Arrêté ministériel fixant les méthodes d'analyse pour la détermination officielle de la qualité et de la composition du lait fourni aux acheteurs

14 OCTOBRE 1994. - Arrêté ministériel fixant les méthodes d' analyse pour la détermination officielle de la qualité et de la composition du lait fourni aux acheteurs. (NOTE : Consultation des versions antérieures à partir du 02-12-1994 et mise à jour au 27-09-1997) CHAPITRE I. - Détermination de la qualité du lait. Article 1. § 1. La méthode de référence pour la détermination de la qualité bactériologique est le comptage sur plaque à 30 °C, décrite à l' annexe 1. § 2. La détermination de la qualité bactériologique peut également s' effectuer selon : la méthode Plate-Loop, décrite à l' annexe 2; la méthode Roll-Tube, décrite à l' annexe 3; la méthode Pétrifilm, décrite à l' annexe 4; la microscopie par épifluorescence, décrite à l' annexe 5. Art. 2. Les méthodes de référence pour la détermination du titre en cellules somatiques sont : la méthode microscopique, décrite à l' annexe 6; la méthode fluoroptoélectronique, décrite à l' annexe 7. Art. 3. L' appareillage utilisé dans le processus de la détermination de la qualité bactériologique (germes) et du titre en cellules somatiques dans le lait, doit être préalablement agréé par le (Service Productions laitière et avicole.) <AM 1997-08-29/37, art. 1, 002; ED : 27-09-1997> Tout achat de nouvel appareillage doit être signalé préalable au service susmentionné. Celui-ci émettra un avis après consultation d' une institution scientifique compétente. Art. 4. § 1. A partir du 1er octobre 1994, les substances inhibitrices sont détectées de la manière suivante : 1° Une épreuve de sélection est effectuée selon la méthode A1 ou A2 de l' annexe 8 sur les échantillons à examiner. 2° Tous les échantillons, qui ont présenté un résultat positif ou douteux lors de l' épreuve sous 1°, sont soumis à une épreuve de confirmation selon la méthode B1 ou B2 de l' annexe 8. 3° Pour les échantillons qui lors de l' épreuve de confirmation visée au point 2° ont donné un résultat positif, on examine la présence de sulfonamides selon la méthode B3 ou B4 de l' annexe 8. 4° L' analyse des échantillons qui ne contiennent pas de sulfonamides selon le point 3 est poursuivie pour déterminer la présence de penicilline ou d' autres substances inhibitrices selon la méthode B5 de l' annexe 8. § 2. Jusqu'au 30 septembre 1994, les substances inhibitrices sont détectées par une méthode au Streptococcus thermophilus, décrite dans la circulaire n° 13. Art. 5. <AM 1997-08-29/37, art. 2, 002; ED : 27-09-1997> § 1er. La méthode de référence pour la détermination du point de congélation est la méthode cryoscopique (à l' aide d' un cryoscope à thermistance) décrite à l' annexe 9, point A. § 2. Une méthode de triage basée sur la spectrophotométrie dans l' infra rouge moyen est autorisée pour autant qu' elle soit calibrée selon les résultats de la méthode de référence. Tout résultat supérieur ou égal à la limite de triage fixée à l' annexe 9, point B doit être confirmé par la méthode de référence cryoscopique. L' appareillage utilisé doit être préalablement agréé par le Service Productions laitière et avicole. Tout achat de nouvel appareillage doit être signalé au préalable au service susmentionné. Celui-ci émettra un avis après consultation d' une institution scientifique compétente. Art. 6. L' examen de la propreté visible du lait est effectué par une épreuve de filtration selon la méthode décrite à l' annexe 10. Art. 7. La recherche de l' absence de traces de désinfectants est effectuée selon la méthode décrite à l' annexe 11. CHAPITRE II. - Détermination de la composition du lait. Art. 8. La méthode de référence pour la détermination de la teneur en matière grasse du lait entier et du lait écrémé est la méthode Röse Gottlieb, décrite à l' annexe 12. Art. 9. La méthode de référence pour la détermination de la teneur en protéines du lait et du lait écrémé est la méthode Kjeldahl, décrite à l' annexe 13. Art. 10. La méthode de référence pour la détermination de la teneur en matière grasse de la crème est la méthode Röse-Gottlieb selon la norme belge NBN V21-001, 3° éd., 1988. Art. 11. La méthode de référence pour la détermination de la teneur en protéines de la crème est la méthode Kjeldahl selon la norme belge NBN V21 003, 2° éd., 1987. Art. 12. A une grande échelle la détermination des teneurs en matière grasse et protéines peut également s' effectuer selon la méthode de détermination par photométrie dans le spectre infrarouge, moyen, décrite à l' annexe 14. Art. 13. Pour exprimer les teneurs matière grasse et protéines en grammes par litre, comme fixé à l' article 1, 3° de l' arrêté ministériel du 17 mars 1994 relatif à la détermination officielle de la qualité et de la composition du lait fourni aux acheteurs, les résultats des méthodes de référence, exprimés en grammes par 100 g de lait, doivent être multipliés, en principe, par la masse volumique de l' échantillon de lait concerné. La méthode de référence pour la détermination de la masse volumique est celle décrite à l' annexe 15. Art. 14. L' appareillage utilisé pour la détermination de la teneur en matière grasse et protéines doit être agréé au préalable par le (Service Productions laitière et avicole). <AM 1997-08-29/37, art. 3, 002; ED : 27 09-1997> Tout achat de nouvel appareillage doit être signalé au préalable au service susmentionné. Celui-ci émettra un avis après consultation d' une institution scientifique compétente. Art. 15. Le présent arrêté produit ses effets le 1er juillet 1994. Bruxelles, le 14 octobre 1994. A. BOURGEOIS Annexes. Art. N1. Annexe 1. Dénomination des micro-organismes - Comptage sur plaque à 30 °C. Art. 1N1. 1. Définition. Par " micro-organismes ", on entend tous les organismes formant des colonies comptables après une incubation en aérobiose dans les conditions opératoires décrites. Art. 2N1. 2. Principe. Mélanger un volume déterminé d' échantillon de lait au milieu de culture dans les boîtes de Pétri et laisser incuber à 30 °C pendant 72 heures. Compter les colonies et calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé ou par 0,1 millilitre de lait stérilisé ou UHT préincubé. Art. 3N1. 3. Appareillage et verrerie. Matériel courant de laboratoire, et notamment : 3.1. Appareillage. Four à air chaud, réglable à 170-175 °C; Autoclave, réglable à 121 °C; ¦ - Etuve, réglable à 30 +/- 1 °C; ¦ - pH-mètre, avec correction de température, sensible à 0,1 unité de pH ¦près; ¦ - Bain d' eau réglable à 45 +/- 1 °C; ¦ - Loupe de grossissement 2-4x; ¦ - Loupe de grossissement 8-10x; ¦ - Compteur enregistreur; ¦ - Agitateur capable de mélanger 1 ml de l' échantillon de lait ou d' une ¦dilution décimale avec 9 ml de diluant et dont le principe de ¦fonctionnement est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu du ¦tube à essai. ¦ 3.2. Verrerie. ¦ - Tubes à essai avec bouchons appropriés et de capacité adéquate pour ¦contenir, avec un espace suffisant permettant une agitation convenable, 10 ¦ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes. ¦ - Fioles de 150 à 250 ml de capacité ou tubes de 20 ml de capacité ¦environ pour contenir pour contenir le milieu de culture. ¦ - Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matériau synthétique ¦stérile, non ébréchées, de 1 ml de capacité nominale, avec un orifice d' écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre. Boîtes de Pétri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent incolore, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur d' environ 90-100 mm. La profondeur intérieure doit être d' au moins 10 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité susceptible de gêner le comptage des colonies. Stérilisation de la verrerie. La verrerie doit être stérilisée par l' une des méthodes suivantes : a) au four à air chaud, à une température de 170 à 175 °C pendant 1 heure au moins; b) à l' autoclave, à une température de 121 +/- 1 °C pendant 20 minutes au moins. Dans l' autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur; si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles doivent être desserrés. Faire sécher la verrerie stérilisée à l' autoclave afin d' éliminer la vapeur. Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud. Art. 4N1. 4. Milieu de culture - Comptage des germes du lait sur plaque de gélose. 4.1. Composition. Extrait de levure : 2,5 g. Tryptone : 5,0 g. D(+) Glucose ou dextrose : 1,0 g. Poudre de lait écrémé : 1,0 g. Agar-agar : 10 à 15 g suivant les propriétés gélifiantes de l' agar-agar. Eau : 1 000 ml. La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices, ce qui sera vérifié à l' aide de tests comparatifs réalisés en utilisant une poudre de lait écrémé reconnue exempte. Préparation. Mettre en suspension en dissolvant, dans l' ordre, l' extrait de levure, la tryptone, le glucose et, enfin, la poudre de lait écrémé, dans l' eau. Le chauffage de la suspension facilite l' opération. Ajouter ensuite l' agar-agar et porter à ébullition en agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète de l' agar-agar ou chauffer à la vapeur pendant 30 minutes environ. Filtrer sur papier filtre, si nécessaire. Verifier de pH à l' aide d' un pH-mètre; si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d' hydroxyde de sodium ou d' acide chlorhydrique de sorte qu' il soit, après stérilisation, de 6,9 +/ 0,1 à 25 °C. 4.2. Répartition, stérilisation et conservation du milieu de culture. Répartir le milieu par quantités de 100 à 150 ml dans les fioles ou de 12 à 15 ml dans les tubes. Boucher les fioles et les tubes. Stériliser à l' autoclave à 121 +/- 1 °C pendant 15 minutes. Vérifier le pH du milieu. Si le milieu de culture n' est pas utilisé immédiatement, le conserver à l' abri de la lumière entre 1 et 5 °C pendant un mois au maximum après sa préparation. 4.3. Milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Le milieu de culture peut être préparé avec un milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Suivre les indications du fabricant, mais ajouter la poudre de lait écrémé avant la dissolution si elle n' entre pas dans la composition du produit. Ajuster le pH à 6,9 +/- 0,1 à 25 °C (selon le mode décrit en 4.1) puis ¦répartir, stériliser et stocker le milieu selon les indications données en ¦5.2. ¦ Art. 5N1. 5. Diluants. ¦ 5.1. Solution peptone/sel. ¦ Composition. ¦ Peptone : 1,0 g ¦ Chlorure de sodium (NaCl) : 8,5 g. ¦ Eau : 1 000 ml. ¦ Préparation. ¦ Dissoudre les composants dans l' eau, en chauffant si nécessaire. ¦ Vérifier le pH avec un pH-mètre; si nécessaire, ajuster le pH en ¦utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d' hydroxyde de sodium ou d' ¦acide chlorhydrique, de sorte que, après stérilisation, il soit de 7,0 +/ ¦0,1 à 25 °C. ¦ 5.2. Répartition, stérilisation et conservation du diluant. ¦ Répartir le diluant dans les tubes à essai en quantité telle que, après ¦stérilisation, chaque tube contienne 9,0 +/- 0,2 ml de diluant. Boucher les ¦tubes. ¦ Stériliser à l' autoclave à 121 +/- 1 °C pendant 15 minutes. Vérifier le pH du diluant. Si le diulant n' est pas utilisé immédiatement, le conserver à l' abri de la lumière entre 1 et 5 °C pendant un mois au maximum après sa préparation. 5.3. Diluants complets déshydratés du commerce. Les poudres comprimés déshydratés vendus dans le commerce peuvent servir à la préparation du diluant. Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH selon le mode décrit en 5.1 et répartir, stériliser et stocker les diluants selon les indications données en 5.2. Art. 6N1. 6. Mode opératoire. 6.1. Fusion du milieu. Avant de procéder à l' examen microbiologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu nécessaire et refroidir le milieu à 45 +/- 1 °C au bain d' eau. 6.2. Préparation de l' échantillon de lait. Mélanger convenablement l' échantillon afin d' obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l' échantillon. Eviter la formation de mousse ou laisser la mousse se disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d' essai ne doit pas dépasser 3 minutes. 6.3. Préparation de la première dilution (10-1). Transférer à l' aide d' une pipette stérile 1 ml de l' échantillon de lait (6.2) dans 9 ml de diluant (5.1) en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. La température du diluant doit être sensiblement la même que celle de l' échantillon de lait. Mélanger soigneusement cette première dilution à l' aide de l' agitateur pendant 5 à 10 secondes. On obtient ainsi une première dilution 10-1. 6.4. Préparation des dilutions décimales suivantes. Transférer, à l' aide d' une pipette stérile, 1 ml de la première dilution (6.3) dans 9 ml de diluant (5.1) en suivant les indications données en 6.3. On obtient ainsi une dilution 10-2. Répéter ces opérations pour obtenir les dilutions décimales suivantes jusqu'à obtention du nombre adéquat de micro-organismes (7.1). 6.5. Inoculation des boîtes de Pétri. Transférer, à l' aide d' une pipette stérile, 1 ml de l' échantillon et/ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte. L' analyse doit porter sur l' examen d' au moins deux dilutions. Pour chaque dilution (7.1), préparer une boîte sélectionnée comme il convient. 6.6. Coulage du milieu. Verser environ 15 à 18 ml de milieu (6.1) dans chaque boîte ensemencée. Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Pétri, afin d' obtenir une répartition régulière des colonies après incubation. Le délai entre la fin de la préparation de l' échantillon et le mélange, selon le type de lait, de la prise d' essai ou de la dilution avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes. Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre jsuqu'à solidification du milieu. 6.7. Incubation des boîtes de Pétri. Placer les boîtes dans l' étuve. Incuber les boîtes retournées. Ne pas empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher, ni être en contact avec les parois et la partie supérieure de l' étuve. Incuber à 30 +/- 1 °C pendant 72 +/- 2 heures. 6.8. Comptage des colonies. Effectuer le comptage des colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 300 colonies. Examiner les boîtes en lumière atténuée. Une loupe et/ou un compteur enregistreur peuvent être utilisés pour faciliter le comptage. Eviter de confondre des particules de matières précitées avec des colonies de la taille d' une pointe d' épingle. En cas de doute, procéder à un examen minutieux en utilisant si nécessaire une loupe de grossissement supérieur, afin de distinguer les colonies des matières étrangères. Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si les colonies envahissantes recouvrent moins d' un quart de la boîte, compter les colonies sur la partie non touchée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte entière. Si les colonies envahissantes recouvrent plus d' un quart de la boîte, éliminer la boîte. Art. 7N1. 7. Calcul et expression des résultats. 7.1. Utiliser les résultats des boîtes contenant entre 10 et 300 colonies (voir 7.3 et 7.4). 7.2. Calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé à l' aide de la formule suivante : SIGMA C (n1 + 0,1 n2) d où ¦ SIGMA C : est la somme totale des colonies comptées selon 7.1. ¦ (n1 + 0,1 n2) d : est égal au volume de l' échantillon ensemencé où : ¦ n1 : est le nombre de boîtes comptées dans la première dilution, ¦ n2 : est le nombre de boîtes comptées dans la deuxième dilution, ¦ d : est le facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont ¦été obtenus. ¦ Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs. Quand le chiffre à ¦arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à ¦gauche soit pair. ¦ Exemple (lait pasteurisé) : ¦ Dilution 10-2 : 278 et 290 colonies. ¦ Dilution 10-3 : 33 et 28 colonies. ¦ 278 + 290 + 33 + 28 ¦Nombre/ml = --------------------- ¦ -2 ¦ (2 + 0,1 x 2) 10 ¦ ¦ 629 ¦ = +------------------------------------------------------------------------------+ = 0,022 = 28.590 = 29.000 4 = 2,9 x 10 7.3. Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est " inférieur à 10 x d ", " d " étant l' inverse du facteur de dilution le plus faible. 7.4. Lorsque tous les dénombrements sont supérieurs à 300 et que le comptage est possible, procéder à une estimation et la multiplier par l' inverse du facteur de dilution. Exprimer le résultat avec l' indication " nombre estimé de micro-organismes par millilitre ". Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N2. Annexe 2. Dénombrement des micro-organismes - Comptage des colonies aerobies à 30 °C - Méthode plate-loop. Art. 1N2. 1. Principe. Un échantillon de lait est prélevé au moyen d' une anse de dimension appropriée et rejeté dans une boîte de Pétri avec de la solution Ringer stérile, diluée au quart. Après addition du milieu de culture et incubatio à 30 °C +/- 1 °C, on dénombre les colonies. Art. 2N2. 2. Milieu de culture et diluants. 2.1. Composants de base. Pour améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d' utiliser, pour la préparation du diluant et du milieu de culture, des composants de base déshydratés ou une préparation complète déshydratée. Les prescription du fabricant doivent être suivies scrupuleusement. Les produits chimiques doivent être de qualité analytique reconnue. L' eau utilisée doit être de l' eau distillée avec un appareillage en verre, ou de l' eau déminéralisée. Elle doit être exempte de substances susceptibles d' inhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de l' essai et doit être contrôlée périodiquement, en particulier dans les cas d' eau déminéralisée. Des solutions d' hydroxide de sodium et d' acide chlorhydrique (environ 0,1 ml/l) doivent être utilisées pour ajuster le pH des diluants et du milieu de culture. Si les diluants ou le milieu de culture ne sont pas utilisés immédiatement, le conserver à l' obscurité entre 0 et 5 °C, pendant 1 mois au maximum dans des conditions évitant toute modification de son volume ou de sa composition. 2.2. Milieu de culture. Tryptone : 5,0 g. Extrait de levure : 2,5 g. Glucose (C6H12O6.H2O) : 1,0 g. Poudre de lait écrémé : 1,0 g. Agar, suivant les propriétés gélifiantes : 12 - 18 g. Eau : 1 000 ml. pH, après stérilisation à 25 °C : 6,9 +/- 0,1. La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices. Dissoudre les composants de base ou le milieu complet dans l' eau chauffée et porter à l' ébullition en agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète. Dans tous les cas, il est indispensable d' ajouter de la poudre de lait écrémé, même si le milieu complet déshydraté est acheté prêt à l' emploi et même si le fabricant considère cette adjonction comme superflue. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,0 ou 7,1 de facon à obtenir le pH requis après stérilisation. Répartir le milieu de culture par quantités de 12 à 15 ml dans des tubes à essais ou par quantités de 100 à 150 ml dans des flacons. Stériliser à l' autoclave à 121 +/- 1 °C pendant 15 min. 2.3. Diluants. 2.3.1. Solution peptone-sel. Peptone : 1,0 g. Chlorure de sodium (NaCl) : 8,5 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre les composants dans l' eau, en chauffant, si nécessaire. Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation, il soit de 7,0 à 25 °C. 2.3.2. Solution de Ringer - diluée au quart. Chlorure de sodium (NaCl) : 2,25 g. Chlorure de potassium (KCl) : 0,105 g. Chlorure de calcium anhydre (CaCl2) : 0,06 g. Hydrogéno-carbonate de sodium (NaHCO3) : 0,05 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre les sels dans l' eau. 1.1.2-----------------------------------------------------ÁTexte: 1 de 1 ã Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation, il soit de 7,0 à 25 °C. 2.3.3. Solution de peptone. Peptone : 1,0 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre le peptone dans l' eau. Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation, il soit de 7,0 à 25 °C. 2.3.4. Répartition et stérilisation des diluants. Répartir le diluant dans des flacons ou des tubes à essai de facon qu' après stérilisation, chaque flacon contienne 90 ml de diluant et que chaque tube à essai contienne 9,0 ml de diluant. Stérilisé à l' autoclave à 121 °C durant 15 min. Art. 3N2. 3. Appareillage et verrerie. 3.1. Appareil d' ensemencement. L' appareil est décrit dans la figure 1. On utilise un fil en platine rhodié ou en platine-iridié de 0,4 mm de diamètre formant une anse, permettant de prélever. 0,001 ml de lait (B & S mesure standard n° 26). La boucle doit être ronde et fixée au bout d' un fil de 70 mm. Ce dernier doit avoir la forme suivante : l' anse est courbée, selon un angle de 30°, à une distance de 3 à 4 mm de son extrémité. L' autre extrémité du fil est courbée à plusieurs endroits. Cette partie courbée est attachée dans un support constitué par une aiguille à injection hypodermique Luer-Lok (mesure standard 13) recoupée à une longueur de 24 26 mm à partir de la base. La partie saillante du fil doit avoir une longueur de 12 à 14 mm. Remarque : utiliser de préférence les anses disponibles dans le commerce. Le diamètre intérieur doit se situer entre 1,25 et 1,50 mm. L' aiguille hypodermique Luer-Lok avec l' anse est fixée sur une seringue Cornwall. La seringue est reliée au moyen d' un tuyau en caoutchouc, à un erlenmeyer contenant la solution de Ringer stérile diluée au quart. Le diamètre interne du tuyau est de 3,0 mm. 3.2. Appareillage et verrerie généralement utilisés dans un laboratoire de microbiologie. Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont adéquates. La verrerie doit pouvoir résister à des stérilisations répétées et être chimiquement inerte. 3.2.1. Appareillage. Autoclave, réglable à 121 +/- 1 °C. Four à chaleur sèche, capable de maintenir une température de 170 à 175 °C pendant 1 h. Etuve, capable de maintenir une température uniforme de 30 +/- 1 °C. pH-mètre avec compensation de température, précis à +/- 0,1 unité pH. balance, précis à +/- 0,01 g. Bain d' eau, réglable à 45 +/- 1 °C. Compteur avec lumière tamisée et loupe. Agitateur, capable de mélanger 1 ml de l' échantillon avec 9 ml de diluant et dont le principe est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu des tubes à essais (agitateur Vortex). 3.2.2. Verrerie. Flacons de capacité suffisante pour contenir les 90 ml de diluant utilisés. Tubes à essais de 15 à 20 ml. Flacons de 150 à 250 ml ou tubes à essais de 15 à 20 ml, pour contenir le milieu de culture. Pipettes de 1 ml graduées à 0,1 ml et pipettes de 10 ml graduées à 1 ml. Les pipettes doivent être bouchées avec du coton. L' orifice d' écoulement est de 2 à 3 mm. Boîtes de Pétri, en verre transparent incolore ou en plastique avec un diamètre intérieur de 85 à 100 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité susceptible d' interférer avec le comptage des colonies. Art. 4N2. 4. Mode opératoire. 4.1. Stériliser les boîtes de Pétri dans un four à air chaud à 170 °C pendant au moins 1 heure ou, si un four à air chaud n' est pas disponible, dans un autoclave durant 20 min. à 121° +/- 1 °C. 4.2. Stériliser tous les éléments de l' appareil d' ensemencement par immersion pendant 10 min. dans l' eau bouillante. Remonter l' ensemble aseptiquement (voir figure 1). Laisser refroidir l' instrument. Aspirer rapidement la solution diluée dans la seringue. Avant de commencer l' examen bactériologique, plonger l' anse dans une solution d' hypochlorite fraîchement préparée (50 ml/l de chlore actif). L' anse sera rincée quelques fois avec la solution diluée. Ensuite, déposer 1 ml de cette solution dans une boîte de Pétri. Cette boîte sera désignée comme " essai à blanc de l' appareil d' ensemencement ". 4.3. Fusion du milieu. Avant de procéder à l' examen bactériologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu requise dans de l' eau bouillante ou sous un courant de vapeur, dans un récipient partiellement fermé. Refroidir le milieu fondu au bain d' eau à 45 °C. 4.4. Préparation de l' échantillon. Agiter vigoureusement l' échantillon en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l' échantillon. Il faut éviter la formation de mousse ou bien le laisser se disperser. L' intervalle de temps entre le mélange et le prélèvement de la prise d' essai ne doit pas dépasser 3 min. 4.5. Prise d' essai à l' anse. Plonger soigneusement l' anse 3 fois de suite verticalement dans l' échantillon jusqu'à la soudure (càd. 3 à 4 mm). Les mouvements d' immersion et de retrait dovent être aussi uniformes que possible et se passer sur une distance de 30 mm. Chaque mouvement vertical doit durer 1 s. environ. La réalisation uniforme de ces immersions et retraits peut être facilitée par l' utilisation d' un métronome. La vitesse de retrait a une influence sur le volume de lait prélevé (un mouvement trop lent aura pour conséquence un volume plus petit que 0,001 ml; tandis que un mouvement trop rapide engendrera un volume plus grand que 0,001 ml). 4.6. Ensemencement des boîtes à Pétri. Soulever le couvercle d' une boîte à Pétri stérile, introduire l' anse dans la boîte et chasser le contenu de l' anse à l' aide 1 ml de solution de Ringer. 4.7. Répartition du milieu de culture dans les boîtes de Pétri. Déposer une quantité suffisante (10 à 12 ml) de milieu fondu à une température de 45 °C, dans chaque boîte ensemencée de facon à obtenir une couche de 3 à 4 mm d' épaisseur. Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Pétri afin d' obtenir une répartition régulière des colonies après incubation. Laisser reposer les boîtes sur une surface horizontale et propre jusqu'à solidification du milieu. 4.8. Incubation. Retourner les boîtes et les placer dans l' étuve. En empiler 6 aux plus. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher, ni être en contact avec les parois ou la partie supérieure de l' étuve. Incuber à 30 °C pendant 72 +/- 2 h. 4.9. Comptage des colonies. Compter les colonies sur les boîtes. Examiner les boîtes à la lumière tamisée. Pour faciliter le comptage une loupe et/ou un compteur peuvent être utilisés. Les colonies envahissantes doivent être considérées comme colonies uniques. Si moins d' un quart de la boîte est recouvert par des colonies envahissantes, compter les colonies sur la partie non affectée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte entière. Si plus d' un quart de la boîte est recouvert par des colonies envahissantes, éliminer la boîte. Figure. - Matériel d' ensemencement. (Figure non reprise pour des raisons techniques. Voir MB 02/12/1994, p. 29895) Art. 5N2. 5. Expression du résultat. Calculer le nombre de micro-orgnismes par ml en multipliant par 1 000 le nombre de colonies. Remarque : il faut prévoir un nombre suffisant d' essais à blanc pour contrôler la stérilité du milieu de culture, du liquide de dilution, des pipettes, des boîtes de Pétri, etc. ... Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N3. Annexe 3. Dénombrement des micro-organismes - Comptage des colonies à 30 °C - Méthode roll-tube. Art. 1N3. 1. Définition. Par micro-orgnismes, on entend : les organismes qui forment des colonies comptables après incubation à 30 °C dans les conditions spécifiées. Art. 2N3. 2. Principe. Un échantillon de lait est mélangé dans un tube à essai avec le diluant. Après addition du milieu de culture le tube à essai est fermé. Le milieu de culture est réparti sur la paroi du tube sous la forme d' un film par rotation horizontale et refroidissement simultané du tube. Après incubation pendant 72 h à 30 °C, le nombre de colonies est compté visuellement, ou à l' aide d' un compteur. Art. 3N3. 3. Appareillage et verrerie. 3.1. Appareillage. Four à chaleur sèche, capable de maintenir une température de 170 à 175 °C pendant 1 h. Autoclave, réglable à 121 +/- 1 °C. Etuve, capable de maintenir une température uniforme de 30 +/- 1 °C. Appareil de pipettage automatique avec possibilité de nettoyage entre les échantillons. Appareil à anse avec plusieurs anses à alliage chrome nickel. Toutes les anses doivent transférer les mêmes quantités de lait. Un rincage intermédiaire doit également être possible. Les anses doivent être montées avec un angle de 10° par rapport à l' axe afin de permettre un bon mélange de l' échantillon, de la solution de dilution, et du liquide de rincage (hypochlorite). Dispenseur automatique de milieu de culture formé d' un container à double paroi à circulation d' eau chaude pour maintenir la température du milieu à 47 °C. Appareil rotatif pour tubes à essais couplé à un système de refroidissement à l' eau courante. pH-mètre avec compensation de température, précis à +/- 0,1 unité pH. Compteur de colonies fonctionnant selon le prinicpe de diffraction de la lumière. 3.2. Verrerie. Tubes à essais stériles avec bouchons appropriés en silicone. La stérilisation s' effectue au four ou à l' autoclave. Art. 4N3. 4. Diluant et milieu de culture. Pour améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d' utiliser, pour la préparation du diluant et du milieu de culture, des composants de base déshydratés ou une préparation complète déshydratée. Les prescriptions du fabricant doivent être suivies scrupuleusement. Tous les composants de base doivent être de qualité analytique. Des solutions d' hydroxide de sodium et d' acide chlorhydrique (environ 0,1 ml/l) doivent être utilisées pour ajuster le pH des diluants et du milieu de culture. Si les diluants ou le milieu de culture ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver à l' obscurité entre 0 et 5 °C, pendant 1 mois au maximum dans des conditions évitant toute modification de son volume ou de sa composition. 4.1. Diluants. 4.1.1. Solution peptone-sel. Peptone : 1,0 g. Chlorure de sodium (NaCl) : 8,5 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre les composants dans l' eau, en chauffant, si nécessaire. Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation il soit de 7,0 à 25 °C. 4.1.2. Solution de Ringer - diluée au quart. Chlorure de sodium (NaCl) : 2,25 g. Chlorure de potassium (KCl) : 0,105 g. Chlorure de calcium anhydre (CaCl2) : 0,06 g. Hydrogéno-carbonate de sodium (NaHCO3) : 0,05 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre les sels dans l' eau. Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation, il soit de 6,9 à 25 °C. 4.1.3. Répartition et stérilisation des diluants. Répartir le diluant dans les tubes à essai de facon qu' après stérilisation, chaque tube à essai contienne environ 1,3 ml de diluant. Stériliser à l' autoclave à 121 °C durant 15 min. 4.2. Milieu de culture. 4.2.1. Composition. Plate Count Agar : 28,5 g. Agar : 10-15 g suivant les propriétés gélifiantes. Poudre de lait écrémé : 1,0 g. Eau : 1 000 ml. La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices. 4.2.2. Préparation. Utiliser de préférence les préparations complètes déshydratées, vendues en commerce (Plate Count Agar et poudre de lait écrémé sont vendus comme milieu de culture composé sous le nom " Plate Count Skim Milk Agar ".). Mélanger le milieu complet ou les composants de bases avec l' eau (suivre les prescriptions du fabricant). Il est indispensable d' ajouter la poudre de lait et le surplus d' agar. Ajuster le pH de sorte qu' après stérilisation, il soit de 6,9 à 25 °C. Stériliser à l' autoclave à 121 °C durant 15 minutes. Transférer le milieu de culture dans le container à double paroi du dispenseur. Art. 5N3. 5. Mode opératoire. 5.1. Mélanger convenablement l' échantillon afin d' obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l' échantillon. Eviter la formation de mousse ou laisser la mousse se disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d' essai ne doit pas dépasser 3 minutes. 