Regulation on measures for the detection, prevention and control of the harmful organism Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. which causes the potato disease ring rot

21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 11 1419 На основу члана 36, а у вези за чланом 43. Закона о за штити здравља биља у Републици Српској (“Службени гла сник Републике Српске”, број 25/09), и члана 76. став 2. За кона о републичкој управи (“Службени гласник Републике Српске”, број 115/18), министар пољопривреде, шумарства и водопривредe д о н о с и ПРАВИЛНИК О МЈЕРАМА ЗА ОТКРИВАЊЕ, СПРЕЧАВАЊЕ ШИРЕЊА И СУЗБИЈАЊЕ ШТЕТНОГ ОРГАНИЗМА Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., ПРОУЗРОКОВАЧА ПРСТЕНАСТЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА Члан 1. Овим правилником прописују се мjере за открива ње, спречавање ширења и сузбијање штетног организма Clavibavetr michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., проузроковача прсте насте трулежи кртола кромпира, начин одређивања грани ца зараженог, угроженог и подручја без штетног организма, услови за окончање наложених мjера, као и начин оба вjештавања о предузетим мjерама и престанак мjера. Члан 2. (1) Ради откривања штетног организма Clavibavetr michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., проузроковача прсте насте трулежи кртола кромпира (у даљем тексту: штетни организам), спроводи се посебан надзор над штетним орга низмом који обухвата прегледе биљака и кртола кромпира (Solanum tuberosum L.) и прегледе регулисаних објеката. (2) Број, поријекло, метод и вријеме узимања узорака приликом прегледа биљака и кртола кромпира и регули саних објеката одређује се у зависности од специфичних система производње кромпира и биологије штетног орга низма. Члан 3. (1) При прегледу биљака кромпира у пољу у току ве гетације врши се визуелни преглед на присуство штетног организма, узимају се узорци биљака и достављају овла шћеној фитосанитарној лабораторији (у даљем тексту: ла бораторија) ради лабораторијског испитивања. (2) При прегледу кртола кромпира узимају се узорци кртола сјеменског кромпира и осталог кромпира који није намијењен садњи (у даљем тексту: меркантилни кромпир), првенствено из лотова у складиштима и дистрибутивним центрима ради обављања визуелног прегледа сјечењем кртола, односно достављања лабораторији ради лаборато ријског испитивања. (3) Сјеменски кромпир мора да потиче директно од ма теријала произведеног у складу са званичним програмом контроле и за који је лабораторијским испитивањем утврђе но да није заражен штетним организмом. (4) Лабораторијско испитивање из ст. 1. и 2. овог члана спроводи се у складу са међународно прихваћеним проце дурама, на начин описан у Шеми тестирања за дијагности ку, детекцију и идентификацију проузроковача прстенасте трулежи кромпира, којa је се налази у Прилогу овог пра вилника и чини његов саставни дио. Члан 4. (1) Сумња на појаву штетног организма постоји ако су визуелним прегледом уочени типични симптоми болести или је резултат једног од брзих тестова провјере (screening test) позитиван. (2) Да би се потврдила или отклонила сумња на појаву штетног организма, спроводе се лабораторијска испитива ња на начин описан у Прилогу овог правилника. (3) Приликом спровођења лабораторијских испитива ња, на одговарајући начин, чувају се узорковане кртоле и, када је то могуће, узорковане биљке, преостали екстракт и додатно припремљен материјал за брзе тестове провјере (screening test), нпр. стакалца за имунофлуоресценцију и сву релевантну документацију. (4) У случајевима када је то потребно, сачувани узорак кртола омогућава и испитивање сортности. (5) Када је лабораторијским испитивањем потврђено присуство штетног организма, најмање мјесец дана од дана потврђене заразе чува се, на одговарајући начин, узорак вјештачки заражених тест биљака плавог патлиџана и изо лована култура штетног организма. Члан 5. (1) У случају сумње на појаву штетног организма, пре дузимају се сљедеће мјере: 1) забрана премјештања свих лотова или пошиљака кромпира из којих су узети узорци, 2) додатне превентивне мјере ради спречавања ширења штетног организма, у зависности од процијењеног степена ризика. (2) Додатне превентивне мjере из става 1. тачка 2) овог члана посебно укључују надзор над премјештањем свих осталих кртола или биљака повезаних са сумњивом поја вом, унутар и ван објеката, ограничавање употребе могуће заражених машина и опреме. Члан 6. Ако држалац биља, биљних производа и регулисаних објеката или било која друга особа уочи симптоме заразе или посумња на појаву штетног организма, обавезан је да о томе одмах обавијести Министарство пољопривреде, шу марства и водопривреде (у даљем тексту: Министарство) и Републичку управу за инспекцијске послове (у даљем тек сту: Инспекторат). Члан 7. Када се на основу резултата лабораторијског испитива ња потврди присуство штетног организма, Министарство у сарадњи са Инспекторатом одређује границе зараженог, угроженог или подручја без штетног организма, тако што: 1) означава као заражене кртоле или биљке, пошиљке, односно лотове, машине, превозна средства, складишта или њихове дијелове и друге објекте и предмете, укљу чујући и материјал за паковање из којих је сваки од узорака узет, као и мјеста производње и парцеле са којих потичу биљке и кртоле, 2) одређује обим могуће заразе евидентирањем чиње ница о свим контактима у производном процесу са извором заразе (прије и послије вађења кртола) с циљем одређивања обима могуће заразе и ширења штетног организма, 3) разграничава заражено, угрожено и подручје без штетног организма на основу означене и потврђене заразе, обима могуће заразе, као и могућег ширења штетног орга низма. Члан 8. (1) Министарство у сарадњи са Инспекторатом, на основу података заснованих на научним принципима и биологији штетног организма, као и података о систему производње, маркетинга и прераде, утврђује обим могуће заразе на основу информација о могућем контакту кртола са утврђеном заразом прије и послије њиховог вађења или током њихове производње, узимајући у обзир: 1) кртоле или биљке произведене на мјесту производње које је означено као заражено, 2) другa мјеста производње која су у било каквој вези са кртолама или биљкама које су означене као заражене, као и заједнички коришћена опрема и објекти, 3) кртоле или биљке које су произведене на мјестима производње из тачке 2) овог става или су се налазиле на тим мјестима истовремено са кртолама и биљкама које су означене као заражене, 12 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. 4) простор и објекте у којима се обавља манипулација кромпира који потиче са мјеста производње из т. 1) до 3) овог става, 5) машине, превозна средства, складишта или њихове дијелове, као и друге објекте или предмете, укључујући и материјал за паковање, који су могли да дођу у додир са кртолама или биљкама које су означене као заражене, 6) кртоле или биљке које су биле ускладиштене или у додиру са неким од регулисаних објеката или са предме тима из тачке 5) овог става прије њиховог чишћења и де зинфекције, 7) кртоле или биљке које се сматрају могуће зараженим због клонске повезаности са кртолама или биљкама које су означене као заражене, иако су резултати тестирања нега тивни, а када је потребно, спроводи се и тест сортности да би се провјерио идентитет заражених и клонски сродних кртола или биљака кромпира, 8) мјесто производње кртола или биљака из тачке 7) овог става. (2) Одређивање могућег ширења штетног организма врши се на основу близине других мјеста производње кромпира и других биљака домаћина, као и заједничке про изводње и употребе залиха сјеменског кромпира. Члан 9. (1) Партије кромпира које су клонски сродне са кртола ма или биљкама које су означене као заражене подлијежу обавезном лабораторијском испитивању на начин описан у Прилогу овог правилника. (2) Након добијања резултата лабораторијског тести рања из става 1. овог члана, Министарство у сарадњи са Инспекторатом спроводи даље утврђивање обима потврђе не заразе и обима могуће заразе, те посебно регулисаног подручја. (3) Министарство у сарадњи са Инспекторатом обиље жава посебно регулисано подручје. Члан 10. (1) Кртоле или биљке које су означене као заражене се уништавају, односно спаљују или на други начин одлажу на мјесту за одлагање отпада на коме не постоји ризик од ширења штетног организма. (2) Ако је утврђено да не постоји ризик од ширења штетног организма, кртоле или биљке које су означене као заражене могу се употребљавати на сљедећи начин: 1) као храна за животиње послије термичке обраде на начин који не оставља никакву могућност преживљавања штетног организма, 2) индустријски прерађивати, под условом да се ди ректно допреме до мјеста прераде на коме постоји опре ма за одлагање отпада чијим коришћењем је отклоњена опасност од ширења штетног организма и које има систем за чишћење и дезинфекцију превозних средстава која на пуштају мјесто прераде, 3) подвргавати и другим мјерама под условом да нема опасности од ширења штетног организма. Члан 11. Кртоле или биљке које се сматрају могуће зараженим штетним организмом и кртоле или биљке кромпира које су клонски повезане са онима које су означене као заражене, без обзира на резултате тестирања, не смију се користити за садњу, већ се могу: 1) употријебити као меркантилни кромпир намијењен исхрани, при чему кромпир мора да буде пакован на мје стима која располажу одговарајућом опремом за одлагање отпада и који је пакован за директну испоруку без препаки вања, а са сјеменским кромпиром дозвољено је руковати на тим истим мјестима само ако се ради одвојено или након чишћења и дезинфекције, или 2) употријебити као меркантилни кромпир намијењен индустријској преради, уз директну и брзу испоруку до погона за прераду, који мора да располаже одговарајућом опремом за одлагање отпада и системом за чишћење и дезинфекцију превозних средстава која напуштају мјесто прераде, или 3) употријебити или одложити на неки други начин под условом да нема опасности од ширења штетног организма. Члан 12. (1) Отпад који је настао као резултат спровођења мјера из чл. 10. и 11. овог правилника и отпад који настаје то ком руковања, одстрањивања и прераде заражених партија кромпира одлаже се на начин да се избјегне свака опасност од ширења штетног организма, и то: 1) отпаци кромпира (укључујући одбачени кромпир и кору) и сви други чврсти отпаци који су у вези с кромпиром (укључујући земљу, камење и друге остатке) уклањају се на сљедећи начин: 1. одлагањем на за то службено одобреном мјесту на којем не постоји опасност од неконтролисаног ширења штетног организма у околину, нпр. испирањем кроз поре земље до пољопривредног земљишта, на начин да се от паци превозе директно до одређеног мјеста у затвореном превозном средству тако да не постоји опасност од губитка отпада, 2. спаљивањем, 3. примјеном неке друге мјере за које је утврђено да не постоји опасност од ширења штетног организма; 2) течни отпад настао у преради који садржи чврсте че стице се филтрира или обрађује поступком седиментације ради уклањања чврстих честица, које се након тога укла њају на начин из става 1. тачка 1) овог члана. (2) Течни дио отпада неопходно је загријати на тем ператури од најмање 60 °C у трајању најмање 30 минута или одстранити под службеним надзором на начин који онемогућава да отпаци дођу на било који начин у додир са пољопривредним земљиштем или изворима воде која може бити коришћена за наводњавање пољопривредног земљи шта. Члан 13. (1) Машине, превозна средства, складишта и њихови дијелови и други објекти и предмети, укључујући и мате ријал за паковање, који су означени као заражени или се сматрају зараженима, чисте се и дезинфикују примјеном одговарајућих метода за чишћење и дезинфекцију којима се отклања опасност од ширења штетног организма. (2) У случају када материјал за паковање из става 1. овог члана није могуће очистити и дезинфиковати тако да се отклони опасност од ширења штетног организма, нала же се његово уништавање. Члан 14. (1) На пољу које је означено као заражено спроводе се сљедеће мјере: 1) за вријеме од најмање три вегетационе године послије године у којој је утврђена зараза није дозвољена садња кртола и биљака, као ни сјетва сјемена кромпира у ботаничком смислу и других биљака домаћина штетног организма или усјева за које је утврђено да омогућују ши рење штетног организма и обавезно се уклањају самоникле биљке кромпира и других биљака домаћина штетног орга низма, 2) током четири вегетационе године послије године у којој је утврђена зараза спроводе се мјере одржавања поља на угару или коришћење поља као трајног пашњака са ин тензивном испашом или честом ниском косидбом и укла њање самониклих