Arrêté du 18 Ramadhan 1438 correspondant au 13 juin 2017 rendant obligatoire la méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement d’Escherechia coli présumés par la technique du nombre le plus probable (NPP)

1. DOMAINE D'APPLICATION : Vu le décret exécutif n° 13-328 du 20 Dhou EL Kaâda 1434 correspondant au 26 septembre 2013 fixant les La présente méthode donne des directives générales conditions et les modalités d'agrément des laboratoires au pour la détection et le dénombrement d'Escherichia coli titre de la protection du consommateur et de la répression (E.coli) présumés, au moyen de la technique de culture en des fraudes ; milieu liquide avec calcul du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 37 °C, puis à 44 °C. Vu le décret exécutif n° 15-172 du 8 Ramadhan 1436 correspondant au 25 juin 2015 fixant les conditions et les La présente méthode s'applique : modalités applicables en matière de spécifications microbiologiques des denrées alimentaires ; — aux produits pour l'alimentation humaine et animale ; Vu le décret exécutif n° 17-140 du 14 Rajab 1438 — aux échantillons d'environnement dans les domaines correspondant au 11 avril 2017 fixant les conditions de la production et de la distribution des denrées d'hygiène et de salubrité lors du processus de la mise à la alimentaires. consommation humaine des denrées alimentaires ; Vu l'arrêté du 26 Rajab 1425 correspondant au 11 NOTE - Certaines souches d'Escherichia coli septembre 2004 rendant obligatoire une méthode de pathogènes ne sont pas cultivables à 44 °C. préparation des échantillons pour essai et dilutions en vue de l'examen microbiologique ; 2. TERMES ET DEFINITIONS : Vu l’arrêté du 28 Rajab 1435 correspondant au 28 mai Pour les besoins de la présente méthode, les termes et 2014 rendant obligatoire la méthode de préparation des définitions suivants s'appliquent : échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique ; 2.1 Escherichia coli présumés, bactéries qui, à 44 °C, fermentent le lactose avec production de gaz et qui, à cette Arrête : température, produisent de l'indole à partir du tryptophane, lorsque l'essai est effectué selon la technique Article 1er. — En application des dispositions de spécifiée dans la présente méthode. l’article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a 2.2 Dénombrement d'Escherichia coli présumés, pour objet de rendre obligatoire la méthode horizontale nombre le plus probable d'E. coli par millilitre ou par pour la recherche et le dénombrement d’Escherechia coli gramme d'échantillon pour essai, lorsque l'essai est présumés par la technique du nombre le plus probable effectué selon la technique spécifiée dans la présente (NPP). méthode. 18 Safar 1439 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 64 27 7 novembre 2017

3. PRINCIPE : 3.2.6 A partir de chaque tube de milieu obtenu en (3.2.5) présentant un dégagement gazeux, faire une 3.1 Méthode de détection : subculture dans un tube contenant de l'eau peptonée exempte d'indole. 3.1.1 Inoculer un milieu d'enrichissement sélectif liquide avec une quantité déterminée de la suspension 3.2.7 Les tubes obtenus en (3.2.6) sont incubés 48 h à initiale de l'échantillon pour essai. 