5.2. Prélever à l' aide de l' appareil de pipettage, 1 ml de l' échantillon et l' ajouter à un tube à essai. 5.3. Prélever à l' aide d' une anse environ 1 microlitre de lait et l' ajouter à un tube à essai contenant le diluant. Les tubes à essai seront préalablement chauffés à 40 °C. 5.4. L' anse doit tourner autour de son axe lors de son immersion dans l' échantillon afin d' obtenir un bon mélange de l' échantillon. 5.5. Déposer 3 ml de milieu de culture à 47 °C dans chaque tube à essai grâce au dispenseur. La température du mélange, - liquide de dilution et milieu de culture sera d' environ 45 °C. 5.6. Fermer chaque tube à essai avec un bouchon stérile en silicone. 5.7. Placer le tube horizontalement dans l' appareil rotatif et laisser figer le milieu de culture sur la paroi des tubes. La gélose aura une épaisseur d'1,5 mm. Pour accélérer le processus, on refroidit les tubes à l' eau courante. 5.8. Incuber à 30 °C pendant 72 +/- 2 h. 5.9. Lire le nombre de colonies de manière visuelle ou électronique. Art. 6N3. 6. Calcul et expression des résultats. Calculer le nombre de micro-organismes par ml en multipliant par 1 000 le nombre de colonies. Remarque : il faut prévoir un nombre suffisant d' essais à blanc pour contrôler la stérilité du milieu de culture, du liquide de dilution, des pipettes, des boîtes de Pétri, etc. ... Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N4. Annexe 4. Dénombrement des micro-organismes - Comptage des colonies aerobies à 30 °C - Méthode pétrifilm. Art. 1N4. 1. Définition. Par " micro-organismes " il faut entendre les organismes formant des colonies comptables lors d' une incubation en aérobiose dans les conditions spécifiées ci-après. Art. 2N4. 2. Principe. Les pétrifilms sont constitués de 2 films plastiques : le film inférieur sert de support au milieu de culture, le film supérieur contient un indicateur au tétrazolium. L' échantillon (ou la dilution) est déposée sur le milieu de culture. Après incubation à la température adéquate, les colonies formées sont dénombrées. Art. 3N4. 3. Appareillage et verrerie. 3.1. Appareillage. Pétrifilm SM + diffuseur plastique. Four à air chaud, réglable à 170-175 °C. Autoclave, réglable à 121 +/- 1 °C. Etuve réglable à une température uniforme de 30 +/- 1 °C. Agitateur fonctionnant suivant le principe de rotation exentrique. pH-mètre, avec correcteur de température, sensible à 0,1 unité de pH près. 3.2. Verrerie. Tubes à essai avec bouchons appropriés et de capacité suffisante pour contenir 10 ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes. Pipettes (cotonnées) en verre ou en matériau synthétique stérile, non ébréchées, de 1 ml de capacité nominale, présentant un orifice d' écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre. Stérilisation de la verrerie. Stériliser la verrerie pendant au moins 20 min à 121 +/- 1 °C à l' autoclave ou pendant 1 h au four à une température de 170 à 175 °C. Art. 4N4. 4. Liquide de dilution. Tous les composants de celui-ci seront de qualité " pour analyse ". 4.1. Solution de peptone-sel. Composition. Peptone : 1,0 g. Chlorure de sodium (NaCl) : 8,5 g. Eau : 1 000 ml. Préparation. Dissoudre les composants dans l' eau, en chauffant si nécessaire. Vérifier le pH avec un pH-mètre et ajuster au besoin le pH, en utilisant une solution d' HCl (0,1 M) ou NaOH (0,1 M) de sorte qu' après stérilisation, il soit de 7,0 à 25 °C. 4.2. Solution de Ringer diluée au quart. Composition. NaCl : 2,25 g. KCl : 0,105 g. CaCl2 : 0,06 g. NaHCO3 : 0,05 g. Eau : 1 000 ml. Dissoudre les sels dans l' eau. Vérifier le pH avec un pH-mètre et ajuster de manière qu' après stérilisation le pH soit de 7,0 à 25 °C. L' ajustement de pH se fait avec 1 solution de HCl (0,1 M) ou de NaOH (0, 1 M). 4.3. Répartition, stérilisation et conservation du diluant. Répartir le diluant dans des tubes à essai en quantités telles qu' après stérilisation chaque tube contienne 9,0 ml de diluant. Boucher les tubes. Stériliser à l' autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Vérifier le pH du diluant. Si le diluant n' est pas utilisé immédiatement, le conserver à l' abri de la lumière entre 0 et 5 °C pendant un mois au maximum après sa préparation. Remarque : la solution diluée peut aussi être préparée au moyen de tablettes en vente dans le commerce. Art. 5N4. 5. Mode opératoire. 5.1. Préparation de l' échantillon et des dilutions. 5.1.1. Agiter vigoureusement l' échantillon en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l' échantillon. Il faut éviter la formation de mousse ou bien le laisser se disperser. L' intervalle de temps entre le mélange et le prélèvement de la prise d' essai ne doit pas dépasser 3 min. 5.1.2. Prélever à la pipette 1 ml ou 10 ml de l' échantillon et ajouter à 9 ml resp. 90 ml de diluant approprié. 5.1.3. Agiter cette dilution 25 fois sur 30 cm en 10 secondes. On obtient alors la dilution 10-1. 5.1.4. Introduire 1 ml ou 10 ml de la dilution 10-1 dans un nouveau tube contenant 9 ml, resp. un nouveau flacon contenant 90 ml de diluant. Mélanger avec soin avec l' agitateur ou dans le cas des flacons manuellement comme indiqué en 5.1.3. Ainsi on obtient la dilution 10-2. 5.1.5. Introduire 1 ml ou 10 ml de la dilution 10-2 dans un nouveau tube contenant 9 ml, resp. un nouveau flacon contenant 90 ml de diluant. Mélanger avec soin avec l' agitateur ou dans le cas des flacons manuellement comme indiqué en 5.1.3. Ainsi on obtient la dilution 10-3. 5.1.6. Si nécessaire, répéter ces opérations pour obtenir les dilutions suivantes. 5.2. Inoculation des pétrifilms. Placer le pétrifilm sur une surface plane. Soulever le film supérieur et déposer 1 ml de l' échantillon (ou de la dilution) au centre de la dépression du film inférieur. Recouvrir délicatement avec le film supérieur. Placer le diffuseur plastique, sur le film et répartir l' échantillon en exercant une légère pression sur le diffuseur. Laisser le diffuseur environ 1 minute sur le pétrifilm pour laisser le gel se solidifier. 5.3. Incubation des pétrifilms. Incuber le pétrifilm à l' horizontale avec la partie claire face vers le haut durant 72 +/- 3 h à 30 +/- 1 °C. Ne pas empiler plus de 20 unités. 5.4. Comptage des colonies. Compter les colonies rouges sur le pétrifilm. Art. 6N4. 6. Calcul et expression des résultats. 6.1. Utiliser les résultats sur les boîtes contenant entre 10 et 300 colonies. 6.2. Calculer le nombre de micro-organismes N par millilitre de lait, comme indiquée ci-après. SIGMA c N = N = (n + 0,1 n ) d 1 2 ou SIGMA c : le nombre total des colonies sur les boîtes utilisées. n1 : le nombre de boîtes utilisées pour la première dilution. n2 : le nombre de boîtes utilisées pour la deuxième dilution. d : la dilution à partir de laquelle les premiers comptages ont été obtenus. 6.3. Arrondir le nombre de micro-organismes calculé selon 6.2. à 2 chiffres significatifs. Le résultat peut être exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10n, n étant la puissance de 10 appropriée. 6.4. Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est " inférieur à 10 x d ", d' étant l' inverse de la dilution la plus faible. 6.5. Si tous les dénombrements sont supérieurs à 300, calculer le nombre estimé à partir des boîtes ayant un nombre de colonies proches de 300 et le multiplier par l' inverse du facteur de dilution. Exprimer ce résultat en tant que " nombre estimé de micro-organismes par millilitre ". Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N5. Annexe 5. Dénombrement des micro-organismes - Comptage du nombre de colonies aérobies - Microscopie par épifluorescense. Art. 1N5. 1. Définition. Le nombre de micro-organismes est déterminé par ces méthodes, en convertissant les impulsions fluorescentes provenant des bactéries fluorescentes (Bactoscan) ou en comptant directement les bactéries ou amas bactériens fluorescents (Cobra). Les résultats sont ensuite transformés en unités formant colonies/ml (UFC) pour le Bactoscan; le Cobra donne quant à lui directement les mesures en UFC/ml. Art. 2N5. 2. Principe. Coloration des bactéries avec l' acridine orange et comptage des bactéries fluorescentes au moyen d' un microscope à épifluorescence. Art. 3N5. 3. Le Bactoscan. 3.1. Appareillage - Mode opératoire. Pour le Bactoscan (Foss Electric, Hillerod, Danemark), l' échantillon de lait est traité avec une solution lysante afin de détruire les micelles de caséine et les cellules somatiques. Les bactéries sont séparées des autres constituants du lait par une centrifugation et une filtration. Les protéines restantes sont hydrolysées par réaction enzymatique. Les bactéries sont colorées avec l' acridine orange. Un volume défini du mélange est prélevé et déposé en un fin film sur un disque tournant qui sert de surface de lecture pour le microscope à épifluorescence. Les bactéries fluorescentes sont détectées comme des impulsions lumineuses (impulsions Bactoscan). Le nombre d' impulsions lumineuses est exprimé en milliers par ml et est transformé grâce à une courbe de calibration en unités formant colonies par ml. 3.2. Conduite de l' analyse. 3.2.1. Les réactifs. Les réactifs nécessaires pour la réalisation des solutions mères et de travail sont disponibles auprès du fabricant de l' appareil. Leur préparation doit être conforme aux prescriptions de celui-ci. 3.2.2. Prétraitement de l' échantillon. L' échantillon est réchauffé à 40° +/- 2 °C dans un bain-marie. L' échantillon est immédiatement mélangé par un minimum de 10 retournements (180°). La formation de mousse doit être évitée. 3.2.3. Mise en route de l' appareil. L' appareil est réglé avant emploi à l' aide d' un standard Bz disponible chez le fabricant de l' appareil. La relation entre le nombre de bactéries compter et le seuil au-dessus duquel le comptage est exécuté, est déterminée de cette manière. la mise au point de l' appareil est exécutée selon les instructions du fabricant. 4 échantillons " blancs " (eau distillée ou désionisée filtrée) sont ensuite mesurés à l' aide de l' appareil. Chaque résultat doit être inférieur à 20 et la moyenne des résultats doit être inférieure à 10 impulsions lumineuses (impulsions Bactoscan). 3.2.4. Comptage du nombre de bactéries. Le comptage est effectué dans les 15 minutes après le prétraitement de l' échantillon conformément aux instructions du fabricant. La dilution et le traitement de l' échantillon sont effectués automatiquement dans l' appareil. On effectue un " blanc " au moins après chaque série de 50 échantillons de lait. La lecture doit être inférieure à 20 impulsions Bactoscan. 3.2.5. Résultat. Le nombre d' impulsions prises en compte par l' appareil est converti en un nombre de colonies déterminées sur base d' une comparaison avec la méthode de référence. 3.3. La conduite et la gestion des appareils doivent être décrites dans le protocole établi par les organismes interprofessionnels. Art. 4N5. 4. Le cobra. 4.1. Appareillage. Le " Cobra " (Biocom, les Ulis - France) est un appareil modulaire de dénombrement de la flore aérobie du lait. Il est constitué de 3 modules : le module de distribution et de préparation des échantillons. Ce module est constitué d' un appareil automatisé de prélèvement à l' aide d' une seringue. Il est composé d' un bloc compact interchangeable en polypropylène creusé de 24 puits (4 rangées de 6 puits). Le distributeur XY procède de manière séquentielle pour alimenter les 24 puits. le module de filtration et de coloration. Cette unité est constituée d' un automate programmable intégrant plusieurs pompes. Un tiroir supporte le filtre d' analyse monté dans un cadre rigide et le bloc de polypropylène avec ses 24 puits contenant les échantillons préparés. le module d' analyse et de traitement des données. Ce module comprend un microscope à épifluorescence avec une caméra et un écran vidéo, une platine motorisée et un analyseur d' images avec micro ordinateur. Une pompe à vide est adjointe au microscope et permet un aplatissement du filtre sur la platine afin d' assurer une surface de lecture parfaitement plane. 4.2. Mode opératoire. Le système de distribution automatique répartit le lait cru à analyser froid, convenablement mélangé et le mélange triton-trypsine dans les blocs en polypropylène chauffés au préalable à 50 °C servant de support à l' eau stérile. L' ensemble réagit pendant 10 minutes afin de détruire les cellules somatiques, les micelles de caséine et rendre plus fluide le passage des globules gras à traves la membrane. Le bloc est transmis dans l' unité de filtration où les 24 échantillons sont traités en parallèle. Les mélanges lait-eau-solution lysante sont filtrés sous pression sur une membrane en polycarbonate rincée ensuite avec du tampon citrate à pH 3. Les bactéries récupérées sur la membrane sont colorées avec une solution d' acridine orange (0,025 %) pendant 3 minutes. Le filtre est rincé avec du tampon citrate à pH 3 et séché pendant 1 minute par de l' air sous pression. Le badge est déposé et fixé sur le poste de lecture et d' analyse. L' ordinateur gère automatiquement la lecture des 24 échantillons grâce à un programme informatisé. 4.3. Conduite de l' analyse. 4.3.1. Les réactifs. Les réactifs et les solutions de travail doivent être conformes aux spécifications du fabricant de l' appareil. 4.3.2. Mise en route et vérification de l' appareil. La mise au point de l' appareil est effectuée selon les instructions du fabricant. Ensuite, on vérifie le bon fonctionnement de l' appareil à l' aide de 4 échantillons " blancs " (eau distillée ou désionisée filtrée). Les 4 lectures doivent être inférieures à 10 bactéries fluorescentes. 4.3.3. Résultat. Les mesures sont exprimées directement en UFC/ml. 4.4. La conduite et la gestion des appareils doivent être décrites dans le protocole établi par les organismes interprofessionnels. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N6. Annexe 6. Dénombrement des cellules somatiques - Methodes microscopique. Art. 1N6. 1. Objet et domaine d' application. La présente norme décrit le procédé de dénombrement du nombre " véritable " de cellules dans un échantillon de lait pour étalonner et vérifier la précision du procédé fluoro-opto-électronique (voir annexe 7). Art. 2N6. 2. Définition. Dans le présent procédé, on entend par cellules somatiques les cellules, par exemple leucocytes et cellules épithéliales, dont le noyau peut être coloré distinctement au bleu de méthylène. Art. 3N6. 3. Principe. Etalement de 0,01 ml de lait sur une surface de 1 cm2 d' une lame porte objet. Le film de lait est séché et coloré. Le comptage s' effectue à l' aide d' un microscope. Le nombre de cellules somatiques dénombrées pour une surface déterminée est multiplié par un facteur de multiplication afin d' obtenir le nombre de cellules par ml. Art. 4N6. 4. Réactifs. Les produits chimiques doivent être de qualité analytique. Solution colorante. Composition. Bleu de méthylène : 0,6 g. Ethanol - 99 % : 54 ml. 1,1,1-trichloro-éthane ou tétrachloro-éthane : 40 ml. Acide acétique glacial : 6 ml. Attention. Le tétrachloro-éthane toxique, les manipulations doivent être réalisées sous une hotte aspirante. Préparation. Mélanger l' éthanol et le 1,1,1-tricholoro-éthane ou tétrachloro-éthane dans un flacon et chauffer dans un bain d' eau à 60-70 °C. Ajouter le bleu de méthylène, mélanger soigneusement, refroidir au réfrigérateur à 4 °C pendant 12 à 24 heures puis ajouter l' acide acétique glacial. Filtrer sur filtre d' une porosité de 10 à 12 microns au maximum et conserver la solution colorante dans un flacon étanche. En cas de formation de particules de sédiments, filtrer à nouveau avant usage. Art. 5N6. 