биљака кромпира и других самониклих биљака домаћина штетног организма. (2) У првој сезони производње кромпира која слиједи послије периода из става 1. тачка 1) овог члана, под усло вом да на пољу најмање двије посљедње вегетационе годи не током спровођења прегледа нису пронађене самоникле биљке кромпира и друге биљке домаћини, дозвољава се 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 13 производња искључиво меркантилног кромпира и спрово ди се лабораторијско испитивање кртола приликом вађења. (3) У сезони производње кромпира која слиједи послије сезоне из става 2. овог члана дозвољава се, уз одговарају ћи плодоред, који мора бити најмање двогодишњи за про изводњу сјеменског кромпира, производња сјеменског или меркантилног кромпира, уз спровођење прегледа. (4) Послије спровођења мјера из става 1. тачка 2) овог члана, у сљедећој вегетационој години дозволиће се про изводња сјеменског или меркантилног кромпира, уз лабо раторијско испитивање извађених кртола, ако на пољу које је означено као заражено у току спровођења прегледа нису пронађене самоникле биљке кромпира и друге биљке до маћини најмање двије узастопне вегетационе године. Члан 15. (1) На осталим пољима унутар мјеста производње које је означено као заражено у вегетационој години која слије ди послије године у којој је утврђена зараза није дозвоље на садња кртола и биљака кромпира, као ни сјетва сјемена кромпира у ботаничком смислу и налаже се уклањање са мониклих биљака домаћина штетног организма. (2) Изузетно од става 1. овог члана, ако је прије садње утврђено да је отклоњена опасност од самониклих биљака кромпира, може се дозволити садња сертификованог сје менског кромпира намијењеног искључиво производњи меркантилног кромпира, уз обавезно лабораторијско испи тивање извађених кртола. (3) У другој и трећој вегетационој години које слиједе послије године у којој је зараза утврђена, послије спро вођења мјера из ст. 1. и 2. овог члана, дозволиће се садња искључиво сертификованог сјеменског кромпира за сјемен ску или меркантилну производњу. (4) Поред мјера из ст. 1, 2. и 3. овог члана, најмање три вегетационе године спроводи се уклањање самониклих биљака кромпира и других биљака домаћина штетног ор ганизма ако су присутне, као и лабораторијско испитивање извађеног кромпира са сваког поља. Члан 16. (1) У заштићеним просторима на мјесту производње које је означено као заражено и који су намијењени про изводњи биља није дозвољена садња кртола и биљака кромпира, као ни сјетва сјемена кромпира у ботаничком смислу све док се не спроведу мјере уништавања штет ног организма и не уклоне остаци биљака домаћина, при чему се као минимална мјера спроводи замјена супстрата за гајење, чишћење и дезинфекција производне јединице и цјелокупне опреме. (2) Послије спровођења мјера из става 1. овог члана дозвољава се садња искључиво сертификованог сјеменског кромпира или мини-кртола или микробиљака добијених из културе биљног ткива које потиче из тестираних извора. Члан 17. Ради праћења здравственог стања биља, биљних про извода и регулисаних објеката у зараженом или угроженом подручју и утврђивања услова за престанак наложених мје ра, поред спровођења мјера из чл. 10. до 16. овог правил ника, у току најмање три вегетационе године које слиједе послије године у којој је зараза утврђена врши се: 1) надзор мјеста на којима се производе, складиште, на лазе или дорађују кртоле кромпира, укључујући и парцеле, површине, уређаје и опрему, 2) садња искључиво сертификованог сјеменског кром пира унутар зараженог или угроженог подручја и обавезно испитивање послије вађења сјеменског кромпира који је произведен на могуће зараженим мјестима производње, 3) на свим производним површинама унутар зараженог и угроженог подручја са произведеним сјеменским кром пиром поступа се одвојено од меркантилног кромпира или се врши чишћење и дезинфекција објеката, уређаја и опреме између поступања са сјеменским и меркантилним кромпиром. Члан 18. (1) Подаци и информације о потврђеној зарази, као и подаци и информације о престанку мјера, достављају се на длежним органима у складу са међународним конвенција ма и споразумима. (2) Министарство води евиденцију која укључује доку ментоване доказе о обиму потврђене заразе, обиму могуће заразе и о подручју могућег ширења, са сљедећим инфор мацијама: 1) датум када је зараза потврђена, 2) опис елемената који су довели до одлуке да се про гласи зараза и подручје могућег ширења штетног органи зма, укључујући и податке о узимању узорака и о лабора торијском налазу, 3) за било коју количину или пошиљку кромпира озна чену као заражену, податке о фитосанитарном цертификату, увјерењу о здравственом стању у случају домаће производ ње кромпира и, када је могуће, податке о биљном пасошу, регистарском броју произвођача, збирним складиштима и диспечерским центрима, 4) информације о идентификованим или могућим изво рима заразе, 5) појединости о обиму означене заразе, укључујући број мјеста производње и број партија са називом сорте, а када се ради о сјеменском кромпиру, и о његовој категорији, 6) појединости о посебно регулисаном подручју, укљу чујући мјеста производње која нису означена као заражена, али су укључена у посебно регулисано подручје. Члан 19. Овај правилник ступа на снагу осмог дана од дана обја вљивања у “Службеном гласнику Републике Српске”. Број: 12.03.3-330-1904/20 29. јуна 2020. године Министар, Бањалука Др Борис Пашалић, с.р. ПРИЛОГ ШЕМА ТЕСТИРАЊА ЗА ДИЈАГНОСТИКУ, ДЕТЕКЦИЈУ И ИДЕНТИФИКАЦИЈУ ПРОУЗРОКОВАЧА ПРСТЕНАСТЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА Поглавље I ОБЛАСТ ПРИМЈЕНЕ ШЕМЕ ТЕСТИРАЊА Приказана шема тестирања описује различите поступке укљу чене у: 1) дијагнозу прстенасте трулежи на кртолама и биљкама кром пира, 2) детекцију Clavibavetr michiganensis ssp. sepedonicus у узор цима кртола кромпира и биљкама, 3) идентификацију Clavibavetr michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus). Поглавље II ОПШТА НАЧЕЛА У поглављима III-XI овог прилога налазе се стандардни прото коли за поједине методе, потврђени и одобрени реагенси и поједи ности везане за припрему материјала за тестирање и референтног материјала. У Поглављу III овог прилога налази се и списак ла бораторија укључених у процес оптимизације и валидације про токола. С обзиром на то да протоколи укључују методе детекције карантинског организма, што подразумијева и употребу живих референтних култура C.m. subsp. sepedonicus, процедура се мора изводити у прописаним карантинским условима са одговарајућим објектима за одлагање, чување и уништавање отпада у складу са Правилником. Параметри тестирања морају обезбиједити уједначене и поно вљиве нивое детекције C. m. subsp. sepedonicus према прописаним праговима осјетљивости појединих метода. Обавезна је прецизна припрема позитивних контрола. Тестирање у складу са захтиjеваним прагом осјетљивости подразумијева правилно постављање, одржавање и калибрисање опреме, пажљиво руковање и чување реагенаса, као и предузи мање мјера за спречавање контаминације између узорака, нпр. ра 14 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. здвајање позитивних контрола од узорака за тестирање. Да би се избјегле административне или друге грешке, морају се примјењи вати стандарди контроле квалитета, посебно при означавању узо рака и вођењу документације. Сумња на присуство патогена у узорку подразумијева позити ван резултат теста провјере узорка, као што је приказано у дија грамима тока. Ако је резултат првог теста провјере (IF или PCR/FISH) по зитиван, тада се сумња на присуство C. m. subsp. sepedonicus и потребно је примијенити и други тест провјере. Ако је резултат и другог теста позитиван, тада је сумња потврђена и тестирање се наставља према описаној шеми. Ако је резултат другог теста негативан, тада се сматра да C. m. subsp. sepedonicus није присутан у узорку. Позитиван резултат IF теста дефинише се као позитивно очи тавање IF теста потврђено и другим тестом провјере (PCR/FISH). Потврђено присуство патогена подразумијева изолацију и идентификацију чисте културе C. m. subsp. sepedonicus и потврду патогености. 1. Приказ дијаграма тока 1.1. Шема утврђивања присуства проузроковача прстенасте трулежи у кртолама и биљкама кромпира са типичним симптоми ма прстенасте трулежи (Шема 1) Поступак тестирања се примјењује за кртоле и биљке кром пира са типичним симптомима или симптомима који изазивају сумњу на присуство проузроковача прстенасте трулежи. Поступак укључује тест провјере, изолацију патогена из зараженог спровод ног ткива на хранљиву подлогу и, у случају позитивног резултата, идентификацију чисте културе C. m. subsp. sepedonicus. Шема 1. 1) Опис симптома наведен је у тачки 2. овог поглавља. 2) Одговарајући тестови су: IF тест (тачка 4. овог поглавља), PCR тест (тачка 6. овог поглавља), FISH тест (тачка 5. овог поглавља). 3) Иако је изолација патогена из биљног материјала са типич ним симптомима примјеном методе разрјеђења и засијавања на хранљиву подлогу једноставна, овај поступак може бити значајно отежан у узорцима у поодмаклој фази инфекције. Сапрофитне бак терије које се развијају на обољелом ткиву могу прерасти или ин хибирати патогена на хранљивој подлози. Зато се препоручује ко ришћење и неселективне и селективне хранљиве подлоге (најбоље MTNA) или примјена биолошког теста из тачке 7. овог поглавља. 4) Опис типичне морфологије колоније наведен је у тачки 8. овог поглавља. 5) Ако је резултат изолације негативан, а симптоми болести типични, тада је потребно поновити поступак изолације патогена. 6) Поуздана идентификација чисте културе C. m. subsp. sepedonicus постиже се примјеном тестова наведених у тачки 9. овог поглавља. 7) Тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. 1.2. Шема за утврђивање присуства и идентификацију C. m. subsp. sepedonicus у узорцима кртола кромпира без видљивих симптома (Шема 2) Шема 2. 1) Стандардна величина узорка је 200 кртола, а ако на распо лагању нема 200 кртола, поступак се може спровести и на мањим узорцима. 2) Методе екстракције и концентровања патогена описане су у тачки 3. овог поглавља. 3) Ако су резултати најмање два теста који су засновани на различитим биолошким начелима позитивни, потребно је извр шити изолацију и потврдити присуство патогена. Извршити бар један тест провјере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други или више тестова провјере који су за сновани на различитим биолошким начелима да би се потврдио позитиван резултат. Ако су резултати осталих тестова негативни, сматра се да је тај узорак негативан. Даље тестирање није потреб но. 4) Тест имунофлуоресценције (IF) - користити поликлонална антитијела за IF тест, а додатна моноклонална антитијела омогућа вају већу специфичност (тачка 4. овог поглавља). 5) PCR тест - користити потврђене и одобрене реагенсе и про токоле за PCR (тачка 6. овог поглавља). 6) FISH тест - користити потврђене реагенсе и протоколе (тач ка 5. овог поглавља). 7) Селективна изолација: У многим случајевима коришћење MTNA или NCP-88 хранљивих подлога и 1/100 разрјеђења ресу спендованог талога је одговарајућа метода за директну изолацију C. m. subsp. sepedonicus. Типичне колоније се појављују три до десет дана послије засијавања на хранљиву подлогу, када их је мо гуће пречистити и идентификовати патогена. Пажљивим вађењем и припремом конуса пупчаног дијела кртоле кромпира избјегава се 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 15 појава сапрофитних бактерија са кртола кромпира, које на хранљи вој подлози конкуришу колонији C. m. subsp. sepedonicus и могу је прерасти. Ако се патоген не може изоловати на хранљивој подлози, потребно је поновити поступак изолације коришћењем биљака из биолошког теста (тачка 8. овог поглавља). 8) Биолошки тест се користи за изолацију C. m. subsp. sepedonicus из екстракта селективним обогаћивањем у биљкама плавог патлиџана (Solanum melongena). Тест захтиjева оптималне услове инкубације као што је наведено у овој методи. Током при мjене овог теста, највjероватније је да неће доћи до појаве бактерија које инхибирају раст и развој C.m. subsp. sepedonicus на хранљивим подлогама MTNA или NCP-88 (тачка 7. овог поглавља). 9) Типична морфологија колоније описана је у тачки 8. овог поглавља. 10) Гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспјешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бак теријама. Ако се у тестовима провјере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање спроводног ткива на мјесту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке. 11) Поуздана идентификација чистих култура C. m. subsp. sepedonicus постиже се извођењем тестова описаних у тачки 9. овог поглавља. 12) Тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. Начело - Поступак тестирања намијењен је за откривање при суства скривене заразе у кртолама кромпира. Позитиван резултат најмање два теста провјере, заснован на различитим биолошким начелима, допуњује се изолацијом пато гена, послије чега, у случају изолације типичних колонија, слиједи потврда чисте културе C. m. subsp. sepedonicus. Позитиван резул тат само једног од тестова провјере није довољан да би се узорак сматрао вјероватно зараженим. Тестови провјере и изолација морају омогућити ниво осје тљивости детекције 103 до 104 ћелија/ml ресуспендованог талога, укљученог као позитивна контрола у свакој серији тестова. 1.3. Шема за утврђивање присуства и идентификацију C. m. subsp. sepedonicus у узорцима биљака кромпира без симптома (Шема 3) Шема 3. 1) Препоручене величине узорака наведене су у тачки 3. подтачка 3.2. овог поглавља. 2) Екстракција патогена и методе концентровања описане су у тачки 3. подтачка 3.2. овог поглавља. 3) Ако су резултати најмање два теста који су засновани на ра зличитим биолошким начелима позитивни, потребно је извршити изолацију и потврду присуства патогена. Извршити бар један тест провјере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други или више тестова провјере који су засновани на различитим биолошким начелима да би се потврдио позитиван резултат. Ако су резултати осталих тестова негативни, сматра се да је тај узорак негативан. Даље тестирање није потребно. 4) Селективна изолација и типична морфологија колоније опи сани су у тачки 8. овог поглавља. 5) IF тест описан је у тачки 4. овог поглавља. 6) PCR тестови описани су у тачки 6. овог поглавља. 7) FISH тест описан је у тачки 5. овог поглавља. 8) Биолошки тест описан је у тачки 7. овог поглавља. 9) Гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспјешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бак теријама. Ако се у тестовима провјере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање спроводног ткива на мјесту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке. 10) Поуздана идентификација чистих култура C. m. subsp. sepedonicus постиже се извођењем тестова описаних у тачки 9. овог поглавља. 11) Тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. 2. Визуелни преглед за откривање симптома прстенасте трулежи 2.1. Биљке кромпира У европским климатским условима симптоми се ријетко про налазе у пољу, и то често тек на крају сезоне. Осим тога, симптоми су често прикривени или се могу замијенити са симптомима дру гих биљних болести, старења биљака или механичким оштећењи ма. Зато се симптоми могу врло лако превидјети приликом прегле да у пољу. Симптоми увенућа разликују се од оних код проузроко вача мрке трулежи; увенуће је обично споро и у почетку ограниче но на ивице листова. Mлади заражени листови често настављају раст, мада у зараженим дијеловима спорије, што доводи до форми рања листова необичног облика. Због блокаде спроводног ткива у доњем дијелу стабљике, на листовима се између лисних нерава че сто појављују хлоротичне, жуто-наранџасте површине. Временом пропадају заражени дијелови листа, листови, па чак и стабљике. Често долази само до смањења величине листова и кртола. Повре мено су биљке закржљале. 2.2. Кртоле кромпира У најранијој фази појаве симптома ткиво кртоле је стакласто или прозирно, без омекшавања око спроводног ткива, посебно у близини пупчаног дијела кртоле. У пупчаном дијелу кртоле, прстен спроводног система може бити мало тамнији од уобичајеног. Први лако уочљив симптом је жућкаста боја спроводног прстена, а када се кртола благо стисне, из спроводних судова излазе мале количине материје сирасте конзистенције, која садржи милионе бактерија. Могућ је развој појаве браон (смеђе, мрке) боје спроводног ткива и симптоми на кртоли су у овом стадијуму слични симптомима мрке трулежи коју проузрокује Ralstonia solanacearum. У почетку, симптоми су ограничени на један дио спроводног прстена, не оба везно близу пупка, а касније се постепено проширују на цијели прстен. Како инфекција напредује, долази до потпуног пропадања спроводног ткива; спољни и унутрашњи дио кртоле могу се ра здвојити. У каснијим фазама инфекције на површини кртола поја вљују се пукотине, које су често црвенкастосмеђе боје по ивицама. Недавно је у Европи забиљежено неколико случајева појаве симп тома гдје је средиште кртоле трунуло истовремено са спроводним прстеном, што је довело до секундарног напада патогена са ства рањем унутрашњих шупљина и некроза. Присуство секундарних гљива или бактерија може прикрити симптоме, усљед чега може бити тешко, чак и немогуће, разликовати узнапредовале симптоме прстенасте трулежи од других трулежи кртола. Могућа је појава и нетипичних симптома прстенасте трулежи. 3. Припрема узорака 3.1. Кртоле кромпира Напомена 1. стандардна величина узорка је 200 кртола по тесту. Ин тензивније узорковање захтијева извођење већег броја тестова на узорцима те величине. Већи број кртола у узорку довешће до инхи биције или ће отежати тумачење резултата. Када је на располагању мање кртола, поступак се може примијенити и за узорке са мање од 200 кртола; 2. валидација свих метода за утврђивање присуства патогена, које су описане у даљем тексту, базира се на тестирању узорака од 200 кртола; 3. екстракт кромпира који је описан у даљем тексту може се користити и за утврђивање присуства проузроковача мрке трулежи кромпира бактерије Ralstonia solanacearum. Процедура која претходи припреми узорка: опрати кртоле, употријебити одговарајућа дезинфекциона средства (при ко 16 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. ришћењу PCR теста употријебити једињења хлора ради уклањања евентуално присутног ДНК патогена) и детерџенте између сваког узорка, те осушити кртоле на ваздуху. Поступак прања је посебно користан, али не и обавезан за случајеве обраде узорака са већом количином земље при извођењу PCR теста или процедуре директне изолације. 3.1.1. Чистим и дезинфикованим скалпелом или ножем за по врће уклонити покожицу са пупчаног дијела кртоле тако да се виде спроводни судови. Пажљиво изрезати мали конусни дио спровод ног ткива на пупчаном дијелу, захватајући што мање околног, не спроводног ткива. Напомена све кртоле са потенцијално сумњивим симптомима прстена сте трулежи одвојити посебно и тестирати; ако се приликом вађења конуса из пупчаног дијела уоче по тенцијални симптоми прстенасте трулежи, кртоле треба визуелно прегледати. Сваку пресјечену кртолу са оваквим симптомима тре ба оставити два дана на собној температури, а потом чувати у ка рантинским условима (на 4 °C до 10 °C) до спровођења тестирања. Све кртоле у узорку (укључујући и оне са сумњивим симптомима) треба чувати на начин прописан овим правилником. 3.1.2. Извађене конусе из пупчаног дијела кртоле који садрже дијелове спроводног ткива ставити у стерилне посуде које се могу запечатити и/или херметички затворити (ако су посуде већ упо требљаване, морају се темељно очистити и дезинфиковати употре бом средстава на бази једињења хлора). Узорке је пожељно одмах обрадити. Ако то није могуће, потребно је чувати их у посуди без додатка пуфера, најдуже 72 часа у фрижидеру или најдуже 24 часа на собној температури. Током чувања долази до сушења и субери зације сржног дијела конуса, као и до раста и развоја сапрофита, што може ометати утврђивање присуства бактерије проузроковача прстенасте трулежи. 3.1.3. Извађене конусе из пупчаног дијела кртоле обрадити ко ришћењем једног од сљедећих поступака: а) извађене конусе прекрити довољном количином (око 40 ml) екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога) и центрифуги рати на 50 до 100 обртаја/мин. четири часа на температури испод 24 °C или од 16 до 24 часа уз хлађење; б) извађене конусе хомогенизовати са довољном количином (око 40 ml) екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога), било у мјешалици (нпр. Waring или Ultra Thurax) било дробљењем у затвореној кеси за мацерацију за једнократну употребу (нпр. кесе Stomacher или Bioreba од чврстог политена, 150 mm · 250 mm, сте рилизоване зрачењем), користећи гумени чекић или одговарајући апарат за мацерирање (нпр. Homex). Напомена Ако се узорци хомогенизују у блендеру, постоји велика опа сност од њихове унакрсне контаминације. Предузети мјере опре за с циљем спречавања настајања аеросола или просипања током екстракције. За сваки узорак употријебити стерилизоване ножиће и посуде. Током процедуре PCR, спријечити пренос ДНК на кон тејнере или апаратуру за мацерирање. За PCR тест препоручује се мацерирање узорака у кесицама за једнократну употребу и даље коришћење епрувета и туба за једнократну употребу. 3.1.4. Одлити супернатант. Ако је превише мутан, разбистри ти га ултрацентрифугирањем на мањем броју обртаја (највише 180 g, 10 минута на температури од 4 °C до 10 °C) или вакуум ском филтрацијом (40 μm до 100 μm), током које се филтер до датно испира екстракционим пуфером (око 10 ml) - (Поглавље V овог прилога). 3.1.5. Извршити концентрисање фракције бактерије центрифу гирањем на 7.000 g 15 минута (или 10.000 g 10 минута) на темпе ратури од 4 ºC до 10 ºC, послије чега се пажљиво, без мијешања са талогом, одлива супернатант. 3.1.6. Ресуспендовати талог у 1,5 ml пелет пуфера (пуфера за растварање талога), (Поглавље V овог прилога). Од ове количине користити 500 μl за тестирање на присуство C. m. subsp. sepedonicus, 500 μл за тестирање на присуство Ralstonia solanacearum и 500 μl као референтни материјал за чување. У посљедњи, референтни дио од 500 μl додати стерилни глицерол у коначној концентрацији од 10% до 25% (v/v), промијешати и чувати на температури од -16 °C до -24 °C (недјељама) или на температури од -68 °C до -86 °C (мјесецима). Дијелове одвојене за утврђивање присуства бакте рија током тестирања чувати на температури од 4 °C до 10 °C. Не препоручује се вишеструко замрзавање и одмрзавање. У случају потребе за транспортом узорака, узорке доставити у преносивом фрижидеру у року од 24 до 48 часова. 3.1.7. Важно је да се све позитивне контроле C. m. subsp. sepedonicus и узорци држе одвојено да би се избјегла контамина ција. Ово се односи и на IF плочице и друге тестове. 3.2. Биљке кромпира Напомена За откривање латентних популација C. m. subsp. sepedonicus препоручује се тестирање збирних узорака. Поступак се може погодно примијенити на збирне узорке са највише 200 дијелова стабљике (узимање узорака током спровођења надзора се мора заснивати на статистички репрезентативном узорку испитиване биљне популације). 3.2.1. Чистим дезинфикованим ножем или маказама за резидбу одрезати 1 cm до 2 cm доњег дијела сваке стабљике, одмах изнад површине земљишта. Дијелове стабљике дезинфиковати кратким потапањем у 70% етанола и одмах осушити упијајућим папиром. Ставити дијелове стабљике у затворену стерилну посуду. 3.2.2. Обрадити дијелове стабљике помоћу једног од сљедећих поступака: а) дијелове стабљике прекрити довољном количином (при ближно 40 ml) екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога) и ултрацентрифугирати на 50 до 100 obrt/min четири часа на темпе ратури испод 24 °C или 16 до 24 часа уз хлађење; б) дијелове стабљике измацерирати у чврстој кеси за мацера цију (нпр. Stomacher или Bioreba) са одговарајућом количином ек стракционог пуфера (Поглавље V овог прилога), користећи гумени чекић или одговарајућу опрему за мацерирање (нпр. Homex). Ако то није могуће, дијелове стабљике чувати у фрижидеру најдуже 72 часа или на собној температури најдуже 24 часа. 3.2.3. Након 15 минута таложења, одлити супернатант. 3.2.4. Даље избистравање екстракта или концентровање фрак ције бактерија обично није потребно, али се може постићи фил трирањем и/или центрифугирањем. 3.2.5. Подијелити чисти или концентровани екстракт узорка на два једнака дијела. Једну половину чувати на температури од 4 °C до 10 °C током тестирања, а другу половину оставити за случај употребе у додатним тестирањима: у екстракт се додаје од 10% до 25% (v/v) стерилног глицерола и чува на температури од -16 °C до -24 °C (недjељама) или на температури од -68 °C до -86 °C (мјесецима). 