44 °C. Les tubes sont examinés pour vérifier la production d'indole résultant de la dégradation du tryptophane dans 3.1.2 Incuber le tube à 37 °C pendant 48 h. Examiner la les constituants peptonés. formation de gaz dans le tube après 24 h et 48 h. 3.2.8 Le nombre le plus probable d'Escherichia coli 3.1.3 Si le tube montre une opacité, un aspect trouble ou présumé est déterminé au moyen de la table NPP d'après un dégagement gazeux, faire une subculture dans un tube le nombre de tubes de milieu simple et double contenant un milieu sélectif liquide (bouillon EC). concentration dont les subcultures ont donné une production de gaz dans le bouillon EC et une production 3.1.4 Le tube obtenu en (3.1.3) est incubé à 44 °C d'indole dans l'eau peptonée à 44 °C. pendant 48 h. Examiner la formation de gaz après 24 h et 48 h. 4. DILUANT, MILIEUX DE CULTURE ET REACTIF : 3.1.5 Si un dégagement gazeux est noté dans le tube en (3.1.4), réaliser une subculture dans un tube contenant de 4.1 Diluant : l'eau peptonée exempte d'indole. Il convient de préparer les diluants conformément aux 3.1.6 Le tube obtenu en (3.1.5) est incubé durant 48 h à recommandations spécifiées dans la méthode relative à la 44 °C. Le tube est examiné pour la production d'indole préparation des échantillons pour essai, de la suspension résultant de la dégradation du tryptophane dans les mère et des dilutions décimales en vue de l'examen constituants peptonés. microbiologique. 3.1.7 Les tubes, présentant une opacité, un aspect 4.2 Bouillon au lauryl sulfate (milieu d'enrichissement trouble ou un dégagement gazeux dans le milieu sélectif). d'enrichissement sélectif liquide (3.1.1) et dont les sous-cultures ont produit du gaz dans le bouillon EC et de 4.2.1 Composition : l'indole dans l'eau peptonée à 44 °C, sont considérés comme contenant d'Escherichia coli présumés. On donne les résultats « présence » ou « absence » d'Escherichia coli présumés dans x g ou x ml de produit. (a) (b) Milieu double Milieu simple 3.2 Méthode de dénombrement : concentration concentration 3.2.1 Trois tubes de milieu d'enrichissement sélectif double concentration sont inoculés avec une quantité Digestat enzymatique de 40 g 20 g déterminée de la suspension initiale. tissus végétaux et animaux 3.2.2 Trois tubes de milieu d'enrichissement simple concentration sont inoculés avec une quantité déterminée Lactose 10 g 5g de la suspension initiale. Par ailleurs, dans les mêmes conditions, trois autres Monohydrogénophosphate 5,5 g 2,75 g tubes de milieu simple concentration sont inoculés avec de dipotassium (K2HPO4) une quantité déterminée des dilutions décimales de la suspension initiale. Dihydrogénophosphate de 5,5 g 2,75 g 3.2.3 Les tubes de milieu simple et double potassium (KH2PO4) concentration sont incubés à 37 °C pendant 48 h. Les tubes sont examinés pour vérifier la production de gaz après 24 h et 48 h. Chlorure de sodium 10 g 5g 3.2.4 Pour chaque tube simple et double concentration présentant une opacité, un aspect trouble ou un dégagement gazeux, réaliser une subculture dans un Lauryl sulfate de sodium 0,2 g 0,1 g milieu sélectif liquide (bouillon EC). [CH3(CH2)11OSO3Na] 3.2.5 Les tubes obtenus en (3.2.4) sont incubés à 44 °C pendant 48 h. Les tubes sont examinés pour vérifier la Eau 1000 ml 1000 ml production de gaz après 24 h et 48 h. 18 Safar 1439 28 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 64 7 novembre 2017 4.2.2. Préparation : 4.4 Eau peptonée exempte d'indole : Dissoudre les composants ou le milieu complet 4.4.1 Composition : déshydraté dans l'eau, en chauffant, si nécessaire. Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après Digestat enzymatique de caséine 10 g stérilisation, il soit de 6,8 ± 0,2 à 25 °C. Chlorure de sodium 5g Répartir les milieux par quantités de 9 ml dans des tubes de 16 mm x 160 mm (5.4) contenant des cloches de Eau 1000 ml Durham (5.6) dans le cas du milieu simple concentration, et par quantités de 10 ml dans des tubes de 18 mm x 80 mm ou 20 mm x 200 mm (5.4) contenant des cloches de 4.4.2 Préparation : Durham (5.6) dans le cas du milieu double concentration. Dissoudre les composants ou le milieu complet Stériliser ces tubes à l'autoclave (5.1) réglé à 121 °C déshydraté dans l'eau, en chauffant, si nécessaire. pendant 15 min. Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de stérilisation, il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C. bulles d'air après stérilisation. Répartir le milieu, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans 4.3 Bouillon EC (milieu sélectif) : des tubes de 16 mm x 160 mm (5.4). 4.3.1 Composition : Stériliser à l'autoclave (5.1) réglé à 121 °C pendant 15 min. 20 g 4.5 Réactif pour la recherche de l'indole (réactif de Digestat enzymatique de caséine Kovacs) : Lactose 5g 4.5.1 Composition : Sels biliaires n° 3 1,5 g Diméthylamino-4 benzaldéhyde 5g Monohydrogénophosphate de potassium 4g (K2HPO4) Méthyl-2 butanol-1 ou pentanol-1 75 ml Dihydrogénophosphate de potassium 1,5 g Acide chlorhydrique (ρ20 1,18 à 1,19 g/ml) 25 ml (KH2PO4) Chlorure de sodium 5g 4.5.2 Préparation : Eau 1000 ml Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l'alcool en chauffant dans un bain d'eau maintenu entre 50 °C et 55 °C. Refroidir et ajouter l'acide. 4.3.2 Préparation : Mettre à l'abri de la lumière et conserver à 4 °C. Dissoudre les composants ou le milieu complet Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair. déshydraté dans l'eau, en chauffant, si nécessaire. NOTE- Une préparation commerciale, prête à l'emploi, peut également être utilisée. Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 6,8 ± 0,2 à 25 °C. 5. APPAREILLAGE ET VERRERIE : Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications tubes de 16 mm x 160 mm (5.4) contenant des cloches de sont similaires. Durham (5.6). Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et en Stériliser à l'autoclave (5.1) réglé à 121 °C pendant 15 particulier, ce qui suit : min. 5.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave) : Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d'air après stérilisation. 5.2 Etuve, réglable à 37 °C ± 1 °C et à 44 °C ± 1 °C. 18 Safar 1439 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 64 29 7 novembre 2017 5.3 Bain d'eau, pouvant être maintenu à 44 °C ± 1°C. 8.1.2 Incubation du milieu sélectif d'enrichissement (bouillon lauryl sulfate) : 5.4 Tubes à essais, de dimension 16 mm x 160 mm et Incuber le bouillon lauryl sulfate (4.2) simple ou double 18 mm x 180 mm ou 20 mm x 200 mm environ. concentration dans l'étuve (5.2) réglé à 37 °C pendant 24 h ± 2 h. Si, à ce stade, on n'observe pas de production de 5.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en gaz, ni de trouble empêchant l'observation du dégagement nickel/chrome, d'environ 3 mm de diamètre, ou anses gazeux, prolonger l'incubation jusqu'à 48 h ± 2 h. bouclées stériles à usage unique de 10 µl approximativement. NOTE - Pour les coquillages marins vivants, la durée d'incubation peut être limitée à 48 h ± 2 h. 5.6 Cloches de Durham, de dimensions appropriées Pour certains produits laitiers (caséine par exemple), la pour leur utilisation dans les tubes à essais (5.4). cloche de Durham peut être collée au fond des tubes de milieu d'enrichissement sélectif. 5.7 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacité nominale. Si après 48 h d'incubation, une opacité sans formation de gaz est observée, ensemencer un bouillon EC à partir 5.8 pH-mètre, ayant une résolution de 0,01 unité de pH du bouillon précédent puis continuer la méthode tel que et une exactitude de mesurage de ± 0,1 unité de décrit en (8.1.3). pH à 25 °C. 8.1.3 Ensemencement et incubation du milieu sélectif (bouillon EC) :