5. Appareillage et verrerie. microscope permettant un grossissement de x 500 à x 1 000. Microseringue permettant de répartir des quantités de 0,01 ml avec une précision de 2 % ou meilleure. Lame porte-objet pour l' étalonnement du film comportant un rectangle gravé de 20 mm x 5 mm ou lame standard et gabarit de 20 m x 5 mm. Plaque chauffante horizontale (30-50 °C) pour sécher les lames. Ventilateur (type sèche-cheveux) pour sécher le film. Bain d' eau, réglable à 30-40 °C pour chauffer l' échantillon de lait. Micromètre objectif gradué au 1/100 fe mm. Art. 6N6. 6. Mode opératoire. 6.1. Echantillon de lait. L' échantillon de lait doit être analysé dans les six heures qui suivent le prélèvement. Pendant le stockage, la température de l' échantillon ne doit pas dépasser 6 °C. La congélation doit être évitée. 6.2. Préparation de l' échantillon dans le laboratoire. Chauffer l' échantillon dans un bain d' eau à 30-40 C, puis mélanger soigneusement. Refroidir à la température à laquelle la microseringue a été étalonnée, par exemple 20 °C. 6.3. Prétraitement des lames. Nettoyer les lames à l' éthanol par exemple, essuyer à l' aide d' un papier ne laissant pas de particules, flamber et laisser refroidir. Conserver dans une boîte à l' abri des poussières. 6.4. Préparation du film. A l' aide de la microseringue prélever 0,01 ml de l' échantillon de lait préparé comme indiqué ci-dessus. Netoyer soigneusement la partie externe de la seringue entrée en contact avec le lait. Déposer le contenu de la seringue sur la lame après avoir pris soin de délimiter les contours du rectangle (20 mm x 5 mm). Répartir ensuite le prélèvement aussi régulièrement que possible sur cette surface. Laisser sécher le film sur une plaque chauffante horizontale jusqu'à ce qu' il sit complètement sec. Une meilleure adhésion est parfois réalisée en laisant sécher le lait pendant quelques heures à la température de la pièce. Préparer et examiner au moins deux films pour chaque échantillon. 6.5. Coloration des films. Immerger dans une solution colorante (4) pendant 10 minutes. Sécher et, si nécessaire, compléter le séchage à l' aide du ventilateur. Plonger les films dans de l' eau jusqu'à élimination complète du surplus de colorant. Sécher à nouveau et conserver à l' abri des poussières. 6.6. Etalonnage du champ microscopique. A partir du grossissement choisi (x 500 - x 1 000), mesurer à l' aide du micromètre objectif le diamètre du champ microscopique. Art. 7N6. 7. Comptage et calcul. 7.1. Dénombrement des cellules. Utiliser le microscope. Au lieu de dénombrer les cellules, dénombrer uniquement les noyaux de cellules, clairement reconnaissables et dont au moins la moitié est visible dans le champ microscopique. Compter les bandes ou les champs situés dans le tiers central du film en évitant de compter les bandes ou les champs sélectionnés exclusivement dans les zones périphériques du film. Le soin apporté à la préparation des films et, par conséquent, la fiabilité des résultats doivent être vérifiés au moins une fois par mois en comptant différentes parties du film. Il est également possible de procéder au dénombrement en comptant les champs microscopiques répartis de telle facon que toutes les parties du film seront représentées de manière équivalente. 7.2. Déterminant du nombre minimal de cellules à compter. Etant donné que le dénombrement microscopique des cellules somatiques peut également être utilisé pour l' étalonnage des techniques de comptage mécaniques et automatiques, le coefficient de variation des comptages sur des échantillons identiques ne doit pas être plus élevé que celui obtenu avec les appareils électroniques. Le coefficient de variation pour un échantillon de lait contenant de 400 000 à 600 000 cellules per ml ne doit pas dépasser 5 %. D' après la loi de distribution de Poisson, afin d' obtenir cette répétabilité, le nombre de cellules somatiques à dénombrer dans chaque échantillon ne doit pas être inférieur à 400. Selon la loi de distribution de Poisson, M = V = s2, ou M est la valeur moyenne arithmetique, V est la variance, s est l'ecart-type. Le coefficient de variation est : s x 100 % 100 % 100 % CV = ---------- ou CV = ----- ou CV = M s SQR(M) M (moyenne) represente le nombre de particules (cellules) qui ont ete denombree (par exemple, 400 pour CV = 5 %). NOTE : SQR = Racine carree 7.3. Calcul du facteur de multiplication. En utilisant 0,01 ml de lait, le facteur de multiplication se calcule conformément aux points 7.3.1 ou 7.3.2. 7.3.1. Comptage des bandes dans le film. La longueur des bandes à dénombrer est de 5 mm, soit la largeur du film. La largeur de la bande correspond par contre au diamètre du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif. 20 x 100 Facteur de multiplication = d x b où d est le diamètre en millimètres du champ microscopique, déterminé par le micromètre objectif. b est le nombre de bandes entièrement comptées. 7.3.2. Comptage des champs microscopiques dans le tiers central du film ou à l' aide d' une grille. 20 x 5 x 100 12.732 Facteur de multiplication = ------------ = 2 2 PI x d x s d x s 4 où d représente le diamètre en millimètres du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif. s représente le nombre de champs comptés. 7.4. Calcul de la teneur en cellules. Le nombre de cellules somatiques dénombrées (7.1 et 7.2) est multiplié par le facteur de multiplication (7.3), afin d' obtenir le nombre de cellules par ml de lait. 7.5. Précision. Le coefficient de variation de répétabilité (voir 7.2) ne doit pas excéder 5 %. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N7. Annexe 7. Dénombrement des cellules somatiques - Méthode fluoro opto-électronique. Art. 1N7. 1. Objet et domaine d' application. La présente norme décrit le procédé officiel qui, après un étalonnage adéquat (voir annexe 6), peut être utilisé pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru - avec ou sans addition de conservateurs chimiques. Art. 2N7. 2. Définition. Pour ce procédé, les cellules somatiques sont des particules qui ont une intensité de fluorescence minimale due à la coloration de l' ADN cellulaire. Art. 3N7. 3. Principe. Un volume de l' échantillon (par exemple 0,2 ml) est mélangé convenablement avec la solution tampon et la solution fluorescente. Une partie de ce mélange est ensuite transférée sous la forme d' un mince film dans un disque rotatif faisant fonction de porte-objet. Chaque cellule produit une impulsion électrique qui est amplifiée et enregistrée. Le nombre de cellules somatiques est imprimé en milliers par ml. Art. 4N7. 4. Réactifs. Sauf indication contraire, n' utiliser que des produits chimiques de qualité analytique. L' eau utilisée doit être de l' eau distillée ou déionisée, ou de l' eau d' une pureté équivalente. 4.1. Solution tampon. Composition. Hydrogénophtalate de potassium : 51,0 g. Hydroxyde de potassium : 13,75 g. Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)-phényl-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume : 10,0 ml. pH 5,7 - 5,9. Compléter à 10 000 ml avec de l' eau distillée. Préparation. Mélanger les différents composants. La conservation sous fermeture hermétique ne doit pas dépasser 7 jours. 4.2. Solution fluorescente (solution mère). Composition. Bromure d' éthidium : 1,0 g. Compléter à 1 000 ml avec de l' eau. Préparation. Dissoudre le bromure d' éthidium dans l' eau. La conservation dans un flacon hermétique à l' abri de la lumière ne doit pas dépasser 2 mois. Vu les caractéristiques fortement cancérigènes du bromure d' éthidium il faut éviter tout contact direct avec le produit. 4.3. Solution fluorescente (solution pour l' analyse). Mélanger 20 ml de la solution mère (4.2) à la solution tampon (4.1) de manière à obtenir 1 000 ml. La solution pour l' analyse ne doit pas être utilisée au-delà de 7 jours. 4.4. Solution de lavage. Composition. Solution tampon (4.1) : 10,0 ml. Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyle)-phényle-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume : 10,0 ml. Ammoniac, à 25 % en volume : 25,0 ml. Compléter à 10 000 ml avec de l' eau. Préparation. Mélanger les différents composants. Ne pas conserver au-delà de 30 jours. Art. 5N7. 5. Appareillage et verrerie. 5.1. Compteur fonctionnant selon le principe de la fluorescence optique. Note. Avant l' emploi, étalonner l' instrument. La relation entre le volume des particules à dénombrer et le seuil limite à partir duquel les dénombrements sont appliqués est déterminée de la sorte. L' étalonnage de l' appareil s' effectue suivant les instructions du fabricant en utilisant des échantillons dont la teneur en cellules a été déterminée par la méthode microscopique (A). 5.2. Bain d' eau, à circulation, réglable à 40 +/- 1 °C. 5.3. Tube à essai, avec fermeture appropriée, d' environ 15 ml. Art. 6N7. 6. Echantillon de lait. 6.1. L' échantillon doit être stocké à basse température dans un tube à essai (5.3). Si l' échantillon ne contient pas de conservateur chimique, le dénombrement ne doit pas s' effectuer dans les 24 heures qui suivent la traite, étant donné que la teneur en germes serait trop faible. La température de conservation ne doit pas dépasser 6 °C. 6.2. Addition de conservateurs. 1.1.2-----------------------------------------------------ÁTexte: 1 de 1 La conservation chimique doit être réalisée dans les 24 heures. L' addition de conservateurs doit s' effectuer dès que possible après le prélèvement de l' échantillon. 6.2.1. La conservation chimique de l' échantillon est réalisée par l' addition de l' un des conservateurs suivants : acide orthoborique. La concentration finale de l' acide orthoborique dans l' échantillon ne doit pas dépasser 0,6 g/100 ml. L' échantillon conservé de la sorte peut être stocké pendant 24 heures supplémentaires à 6-12 °C. dichromate de potassium. La concentration finale de dichromate de potassium ne doit pas dépasser 0,2 g/100 ml. L' échantillon conservé de la sorte peut être stocké durant 72 heures supplémentaires à 6-12 °C. azide de sodium. L' échantillon peut être conservé avec de l' azide de sodium à une concentration finale de 0,024 g/100 ml, à condition qu' il soit refroidi à une température de 6-12 °C immédiatement après le prélèvement et compté dans les 48 heures qui suivent le prélèvement. bronopol. L' échantillon peut être conservé avec du bronopol à une concentration finale de 0,05 g/100 ml, à condition d' être refroidi à 6-12 °C immédiatement après le prélèvement et compté dans les 72 heures qui suivent le prélèvement. 6.2.2. Un échantillon déjà conservé à l' aide d' acide orthoborique peut être conservé 48 heures de plus par addition de dichromate de potassium. Note. Pour les échantillons conservés à l' aide de dichromate de potassium, les normes locales relatives au rejet des effluents doivent être respectées. Art. 7N7. 7. Mode opératoire. 7.1. Prétraitement de l' échantillon. Le lait à analyser doit être conservé après la traite pendant au moins 24 heures à 2-6 °C environ. Le comptage des échantillons le jour de la traite n' est pas conseillé sans prétraitement, car les résultats risquent d' être trop faibles. S' il faut malgré tout procéder au comptage, l' échantillon doit alors être prétraité pendant trois heures au moins à l' aide de dichromate de potassium (voir 6.2.1). 7.2. Préparation. Chauffer l' échantillon prétraité (7.1) ou l' échantillon non traité ayant au moins un jour dans un bain d' eau à 40 °C environ. Conserver ensuite l' échantillon à température ambiante jusqu'au moment du comptage. 7.3. Comptage des cellules. Procéder au comptage à l' aide du compteur (5.1) dans les quinze minutes qui suivent la fin du chauffage (voir 7.2). Immédiatement avant le comptage, mélanger convenablement les échantillons afin d' obtenir une répartition des cellules somatiques aussi homogène que possible. La dilution et la préparation ultérieures de l' échantillon doivent s' effectuer automatiquement dans le compteur. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N8. Annexe 8. Détection des substances inhibitrices et des sulfamides dans le lait. (Pour des raisons techniques, cette annexe a été subdivisée comme suit : 1N8-19N8) Art. 1N8. Introduction. Cette annexe décrit une méthode de mise en évidence des antibiotiques et des sulfamides dans le lait cru. On effectue une méthode de sélection sur les échantillons à examiner. Tous les échantillons qui après l' incubation prescrite par la méthode de sélection donnent lieu à un résultat positif ou douteux sont soumis à une épreuve de confirmation. Cette méthode de confirmation est exécutée sur l' échantillon de lait originel que l' on porte à 80 °C pendant 10 minutes. Les échantillons qui, lors de l' épreuve de confirmation, montrent à nouveau une inhibition de la croissance, sont soumis à un nouvel examen visant la détermination de sulfamides en effectuant l' épreuve en présence d' acide paraaminobenzoïque. Les laits qui ne contiennent pas de sulfamides sont à nouveau examinés pour déterminer soit la pénicilline soit d' autres substances inhibitrices. Art. 2N8. A. Epreuve de sélection. Art. 3N8. A.1. Méthode de référence : test de diffusion en gélose. A.1.1. Principe. On fait diffuser un échantillon de lait ensemencé de spores d' un micro organisme test Bacillus stéarothermophilus var. calidolactis ATCC 10149 ou C 953 dans un milieu gélosé contenant des substances nutrives, un indicateur de pH, et de la trimétoprime. La croissance normale et la production d' acide d' un micro-organisme test a fait viré après incubation l' indicateur de pH du pourpre au jaune. La présence d' inhibiteurs se traduit par un maintien plus long de la coloration pourpre de l' indicateur de pH que dans les tubes ou cupules contenant l' échantillon témoin exempt de substances inhibitrices. On peut utilise aussi bien des petits tubes à essais que des plaques de microtitration. Art. 4N8. A.1.2. Milieux, solutions standards, micro-organisme test. Remarque : les composants de base des milieux doivent convenir pour des analyses bactériologiques; l' eau utilisée doit être de l' eau distillée ou déminéralisée ou de pureté équivalente et ne pas contenir de substances inhibitrices. A.1.2.1. Gélose nutritive (Nom commercial : Plate Count Agar). Composition : Extrait de levure : 2,5 g Tryptone : 5,0 g Glucose : 1,0 g Agar : 15 g Eau distillee : 1 000 ml Préparation : Dissoudre les composants dans de l' eau en chauffant. Stériliser à 121 +/- 1 °C pendant 15 minutes. pH à 25 °C après stérilisation. A.1.2.2. Solution de trimétoprime. Trimétoprime : 5 mg. Ethanol 96 % : 10 ml. Eau distillée : jusque 1 000 ml. Dissoudre la trimétoprime dans l' éthanol et compléter avec de l' eau. Cette solution se conserve au maximum 1 semaine à l' obscurité et à une température de 0-5 °C. A.1.2.3. Solution de pourpre de bromocrésol. Pourpre de bromocrésol : 250 mg. Ethanol 96 % : 10 ml. Eau distillée : jusque 100 ml. Dissoudre le pourpre de bromocrésol dans l' éthanol et compléter avec l' eau. Conserver cette solution au maximum pendant 6 mois à l' obscurité à une température de 0 à 5 °C. A.1.2.4. Milieu de culture du micro-organisme test (Nom commercial : Nutrient Agar). Composition : Extrait de levure : 2,0 g Extrait de viande : 1,0 g Peptone : 5,0 g Chlorure de sodium : 5,0 g Agar : 15,0 g Eau distillee : 1 000 ml Préparation. Dissoudre en chauffant les composants dans l' eau. Répartir des quantités de 7 ml dans des tubes à essai. Stériliser à 121 +/- 1 °C pendant 15 minutes. Le pH à 25 °C après stérilisation doit être 7,4 +/- 0,1. Laisser le mileu se solidifier dans les tubes en position inclinée. A.1.2.5. Milieu de sporulation. Composition : Extrait de viande : 3,0 g Peptone : 5,0 g Sulfate de manganese (MnSO4.H2O) : 31,3 mg Agar : 15,0 g Eau distillee : 1 000 ml Préparation. Dissoudre en chauffant les ingrédients dans de l' eau et répartir dans des flacons. Stériliser à 121 +/- 1 °C pendant 15 minutes. Le pH après stérilisation à 25 °C est de 7,4 +/- 0,1. Fondre le milieu lors de l' emploi, le répartir dans de grandes boîtes de pétri (A.1.5.2.3.) et le laisser solidifier. A.1.2.6. Solution de Ringer (diluée au 1/4). Composition : Chlorure de sodium : 2,25 g Chlorure de potassium : 0,105 g Chlorure de calcium 6 H20 : 0,12 g Bicarbonate de sodium : 0,05 g Eau distillee : 1 000 ml Préparation : Dissoudre les ingrédients dans l' eau. Stériliser à 121 + /- 1 °C pendant 15 minutes. Le pH doit être de 7,0 +/- 0,1. A.1.2.7. Lait exempt de substances inhibitrices. Lait UHT stérile exempt de substances inhibitrices. A.1.2.8. Solution étalon de pénicilline. Etalon à 0,004 microgrammes/ml (= 0,0067 U.I./ml) de pénicilline, effectué à partir de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.). Cet étalon placé à - 18 +/- 2 °C se conserve au moins 3 mois. A.1.2.9. Solution standard de sulfadimidine (= sulfaméthazine). Etalaon à 0,750 microgrammes/ml de sulfadimidine réalisé à partir de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.). Cet étalon placé à - 18 +/- 2 °C se conserve au moins 3 mois. A.1.2.10. Micro-organisme test. Bacillus stéarothermophilus var. calidolactis, souche ATCC 10149 ou C 953. Art. 5N8. A.1.3. Préparation du test. A.1.3.1. Culture de réserve. Le micro-organisme test (A.1.2.10.) est conservé sur une gélose nutritive inclinée et figée (A.1.2.4.). Ensemencer à l' aide d' une anse imprégnée du micro-organisme test en effectuant des stries sur la surface de la gélose inclinée. Incuber 48 h à 55 °C +/- 1 °C. Après incubation, passer à la flamme et enfoncer légèrement la bourre d' ouate dans le tube. Fermer hermétiquement le tube à l' aide d' un bouchon stérile en caoutchouc. La culture mère ainsi obtenu peut être conservée plusieurs mois au réfrigérateur à 5 °C. A.1.3.2. Matériel d' ensemencement. Transvaser aseptiquement la gélose nutritive fondue pour la culture du micro-organisme test (A.1.2.4.) dans des boîtes de Pétri stériles (A.1.5.2. 