4. IF тест Начело: Употреба IF теста као главног теста провјере препору чује се због његове доказане уједначености у постизању захтијева них прагова осјетљивости методе. Када се IF тест користи као главни тест провјере и ако је IF очитавање позитивно, додатно се као други тест користи PCR или FISH тест. Када се IF тест користи као други тест провјере и IF очитавање је позитивно, даља тестирања с циљем комплетирања анализа се изводе према дијаграму тока. Напомена Када се IF тест користи као главни тест провјере, увијек ко ристити поликлонална антитијела. У случају позитивног IF очи тавања с поликлоналним антитијелима, даља провјера употребом моноклоналних антитијела може повећати специфичност, али и умањити осјетљивост теста. Употријебити антитијела за референтни сој C. m. subsp. sepedonicus. Препоручује се одређивање титра за сваку нову серију антитијела. Титар се дефинише као највеће разрјеђење у коме до лази до оптималне реакције при тестирању суспензије која садржи 105 до 106 ћелија по ml одговарајућег соја C. m. subsp. sepedonicus уз коришћење флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC) конјугата у складу с препорукама произвођача. Неразријеђена поликлонална и монокло нална антитијела треба да имају IF титар најмање 1 : 2.000. Током тестирања користити радна разрjеђења антитијела, која су близу или једнака титру. Користити потврђена и одобрена антитијела. Тестирање треба извршити на свјеже припремљеним екстрак тима узорака, а по потреби, тестирање се може успjешно извршити и на екстрактима који су били чувани на температури од -68 °C до 86 °C са додатком глицерола. Глицерол уклонити додавањем 1 ml пелет пуфера (пуфера за растварање талога), поновним центрифу гирањем на 7.000 g у трајању од 15 минута и ресуспендовањем та лога у једнакој запремини пелет пуфера. Овај дио процедуре често није потребан, нарочито ако су узорци фиксирани на микроскопска IF стакла пламеном. На одвојеним микроскопским стаклима припремити пози тивну контролу, и то хомологни или неки други референтни изо лат C. m. subsp. sepedonicus, растворен у екстракту кромпира и по избору у пуферу. На истој IF плочици треба, гдје год је то могуће, користити и позитивну контролу коју чини природно заражено ткиво (лиофи лизовано или замрзнуто на температури од -16 °C до -24 °C). Негативну контролу могу представљати и дијелови екстракта узорака који су у ранијем тестирању показали негативан резултат. 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 17 Користити микроскопске плочице са више бунарчића, по мо гућности са 10 отвора пречника најмање 6 mm. Примијенити идентичан поступак тестирања на узорке и на позитивне и негативне контроле. 4.1. Припремити IF плочице за тестирање једним од сљедећих поступака: a) за талоге са релативно малом количином наталоженог ск роба: у први бунарчић пипетом одмjерити стандардну запреми ну разрjеђења од 1/100 ресуспендованог талога кромпира (15 μl је довољно за бунарчиће пречника 6 mm - повећати запремину за веће бунарчиће). Потом, у остале бунарчиће у истом реду пипетом одмjерити сличну запремину неразриjеђене суспензије (1/1) тало га. Други ред може се користити као дупликат првог или за други узорак као што је приказано на Шеми 4; б) за остале суспензије талога: припремити децимална раз рjеђења (1/10 и 1/100) ресуспендованог талога у пуферу за талог. У један ред бунарчића пипетом одмjерити стандардну запремину ресуспендованог талога и сваког разрjеђења (15 μl је довољно за бунарчиће пречника 6 mm - повећати запремину за веће). Други ред може се користити као дупликат првог или за други узорак као што је приказано на Шеми 5. 4.2. Оставити да се капљице осуше на собној температури или их загријати до температуре од 40 °C до 45 °C. Ћелије бактерија фиксирати на IF плочицу загријавањем (15 минута на 60 °C), пров лачењем кроз пламен, 95% етанолом или према посебним упут ствима произвођача антитијела. Уколико је то неопходно, фиксиране плочице могу се чувати замрзнуте у десикатору у краћем временском интервалу (највише до три мјесеца). Припрема плочица у складу са т. 4.1. а) и 4.3. а) Разрјеђење ресуспендованог талога 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 □ разрјеђење ресуспендованог талога (Т - титар) Т2 Т4 Т2 Т 2Т □ двоструко разрјеђење серума/антитијела Узорак 1 Дупликат узорка 1 или узорак 2 ● 1 ● 2 ● 3 ● 4 ● 5 ● 6 ● 7 ● 8 ● 9 ● 10 Шема 4. 4.3. IF поступак: а) у складу са поступком за припрему плочица за тестирање, како је описано у 4.1. а), припремити двоструки низ разрјеђења антитијела у IF пуферу. Први бунарчић мора имати 1/2 титра (Т/2), а остали 1/4 титра (Т/4), 1/2 титра (Т/2), титар (Т) и двоструки ти тар (2Т); б) у складу с поступком за припрему плочица за тестирање, како је описано у 4.1. б), припремити радно разрјеђење антитијела у IF пуферу. Радно разрјеђење утиче на специфичност. Припрема плочица у складу са т. 4.1. б) и 4.3. б) Радна разрјеђења серума/антитијела 1/1 1/10 1/100 празно празно □ децимална разрјеђења ресуспендованог талога Узорак 1 Дупликат узорка 1 или узорак 2 ● 1 ● 2 ● 3 ● 4 ● 5 ● 6 ● 7 ● 8 ● 9 ● 10 Шема 5. 4.3.1. Поређати плочице на навлажени папир. Сваки бунарчић потпуно испунити разрјеђењем антитијела. Запремина антитијела мора бити једнака запремини нанесеног екстракта. Уколико не постоје посебна упутства произвођача антитијела, потребно је слиједити сљедећу процедуру. 4.3.2. Инкубирати прекривене плочице на влажном папиру 30 минута на собној температури (од 18 °C до 25 °C). Капљице са сваке плочице отрести и плочице пажљиво испра ти IF пуфером. Потопити плочице у IF пуфер Тwееn (Поглавље V овог прилога) па у IF пуфер, у трајању од по пет минута. Сприје чити стварање аеросола или пренос капљица, јер би могло доћи до унакрсне контаминације узорака. Плочице пажљиво осушити упијајућим папиром. 4.3.3. Поређати плочице на навлажени упијајући папир. Бу нарчиће попунити разријеђеним FITC конјугатом који се користи за одређивање титра. Запремина конјугата нанесеног на бунарчић мора бити једнака запремини нанесеног антитијела. 4.3.4. Инкубирати покривене плочице на влажном папиру, 30 минута на собној температури (од 18 °C до 25 °C). 4.3.5. Отрести капљице конјугата са плочица. Испрати и опра ти плочице како је претходно описано (4.3.3). Плочице пажљиво осушити. 4.3.6. На сваки бунарчић пипетом нанијети од 5 μл до 10 μл 0,1 М глицерола са фосфатним пуфером (Поглавље V овог прилога) или комерцијално доступно средство против избљеђивања и ста вити покровно стакло. 4.4. Очитавање IF теста 4.4.1. Прегледати припремљене плочице под епифлуоресцент ним микроскопом са одговарајућим филтерима за ексцитацију FITC, под уљном или воденом имерзијом и увећањем од 500 до 1.000 пута. Прегледати сваки бунарчић уздуж и попријеко, под правим уг лом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. Прво треба прегледати плочицу с позитивном контролом. Ћелије морају бити изразито флуоресцентне и потпуно обојене на утврђеном титру антитијела или радног разрjеђења. У случају да код обојености дође до одступања, IF тест се мора поновити. 4.4.2. Утврдити да ли јасно флуоресцентне ћелије које се уоча вају у бунарчићима имају морфологију карактеристичну за C. m. subsp. sepedonicus. Интензитет флуоресценције мора бити једнак или бољи од оног који даје позитивни контролни изолат при једнаком разрјеђе њу антитијела. Занемарити непотпуно обојене или слабо флуоре сцентне ћелије. Уколико се посумња на контаминацију, тест се мора поно вити - нпр. ако због контаминације пуфера све плочице у серији показују позитивне ћелије или ако су позитивне ћелије пронађене (изван бунарчића) на површини плочице. 4.4.3. Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу теста имунофлуоресценције. У концентрованом екстракту из двојених конуса пупчаних дијелова кртоле или дијелова стабљике увијек се очекује и присуство популација флуоресцентних ћелија са нетипичном морфологијом или унакрсна реакција са сапро фитним бактеријама сличне величине и грађе као C. m. subsp. sepedonicus. 4.4.4. Приликом очитавања у обзир се узимају само флуоре сцентне ћелије типичне величине и морфологије у титру или рад ном разрјеђењу антитијела како је описано у тачки 4. подтачка 4.3. овог поглавља. 4.4.5. Тумачење очитавања IF теста: а) уколико се утврди присуство јасно флуоресцентних ћелија карактеристичне морфологије, одредити просјечан број типич них ћелија по микроскопском видном пољу и израчунати број ти пичних ћелија по ml ресуспендованог талога (Поглавље VI овог прилога); Очитавање IF теста је позитивно за узорке који имају најмање 5 · 10³ типичних ћелија по ml ресуспендованог талога. Овакав узорак сматра се потенцијално контаминираним и потреб но је извршити даље тестирање; б) очитавање IF теста је негативно за узорке који имају мање од 5 · 10³ ћелија по ml ресуспендованог талога и узорак се сматра негативним. Није потребно даље тестирање. 5. FISH тест Начело: Уколико се у FISH тесту као првом тесту провјере добије позитиван резултат, IF тест се користи као други обавезни тест провјере. Ако се FISH тест користи као други тест провјере и ако се њиме добије позитиван резултат, за постављање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање према дијаграму тока. Напомена Користити потврђене и одобрене олиго-пробе специфичне за бактерију C. m. subsp. sepedonicus (Поглавље IX овог прилога). Прелиминарна тестирања примјеном ове методе треба да омо гуће поновљиву детекцију најмање 103 до 104 ћелија C. m. subsp. sepedonicus по ml додатих екстракту узорка претходно доказаног као негативног. Поступак треба извршити на свјеже припремљеним екстрак тима узорака, али се успјешно може примијенити и на екстракт узорка који је био чуван са глицеролом на температури од -16 °C до -24 °C или од -68 °C до -86 °C. За негативну контролу употријебити дијелове екстракта узора ка који су у ранијем тестирању на C. m. subsp. sepedonicus доказани као негативни. 18 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. За позитивну контролу припремити суспензије које садрже 105 до 106 ћелија/ml 0,01М фосфатног пуфера (PB) C. m. subsp. sepedonicus (нпр. сој NCPPB 4053 или PD 406) из културе старе три до пет дана (за припрему видjети Поглавље IV овог прилога). При премити одвојене плочице за позитивну контролу са хомологим или неким другим референтним изолатом C. m. subsp. sepedonicus, раствореним у екстракту кромпира као што је наведено у Погла вљу IV овог прилога. Коришћење еубактеријске олиго-пробе обиљежене FITC омо гућава контролу процеса хибридизације, јер ће се обојити све еубактерије присутне у узорку. Контролни материјал тестирати примјеном исте процедуре као и узорке. 5.1. Фиксирање екстракта кромпира Сљедећи протокол се заснива на процедури Wullings и сар., (1998): 5.1.1. Припремити раствор за фиксирање (Поглавље IX овог прилога). 5.1.3. Пипетом одмјерити 100 μl екстракта сваког узорка у Eppendorf епрувету, па центрифугирати осам минута на 7.000 g. 5.1.4. Уклонити супернатант и растворити талог у 500 μl фиксатива припремљеног највише 24 часа раније, промијешати и инкубирати преко ноћи на 4 °C. Алтернативни фиксатив је 96% етанол. При томе је потребно растворити талог у 50 μl 0,01 М PB и 50 μl 96% етанола, промијешати и инкубирати на 4 °C 30 до 60 минута. 5.1.5. Центрифугирати осам минута на 7.000 g, уклонити су пернатант и ресуспендовати талог у 75 μл 0,01 М PB (Поглавље V овог прилога). 5.1.6. У бунарчиће чистих плочица нанијети 16 μl фиксира них суспензија како је приказано на Шеми 6. На сваку плочицу нанијети два различита, неразриjеђена узорка и употријебити 10 μl за припремање разрјеђења 1 : 100 (у 0,01 М PB). Преостали фик сирани раствор узорка (49 μl) чувати на -20 °C послије додавања једнаке запремине 96% етанола. Ако FISH тест треба поновити, центрифугирањем уклонити етанол и додати једнаку запремину 0,01 PB (уз мијешање). Приказ плочице за FISH тест Шема 6. 5.1.6. Плочице осушити на ваздуху (или у сушници на 37 °C) па их фиксирати провлачењем кроз пламен. На овом кораку се може прекинути поступак и наставити сљедећи дан. Плочице тре ба чувати на собној температури у сувом простору без прашине. 5.2. Претхибридизација и хибридизација 5.2.1. Припремити раствор лизозима који садржи 10 mg ли зозима (Sigma L-6876) у 10 ml пуфера (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Тај се раствор може чувати, али се само једном смиjе замрзнути и одмрзнути. Сваки узорак добро прекрити са приближно 50 μl раствора лизозима и инкубирати десет минута на собној температури. Затим само једном потопити плочицу у деми нерализовану воду и пажљиво осушити филтер-папиром. Алтернативно, умјесто лизозима додати 50 μl 40 до 400 μg ml-1 протеиназе К у пуферу (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl, pH 7,4) на сваки бунарчић и инкубирати на 37 °C 30 минута. 5.2.2. Дехидратацију ћелија извршити узастопним потапањем плочица у 50%, 80% и 90% етанол, у трајању од по једног минута. Плочице поставити на држач и осушити на ваздуху. 5.2.3. Припремити влажну комору за инкубацију тако што се дно херметички затворене кутије прекрива упијајућим или филтер папиром потопљеним у 1 · hybmix (Поглавље IX овог прилога). Кутију претходно инкубирати у апарату за хибридизацију нук леинских киселина на 55 °C најмање десет минута. 