Orden de 19 de septiembre de 2001 - Modifica el Real Decreto Nº 1.488/1994, sobre medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces de acuicultura

ORDEN de 19 de septiembre de 2001 por la que se modifica el anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas m�nimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces. El Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas m�nimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, incorpora al ordenamiento jur�dico interno la Directiva 93/53/CEE, del Consejo, de 24 de junio, por la que se establecen medidas comunitarias sobre la materia e incluye en su anexo F la Decisi�n 92/532/CEE, de la Comisi�n, de 19 de noviembre, por la que se establecen los planes de muestreo y los m�todos de diagn�stico para la detecci�n y confirmaci�n de determinadas enfermedades de los peces. Desde que se adopt� la Decisi�n 92/532/CEE, se han producido novedades pr�cticas y cient�ficas, y se ha modificado la Directiva 91/67/CEE, del Consejo, de 28 de enero, relativa a las condiciones de polic�a sanitaria aplicables a la puesta en el mercado de animales y productos de la acuicultura. Ello ha motivado la reciente aprobaci�n de la Decisi�n 2001/183/CE, de la Comisi�n, de 22 de febrero, por la que se establecen los planes de muestreo y los m�todos de diagn�stico para la detecci�n y confirmaci�n de determinadas enfermedades de los peces y se deroga la Decisi�n 92/532/CEE. Mediante la citada Decisi�n 2001/183/CE se actualiza la normativa comunitaria en relaci�n con el examen y la identificaci�n de los virus que originan la septicemia hemorr�gica viral (SHV) y la necrosis hematopoy�tica infecciosa (NHI), y se introducen los cambios necesarios de conformidad con las �ltimas modificaciones de la Directiva 91/67/CEE. Procede, por tanto, modificar el anexo F del Real Decreto 1488/1994, de acuerdo con la facultad expresamente recogida en su disposici�n final primera, en la redacci�n dada por el Real Decreto 138/1997, de 31 de enero, por el que se modifica parte de los anexos del Real Decreto 1488/1994. En la elaboraci�n de esta disposici�n han sido consultadas las Comunidades Aut�nomas y los sectores afectados. En su virtud, dispongo: Art�culo �nico. Modificaci�n del anexo F del Real Decreto 1488/1994. El anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen las medidas m�nimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, se sustituye por el que figura en la presente Orden. Disposici�n adicional �nica. T�tulo competencial. La presente Orden se dicta al amparo de lo dispuesto en el art�culo 149.1.16.a de la Constituci�n, por el que se atribuye al Estado la competencia exclusiva en materia de bases y coordinaci�n general de la sanidad. Disposici�n final �nica. La presente Orden entrar� en vigor el d�a siguiente al de su publicaci�n en el "Bolet�n Oficial del Estado". Madrid, 19 de septiembre de 2001. ARIAS CA�ETE ANEXO Planes de muestreo y m�todos de diagn�stico para la detecci�n y la confirmaci�n de la septicemia hemorr�gica viral (SHV)y la necrosis hematopoy�tica infecciosa (NHI) INTRODUCCI�N El presente anexo: a) Establece directrices y requisitos m�nimos aplicables a los planes de muestreo y m�todos de diagn�stico para la detecci�n y confirmaci�n de la presencia de septicemia hemorr�gica viral (SHV) y necrosis hematopoy�tica infecciosa (NHI). b) Integra las disposiciones de los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE para la obtenci�n y el mantenimiento de la autorizaci�n de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas. c) Establece disposiciones para el correcto diagn�stico de la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa y el reconocimiento oficial de la autorizaci�n de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas de conformidad con los art�culos 5 y 6 de la Directiva 91/67/CEE. d) Est� destinado a las autoridades responsables de la lucha contra la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa y al personal de laboratorio que lleve a cabo las pruebas de estas enfermedades. En consecuencia, se presta especial atenci�n a los procedimientos de muestreo, los principios y aplicaciones de las pruebas de laboratorio y la evaluaci�n de sus resultados, as� como a las t�cnicas de laboratorio detalladas. No obstante, cuando proceda, los laboratorios podr�n modificar las pruebas recogidas en el presente anexo o utilizar pruebas diferentes, siempre que se pueda demostrar que tienen una sensibilidad y especificidad equivalentes. La parte I comprende los planes de muestreo y los m�todos de diagn�stico para la vigilancia de la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa con objeto de obtener y mantener la autorizaci�n de una zona o de una explotaci�n situada en una zona no autorizada. En la parte II se describen los procedimientos de diagn�stico para confirmar la existencia de la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa en caso de que se sospeche de su presencia. En la parte III se establecen criterios y directrices de un programa oficial de inspecci�n sanitaria que documente la ausencia hist�rica de septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa. En la parte IV se recogen recomendaciones sobre el procedimiento empleado para la titulaci�n del virus de la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa y para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci�n. En la parte V se recogen los acr�nimos y las abreviaturas. PARTE I Planes de muestreo y m�todos de diagn�stico para la vigilancia de la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa, con objeto de obtener y mantener la autorizaci�n de una zona o de una explotaci�n situada en una zona no autorizada I. Inspecciones y muestreo 1. Disposiciones generales sobre las inspecciones sanitarias cl�nicas, la recogida y la selecci�n de muestras para vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorizaci�n con respecto a la SHV o la NHI.