ACIDO TRICLOROACETICO. DISOLVER EL AZUL DE COOMASSIE G-250 EN AGUA DESTILADA Y AÑADIR LA SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2 N. MEZCLAR BIEN AGITANDO DURANTE UNA HORA Y FILTRAR POR PAPEL WHATMAN NUMERO 1. MEDIR EL VOLUMEN DE FILTRADO Y AÑADIR 1/9 DE ESTE VOLUMEN DE LA SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO 10 N. AÑADIR ACIDO TRICLOROACETICO A ESTA DISOLUCION HASTA QUE LA CONCENTRACION FINAL SEA DEL 12 POR 100. ESTA SOLUCION DE TEÑIDO ES ESTABLE DURANTE VARIOS MESES SI EL PH SE MANTIENE POR DEBAJO DE 1. SE PUEDE UTILIZAR VARIAS VECES PERO ES CONVENIENTE FILTRARLA ANTES DE CADA USO. 8.4 PROCEDIMIENTO. 8.4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SOLUBLE A PH 4,6. PESAR 15 G DE QUESO PREVIAMENTE TRITURADO, AÑADIR 5 ML DE SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10 POR 100 (8.3.1.1) Y 5 ML DE SOLUCION DE ACETATO SODICO 1 N (8.3.1.2), HOMOGENEIZAR Y COMPROBAR CON PH METRO QUE EL PH DE LA MEZCLA ES EXACTAMENTE 4,6. CENTRIFUGAR A 3.000 R.P.M. DURANTE DIEZ MINUTOS Y FILTRAR EL SOBRENADANTE A TRAVES DE UN PAPEL DE FILTRO DE VELOCIDAD MEDIA. 8.4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. DEPENDIENDO DEL TIPO DE MUESTRA QUE SE DESEA ANALIZAR, PARTIR DE PATRONES DE QUESOS PUROS DE OVEJA O DE CABRA Y DE VACA, ASI COMO PATRONES DE QUESOS DE MEZCLA DE VACA EN OVEJA O DE VACA EN CABRA, EN CONCENTRACIONES DEL 5 POR 100, 10 POR 100 Y 20 POR 100. LA LECHE UTILIZADA PARA LA FABRICACION DE ESTOS QUESOS PATRON PODRA SER CRUDA O PASTEURIZADA, EN ESTE ULTIMO CASO LA LECHE DEBERA SER PASTEURIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 74 GRAD. C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO DE TREINTA SEGUNDOS. LA FRACCION SOLUBLE DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 8.4.1. 8.4.3 INMEDIATAMENTE ANTES DE SU APLICACION EN GEL MEZCLAR. UN VOLUMEN DE LA FRACCION SOLUBLE OBTENIDA SEGUN 8.4.1. UN VOLUMEN DE LA SOLUCION DE GLICEROL AL 40 POR 100 (8.3.2.7). MEDIO VOLUMEN DE LA SOLUCION AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000 (8.3.2.6). 8.4.4 PREPARACION DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. PREPARAR EL GEL LAMINAR DE ESPESOR COMPRENDIDO ENTRE 0,5 MM Y 1 MM. PARA 50 ML DE LA SOLUCION DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA, AÑADIR 0,5 ML DE SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10 POR 100 (8.3.2.4), DESAIREAR EN UN KITASATO MEDIANTE VACIO Y AÑADIR COMO AGENTE POLIMERIZANTE 50 ML DE TEMED (8.3.2.5). 8.4.5 ELECTROFORESIS. COLOCAR EL GEL EN EL APARATO DE ELECTROFORESIS Y LLENAR LAS CAMARAS DE LOS ELECTRODOS CON EL TAMPON PH 8,3 (8.3.2.3). APLICAR CON MICROJERINGA EN CADA UNO DE LOS POCILLOS DEL GEL UN VOLUMEN COMPRENDIDO ENTRE 10 MICROL. Y 20 MICROL. DE LAS SOLUCIONES OBTENIDAS SEGUN 8.4.3, TANTO DE LA MUESTRA COMO DE LOS PATRONES. LA ELECTROFORESIS SE REALIZA A 60 MA (220 V) DEJANDO CORRER EL FRENTE HASTA QUE LA LINEA DEL AZUL DE BROMOFENOL ESTE A 0,5 MM DEL EXTREMO INFERIOR DEL GEL. LA DURACION ES APROXIMADAMENTE DE TRES HORAS. 