5.2.4. Припремити раствор за хибридизацију, и то 45 μl по плочици (Поглавље IX овог прилога) и претходно инкубирати пет минута на 55 °C. 5.2.5. Ставити плочице на термоблок на 45 °C и нанијети по 10 μl хибридизованог раствора на сваки од четири бунарчића. 5.2.6. Ставити два покровна стакалца (24 mm · 24 mm) на сваку плочицу, пазећи притом да у бунарчићима не остане ваздух. Стави ти плочицу у претходно загријану влажну комору и хибридизовати у апарату за хибридизацију на 55 °C, у мраку (преко ноћи). 5.2.7. Припремити три посуде са 1 l ултрачисте воде, 1 l 1 · hybmix (334 ml 3 · hybmix и 666 ml ултрачисте воде) и 1 l 1/2 · hybmix (167 ml 3 · hybmix и 833 ml ултрачисте воде). Сваку посуду претходно инкубирати у воденом купатилу на 55 °C. 5.2.8. Скинути покровна стакалца, а предметне плочице ста вити на држач. 5.2.9. Вишак пробе уклонити инкубирањем у трајању од 15 минута на 55 °C у посуди са 1 · hybmix. 5.2.10. Пренијети држач плочица у раствор за прање (1/2 · hybmix) и инкубирати још 15 минута. 5.2.11. Плочице накратко уронити у ултрачисту воду и ставити на филтер-папир. Вишак влаге уклонити филтер-папиром. У сваки бунарчић пипетом нанијети од 5 μl до 10 μl заштитног раствора против избљеђивања (нпр. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA или еквивалентна), па цијелу предметну плочицу покрити великим покровним стаклом (24 mm · 60 mm). 5.3. Очитавање FISH теста 5.3.1. Плочице прегледати под епифлуоресцентним микро скопом, коришћењем уљане имерзије, с увећањем 630 или 1.000 пута. Са филтером прикладним за флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC) еубактеријске ћелије (укључујући већину Грам-негатив них ћелија) у узорку се виде као флуоресцентно зелене. Употре бом филтера за тетраметилродамин-5-изотиоцијанат ћелије C. m. subsp. sepedonicus, обојене са Cu3, виде се као флуоресцентно црвене. Упоредити морфологију ћелија узорка с морфологијом ће лија позитивних контрола. Ћелије морају бити јасно флуоресцент не и у потпуности обојене. Ако дође до одступања у обојености, FISH тест се мора поновити. Прегледати сваки бунарчић уздуж и попријеко под нормалним углом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. 5.3.2. Уочити да ли су видљиве јасно флуоресцентне ћелије у бунарчићима морфологије карактеристичне за C. m. subsp. sepedonicus (види веб-страницу). Интензитет флуоресценције мора бити једнак или јачи него код позитивне контроле. Ћелије које нису у потпуности обојене или су слабе флуоресценције не узимају се у обзир. 5.3.3. Уколико постоји сумња да је дошло до контаминације, тест се мора поновити (нпр. све плочице у серији због контами нације пуфера показују позитивне ћелије или су позитивне ћелије пронађене изван бунарчића, на површини плочице). 5.3.4. Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу FISH теста. У концентрованом екстракту издвојених конуса пуп чаних дијелова кртоле или стабљике увијек се очекује и присуство популација флуоресцентних ћелија са нетипичном морфологијом или унакрсна реакција са сапрофитним бактеријама сличне вели чине и грађе као C. m. subsp. sepedonicus, мада знатно рјеђе него код IF теста. 5.3.5. У обзир се узимају само флуоресцентне ћелије типичне величине и морфологије. 5.3.6. Тумачење резултата FISH теста: а) резултати FISH теста сматрају се важећим ако се у свим по зитивним и ни у једној негативној контроли примјеном FISH фил тра уочава присуство јасно зелених флуоресцентних ћелија чија је величина и морфологија типична за C. m. subsp. sepedonicus и ако се примјеном филтера за родамин уочавају јасне црвене флуоре сцентне ћелије. Ако се уоче јасне ћелије карактеристичне морфо логије, одредити просјечан број типичних флуоресцентних ћелија по микроскопском видном пољу и израчунати број типичних ће лија по ml ресуспендованог талога (Поглавље VI овог прилога). Потенцијално позитивним сматрају се узорци са најмање 5 · 103 типичних ћелија по ml ресуспендованог талога и потребна су им даља тестирања. Негативним се сматрају узорци с мање од 5 · 103 типичних ћелија по ml ресуспендованог талога; б) FISH тест је негативан ако се примјеном филтера за родамин не уоче снажно флуоресцентне црвене ћелије чија је величина и морфологија типична за C. m. subsp. sepedonicus, под условом да се примјеном филтера за родамин уоче типичне изразито флуоре сцентне црвене ћелије у препаратима позитивне контроле. 6. PCR тест Начело: Када се употребом PCR теста као првог теста провјере добије позитиван резултат, IF тест се користи као други обавезни тест провјере. Ако се коришћењем PCR теста као другог теста про 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 19 вјере добије позитиван резултат, за постављање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање према дијаграму тока. Коришћење ове методе као главног теста провјере препоручује се само уколико је доступна специјализована експертиза. Напомена Прелиминарна тестирања примјеном ове методе треба да омо гуће поновљиву детекцију најмање 103 до 104 ћелија C. m. subsp. sepedonicus по ml које су додате екстракту узорка претходно дока заног као негативног. За постизање највећег степена осјетљивости и специфичности у свим лабораторијима, потребно је извођење огледа за стандар дизацију (оптимизацију) методе. Користити потврђене и одобрене реагенсе и протоколе за PCR. Пожељно је одабрати метод који по длијеже интерној контроли. Предузети одговарајуће мјере опреза да би се избјегла контаминација узорка циљном ДНК. PCR тест треба да обављају искусни стручњаци, у специјализованим лабо раторијима за молекуларну биологију. Негативне контроле (за екстракцију ДНК и PCR поступак) тре ба да се увијек у поступку обраде посљедње како би се утврдило да ли је евентуално дошло до било каквог преношења ДНК. У PCR тест укључити сљедеће негативне контроле: 1. екстракт узорка у коме претходно током тестирања није до казано присуство C. m. subsp. sepedonicus; 2. пуфер коришћен за екстракцију бактерије и ДНК из узорка; 3. PCR реакциони микс. У PCR тест укључити сљедеће позитивне контроле: аликвоте ресуспендованих талога у које је додата C. m. subsp. sepedonicus (Поглавље IV овог прилога), суспензију од 106 ћелија по ml вирулентног изолата C. m. subsp. sepedonicus у води (нпр. NCPPB 2140 или NCPPB 4053); 4. ако је могуће, у PCR тесту користити и ДНК екстрахован из позитивних контролних узорака. Да би се избjегла могућа контаминација, позитивне контроле припремити просторно одвојено од узорака за тестирање. С обзиром на то да примјена PCR протокола захтијева ко ришћење екстракта узорака са што мање земље, прије почетка про цедуре извођења теста узорке кромпира је пожељно добро опрати. 6.1. Методе пречишћавања ДНК Позитивну и негативну контролу користити на претходно опи сан начин. Контролни материјал припремити на исти начин као и узорке. Доступне су различите методе пречишћавања циљане ДНК из комплексних супстрата узорка с циљем уклањања инхибитора PCR реакције и других ензимских реакција и методе концентрова ња циљане ДНК у екстракту узорка. Метода која слиједи је стандардизована за коришћење са по тврђеном и одобреном PCR методом у (Поглавље VIII овог при лога). а) Метода према Pastriku (2000) 1. Пипетом одмjерити 220 μl лизис пуфера [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] у Eppendorf тубу од 1,5 ml; 2. Додати 100 μl екстракта узорка и ставити у термоблок или водено купатило на 95 °C 10 минута; 3. Ставити тубу на лед у трајању од пет минута; 4. Додати 80 μl основног шток раствора Lysozyme (50 mg ли зозима по ml у 10 mM Tris HCl, pH 8,0) и инкубирати на 37 °C 30 минута; 5. Додати 220 μl раствора Easy DNA® A (Invitrogen), добро из мијешати на вортексу и инкубирати на 65 °C 30 минута; 6. Додати 100 μl раствора Easy DNA® A (Invitrogen) и снаж но измијешати на вортексу до постизања униформног вискозитета узорка; 7. Додати 500 μл хлороформа, измијешати на вортексу док се вискозитет не умањи и смјеса постане хомогена; 8. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 °C да се подије ле фазе и створи међуфаза; 9. Пренијети горњу фазу у нову Eppendorf тубу; 10. Додати 1 ml 100% етанола (-20 °C), кратко промијешати на вортексу и инкубирати на леду 10 минута; 11. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 °C и уклонити етанол од талога; 12. Додати 500 μl 80% етанола (-20 °C) и промијешати окре тањем тубе; 13. Центрифугирати на 15.000 g 10 минута на 4 °C, сачувати талог а уклонити етанол; 14. Оставити талог да се суши на ваздуху или у вакуумској центрифуги (DNK speed vac); 15. Ресуспендовати талог у 100 μl стерилне ултрачисте воде и оставити на собној температури најмање 20 минута; 16. Чувати на -20 °C до извођења PCR; 17. Било који бијели талог издвојити центрифугирањем и за PCR употријебити 5 μl супернатанта који садржи ДНК; б) Друге методе За екстракцију ДНК могу се примијенити и друге методе (нпр. Qiagen DNeasy Plant Kit) уколико је доказана еквивалентност у прочишћавању ДНК из контролних узорака који садрже 103 до 104 патогених ћелија по ml. 6.2. PCR 6.2.1. Припремити узорке за тестирање и контролне узорке за PCR према одобреним протоколима (Поглавље VIII овог прилога). Припремити разрјеђење екстракта ДНК из узорка 1 : 10 у ултра чистој води. 6.2.2. У неконтаминираном простору припремити одговарају ћи реакциони микс за PCR према објављеним протоколима (По главље VIII овог прилога). Одобрени PCR протокол је мултиплекс реакција која такође укључује унутрашњу PCR контролу. 6.2.3. Додати 5 μl екстракта ДНК у стерилне епрувете за PCR за PCR реакцију која се изводи у 25 μl. 6.2.4. Укључити и негативну контролу која садржи само PCR реакциони микс, а умјесто узорка додати исти извор ултрачисте воде који је коришћен за припрему PCR реакционог микса. 6.2.5. Ставити епрувете у уређај за PCR (thermal cycler) и покре нути стандардизовани PCR програм (Поглавље VIII овог прилога). 6.3. Анализа PCR продуката 6.3.1. Умножене PCR продукте раздвојити електрофорезом у агарозном гелу. У сваки бунарчић 2% (v/v) агарозног гела у трис ацетат EDTA пуферу (ТАЕ) нанијети најмање 12 μl ампликона ДНК из сваког узорка, помијешане с 3 μl боје и пропустити уз на пон од 5 до 8 B V/cm. Употријебити одговарајући ДНК маркер, нпр. 100 bpladder (Поглавље VIII овог прилога). 6.3.2. Обојити електрофоретске траке ДНК у гелу потапањем гела у етидиjум бромид (0,5 mg/l) у трајању од 30 до 45 минута. Предузети одговарајуће мјере опреза при раду са овим мутагеном. 6.3.3. Обојени гел прегледати на краткоталасном UV трансилу минатору (нпр. λ = 302 nm) и потражити умножене фрагменте оче киване дужине (Поглавље VIII овог прилога) и документовати их. 6.3.4. Приликом сваког новог налаза/случаја провјерити аутен тичност умноженог PCR продукта извођењем анализе уз помоћ ре стрикционих ензима на узорку преостале умножене ДНК, и то ин кубацијом при оптималној температури и у оптималном времену с одговарајућим ензимом и пуфером (Поглавље VIII овог прилога). Настале фрагменте раздвојити електрофорезом у агарозном гелу како је претходно наведено и послије бојења етидиjум бромидом на UV трансилуминатору посматрати карактеристичну матрицу (образац) рестрикционих фрагмената и упоредити је са позитив ном контролом прије и послије раздвајања. Тумачење резултата PCR теста PCR тест је негативан ако у тестираном узорку није видљив PCR продукт очекиване дужине, који је специфичан за C. m. subsp. sepedonicus, али је видљив у свим позитивним контролним узор цима (код мултиплекс PCR са прајмерима за унутрашњу контролу који су специфични за биљку домаћина: у тестираном узорку се мора умножити други продукт PCR очекиване величине). PCR тест је позитиван ако је видљив PCR продукт који је спе цифичан за C. m. subsp. sepedonicus и који је очекиване дужине и рестрикционог обрасца, под условом да није умножен ни у једном узорку који представља негативну контролу. Поуздана потврда позитивног резултата представља и успjешно понављање теста с другим паром PCR прајмера (тачка 9. подтачка 9.3. овог поглавља). Напомена Уколико се очекивани фрагмент (позитивна реакција) добије у узорку позитивне контроле која садржи C. m. subsp. sepedonicus у води, а негативни резултат добије у узорку позитивне контроле која садржи C. m. subsp. sepedonicus у екстракту кромпира, претпо ставља се да је дошло до инхибиције PCR реакције. У мултиплекс PCR протоколима који се изводе употребом унутрашњих PCR контрола сматра се да је дошло до инхибиције реакције ако није добијен ни један од два продукта. Такође, ако се из једне или више негативних контрола добије очекивани продукт, може се сумњати да је дошло до контамина ције. 20 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. 