-En los cuadros 1A, 1B y 1C se resumen las inspecciones sanitarias cl�nicas y el muestreo de tejidos de los peces, del fluido ov�rico o de ambos, que deber� realizarse en las zonas o las explotaciones situadas en zonas no autorizadas para lograr o mantener la autorizaci�n con respecto a la SHV o la NHI de conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE. En las partes I.I.2 a I.I.4 se recogen detalles m�s precisos. Los cuadros 1A y 1B no ser�n aplicables a las nuevas explotaciones ni a las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes una zona autorizada o de una explotaci�n autorizada situada en una zona no autorizada, siempre que cumplan lo dispuesto en las letras a) o b) de la parte I.A6 o en las letras a) o b) de la parte II.A3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE. Las inspecciones cl�nicas deber�n efectuarse durante el per�odo comprendido entre octubre y junio o siempre que la temperatura del agua est� por debajo de los 14 oC. Cuando las explotaciones deban ser inspeccionadas cl�nicamente dos veces al a�o, los intervalos entre ambas visitas deber�n ser de un m�nimo de cuatro meses. Todas las unidades de producci�n (estanques, tanques, jaulas de red, etc.) deber�n inspeccionarse para comprobar si hay peces muertos, d�biles o que act�en de manera anormal. Deber� prestarse especial atenci�n a la zona de desag�e, donde los peces d�biles tienen tendencia a acumularse debido a la corriente de agua. Los peces que se tomen como muestra se seleccionar�n de la siguiente manera: Si hay truchas arco iris, toda la muestra estar� compuesta de peces de esa especie. En caso contrario, la muestra deber� incluir peces de todas las especies presentes siempre que sean sensibles al virus de la SHV o de la NHI (de conformidad con la lista recogida en el anexo A de la Directiva 91/67/CE). Las especies deber�n estar representadas de manera proporcional en la muestra. Si se emplea m�s de una fuente de agua para la producci�n de peces, la muestra deber� incluir peces que representen a todas las fuentes. Si hay peces d�biles, que act�en de manera anormal o muertos recientemente (sin descomponer), tales peces ser�n los primeros que se incluyan en la muestra. En caso de que no los haya, �sta deber� estar compuesta de peces sanos, de apariencia normal, recogidos de tal modo que est�n representadas proporcionalmente todas las partes de la explotaci�n y las clases de edad. 2. Disposiciones espec�ficas, incluida la recogida de muestras, para la vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorizaci�n con respecto a la SHV y la NHI. a) Una zona o una explotaci�n situada en una zona no autorizada sometida a supervisi�n por los servicios oficiales puede obtener la autorizaci�n con respecto a la SHV o la NHI siempre que se someta a uno de los dos modelos siguientes: 1. Modelo A: Un programa de vigilancia de dos a�os. Tras un plazo m�nimo de dos a�os de ausencia de signos cl�nicos o de otro tipo de SHV o NHI, todas las explotaciones de la zona o toda explotaci�n situada en una zona no autorizada que deseen ser autorizadas, deber�n someterse a una inspecci�n sanitaria dos veces al a�o durante dos a�os. A lo largo de este per�odo de control de dos a�os que precede a la consecuci�n de la autorizaci�n, se deber� mantener la ausencia de signos cl�nicos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deber�n recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1A. Adem�s, las muestras deber�n seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los ex�menes de laboratorio para detectar la SHV o la NHI deber�n ser negativos. 2. Modelo B: Un programa de vigilancia de dos a�os con una muestra de tama�o reducido. Tras un programa oficial de inspecci�n sanitaria que documente la ausencia hist�rica de SHV o NHI durante, al menos, cuatro a�os, todas las explotaciones de la zona o toda explotaci�n que est� situada en una zona no autorizada, que deseen ser autorizadas, deber�n someterse a inspecci�n sanitaria dos veces al a�o durante dos a�os. A lo largo de este per�odo de control de dos a�os que precede a la consecuci�n de la autorizaci�n, se deber� mantener la ausencia de signos cl�nicos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deber�n recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1B. Adem�s, las muestras deber�n seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los ex�menes de laboratorio para detectar la septicemia hemorr�gica viral o la necrosis hematopoy�tica infecciosa deber�n ser negativos. Para que los servicios oficiales reconozcan un programa de inspecci�n sanitaria a efectos de documentaci�n de la ausencia de septicemia hemorr�gica viral o necrosis hematopoy�tica infecciosa, �ste deber� cumplir los criterios y directrices recogidos en la parte III. b) Disposiciones especiales para la autorizaci�n de nuevas explotaciones y de explotaciones que vuelven a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada, o de una explotaci�n autorizada situada en una zona no autorizada. Las nuevas explotaciones y las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada o de una explotaci�n autorizada situada en una zona no autorizada podr�n obtener la autorizaci�n de conformidad con lo dispuesto en las letras a) y b) de la parte I.A.6 o en las letras a) y b) de la parte II.A.3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE. Por