8.4.6 METODOS DE TINCION. 8.4.6.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION FIJADORA (8.3.3.1.1): UNA HORA. 2. LA SOLUCION DECOLORANTE (8.3.3.1.2): DIEZ MINUTOS. 3. LA SOLUCION DE TINCION (8.3.1.3): DOCE HORAS. 4. LA SOLUCION DECOLORANTE (8.3.3.1.2), QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA, HASTA ELIMINAR EL FONDO. 8.4.6.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION DE FIJACION/TINCION (8.3.3.2.1): DOCE HORAS. 2. AGUA DESTILADA, QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA: UNA HORA. 8.5 INTERPRETACION DE RESULTADOS 8.5.1 IDENTIFICACION DE LAS BANDAS EN EL DIAGRAMA SE OBSERVA EL ORDEN DE LAS BANDAS DE LAS PROTEINAS DE MENOR A MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA EN CADA UNA DE LAS ESPECIES: (DIAGRAMA OMITIDO) 8.5.2 DENSITOMETRIA MEDIR LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CON DENSITOMETRO A UNA LONGITUD DE ONDA DE 560 NM SI SE UTILIZA COOMASSIE R-250 EN LA TINCION Y DE 600 NM SI SE UTILIZA EL METODO DEL COOMASSIE G-250. 8.5.3 CUANTIFICACION COMO SE PUEDE OBSERVAR EN EL DIAGRAMA, LAS B LACTOGLOBULINAS A Y B EN LECHE DE VACA PRESENTAN UNA MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LAS DE LAS OTRAS DOS ESPECIES. AL AUMENTAR EL PORCENTAJE DE LECHE DE VACA PRESENTE EN LA MUESTRA, AUMENTA LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CORRESPONDIENTES A DICHAS B LACTOGLOBULINAS Y POR TANTO AUMENTA LA ALTURA DE LOS PICOS OBTENIDOS EN EL DENSITOGRAMA. MEDIR LAS ALTURAS DE LOS PICOS DE LAS B LACTOGLOBULINAS A Y B DE LECHE DE VACA Y DEL PICO DE LA SEROALBUMINA (BSA). A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA LOS PATRONES, RESULTA LA RECTA DE REGRESION Y = AX + B, DONDE (FORMULAS OMITIDAS) 8.6 EXPRESION DE RESULTADOS EXPRESAR EL CONTENIDO EN LECHE DE VACA SEGUN LOS SIGUIENTES INTERVALOS: MENOR DEL 5 POR 100. ENTRE EL 5 Y EL 10 POR 100. ENTRE EL 10 Y EL 20 POR 100. MAYOR DEL 20 POR 100. SIENDO EL LIMITE DE DETECCION PRACTICO DEL 3 POR 100 EN LECHE DE VACA, EN QUESO DE OVEJA O EN QUESO DE CABRA. 8.7 REFERENCIAS 8.7.1 RAMOS, M.; JUAREZ, M. (1986): <CHROMATOGRAPHIE, ELECTROPHORETIC AND IMMUNOLOGICAL METHODS FOR DETECTING MIXTURES OF MILKS FROM DIFFERENT SPECIES>. 8.7.2 AMIGO, L.; SANTAMARIA, G.; GONZALEZ DEL LLANO, D.; RAMOS, M. (1986): <POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS OF WHEY PROTEINS IN CHEESES MADE FROM MILK OF DIFFERENT SPECIES. MILK THE VITAL FORCE>, XII INTERNAT. DAIRY CONGRESS, THE HAGUE, 152. 8.7.3 AMIGO, L.; CALVO, M.; RAMOS, M. (1987): <QUANTITATIVE DETERMINATION COW'S MILK IN GOAT'S AND EWE'S MILK BY PAGE USING A INTERNAL STANDARD>. II CONGRESO MUNDIAL DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, BARCELONA, 151. 