7. Биолошки тест Напомена Прелиминарно тестирање овом методом треба да омо гући поновљиво откривање присуства 103 до 104 cfu C. m. subsp. sepedonicus по ml, додатих екстрактима узорака који су у ранијем тестирању били негативни (за припрему видјети Поглавље IV овог прилога). Највећа осjетљивост детекције може се очекивати ако се кори сте свјеже припремљени екстракти узорака и оптимални услови за раст и развој патогена. Међутим, ова метода може успјешно да се примјени и употребом екстраката који су чувани са глицеролом на температури од -68 °C до -86 °C. Неке сорте плавог патлиџана представљају одличну селек тивну подлогу за обогаћење и раст C. m. subsp. sepedonicus, чак и у одсуству симптома, а уједно су и одличне за утврђивање биљака домаћина. Услови раста треба да су оптимални да би се умањио ризик од добијања лажно негативних резултата. Детаљи у вези са гајењем биљака (Поглавље X овог прилога). 7.1. На преосталу количину ресуспендованог талога оставље ног за тестирање из 3.1.6. или 3.2.5. примијенити методу инокула ције зарезивањем или методу инокулације инјекцијом. Користити само биљке плавог патлиџана у стадијуму два до три права листа, до потпуне развијености трећег правог листа. По једном узорку потребно је 15 до 25 биљака патлиџана да би се у потпуности иско ристио ресуспендовани талог и осигурала ефикасна инокулација. 7.2. С циљем смањења тургора, биљке патлиџана не залијевати један до два дана прије инокулације. 7.3. Инокулација зарезивањем: 7.3.1. Држећи биљку међу прстима, пипетом нанијети капљи цу (око 5-10 μл) ресуспендованог талога на стабљику, и то између котиледона и првог листа; 7.3.2. Стерилним скалпелом направити дијагонални рез, дуг око 1 cm и дубок око 2/3 дебљине стабљике, почевши од нанесене капљице ресуспендованог талога; 7.3.3. Чврсто затворити рез стерилним вазелином из шприца. 7.4. Инокулација инјекцијом. Стабљике плавог патлиџана инокулисати непосредно изнад котиледона инјекцијом с танком иглом (не мањом од 23 G). Узорак подијелити на биљке плавог патлиџана тако да свака биљка добије одговарајућу количину. 7.5. Позитивна контрола: пет биљака инокулисати суспен зијом од 105 до 106 ћелија по ml воде познате културе C. m. subsp. sepedonicus и, када је могуће, екстрактом природно зараженог тки ва кртола (тачка 4. овог поглавља) истом методом инокулације. 7.6. Негативна контрола: пет биљака инокулисати истом ме тодом инокулације користећи стерилни пелет пуфер (пуфер за растварање талога). Биљке гајити у карантинским просторијама до четири седмице на 18 °C до 24 °C, уз довољну количину свjетла и високу влажност (од 70% до 80%) и адекватно залијевати како би се спријечило накупљање воде или увенуће због недостатка воде. C. m. subsp. sepedonicus се не развија на температурама изнад 30 °C, а оптимал на температура је 21 °C. 7.7. С циљем спречавања унакрсне контаминације, биљке по зитивне и негативне контроле гајити на јасно одвојеним столовима у стакленику или полицама у комори за раст или, у случају да је простор ограничен, побринути се да су биљке јасно одвојене изме ђу појединих поступака у току извођења процедуре. Ако се биљке за различите узорке морају гајити близу једна другој, раздвојите их погодним платном. Пазити да не дође до унакрсне контаминације приликом прихрањивања, залијевања, прегледања и сваког другог поступка с биљкама. Од кључне важности је да у стакленицима и коморама за гајење не буде никаквих инсеката јер они могу пре нијети бактерију с узорка на узорак. 7.8. Појаву симптома редовно провјеравати послије седам дана од инокулације. Пребројати биљке које показују симптоме. C. m. subsp. sepedonicus изазива увенуће листова патлиџана које може почети као увенулост ивица или између нерава листова. Увенуло ткиво у почетку изгледа тамнозелено или прошарано, али касније постаје блиједо па некротично. Увела површина између лисних не рава често изгледа масно, као да је натопљена водом. Некротично ткиво често има свијетложуту ивицу. Биљке не угину увијек; што је период прије него што се симптоми почну развијати дужи, већа је могућност преживљавања. Биљке могу прерасти заразу. Mладе биљке патлиџана много су осјетљивије на присуство ниског нивоа популација C. m. subsp. sepedonicus него старије биљке; због тога се користе биљке у фази три права листа или непосредно прије фазе три права листа. Увенуће може бити изазвано и популацијом других бакте рија или гљивица које су присутне у екстракту ткива кртола. То су: Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora i Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, као и популације великог броја сапрофитних бактерија. Нарочито Erwinia chrysanthemi може изазвати симптоме на листовима и увенуће које је врло слично симптомима C. m. subsp. sepedonicus. Једину разлику представља појава тамњења/црњења стабљика у случају инфекција бактеријом Erwinia chrysanthemi. Друге врсте увенућа се разликују од оних које проузрокује C. m. subsp. sepedonicus, зато што цијели листови или цијеле биљке врло брзо вену. C. m. subsp. sepedonicus се од Erwinia spp. може брзо и лако раздвојити и извођењем бојења и/или реакције по Граму. 7.9. Одмах по уочавању присуства симптома на биљкама патлиџана потребно је извршити реизолацију, користећи дијелове увенулог ткива лишћа или ткива стабљике. Листове и стабљике биљака патлиџана површински дезинфиковати брисањем са 70% етанолом. Ткиво измацерирати и примијенити IF или PCR тест на соку патлиџана и изолацију патогена на погодну (селективну) хранљиву подлогу (тачка 8. овог поглавља). Такође, може се при мијенити и бојење/реакција по Граму (Поглавље XI овог прилога). Извршити идентификацију чисте културе C. m. subsp. sepedonicus и провјеру патогености (т. 9. и 10. овог поглавља). 7.10. У одређеним околностима, нарочито у условима непо вољним за раст и развој биљака, могуће је да се чак и послије пе риода инкубације од четири недјеље C. m. subsp. sepedonicus нала зи латентно у биљкама патлиџана. Ако ни послије четири недјеље од инокулације не дође до појаве симптома, на биљкама треба извести IF/PCR тест на збирном узорку састављеном од дијелова стабљике (1 cm од сваке биљке за тестирање, узетом изнад мјеста инокулације). Ако је тест позитиван, поновно извршити изолацију патогена на одговарајућу (селективну) хранљиву подлогу, према поступку из тачке 8. овог прилога. Извршити идентификацију чи сте културе C. m. subsp. sepedonicus и провјеру патогености (т. 9. и 10. овог поглавља). Тумачење резултата биолошког теста - валидни резултати био лошког теста добијају се ако биљке у позитивној контроли пока зују типичне симптоме, ако се из тих биљака може поново издво јити бактерија и ако на биљкама негативне контроле не дође до појаве симптома. Биолошки тест је негативан ако тестиране биљке нису зараже не C. m. subsp. sepedonicus, а под условом да је утврђено присуство C. m. subsp. sepedonicus у позитивним контролама. Биолошки тест је позитиван ако су тестиране биљке заражене C. m. subsp. sepedonicus. 8. Изолација C. m. subsp. sepedonicus Напомена Дијагноза се може потврдити само ако се C. m. subsp. sepedonicus изолује, а затим изврши и идентификација добијеног изолата (тачка 9. овог поглавља) и ако се потом потврди и пато геност добијеног изолата (тачка 10. овог поглавља). Иако је C. m. subsp. sepedonicus захтијеван организам, може се изоловати из ткива са карактеристичним симптомима. Приликом изолације лако може доћи до прерастања колоније овог патогена са колонијама бр зорастућих сапрофитних бактерија, па је зато изолација директно из екстракта ткива кртола или стабљике тешка. Директна изола ција C. m. subsp. sepedonicus могућа је коришћењем одговарајуће селективне хранљиве подлоге и разрјеђења ресуспендованог тало га добијеног из издвојеног конуса пупчаног дијела кртоле или из стабљика кромпира. Изолације је потребно извршити из свих кртола или дијелова стабљике кромпира са симптомима, као и из тестираних биљака патлиџана код којих нису примијећени симптоми или је IF/PCR тест из збирног узорка био позитиван (тачка 7. подтачка 7.10). По потреби, треба да се користи и мацерирање стабљика патлиџана према прописаној процедури. Позитивна контрола: припремити децимална разрјеђења су спензије 106 cfu по ml C. m. subsp. sepedonicus (нпр. NCPPB 4053 или PD 406). Позитивне контроле припремити потпуно одвојено од узорака који се тестирају да би се избјегла могућност контами нирања узорака. Прије употребе за рутинско тестирање узорака провјерити по годност сваке серије селективне хранљиве подлоге за раст и развој патогена. Контролни материјал подвргнути истим принципима те стирања, као и узорак или узорке. 8.1. Гајење на селективној хранљивој подлози 8.1.1. Из одвојене количине од 100 μl ресуспендованог талога добијеног из кртоле кромпира или биљног сока биљака патлиџа на припремити децимална разрjеђења у пелет пуферу (пуфер за растварање талога из тачке 3. овог поглавља). 8.1.2. Изолација из ресуспендованог талога без претходног разрjеђивања обично не успијева због тешког гајења C. m. subsp. sepedonicus и велике конкурентске способности сапрофита. С 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21 обзиром на то да је у зараженом ткиву биљке бактерија обично присутна у популацијама високог нивоа, сапрофити се могу од странити разрjеђивањем, док патоген остаје. Стога се препоручује наношење 100 μl из сваког узорка (код употребе Петријевих посуда пречника 90 mm, док за Петријеве посуде других величина треба прилагодити количину), 1/100 до 1/10.000 разријеђене суспензије на хранљиву подлогу MTNA или на NCP-88 (Поглавље VII овог прилога), техником размаза. Напомена Алтернативна могућност је размаз почетне количине од 100 μl ресуспендованог талога на прву подлогу, а затим прављење разма за истим штапићем на другој и трећој подлози, при чему се на њих наносе остаци екстракта с претходне подлоге. На овај начин добија се ефекат сличан ефекту коришћења разрjеђења. 8.1.3. Засијану подлогу инкубирати у мраку на температури од 21 °C до 23 °C. 8.1.4. Прва провјера подлога и процјена појаве и развоја ко лонија налик C. m. subsp. sepedonicus у поређењу са подлогама позитивне контроле врши се послије три дана, а наредне процјене послије пет, седам и евентуално десет дана. 8.2. Пречишћавање сумњивих колонија Напомена Колоније сличне C. m. subsp. sepedonicus треба даље преније ти на хранљиву подлогу YGM ако ће се користити за инокулацију патлиџана и/или даљу идентификацију. То треба учинити прије него на подлогама дође до прерастања колонија, односно најбоље послије три до пет дана. 8.2.1. Размазом нанијети колоније сличне C. m. subsp. sepedonicus на једну од сљедећих хранљивих подлога: хранљиви агар с додатком декстрозе (користи се само за пресијавање изола та), агар са додатком квасца, пептона и глукозе, агар са додатком екстракта квасца и минералних соли. Састав хранљивих подлога наведен је у Поглављу VII овог прилога. Засијану подлогу инкубирати на 21 °C до 24 °C у трајању до 10 дана. C. m. subsp. sepedonicus споро расте, обично ствара кремасте, куполасте колоније са шиљатим врхом. Пречишћавање изолата по стиже се поновним размазима и исцрпљивањем на одговарајућим хранљивим подлогама. Ниво пораста се повећава пресијавањем. Типичне колоније су кремастобијеле или боје слоноваче, понекад жуте, заокружене, глатке, повишене, конвексно-куполасте, слуза во-течне, с цијелим ивицама и обично од 1 до 3 mm у пречнику. Једноставно бојење по Граму (Поглавље XI овог прилога) може помоћи при избору колонија за даље тестирање. 8.2.2. Извршити идентификацију изабраних колонија (тачка 9. овог поглавља) и провјерити патогеност изолата (тачка 10. овог поглавља). 9. Идентификација Идентификација чисте културе добијених изолата C. m. subsp. sepedonicus врши се коришћењем најмање два теста од наведених тестова који се заснивају на различитим биолошким принципима. Према потреби, укључити познате референтне изолате за сваки тест. 9.1. Одгајивачки и ензимски тестови за идентификацију Фенотипска својства универзално присутна или одсутна код бактерије C. m. subsp. sepedonicus утврдити према методама Lelliott i Stead (1987), Klement и сар. (1990), Schaad и сар. (2001), непознати аутор (1987) и сл. Све хранљиве подлоге инкубирати на 21 °C и прегледати на кон шест дана. Ако не дође до раста колонија, инкубирати до 20 дана. У све тестове треба укључити познату контролу C. m. subsp. sepedonicus. Одгајивачке и физиолошке тестове изводити ко ришћењем културе са хранљивог агара. Морфолошка упоређења извршити у односу на културе на хранљивом агару са додатком декстрозе. Тестови Очекивани резултати Тест оксидације/ферментације (О/Ф) инертан или слабо оксида тиван Активност оксидазе Раст на 37 °C Активност уреазе Хидролиза ескулина + Хидролиза скроба - или слаба Толерантност на 7% раствора NaCl Стварање индола Активност каталазе + Стварање H2S Коришћење цитрата Растварање желатина Стварање киселине из глицерола Стварање киселине из лактозе - или слаба Стварање киселине из рамнозе Стварање киселине из салицина Бојење по Граму (Поглавље XI) + 9.2. IF тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у IF пуферу (Поглавље V овог прилога). Припремити двострука разрјеђења раствора погодног антисе рума. Примијенити IF поступак (тачка 4. овог поглавља). IF тест је позитиван ако је IF титар културе једнак титру пози тивне контроле. 