tanto, las disposiciones de muestreo establecidas en los ya citados modelos A y B [letras a) y b) de la parte I.I.2.1] no ser�n aplicables a dichas explotaciones. c) Programa de vigilancia para el mantenimiento de la autorizaci�n con respecto a la septicemia hemorr�gica viral o la necrosis hematopoy�tica infecciosa. Con objeto de mantener la autorizaci�n de una zona o de una explotaci�n situada en una zona no autorizada con respecto a la septicemia hemorr�gica viral o la necrosis hematopoy�tica infecciosa, las inspecciones y el muestreo para realizar los ex�menes deber�n llevarse a cabo de conformidad con lo establecido en el cuadro 1C. Las muestras deber�n seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los ex�menes de laboratorio deber�n ser negativos con respecto a los agentes causantes de la septicemia hemorr�gica viral o la necrosis hematopoy�tica infecciosa. 3. Preparaci�n y env�o de muestras procedentes de los peces.-Antes de su env�o o traslado al laboratorio, se extraer�n de los peces partes de los �rganos que deban examinarse con instrumental est�ril de disecci�n y se introducir�n en tubos de pl�stico est�riles que contengan medio de transporte, es decir, medio de cultivo celular con un 10 por 100 de suero de ternera y antibi�ticos. Se recomienda la combinaci�n de 200 UI de penicilina, 200 microgramos de estreptomicina y 200 microgramos de kanamicina por ml, aunque podr�n utilizarse asimismo otros antibi�ticos de eficacia probada. Los tejidos que se deber�n examinar son el bazo, la parte anterior del ri��n y, adem�s, bien el coraz�n o bien el enc�falo. En algunas ocasiones, deber� examinarse el fluido ov�rico (cuadros 1A-1C). El fluido ov�rico o las partes de �rganos de un m�ximo de 10 peces (cuadros 1A-1C) podr�n recogerse en un solo tubo est�ril que contenga al menos 4 ml de medio de transporte, para constituir una muestra conjunta. El peso del tejido de cada muestra deber� ser de 0,5 gramos como m�nimo. Los tubos se colocar�n en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de poliestireno de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo o de bloques de enfriamiento para garantizar la refrigeraci�n de las muestras durante su traslado al laboratorio. Se evitar� la congelaci�n. La temperatura de las muestras durante el transporte nunca deber� exceder de 10 oC y en el momento de la recepci�n todav�a deber� haber hielo en el recipiente de transporte o alternativamente, uno o m�s bloques de enfriamiento deber�n estar a�n helados parcial o totalmente. El examen virol�gico deber� iniciarse lo antes posible y nunca despu�s de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la recogida de las muestras. En casos excepcionales (1), el examen virol�gico podr� empezar a m�s tardar en un plazo de setenta y dos horas desde la recogida del material, siempre que �ste quede protegido con medio de transporte y se cumplan los requisitos de temperatura durante el transporte (v�ase el punto 3 de la parte I.I.3). En caso de que puedan cumplirse los requisitos de temperatura durante el transporte, podr�n enviarse peces enteros al laboratorio. Los peces enteros podr�n envolverse en papel absorbente y deber�n enviarse en bolsas de pl�stico refrigeradas seg�n se indica m�s arriba. Tambi�n podr�n enviarse peces vivos. El embalaje y etiquetado deber�n realizarse de conformidad con la normativa de transporte nacional e internacional actualmente vigente que corresponda. 4. Recogida de material de diagn�stico suplementario.-De acuerdo con el laboratorio de diagn�stico correspondiente, tambi�n se podr�n recoger otros tejidos de peces, que se preparar�n para efectuar ex�menes suplementarios. II. Preparaci�n de las muestras para el examen virol�gico 1. Congelaci�n en casos excepcionales.-En caso de que surjan dificultades pr�cticas (por ejemplo, condiciones meteorol�gicas adversas, d�as festivos, problemas de laboratorio, etc.), que impidan inocular las c�lulas en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podr�n congelar estas muestras en medio de cultivo celular a una temperatura igual o inferior a -20 oC y realizar el examen virol�gico en un plazo de catorce d�as. En cualquier caso, el tejido s�lo podr� congelarse y descongelarse una �nica vez antes de su examen. Se deber� llevar un registro de los motivos por los que se han congelado las muestras de tejido en cada ocasi�n en que se haya hecho (como, por ejemplo, tormenta, muerte de las l�neas celulares, etc.). 2. Homogeneizaci�n de los �rganos.-Una vez en el laboratorio, se homogeneizar� completamente el tejido de los tubos (con un triturador, mezclador o mortero con arena est�ril) y a continuaci�n se suspender� el homogeneizado en el medio de transporte original. Si la muestra est� formada por peces enteros de menos de 4 cm de longitud, �stos se desmenuzar�n con unas tijeras est�riles o un escalpelo tras haberse (1) En casos excepcionales, como, por ejemplo, cuando los peces se recojan en zonas muy remotas que no dispongan de correo diario. eliminado la parte del cuerpo posterior a la cloaca. Si la muestra est� formada por peces enteros de una longitud comprendida entre 4 y 6 cm, se recoger�n las v�sceras, sin descartar los ri�ones. Si la muestra est� formada por peces enteros de m�s de 6 cm de longitud, se recoger�n muestras de tejido de conformidad con el procedimiento descrito en la parte I.I.3. Las muestras de tejido se desmenuzar�n con escalpelo o tijeras est�riles y se homogeneizar�n seg�n el procedimiento arriba descrito ; se suspender� el homogeneizado en medio de transporte. La proporci�n final entre tejidos y medio de transporte deber� ajustarse en el laboratorio a 1:10. 