8.7.4 CALVO, M. M.; AMIGO, L.; OLANO, A.; MARTIN, P. J.; RAMOS, M. (1989): <EFFECT OF THERMAL TREATMENTS ON THE DETERMINATION OF BOVINE MILK ADDED TO OVINE OR CAPRINE MILK>. FOOD CHEMISTRY 32 (99-108). 9. DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN QUESO DE OVEJA (METODO ELECTROFORETICO) 9.1 PRINCIPIO . LA FRACCION SERICA DE LA MUESTRA SE EXTRAE POR ADICION DE SOLUCION TAMPON A PH 4,6 Y POSTERIOR CENTRIFUGACION. LAS PROTEINAS DE SUERO SON SEPARADAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA A PH 8,3. LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA PRESENTA UNA MENOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LA ALFA LACTOALBUMINA Y LA B LACTOGLOBULINA DE LA LECHE DE OVEJA. 9.2 MATERIAL Y APARATOS . 9.2.1 MATERIAL DE USO CORRIENTE EN LABORATORIO. 9.2.2 MICROJERINGA. 9.2.3 PH METRO. 9.2.4 CENTRIFUGA. 9.2.5 EQUIPO DE ELECTROFORESIS. 9.2.6 FUENTE DE ALIMENTACION. 9.2.7 DENSITOMETRO. 9.3 REACTIVOS . 9.3.1 REACTIVOS PARA LA OBTENCION DE LA FRACCION SERICA. 9.3.1.1 SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10 POR 100. 9.3.1.2 SOLUCION DE ACETATO SODICO 1 N. 9.3.2 REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS. 9.3.2.1 TAMPON DE LOS GELES PH 8,9. TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 46 G. ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO: 4 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 1.000 ML. 9.3.2.2 SOLUCION DE ACRILAMIDA DISACRILAMIDA (T = 9,4 POR 100, C = 4,2). ACRILAMIDA: 9 G. N N' METILENBISACRILAMIDA: 0,4 G. TAMPON DE LOS GELES: 100 ML. 9.3.2.3 TAMPON DE LOS ELECTRODOS PH 8,3. TRISHIDROXIMETIL AMINOMETANO: 1,2 G. GLICINA: 5,8 G. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 9.3.2.4 SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10 POR 100 (ESTE REACTIVO DEBE PREPARARSE CADA SEMANA). 9.3.2.5 NNN'N' TETRAMETILETILENDIAMINA (TEMED). 9.3.2.6 SOLUCION DE AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000. 9.3.2.7 SOLUCION DE GLICEROL AL 40 POR 100. 9.3.3 REACTIVOS PARA LA TINCION. 9.3.3.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250. 9.3.3.1.1 SOLUCION FIJADORA. ACIDO SULFOSALICILICO: 17,3 G. ACIDO TRICLOROACETICO: 57,3 G. AGUA DESTILADA: HASTA 500 ML. 9.3.3.1.2 SOLUCION DECOLORANTE. ETANOL: 500 ML. ACIDO ACETICO GLACIAL: 160 ML. AGUA DESTILADA: HASTA 2.000 ML. 9.3.3.1.3 SOLUCION DE TINCION. AZUL COOMASSIE BRILLANTE R-250: 0,46 G. SOLUCION DECOLORANTE (9.3.3.1.2): 400 ML. 9.3.3.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250. 9.3.3.2.1 SOLUCION UNICA DE FIJACION Y TINCION. AZUL COOMASSIE G-250: 1 G. AGUA DESTILADA: 500 ML. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO 2N: 500 ML. SOLUCION DE HIDROXIDO POTASICO: 10 N. ACIDO TRICLOROACETICO. DISOLVER AL AZUL DE COOMASSIE G-250 EN AGUA DESTILADA Y AÑADIR LA SOLUCION DEL ACIDO SULFURICO 2N. MEZCLAR BIEN, AGITANDO DURANTE UNA HORA, Y FILTRAR POR PAPEL WHATMAN NUMERO 1. MEDIR EL VOLUMEN DE FILTRADO Y AÑADIR 1/9 DE ESTE VOLUMEN DE LA SOLUCION DE HIDROXICO POTASICO 10 N. AÑADIR ACIDO TRICLOROACETICO A ESTA DISOLUCION HASTA QUE LA CONCENTRACION FINAL SEA DEL 12 POR 100. ESTA SOLUCION DE TEÑIDO ES ESTABLE DURANTE VARIOS MESES SI EL PH SE MANTIENE POR DEBAJO DE 1. SE PUEDE UTILIZAR VARIAS VECES PERO ES CONVENIENTE FILTRARLA ANTES DE CADA USO. 9.4 PROCEDIMIENTO . 9.4.1 OBTENCION DE LA FRACCION SOLUBLE A PH 4,6. PESAR 15 G DE QUESO PREVIAMENTE TRITURADO, AÑADIR 5 ML DE SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10 POR 100 (9.3.1.1) Y 5 ML DE SOLUCION (9.3.1.2), HOMOGENEIZAR Y COMPROBAR CON PH METRO QUE EL PH DE LA MEZCLA ES EXACTAMENTE 4,6. CENTRIFUGAR A 3.000 R.P.M. DURANTE DIEZ MINUTOS Y FILTRAR EL SOBRANTE A TRAVES DE UN PAPEL DE FILTRO DE VELOCIDAD MEDIA. 9.4.2 PREPARACION DE LA CURVA PATRON. PARTIR DE PATRONES DE QUESOS PUROS DE OVEJA Y DE CABRA, ASI COMO DE PATRONES DE QUESOS DE MEZCLA DE CABRA EN OVEJA, EN CONCENTRACIONES DEL 5 POR 100, 10 POR 100 Y 20 POR 100. LA LECHE UTILIZADA PARA LA FABRICACION DE ESTOS QUESOS PATRON PODRA SER CRUDA O PASTERIZADA, EN ESTE ULTIMO CASO LA LECHE DEBERA SER PASTERIZADA A UNA TEMPERATURA MAXIMA DE 74 C DURANTE UN TIEMPO MAXIMO DE TREINTA SEGUNDOS. LA FRACCION SOLUBLE DE LOS PATRONES SE OBTIENE SIGUIENDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN 9.4.1. 9.4.3 INMEDIATAMENTE ANTES DE SU APLICACION EN EL GEL MEZCLAR. 1 VOLUMEN DE LA FRACCION SOLUBLE OBTENIDA SEGUN 9.4.1. 1 VOLUMEN DE LA SOLUCION DE GLICEROL AL 40 POR 100 (9.3.2.7). 1/2 VOLUMEN DE LA SOLUCION AZUL DE BROMOFENOL AL 1/1.000 (9.3.2.6). 9.4.4 PREPARACION DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. PREPARAR EL GEL LAMINAR DE ESPESOR COMPRENDIDO ENTRE 0,5 MM Y 1 MM. PARA 50 ML DE LA SOLUCION DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA, AÑADIR 0,5 ML DE SOLUCION DE PERSULFATO AMONICO AL 10 POR 100 (9.3.2.4), DESAIREAR EN UN KITASATO MEDIANTE VACIO Y AÑADIR COMO AGENTE POLIMERIZANTE 50 1 DE TEMED (9.3.2.5). 9.4.5. ELECTROFORESIS COLOCAR EL GEL EN EL APARATO DE ELECTROFORESIS Y LLENAR LAS CAMARAS DE LOS ELECTRODOS CON EL TAMPON PH 8,3 (9.3.2.3). APLICAR CON MICROJERINGA EN CADA UNO DE LOS POCILLOS DEL GEL UN VOLUMEN COMPRENDIDO ENTRE 10 L Y 20 L DE LAS SOLUCIONES OBTENIDAS SEGUN 9.4.3, TANTO DE LA MUESTRA COMO DE LOS PATRONES. LA ELECTROFORESIS SE REALIZA A 60 MA (220 V) DEJANDO CORRER EL FRENTE HASTA QUE LA LINEA DE AZUL DE BROMOFENOL ESTE A 0,5 MM DEL EXTREMO INFERIOR DEL GEL. LA DURACION ES APROXIMADAMENTE DE TRES HORAS. 9.4.6 METODOS DE TINCION 9.4.6.1 TINCION CON AZUL COOMASSIE R-250 UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION FIJADORA (9.3.3.1.1): UNA HORA. 2. LA SOLUCION DECOLORANTE (9.3.3.1.2): DIEZ MINUTOS. 