2.). Laisser le milieu se solidifier. Ensemencer la culture de réserve sur ce milieu. Incuber 24 h à 63 +/- 1 °C. A.1.3.3. Suspension de spores. A.1.3.3.1. Reprendre la culture (A.1.3.2.) développée sur la boîte de Pétri dans 2 ml de solution de Ringer stérile à l' aide d' un écouvillon stérile ou d' une spatule en verre stérile. Transférer à l' aide d' une pipette stérile 1 ml de cette solution bactérienne sur les grandes boîtes de Pétri contenant le milieu de sporulation (A.1.2.5.). Entendre l' inoculum sur la surface de la boîte à l' aide d' un écouvillon stérile ou d' une spatule stérile de Drigalsky. Ensemencer ainsi un nombre suffisant de boîtes de Pétri. Emballer les boîtes de Pétri ensemencées dans un sac de plastique et incuber 3 jours à 63 +/- 1 °C. A.1.3.3.2. Transférer 5 ml de solution de Ringer stérile (A.1.2.6.) sur chaque boîte et laver les spores de la gélose à l' aide d' une spatule stérile ou d' un écouvillon stérile. Transvaser la suspension de spores dans un flacon en verre stérile. Fermer le flacon et l' agiter vigoureusement. La suspension de spores ainsi obtenue doit avoir une turbidimétrie uniforme. Si on observe un floconnage de sédiments, il faut remplacer cette culture par une nouvelle culture préparée à partir de la culture de réserve (A.1.3.1.). Contrôler la suspension de spores à l' aide d' un microscope quant à la pureté et à la sporulation. A.1.3.3.3. Déterminer le nombre de spores sur le milieu de base après incubation à 63 +/- 1 °C pendant 1 h. A.1.3.3.4. Diluer la suspension à l' aide d' une solution de Ringer stérile (A.1.2.6.) jusqu'à une concentration de environ 10-7 spores par ml. A.1.3.3.5. Une telle solution de spores se conserve 1 an à une température de - 18 °C +/- 2 °C. Art. 6N8. A.1.4. Préparation des tubes test ou des microplaques test. A.1.4.1. Fondre le milieu de base (A.1.2.1.) au maximum 24 h avant l' emploi. Le refroidir à 63 °C. Ajouter de manière aseptique par 100 ml de milieu de base, 2 ml de pourpre de bromocrésol (A.1.2.3.) et 2 ml de solution de trimétorpime (A.1.2.2.). Ajuster le pH du milieu à 63 °C à 8,00 +/- 0,02 par addition de NaOH 1 M à l' aide d' un pH-mètre avec correction de température. Ajouter une quantité telle (soit dans les tubes tests +/ 450 microlitres et sur les microplaques +/- 1 ml) de la solution de spores (A.1.3.3.5.) que le lait de contrôle (A.1.2.7.) (exempt de substances inhibitrices) change complètement de couleur après +/- 4,5 h d' incubation. A.1.4.2. Mélanger et répartir le milieu d' épreuve (A.1.4.1.) dans les tubes test (A.1.5.2.8.) ou dans les cupules de la microplaque (A.1.5.2.8.) en fractions de respectivement 1 ml et 200 microlitres. Laisser le milieu d' épreuvre se solidifier. Soigneusement fermés, les tubes d' essais ou les microplaques peuvent se conserver 1 jour à une température de 0-5 °C. Art. 7N8. A.1.5. Appareillage et verrerie. Matériel courant de laboratoire, notamment : A.1.5.1. Appareillage. A.1.5.1.1. Etuve à circulation d' air forcée réglée à une température de 63 +/- 1 °C. A.1.5.1.2. Etuve à circulation d' air forcée réglée à 55 +/- 1 °C. A.1.5.1.3. Bain maie à circulation forcée réglée à 63 +/- 1 °C. A.1.5.1.4. Support pour tubes. A.1.5.1.5. Micropipettes à volume réglable avec les tips correspondants pour les prélèvement de volumes de 100, 200, 300 et 450 microlitres. A.1.5.2. Verrerie et matériel plastique. A.1.5.2.1. Flacons à échantillons. A.1.5.2.2. Boîtes de Pétri en vere transparent, incolore ou boîtes préstérilisées en matière plastique, avec un diamètre intérieur de environ 90 mm et une hauteur minimale de 10 mm. Le milieu doit être plat et avoir une épaisseur suffisante. A.1.5.2.3. Boîtes de Pétri en verre transparent, incolore ou préstérilisées en matière plastique, avec un diamètre intérieur d' environ 140 mm. Le milieu doit être plat et avoir une épaisseur suffisante. A.1.5.2.4. Flacons d' une capacité de 250 ml. A.1.5.2.5. Pipettes en verre ou en matériel plastique stérile d' une capacité de 1 et 10 ml. A.1.5.2.6. Spatules en verre de Drigalsky. A.1.5.2.7. Tubes à essais de dimensions 140 x 14 mm. A.1.5.2.8. Tubes à essais courts de dimensions 85 x 14 mm. A.1.5.2.9. Microplaques avec cupules à fond plat. Remarque : La verrerie peut être stérilisé de la manière suivante : a) dans un four à air chaud à une température de 170 à 175 °C pendant 1 heure au moins; b) à l' autoclave à une température de 121 °C pendant 20 min. au moins. Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud. Art. 8N8. A.1.6. Mode opératoire. A.1.6.1. Les échantillons doivent être analysés le plus tôt possible, de préférence dans les 24 heures qui suivent le prélèvemen; entretemps, les échantillons doivent être conservés à une température de 0 à 5 °C. Si ce n' est pas possible, conserver les échantillons au congélateur (- 30 °C ou 15 °C). A.1.6.2. Identifier chaque tube (A.1.4.2.) ou cupule (A.1.4.2.) de chaque microplaque contenant le milieu test. A.1.6.3. Mélanger les échantillons à analyser. Transférer respectivement 300 microlitres ou 100 microlitres de l' échantillon dans un tube à essais (A.1.4.2.) ou dans une cupule de microplaque (A.1.4.2.) contenant le milieu test. A.1.6.4. Transférer en double respectivement 300 microlitres ou 100 microlitres de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.) dans un tube à essais (A.1.4.2.) ou dans une cupule de microplaque (A.1.4.2.) contenat le milieu test. A.1.6.5. Transférer en double respectivement 300 microlitres ou 100 microlitres de l' étalon pénicilline (A.1.2.8.) dans un tube à essais (A.1. 4.2.) ou dans une cupule de microplaque (A.1.4.2.) remplie de milieu test. A.1.6.6. Transférer en double respectivement 300 microlitres ou 100 microlitres de l' étalon sulfadimidine (A.1.2.9.) dans un tube à essais (A. 1.4.2.) ou dans une cupule de microplaque (A.1.4.2.) remplie de milieu test. A.1.6.7. Laisser les échantillons et les standards diffuser pendant 1 heure à la température ambiante dans le milieu test. A.1.6.8. Eliminer le surnageant de lait du milieu test contenu dans les tubes à essais ou les cuplues. Eviter ainsi les contaminations entre les tubes ou les cupules. Fermer les tubes ou les cupules et les placer directement ou après conservation à 5 °C (18 heures au maximum) dans un bain marie à 63 +/- 1 °C et incuber jusqu'à ce que le milieu test du lait exempt de subsances inhibitrices soit de coloration jaune homogène. Le moment de retrait de l' incubation est déterminé, à partir du moment où la couler dans les tubes ou cupules d' échantillon de lait de contrôle (A.1.6. 4.) commence à changer; on évalue la coloration toutes les 10 minutes. Art. 9N8. A.1.7. Examen des échantillons, interprétation des résultats. La coloration du milieu test est évaluée sur les tubes à essais ou les cupules 5 à 10 minutes après retrait du bain-marie. A.1.7.1. Une coloration pourpre du milieu test montre la présence de substances inhibitrices. A.1.7.2. Une coloration pourpre dans seulement une partie du milieu test ou une décoloration incomplète (vert jaune, jaune violet) indique la présence possible de substances inhibitrices. A.1.7.3. Une coloration jaune du milieu test signifie que des substances inhibitrices ne sont pas décelées. A.1.7.4. Le milieu dans les tubes à essais ou cupules avec le lait exemp de substances inhibitrices doit être coloré en jaune. Si ce n' est pas le cas, la vitalité des spores est insuffisante et l' essai doit être recommencé. A.1.7.5. Le milieu dans les tubes à essais ou cupules contenant l' étalo de pénicilline (A.1.6.5.) doit être coloré en violet; tandis que le milieu dans les tubes à essais ou cupules contenant l' étalon de sulfadimidine (A 1.6.6.) doit être jaune-violet. Si ce n' est pas le cas, les spores sont insuffisament sensibles et l' essai doit être recommencé. Art. 10N8. A.1.8. Confirmation des résultats. L' épreuve de confirmation des échantillons qui donnent une réaction telle que décrite au points A.1.7.1. et A.1.7.2. est réalisée à l' aide de la méthode B. Art. 11N8. A.2. Delvotest SP (Gist Brocades SA). Art. 12N8. A.2.1. Principe. Le Delvotest SP, basé sur le même principe que le test de diffusion en gélose décrit au point A.1, peut également être utilisé comme méthode de sélection pour la détermination des échantillons de lait positifs ou douteux en ce qui concerne les substances inhibitrices. Le Delvotest SP peut être utilisé en ampoules ou en microplaques. A.2.2. Mode opératoire. Tout d' abord, respecter ici aussi les directives relatives à la conservation des échantillons (A.1.6.1.). Procéder ensuite à l' exécution du test selon le volet livré avec le kit. En plus des échantillons à analyser, il est procédé à l' examen en double d' un échantillon de lait exempt d' antibiotique (A.1.2.7.) un étalon de pénicilline (A.1.2.8.) et d' un étalon de sulfadimidine (A.1.2.9.). A.2.3. Examen des échantillons, interprétation des résultats. L' interprétation de la couleur du milieu test est effectuée après incubation de la même manière que décrite en A.1.7. A.2.4. Confirmation des résultats. Confirmer tous les échantillons ayant une réaction telle que décrite au moins A.1.7.1. et A.1.7.2. avec la méthode B. Art. 13N8. B. Confirmation. Tout échantillon (A.1.8. ou A.2.4.) qui, à l' épreuve de sélection (A.1. ou A.2.) contient ou est succeptible de contenir des substances inhibitrices doit être confirmé par la méthode B.1. ou B.2. Les échantillons doivent au prélable être chauffés à 80 °C pendant 10 minuts au bain-marie avant confirmation. Le niveau d' eau du bain-maire doit être au moins 1 cm au-dessus du niveau du lait. Par chauffage, les éventuelles substances inhibitrices naturelles contenues dans le lait sont détruites. Après le chauffage, les échantillons sont directement refroidis sous courant d' eau froide et conservés ultérieurement à 0-5 °C. Les échantillons où la confirmation est positive sont soumis à la détection des sulfamides selon la méthode B.3. ou B.4. Indépendamment du résultat, les échantillons sont confirmés par la méthode B.5. Art. 14N8. B.1. Confirmation (en tubes à essais ou en microplaques). B.1.1. Principe. La méthode décrite au point A.1. est répétée sur les échantillons de lait chauffés afin d' éviter de confirmer des échantillons contenant des inhibiteurs naturels. B.1.3. Préparation des tubes tests ou des microplaques tests. B.1.3.1. Préparation de tubes tests ou des microplaques tests pour la confirmation de la présence de substances inhibitrices non naturelles. Ces tubes ou ces microplaques tests sont préparés selon la méthode décrite au point A.1.4. pour la confirmation de la présence de substances inhibitrices dans le lait. B.1.4. Mode opératoire. B.1.4.1. Identifier chaque tube à essais (A.1.4.2.) ou chaque cupule de la microplaque (A.1.4.2.). B.1.4.2. Mélanger les échantillons (A.1.8.). Transférer 300 microlitres de l' échantillon de lait chauffé sur la gélose test du tube à essais (A.1. 4.2.). Pour les microplaques, 100 microlitres de lait sont prélevés et déposés dans les cupules (A.1.4.2.). B.1.4.3. Effectuer également une analyse en double de respectivement 300 microlitres (tubes à essais) ou 100 microlitres (microplaque) de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.), d' étalon pénicilline (A.1.2. 8.) et de sulfadimidine (A.1.2.9.). B.1.4.4. Laisser les échantillons et les étalons diffuser pendant 1 heure à température ambiante sur le milieu gélosé. B.1.4.5. Eliminer le surnageant de lait sur la gélose. Fermer les tubes ou les cupules de la plaque et les placer dans un bain-marie à 63 +/- 1 °C jusqu'à ce que le milieu test contenant le lait exempt de substances inhibitrices soit complètement coloré en jaune. Le moment de retrait du bain-marie est déterminé de la manière suivante : quand la coloration dans les tubes ou dans les cupules des échantillons de lait exempts d' antibiotiques commence à changer, évaluer cette coloration toutes les minutes. B.1.5. Examen des échantillons, interprétation des résultats. La couleur du milieu test est examinée sur les tubes à essais ou les cupules environ 5 à 10 minutes après sortie du bain-marie. B.1.5.1. Une couleur jaune du milieu test montre l' absence à un niveau décelable de substances inhibitrices non naturelles dans le lait analysé. Un résultat douteux ou positif de ce même échantillon à l' épreuve de sélection (A.) signifie que des inhibiteurs naturels sont présents dans le lait. L' analyse de ces échantillons n' est pas poursuivie. B.1.5.2. Une couleur pourpre ou irrégulière (vert jaune) du milieu test confirme la présence de substances inhibitrices non naturelles dans l' échantillon de lait. Ces échantillons seront réexaminés quant à la présence de sulfamides (voir B.3 et B.4), et indépendamment du résultat, ils seront contrôlés quant à la présence de pénicilline ou d' autres substances inhibitrices tel que décrit au point B.5. B.1.5.3. Le milieu des tubes à essais ou cupules contenant le lait exempt de substances inhibitrices (A.1.6.4.) doit être coloré en jaune; si ce n' est pas le cas, la vitalité des spores est insuffisante et l' essai doit être reconduit. B.1.5.4. Le milieu des tubes à essais ou cupules contenant l' étalon pénicilline (A.1.6.5.) doit être coloré en pourpre; le milieu des tubes à essais ou cupules contenant l' étalon sulfadimidine doit avoir une coloration jaune violet; si ce n' est pas le cas, la sensibilité des spores est insuffisante et l' essai doit être recommencé. Art. 15N8. B.2. Confirmation (Delvotest SP) en ampoules ou en microplaques. B.2.1. Principe. La méthode décrite en A.2 (Delvotest SP) est répété, mais cette fois avec du lait chauffé, pour confirmer la présence de substances inhibitrices non naturelles dans le lait. Le test peut être effectué dans des ampoules ou dans des microplaques. B.2.2. Mode opératoire. Le test est entièrement effectué selon les instructions fournies avec le kit. Les laits exempts de substances inhibitrices (A.1.2.7.), les étalons pénicilline (A.1.2.8.) et les étalons sulfadimidine (A.1.2.9.) sont analysés en double avec les échantillons à analyser (A.1.8.). B.2.3. Examen