3. Centrifugado del homogeneizado.-El homogeneizado se centrifugar� a una aceleraci�n de entre 2000 y 4000 x g durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5 �C, y el sobrenadante se recoger� y se tratar� durante cuatro horas a 15 �C o durante toda la noche a 4 �C con antibi�ticos ; por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina puede ser �til en esta fase. Si la muestra ha sido enviada en un medio de transporte (es decir, con exposici�n a antibi�ticos), podr� omitirse el tratamiento con antibi�ticos del sobrenadante. El tratamiento con antibi�ticos tiene por objeto luchar contra la contaminaci�n bacteriana de las muestras y hace innecesaria la filtraci�n con filtros de membrana. Si el sobrenadante recogido se almacena a -80 �C en el plazo de cuarenta y ocho horas siguientes a la toma de muestras, podr� ser reutilizado una sola vez para el examen virol�gico. En caso de que surjan dificultades pr�cticas (por ejemplo, aver�a de la incubadora, problemas con los cultivos celulares, etc.) que impidan inocular las c�lulas en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podr� congelar el sobrenadante a 80 �C y realizar el examen virol�gico en un plazo de catorce d�as. Antes de la inoculaci�n de las c�lulas, el sobrenadante se mezclar� a partes iguales con un conjunto de antisueros de los serotipos aut�ctonos de virus de la necrosis pancre�tica infecciosa (NPI), diluidos en la proporci�n adecuada, y la mezcla se incubar� durante una hora como m�nimo a una temperatura de 15 oC o durante dieciocho horas como m�ximo a una temperatura de 4 oC. El t�tulo del antisuero deber� ser como m�nimo de 1:2000 en una prueba de neutralizaci�n en placa del 50 por 100. El tratamiento de todos los in�culos con antisuero del virus de la NPI (virus que en algunas partes de Europa est� presente en el 50 por 100 de las muestras de peces) tiene por objeto evitar el desarrollo de efectos citopatog�nicos (ECP) debidos a este virus en los cultivos celulares inoculados. Con ello se logra reducir la duraci�n de los ex�menes virol�gicos, as� como el n�mero de casos en que la presencia de ECP deber�a considerarse como indicador potencial de la presencia del virus de la septicemia hemorr�gica viral o del de la necrosis hematopoy�tica infecciosa. Cuando las muestras procedan de unidades de producci�n consideradas indemnes de NPI, podr� omitirse el tratamiento de los in�culos con antisuero del virus de dicha enfermedad. III. Examen virol�gico 1. Medios y cultivos celulares.-Se cultivar�n c�lulas BF-2 o RTG-2 y bien EPC o bien FHM a una temperatura comprendida entre 20 y 30 oC en un medio adecuado como, por ejemplo, MEM de Eagle (o sus modificaciones) con adici�n de un 10 por 100 de suero vacuno fetal y antibi�ticos en concentraciones normales. Si las c�lulas se cultivan en frascos cerrados, es recomendable amortiguar el medio con bicarbonato. El medio utilizado para el cultivo de c�lulas en unidades abiertas podr� amortiguarse con Tris-HC1 (23 mM) y bicarbonato s�dico (6 mM). El pH deber� ser de 7,6 >0,2. Para la inoculaci�n con tejidos se emplear�n cultivos celulares j�venes (de entre cuatro y cuarenta y ocho horas) y en crecimiento activo (no confluente) en el momento de la inoculaci�n. 2. Inoculaci�n de los cultivos celulares.-La suspensi�n de �rganos tratada con antibi�ticos se inocular� en cultivos celulares en dos diluciones, es decir, la diluci�n original y, adem�s, una diluci�n 1:10 de la misma, que dar�n lugar a diluciones finales del material tisular en el medio de cultivo celular de 1:100 y 1:1000, respectivamente (a fin de evitar interferencias hom�logas). Deber�n inocularse, como m�nimo, dos l�neas celulares (v�ase la parte I.III.1). La proporci�n entre el tama�o del in�culo y el volumen del medio de cultivo celular ser� aproximadamente de 1:10. Para cada diluci�n y cada l�nea celular se emplear� al menos un �rea celular de 2 cm2 aproximadamente, correspondiente a un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Se recomienda el uso de placas de cultivo celular, aunque tambi�n son aceptables otras unidades con �reas de crecimiento similares o mayores. 3. Incubaci�n de los cultivos celulares.-Los cultivos celulares inoculados se incubar�n entre siete y diez d�as a una temperatura de 15 oC. Si el color del medio de cultivo celular pasa de rojo a amarillo, lo que indica la acidificaci�n del medio, se llevar� a cabo el ajuste del pH con una soluci�n est�ril de bicarbonato, o con una sustancia equivalente, para garantizar la sensibilidad celular a la infecci�n v�rica. Al menos una vez cada seis meses, o si se sospecha que la sensibilidad celular ha descendido, se efectuar� la titulaci�n de material congelado de virus de septicemia hemorr�gica viral y necrosis hematopoy�tica infecciosa para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci�n. En la parte IV se describe el procedimiento recomendado. 4. Microscopia.-Se observar�n peri�dicamente (al menos tres veces por semana) a 40-150 aumentos los cultivos celulares inoculados para comprobar si se han producido ECP. Si hay signos evidentes de ECP, se iniciar�n inmediatamente los procedimientos de identificaci�n del virus de conformidad con la parte I.IV. 5. Subcultivos.