6. ECHANTILLONNAGE : Après l'incubation du milieu double concentration Il est recommandé que le laboratoire reçoit un (4.2.1 a) en (8.1.2), si une opacité, un trouble ou un échantillon représentatif, non endommagé ou modifié lors dégagement gazeux sont observés, ou après l'incubation du transport ou de l'entreposage. du milieu simple concentration (4.2.1 b) selon (8.1.2), si un dégagement gazeux est observé, inoculer un tube de

7. PREPARATION DE L'ÉCHANTILLON POUR bouillon EC (4.3) avec une anse (5.5) et incuber en bain d'eau (5.3) ou dans une étuve (5.2) réglée à 44 °C pendant ESSAI : 24 h ± 2 h. Si, à ce stade, il n'y a aucun gaz visible dans le bouillon EC (4.3), poursuivre l'incubation jusqu'à 48 h ± Préparer l'échantillon pour essai conformément à la 2 h. méthode spécifique du produit concerné. NOTE - Pour les coquillages marins vivants, la durée

8. PROCEDURE : d'incubation peut être limitée à 24 h ± 2 h. 8.1 Méthode de détection : 8.1.4 Ensemencement et incubation de l'eau peptonée : 8.1.1 Prise d'essai et suspension mère : Après incubation en (8.1.3), si un dégagement gazeux est observé, inoculer avec une anse (5.5) un tube d'eau Ajouter 1 ml de la suspension mère à 9 ml de bouillon peptonée (4.4), préchauffé à 44 °C. Incuber pendant 48 h lauryl sulfate simple concentration (4.2.1 b) (c'est-à-dire ± 2 h à 44 °C. 0,1 g ou 0,1 ml de l'échantillon) ou 10 ml de la suspension mère à 10 ml de bouillon lauryl sulfate double 8.1.5 Examen pour la production d'indole : concentration (4.2.1 a) (c'est-à-dire 1 g ou 1 ml de Ajouter 0,5 ml de réactif indole (4.5) aux tubes d'eau l'échantillon). peptonée (4.4) et incuber selon (8.1.4). Pour des volumes plus importants de prise d'essai, Bien mélanger et examiner après 1 min. Une couleur préparer la suspension mère en ajoutant x ml ou x g à 9 x rouge dans la phase alcoolique indique la présence ml de diluant. Puis ajouter la totalité de la suspension d'indole. mère à 90 x ml de bouillon lauryl sulfate simple concentration (4.2.1.b). Par exemple, ajouter 5 ml ou 5 g 8.1.6 Interprétation : de l'échantillon à 45 ml de diluant et ajouter la totalité de Est considéré comme positif, le milieu d'enrichissement la suspension mère à 450 ml de bouillon lauryl sulfate sélectif incubé en (8.1.2), montrant, après la subculture et simple concentration (4.2.1. b), ou ajouter la prise d'essai l'incubation en (8.1.3) et (8.1.4), un dégagement gazeux à un volume égal de bouillon lauryl sulfate double visible dans le tube de bouillon EC (4.3) et une production concentration (4.2.1.a). d'indole dans le tube d'eau peptonée (4.4). 18 Safar 1439 30 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 64 7 novembre 2017 8.2 Méthode de dénombrement : 8.2.3 Subculture et incubation du milieu sélectif (bouillon EC) : 8.2.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions : 8.2.3.1 Pour chaque tube de milieu double concentration et pour chaque tube de milieu simple Préparer un nombre suffisant de dilutions pour assurer concentration incubé selon (8.2.2.5), si on observe une que tous les tubes de la dilution finale donneront un opacité, un aspect trouble ou un dégagement gazeux, résultat négatif. réaliser une subculture dans un tube de bouillon EC (4.3) à l'aide d'une anse (5.5). 