des échantillons, interprétation des résultats. La couleur du milieu test du Delvotest SP après incubation est jugée et inteprétée de manière analogue à celle décrité au point B.1.5. Tout échantillon où la présence de substances inhibitrices non naturelles est confirmée est réexaminé pour détecter la présence de sulfamides (comme décrit en B3 et B4) et indépendamment du résultat, contrôlé quant à la présence de pénicilline ou d' autres substances inhibitrices comme décrit en B5. Art. 16N8. B.3. Confirmation de la présence des sulfamides (en tubes à essais ou en microplaques). B.3.1. Principe. La méthode en A1 est répétée avec le lait préalablement chauffé (10 min., 80 °C) et en présence d' acide paraaminobenzoïque pour confirmer la présence de sulfamides. L' acide paraaminobenzoïque s' oppose à l' action inhibitrice des sulfamides. B.3.2. Solution étalon. B.3.2.1. Solution d' acide paraaminobenzoïque. Composition : acide paraaminobenzoïque : 1,0 g. eau distillée : 200 ml. Préparation : Dissoudre l' acide paraaminobenzoïque dans l' eau en chauffant légèrement. Refroidir à la température ambiante. Cette solution se conserve au maximum 1 semaine à l' obscurité et à une température de 0-5 °C. B.3.3. Préparation des tubes à essais et des microplaques. B.3.3.1. Les tubes à essais et les microplaques sont préparés comme matériel de référence pour déterminer l' activité de l' acide paraaminobenzoïque. Ces tubes ou ces microplaques sont identiques à ceux utilisés lors de l' épreuve de sélection et de première confirmation et ils sont préparés selon la méthode décrite en A.1.4. B.3.3.2. Préparation des tubes tests ou des microplaques test pour la confirmation des sulfamides. B.3.3.2.1. Fondre au maximum 24 h avant emploi le milieu gélosé de base (A.1.2.1.). Le refroidir à 63 °C. Ajouter, de manière aseptique, par 100 ml, 2 ml de pourpre de bromocrésol (A.1.2.3.), 2 ml de solution de trimétoprime (A.1.2.2.) et 2 ml de solution d' acide paraaminobenzoïque (B. 3.2.1.). Ajuster le pH du milieu à 63 °C avec du NaOH 1 M à 8,00 +/- 0,02 en utilisant un pH-mètre avec correction de température. Ajouter la solution de spores (A.1.3.3.5.) en quantité suffisante pour que le lait exempt de substances inhibitrices change complètement de coloration en +/- 4,5 h. B.3.3.2.2. Mélanger et répartir le milieu test de détection des sulfamides dans des tubes tests (A.1.5.2.8.) ou dans les cupules de la plaque de microtitration (A.1.5.2.9.), en portions de respectivement 1 ml ou 200 microlitres. Laisser le milieu test se solidifier. Les tubes tests ou les microplaques peuvent se conserver fermés 1 jour à 0-5 °C. B.3.4. Mode opératoire. B.3.4.1. Identifier chaque tube à essais (A.1.4.2. et B.3.3.2.2.) ou chaque cupule de microplaque (A.1.4.2. et B.3.3.2.2.). B.3.4.2. Mélanger les échantillons à analyser (B.1.5.2. et B.2.3.). Transférer 300 microlitres de l' échantillon chauffé, dans un tube à essais contenant le milieu test (A.1.4.2.) et dans un tube à essais contenant le milieu test pour les sulfamides (B.3.3.2.2.). Pour le travail en microplaques, 100 microlitres de l' échantillon de lait sont transférés respectivement dans les cupules de la microplaque (A.1.4.2. et B.3.3.2.2.). B.3.4.3. Réaliser également la détermination en double sur respectivement 300 microlitres (tubes à essais) ou 100 microlitres (microplaques) d' un échantillon de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.), sur les mêmes quantités de l' étalon pénicilline (A.1.2.8.) et de l' étalon sulfadimidine (A.1.2.9.). B.3.4.4. Laisser les échantillons et les étalons diffuser pendant 1 h à la température ambiante dans le milieu témoin et dans le milieu prévu pour la détection des sulfamides. B.3.4.5. Eliminer le surnageant du milieu test (sulfamides). Fermer les tubes ou les cupules et les placer dans un bain d' eau à 63 +/- 1 °C jusqu' à ce que la coloration du milieu test du lait exempt de substances inhibitrices soit jaune et homogène. Le moment du retrait du bain-marie est déterminé de la manière suivante. Quand la coloration dans les tubes ou dans les cupules des échantillons de lait exempts d' antibiotiques, commence à changer, évaluer cette coloration toutes les 10 minutes. B.3.5. Examen des échantillons, interprétation des résultats. La coloration du milieu test pour sulfamides est examinée environ 5 à 10 minutes après le retrait des tubes à essais ou des cupules du bain-marie. La coloration du milieu test pour les sulfamides (+ acide paraaminobenzoïque). B.3.5.1. Si l' ajout d' acide paraaminobenzoïque (milieu test pour les sulfamides) produit une coloration moins violette ou moins jaune vert que celle observée dans le milieu test sans acide paraaminobenzoïque avec le même échantillon, cela signifie que cet échantillon contient des sulfamides. Tous les échantillons ne contenant pas de résidus de sulfamides sont traités comme en B.5. B.3.5.2. Le milieu test (pour sulfamides) dans les tubes ou cupules doit avoir une coloration jaune avec le lait de contrôle exempt de substances inhibitrices (A.1.6.4.); si ce n' est pas le cas, les spores ont une vitalité insuffisante et l' essai doit être recommencé. B.3.5.3. Le milieu test (pour sulfamides) dans les tubes ou cupules avec l' étalon pénicilline (A.1.6.5) doit être de coloration violette. Le milieu test ajouté à l' étalon sulfadimidine (A.1.6.6.) doit étre de coloration jaune violette, tandis que la coloration de l' étalon sur le milieu test pour sulfamides doit être jaune homogène; si ce n' est pas le cas, l' essai doit être recommencé. Art. 17N8. B.4. Confirmation des sulfamides (Delvotest SP) en ampoules ou en microplaques. B.4.1. Principe. La méthode décrite au point A.2 (Delvotest SP) est répétée avec le lait chauffé au préalable (10 minutes/80 °C) et en présence d' acide paraaminobenzoïque pour confirmer la présence de sulfamides. Les tests peuvent être réalisés en ampoules ou en microplaques. B.4.2. Mode opératoire. Le test est réalisé entièrement selon le mode opératoire livré avec le kit de détection. Les échantillons (B.1.5.2. ou B.2.3.) sont testés en présence et en absence d' acide paraaminobenzoïque. Les échantillons de lait exempt de substances inhibitrices (A.1.2.7.), l' étalon de pénicilline (A.1.2.8.) et l' étalon de sulfadimidine (A.1.2.9.) sont analysés en double avec et sans acide paraaminobenzoïque en même temps que les échantillons de lait (A.1.8. ). B.4.3. Examen des échantillons, interprétation des résultats. Après incubation, la coloration du milieu test du Delvotest SP est examinée et interprétée tel que décrit en B.3.5. La coloration du milieu de chaque échantillon en présence d' acide paraaminobenzoïque est comparée à celle du même milieu en absence d' acide paraaminobenzoïque. L' analyse de tous les échantillons où la présence de sulfamides n' est pas décelée est poursuivie comme décrit en B.5. Art. 18N8. B.5. Confirmation des pénicillines (en boîtes de Pétri). Tous les échantillons montrant une croissance des bactéries ralentie à l' épreuve de sélection (méthode A.1 ou A.2) ou de confirmation (méthode B. 1 ou B.2) mais où aucun résidu de sulfamides n' est mis en évidence (méthode B.3 ou B.4) sont contrôlés quant à la présence de pénicillines ou d' autres substances inhibitrices. B.5.1. Définition. Un échantillon de lait contient de la pénicilline lorsque l' application de la méthode décrite dans ce point donne une zone d' inhibition qui se réduit (pénicilline + autre antibiotique) ou disparaît (pénicilline) après ajout de pénicillinase (bétalactamase) à l' échantillon. Si la zone d' inhibition ne disparaît pas après ajout de pénicillinase, l' échantillon de lait contient une autre substance inhibitrice; la zone d' inhibition ne disparaît qu' en partie lorsque l' échantillon contient de la pénicilline et un autre antibiotique. B.5.2. Principe. Un disque de papier absorbant imprégné de lait à analyser est placé sur la surface d' un milieu gélosé ensemencé avec une souche de Bacillus stéarothermophilus variété calidolactis. La croissance normale des micro organismes rend le milieu gélosé trouble après incubation. La présence d' une zone claire autour du disque révèle la présence dans le lait de substances inhibitrices de la croissance. Le diamètre de la zone claire dépend, entre autres, de la concentration et du type des substances inhibitrices présentes dans le lait. B.5.3. Milieu, solutions étalons, micro-organisme test. Remarque : - les ingrédients des milieux doivent convenir pour les analyses bactériologiques; l' eau utilisée doit être de l' eau distillée sur verre ou de l' eau déminéralisée de pureté au moins équivalente, exempte de substances pouvant inhiber la croissance des micro-organismes. B.5.3.1. Gélose nutritive. (voir A.1.2.4.) B.5.3.2. Milieu d' essai = Plate count agar. (voir A.1.2.1.) B.5.3.3. Solution étalon de pénicilline. (voir A.1.2.8.) B.5.3.4. Solution de pénicillinase. Dissoudre une quantité suffisante de pénicillinase (bétalactamase) dans de l' eau distillée stérile pour obtenir une concentration de 40 000 Ul/ml. Cette solution, de préférence répartie en petites portions, peut être conservée à 5 °C pendant 4 semaines. B.5.3.5. Organisme test. (voir A.1.2.10.) B.5.3.6. Culture test (suspension de spores). (voir A.1.3.3.5.) B.5.4. Appareillage et verrerie. B.5.4.1. Appareillage. (voir A.1.5.1.) B.5.4.2. Verrerie. (voir A.1.5.2.) B.5.4.3. Disques de papier filtre spécifiques à la détection d' antibiotiques. Disques d' un diamètre de 12 à 13 mm (Schleicher & Schuell 601/2 ou une qualité correspondante.). Un test témoin doit être effectué sur neuf disques de chaque lot de papier filtre. Les disques imbibés d' eau distillée stérile ne peuvent pas présenter de zone claire sur la plaque de Pétri (B.5.5.4.) après incubation de 3 heures à une température entre 55 et 63 °C. B.5.5. Mode opératoire. B.5.5.1. Faire fondre le milieu d' essai (B.5.3.2.) et le refroidir à 55 °C. B.5.5.2. Ajouter, de manière aseptique, une partie de suspension de spores fraîches (B.5.3.6.) à une quantité suffisante de milieu gélosé (5 25) pour obtenir la densité appropriée de colonies dans le milieu d' essai (B.5.3.2.) ensemencé et mélange soigneusement. B.5.5.3. Transvaser dans une boîte de Pétri stérile et préalablement chauffée à 55 °C, le milieu d' essai ensemencé (B.5.5.2.) de facon à former une couche uniforme de 0,06 à 0,8 mm d' épaisseur (soit 6 ml pour des boîtes de diamètre normal de 90 mm). B.5.5.4. Placer les boîtes de Pétri sur une surface horizontale froide. Laisser solidifier le milieu gélosé. Sécher les boîtes. Retourner les boîtes solidifiées. B.5.5.5. Les boîtes de Pétri ainsi préparées doivent être utilisées de préférence le jour même, mais elle peuvent être conservées 1 semaine au maximum à condition d' être placées à 5 °C dans un sachet en polyéthylène scélé, immédiatement après leur préparation. B.5.6. Réalisation de l' essai. B.5.6.1. Préparation des échantillons. On utilise les échantillons de lait chauffé (10 min, 80 °C). Après mélange, transvaser 9,75 ml de lait dans un flacon stéril et ajouter 0,25 ml de solution de pénicillinase (B.5.3.4.) de telle manière que la concentration en pénicillinase soit de 1 000 Ul/ml (Rapport échantillon/solution de pénicillinase = 39/1). Bien mélanger et incuber à 37 °C, pendat 1 h 1/2. B.5.6.2. Détection de la pénicilline. B.5.6.2.1. Mélanger soigneusement l' échantillon. Plonger un disque de papier (B.5.4.3.) avec le bord au ras de la surface du lait jusqu'à ce qu' il soit bien imprégné, à l' aide d' une pince propre et sèche. Eliminer le surplus de lait en pressant le disque de papier contre la paroi du flacon. Placer le disque à plat sur la surface de la boîte de Pétri (B.5.5.4.) et appuyer légèrement à l' aide de la pince. B.5.6.2.2. Un disque imprégné de la solution de lait après traitement à la pénicillinase est réalisé pour chaque échantillon (B.5.6.1.). B.5.6.2.3. Les disques doivent se situer à 20 mm à 20 mm au moins les uns des autres et à 10 mm au moins du bord. B.5.6.2.4. Afin de déterminer la sensibilité du test, on place des disques dans la solution étalon de pénicilline (B.5.3.3.). On utilisera au minimum un de ces disques étalons par boîte. B.5.6.2.5. Par boîte de Pétri, on constitue aussi un blanc avec un disque exempt de substances inhibitrices. B.5.6.2.6. La boîte de Pétri où les disques de papier ont été disposés est placée pendant 2,5 à 3 h le couvercle en bas à une température d' incubation de 55 à 63 °C. B.5.6.2.7. Après incubation, les boîtes de Pétri sont examinées quant à la présence de zones d' inhibition. Mesurer ces zones claires. Il doit y avoir des zones claires d' au moins 2 mm autour des disques contenant la solution étalon de pénicilline. B.5.6.2.8. La présence de zones claires d' au moins 2 mm autour des disques contenant l' échantillon de lait révèle la présence de substances inhibitrices. B.5.7. Interprétation des résultats. B.5.7.1. Si aucune zone claire n' apparaît autour du disque contenant la solution témoin de pénicillinase, mais qu' une zone claire d' un diamètre égale ou supérieur à celui de la zone développée, apparaît autour du disque contenant la solution étalon de pénicilline, cela signifie que le taux d' antibiotiques exprimé en benzylpénicillinate de soude est au moins de 0,004 mg/ml. Si la petite zone claire autour du disque de l' échantillon de lait traité à la pénicilline a moins de 2 mm de diamètre, on n' en tient pas compte. B.5.7.2. Si le diamètre moyen de la zone d' inhibition autour du disque traité à la pénicillinase est égal au diamètre moyen de la zone claire autour du disque contenant l' échantillon de lait, ce lait contient des substances inhibitrices qui ne sont pas inactivées aux concentrations de pénicillinase utilisées dans la présente méthode. B.5.7.3. Si le diamètre moyen de la zone claire autour du disque contenant la pénicillinase est inférieur au diamètre moyen du disque de l' échantillon de lait, cet échantillon de lait contient à la fois de la pénicilline et une autre substance inhibitrice. Art. 19N8. SCHEMA DU MODE OPERATOIRE POUR LA MISE EN EVIDENCE DES SUBSTANCES INHIBITRICES NON NATURELLES DANS LE LAIT. (Schéma non repris pour des raisons techniques. Voir MB 02/12/1994, p. 29910) Remarques concernant le schéma de mise en évidence des substances inhibitrices non naturelles dans le lait. Malgré l' utilisation d' un même micro-organisme test (Bacillus stéarothermophilus var. calidolactis), la sensibilité du test dépend de la méthode d' exécution en tubes ou en cupules de microplaques d' une part ou en boîtes de Pétri d' autre part. La sensibilité pour divers antibiotiques est notablement plus grande si on effectue l' essai en tubes ou en microplaques. Lors de l' épreuve de confirmation des pénicillines, on doit tenir compte du fait que l' activité antimicrobienne de certaines pénicillines produites partiellement par synthèse n' est pas complètement anéantie par la pénase à une concentration de 1 000 Ul/ml. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N9. Annexe 9. Détermination du point de congélation. (insertion d' un titre B en fin d' annexe 9 et renumérotation) <AM 1997-08-29/37, art. 4, 002; ED : 27-09-1997> Art. N9A A. Méthode de référence. Art. 1N9A. 1. Définition. Point de congélation du lait : valeur mesurée selon la méthode décrite dans la présente norme et exprimée en degrés Celsius (°C). Art. 2N9A. 2. Principe. Refroidissement d' une prise d' essai jusu'à la température appropriée, en fonction de l' appareil, et amorce de la cristallisation par vibration mécanique entraînant une augmentation rapide de la température jusqu'à un palier correspondant au point de congélation de la prise d' essai. L' instrument est étalonné de manière à obtenir des lectures correctes pour deux solutions étalons en utilisant le même mode opératoire que pour les échantillons de lait. Dans ces conditions, le palier donne le point de congélation du lait en degrés Celsius. Art. 3N9A. 3. Appareillage et verrerie. Matériel courant de laboratoire, et notamment : 3.1. Cryoscope. Le cryoscope se compose d' un bain de réfigération contrôlé par thermostat, d' une sonde à thermistance (thermomètre à résistance semi conductrice) avec circuit associé, d' un galvanomètre, ou " lecteur ", d' un agitateur à échantillons, d' un système pour amorcer la congélation et de tubes à échantillon. 