-Si despu�s de la incubaci�n primaria de siete a diez d�as no se han desarrollado ECP, se realizar�n subcultivos en nuevos cultivos celulares, utilizando �reas celulares similares a las del cultivo primario. Se reunir�n al�cuotas del medio (sobrenadante) de todos los cultivos/pocillos pertenecientes al cultivo primario, por l�neas celulares, siete o diez d�as despu�s de la inoculaci�n. El resultado se inocular� en cultivos celulares hom�logos sin diluir y en una diluci�n de 1:10 (que dar�n lugar a diluciones finales de 1:10 y 1:100, respectivamente, del sobrenadante) como se describe en la parte I.III.2. De manera alternativa, se pueden inocular directamente en un pocillo que contenga cultivo celular fresco al�cuotas de un 10 por 100 del medio que constitu�a el cultivo primario (subcultivo de pocillo a pocillo). La inoculaci�n podr� ir precedida de la preincubaci�n de las diluciones con el antisuero del virus de la necrosis pancre�tica infecciosa a una diluci�n adecuada, tal y como se describe en la parte I.II.3. Los cultivos inoculados se inocular�n entonces durante siete a diez d�as a una temperatura de 15 �C y se mantendr�n bajo observaci�n, seg�n se indica en la parte I.III.4. Si se producen ECP t�xicos en los tres primeros d�as de incubaci�n, se podr� realizar un subcultivo en esa etapa, pero entonces las c�lulas deber�n incubarse durante siete d�as y volver a subcultivarse durante otros siete d�as. Si se desarrollan ECP t�xicos despu�s de tres d�as, las c�lulas podr�n subcultivarse una vez e incubarse hasta que transcurra el total de catorce d�as desde la inoculaci�n primaria. En los �ltimos siete d�as de incubaci�n no deber� registrarse ninguna se�al de toxicidad. Si, pese al tratamiento con antibi�ticos, se produce una contaminaci�n bacteriana, antes de proceder al subcultivo se deber� centrifugar el sobrenadante a 2000-4000 x g durante un per�odo de quince a treinta minutos y a una temperatura de 2 a 5 �C, o filtrarlo a trav�s de un filtro de 0,45 xm (por una membrana con baja afinidad por las prote�nas), o someterlo a ambos procedimientos. Por lo dem�s, los procedimientos de subcultivo son los mismos que los aplicados a los ECP t�xicos. IV. Identificaci�n del virus 1. Pruebas de identificaci�n del virus.-Si se observa la existencia de ECP en un cultivo celular, se recoger� medio (sobrenadante) y se examinar� someti�ndolo a una o varias de las pruebas siguientes: Neutralizaci�n, IF o ELISA. Si estas pruebas no permiten identificar el virus con seguridad en una semana, el sobrenadante deber� enviarse para su identificaci�n inmediata al laboratorio nacional de referencia o al laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces. 2. Neutralizaci�n.-Se eliminar�n las c�lulas del sobrenadante recogido mediante centrifugaci�n (2000-4000 x g) o filtraci�n por membrana (0,45 xm) por una membrana con baja afinidad por las prote�nas y �ste se diluir� a 1:100 y 1:10000 en un medio de cultivo celular. Se mezclar�n al�cuotas de las dos diluciones de sobrenadante con partes iguales de los siguientes reactivos por separado, y se incubar�n durante sesenta minutos a una temperatura de 15 oC: Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la septicemia hemorr�gica viral a una diluci�n de 1:50 (vol:vol) (1). Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la necrosis hematopoy�tica infecciosa a una diluci�n de 1:50 (vol:vol) (1). Conjunto de antisueros frente a los serotipos aut�ctonos del virus de la necrosis pancre�tica infecciosa a una diluci�n de 1:50 (vol:vol) (1). Medio solo (control positivo). De cada mezcla de sobrenadante y virus, se inocular�n al menos dos cultivos celulares con 50 xl cada uno y se incubar�n a 15 �C. Se controlar� si aparecen ECP de la forma descrita en la parte I.III.4. Algunas cepas del virus de la septicemia hemorr�gica viral no reaccionan en las pruebas de neutralizaci�n. Tales cepas deben identificarse mediante la prueba de IF o la de ELISA. (1) O como indique el laboratorio de referencia en relaci�n con la posible citotoxicidad de los antisueros. Podr�n usarse alternativamente otras pruebas de neutralizaci�n de eficacia probada. 3. IF.-Para cada cepa v�rica que se desee identificar, se sembrar�n con c�lulas al menos ocho cubres o sus equivalentes, a una densidad que permita alcanzar una confluencia del 60 al 90 por 100 aproximadamente despu�s de veinticuatro horas de cultivo. Se recomienda utilizar c�lulas EPC por su fuerte adherencia a las superficies de cristal, pero tambi�n se pueden utilizar otras l�neas celulares, como BF-2, RTG-2 o FHM. Cuando las c�lulas hayan sedimentado en la superficie del cristal (aproximadamente una hora despu�s de la siembra) o cuando los cultivos se hayan incubado durante un per�odo de hasta veinticuatro horas, se inocular� el virus que se desee identificar. Se inocular�n cuatro cultivos en la proporci�n de 1:10 en volumen y otros cuatro en la proporci�n de 1:1000, que, posteriormente, se incubar�n a 15 �C durante un per�odo de veinte a treinta horas. Tras la incubaci�n, los cultivos se aclarar�n dos veces en MEM de Eagle sin suero, se fijar�n con acetona helada al 80 por 100 y se te�ir�n con ayuda de una IFAT de doble capa. La primera capa de reactivo consistir� en anticuerpos policlonales o monoclonales de calidad de referencia. La segunda capa de reactivo estar� formada por un antisuero conjugado con fluorocromo con afinidad por la inmunoglobina utilizada en la primera capa. Por cada uno de los antisueros sometidos a la prueba, deber� te�irse al menos un cultivo inoculado con una dosis alta y otro inoculado con una dosis baja. La prueba incluir� controles negativos y positivos adecuados. Se recomiendan para esta prueba fluorocromos como el FITC o el TRITC. Los cultivos te�idos se preparar�n utilizando soluci�n salina de glicerol y se examinar�n con luz ultravioleta incidente, utilizando oculares de 10 � 12 aumentos y objetivos de 25 � 40 aumentos con aperturas num�ricas > 0,7 y > 1,3, respectivamente. La t�cnica de IF descrita se ofrece como ejemplo. Podr�n usarse alternativamente otras t�cnicas de IF (diferentes en relaci�n con los cultivos celulares, la fijaci�n y los anticuerpos de calidad de referencia) de probada eficacia. 