9.3. PCR тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у ул трачистој води. Загријати 100 μl суспензије ћелија бактерије у затвореним епруветама у термоблоку или у врелом воденом купатилу четири минута на 100 °C. Разлагање ћелија, по потреби, може се убрзати додавањем свјеже припремљеног NaOH до коначне концентрације од 0,05 М. До употребе узорци се могу чувати на температури од 16 °C до -24 °C. Употријебити одговарајуће PCR процедуре за умножавање специфичних фрагмената C. m. subsp. sepedonicus (нпр. Pastrik, 2000; видјети Поглавље VIII овог прилога; Li и de Boer, 1995; Mills и сар., 1997; Pastrik i Raineu, 1999; Schaad и сар., 1999). Идентификација C. m. subsp. sepedonicus је позитивна ако су PCR продукти исте величине и имају исти полиморфизам дужине рестрикционих фрагмената, као и позитивни контролни изолат. 9.4. FISH тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml ултра чисте воде. Примијенити FISH поступак (тачка 5. овог поглавља). FISH тест је позитиван ако су постигнуте реакције културе и позитивне контроле једнаке. 9.5. Профилирање масних киселина (FAP) Културу гајити на триптиказа-соја-агару (Oxoid) 72 часа на 21 °C (+/- 1 °C). Примијенити одговарајући FAP поступак (Janse, 1991; Stead, 1992). FAP тест је позитиван ако је профил тестиране културе иден тичан профилу позитивне контроле. Присуство карактеристичних масних киселина: 15 : 1 Anteiso А, 15 : 0 Iso, 15 : 0 Anteiso, 16 : 0 Isо, 16 : 0 и 17 : 0 Anteiso у великој мјери указује да се ради о C. m. subsp. sepedonicus. Родови бактерија као Curtobacterium, Arthrobacter и Micrococcus, такође, имају неке од ових киселина, али 15 : 1 Anteiso А је киселина која се ријетко може пронаћи у овим бактеријама, али се појављује у свим бактеријама рода Clavibacter, и то између 1% до 5%. Код C. m. subsp. sepedonicus вриједност је обично око 5%. 9.6. BOX-PCR Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml ултра чисте воде. Примијенити тест у складу с процедуром (Smith и сар., 2001). 10. Тест потврде Тест провјере патогености користи се за коначно потврђивање присуства C. m. subsp. sepedonicus и за процјену вирулентности култура идентификованих као C. m. subsp. sepedonicus. 10.1. Припремити инокулум од приближно 106 ћелија по ml из култура изолата који се тестира, старости три дана и одговарајућег изолата позитивне контроле C. m. subsp. sepedonicus. 10.2. Инокулисати стабљике пет до десет младих сијанаца пла вог патлиџана у фази три прва листа (тачка 7. подт. 7.3. или 7.4. овог поглавља). 10.3. Инокулисано сијанце инкубирати на температури од 18 °C до 24 °C, уз довољну количину свјетла и високу релативну влажност и адекватно залијевати како би се избјегло накупљање воде или стрес од суше (тачка 7. подтачка 7.7. овог поглавља). Код инокулације чистим културама типично увенуће појављује се у 22 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. року од двије недјеље, док се биљке које не испољавају симптоме (видјети тачка 7. подтачка 7.8. овог поглавља) послије тог време на инкубирају још недјељу дана на температурама повољним за раст плавог патлиџана, али не вишим од 25 °C (Поглавље X овог прилога). Ако симптоми нису присутни ни послије три недјеље, добијена култура се не може потврдити као патогени изолат C. m. subsp. sepedonicus. 10.4. Изолацију из биљака са симптомима извршити одстрањи вањем дијела стабљике дужине 2 cm изнад мјеста инокулације, који се потом уситни и раствори у малој количини стерилне дестилова не воде или 50 mM фосфатном пуферу (Поглавље V овог прилога). Изолација патогена потом се врши размазом добијеног мацерата на MTNA и YPGA подлоге (Поглавље VII овог прилога), инкубирањем три до пет дана на 21 °C до 23 °C и утврђивањем да ли су формиране типичне колоније бактерије C. m. subsp. sepedonicus. Поглавље III ЛАБОРАТОРИЈЕ УКЉУЧЕНЕ У ОПТИМИЗАЦИЈУ И ВАЛИДАЦИЈУ ПРОТОКОЛА Лабораторија (1> Мјесто Држава Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Беч и Линц Аустрија Departement Gewasbescherming Merelbeke Белгија Plantedirektoratet Lingby Данска Central Science Laboratory York Енглеска Scottish Agricultural Science Agency Единбург Шкотска Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Аngers Француска Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terr Le Rheu Француска Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Њемачка Pfl anzenschutzamt Hannove Хановер Њемачка State Laborator Даблин Ирска Plantenziektenkundige Dienst Wаgeningen Холандија Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Ас Норвешка Direcção-Geral de Protecção das Culturas Лисабон Португалија Nacionalni institut za biologijo Љубљана Словенија Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Шпанија Поглавље IV ПРИПРЕМА ПОЗИТИВНИХ И НЕГАТИВНИХ КОНТРОЛА ЗА ОСНОВНЕ ТЕСТОВЕ ПРОВЈЕРЕ PCR/IF и FISH тестови Направити суспензију културе вирулентног изолата C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 или PD 406) гајеног 72 часа на MTNA основној хранљивој подлози у 10 mM фосфатном пуферу концентрације приближно 1-2 · 108 cfu/ml. То је обично слабо мут на суспензија оптичке густине 0,20 на 600 nm. Извадити конус пупчаног дијела из 200 кртола бијеле сорте кромпира за које је познато да нису заражене бактеријом C. m. subsp. sepedonicus. Обрадити конусе уобичајеном методом и ресуспендовати та лог у 10 ml. Припремити десет стерилних микроепрувета од 1,5 ml са 900 μl ресуспендованог талога. У прву микроепрувету додати 100 μl суспензије C. m. subsp. sepedonicus и измијешати на вортексу. У сљедећих пет микроепрувета припремити децимална раз рjеђења бактеријске суспензије. Ових шест микроепрувета са зараженим екстрактом користи ти за позитивну, а четири микроепрувете са незараженим екстрак том користити за негативну контролу. У складу с тим, означити микроепрувете. У микроепруветама од 1,5 ml припремити аликвоте од 100 μl тако да се добије девет копија сваког контролног узорка. До упо требе чувати на температури од -16 °C до -24 °C. Присуство и количину присутне C. m. subsp. sepedonicus у кон тролним узорцима прво потврдити IF тестом. За PCR тест извршити екстракцију ДНК у позитивним и не гативним контролним узорцима за сваку серију узорака за тести рање. За IF и FISH тестове извршити тестирање позитивних и нега тивних контролних узорака за сваку серију узорака за тестирање. Код IF, FISH и PCR тестова потребно је утврдити присуство C. m. subsp. sepedonicus у концентрацији од најмање 103 и 104 ћелија/ml код позитивних контрола и ни у једној негативној контроли. Поглавље V ПУФЕРИ ЗА ТЕСТ ПРОЦЕДУРЕ Стерилисани пуфери који нису отварани могу се чувати до једне године. 1. Пуфери за екстракцију 1.1. Екстракциони пуфер (50 mM фосфатни пуфер, pH 7,0) Овај пуфер се користи за екстракцију бактерије из биљног тки ва хомогенизацијом или трешењем. Na2HPO4 (анхидровани) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, провјерити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Сљедећи састојци могу бити корисни: Намjена Количина (по l) Пахуљице Lubrol Дефлокулант* 0,5 g DC силикон против стварања пјене Средство про тив стварања пjене* 1 ml Тетранатријум-пирофосфат Антиоксидант 1 g Polivinilpirolidon-40.000 (PVP-40) Везивање PCR инхибитора 50 g * За употребу код методе екстрак ције хомогенизацијом. 1.2. Пелет пуфер (пуфер за растварање талога - 10 mM фосфат ни пуфер, pH 7,2) Овај пуфер користи се за ресуспендовање и разрjеђивање екс тракта конуса извађених из пупчаних дијелова кртола кромпира, послије концентровања талога центрифугирањем. Na2HPO · 12H2O 2,7 g NaH2PO4 · 2H2O 0,4 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, провјерити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 2. Пуфери за IF тест 2.1. IF пуфер (10 mM фосфатни пуфер с додатком соли (ПБС), pH 7,2) Овај пуфер се користи за разрjеђивање антитијела. Na2HPO4 · 12H2O 2,7 g NaH2PO4 · 2H2O 0,4 g NaCl 8 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, провјерити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 2.2. IF пуфер - Tween Овај пуфер користи се за испирање IF плочица. IF пуферу до дати 0,1% Tween 20. 2.3. Фосфатни пуфер с глицеролом pH 7,6 Овај пуфер користи се као раствор за прекривање бунарчића у IF тесту како би се појачала флуоресценција. Na2HPO4 · 12H2O 3,2 g NaH2PO4 · 2H2O 0,15 g, глицерол 50 ml Дестилована вода 100 ml Комерцијални раствори нпр. Vectashield® (Vector Laboratories) ili Citifl uor® (Leica). Поглавље VI ОДРЕЂИВАЊЕ НИВОА КОНТАМИНАЦИЈЕ У IF И FISH ТЕСТОВИМА 1. Избројати просјечан број типичних флуоресцентних ћелија по видном пољу (c). 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 23 2. Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по бунар чићу микроскопске плочице (C): C = c · S/s, гдје је: S = површина бунарчића IF плочице са више бунарчића, s = површина поља објектива. s = πi2/4G2К2, гдје је: i = коефицијент поља (варира од осам до 24, зависно од типа окулара), К = коефицијент тубе - цијеви (1 или 1,25), G = повећање објектива (100 пута, 40 пута итд.). 3. Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по ml ресуспендованог талога (N) N = C · 1000/u · F, гдје је: u = запремина ресуспендованог талога у сваком бунарчићу, F = фактор разрјеђења ресуспендованог талога. Поглавље VII ХРАНЉИВЕ ПОДЛОГЕ ЗА ИЗОЛАЦИЈУ И ГАЈЕЊЕ C. m. subsp. sepedonicus 1. Опште хранљиве подлоге 1.1. Хранљиви агар (NА) Хранљиви агар (Difco) 23 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 1.2. Хранљиви агар са декстрозом (NDA) Difcobacto хранљиви агар који садржи 1% D (+) глукозе (моно хидрата). Стерилисати у аутоклаву на 115 °C 20 минута. 1.3. Агар са квасцем, пептоном и глукозом (YPGА) Екстракт квасца (Difco) 5 g Bacto пептон (Difco) 5 g D (+) глукоза (монохидрат) 10 g Агар bacto (Difco) 15 g Дестилисана вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 1.4. Агар са екстрактом квасца и минералним солима (YGM) Bacto екстракт квасца (Difco) 2 g D (+) глукоза (монохидрат) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4 · 7H2O 0,1 g MnSO4 · H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4 · 7H2O 0,005 g Bacto агар (Difco) 18 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати 0,5 литара хранљиве по длоге у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 2. Селективне хранљиве подлоге које су прошле валидацију 2.1. MTNA хранљива подлога Осим ако није другачије наведено, сви састојци су из BDH. Екстракт квасца (Difco) 2 g Манитол 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4 · 7H2O 0,1 g MnSO4 · H2O 0,015 g FeSO4 · 7H2O 0,005 g Агар (Oxoid no.1) 16 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и подесити pH на 7,2. Након стерилиза ције у аутоклаву (на 121 °C у трајању од 15 минута) и хлађења на 50 °C, додати антибиотике: триметоприм 0,06 g, налидиксилну ки селину 0,002 g, амфотерицин Б 0,01 g киселина (Sigma), (оба 5 mg/ ml), у 96% етанолу, амфотерицин Б (Sigma), (1 mg/ml), у диметил сулфоксиду. Шток раствори стерилишу се филтрацијом. Концентровани раствори антибиотика: триметоприм (Sigma) и налидиксилна киселина (Sigma), (оба 5 mg/ml), у 96% метанолу, амфотерицин Б (Sigma), (1 mg/ml), у диметил сулфоксиду. Напомена Рок трајања основне хранљиве подлоге је три мjесеца. Након што се додају антибиотици, рок трајања је мјесец дана, и то уколи ко се припремљена подлога чува у фрижидеру. 2.2. NCP-88 Хранљиви (Difco) 23 g Екстракт квасца (Difco) 2 g Д-манитол 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4 · 7H2O 0,25 g Дестилована вода 1 l Растворите састојке и подесите pH на 7,2. Након стерилиза ције у аутоклаву (на 121 °C 15 минута и хлађења на 50 °C), додајте сљедеће антибиотике: полимиксин Б сулфат (Sigma) 0,003 g, нали диксилна киселина (Sigma) 0,008 g, циклохексимид (Sigma) 0,2 g. Шток растворе антибиотика направити на сљедећи начин: растворити налидиксилну киселину у 0,01 М NaOH циклохекси мид у 50% етанолу, полимиксин Б сулфат у дестилованој води. Основни раствори су стерилисани филтрирањем. Напомена Рок трајања основне хранљиве подлоге је три мјесеца. Након што се додају антибиотици, рок трајања је мјесец дана, и то када се чува у фрижидеру. Поглавље VIII ПОТВРЂЕНИ И ОДОБРЕНИ ПРОТОКОЛИ И РЕАГЕНСИ ЗА PCR Напомена Прелиминарна тестирања треба да омогуће поновљиву детек цију од најмање 103 до 104 ћелија C. m. subsp. sepedonicus по ml екстракта узорка. Током прелиминарних тестирања не смије доћи до појаве ла жно позитивних резултата код одабраних бактеријских изолата. 