Règlement grand-ducal relatif à des problèmes de police sanitaire en matière d'échanges intracommunautaires d'animaux des espèces bovine et porcine

205 Reglement grand-ducal du 21 janvier 1993 relatif ades problernes de police sanitaire en matiere d'echanges intracommunautaires d'animaux des especes bovine et porcine. Nous JEAN, par la grace de Dieu, Grand-Duc de Luxembourg, Duc de Nassau; Vu la loi rnodifiee du 29 juillet 1912 concernant la police sanitaire du betail et l'amelioration des chevaux, des betes a cornes et des porcs; Vu la directive du Conseil no 64/432/CEE du 26 juin 1964 relative a des problernes de police sanitaire en matiere d'echanges intracommunautaires d'animaux des especes bovine et porcine, telle qu'elle a ete rnodifiee par la suite et en dernier lieu par la directive du Conseil 911499/CEE du 26 juin 1991 concernant Ie diagnostic de la brucellose bovine et de la leucose bovine enzootique; Vu la directive du Conseil no 90/422/CEE du 26 juin 1990 modifiant la directive 64/432/CEE en ce qui concerne la leucose bovine enzootique; Vu la directive du Conseil no 90/423/CEE du 26 juin 1990, modifiant la directive 85/511 ICEE etablissant des mesures communautaires de lutte contre la fievre aphteuse, la directive 64/432/CEE relative ades problernes de police sanitaire en matiere d'echanges intracommunautaires d'animaux des especes bovine et porcine; Vu I'avis de la Chambre d'Agriculture; Vu l'avis du College Veterinaire : Vu l'article 27 de la loi du 8 fevrier 1961 portant organisation du Conseil d'Etat et considerant qu'il y a urgence; Sur Ie rapport de Notre Ministre de l'Agriculture, de la Viticulture et du Developpernent rural et de Notre Ministre de la Justice et apres deliberation du Gouvernement en Conseil; Arretons: Art. 1er• Le present reglernent concerne les echanges entre Ie Grand-Duche de Luxembourg et les autres Etats membres des animaux d'elevage, de rente ou de boucherie des especes bovine et porcine. Art. 2. Au sens du present reglernent on entend par: a) exploitation: l'etablissernent agricole ou l'etable de negociant officiellement controlee dans lequel des animaux d'elevage, de rente ou de boucherie sont detenus ou sont eleves de facon habituelle; b) animal de boucherie: I'animal des especes bovine et porcine destine aetre conduit directement aI'abattoir ou sur un rnarche : c) animaux d'elevage ou de rente: les animaux des especes bovine et porcine autres que ceux rnentionnes al'alinea b), notamment ceux destines a l'elevage, a la production de lait, de viande ou au travail; d) cheptel bovin officiellement indemne de tuberculose: Ie cheptel bovin qui satisfait aux conditions enurnerees a I'annexe A point I; e) cheptel bovin officiellement indemne de brucellose: Ie cheptel qui satisfait aux conditions enurnerees aI'annexe A point II sous A sous 1 ou 1 bis; f) cheptel bovin indemne de brucellose: Ie cheptel bovin qui satisfait aux conditions enumerees aI'annexe A point II A 2; g) animal de l'espece porcine indemne de brucellose: I'animal de l'espece porcine qui satisfait aux conditions enurne rees aI'annexe A point II B 1 ; h) cheptel porcin indemne de brucellose: Ie cheptel porcin qui satisfait aux conditions enumerees aI'annexe A point II B 2; j) zone indemne d'epizootie : une zone d'un diarnetre de 20 km, dans laquelle selon des constatations officielles il n'y a pas eu, depuis 30 jours au moins avant l'embarquement: i) pour les animaux de l'espece bovine: aucun cas de fievre aphteuse, ii) pour les animaux de l'espece porcine: aucun cas de fievre aphteuse, de maladie vesiculeuse du pore ou de paralysie porcine contagieuse (maladie de Teschen); k) maladies adeclaration obligatoire: les maladies enurnerees a l'annexe E; I) veterinaire officiel: Ie veterinaire designe par l'autorite centrale cornpetente d'un Etat membre. Au Grand-Duche de Luxembourg: Ie veterinaire-inspecteur : m) pays expediteur : l'Etat membre apartir duquel des animaux des especes bovine et porcine sont expedies vers un autre Etat membre; n) pays destinataire: l'Etat membre adestination duquel sont expedies des animaux des especes bovine et porcine provenant d'un autre Etat membre; 0) region: partie du territoire d'un Etat membre dont la superficie est d'au moins 2.000 kilometres carres et qui est soumise a un controle des autorites cornpetentes et inclut au moins I'une des circonscriptions administratives suivantes: 206 pour la Belgique: province/provincie, pour la Republique Federale d'Aliemagne: Regierungsbezirk, pour Ie Danemark: Amt ou lie, pour la France: departement, pour I'ltalie: provincia, pour Ie Luxembourg: l'ensernble du territoire, pour les Pays-Bas: keuring pour Ie Royaume-Uni: pour l'Angleterre, Ie Pays de Galles et I'lriande du Nord: county, pour l'Ecosse: district ou island area, pour l'lriande: county, pour la Grece : Nomos, pour l'Espagne: provincia, pour Ie Portugal continental: distrito, et pour Ie reste du territoire: regiao autonoma. s) cheptel indemne de leucose bovine enzootique: Ie cheptel qui satisfait aux conditions enurnerees a I'annexe G chapitre ler rubrique A; t) Etat membre ou region indemne de leucose bovine enzootique: une region ou un Etat membre satisfaisant aux exigences fixees a I'annexe G chapitre ler rubrique B; u) Ministre: Ie Ministre ayant dans ses attributions l'Administration des services veterinaires ; v) Directeur: Ie Directeur de l'Administration des services veterinaires. Art. 3. 1. Seul peuvent faire I'objet d'une expedition vers un Etat membre de la CE les animaux des especes bovine et porcine, qui remplissent les conditions generales fixees au paragraphe 2, compte tenu Ie cas echeant des disposi tions du paragraphe 7, ainsi que les conditions speciales fixees pour certaines categories d'animaux des especes bovine et porcine aux paragraphes 3 a6. 2. Les animaux des especes bovine et porcine vises par Ie present reglernent doivent: a) ne presenter, au jour d'embarquement, aucun signe c1inique de maladie; b) ne pas avoir ete acquis dans une exploitation faisant l'objet d'une interdiction pour des motifs de police sani taire par suite de I'apparition des maladies suivantes auxquelles les animaux en cause sont receptifs: fievre aphteuse, maladie vesiculeuse du porc, peste porcine, paralysie contagieuse des pores, brucellose bovine, brucellose porcine, charbon bacteridien. Pour autant que tous les animaux des especes sensibles a la maladie n'ont pas ete abattus et les locaux desin fectes, la duree de I'interdiction doit etre, acompter du dernier cas constate, d'au moins trente jours dans Ie cas de fievre aphteuse ou de maladie vesiculeuse du porc, d'au moins quarante jours dans Ie cas de paralysie contagieuse des porcs, d'au moins six semaines dans Ie cas de brucellose bovine ou porcine et d'au moins quinze jours dans Ie cas de charbon bacteridien. Les animaux des especes sensibles ala maladie constatee dans la zone de protection ne peuvent en sortir que s'ils sont conduits a un abattoir sous controle officiel en vue de I'abattage immediat ; c) pour autant qu'il s'agit d'animaux d'elevage ou de rente, avoir ete acquis dans une exploitation repondant offi ciellement aux conditions suivantes: i) etre situee au centre d'une zone indemne d'epizootie, ii) etre indemne depuis 3 mois au moins avant I'embarquement de fievre aphteuse et de brucellose bovine pour les animaux de l'espece bovine et pour les animaux de l'espece porcine, de fievre aphteuse, de maladie vesiculeuse du pore, de brucellose bovine et de brucellose porcine et de paralysie contagieuse des porcs (maladie de Teschen), iii) etre indemne depuis au moins 30 jours avant I'embarquement de toute autre maladie contagieuse pour l'espece animale consideree et sou mise adeclaration obligatoire; d) avoir sejourne dans I'exploitation visee a l'alinea c) pendant les 30 derniers jours avant I'embarquement ou depuis leur naissance en ce qui concerne les animaux d'elevage et de rente. Le veterinaire officiel pourra attester Ie sejour des animaux dans I'exploitation au cours des 30 derniers jours avant I'embarquement ou depuis leur naissance lorsqu'il s'aglt d'animaux identifies dans les conditions visees a l'alinea e) et places sous controle veterinaire officiel permettant de certifier I'appartenance des animaux a I'exploitation; e) etre identifies par une marque officielle ou agreee officiellement qui peut etre rernplacee chez les animaux de l'espece porcine par une estampille durable permettant I'identification; f) etre achernines directement de I'exploitation au lieu precis d'embarquement: i) sans entrer en contact avec des animaux biongules autres que des animaux des especes bovine et porcine repondant aux conditions prevues pour les echanges intracommunautaires; ii) en les separant, animaux d'elevage ou de rente d'une part, animaux de boucherie d'autre part; iii) a l'aide de moyens de transport et de contention prealablernent nettoyes et desinfectes avec un desinfec tant officiellement auto rise ; 207 g) etre ernbarques, en vue de leur transport, conforrnernent aux conditions de l'alinea e) en un lieu precis situe au centre d'une zone indemne d'epizootie : les vehicules de transport doivent etre arnenages de telle sorte que les feces, la litiere ou Ie fourrage des animaux ne puissent pas couler ou tomber hors du vehicu!e pendant Ie transport; h) etre, apres I'embarquement, achernines directement et dans les delais les plus brefs vers Ie pays destinataire; i) etre accornpagnes au cours de leur transport vers Ie pays destinataire d'un certificat sanitaire, conforme a I'annexe F (rnodeles I a IV), qui devra etre etabli Ie jour de I'embarquement, au moins.dans la langue du pays destinataire, et dont la duree de validite sera de 10 jours. Ce certificat doit com porter un seul feuillet. 