8.2.2 Inoculation et incubation du milieu d'enrichissement sélectif (bouillon au lauryl sulfate) : 8.2.3.2 Incuber les tubes en (8.2.3.1) dans un bain d'eau (5.3) ou une étuve (5.2) à 44 °C pendant 24 h ± 2 h. Si, à 8.2.2.1 Une série de trois tubes pour chaque dilution est ce stade, il n'y a aucun dégagement gazeux visible dans le bouillon EC (4.3), poursuivre l'incubation jusqu'à 48 h prévue. Il est nécessaire d'incuber une série de cinq tubes ± 2 h. pour les coquillages marins vivants ou pour d'autres types de produits, et/ou quand une exactitude plus grande des La durée d'incubation doit être de 24 h ± 2 h pour les résultats est exigée. coquillages marins vivants. 8.2.2.2 Prendre trois tubes double concentration de 8.2.4 Inoculation et incubation de l'eau peptonée : milieu d'enrichissement sélectif (4.2.1.a), transférer dans chacun de ces tubes 10 ml de la suspension mère en Pour chaque tube incubé selon (8.2.3.2) et montrant un utilisant une pipette stérile (5.7). Ces prises d'essai dégagement gazeux visible, inoculer avec une anse (5.5) un tube d'eau peptonée (4.4), préchauffé à 44 °C. Incuber correspondent à 1 g d'échantillon par tube. pendant 48 h ± 2 h à 44 °C. 8.2.2.3 Prenez alors trois tubes de milieu 8.2.5 Examen pour la production d'indole : d'enrichissement sélectif simple concentration (4.2.1.b), transférer à chacun de ces tubes 1 ml de la suspension Ajouter 0,5 ml de réactif indole (4.5) aux tubes d'eau initiale en utilisant une nouvelle pipette stérile (5.7). Ces peptonée (4.4) incubés en (8.2.4). prises d'essai correspondent à 0,1 g d'échantillon par tube. Bien mélanger et examiner après 1 min. Une couleur 8.2.2.4 Pour chacune des nouvelles dilutions (égal à rouge de la phase alcoolique indique la présence d'indole. 0,01 g, 0,001 g, etc. d'échantillon par tube), procéder 8.2.6 Interprétation : comme en (8.2.2.3), en utilisant une nouvelle pipette stérile pour chaque dilution. Mélangez soigneusement Est considéré comme positif, chaque tube de milieu l'inoculum et le milieu. d'enrichissement sélectif double concentration (4.2.1.a) et simple concentration (4.2.1.b) incubé selon (8.2.2) 8.2.2.5 Placer dans l'incubateur (5.2) les tubes de milieu montrant, après la subculture et l'incubation en (8.2.3) et d'enrichissement sélectif double concentration préparés en (8.2.4), un dégagement gazeux visible dans le tube de (8.2.2.2) et les tubes simple concentration préparés en bouillon EC (4.3) et une production d'indole dans le tube (8.2.2.3) et (8.2.2.4), à 37 °C pendant 24 h ± 2 h. d'eau peptonée (4.4). Pour chaque dilution, comptez le nombre de tubes de Si, à ce stade, ni la production de gaz, ni l'opacité résultat positif de milieu double concentration (4.2.1.a) et empêchant l'observation de dégagement gazeux ne sont simple concentration (4.2.1.b). observés poursuivre l'incubation jusqu'à 48 h ± 2 h.

9. EXPRESSION DES RESULTATS : Pour les coquillages marins vivants, la durée d'incubation doit être de 48 h ± 2 h. Conformément à l'interprétation des résultats (8.1.6), conclure la présence ou l'absence d'Escherichia coli Pour certains produits laitiers (caséine par exemple), la présumés dans la masse en grammes ou le volume en cloche de Durham peut être collée au fond des tubes de millilitres de l'échantillon pour essai. milieu d'enrichissement sélectif. Si, après 48 h de temps d'incubation, une opacité sans formation de gaz est Calculer le nombre le plus probable (NPP) observée, ensemencer un bouillon EC (4.3) à partir du d'Escherichia coli présumés de chacun des tubes positifs bouillon précédent puis continuer la méthode telle que pour chacune des dilutions, par référence aux tables décrite en (8.2.3). statistiques fixées par les techniques reconnues.