4. ELISA.-Los pocillos de las placas de microtitulaci�n se recubrir�n durante una noche con las diluciones recomendadas de fracciones inmunoglobul�nicas purificadas de anticuerpos de calidad de referencia. Tras aclarar los pocillos con soluci�n amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporar� a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de diluci�n doble o cu�druple y se dejar� reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 �C. Tras el aclarado con la soluci�n amortiguadora PBS-Tween-20, se a�adir�n anticuerpos con biotina de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejar� reaccionar durante sesenta minutos a 20 �C. Despu�s de efectuar otro aclarado como el anterior, se a�adir� estreptavidina conjugada con peroxidasa de r�bano (HRP) y se dejar� reaccionar durante una hora a 20 �C. Tras efectuar un �ltimo aclarado, se visualizar� la enzima ligada utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD u otros). Esta versi�n de ELISA basada en el empleo de biotina y avidina se ofrece a modo de ejemplo. En su lugar podr�n utilizarse otras versiones de ELISA de eficacia probada. CUADRO 1A (VER IM�GENES, P�GINAS 35835 A 35836) Plan de inspecci�n y muestreo para las zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas para el per�odo de control de dos a�os que precede a la autorizaci�n con respecto a la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa (De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo) Ex�menes de laboratorio para detectar la presencia de virus (1) N�mero de inspecciones cl�nicas anuales (dos a�os) N�mero de ex�menes de laboratorio anuales (dos a�os) N�mero de peces en crecimiento (material de los �rganos) N�mero de reproductores (fluido ov�rico) Zonas y explotaciones continentales a) Explotaciones con reproductores. 2 2 120 (primera inspecci�n) (2) 150 (segunda inspecci�n) 30 (primera inspecci�n).(3) 0 (segunda inspecci�n). b) Explotaciones �nicamente con repro ductores. 2 1 0 150 (primera o segunda inspecci�n).(3) c) Explotaciones sin reproductores. 2 2 150 (primera y segunda inspecciones). 0 Zonas y explotaciones costeras a) Explotaciones con reproductores. 2 2 120 (primera inspecci�n). 150 (segunda inspecci�n). 30 (primera inspecci�n). (3) 0 (segunda inspecci�n). b) Explotaciones de salm�nidos sin reproductores. 2 2 30 (primera y segunda inspecciones). (4) 0 c) Explotaciones sin salm�nidos y sin reproductores. 2 2 150 (primera y segunda inspecciones). 0 N�mero m�ximo de peces por muestra conjunta: 10. (1) Asimismo, se podr� utilizar una muestra reducida de conformidad con lo establecido en el cuadro 1B si se cumplen las condiciones establecidas en las partes I.I.1, letra b) de la parte I.I.2.1 y parte III. (2) Inspecciones cl�nicas. (3) En circunstancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ov�rico, en su lugar se podr�an tomar �rganos. (4) Las muestras deber�n recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. CUADRO 1B Plan de inspecci�n y muestreo para el per�odo de control de dos a�os que precede a la autorizaci�n con respecto a la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa en zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas con un historial documentado de ausencia de estas enfermedades oficialmente reconocido (De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en las partes I y III del presente anexo) Ex�menes de laboratorio para detectar la presencia de virus N�mero de inspecciones cl�nicas anuales (dos a�os) N�mero de ex�menes de laboratorio anuales (dos a�os) N�mero de peces en crecimiento (material de los �rganos) N�mero de reproductores (fluido ov�rico) Zonas y explotaciones continentales a) Explotaciones con reproductores. 2 2 0 (primera inspecci�n).(1) 30 (segunda inspecci�n). 30 (primera inspecci�n).2) 0 (segunda inspecci�n). b) Explotaciones �nicamente con reproductores. 2 1 0 30 (primera o segunda inspecci�n).(2) c) Explotaciones sin reproductores. 2 2 30 (primera y segunda inspecciones). 0 Ex�menes de laboratorio para detectar la presencia de virus N�mero de inspecciones cl�nicas anuales (dos a�os) N�mero de ex�menes de laboratorio anuales (dos a�os) N�mero de peces en crecimiento (material de los �rganos) N�mero de reproductores (fluido ov�rico) Zonas y explotaciones costeras a) Explotaciones con reproductores. 2 2 0 (primera inspecci�n). 30 (segunda inspecci�n). 30 (primera inspecci�n). (2) 0 (segunda inspecci�n). b) Explotaciones de salm�nidos sin reproductores. 2 2 30 (primera y segunda inspecciones). (3) 0 c) Explotaciones sin salm�nidos y sin reproductores. 2 2 30 (primera y segunda inspecciones). 0 N�mero m�ximo de peces por muestra conjunta: 10. (1) Inspecciones cl�nicas. (2) En circusntancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ov�rico, en su lugar se podr�an tomar �rganos. (3) Las muestras deber�n recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. CUADRO 1C Plan de inspecci�n y muestreo para las zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas con vistas a mantener la autorizaci�n con respecto a la septicemia hemorr�gica viral y la necrosis hematopoy�tica infecciosa (De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo) N�mero de peces de una muestra conjunta sometida a examen de laboratorio (1) N�mero de inspecciones cl�nicas anuales N�mero de peces en crecimiento (material de los �rganos) N�mero de reproductores (fluido ov�rico) Zonas y explotaciones continentales a) Explotaciones con reproductores. 