3. Les bovins d'elevage ou de rente doivent en outre: a) provenir d'un cheptel bovin officiellement indemne de tuberculose et notamment lorsqu'il s'agit d'animaux ages de plus de 6 semaines avoir reagi negativernent aune intradermotuberculination effectuee dans les trente jours precedant I'embarquement et pratiquee conforrnernent aux dispositions de I'annexe B. b) provenir d'un cheptel bovin officiellement indemne de brucellose et notamment lorsqu'il s'agit d'animaux ages de plus de 12 mois, avoir presence un titre brucellique inferieur a30 unites internationales agglutinantes par millilitre, lors d'une sere-agglutination effectuee dans les trente jours precedant I'embarquement et pratiquee conforrnernent aux dispositions de I'annexe C point A. c) lorsqu'il s'agit de vaches laitieres. ne pas presenter de signe c1inique de mammite; en outre, I'analyse de leur lait, pratiquee conforrnernent aux dispositions de l'annexe D, ne doit avoir decele ni indice d'un etat inflam matoire caracterise, ni germe specifiquernent pathogene. d) provenir d'un cheptel indemne de leucose bovine enzootique au sens de I'article 2 point s). e) outre la condition prevue au point d), lorsqu'ils sont ages de plus de douze mois et lorsqu'ils proviennent d'une region ou d'un Etat membre n'ayant pas Ie statut d'indemne de leucose bovine enzootique, avoir presente un resultat negatif aun test individuel qui a ete pratique conforrnernent al'annexe G chapitre II, dans les trente jours precedant leur embarquement. f) ne pas etre soumis aux exigences des points d) et e) s'il s'agit de bovins ages de moins de 30 mois, destines a la production de viande et s'ils i) proviennent d'un cheptel dans lequel aucun cas de leucose bovine enzootique n'a ete notifie et confirrne au cours des deux dernieres annees, ii) sont identifies par une marque particuliere lors de leur embarquement et restent sous controle jusqu'a leur abattage, pour autant que l'Etat membre de destination prenne to utes les mesures pour eviter la contamination des cheptels indigenes. 4. Les pores d'elevage ou de rente doivent en outre provenir d'un cheptel porcin indemne de brucellose. Lorsqu'il s'agit de pores reproducteurs ages plus de 4 mois, ils doivent avoir presence. lors d'epreuves effectuees dans les trente jours precedant I'embarquement: i) un titre brucellique inferieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre, lors d'une seroagglutina tion pratiquee conforrnernent aux dispositions de I'annexe C point A; ii) une reaction de fixation du complement negative, lors d'un examen serologique pratique conformernent aux dispositions de I'annexe C. 5. Les animaux de boucherie ne doivent en outre pas etre des animaux des especes bovine ou porcine a eliminer dans Ie cadre d'un programme d'eradication des maladies contagieuses. 6. Les bovins de boucherie, pour autant qu'ils soient ages de plus de 4 mois doivent en outre: a) Lorsqu'ils ne proviennent pas d'un cheptel bovin officiellement indemne de tuberculose, avoir reagi negative ment it une intradermotuberculination effectuee dans les 30 jours precedant I'embarquement et pratiquee conforrnernent aux dispositions de I'annexe B; b) Lorsqu'ils ne proviennent pas d'un cheptel bovin officiellement indemne de brucellose, ni d'un cheptel bovin indemne de brucellose, avoir presente, lors d'une seroagglutination effectuee dans les 30 jours precedant l'ernbarquernent et pratiquee conforrnernent aux dispositions de I'annexe C point B), un titre brucellique infe rieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre. 7) Sont egalernent admis pour les echanges intracommunautaires: les animaux d'elevage ou de rente ou les animaux de boucherie acquis sur un rnarche officiellement agree pour les echanges intracommunautaires. Ce rnarche doit repondre aux conditions suivantes: a) etre place sous Ie controle d'un veterinaire officiel; b) etre situe au centre d'une zone indemne d'epizootie : c) ne servir apres desinfection, soit qu'a des animaux d'elevage ou de rente, soit qu'a des animaux de boucherie, repondant aux conditions des echanges intracommunautaires, telles qu'elles sont prevues aux paragraphes 2 a 6 et a I'article 4, pour autant que ces conditions soient applicables a l'espece animale consideree. En particu lier ces animaux doivent avoir ete achernines vers Ie rnarche conforrnernent aux dispositions du paragraphe 2 alinea e). 208 Toutefois, I'intradermotuberculination et la seroagglutination prescrites aux termes du paragraphe 3 sous a) et b) ne doivent pas necessairernent avoir ete effectuees avant I'introduction sur Ie rnarche. Avant d'etre amenes de I'exploitation ou d'un rnarche, repondant aux dispositions du present paragraphe, vers Ie lieu d'embarquement, ces animaux peuvent conforrnernent aux dispositions du paragraphe 2 alinea f), etre conduits dans un lieu de rassemblement officiellement controle si celui-ci satisfait aux conditions fixees pour Ie rnarche. Les animaux acquis sur de tels marches doivent etre directement achernines du marche ou du lieu de rassem blement au lieu precis d'embarquement conforrnernent aux dispositions du paragraphe 2 alineas f) et h) et expedies vers Ie pays destinataire. La duree du rassemblement desdits animaux en dehors de I'exploitation d'origine, notamment sur Ie rnarche, dans Ie lieu de rassemblement ou dans Ie lieu precis d'embarquernent, doit etre irnputee sur Ie delai de 30 jours prevu au paragraphe 2 alinea c), sans que cette duree puisse exceder 6 jours. 8. Le Ministre designe les marches agrees d'animaux d'elevage ou de rente et les marches agrees d'animaux de boucherie prevus au paragraphe 7. II communique ces agrernents aux auto rites centrales cornpetentes des autres Etats membres et a la Commission. 9. Un reglernent ministerial peut fixer les rnodalites selon lesquelles Ie controle officiel des marches et des lieux de rassemblement prevus au paragraphe 7 doit etre effectue. 10. Dans Ie cas prevu au paragraphe 7, des mentions correspondantes doivent etre portees sur les certificats san i taires, conforrnement a l'annexe F (rnodeles I a IV). 11. Un reglernent rninisteriel peut fixer les rnodalites selon lesquelles Ie controle officiel des etables de marchands doit etre effectue. 12. Si I'exploitation ou la zone OU elle se trouve etait frappee de mesures d'interdiction officielles prises ala suite de I'apparition d'une maladie contagieuse pour l'espece animale consideree, les delais indiques au paragraphe 2 alinea c) sub ii) et iii) et a I'article 2 alinea i) prennent effet apartir de la date a laquelle ces mesures d'interdiction ont ete officiellement levees. Art. 4. 1. Tous les animaux destines aux echanges intracommunautaires doivent avoir sejourne sur Ie territoire de l'Etat membre expediteur avant Ie jour de l'ernbarquernent : a) depuis au moins 6 mois s'il s'agit d'animaux d'elevage ou de rente; b) depuis au moins 3 mois s'il s'agit d'animaux de boucherie. Lorsque ces animaux sont ages respectivement de mains de 6 ou 3 rnois, Ie sejour sur Ie territoire de l'Etat membre expediteur est impose depuis la naissance. 2. Dans tous les cas prevus au paragraphe 1, des mentions correspondantes doivent etre portees sur les certificats sanitaires, conforrnernent a I'annexe F (modeles I a IV) Art.5. 1. Les animaux de boucherie, qui ont ete conduits, sitot arrives au Grand-Duche de Luxembourg, soit directement, soit atravers un rnarche ou un centre de rassemblement agree, dans un abattoir, doivent y etre abattus dans les delais les plus brefs, conforrnernent aux exigences de police sanitaire. 2. Les animaux de boucherie qui ont ete conduits, sitot arrives au Grand-Duche de Luxembourg, sur un rnarche attenant a un abattoir dont la reglernentation ne permet la sortie des animaux presents que vers un autre abat toir, doivent etre abattus dans cet abattoir cinq jours au plus tard apres leur entree dans Ie rnarche. Le directeur peut, pour des raisons de police sanitaire, designer l'abattoir vers lequel ces animaux doivent etre achernines. Art. 6. Les regles prevues par la directive 90/425/CEE du Conseil, du 26 juin 1990, relative aux controles veterinaires et zootechniques applicables dans les echanges intracommunautaires de certains animaux vivants et de leurs produits, sont applicables notamment en ce qui concerne les controles a l'origine, I'organisation et les suites a donner aux controles aeffectuer par Ie pays destinataire et les mesures de sauvegarde amettre en oeuvre. Art. 7. Les annexes du present reglernent en font partie integrante et peuvent etre rnodifiees par reglernent rniniste riel. Art. 8. Les decisions prises par les instances communautaires selon la procedure du Cornite Veterinaire Permanent sont directement applicables au Grand-Duche de Luxembourg. Art. 9. Les infractions aux dispositions du present reglernent sont punies d'un emprisonnement de huit jours atrois rnois, et d'une amende de deux mille cinq cent un avingt mille francs, ou d'une de ces peines seulement. Les dispositions legales sur les circonstances attenuantes sont applicables a ces infractions. Art. 10. Les articles 10 a 20 ainsi que les annexes I, II, III, IV, V, VI et VII du reglernent grand-ducal du 3 decernbre 1986 fixant les conditions sanitaires speciales d'irnportation, de transit et d'exportation des animaux et des produits d'animaux sont abroges. 209 Art. 11. Notre Ministre de l'Agriculture, de la Viticulture et du Developpernent rural et Notre Ministre de la Justice sont charges de l'execution du present reglernent qui sera publie au Memorial. Le Ministre de I'Agriculture, Chateau de Berg, Ie 21 janvier 1993. de 10 Viticulture Jean et du Developpement rural, Marie-Josee Jacobs Le Ministre de 10 Justice, Marc Fischbach Dir. 90/422 et 90/423/CEE. ANNEXE I. Cheptel bovin indemne de tuberculose Est considere comme officiellement indemne de tuberculose, un cheptel bovin dans lequel: a) tous les bovins sont exempts de manifestations c1iniques de tuberculose; b) tous les bovins de plus de six semaines ont reagi negativernent a au moins deux intradermotuberculinations offi cielles pratiquees selon les dispositions de l'annexe B, la premiere se situant six mois apres la fin des operations d'assainissement du cheptel, la deuxierne six mois apres la premiere, et les suivantes a intervalle d'un an. Lorsque la totalite des cheptels bovins est sou mise aux operations officielles de lutte contre la tuberculose, Ie pourcen tage des cheptels bovins infectes de tuberculose n'est pas superieur a 1 au cours de deux periodes de contr61e se succedant aun an d'intervalle, cet intervalle peut etre porte a deux ans. Si Ie pourcentage des cheptels bovins infectes n'est pas superieur a 0,2 au cours de deux periodes de contr61e se succedant a deux ans d'intervalle, cet intervalle peut etre porte a trois ans. Lorsque Ie pourcentage des cheptels bovins infectes n'est pas superieur a 0,1 a I'occasion de deux periodes de controles se succedant a trois ans d'intervalle, I'intervalle entre les tuberculi nations ulterieures peut etre porte a quatre ans et/ou l'age auquel les animaux devront etre soumis aces contr61es peut etre porte a vingt-quatre mois; c) aucun bovin n'a ete introduit sans qu'une attestation d'un veterinaire officiel ne certifie que cet animal provient d'un cheptel bovin officiellement indemne de tuberculose et, s'il est age de plus de six semaines, a donne a I'intra dermotuberculination une reaction negative appreciee selon les criteres definis a