1. Протокол за мултиплекс PCR са унутрашњом PCR контро лом (Pastrik, 2000) 1.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер PSA-1 5’ - ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa - 3’. Низводни прајмер PSA-R 5’ - tac tga gat gtt tca ctt ccc c - 3’. Узводни прајмер NS-7-F 5’ - gag gca ata aca ggt ctg tga tgc - 3’. Низводни прајмер NS-8-R 5’ - tcc gca ggt tca cct acg ga - 3’. Очекивана дужина умноженог производа из ДНК C. m. subsp. sepedonicus = 502 bp (пар прајмера PSA). Очекивана дужина умноженог производа из 18S рРНА унутра шње контроле = 377 bp (пар прајмера NS). 1.2. PCR реакциони микс Реагенс Количина по реакцији Коначна кон центрација Стерилна ултрачиста вода 15,725 μl 10 · PCR пуфер1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 · (1,5 mM MgCl2) BSA (фракција V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смjеса d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Прајмер PSA-1 (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM Прајмер PSA-R (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM Прајмер NS-7-F (10 μM)2 0,1 μl 0,04 μM Прајмер NS-8-R (10 μM)2 0,1 μl 0,04 μM Таq полимјераза (5 U/μ)1 0,2 μl 1 U Запремина узорка 5 μl Укупна запремина 25 μl (1) Валидација методе је извршена уз коришћење Taq полимера зе Perkin Elmer (Ampli Taq ili Gold) и Gibco BRL. (2) Оптимизација концентрације прајмера NS-7F и NS-8-R извршена је за екстракцију из пупчаног конуса кромпира методом хомогенизације и пречишћавања ДНК према Pastrik (2000), (Погла вље II тачка 6. подт. 6.1. и 6.2). Уколико се користи екстракција тресењем или нека друга ме тода изолације ДНК, потребно је извршити поновну оптимизацију концентрације реагенаса. 24 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 21.7.2020. 1.3. Услови PCR реакције Извести сљедећи програм: а) један циклус: три минута на 95 °C (денатурација ланца ДНК); б) десет циклуса: један минут на 95 °C (денатурација ланца ДНК); в) један минут на 64 °C (везивање прајмера); г) један минут на 72 °C (хибридизација); д) 25 циклуса: 30 секунди на 95 °C (денатурација ланца ДНК); ђ) 30 секунди на 62 °C (денатурација ланца ДНК); е) један минут на 72 °C (продужавање копије); ж) циклус: пет минута на 72 °C (коначно продужавање); з) држати на 4 °C. Напомена Оптимални услови коришћења овог програма дефинисани су за коришћење на PCR MJ Research PTC 200 thermal cycler. Моди фикација трајања корака циклуса је вјероватно потребна у случају употребе других модела thermal cyclerа. 1.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК C. m. subsp. sepedonicus ис пољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикцио них фрагмената са ензимом Bgl II послије инкубације на 37 °C 30 минута. Рестрикциони фрагменти добијени из специфичног фраг мента C. m. subsp. sepedonicus су величине 282 bp и 220 bp. 2. Припрема боје за електрофорезу 2.1. Бромфенол плаво (10% концентровани раствор) Бромфенол плаво 5 g Дестилована вода (бидестилована) 50 ml 2.2. Пуфер за бојење Глицерол (86%) 3,5 ml Бромфенол плаво (5.1) 300 μl Дестилована вода (бидестилована) 6,2 ml 3. 10 · Трис-ацетатни и EDTA пуфер (ТАЕ), pH 8,0 Трис пуфер 48 g Глацијална сирћетна киселина 11,42 ml EDTA (динатријумова со) 3,72 g Дестилована вода 1 l Разриједити једанпут прије употребе (нпр. Invitrogen или за мјена). Поглавље IX ПОТВРЂЕНИ И ОДОБРЕНИ РЕАГЕНСИ ЗА FISH ТЕСТ 1. Олиго-пробе Специфична проба за C. m. subsp. sepedonicus CMS-CY3-01: 5’ - ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg - 3’. Неспецифична еубактеријска проба EUB-338-FITC: 5’ - gct gcc tcc cgt agg agt - 3’. 2. Раствор за фиксирање Раствор за фиксирање садржи параформалдехид, који је ток сичан. Носити рукавице и не удисати га. Препоручује се рад у ди гестору. Загријати 9 ml воде за употребу у процедурама молекуларне биологије (нпр. ултрачисте воде) на око 60 °C и додати 0,4 g па раформалдехида. Параформалдехид се раствара послије додавања пет капи 1N NaOH и мијешања на магнетној мјешалици. Подесити pH на 7 додајући 1 ml 0,1 М фосфатног пуфера (PB; pH 7,0) и пет капи 1 N HCl. Вриједност pH провјерити и помоћу индикатор трака и ако је потребно подесите pH помоћу HCl или NaOH. У растворима са параформалдехидом не употребљавати pH метар. Профилтрирати раствор кроз мембрански филтер од 0,22 μm и до даље употребе чувати на 4 °C и заштитити од прашине. Напомена Алтернативни раствор за фиксирање је 96% етанол. 3. 3 · Hybmix NaCl 2,7 М Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (филтер стерилисани у аутоклавама) 15 mM Разриједити до једанпут према потреби. 4. Раствор за хибридизацију 1 · Hybmix Натријум-додецил-сулфат (SDS) 0,01% Проба EUB 338 5 ng/μl Проба CMSCY301 5 ng/μl Припремити количине раствора за хибридизацију према про рачунима у Табели 1. Предложене количине за припремање смјесе за хибридизацију (у даљем тексту: Табела 1). За сваку плочицу (са два различита узорка у дупликату) треба 90 μl раствора за хибри дизацију. Табела 1. двије плочице осам плочица Стерилна ултрачиста вода 50,1 200,4 3 · Hybmix 30 120 1% SDS 0,9 3,6 Проба EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18 Проба CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18 Укупна запремина (μl) 90 360 Напомена Све растворе који садрже олиго-пробе осjетљиве на свjетлост чувати у мраку на -20 °C. Током употребе заштитити их од директ не сунчеве свјетлости или електричног свјетла. 5. 0,1 М фосфатни пуфер, pH 7,0 Na2HPO4 8,52g KH2PO4 5,44 g Дестилована вода Растворити састојке, провјерити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Поглавље X ГАЈЕЊЕ ПЛАВОГ ПАТЛИЏАНА Посијати сјеме плавог патлиџана (Solanum melongena) у пасте ризовани компост за сјеме. Пресадити сијанце са потпуно развије ним котиледонима (10 до 14 дана) у пастеризован компост у сак сијама. Плави патлиџани треба да се гаји у стакленику под сљедећим условима: 1) дужина дана: 14 часова или природна дужина дана, ако је дужа од 14 часова, 2) температура: дан: од 21 °C до 24 °C, ноћ: 15 °C. Осјетљиве сорте плавог патлиџана: Black Beauty, Long Tom, Rima, Balsas. Поглавље XI ПОСТУПАК БОЈЕЊА ПО ГРАМУ (HUCKEROVA МОДИФИКАЦИЈА), (DOETSCH, 1981) а) Раствор кристал виолет Растворите 2 g кристал виолет у 20 ml 95% етанола. Раствори те 0,8 g амонијум-оксалата у 80 ml дестиловане воде. Помијешати два раствора. б) Луголов раствор Јод 1 g Калијум-јодид 2 g Дестилована вода 300 ml Уситнити састојке користећи тучак и аван. Додати састојке води и промијешати да се растворе у затвореној посуди. в) Раствор шафранина за контраст Основни раствор: шафранин О 2,5g, 95% етанол 100 ml. Промијешати и чувати. Разриједити 1 : 10 за добијање радног раствора. Поступак бојења: 1. припремити размазе, осушити на ваздуху и фиксирати их загријавањем, 2. плочицу прелити раствором кристал виолет и држати један минут, 3. кратко испрати текућом водом, 4. прелити Луголовим раствором један минут, 21.7.2020. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 71 25 5. испрати текућом водом и просушити филтер-папиром, 6. боју уклонити 95% етанолом, који се додаје кап по кап или се размаз урони на 30 секунди и лагано протресе, 7. испрати текућом водом и просушити филтер-папиром, 8. прелити раствором шафранина 10 секунди, 9. испрати текућом водом и осушити филтер-папиром, 10. Грам-позитивне бактерије боје се љубичасто-плаво, а Грам негативне бактерије боје се ружичасто-црвено. 1420 На основу члана 117. став 3. Закона о водама (“Службени гласник Републике Српске”, бр. 50/06, 92/09, 121/12 и 74/17) и члана 76. став 2. Закона о републичкој управи (“Службени гласник Републике Српске”, број 115/18), министар пољо привреде, шумарства и водопривреде д о н о с и ПРАВИЛНИК О ВОДНОМ ИНФОРМАЦИОНОМ СИСТЕМУ Члан 1. Овим правилником прописују се успостављање и упра вљање Водним информационим системом, елементи и садржај и начин прикупљања, чувања, дистрибуције и пре зентације података Водног информационог система. Члан 2. Водни информациони систем је мрежно оријентисан, модуларни систем који обезбјеђује прикупљање, уношење, одржавање, анализу, презентацију и дистрибуцију података о: површинским и подземним водама, класама и катего ријама водних тијела, коришћењу вода, водном земљишту, водним грађевинама, заштити од вода, заштити вода, мо ниторингу, метеоролошким станицама, водној документа цији, водној карактеризацији, мапама опасности и ризика од поплава, плановима управљања ризиком од поплава, научно-техничким и другим подацима значајним за упра вљање водама. Члан 3. Појмови коришћени у овом правилнику имају сљедеће значење: 1) просторни подаци су сви они подаци који имају ди ректну или индиректну везу са специфичном локацијом или географским подручјем, 2) алфанумерички подаци су сви они подаци који за на чин представљања и обраду информација, поред цифара, користе и слова и специјалне симболе. Члан 4. Јавна установа “Воде Српске” организује, успоставља и управља Водним информационим системом, који обухвата обласни ријечни слив ријеке Саве и обласни ријечни слив ријеке Требишњице. Члан 5. Водни информациони систем успоставља се у складу са техничким нормама и стандардима за развој и управља ње информационим системима, с циљем: 1) формирања јединственог система прикупљања, еви дентирања и чувања података из сектора вода, 2) лакше размјене података, ефикаснијег претраживања и анализе база података, надзора над процесима и појавама у простору ради доношења одговарајућих одлука, 3) повећања продуктивности и ефикасности у процесу послова управљања водама и побољшања комуникације међу субјектима, 4) унапређивања општег квалитета процеса планирања и одлучивања, 5) увођења јединствених стандарда, метода и поступака обраде података из сектора вода. Члан 6. (1) Водни информациони систем садржи сљедеће мо дуле података о: 1) површинским водама (подаци о водотоцима, водама стајаћицама, класама и категоријама, ријечним базенима и др.), 2) коришћењу вода (подаци о захватима воде, систе мима за снабдијевање водом, хидротехничким објектима, пловним путевима и праћењу концесија и др.), 3) подземним водама (подаци о изворима, бушеним објектима, копаним објектима, геоморфолошким објекти ма, трасирању подземних вода, цјелинама подземних вода и др.), 4) водним грађевинама (подаци о документацији, узду жним водним грађевинама, попречним водним грађевина ма и др.), 5) заштити од вода (подаци о одбрани од поплава, заштитним објектима и баријерама, уређењу водотока, поплавама, геометрији водотока и др.), 6) заштити вода (подаци о заштићеним подручјима, по тенцијалним загађивачима, системима одводње, инцидент ним загађењима вода и др.), 7) мониторингу (подаци о станицама за посматрање вода, хидролошким станицама, станицама за посматрање квалитета воде, станицама за посматрање нивоа воде, био лошком мониторингу и др.), 8) метеоролошким станицама (подаци о метеоролош ким станицама, локацијама, документација о метеоролош ким мјерењима, карактеристичним мјерењима, временским подацима о метеоролошким мјерењима и др.), 9) водној карактеризацији (подаци о карактеристикама водних подручја и ријечних базена за потребе израде плана управљања ријечним базенима), 10) мапама опасности и мапама ризика од поплава (по даци о плавним зонама и ризицима за различите вјероват ноће поплава), 11) водној документацији (подаци о захтјевима за изда вање водних аката, издатим водним смјерницама, водним сагласностима и водним дозволама, управним процесима и др.), 12) водном земљишту (подаци о катастарским општи нама и катастарским парцелама које обухвата водно земљиште, власничким односима, врсти водног добра и коришћењу водног земљишта и др.), 13) регистру евиденција о инспекцијском прегледу, 14) одводњавању и наводњавању (подаци о системима за одводњавање, системима за наводњавање, о земљишту, мелиорационим и сливним подручјима и др.), 15) катастру бујица и модела осјетљивости (подаци о ерозији, типовима, категоријама, предузетим мјерама и др.), 16) плановима управљања ризиком од поплава (подаци добијени из планова управљања ризиком од поплава, не грађевинске мјере за заштиту од вода, правилници и остали акти и др.), 17) остало (подаци о адресару, организацији управља ња, локацијама, научно-техничким и другим стварима бит ним за управљање водама). (2) Подаци из става 1. овог члана разврставају се на просторне и алфанумеричке. Члан 7. Подаци који се уносе у Водни информациони систем прикупљају се од: 1) републичких органа и организација, 2) јединица локалне самоуправе, 3) привредних субјеката чије активности имају утицај на водни режим, 4) јавних предузећа из области водопривреде.