2 20 (primera o segunda inspecci�n). 10 (primera o segunda inspecci�n). b) Explotaciones �nicamente con reproductores. 2 0 30 (primera o segunda inspecci�n). (2) c) Explotaciones sin reproductores. 1 30 0 Zonas y explotaciones costeras a) Explotaciones con reproductores. 2 20 (primera o segunda inspecci�n). 10 (primera o segunda inspecci�n). (2) b) Explotaciones sin reproductores. 1 30 (3) 0 N�mero m�ximo de peces por muestra conjunta: 10. (1) En las zonas autorizadas s�lo ser� necesario recoger muestras por rotaci�n en un 50 por 100 de las explotaciones cada a�o. En las explotaciones autorizadas situadas en zonas no autorizadas se deber� recoger muestras cada a�o. (2) En circunstancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ov�rico, en su lugar se podr�a tomar �rganos. (3) Las muestras deber�n recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. PARTE II Procedimientos de diagn�stico para la confirmaci�n de la necrosis hematopoy�tica infecciosa y de la septicemia hemorr�gica viral en presuntos brotes Se emplear�n una o m�s de las siguientes t�cnicas para el diagn�stico de estas enfermedades: A) Aislamiento convencional de los virus y posterior identificaci�n serol�gica de los mismos. B) Aislamiento e identificaci�n serol�gica simult�nea de los virus. C) Otras t�cnicas de diagn�stico (IFAT, ELISA). En las explotaciones de las zonas autorizadas, el primer caso de estas enfermedades no deber� confirmarse bas�ndose �nicamente en el m�todo C. Deber� utilizarse tambi�n el m�todo A o el B. Es posible que en algunos casos el material tisular destinado al examen virol�gico tenga que ir acompa�ado de material suplementario para ex�menes bacteriol�gicos, parasitol�gicos, histol�gicos o de otro tipo que permitan un diagn�stico diferencial. A. Aislamiento convencional de los virus y posterior identificaci�n serol�gica de los mismos I.1 Selecci�n de muestras.-Para el examen se seleccionar�n como m�nimo 10 peces que muestren los signos t�picos de la necrosis hematopoy�tica infecciosa o de la septicemia hemorr�gica viral. I.2 Preparaci�n y env�o de muestra de peces.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.I.3. I.3 Recogida de material suplementario para diagn�stico.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.I.4. II. Preparaci�n de las muestras para el examen virol�gico.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.II. III. Examen virol�gico.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.III. IV. Identificaci�n del virus.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.IV. B. Aislamiento e identificaci�n serol�gica simult�nea de los virus I.1 Selecci�n de muestras.-Proc�dase del modo indicado en la parte II.A.I.1. I.2 Preparaci�n y env�o de muestras de peces. Proc�dase del modo indicado en la parte I.I.3. I.3 Recogida de material suplementario para diagn�stico.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.I.4. II.1 Homogeneizaci�n de los �rganos.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.II.2. II.2 Centrifugado del homogeneizado.-El homogeneizado se centrifugar� a una aceleraci�n de entre 2000 y 4000xg durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5 �C, y el sobrenadante se recoger� y se tratar� durante cuatro horas a 15 �C con antibi�ticos, por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina, o se filtrar� (0,45 xg) por una membrana con baja afinidad por las prote�nas. II.3 Tratamiento del sobrenadante con antisueros para diagn�stico.-La suspensi�n de �rganos tratada con antibi�ticos o filtrada por membrana se diluir� a 1:10 y 1:1000 en medio de cultivo celular ; se mezclar�n al�cuotas suyas a partes iguales con los reactivos enumerados en la parte I.IV.2 y se incubar�n durante 60 minutos a 15 �C. III.1 Medios y cultivos celulares.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.III.1. III.2 Inoculaci�n de los cultivos celulares.-De cada mezcla de suero y virus (preparada del modo indicado en la parte II.B.II.3), se inocular�n al menos dos cultivos celulares por l�nea celular con 50 xl cada uno. III.3 Incubaci�n de los cultivos celulares.-Proc�dase del modo indicado en la parte I.III.3. III.4 Microscopia.-Se observar�n diariamente a 40-150 aumentos los cultivos celulares inoculados para comprobar si se han producido ECP. Si se evita la aparici�n de ECP con alguno de los antisueros utilizados, el virus podr� considerarse identificado. En caso contrario, se iniciar�n los procedimientos de identificaci�n del virus de conformidad con la parte I.IV. III.5 Subcultivos.-Si no se han obervado ECP despu�s de siete a diez d�as, se realizar�n subcultivos a partir de los cultivos inoculados con sobrenadante y medio (parte II.B.II.3) con arreglo a la parte I.III.5. C. Otras t�cnicas de diagn�stico Las t�cnicas IFAT o ELISA descritas en las partes I.IV.3 y I.IV.4, respectivamente, se podr�n aplicar al sobrenadante, que se habr� preparado del modo indicado en la parte I.II.2. Estas t�cnicas r�pidas se completar�n con un examen virol�gico con arreglo a los puntos A o B antes de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la toma de la muestra, si: a) Se obtiene un resultado negativo, o b) Se obtiene un resultado positivo con material que constituya el primer caso de necrosis hematopoy�tica infecciosa o septicemia hemorr�gica viral en una zona autorizada. El material tisular podr� someterse a otras t�cnicas de diagn�stico como la RCPTI, la IF realizada con cortes congelados o la inmunohistoqu�mica realizada con material fijado con formol. Estas t�cnicas deber�n completarse siempre con la inoculaci�n en cultivos celulares de material tisular no fijado. PARTE III Demostraci�n documental de la ausencia de septicemia hemorr�gica viral, de necrosis hematopoy�tica infecciosa o de ambas en zonas o en explotaciones situadas en zonas no autorizadas Directrices y criterios aplicables a un programa oficial de inspecci�n sanitaria. 