l'annexe B 32 a). i) Toutefois, I'intradermotuberculination n'est pas requise lorsque Ie pourcentage des cheptels bovins infectes de tuberculose est inferieur a 0,2 et s'il resulte d'une attestation du veterinaire officiel que I'animal: 1) est durnent identifie : 2) provient d'un cheptel bovin officiellement indemne de tuberculose; 3) n'est pas entre en contact, a I'occasion du transport, avec des bovins ne provenant pas de cheptels bovins officiellement indemnes de tuberculose. ii) l.'attestation prevue sous i) peut ne pas etre exigee lorsque, depuis quatre ans au minimum: 99,80 % au moins des cheptels bovins sont reconnus officiellement indemnes de tuberculose et ou les cheptels qui ne sont pas officiellement indemnes se trouvent sous contr61e officiel, Ie transfert des bovins hors de ces cheptels etant interdit, sauf s'ils sont conduits sous contr61e officiel a I'abattage. Si, dans un troupeau de bovins officiellement indemne de tuberculose, un animal est considere avoir reagi positive ment a une tuberculination de routine ou si dans ce troupeau un cas c1inique de tuberculose a ete diagnostique lors de I'inspection post-mortem de routine sur un animal venant d'un troupeau officiellement indemne de tuberculose, Ie statut de troupeau officiellement indemne doit etre suspendu jusqu'a ce que tous les animaux restants, ages de plus de six sernaines, alent reagi negativernent a au moins deux intradermotuberculinations officielles conforrnernent a I'annexe B, la premiere ayant lieu deux mois au moins apres l'elirnination de l'anirnal en question du troupeau et la seconde au moins quarante-deux jours apres la premiere. II. Animaux de l'espece porcine et cheptels bovin et porcin indemnes de brucellose A. Cheptel bovin 1) Est considere comme officiellement indemne de brucellose un cheptel bovin dans lequel: a) ne se trouvent pas d'animaux de l'espece bovine vaccines centre la brucellose, a moins qu'il ne s'agisse de femelles ayant ete vaccinees depuis au moins trois ans; b) tous les bovins sont exempts de manifestations cliniques de brucellose depuis six mois au moins; c) tous les bovins ages de plus de douze mois: i) ont presence, a l'occasion de deux sere-agglutinations pratiquees officiellement a des intervalles de trois mois au moins et de douze mois au plus et selon les dispositions de I'annexe C point A, un titre brucellique inferieur a 30 unites internationales agglutinantes par rnillilitre, etant entendu que: la premiere sere-agglutination peut etre rernplacee par trois epreuves de I'anneau (ring-test) effec tuees a intervalle de trois mois, a la condition toutefois que la seconde sere-agglutination soit effec tuee six semaines au moins apres la troisierne epreuve de I'anneau; 210 les epreuves de sero-agglutination visees au paragraphe 1 peuvent etre rernplacees par deux epreuves a l'antigene brucellique tarnponne pratiquees officiellement ou par deux epreuves de micro-agglutina tion pratiquees conformernent a I'annexe C points D et G. Ces epreuves sont effectuees a intervalle de trois mois au moins et de douze mois au plus; ii) sont controles annuellement pour determiner l'absence de brucellose par trois epreuves de l'anneau ou trois epreuves ELISA sur Ie lait, effectuees ades intervalles d'au moins trois mois, ou deux epreuves de I'anneau ou deux epreuves ELISA sur Ie lait, effectuees a des intervalles d'au moins trois mois, et une epreuve serolcgique (epreuve de seroagglutination, epreuve a l'antigene brucellique tamponne, epreuve de plasmo-agglutination, epreuve de l'anneau de lait sur plasma sanguin, epreuve de micro-agglutination ou epreuve ELISA individuelle sur Ie sang), pratiquee six semaines au moins apres la deuxierne epreuve de I'anneau ou la deuxierne epreuve ELISAsur Ie lait. Lorsque les epreuves de I'anneau ou epreuves ELISAsur Ie lait ne sont pas pratiquees, deux epreuves serologiques (epreuve de sere-agglutination. epreuve al'anti gene brucellique tarnponne, epreuve de plasmoagglutination, epreuve de I'anneau de lait sur plasma sanguin, epreuve de micro-agglutination ou epreuve ELISA individuelle sur Ie sang) sont effectuees chaque annee a des intervalles de trois mois au moins ou de six mois au plus. Lorsque la totalite des cheptels bovins est sou mise aux operations officielles de lutte contre la brucellose et que Ie pourcentage des cheptels bovins infectes n'est pas superieur aun, il suffit de proceder annuelle ment adeux epreuves de I'anneau ou deux epreuves ELISA sur Ie lait, ades intervalles d'au moins trois mois, ou a une epreuve serologique (epreuve de sere-agglutination ou epreuve a l'antigene brucellique tarnponne, epreuve de plasmoagglutination, epreuve de I'anneau de lait sur plasma sanguin, epreuve de micro-agglutination ou epreuve ELISA sur Ie sang). En cas de contr6le de citernes, Ie nombre des epreuves de I'anneau visees aux alineas precedents est a doubler, les intervalles etant reduits de rnoitie. iii) II peut etre renonce aux exigences concernant Ie controle annuel de l'absence de brucellose prevu so us ii) lorsqu'au moins 99,8 % du cheptel bovin sont reconnus officiellement indemnes de brucellose depuis quatre ans au minimum; dans ce cas, I'intervalle entre les contr6les peut etre porte a deux ans et les contr6les doivent etre effectues a l'aide de l'une des epreuves serologiques citees sous ii). d) Aucun bovin n'a ete introduit sans qu'une attestation d'un veterinaire officiel ne certifie que cet animal provient d'un cheptel bovin officiellement indemne de brucellose, et, s'il est age de plus de douze mois, qu'il a presente un titre brucellique inferieur a30 unites internationales agglutinantes par millilitre, lors d'une sero agglutination pratiquee selon les dispositions de I'annexe C, dans les trente jours avant I'introduction dans Ie cheptel. i) Toutefois, la sere-agglutination ne peut pas etre exigee lorsque Ie pourcentage des cheptels bovins infectes de brucellose n'est pas, depuis deux ans au moins, superieur a0,2 et s'il resulte d'une attestation d'un veterinaire officiel que I'animal: 1. est dument identifie, 2. provient d'un cheptel bovin officiellement indemne de brucellose, 3. n'est pas entre en contact, aI'occasion de son transport, avec des bovins ne provenant pas de cheptels bovins officiellement indemnes. ii) l.'attestation prevue sous i) peut ne pas etre exigee lorsque, depuis quatre ans au minimum: 99,80 % au moins des cheptels bovins sont reconnus officiellement indemnes de brucellose; et que les cheptels qui ne sont pas officiellement indemnes se trouvent sous contr6le officiel, Ie transfert des bovins hors de ces cheptels etant interdit, sauf s'ils sont conduits sous contr6le officiel a I'abattage. 2) Est egalernent considere comme officiellement indemne de brucellose, un cheptel bovin: se trouvant dans un Etat membre OU, ala date du 1er janvier 1979, aucun cas de brucellose bovine n'a ete offi ciellement constate depuis au moins dix ans; ayant satisfait pendant cette periode aux dispositions du paragraphe 1 a I'exception, si tous les cheptels bovins de I'Etat membre concerne ont ete soumis pendant la rnerne periode ades tests de contr6le periodi ques officiels, acelles visees au point c) sous ii). 3) 1. Un cheptel bovin est considere comme indemne de brucellose si : a) il ne com porte pas de bovins males ayant ete vaccines contre la brucellose; b) toutes les femelles de l'espece bovine, ou une partie d'entre elles, ont ete vaccinees : a l'age de 6 mois au plus, a I'aide du vaccin vivant Buck 19 ou d'autres vaccins agrees par les instances communautaires; a l'age de 15 mois au plus, a l'aide du vaccin tue adjuve 45/20 controle et reconnu ~fficiellement. c) Tous les bovins satisfont aux conditions indiquees au point 1 sous b) et c), etant entendu que les bovins ages de moins de trente mois qui ont ete vaccines a l'aide du vaccin vivant Buck 19 peuvent presenter un titre brucellique egal ou superieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre mais inferieur a80 unites internationales agglutinantes par millilitre, pour autant qu'ils presentent, lors de la reaction de fixation du complement un titre inferieur a 30 unites CEE, s'il s'agit de femelles vaccinees depuis moins de douze mois, un titre inferieur a 20 unites CEE dans tous les autres cas. Les epreuves de sero-agglutination visees au paragraphe 1 point c) sous i) premier tiret peuvent etre rem pla cees par des epreuves a l'antigene brucellique tarnponne effectuees conforrnernent a I'annexe C point D ou par des epreuves de micro-agglutination effectuees conforrnernent a I'annexe C point G. 211 d) Aucun animal de l'espece bovine n'a ete introduit sans une attestation d'un veterinaire officiel certifiant ou qu'il se trouve dans les conditions prevues au point 1 sous d), ou qu'il provient d'un cheptel bovin reconnu indemne de brucellose, et, dans ce cas, s'il est age de plus de douze mois, qu'il a presente dans les trente jours avant I'introduction dans Ie cheptel selon les dispositions de I'annexe C, un titre brucellique inferieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre et une reaction de fixation du complement negative. Toutefois, s'il s'agit d'un bovin vaccine al'aide du vaccin vivant Buck 19 et age de moins de trente rnois, il peut presenter un titre brucellique egal ou superieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre, mais inferieur a80 unites internationales agglutinantes par millilitre, pour autant qu'il presente, lors de la reaction de fixation du complement: un titre inferieur a 30 unites CEE, s'il s'agit d'une femelle vaccinee depuis moins de douze mois; un titre inferieur a 20 unites CEE, apres Ie douzierne mois suivant la vaccination. 4) Un cheptel bovin indemne de brucellose peut acquerir la qualification de cheptel bovin officiellement indemne de brucellose apres un delai minimum de trois ans, si: a) il ne s'y trouve aucun animal vaccine contre la brucellose depuis moins de trois ans; b) les conditions prevues au point 2 sous c) ont ete respectees sans interruption pendant ces trois annees ; c) a I'issue de la troisierne annee, les animaux de plus de douze mois ont presente un titre brucellique inferieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre lors d'une sere-agglutination et un resultat negatif lors de la reaction de fixation de complement, ces epreuves etant pratiquees selon les dispositions de I'annexe C. 5) Dans un cheptel bovin reconnu officiellement indemne de brucellose peuvent etre introduits egalernent des bovins provenant d'un cheptel bovin indemne de brucellose, si: au moment de leur introduction, ils sont ages d'au moins dix-huit mois; au cas ou ils ont ete vaccines contre la brucellose, cette vaccination a ete effectuee depuis plus d'un an; dans les trente jours avant leur introduction, ils ont presente, conformernent aux dispositions de I'annexe C, un titre brucellique inferieur a30 unites internationales agglutinantes par millilitre, ainsi qu'un resultat negatif lors de la reaction de fixation du complement. Si, conforrnernent au premier alinea, un bovin est introduit dans un cheptel bovin reconnu officiellement indemne de brucellose, pour les echanges intracommunautaires, ce dernier est considere comme indemne de brucellose pendant deux ans a partir de la date d'introduction de I'animal. 