1° Bain de réfrigération. Deux types de bain de réfrigération peuvent être utilisés. a) Type à immersion. Ce type consiste en un bain parfaitement isolé contenant un liquide de refroidissement approprié agité de manière que la différence de température entre deux points quelconques du liquide ne dépasse pas 0,2 °C. La température du liquide ne doit pas varier de plus de 0,5 °C de la valeur nominale établie par le fabricant. Il est important que le liquide dans le bain soit maintenu à un niveau constant. Toute la surface du tube à échantillon au-dessous du trait repère de volume doit être recouverte par le liquide de refroidissement. b) Type à circulation. Un courant continu de liquide de refroidissement approprié circule autour du tube à échantillon. La température du liquide ne doit pas varier de plus de +/- 0,5 °C de la valeur nominale déclarée par le fabricant. Une solution aqueuse de 1,2 éthanediol (éthylèneglycol) à 33 % (v/v) constitue un liquide de refroidissement approprié. 2° Thermistance et circuit connexe. La thermistance doit être du type sonde en verre (diamètre maximal 1,80 + /- 0,2 mm et diamètre conducteur maximal de 0,31 mm). La constante de temps de la thermistance doit être inférieure à 2 secondes et la valeur de B (voir note) doit être élevée. La tension de service, le courant et la constante de dissipation doivent être tels que la température de la thermistance ne s' élève pas de plus de 0,0005 °C autour de - 0,512 °C. La tolérance maximale de la résistance doit être de +/- 5 %. Quand la sonde est en position de service dans le cryoscope, l' extrémité de la partie en verre doit se trouver dans l' axe du tube à échantillon et à 44,6 +/- 0,1 mm au-dessous du sommet du tube (voir figure 1). Un centreur doit être fourni pour permettre à l' utilisateur de placer la sonde dans cette position. Note. B définit les caractéristiques thermiques de la thermistance selon la formule : dR 1 BETA -- x - = dT R 2' T où T représente la température en degrés Kelvin, R représente la résistance en ohms à la température T. dR 1 -- x --- = coefficient de temperature. dT R B est une constante qui dépend du matériau utilisé pour la fabrication de la thermistance. En pratique courante, une valeur supérieure à 3 000 est couramment recommandée. 3° Appareil de mesure et de lecture. a) Principe de mesure. L' instrument utilisé doit opérer selon le principe de recherche du premier " palier " dans la courbe du point de congélation. Le palier correspond à la partie de la courbe dans laquelle la température reste constante à +/- 0,0002 °C près pendant 20 secondes au minimum. b) Opération manuelle. La résistance de la thermistance doit être équilibrée au moyen d' un pont de Wheatstone ou d' un appareil similaire, en utilisant des résistances stables de qualité supérieure dont la tolérance maximale est de +/- 10 % et dont le coefficient de température ne dépasse pas 2 x 10-5 °C. La résistance de référence doit avoir une linéarité dans sa gamme d' utilisation meilleure que 0,3 % de sa valeur maximale. Il doit être possible d' ajuster les résistances pour un étalonnage. L' écart entre les graduations du cadran de mesure ne doit pas être supérieure à 0,001 °C. c) Opération automatique. L' appareil de lecture doit permettre de distinguer au moins 0,001 °C dans la gamme de 0 à - 1 °C. La stabilité de l' appareil de lecture et de son circuit associé doit être telle que l' écart ne soit pas supérieur à 0,001 °C entre deux lectures successives d' une même température. La linéarité du circuit doit être telle qu' aucune erreur supérieure à +/ 0,001 °C ne s' introduise en un point quelconque dans la gamme - 0,400 à 0,600 °C quand l' appareil est utilisé correctement. 4° Agitateur. Pour agiter la prise d' essai, utiliser une tige en métal, inerte vis-à vis du lait, ayant un diamètre compris entre 1 et 1,5 mm. L' agitateur doit être réglé en amplitude et installé verticalement, son extrémité inférieure étant au même niveau que la pointe de la sonde à thermistance. Une tolérance d' environ 1,5 mm au-dessus ou au-dessous de cette position est admise. L' agitateur doit vibrer latéralement avec une amplitude suffisante indiquée par le fabricant (au moins +/- 1,5 mm) pour assurer une température uniforme à la prise d' essai pendant la détermination. Au cours de son fonctionnement, l' agitateur ne doit, à aucun moment, toucher la sonde à thermistance ou la paroi du tube. 5° Dispositif permettant d' amorcer la congélation. Ce dispositif peut être n' importe quel appareil qui, en fonctionnant, amorce instantanément la congélation de la prise d' essai, de telle sorte que la température de cette prise d' essai s' élève au voisinage du point de congélation. L' agitateur peut être utilisé à cet effet; une des méthodes consiste à augmenter l' amplitude de vibration pendant 1 à 2 secondes, de facon que l' agitateur touche la paroi du tube à échantillon. 6° Tubes à échantillon. Les tubes à échantillon (voir figure 1) doivent être en verre de 50,8 +/ 0,1 mm de longueur, 16,0 +/- 0,1 mm de diamètre extérieur et 13,5 +/ 0,1 mm de diamètre intérieur. L' épaisseur du verre ne doit pas varier de plus de 0,1 mm sur l' ensemble de la paroi. Les tubes doivent avoir un trait repère situé 29,8 mm au-dessous du bord (21 mm au-dessus de la base du tube) pour indiquer un volume d' échantillon de 2,5 +/- 0,1 ml. 7° Alimentation électrique. La tension d' alimentation doit être stabilisée, soit à l' intérieur ou à l' extérieur de l' appareil, de sorte que les fluctuations éventuelles ne dépassent pas +/- 1 % de la valeur nominale quand l' alimentation principale varie de +/- 6 %. 3.2. Balance analytique. 3.3. Fioles jaugées à un trait de 1 000 ml de capacité, classe A. 3.4. Etuve, bien ventilée, réglable à 130 +/- 1 °C. ou four électrique, ventilé, réglable à 300 +/- 25 °C. 3.5. Dessiccateur. Art. 4N9A. 4. Réactifs. 4.1. Eau distillée dans un appareil en verre borosilicaté, bouillie et refroidie à 20 +/- 2 °C dans une fiole pourvue d' un tube absorbant l' anhydride carbonique. 4.2. Chlorure de sodium, de qualité analytique, finement broyé, séché pendant cinq heures à 300 +/- 25 °C dans le four électrique ou séché dans l' étuve à 130° +/- 1 °C pendant au moins 24 heures et refroidi à la température ambiante dans un dessiccateur efficace. 4.3. Solutions étalons. Peser la quantité appropriée (voir tableau 1) de chlorure de sodium séché (4.2.) dans un vase à peser. Dissoudre dans l' eau (4.1), transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 1 000 ml et compléter au trait repère avec l' eau à 20 +/- 2 °C. Conserver cette solution pendant 2 mois au maximum à 5 °C environ dans des flacons en polyéthylène bien bouchés d' une capacité maximale de 250 ml. Tableau 1 - Point de congélation de solutions de chlorure de sodium à 20 °C. g NaCl/l °C 6,859 - 0,408 7,818 - 0,464 8,149 - 0,483 8,314 - 0,492 8,480 - 0,502 8,646 - 0,512 8,811 - 0,521 8,977 - 0,531 9,143 - 0,541 10,155 - 0,600 Avant d' utiliser une solution étalon, la mélanger soigneusement par gitation et retournements successifs du flacon. Ne pas agiter violemment a solution étalon, afin d' éviter l' incorporation d' air. Les prises d' essai d' une solution étalon doivent être effectuées par coulement dans un gobelet sec et propre. Ne pas utiliser de pipettes. Ne pas utiliser de solutions contenues dans des flacons aux trois-quarts ides et ne pas utiliser de solutions ayant plus de deux mois si elles ne ontiennent pas un fongicide (solution de thiomersal à 10 g/l par exemple). Art. 5N9A. 5. Etalonnage du cryoscope à thermistance. Le cryoscope doit étre réglé, de telle sorte que la température ambiante e s' écarte pas de plus de 1 °C de la température d' étalonnage. Le ryoscope ne peut pas être exposé à la lumière du soleil, aux courants d' ir ou à une température ambiante dépassant 26-27 °C. S' assurer que le cryoscope est en état de fonctionnement conformément aux indications du fabricant et qu' il a été mis en service 12 h au moins avant de procéder à l' étalonnage. Vérifier la position de la sonde, l' amplitude des vibrations de l' agitateur et la température des fluides cryogéniques. Choisir deux solutions étalons (voir tableau 1) qui encadrent de près la valeur supposée du point de congélation supposé du lait à analyser. La différence entre les points de congélation des deux solutions devrait, de préférence, ne pas dépasser - 0,100 °C. (Avec certains types de cryoscopes actuellement disponibles, le circuit associé à la thermistance est concu de manière à se stabiliser sur une valeur spécifique du point de congélation dans la gamme des mesures de l' appareil. Dans ce cas, la sélection, parmi les solutions étalons, d' une solution étalon ayant ce point de congélation facilite l' étalonnage; le fabricant doit indiquer cette valeur). Introduire à l' aide d' une pipette 2,5 +/- 0,1 ml d' une solution étalon dans un tube à échantillon propre et sec, puis procéder à la mesure à l' aide du cryoscope. Note. Les tubes à échantillon utilisés pour l' étalonnage doivent être fabriqués et traités comme ceux utilisés pour les échantillons de lait (même type de verre, laves et rincés avec de l' eau déminéralisée). Les températures des solutions étalons doivent être identifique à celles des échantillons de lait. Procéder aux contrôles d' étalonnage, en respectant les indications du fabricant, jusqu'à ce que la lecture du cryoscope soit identique au point de congélation de la solution étalon. Répéter cette opération avec l' autre solution étalon et continuer en alternant de la sorte jusqu'à ce que les lectures successives donnent, pour chaque solution, la valeur correcte de leur point de congélation sans réglage supplémentaire. Le cryoscope est alors prêt à l' emploi et indique directement, sans correction, le point de congélation de l' échantillon de lait. Art. 6N9A. 6. Préparation de l' échantillon à analyser. 6.1. Si nécessaire, conserver les échantillons à une température entre 0 et 5 °C. 6.2. Eliminer de l' échantillon tout corps étranger visible ou toute matière grasse solide par filtrage, si nécessaire, dans un récipient sec et propre et mélanger doucement l' échantillon. Si un filtre est utilisé, il doit être inerte vis-à-vis du lait et efficace à la température du laboratoire. 6.3. Le lait peut être analysé à sa température de conservation (entre 0 et 5 °C) ou peut être amené à la température du laboratoire immédiatement avant de commencer l' analyse. Lors de leur utilisation, les solutions étalons et les échantillons de lait doivent cependant être à la même température. 6.4. Déterminer l' acidité titrable du lait, autant que possible, en même temps que la détermination du point de congélation. Les échantillons dont l' acidité dépasse 0,18 g d' acide lactique pour 100 ml de lait ne peuvent pas être analysés. 6.5. Le lait UHT et le lait stérilisé doivent reposer au moins 20 minutes dans un récipient ouvert avant d' être analysés. Art. 7N9A. 7. Mode opératoire. 7.1. Vérifications préliminaires. S' assurer que le niveau et la température du liquide de refroidissement sont conformes aux indications du fabricant et que la sonde à thermistance se trouve dans un tube à essai vide, à l' emplacement exact de l' échantillon. Mettre le cryoscope en service et s' assurer que le liquide de refroidissement est convenablement agité ou circule correctement selon le cas. Si le cryoscope a fonctionné pendant 12 h au moins, vérifier la température du liquide de refroidissement de même que la position de l' agitateur et l' amplitude de ses vibrations. 7.2. Vérification de routine de l' étalonnage. Avant chaque série d' essais, mesurer le point de congélation d' une solution étalon de chlorure de sodium (par exemple, une solution ayant un point de congélation de - 0,512 °C) jusqu'à ce que les valeurs obtenues à l' issue de deux déterminations consécutives ne diffèrent pas de plus de 0, 001 °C. Si la moyenne de ces valeurs diffère de plus de 0,002 °C du point de congélation de la solution étalon, étalonner à nouveau le cryoscope comme décrit au point 5. Si le cryoscope est utilisé en continu, effectuer la vérification de routine de l' étalonnage au moins une fois par heure, en respectant les indications du fabricant. 7.3. Détermination du point de congélation du lait. Mélanger le récipient contenant l' échantillon de lait par agitations modérées et retournements successifs. Eviter d' agiter violemment l' échantillon afin d' éviter toute incorporation d' air. Introduire à l' aide d' une pipette 2,5 +/- 0,1 ml de lait dans un tube à échantillon sec et propre. S' assurer que la sonde et l' agitateur sont propres et secs, les essuyer si nécessaire de bas en haut avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas. Placer le tube à échantillon dans le cryoscope étalonné en suivant les indications du fabricant. Le lait est refroidi et la congélation amorcée, à +/- 0,1 °C près de la température indiquée par le fabricant. (Sur certains appareils automatiques, cette température peut être relevée sur le lecteur digital; sur les appareils manuels, la précision nécessaire est obtenue en s' assurant que la congélation débute lorsque l' aiguille ou le fil du galvanomètre coïncide avec le repère approprié). Si, pour une raison quelconque, la congélation débute avant ou après la plage de température indiquée, arrêter l' analyse et la recommencer avec une autre prise d' essai de lait. Si cette deuxième prise d' essai congèle aussi avant la température indiquée, chauffer une fraction aliquote du lait à examiner à 45 °C et la maintenir à cette température pendant cinq minutes pour permettre la fusion de la matière grasse cristalline. Refroidir ensuite à la température d' essai et procéder immédiatement à une nouvelle analyse. La température du lait après le début de la congélation augmente rapidement jusqu'à une valeur qui reste pratiquement constante pendant un certain temps avant de redescendre. Le point de congélation correspond à la température la plus élevée atteinte durant cette période, valeur qu' il convient de relever. Note. Le temps pendant lequel la température reste constante et l' intervalle de temps entre le début de la congélation et l' obtention de la température la plus élevée différent d' un échantillon à l' autre et sont considérablement plus courts pour l' eau et les solutions étalons de chlorure de sodium que pour le lait. Il est essentiel de relever la température la plus élevée. Lorsque la mesure est effectuée de facon satisfaisante, enlever le tube, le rincer à l' eau puis essuyer de bas en haut la sonde à thermistance et l' agitateur avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas et procéder à une seconde détermination sur une autre prise d' essai. Si la différence entre les points de congélation obtenus est supérieure à la valeur de la répétabilité (0,004 °C), effectuer une seconde détermination sur une autre prise d' essai. Si les valeurs des deux déterminations concordent à 0,004 °C près, elles devraient être retenues et utilisées pour le calcul du résultat final. Détail du cryoscope à thermistance (position du tube à essai par rapport à la bille de la thermistance et à l' agitateur). (Croquis non repris pour des raisons techniques. Voir MB 02/12/1994, p. 29914) 7.4. Refroidissement de la sonde. Après utilisation de l' appareil, placer un tube à échantillon vide à l' emplacement de l' échantillon et abaisser le mandrin de facon à garder la sonde au froid. (Avec certains types de cryoscope, cela n' est pas possible; s' assurer dans ce cas que la sonde est bien refroidie avant d' effectuer les mesures en procédant par exemple à plusieurs déterminations factices jusqu'à obtention de lectures identiques). Art. 8N9A. 8. Expression des résultats. 