1. S�lo se podr� iniciar un programa de inspecci�n sanitaria: Tras haber aplicado un programa de erradicaci�n del virus de la septicemia hemorr�gica viral o del virus de necrosis hematopoy�tica infecciosa reconocido oficialmente, en virtud del cual se hayan retirado todos los peces de las instalaciones y �stas se hayan limpiado, desinfectado y dejado en reposo antes de volver a abastecerlas con peces procedentes de explotaciones autorizadas, o En explotaciones pisc�colas en las que no haya precedentes de infecci�n con los virus de estas enfermedades. 2. El programa de inspecci�n sanitaria deber� constar tanto de inspecciones cl�nicas como de ex�menes de laboratorio. 3. El programa deber� incluir dos inspecciones sanitarias cl�nicas anuales realizadas de conformidad con las directrices recogidas en la parte I. 4. En al menos una de las inspecciones llevadas a cabo cada a�o, se recoger�n 30 muestras de tejidos de peces o de fluido ov�rico de cada explotaci�n pisc�cola. Las muestras se seleccionar�n, preparar�n y someter�n a examen de laboratorio de conformidad con las partes I, II y IV. 5. El programa de inspecci�n sanitaria se llevar� a cabo durante al menos cuatro a�os en todas las explotaciones de la zona o en la explotaci�n (situada en una zona no autorizada) que vayan a autorizarse. 6. Para que se reconozca oficialmente el programa, no deber� darse ni detectarse ning�n caso de septicemia hemorr�gica viral ni de necrosis hematopoy�tica infecciosa (ni infecciones cl�nicas ni aislamientos de virus). PARTE IV Procedimiento de titulaci�n para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci�n A continuaci�n se recogen los procedimientos de titulaci�n recomendados mencionados en la parte I.III.3. Se deber�n emplear al menos dos cepas de virus de la septicemia hemorr�gica viral y una cepa de virus de la necrosis hematopoy�tica infecciosa. Las cepas deber�n representar los principales grupos de virus presentes en la Uni�n Europea ;por ejemplo, en el caso del virus de la septicemia hemorr�gica viral, se deber� elegir una cepa patog�nica para la trucha arco iris de agua dulce y una cepa de agua salada patog�nica para el rodaballo, y en el caso del virus de la necrosis hematopoy�tica infecciosa se deber� elegir una cepa patog�nica para la trucha arco iris de Europa. Deber�n emplearse cepas bien definidas procedentes de los Estados miembros. El laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces puede suministrar cepas de referencia. En tubos de cultivo celular con c�lulas BF-2 o RTG-2, en el caso del virus de la septicemia hemorr�gica viral, y con c�lulas EPC o FHM, en el del virus de la necrosis hematopoy�tica infecciosa, se propagar�n lotes de virus de un n�mero bajo de pases en cultivos celulares. Se deber� emplear un medio de cultivo celular con, al menos, un 10 por 100 de suero. En la inoculaci�n deber� emplearse una MOI baja (< 1). Con los ECP totales presentes, se recoger� el virus mediante centrifugado del sobrenadante del cultivo celular a 2000xg durante quince minutos, se esterilizar� pas�ndolo por un filtro de membrana de 0,45 �m y se distribuir� en criotubos etiquetados. El virus se mantendr� a -80� C. Una semana despu�s de la congelaci�n, se descongelar�n tres tubos de cada virus coloc�ndose en agua fr�a y se titular�n con sus l�neas celulares respectivas. Cada cepa de virus se descongelar� y titular�, al menos, cada seis meses o si se sospecha que la sensibilidad de una l�nea celular se ha visto reducida. Se deber�n describir detalladamente los procedimientos de titulaci�n y se deber� seguir el mismo procedimiento cada vez. La titulaci�n por diluci�n hasta el l�mite se efectuar� utilizando, al menos, seis tubos en cada fase de diluci�n. Los t�tulos se comparar�n con los obtenidos previamente. Si el t�tulo de uno de las tres cepas de virus es inferior en un factor igual o superior a dos unidades logar�tmicas, respecto al t�tulo inicial, no deber� volver a utilizarse la l�nea celular para fines de vigilancia. Si en el laboratorio se guardan distintas l�neas celulares, cada una deber� examinarse por separado. Los registros se conservar�n, al menos, diez a�os. PARTE V Acr�nimos y abreviaturas BF-2 Fibroblasto de alev�n de Lepomis macrochirus (l�nea celular). ECP Efectos citopatog�nicos. LCR Laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces. ELISA Prueba de inmunoabsorci�n enzim�tica. EPC Epithelioma papulosum cyprini (l�nea celular). FHM Pimephales promeles (l�nea celular). FITC Isotiocianato de fluoresce�na. Hepes �cido N-2-hidroxietilpiperazina-N'2-etano-sulf�nico. HRP Peroxidasa de r�bano. IF Inmunofluorescencia. IFAT Prueba de fluorescencia indirecta para la detecci�n de anticuerpos. (V) NHI (Virus de la) necrosis hematopoy�tica infecciosa. (V) NPI (Virus de la) necrosis pancre�tica infecciosa. MEM Medio m�nimo fundamental. MOI Multiplicidad de infecci�n (proporci�n del n�mero de part�culas v�ricas infecciosas a�adido a un n�mero conocido de c�lulas de un cultivo). OPD Orto-fenilendiamina. PBS Soluci�n salina amortiguadora fosfatada. RTG-2 G�nadas de trucha arco iris (l�nea celular). RCP-TI Reacci�n de polimerizaci�n en cadena con transcripci�n inversa. Tris-HC1 Tris (hidroximetil) aminometano-HC1. TRITC Isotiocianato de tetrametil-rodamina. (V) SHV (Virus de la) septicemia hemorr�gica viral.