6) Si dans un cheptel officiellement indemne de brucellose, on a constate une suspicion de brucellose chez un ou plusieurs bovins, au lieu du retrait de la qualification de ce cheptel, celle-ci peut provisoirement etre suspendue, si I'animal ou les animaux sont imrnediaternent elirnines ou isoles, La suspicion provisoire peut etre levee si deux seroagglutinations effectuees, selon les dispositions de I'annexe C, aintervalle de six ahuit semaines, chez tous les animaux ages de plus de douze rnois, donnent un titre inferieur a 30 unites internationales agglutinantes par millilitre. Les animaux isoles peuvent etre reintroduits dans Ie cheptel si, dans I'intervalle de six a huit semaines, deux seroagglutinations ont donne un titre inferieur a30 unites internationales agglutinantes par millilitre et deux fixa tions du complement ont donne un resultat negatif, ces epreuves etant pratiquees selon les dispositions de l'annexe C. Les dispositions prevues ci-dessus sont egalement applicables aux cheptels indemnes de brucellose lorsqu'une suspicion de la maladie a ete constatee chez un ou plusieurs bovins ages de plus de trente mois. 7) Les dispositions prevues ci-dessus pour les animaux appartenant aun cheptel indemne de brucellose sont egale ment applicables aux animaux qui, avant la date de la mise en application des dispositions du present reglernent, ont ete vaccines entre cinq et huit mois d'age. B. Pores et cheptel porcin 1. Est considere comme indemne de brucellose un pore qui: a) ne presence pas de manifestations c1iniques de la maladie; b) s'il pese plus de 25 kilogrammes, presente, lors d'epreuves serologiques effectuees sirnultanernent et selon les dispositions de I'annexe C: i) un titre brucellique inferieur a30 UI agglutinantes par millilitre, lors d'une sere-agglutination: ii) un resultat negatif lors de la reaction de fixation du complement. 2. Est considere comme indemne de brucellose un cheptel porcin dans lequel: a) tous les pores sont exempts de manifestations c1iniques de la maladie depuis un an au moins; b) les bovins se trouvant en rnerne temps dans I'exploitation appartiennent a un cheptel officiellement indemne ou a un cheptel indemne de brucellose. 3. Les tests prevus aux points 1 a6 ne sont pas requis pour les animaux males castres avant l'age de quatre mois. 212 ANNEXE B Normes en matiere de fabrication et d'utilisation des tuberculines aviaires et bovines 1. Les tubercullnalJons contrclees officlllement dolvent etre effectuees au moyen de tubercullnes PPO ou HSCM. 2. Les normes de fabrlcatJon appliquees pour Ie controle des tubercullnes bovines PPO et HCSM dolvent etre etablles en unites communautalres de tubercullne (UCn, sur la base d'essals biologiques effectues avec la tuberculine standard communautalre approprlee. 3. Pour Ie controle des tubercullnes avlalres, les normes de fabrication dolvent etre etablles en unites InternatJonales apres essal blologlque par rapport a la norme CEE pour la tubercullne PPO avlalre. 4. La norme CEE de 101 tubercullne PPO bovine est celie du Centraal Dlergeneeskundlg InstJtuut, afdellng Rotterdam, Pays-Bas. 5. La norme CEE de la tubercullne HCSM bovine est celie de 1'lnstJtut Pasteur de Parts, France. 6. La norme CEE de la tubercullne avlalre est celie du Central Veterinary Laboratory, Weybrldge, Surrey, Angleterre. 7. Les tubercullnes bovines dolvent ~tre preparees avec une des souches de Mycobacterium bovis cl-apres: a) AN s. b) Vallee. 8. les tuberculines aviaires doivent etre preparees avec l'une des souches de Mycobacterium avium Indlquees ci-apres: a) 04 ERj b) TB 56. 9. Le pH des tuberculines dolt se sltuer entre 6,5 et 7,5. 10. II dolt avoir ere etabll, a 101 satisfaction de I'lnstitut d'Etat responsable du contraIe offlclel de 101 tuberculine, que les agents conservateurs speciflquernent antimlcroblens ou autres substances qui peuvent avolr ete ajoutes a la tuberculine n'alterent ru I'lnnocuite nl I'efficaclte du prodult. Les concentrations max/males autorisees sont les suivantes pour Ie phenol ec Ie glycerol: a) phenol: 0,5% M/v; b) glycerol: 10% vlv. 11. A condition d'avoir ete conservees a l'abrJ de la lumlere, aune temperature comprise entre 2 et 8° C, les tuberculines peuvent etre uulisees jusqu'a 101 fin des periodes suivantes apres que Ie dernier test d'activite a ete juge satisfaisant: a) tuberculines Iiquides PPO: deux ans, tubercullnes liophilisees PPO: hUit ans: b) tuberculines HCSM diluees: deux am. 12. Les Instituts d'Etat deslgnes ci-apres sont charges du controle officiel des tubercullnes dans leur pays respectif: a) Republlque federale d'Allemagne: Paul-Ehrlich Institut, Francfort-sur-le-Haln; b) Belgique: Institut d'hygrene et de I'epldemlologie, rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles; c) France: Laboratoire national des medicaments veter/naires, Fougeresj d) Grand-duche de Luxembourg: Ji,stitut du pays fourntsseur; e) ltalie: Istituto superiore dl sanita, Rome; f) Pays-Bas: Centraal Oiergeneeskundig Instituut, afdeling Rotterdam; g) Oanemark: Statens Veterinaere Serumlaboratorium, Copenhague Vj h) Irlande: institut du pays fournisseur i) Royaume-Unl: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey; j) Grece: Ktiniatrikon Institouton Umodon Ke ParasltJkon Nosimaton lepa. Odos, 75 Athenes, 301; k) Espagne: laborator/o de Sanidad y Producclon Animal de Granada; I) Portugal; Laboratorlo Naclonal de Investiga~o Vetennarla - Usboa. 13. Le ccntrcle offielel dolt etre effectue sur chacun des lots de tubercullnes mises en flacons et pretes a I'emplol. 14. le controle de tuberculines dolt etre effectue par des methodes biologiques ainsl que par des methodes chlmiques. 15. les tubercullnes dolvent etre stertles. Les tests de ster/lite dolvent etre effectues selon les prescriptJons de Ia pharmacopee europeenne, 16. Un ccntrele vlsant a etabllr I'absence de toxlelte ou de proprtetes Imtantes dolt etre effectue selon les prescriptions de la pharmacopee europeenne. 213 17. Les tuberculines dolvent etre soumlses aune analyse chimique permettant de determiner fa concentration de glycerol etfou de phenol alnsl que la concentradon de tout autre agent conservateur qui auralt pu ~tre ajouce.. 18. Une epreuve de non sensibllisadon a la tuberculine dou etre effectuee selon les specifications de la pharmacopee europeenne, 19. L'aetivlte des tuberculines dolt etre appredee par des methodes biologiques. Ces methodes dolvent etre utilisees pour fes tuberculines HCSM et PPD; elles, sont fondees :sur une comparaison entre fes tuberculines standard et les tuberculines a tester. 20. La teneur en protelne de la tuberculine PPD dolt etre appredee par la methode de KJeldahl. Le faeteur de conversion de I'azote en tuberculo-procelne est de 6,25. 21. La tuberculine bovine HCSM de norme CEE a une actJvlte de 65.000 unites communautaires provlsolres par ml et est presentee en ampoules de 5 ml. 22. Latubercullne bovine PPD de norme CEEa une activlte de 50.000 unites communautalres de tuberculine (UCT) par mg de PPD et est presentee a I'etat lyophillse, en ampoules contenant 1,8 mg de PPD, c'est-a-dlre que 0,00002 mg de PPD a une act/vlte egale aune actJviteegaleaune unite communautalre de tuberculine. 23. La tuberculine avialre PPD de norme CEE a une activite de 50.000 unites internatlonales (VI) par mg de mat/ere seche du derive protelque pUrifie et est presentee aI'etat Iyophillseen ampoules contenant 10 mg de PPD plus de 26,3 mg de sels, c'est-a-dtre que 0,0000726 mg de standard a une activlte egaJea une unite Intemadonale. 24. Les tubercullnes soumises par fes fabricants au contrele des insdtuts d'Etat cltes au point 12 dolvent d'abord sublr un controle de I'aetivlte comportant un essal biologique, effeetue par rapport aux standards appropries indlques aux points 2 et 3. 25. a) Contrele d'activite sur les cobayes On dolt falre usage de cobayes albinos dont Ie poIds dolt etre comprls entre 400 et 600 g. Ces cobayes dolvent etre en bonne sante au moment de l'lnjectlon de la tuberculine. Le nombre de cobayes a utlliser pour chaque essaJ ne dolt pas etre inferleur ahult. L'essai ne devrait pas etre realise molns d'un mols apres la senslbllisatlon. aa) Pour tester les tuberculines bovines, les cobayes seront sensibtllses seJon l'une des methodes suivantes: 1. Injection de Mycobacterium bov;s de souche AN 5, tues par fa chaleur, dans un adjuvant hulleux; 2. injectionde Mycobacterium bov;s de souche AN 5, vivants, dans une emulsion saline physlologique; 3. injeetion de vaccin BCG. bb) Pour tester les tuberculines avlaires, la sensibilisation des cobayes doit se faire par une injection de 2 mg de bacilles tuberculeux tues par la chaleur, de type avlaire, en suspension dans environ 0,5 ml de paraffine IIquide sterile ou par l'lnjection de badles tuberculeux vivants de type aviaire en emulsion saline physiologique. A cet effet, il y a lieu d'utiliser une souche de type aviaJre D 4. cc) Chaque tuberculine acontroler dolt etre testee par rapport afa tuberculine standard appropriee a I'aide d'une Injection intradermique, sur des groupes de cobayes convenablement sensibilises. Les flanesdes cobayes dolvent avolr ete rases. L'essaJ dolt etre base sur une comparaison entre les reactions provoquees par une serle d'injections lntracutanees de doses de 0,2 ml au plus de dllutlons de tuberculine standard en soludon saline lsotonique tamponnee contenant 0,0005 % de Tween 80 et par une sene correspondante d'lnjectJons de la tuberculine atester. Les dilutions se feront selon les series geometriques et seront Injeaees aux cobayes selon un carre latin aleaeolre (quatre cases sur chaque cate d'un essaJen huit points). Lesdtametres des reactions dans chaque case dolvent etre rnesures et notes apres 24 a 28 heures. Pour chaque echandtlon de tuberculine a tester, II y a lieu de faire une estimation de son aetivlte relauve selon fa norme appropriee et de ses Iimltes de flablllte aJ'aide de methodes staustlques, en udlisant les dlametres des reactions et des logarythmes des doses comme metarnetres, La tuberculine a tester est acceptable sl son actlvite estimee garantit par doses bovines 2.000 unites communautaires de tuberculine (+ 25 %) dans les bovins. L'acnvue de chaque tubercullne dolt etre exprimee, selon Ie cas, en unites communautaires de tuberculine ou en unites internationales par ml. b) Contrale d'actlvlte sur les bovins Un contr61e periodlque de I'activite des tubercullnes bovines peut etre effectue sur des anlmaulC attelnts de tuberculose, naturellement ou arnflctellement, Ces controles de I'activlte sur fes groupes de bovins tuberculeux dolvent comporter une inject/on Intradermique (enquatre ou six points) de la tuberculine a tester; lis se feront par rapport au standard adequat et I'aetivite de la tuberculine sera estlrnee par des methodes stadstiques comme dans I'essal sur les cobayes. 