3. LA SOLUCION DE TINCION (9.3.3.1.3): DOCE HORAS. 4. LA SOLUCION DECOLORANTE (9.3.3.1.2), QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA, HASTA ELIMINAR EL FONDO. 9.4.6.2 TINCION CON AZUL COOMASSIE G-250 UNA VEZ COMPLETADA LA ELECTROFORESIS, INTRODUCIR EL GEL SUCESIVAMENTE EN: 1. LA SOLUCION DE FIJACION/TINCION (9.3.3.2.1): DOCE HORAS. 2. AGUA DESTILADA, QUE SE RENOVARA CON FRECUENCIA: UNA HORA. 9.5 INTERPRETACION DE RESULTADOS 9.5.1 IDENTIFICACION DE LAS BANDAS EN EL DIAGRAMA SE OBSERVA EL ORDEN DE LAS BANDAS DE LAS PROTEINAS DE MENOR A MAYOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA EN LA LECHE DE CABRA Y EN LA LECHE DE OVEJA. (DIAGRAMA OMITIDO) 9.5.2 DENSITOMETRIA MEDIR LA INTENSIDAD DE LAS BANDAS CON DENSITOMETRO A UNA LONGITUD DE ONDA DE 560 NM SI SE UTILIZA COOMASSIE R-250 EN LA TINCION Y DE 600 NM SI SE UTILIZA EL METODO DEL COOMASSIE G-250. 9.5.3 CUANTIFICACION COMO SE PUEDE OBSERVAR EN EL DIAGRAMA, LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA PRESENTA UNA MENOR MOVILIDAD ELECTROFORETICA QUE LA A LACTOALBUMINA Y LA B LACTOGLOBULINA DE OVEJA. AL AUMENTAR EL PORCENTAJE DE LECHE DE CABRA PRESENTE EN LA MUESTRA, AUMENTA LA INTENSIDAD DE LA BANDA CORRESPONDIENTE A LA B LACTOGLOBULINA DE LA LECHE DE CABRA Y, POR TANTO, AUMENTA LA ALTURA DEL PICO OBTENIDO EN EL DENSITOGRAMA. MEDIR LA ALTURA DEL PICO DE LA B LACTOGLOBULINA DE LECHE DE CABRA Y EL PICO DE LA SEROALBUMINA (BSA). A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA LOS PATRONES, RESULTA LA RECTA DE REGRESION Y = AX + B, DONDE (FORMULAS OMITIDAS) 9.6 EXPRESION DE RESULTADOS EXPRESAR EL CONTENIDO EN LECHE DE CABRA SEGUN LOS SIGUIENTES INTERVALOS: MENOR DEL 5 POR 100. ENTRE EL 5 Y EL 10 POR 100. ENTRE EL 10 Y EL 20 POR 100. MAYOR DEL 20 POR 100. SIENDO EL LIMITE DE DETECCION PRACTICO DEL 3 POR 100 DE LECHE DE CABRA EN QUESO DE OVEJA. 9.7 REFERENCIAS 9.7.1 RAMOS, M.; JUAREZ, M. (1986): <CHROMATOGRAPHIE, ELECTROPHORETIC AND IMMUNOLOGICAL METHODS FOR DETECTING MIXTURES OF MILKS FROM DIFFERENT SPECIES>. 9.7.2 AMIGO, L.; SANTAMARIA, G.; GONZALEZ DEL LLANO, D.; RAMOS, M. (1986): <POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS OF WHEY PROTEINS IN CHEESES MADE FROM MILK OF DIFFERENT SPECIES. MILK THE VITAL FORCE>, XII INTERNAT. DAIRY CONGRESS, THE HAGUE, 152. 9.7.3 AMIGO, L.; CALVO, M.; RAMOS, M. (1987): <QUANTITATIVE DETERMINATION COW'S MILK IN GOAT'S AND EWE'S MILK BY PAGE USING A INTERNAL STANDARD>. II CONGRESO MUNDIAL DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, BARCELONA, 151. 9.7.4 CALVO, M. M.; AMIGO, L.; OLANO, A.; MARTIN, P. J.; RAMOS, M. (1989): <EFFECT OF THERMAL TREATMENTS ON THE DETERMINATION OF BOVINE MILK ADDED TO OVINE OR CAPIRNE MILK>. FOOD CHEMISTRY 32 (99-108).