26. L'etiquetage des recipients et des emballages de tuberculine doit repondre aux conditions suivantes. L'edquette du recipient et l'etrquene de I'emballage dolvent indlquer: fe nom de la preparation, pour les preparations Iiquides, Ie volume total du reclpient, Ie nombre d'unites communautalres ou d'unites internationales par ml ou par mg, Ie nom du fabricant, 214 Ie numero de lot, la nature et la quantlte du IIqulde de reconstitution pour les preparations Iyophillsees. L'etiquette du recipient ou I'etiquette de I'emballage don Indlquer: la date de peremption, les conditions de conservations, la denomination et, sl possible, la proportion de toute substance ajoutee, Ie type de bacl/e utilise pour la preparation de la tubercullne. 27. Des laboratolres communautaires designes conformement a I'article 3 seront charges de I'examen complernentalre des tubercullnes utilisees normalement sur Ie terrain dans les Etats membres pour garantir que "activite de chacune de ces tuberculines est appropriee, compte tenu de Ia tubercullne standard communautaire adequate. Ces analyses doivent etre effctuees sur des bovins tuberculeux, sur des cobayes convenablement senslbillses et par des essais chimiques appropries. 28. Sont conslderees comme Intradermo-tubercullnations offldelles: a) l'lntradermo-tuberculination simple: cette tuberculination comporte une seule injection de tubercullne bovine; b) I'intradermo-tuberculination de comparaison: ceue tuberculination comporte une seule injection de tubercullne bovine et une seule Injection de tuberculine aviaire, admmlstrees simultanement. 29. La dose de tuberculine lnjectee sera: 1. 2.000 UCT au minimum de tubercullne bovine; 2. 2.000 UI au minimum de tubercullne aviaire. Le volume de chaque Injection ne depassera pas 0,2 mi. 30. Les tubercullnatlons dolvent etre effectuees par Injection de la ou des tubercullnes dans la peau du cou. Les points d'injections seront sltues a la limite du tiers anterieur et du tiers median du cou. 51 I'on Injecte au meme animal a la fois de la tubereullne aviaire et de la tubercullne bovine, Ie point d'injection de tuberculine avlairedolt etre sltue aquelque 10 em. de Ia crete du cou et Ie point d'injection de,tubercullne bovine doit se situer a12,5 cm au-dessous d'une IIgne plus au molns paralleleala IIgne de I'epaule ou en differents points du cou; chez les jeunes animaux OU iI n'est pas possible de separer sufflsamment les lieux d'injection sur un cote du cou, une infection sera faire de chaque cote du cou ades endrolts Identiques au centre du tiers median du cou. 31. La technique de la tubercullnatlon et l'lnterpretadon des reactions seront les sulvantes: a) Technique Les zones d'injection seront rasees et nettoyees, Un pll de la peau dans chaque zone rasee sera pris entre I'index et Ie pouce et rnesure aI'aide d'un compas et note. Une petite aiguille sterile, avec Ie bord biseaute a l'exterieur, rellee a une seringue graduee contenant de la tuberculine, sera Introduite obliquement dans les couches les plus profondes de la peau. La dose de tuberculine sera ensuite injectee. L'lnjection bien faite donnera, ala palpation, un leger renflement de lagrosseur d'un petit pois achaque point d'injection. L'epaisseur du plls de la peau sur chaque point d'injection sera remesuree 72 heures apres I'injection et notee, b) Interpretation des reactions L'Interpretauon des reactions se fondera sur I'observation c1inique et sur I'accroissement ou les accroissements notes dans l'epaisseur du pfis de la peau aux points d'injectlon, 72 heures apres l'lnjection de la ou des tuberculines. ba) Reaction negative: si I'on n'observe qu'un gonflement limite, avec un accrolssement maximal de 2 mm de l'epalsseur du pli de la peau, sans signes c1iniques tels que oedemes dlffus ou etendu, exsudation, necrose, douleur ou reaction inflammatoire des Iymphatiques de la region ou des ganglions. bb) Reaction douteuse: si I'on n'observe aucun des signes c1iniques lndlques sous ba), mais que I'augmentation d'epaisseur du pll de la peau soit superieure a 2 mm et inferieure a 4 mm. be) Reaction positive: si I'on observe les signes c1iniques lndlques sous ba) ou une augmentation d'epaisseur du pli de la peau de 4 mm ou plus a I'endroit de I'injection. 32. L'interpretation des intradermo-tuberculinations offlcielles est la suivante: a) Intradermo-tuberculination simple POSitive: reaction telle qu'elle est deflnle au point 31 sous be). Douteuse: reaction comme celie qui est detlnie au point 31 sous bbl. Negative: reaction telle qu'elle est deflme au point 31 sous ba). Les animaux chez qui I'intradermo-tubercullnation simple a donne des resultats douteux serent soumis a une autre tuberculination apres un delai minimal de 42 [ours, Les animaux chez qui cette seconde tuberculination ne donne pas de resultats negatifs doivent etre conslderes comme ayant reagi positivement a la tuberculination. Les animaux positifs a I'intradermo-tuberculination intradermique simple peuvent etre soumis a une intradermo-tuberculination de comparaison. b) Intradermo-tuberculination de comparaison pour la determination et Ie maintien de la qualificationde troupeau officiellement indemne de tuberculose. Positive: reaction bovine superieure de plus de 4 mm a la reaction aviaire ou presence de signes diniques. 215 Douteuse: reaction bovine positive ou douteuse et superieure de 1 a 4 mm a Ia reaction avlalre et absence de signes c1iniques. Negative: reaction bovine negative ou reaction bovine positive ou douteuse mals egale ou Inferleure a une reaction aviaire positive ou douteuse et absence de signes c1inlques dans les deux cas. Les animaux chez qui f'intradermo-tuberculination de comparaison a donne des resultats douteux dolvent etre soumis aune autre tuberculinatlon apres un delai minimal de 42 lours. Les anlmaux chez qui cette seconde tuberculination ne donne pas de resukats negatlfs seront conslderes comme ayant reagi positivement a la tuberculination. c) Laqualification de troupeau offiaellement indemne de tuberculose peut etre suspendue jusqu'a ce que Ie statut des animaux suivants ait ete regh~: 1. animaux qui ont ete conslderes comme ayant eu une reaction douteuse a I'intraderme tuberculination simple; 2. anlmaux qui ont ete cons Ideres com me ayant reagl posltlvement a 1'lntradermo-tubercullnatJon simple, mals qui dolvent etre testes a nouveau par Intradermo-tubercullnatlon de comparaison; 3. animaux qui ont ete consideres comme ayant eu une reaction douteuse a l'lntraderme tuberculinatlon de comparaison. 33. Les anlmaux destines au commerce Intracommunautalre seront soumis a une Intradenno-tubercullnatlon simple dans les trente Jours avant tout mouvement. Les anlmaux sur lesquels on observe une augmentation du pll de la peau de plus de 2 mm ou des signes c1lniques ne peuvent me admls dans les echanges lntraccmmunautaires. Les anlmaux provenant des cheptels vises au point 32 sous c) sont exclus des echanges Intracommunautaires Jusqu'a ce que I'etat sanltaire des aplrnaux qui y sont vises alt ete edalrd. ANNEXE C BrucelJose A. Sero-agglutination 1. Le serum agglutinant standard dolt etre confonne au serum etalon prepare par Ie Veterinary Laboratory, a Weybridge, Surrey, Angleterre. L'ampoule dolt contenir 1.000 unites intematlonales (UI)agglutinantes provenant de Ia Iyophillsatlonde 1 millilltre de serum bovln. 2. La foumiture du serum standard dolt etre assuree par Ie Bundesgesundheltsamt, a Berlin. 3. Le taux des agglutines brucelliques d'un serum dolt etre exprlme en unites Intematlonales par mlllllltre (par exemple: serum X = 80 unites internationales par millilitre). 4. La lecture de la sere-agglutination lente en tubes dolt se faire a 50 ou a 75% d'agglutlnatlon, I'antlgene utilise devant avoir ete titre dans des conditions Identiques en presence de serum standard. 5. L'agglutlnabillte des divers antlgenes a l'egard du serum standard dolt etre comprise dans les IImites suivantes: sl la lecture est fatte a sooAl: entre '/600 et '/,rm, sl la lecture est falte a 75%: entre 1/1f,o et '/750• 6. Pour la preparation de I'antlgene destine' a la sero-agglutination en tubes (methode rente), les souches Weybridge n? 99 et USDA 1119 ou toute autre souche de sensibillte equlvalente dolvent etre utlllsees. 7. Les milieux de culture utilises tant pour l'entretlen de la souche en Iaboratoire que pour Ia production de "antigene doivent etre choisls de manlere qu'ils ne favorisent pas la dissodatlon baeterienne (S - R); de preference, on do it employer la gelose a la pomme de terre. 8. L'emulston bacterienne dolt etre falte au serum physiologique (NaCi 8,5%0 pheruque a0,5 Ofo. Le formol ne dolt pas etre employe. 9. Les Instituts officlels lndlques d-apres dolvent etre charges du contrOle offlclel des antlgenes: a) Allemagne: Bundesgesundheitsamt, Berlin; b) Belgique: Instltut national de recherches veterlnalres, Bruxelles; c) France: Laboratolre central de recherches veterinalres, Alfort; d) Grand-duche de Luxembourg: Instltut du pays foumlsseur; e) ltalle: Istituto superiore dl sanltil, Rome; f) Pays-Bas: Centraal Dlergeneeskundlg Instituut afdeltng, Rotterdam; g) Danemark: Statens Veterinaere Serumlaboratorlum, Copenhague V; h) lrtande: The Veterinary Research Laboratory, Departement of Agriculture and Fisheries, Thorndale, Beaumont Road, Dublin 9; I) Royaume-Unl: Grande-Bretagne: lrlande du Nord: J) Grece: k) Espagne: I) Portugal: The Central Veterinary Laboratory, Weybrldge. Surrey, Angleterre, The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; Ktlniatrikon Institouton Umodon Ke Parasltikon Noslmaton lepa Odos, 75 Athenes 301; Centro Naclonal de Brucelosis de Murcia; Laborat6rlo Nacional de Investiga~o Veterlnana - Usbo.1. 216 10. Les antlgenes peuvent etre Iivres af'etat concentre pour autant que Ie faceeur de dilution a utiliser solt rnenuonne sur I'etiquette du flacon. 11. Pour effeecuer une stko-agglutlnation, on dolt preparer au molns trois dilutions pour chaque shum. Les dilutions du serum suspect dolvent etre effectuees de celie maniere que Ia leecure de la reaction aIa IImlce d'infeetion se fasse dans Ie cube median. En cas de reaction positive dans ce cube, Ie shum suspect contient donc au moins la quantlte de 30 unites incernationales agglutlnances par milltlltre. B. Reaction de fixation du complement; 1. Le serum standard est Ie merne que celul figurant ala presence annexe au point A 1. Outre sa ceneur en unites incernationales agglutinantes, 1 millilttre de ce serum bovln Iyophillse dolt contenir 1.000 unites sensibilisatrices assurant la fixation du complement. Ces unlces sensibillsatrices sont appelees unites CEe sensibillsatrices. 2. La foumiture du serum standard doit ctre assuree par Ie Bundesgesundheitsamt de Bertin. 3. Le taux d'un serum en anticorps flxateurs du complement dolt etre. exprlme en unites CEE senslbilisatrices (par exempfe: serum X =60 unites CEE sensibiltsatrices par millllltre). 4. Un serum contenant 20 unites CEE sensibiltsatrices ou plus (soit une activice egale a20%0 de celie du serum standard) par millilitre dolt etre c·onsidere comme positif. 5. Les serums doivent etre inactives de la facon suivante: a) serum bovin: 56 a 60° C pendant 30 a 50 mlnuces; b) serum pordn: 60° C pendant 30 aso minutes. 6. Pour la preparation de I'antlgene, les souches Weybrldge nO 99 ou USDA 1119 doivent etre udllsees. L'antlgene represente une suspension bacterienne dans un shum physiologique a0,85 % au dans une solution tampon veronal, 7. Pour effeceuer la reaction, II convlent d'utiliser une dose de complement superleure au minimum necessaire pour une hemolyse totale. 8. Lorsqu'on effeecue la reaction de fixation du complement, II est necessalre de proceder chaque fols aux contr61es sulvants: a) contrOle de I'effet anticomplementalre du serum; b) contr61e de l'anugene; c) contrOle des hernaues senslblllsees; d) contrOle du complement; e) contr61e a I'aide d'un serum posltlf, de la senslbllice au declenchement de Ia reaction; f) contr61e de la splkJficlte de Ia reaction a I'aide d'un serum negatif. 9. Lasurveillance et le contrOle offlclel des serums standard et des antlgenes sont assures par les organlsmes vises au point A 9 de la presence annexe. 10. Les antlgenes peuvent etre Iivres aI'etat ccncentre, pour autant que Ie faeteur de dilution a utlltser solt rnendonne sur I'etlquette du flacon. C. Epreuve de I'anneau 1. L'epreuve de I'anneau doit etre executee sur Ie contenu de chaque bidon de lait ou Ie contenu de chaque citerne a lait de I'exploitation. 2. l.'anngene standard autiliser doit provenir d'un des instituts nornrnes au point A. 9 a) a j). II est consellle de proceder a la standardisation des antigenes selon les recommandations de I'OMS/FAO. 3. L'antigene ne peut etre colore qu'a l'hernatoxyline ou au tetrazolium: il faut donner fa preference a l'hernatoxyllne. 4. Si aucune mesure de conservation n'est prise, la reaction do it etre pradquee entre la 18 m • et la 24 1nO heure acompter du prelevement de l'echannllon sur la vache, Si l'epreuve est effectuee plus de 24 heures apres Ie prelevernent de l'echanullon de lait, il faut assurer la conservation de celui-ci; les agents conservateurs pouvant etre utilises sont Ie formol et Ie chlorure mercurique et Ie delal dans lequel l'epreuve dolt etre effectuee apres I'utilisation d'un de ces deux agents conservateurs est de 14 jours suivant Ie jour du prelevernent, En cas d'utilisation de formol, la dilution finale dans l'echanullon de lait est de 0,2 %; la proportion entre la quanute de lait et la solution de formol do it etre d'au moins 10 a 1. A la place du formol, on peut utiliser du chlorure mercurique: la dilution finale dans Ie lalt est alors de 0,2 % et la proportion entre la quantlte de lait et la solution de chlorure mercurique de 10 a 1. 5. La reaction doit etre pratiquee selon une des methodes sutvantes: sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de haut et un volume de lait d'1 mi addiuonne de 0,03 ml d'un des antigenes standardises colores; ~ sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de haut et un volume de lait d'1 ml addluonne c. -..; 0,05 ml d'un des anrigenes standardises colores: sur une colonne de lait d'au moins 8 ml additionne de 0,08 ml d'un des anugenes standardises colores; sur une colonne de lait d'au moins 2S mm de haut et un volume de lait de 2 ml additlonne de 0,05 ml d'un des anugenes standardlses colores; 6. Le melange de lait et d'anugene doit etre mis aI'etuve a3 lOC pendant 45 minutes au moins et 60 minutes au plus. L'evaluation doit avoir lieu dans un delai de 15 minutes a compter de la sortie de I'etuve; 7. La reaction est appreciee selon les criteres suivants: 217 a) reaction negative: lait colore, creme decoloree; b) reaction positive: lait et creme colores de facon identJque ou lait decolore et creme ccloree. D. Epreuve a I'antigime brucellique tamponni l.'epreuve a i'anugene brucellique taponne peut etre reansee selon l'une des methodes suivantes a) Methode manuelle 1. Le serum standard est Ie deuxierne serum standard international contre I'avortement brucellique fourni par Ie Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Angleterre. 2. L'antigene est prepare sans reference a la concentration cellulaire, mais sa senslbilite doit etre eta/on nee par rapport au deuxierne serum standard international contre I'avortement brucellique de man/ere ace que I'antigene produise une reaction positJve pour une dilution de serum de 1: 47,S et une reaction negative pour une dilution de 1:55. 3. L'anugene est mis en suspension dans du diluant a I'antigene brucellique tamponne de pH 3,65 + 0,5 et peut avoir ete marque au moyen d'une teinture au rose de Bengale. 4. Pour preparer !'antJgene, utillser la souche nO 99 de Weybridge ou la souche USDA 1119 ou toute souche de senstbllite equivalente. 5. Les milieux de culture utilises pour conserver la souche en Jaboratoire et pour produire I'antlgene doivent ne pas provoquer de dissociation bacterlenne (S - R); utiliser de la gelose a la pomme de terre ou des methodes de culture continue. 6. L'antlgene est teste au moyen de 8 serums seches par precede frlgorlflque, dont on salt qu'Us sont respectlvement posltifs et negatlfs. 7. La surveillance et Ie controle offlclels du serum et de I'antlgene standard sont effectues par les Instituts offldels enurneres a /'annexe C point A 9. 8. L'antigime est fournl pret a I'emplol. 9. L'epreuve a I'antlgene brucellJque tarnponne dolt etre realisee de la manlere sulvante: a) mettre une goutte (0,03 ml) d'anugene et une goutte (0,03 ml) de serum sur une plaque blanche; b) aI'alde d'un agitateur melanger d'abord sur une IIgne drolte puis dans un mouvement circulalre d'un dlarnetre de 10 a 12 mm environ; c) agiter ensuite la plaque alternativement en avant et en arrtere pendant 4 minutes (environ 30 mouvements par minute); d) effectuer la lecture sous un bon eclalrage; en I'absence d'agglutlnation I'epreuve est eonstderee comme negative; toute agglutination permet de conslderer l'epreuve comme positive, amains que Ie sechage soit excessif sur les bords. b) Methode automatlsee La methode automatlsee doit etre au mains aussl sensible que la methode manuelle. E. Epreuve de l'anneau de lait effectuee sur Ie plasma sanguin 0) Obtention du plasma sanguin Les eprouveues contenant Ie sang rendu Incoagulable par ad/onction d'EDTA sont centrifugees pendant 3 minutes a3000 tours/minute et sont ensuite conservees pendant 12 a24 heures aune temperature de 370 C; b) Utilisation dlognostique On verse 0,2 ml de plasma stabilise dans une eprouvette contenant 1 ml de lait cru, Apres agitation, on a/oute une goutte (0,05 ml) d'antlgene ABR et on aglte anouveau. L'antigene est normalise d'apres un antigene standard mis a disposition par I'institut vise au point A 9 a). Apres avoir lalsse reposer pendant 45 minutes aune temperature de 370 C, on examine Ie resultat dans un delai de 15 minutes. L'epreuve est conslderee comme positive sl I'anneau de lalt pr~sente la meme coloration ou une coloration plus proncncee que celie de la colonne de lait. F. Agglutination du plasma sanguin Le plasma sanguln obtenu ccnforrnernent a 101 methode vlset! a la sectlon E point a) peut acre utilise tmmedlatemenr apres centrifugation sans qu'iJ soIt necessalre de proceder a une stabilisation thermlque. On melange 0,05 ml de plasma a1 ml d'anngene pour la sera-agglutination a50%, ce qui correspond aun degre de dilution de 1: 20 dans Ie cas de la sera-agglutination. On examine Ie resulcac apres avolr laisse reposer pendant 18 a 24 heures a une temperature de 370 C. L'epreuve est ccnslderee comme positive si I'agglutination est egale ou superleure a 50 %. G. Epreuve de micro-agglutination 1. Les dlluants sont composes d'une solution saline physlologlque a 0,85 % phenolee a 0,5 %. 2. L'antigene est prepare conforrnernenr aux Indications des points 6, 7 et 8 de I'annexe C point A et Ie titrage dote etre effectue conforrnernent aux indications du point A. 5 de I'annexe C. Au moment de I'utilisation de "antlgene, on ajoute de la safran/ne 0 a 0,02 % (dilution flnale). 3. Le serum standard est Ie merne que celul du point A.1 de I'annexe C. 4. La fournlture du serum standard dolt etre assuree par Ie Bundesgesundheltsamt, Berlin. 218 5. L'epreuve de mIcro-agglutination est prauquee sur des plaques comporunt des cupules a fond conlque et dont Ie volume est egal a 0,250 ml. l.'epreuve est executee de la rnanlere suivante: a) Predlluuons des serums: on ajoure dans chaque cupule contenant 0,075 ml de diluant 0,050 ml de chaque serum en examen. Les melanges sont agites pendant 30 secondes. b) Dilutions graduelles des serums: preparer au molns trois dilutions pour chaque serum. A cet effet, a partir des predtluucns (1:2,5) on preleve 0,025 ml de chaque serum et on les transfere sur une plaque contenant 0,025 ml de dtluant, De cetre rnanlere, la premiere dilution est portee ala valeur de 1:5 et les dllutlons suivantes sont effectuees par redoublement. c) AJout de l'antrgene: on ajoute dans chaque cupule contenant Jes dlfferentes dilutions des serums en examen de I'anugene a raison de 0,025 ml. Apres agitation pendant 30 secondes, les plaques sont ferrnees par leur couvercle respecuf et sont placees a 370 C pendant 20 a24 heures en atmosphere hurnldtflee. d) Lecture des resultats: on evalue I'aspect de la sedlmentauon de l'antlgene par un examen du fonds de la cupule reflechl par un mlrolr concave place au-dessous de celle-d. En cas de reaction negative, l'anugene forme des sediments sous forme d'un bouton compact, aux bords nets et de couleur rouge Intense. En cas de reaction posltlve, par contre, II se forme un volle diffus, de couleur rose et unlforrnernent repartl, Les dlffererus- pourcentages d'agglutlnatlon sont determines par comparaison avec des contr61es de l'anugene Indiquant 0,25, SO, 75 et 100% d'agglutlnatlon. Le titre de chaque serum est ex prime en unites Internatlonales agglt.:tlnantes par mi. II convlent d'inclure dans l'epreuve des contr61es a "aide de serum negatlf et de serum posltlf dilue de fa)on a contenir 30 unites Internatlonales agglutlnantes par ml. H. L'ipreuve EUSA de dipistage de Ia brucelIose bovine. dic:rn ararvlexe G. ANNEXE D Analyse du lait 1. Toutes les analyses de lalt dolvent etre effectuees dans des laboratolres offlclels ou ofllclellement agrees. 2. Les echanullcns de lalt dolvent etre preleves en observant les conditions sulvances: a) les rayons dolvent etre destnfectes au prealable avec de l'alcool a 70%; b) pendant leur rempllssage, les tubes dolvent etre malntenus en posldon lncllnee; c) les echanullons de lalt doivent etre preleves au debut de-la tralte, apres elimination des premiers jets de chaque trayon; d) un echanullon doit etre preleve sur chaque quartler; les lalts de ces echanullons ne peuvent pas etre melanges; e) chaque echantlllon dolt comporter au moins 10 millilltres de lalt; f) sl un agent conservateur est necessalre, on doit utlliser l'acrde borique a 0,5 %; g) chaque tube dolt etre munl d'une etiquette portant les Indications sulvantes: Ie nurnero de la marque aurlculalre au tout autre moyen d'ldentJflcatJon de "animal, la designation du quaruer, la date et I'heure du prelevernent: h) les echanullons sont accornpagnes d'un document qui dolt comporeer les IndlcatJons sulvantes: Ie nom et J'adresse du vetertnalre ofllclel, Ie nom et l'adresse du proprletalre, les elements d'ldencJflcatlon de I'anlmal, Ie stade de lactauon, 3. L'analyse du lalt dolt etre pradquee 30 lours au plus avantl'embarquement et dolt toujours cornporter un examen bactertclcgtque alnsl qu'un White-Side-Test (WST) ou un Glifomla-MastJcJs-Test (CMI). Les resultats de ces deux examens dolvent etre negatlfs, sous reserve des dlsposlcJons sulvantes. a) SI Ie resultac de I'examen baeterlologique est poslcJf - rneme en I'absence d'un etat intlamn caracterise - alors que Ie resultat du WST (ou du CMT) est negacJf, un second examen bacterial dolt etre effectue au moins 10 jours plus tard - dans 101 limite de 30 [ours prevue cl-dessu Ce second examen dote etabllr: aa) 101 dlspositlon des gennes pathogenes; bb) l'absence d'antibiotJques. En outre, I'absence d'etat Inflammatolre dolt etre consratee par un nouveau WST (au un nouveau CMT) qui doit donner un resultat negatlf. b) Si l'examen bactertologtque est negatif, alors que Ie WST (ou Ie CMT) est positJf, on doit proceder i un examen cycologique complet qui dou donner un resultat negatif. 219 4. L'examen bactertologique dolt com porter: a) I'ensemencemenc du laic, en boice de Petri, sur gelose au sang de boeuf ou de mouton; b) I'ensemencemenc du lait en milieu TKT ou en milieu d'Edwards. L'examen bacteriologique doit viser aJ'ldentifkation de tout germe pachologique ec ne peut se limiter ala mise en evidence de strepcocoques et de scaphyiocoques speciflquement pathogenes, Dans ce but, I'identiflcadon des colonies suspecees obtenues par ensemencement sur les milieux precites doit ecre poursuivie par les techniques cJassiques de dlfferenciauon de Iabacteriologie, telles que I'emploj du milieu de Chapman pour I'identiflcation des scaphylocoques et de divers milieux selecufs pour la detection des enterobacteries. 5. L'examen cytologique complec est destine amettre en evidence, Ie cas echeant, un etat inflammatoire caracterise, independamrnenc de tout sympt6me dinique. Cet etat inflammatoire est ecabli lorsque 13 numerotadon leucocytaire seJon la technique de Breed atteint 1 million de leucocytes par millilitre et que Ie rapport entre rnononucleatres et polynucJe.aires esc inferleur a 0,5. ANNEXE E Sont soumises a declaration obligatoire les maladies suivantes: a) maladies de l'espece bovine: rage, tuberculose, brucellose, flevre aphteuse, charbon bacteridlen, peste bovine, peripneumonie, leucose bovine enzooclque; b) maladies de l'espece porcine: rage, brucellose, charbon bactendlen, flevre aphteuse, pesce porcine classique, peste porcine africaine, maladie vesiculeuse du pore, paraJysie contagieuse des pores (maJadle de Teschen). ANNEX:c: F Des ITlC>deles de certificats soot mis 0 Ia disposition des interesses par rAdminis1ration des services vet6rinaires. ANNEXE G .CHAPITRE PREMIER CHEPTELS, ~TATS MEMBRES OU R£CIONS INDEMNE5.DE LEUCOSE BOVINE ENZOOTIQUE A. Cheptel indemDe de Ieucose bovine eRZoouque: 1) un cheprel dans lequcl: i) aucun C;lS de leucose bovine enzootlque D';I ere mis en evidence, que ce SOil cliniquement au ~ 1;1 suile de J'un des [eSlS praliques con{ormemeRl"llu chapitre 11, ni c:onfirme au courl des deux demi~rel annees et 220 ii) rous les animawe de plus de vingt-quarre mois ont lInu!ricuremenr rl!agi n~atiycment au COW'l des douse derniers rna is ~ deux rests prariqul!s ccnforrnemenr ~ la prl!sente annexe, ~ un interva1le de quarre mois au mains er iii) apres achevemenr des rcsts Vilil!S au point ii), ne se trouvent plus que les animaux qui y sont nl!sau qui provienncnt d'un cheptel indemne de leucose bovine enzcorique, ee dans lequel, apres sa qualification, les animaux de plus de vingt-quarre mois ant continue de reagir n~ativement ~ I'un des tesrs prariqul!s confcrmemene au chapitre II ~ un intervalle de trois ans et Ics conditions prl!vues aux points i) er iii) conrinuenr d'erre remplics; 2) un cheptel sirue dans un ~rar membre au une n!gion indemne de leucose bovine enzcorique. B. ttat membre au rl!gion indemne de leucose bovine enzoorique . Un ~tat membre au une rl!gion au sens de l'arricle 2 point 0) de cet trar membre: 1) dans lequel au laqueUe: a) au moins 99,8 % des cheprels bovins sont des cheprels indemnes de leucose bovine enzootique au sens du poinr s) au b) d'une part, au cours des cinq dernieres annces prcccdant la dare de notification de la prcsente directive au au cours des rrois dernieres annces apres certe dare, aucun cas de leucosc bovine enzootique n'a l!tc norific ni confirmc de quelque maniere que ce soir er, d'aurre part, au cours des deux dernieres annces: i) les conrr61es alcatoires prariqucs sur rout le territoire con[ormcment au chapirre II er eEEectul!s pendant une periode de deux ans sur tousles animaux de plus de vinst·quarre mois dans au mains 10 % des cheprcls ant donne des n!sultals negatils er ii) tousles animaox de plus de vingt-quatre mois ant rl!agi ncgarivement au moins une Eois~ I'un des lesrs pn!vus au chapitre II; 2) dans lequel au laquelle, aprl:s avoir satisEait aux conditions prl!vues au point 1): i) chaque annl!e, soit un l!chanrillon a1l!atoire donnant un taux de eernrude de 99% a dl!monue que moins de 0,2 % des cheprels craient in[ecrcs, soit au mains 20 % des bovins de plus de dewe ans a donnl! un rcsuhat ncgalii ~ un des leSIS pratiques conformemenr au chapitre II et ii) les condirions cnoncces au point AI) sont toujours rem plies. C. Suspension du staNt d'indemae apres I'apparilion de la leucose 1) Au cas au, dans un eheprel indemne de leucose bovine cnzoorique, un animal a rl!ap posirivement ll'un des resll vises sous ii), Ie starur de ce cheprel est suspendu jusqu'~ ce que les mesures suivantes aienr erl! prises: i) I'animal ayant reagi positivement er, s'i!s'agit d'une vache, son l!ventuel vellUdoivent quirter Ie cheptcl pour abareage, .ous contr61e des aurorirCs vctl!rinaire.; ii) Jcs animaux reSlantS ant ele soumis avec un resullat negaliC1 un lcst sbologique individuel c:ffeaui conformcment au chapilre II crois mois au mains apr~s climination de J'animal positiC ct de sa descendance cvenruelle; III} une enquele ep,uemlologlque doir hre mence et les chcprcls cpidcmiologiquement relies au cheptel infectl! doivent erre soumis aux mesures prcvues sous iiI, Tourelois,I'auroriu! compclellle peur :JccorJer une derogation 1ll'oblig.llion d'abanage du veau d'une vache infecrce lorsque ce veau a ele sep;are .Ie s:amhe apres vcl:age. Dans cc c:as, Ie veau doir crre soumis :lUX exigenccs prevues au paine 2 sous iiI. 2) Au cas au plus d'un animal d'un cheplel indemne de:leucolC bovine enzoorique a rl!agi posirivemenr, Ie srarut .Ie ce cheprel esr suspendu jusqu'll ce que les mesures suivllnres aient crc prises: i) les animaux infectcs cr, s'i1 s'agir d'une vache infectte - sauE dl!rog:lrion accordce par I'aurorirl! compClente conformemcnt au poinr 1) sous iii) deuxieme alinca -, leurs veaux l!venruc:ls duivent qui ncr Ie cheprel pour ab:luage sous cOlllr61e des lIuroritcs vcrcrin:aires; ii) les animaux resrants - y indus, te c:asechCanr.Ies vC:Jux dcs anill\:Jux infccres - de mains de six mois duivenr, apres idenlificarion, resrer sur I'exploiration jusqu'll ce qu'i1s aienr salisfair aux rcsrs visl!sau point AI) sous ii); iii) Ie cheplel doir resrer sous conrr61e oCficicl jusqu'a ce que les condilions prl!vues aux poinrs AI) sous ii) er iii) soienr ~ nouveau remplies; iv) une enquere cpidcmiologique doir crre menee er les cheprels cpidcmiologiquement relil!s au cheptel infecte doivent crre soumis au mesures prevues au point AI) sous ii). 221 3) Au cas au la leucose bovine enzootique a ete conSlatee ee confirmee sur plus de 0,2 % des cheptels de I. rcgion au de I'£tat membre, le srarur de eene rCGion au de cet £tat membre cst suspendu er, outre les mesures prevues 3UX points 1) au 2), 20 % de:s aurres cheptels de 101 region ou de I'Etat membre doivent, d..ns les deJais prevus au poinr AI) sous ii), etre soumis ~ un des tests prevus au chapiue II. Le sratut est rerabli lorsque, apres achevement des mesures prevues sous les points precedenrs, un resultar negari! aux tests qui y sont prevus a etc consrare», CHAPITRE 11 Eprewes pour Ia recherche de Ia leucose tx>vine enzootique et de Ia brucellose bovine L~ recherche de b leucuse bcvine euzocrique cst e((":lu~C au moyen <lc l'cprclIvc J'imlllulloJi((u.ion <I~ns Ics ccndirions <lc!criles aux puinlS A cC Dci·,p,b ou p,r l'tl'rellve d'lmmunc-absorpcion enzym..tique (ELISA) dans lu conditions d~crices au PUiOl C ci-apres. La merhode o'illllnullnJi((usion eSI rc.<:fVCe :lUX le,lS illJividuels. 5i IUlcsullau des leslS (uOlI'ouicc J'une COlllcscaliun mOlivce, un cnnrr61e compl~mcOlaireeSlpuciquc au moyen d'une cprcuvc d'Iuunuuodiffusion, A. £prcuvcs o'immunndiffusion sur plaque de l;Hosc 1. L'ancig~ne.\ uriliaer dans cerre CplCUVC duic coruenir Jes l;lycoprocciucs du virus de: la leucose bovine. L'anlil;tnc <loil elrC Slandardisc par rappOll i un .crum tlalon (strum E I) (ourni p'" Ic51a1CI.. Vecerina.,e Serum Laboraror ium de Copeuhague, 2. Lcs inSlicuu d'£cau dcsil:ncs ci-apr~s doivenr acrc charg~s d'cllllonncr I'anrig~ne sundard de travail du laboraluire par rappoll au serum c(alon officiel CEF. (scrulII E I) lourni par le SIJICnS VClcrinJrfc Serum Labcraroriurn de Copenhague, ~) Allemague (RF); b) Belgiquc: c) Frances d) Cund·duche de Luxembourg: c) hJlle: () Pays·Das: g) Oanemark: h) lrlande. i) Ray,ume-Uni: I. Crande·firelagne: 2. lrlande du Nord: j) EspJl:llc: k) Portugul: DUllu<s(nrschunr.sansl,1l (ur Vlrusknnkhcilcn der Tiere, Tubin,en; fnslilul nalional de recherchcs veccrinaire., Druxdles; Laboraroire nalional J("P3lhulogic hovine, Lyon; ("iIIlIO Zooprofilaerico Sl'erimenc.>le, Pcrucia; Cenrraal Diergeneeskundig (nsliruut. ,{ddillll Roerctd ..mi Slalcns Vererincere Serum Laborurcrium, Kuuenhavni VClerinary Research L:ll>orarary, Abborsrown, Publini Cenrral VCI"rill:lry Laborarory, Wcyuridge, EnlllanJ, Velerinary RcseJt.:h Laborarory, Slormont, Bellasl, Subdirecci6h general de sanidad animal. Laborarorlo de sanidad y prcduccion animal ALGETE (l\'l:cdrid) •• Laborarorio Nacional dc InvesliGa~30 VClcrinaeia, Lisboa, 3. Les :lnlillenes tl:llons ucilises au Iubcraroire doivcnc tICe prescntS au mains une lois par an 3UXl:cboralaires ue rU~rcnce C£E enUlI\creS:lU p:crar.raphe 2 d·Je'sus (lour y ecre leSleS p:cr rapl'0Cl JU serum tlalon CEF.. Indc!pcndllmll\cnc de CClle Slalldardisalion, 1':lllIil:tne ulilise peut hre: tlalonlle con(ormcmenc ~ 101 lellrc D. 'I. l.'~l'reuvc meC en a:uvre les rC:lcli(s suivanls: a) ,nrill~ne: 1':lnciG~ne Jail contcnir de. Glycoproleine:. specifiqucs du viru. dc leucose bovine elLlooliquc qui a Cle Sl3ndardisc par rapl'01l au scrum officid CEE; b) Ic scrum 11 ICSlCr; c) un scrum dc camr61e pasili'{ cannui J) gclosci 0,8% :Icar 8,5 % NaCI lampon Tei, 0,05 M, pH 7,2 15 millilicrca de ccere Gelosc doivent hrc clluICs dan. une bulle de Petri de 8S millimtlrca de diamttre, ce qui donne unc prolandeur de: 2,6 millilll~lresde gelose, 222 5. Un disrositi( experimenral de sept loges exempIes d'humiJile Joit Clre re:alise p;At perCor:uion de la gelose [usqu'au (and de 1:1 plaque; ce reseau con-iSle en une lo\:e centrale au lour de bquelle s'oedcunem six 101l"S peripheriques disrosees en cerele, Diamclre de la loge cemrale: " millim~lres Diamerre des laces periphcri'lues: 6 millimhre:r Dislance entre les 10lles cenrrales cr peripheriques: J millirn~rres 6. La loge centrale doit clre remplie de I'anrigcne ctalon. Les loges periphcriques 1 er " (voir schema ci-dessous) sam rem plies avec le serum posirif connu,les loges 2, J, 5 er 6 avec les serums a rester. Les loges doivent ttrc empties jusqu'b, disparirion du menisque, I o 60 50 7. Les quanriles obtenues sane les suivanles: o o 4 02 OJ anrigene, serum de conrr6le: serum a tester; J2 microlirres, 7J microlirres, 7J microlirrcs. 8. L'ineubaeion doir durer 72 heures a temperature ambiante (20·27°C) dans une enceinte humide fermee, 9. L'epreuve peur hre lue apres 24 heures, puis arrh 48 heures, mais aucon resultat final ne peut crre obrenu avant 72 heures: a) un serum arester ~st positif s'il forme une caurbe de preciphation, speciflque avec I':lntigcne du virus de la leucose bovine et si cerre courbe coincide avec celle du serum de conrrele; b) un serum a rester est neg:uif s'i1ne donne pas une courbe de precipitanon specifique AvecI'anligcne du virus de la leucose bovine ee s'il n'inllCchir pas la courb~ du serum de conrrele; c) la reaction ne pourrair ctre consiJeree comme concluame si: (i) elle inflechill:a courbe du serum de conrrule vers la loge de I'antigcne du virus de la leucose bovine salis former une courbe de precipitation visable avec I'antigene ou (ii) s'il n'est pas possible de I'inrerpreter comme negative ou comme positive. Pour les rcactians non concluanres, all peur repeler ('cpreuve er utiliser du serum cancentre. B. Methode de slandardisation de I'an.igene Solutions d matlriels nlcessai,es 1.. 40 millililres de gclose a 1,6% dans un tampon Tris 0,05 M/HCI, pH 7,2 avec g,5% de NaCI; 2. 15 millilitres d'un serum de leucose bovine n'ayanr d'anticorps qu'a I'cgard des glycoproteines du virus de la leueose bovine, serum dilue au 1/10 dans un tampon Tris 0,05 M/HCI, pH 7,2 avec 8,5 % de NaCI; 3. 15 millilicres d'un serum de la leucose bovine n'ayanr d'anricorps qu'a I'egard des glycoproteines du virus de la leucose bovine, serum dilue au 11lS dans un tampon Tris 0,05 M/HCI, pH 7,2 avec 8,5% NaO; 4. quaere boires de Perri en matiere plastique, d'un diamctre de 85 millimetres; 5. un poinccn d'un diamctre de " a 6 millimetres; 6. un antigcne de reference; 7. I'antigcne a seandardiser; 8. un bain d'eau chaude (56°C). Mode opiratoi,e Dissoudre la gelose 0,6 "10) dans le tampon Tris/HCI en chauffant avec precaution jusqu'a 100 °C. Menre en place Ie bain d'eau a 56°C pour environ 1 heure. Placer en outre les solutions du serum de I:a leueose bovine dans le bain d'eau 1 56°C. Mel anger ensuire IS millilirres de la solution de gelose a56°C avec les 15 millilitres de serum de la Ieucose bovine (1:10), agirer rapidemenr ee verser dans deux boires de Perri, 1 raison de 15 millilicres par boite. Recommencer les operations precedemment decrites avec Ie scrum de la leucosebovinc dilue au 1/5. 223 Lorsque I. gelose a durci, les frous y sont pratiques de la maniere suivante: Boi/II de PeITi nO 1 Serum 1:10 a A Boi/II de Petri nO J SCrum'l:S a Ii 000 C 0 E Bolt« de Petri n" 2 Serum 1:10 Addition d'ant;getles I. Bohes de Petri 110 • 1 er J: loge A loge: B loges C + E log" 0 aurlgene de reCCrence non dilue, = anligene de rCCc!rence diluc 11 112, = amigencs de reference, = ..nligen"s alcslcr, non dilue, II. Bailes de Petri n'" 2 er 4: loge A loge B loge C loge 0 = anligelle Ii tester, non dilue, = anrigene Ii rester, diluc a 1/2, = antigene II rester, diluc :& 1/4. = antigene::& rester, diluc :& 1/8. Diarnetre 224 Instructions comfJlemenlaires 1. L'experience doit erre effectuee avec de:ux degrcs de: dilution du serum (l:S er 1:10) afin d'obtenir 1:1 I'rccipir;uion optimale:. 2. Si le diafll~lre: de- pr!!cipilarion est rrep (:Jible pour chacun des deux degr!!s de dilurion, le s!!rum doit Iaire I'objet d'une dilution supplcmenraire. 3, Si le diamerre de precipirarion e:sr excessif pour les deux de:grcs de dilution ee si Ie: prccipitc disparah, un degrc de dilurion plus (aible: doit erre:choisi pour Ie serum, 4. La concemration finale de: la gelose doit s'clablir ~ 0,8 % er celle des scrums a S% e:r ~ 10 % respecrivemenr, S. Norer Ie:s dlamerres me:surcs dans le sysr~me: ecordonne suivanr. La dilurion de travail est celie: ou on enregisrre: le meme diametre pour I':mris~ne 11 rester que pour I'anrigl:ne de rcfcrence. mm 13 12 11 10 9 8 7 6 s 3 2 1:1 1:2 1:4 1:8 Dilutions des antigtnes 225 c. Epreuve d'imrnuno-absorprion enzymarique (ELISA) pour I;> recherche de ':I Ieueose bo~ine enzoocique I. Pour la rnerhode ELISA, les materiels ei reactifs 3 uriliser sonc les suivanrs: a) des microplaques pour phase solide, des cuvettes ou lOUIe autre phase solide; b) I'anrigene est fix': sur 1'1 phase solide avec ou sans l'aide d'anucnrps de caprage pulyclonaux ou monoclonaux, Si l'aurigene cst associe direcremenr ~ I;> phase solide, to us les ech:lIuilions soumis ~ l'exarnen preseneanr une reacrion pusilive doive"t etre reex;,unines par rappore ~ I'antigene de concrole. Celui-ci devrair erre idernique ~ l'antigene examine, sauf en ce qui coucerne les antigenes BlV. Si Jes anricorps de:caprage sonr associes ~ la phase soliJe,!es amicorps ue Joivent pas reasir 3 Jes anrigenes aurres que les anrigenes BlV: c) le liquide biologique a examiner (serum ou lair); J) un conrrole positif ec nes:ltif: c) le conjugue: une immunoglobine ancibovine bintinyl':e ou enzyme conjuguee ou une imrnuncglobine biminylc:e ann illV uu une enzyme conjuguee; £) l'avidine: une enzyme pour essais utilisallC des prepuranuns J'immulloslohines biutin)'I':es; g) un subsrrar adapte 'lUX enzymes urihsees; h) une solution d'obeurarion; i) des solutions tampons pour I;> dilution des echannllons examines, I;> preparation des reaaifs ee le lavage; j) un sysreme de: lecture avec fillres appropries correspondant au substrar utilise. 2. I1prcullc de standardisation et de: sensibi/ite La sensibilile du lest ELISA doir etre d'un niveau tel que Ie: serum E .. presenee une reaction posmve lorsqu'il est dilue 10 fois (echanrillons de serum) ou 250 fO,is (ech:2IItillons de lait) plus que la dilution obrenue a partir d'echanriilons mis en commun. lars d'essais ou les echannllons (serum er laic) sonr examines individue:lIe:mcnt,le: serum E 4, dilue 3 r:lison de: 1 pour 10 (serum neg,ui£) ou iI raison de 1 pour 250 (laic negalif) doir preseneee une: reaction posicive:, lorsqu'il esr examine dans I~ merne dilurion d'essai que: celle urilisee pour lcs e:ssau inJividuels. Le serum E 4 sera fourni par Ie laboratoire veterinair" naeionai de Copenhague:. 3. Conditions d'utilisation du test ELISA La methode ELISA peur etre urilisee sur un echanrillon de I:lit preIeve sur la collecre de laic prove:nanc d'une: exploitation comprenane au mains 30 % de vaches laiciercs en Iacranon ~ la condition que I'cch:lncillon porte sur le lair produic par moins de 50 vaches er sur une concentrarion du lacroserum du laie cellecte sur un norubre de vaches cornpris en Ire 20 er 50 au maximum ec que.Iorsque la colleere de lait porte sur plus Je: 50 vaches, Ie: nomhre de prelevernenes soit augmenee proporrionnellemenr. l:l melhude: ELISA peut egalemel1t eIre ucilise:c sur un e.::hantillon de sang prelevci sur un maximum de: 50 :lnimaux. En c;>s de: recoun a l'une: des facultc!s precitees, des mesurc:s doivenc eIre prises pour assure:r une: correspondance encre les echaneillolls prdeves cr Ics animaux donr proviennent Ie lair examine ou in serums. En cas de result:lt posieif 5ur I'un des echantillolls, Ie chepcd doit resce:r sous concrole: officid jusqu'a ce qu'un resultat negatif ;liepu ctre enregistr': puur au mains deux tests individuds e£fc:etues, ~ un incervalle: de qU:lcre mois minimum, sur 10US les bovills 31leS de: plus Je six mois, conformemenc 'lUX dispositions precitees, eC dans un laboraloire directemenc sllpervise par un labor:ltoire me:ntionn': au point A••