8.1. Calcul. Si l' étalonnage est confirmé après vérification de l' étalonnage en routine, prendre comme résultat la moyenne des deux valeurs acceptables obtenues pour le point de congélation arrondie à la troisième décimale. Si la somme des deux valeurs acceptables de déterminations effectuées en double est un nombre impair, la moyenne doit être arrondie à la valeur paire la plus proche comme le montre l' exemple suivant : Point de congelation ( C) Valeurs de determination en double Moyenne 0,544 - 0,545 - 0,544 0,545 - 0,546 - 0,546 8.2. Répétabilité (r) : 0,004 °C. Reproductibilité (R) : 0,006 °C. Art. N9B. B. Méthode de triage par spectrophotométrie dans l' infra-rouge moyen. Art. 1N9B. 1. Principe. La détermination du point de congélation est effectuée par une méthode indirecte basée sur la spectrophotométrie dans l' infra-rouge moyen couplée à une mesure de conductivité et sur la calibration des résultats sur les résultats de la méthode de référence. Art. 2N9B. 2. Réactifs. Aucun réactif n' est nécessaire pour l' exécution de la spectrophotométrie dans le moyen infra-rouge. Art. 3N9B. 3. Appareillage. 3.1. Spectrophotomètre concu pour être appliqué dans l' infra-rouge moyen. Les mesures spectrophotométriques dans l' infra-rouge moyen sont couplées à une mesure de conductivité. 3.2. Bain-marie à circulation d' eau réglable à 40° C (précision de plus ou moins 2° C). Art. 4N9B. 4. Mode opératoire. Une description détaillée du mode opératoire doit être présentée dans le protocole de l' organisme interprofessionnel. 4.1. Préparation de l' échantillon. Les échantillons à analyser sont préalablement réchauffés dans un bain marie à 40 \+ 2°C et ensuite soigneusement mélangés. Les échantillons doivent être analysés dans un délai de 15 minutes après mélange. 4.2. Mise en route du spectrophotomètre dans l' infra-rouge moyen. L' appareil doit être mis en route conformément aux instructions du constructeur. Lors de l' installation, l' appareil doit être calibré par rapport à la méthode de référence cryoscopique selon les instructions du constructeur. Cette calibration doit être vérifiée tous les 2 mois par l' organisme interprofessionnel sur un minimum de 15 échantillons de lait cru selon une procédure détaillée dans son protocole. 4.3. Conduite des analyses. Toutes les opérations de nettoyage et de maintenance de l' appareil seront exécutées conformément aux spécifications du constructeur de l' appareil. Les analyses sont exécutées selon les instructions du constructeur. La droite de calibration doit être vérifiée chaque jour sur un minimum de 5 échantillons de lait cru déterminés par la méthode de référence cryoscopique. Les critères d' acceptation de la calibration sont repris dans le protocole de l' organisme interprofessionnel. La stabilité de l' appareil est vérifiée par l' analyse toutes les demi heures d' un échantillon de lait pilote. La constitution et les critères d' utilisation de ce lait pilote sont décrits dans le protocole de l' organisme interprofessionnel. Chaque échantillon de lait pilote ne peut être utilisé qu' une seule fois. La valeur limite de triage est déterminée par le Service Productions laitière et avicole. Elle est fixée à - 0,515° C. Les échantillons de lait dont le point de congélation est supérieur ou égal à la valeur limite de triage doivent être confirmés par la méthode de référence cryoscopique. Cette confirmation doit être effectuée dans les 2 heures qui suivent la mesure au spectrophotomètre et après que l' échantillon soit revenu à une température inférieure à 25° C. 4.4. Etablissement de fiches de contrôles. Une fiche de contrôle de l' appareil doit être établie chaque jour en reprenant notamment : les données sur l' entretien de la calibration; les résultats du contrôle de la droite de calibration; les résultats de l' échantillon de lait pilote; les problèmes éventuels rencontrés dans l' exécution des analyses et les actions entreprises pour les résoudre. Les fiches de contrôle seront conservées pendant une période de 6 mois minimum. Art. N10. Annexe 10. - Examen de la propreté visible. Art. 1N10. 1. Principe. La détermination de la propreté visible est réalisée par une épreuve de filtration. Celle-ci consiste à filtrer, à l' aide d' un appareil de filtration, un volume défini de lait à travers un petit disque d' ouate. Art. 2N10. 2. Equipement. 2.1. Appareillage. L' appareil de filtration doit être approuvé par le Ministère de l' Agriculture. 2.2. Disques d' ouate. disques d' ouate correspondant à la qualité déterminée par le Ministère de l' Agriculture. disques d' ouate standards parmi lesquels un disque dont le dépôt est de 0,25 US. Art. 3N10. 3. Exécution. Environ 40 ml de lait sont aspirés ou refoulés sans interruption avec l' appareillage, à travers un disque d' ouate, de surface circulaire, dont le diamètre est de 6,4 mm. En dérogation à ce qui a été écrit auparavant, le test de filtration peut aussi être effectué sur des échantillons d' environ 200 ml à 250 ml de lait. La surface filtrante doit avoir, dans ce cas, un diamètre de respectivement 14 ou 16 mm. Après utilisation, les disques sont séchés. Il est impératif d' éviter le brunissement par la chaleur. Art. 4N10. 4. Interprétation. L' interprétation a lieu sur les disques secs. La classification se fait par comparaison aux disques standards. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N11. Annexe 11. - Recherche de la présence de traces de désinfectants (oxydants). Art. 1N11. 1. Principe. Par l' action d' oxydants sur l' iodure de potassium en milieu acide, l' iode est libéré et coloré en bleu par une solution d' amidon. Art. 2N11. 2. Produits chimiques. Les produits chimiques doivent être de qualité " pour analyse ". L' eau utilisée est de l' eau déminéralisée. 2.1. Acide chlorhydrique 36 - 38 % (exempt de chlore). A conserver à l' obscurité. 2.2. Solution d' amidon 2 %. La solution peut être conservée au frigo pendant une semaine. Utiliser de préférence un amidon selon Zulkowsky. 2.3. Solution d' iodure de potassium 10 %. La solution doit être préparée le jour de l' exécution de l' épreuve et elle doit être conservée à l' obscurité. 2.4. Solution de chloramine T. préparation de la solution A. Peser 0,1 gr de chloramine T p.a. (C7H7ClNNaO2S.3H2O). Transférer dans un ballon jaugé de 50 ml et porter au trait de jauge avec de l' eau déminéralisée. Bien mélanger. Cette solution conservée à 4 °C, peut être utilisée pendant une semaine maximum. préparation de la solution B. Pipetter 3 ml de la solution A et ajouter 17 ml de lait. Utiliser de préférence du lait cru de différentes fermes, qui ne subit aucun changement de coloration (voir paragraphe 4 : exécution). Bien mélanger. Cette solution constitue la solution standard et est équivalente à 20 ppm de chlore actif. Cette solution peut au maximum être utilisée pendant 3 jours et doit être conservée au frais et à l' obscurité. Art. 3N11. 3. Equipement. 3.1. Des tubes à essais. 3.2. Des pipettes de 1 ml, graduées au 0,1 ml. Les tubes à essais et pipettes doivent être secs et bien nettoyés. Art. 4N11. 4. Exécution. Veiller à ce que lors de l' exécution des points 4.1. à 4.4., la paroi du tube à essais se trouvant au-dessus de la surface du liquide ne soit pas mouillée, afin d' éviter des réactions faussement positives. 4.1. Pipetter 1 ml de lait à analyser au fond d' un tube à essais. Pipetter de la même manière 1 ml de chloramine T (solution B) dans un autre tube à essais. 4.2. Ajouter à chaque tube à essais 0,1 ml de la solution d' iodure de potassium et 0,1 ml de la solution d' amidon. Bien mélanger. 4.3. Ajouter à chaque tube à essais 1 ml d' acide chlorhydrique sans que celui-ci touche la paroi du tube à essais. 4.4. Mélanger immédiatement après addition de l' acide. 4.5. Apprécier la couleur après 3 minutes. Considérer l' échantillon comme positif lorsque la coloration de l' échantillon est d' intensité égale ou supérieure à celle du standard. 4.6. Quand on effectue des séries d' analyses, il faut recommencer l' épreuve lorsqu'un échantillon réagit positivement. Si la réaction est à nouveau positive, on estime que l' échantillon contient des traces d' oxydants. Remarques : il est impératif de respecter scrupuleusement la durée de 3 minutes, nécessaire au développement de la coloration. en routine, il est conseillé d' effectuer les analyses par petites séries. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N12. Annexe 12. - Détermination de la teneur en matière grasse. Art. 1N12. 1. Principe. Extraction d' une solution ammoniaco-éthanolique d' une prise d' essai au moyen d' oxyde diéthylique et d' éther de pétrole, élimination des solvants par distillation ou évaporation puis détermination de la masse des substances extraites solubles dans l' éther de pétrole (méthode habituellement connue sous le nom de Röse-Gottlieb). Art. 2N12. 2. Réactifs. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et ne doivent pas laisser de résidu appréciable lors de l' essai à blanc. Pour vérifier la qualité des réactifs, effectuer une détermination comme spécifié au point 4.3. Pour le pesage, utiliser une fiole, un gobelet ou une capsule métallique vide, préparés en tant que tare comme indiqué au point 4.4 (pour pouvoir corriger l' incidence de modifications des conditions atmosphériques sur le poids obtenu). Si le résidu global, corrigé en fonction des modifications apparentes de la masse de la tare, est supérieur à 2,5 mg, déterminer le résidu des solvants en évaporant respectivement 100 ml d' oxyde diéthylique et 100 ml d' éther de pétrole. Utiliser également une tare pour le pesage. Si le résidu est supérieur à 2, 5 mg, nettoyer le solvant par distillation ou le remplacer. 2.1. Hydroxyde d' ammonium, solution à environ 25 % (m/m) de NH3. Une solution d' hydroxyde d' ammonium plus concentrée peut également être utilisée. 2.2. Ethanol, au moins 94 % (v/v). De l' éthanol dénaturé par du méthanol peut être utilisé pour autant qu' il soit certain que cela ne modifiera en rien les résultats de la détermination. 2.3. Rouge congo ou rouge de crésol. Dissoudre 1 g de rouge congo ou de rouge de crésol dans l' eau et diluer à 100 ml. Note. L' emploi de cette solution, qui permet de mieux voir l' interface entre e solvant et la couche aqueuse, est facultatif. D' autres solutions queuses de colorants peuvent être utilisées pour autant qu' elles ne odifient pas le résultat de la détermination. 2.4. Oxyde diéthylique, exempt de peroxydes, ne contenant pas plus de 2 g/kg d' antioxydants et conforme aux spécifications de l' essai à blanc. 2.5. Ether de pétrole ayant un point d' ébullition entre 30 et 60 °C. 2.6. Mélange de solvants préparé peu de temps avant l' emploi par mélange e volumes égaux d' oxyde diéthylique et d' éther de pétrole. Art. 3N12. 3. Appareillage et verrerie. Avertissement. Etant donné que la détermination fait intervenir des solvants volatifs nflammables, l' appareillage électrique utilisé doit être conforme à la égislation relative à l' emploi de ces solvants. Matériel courant de laboratoire, et notamment : 3.1. Balance analytique. 3.2. Centrifugeuse dans laquelle les fioles ou les tubes d' extraction euvent être soumis à une vitesse de rotation de 500 à 600 tr/min-1 de facon à produire un champ de gravitation de 80 à 90 g à l' extrémité extérieure des fioles ou des tubes. Note. L' emploi d' une centrifugeuse est facultatif. 3.3. Appareils de distilation ou d' évaporation permettant de distiller les solvants et l' éthanol des fioles ou de les évaporer des béchers et des capsules à une température n' excédant pas 100 °C. 3.4. Etuve, à chauffage électrique, munie d' ouies de ventilation complètement ouvertes, réglables à une température de 102 +/- 2 °C dans l' espace utilisé. L' étuve doit être munie d' un thermomètre convenable. 3.5. Bain d' eau réglable à une température de 35 à 40 °C. 3.6. Fioles d' extraction de la matière grasse, type Mojonnier. Note. On peut également utiliser des tubes d' extraction de la matière grasse munis d' un siphon ou d' un dispositif de lavage dont le mode opératoire, différent dans ce cas, est décrit au point 6. Les fioles (ou les tubes) doivent être pourvus de bouchons en verre dépoli, en liège de bonne qualité ou en une autre matière inaltérable aux réactifs utilisés. Les bouchons en liège doivent être lavés à l' oxyde diéthylique, maintenus dans l' eau à 60 °C ou plus pendant au moins 15 minutes et ensuite mis à refroidir dans l' eau, de facon à en être imprégnés au moment de l' emploi. 3.7. Portoir pour maintenir les fioles (ou les tubes) d' extaction de la matière grasse. 3.8. Flacon de lavage approprié à l' emploi du mélange de solvants. Ne pas utiliser de flacon de lavage en plastique. 3.9. Récipients pour la récupération de la matière grasse, par exemple fioles à ébullition (fioles à fond plat) ou d' Erlenmeyer d' une capacité de 125-250 ml ou capsules métalliques. Lorsqu'on utilise des capsules métalliques, elle doivent, de préférence, être en acier inxoydable, à fond plat, avec un bec et elles doivent avoir un diamètre de 80 à 100 mm et une hauteur d' environ 50 mm. 3.10. Régulateurs d' ébullition, exempts de matière grasse, en porcelaine non poreuse, en carbure de silicium ou billes de verre (emploi facultatif dans le cas de capsules métalliques). 3.11. Eprouvettes graduées de 5 et 25 ml de capacité. 3.12. Pipettes graduées de 10 ml de capacité. 3.13. Pinces métalliques permettant de tenir les fioles, béchers ou capsules. Art. 4N12. 4. Mode opératoire. 4.1. Préparation de l' échantillon pour essai. Amener la température de l' échantillon pour essai à 35-40 °C environ pendant 15 minutes en utilisant le bain d' eau si nécessaire. Mélanger convenablement, mais doucement, l' échantillon en retournant plusieurs fois le récipient sans provoquer de mousse ou de barattage et refroidir rapidement à 20 °C environ. 4.2. Prise d' essai. Mélanger l' échantillon (4.1) en retournant doucement le récipient trois ou quatre fois et peser immédiatement, à 1 mg près, 10 à 11 grammes de l' échantillon pour essai, directement ou par différence, dans une fiole d' extraction. La prise d' essai doit être placée le plus complètement possible dans le bulbe inférieur (étroit) de la fiole d' extraction. 4.3. Essai à blanc. Effectuer un essai à blanc en même temps que la détermination en utilisant le même mode opératoire et les mêmes réactifs, mais en remplacant la prise d' essai par 10 à 11 ml d' eau. Le changement de masse apparent du récipient de récupération de la matière grasse, corrigé du changement apparent de masse du récipient de contrôle, ne doit pas être supérieur à 2,5 mg. 4.4. Préparation du récipient pour la récupération de la matière grasse. Sécher un récipient contenant quelques régulateurs d' ébullition - pour permettre une ébullition modérée au cours de l' élimination ultérieure du solvant - dans l' étuve pendant une heure. Laisser refroidir le récipient (non dans un dessiccateur, mais à l' abri de la poussière) à la température de la salle des balances (pendant une heure au moins pour les récipients en verre et pendant 30 minutes au moins pour les capsules métalliques). A l' aide de pinces (en particulier pour éviter les écarts de température), placer le récipient sur la balance et peser à 0,1 mg près. 4.5. Détermination. 4.5.1. Ajouter 2 ml de solution d' hydroxyde d' ammonium ou un volume équivalent d' une solution plus concentrée et mélanger vigoureusement avec la prise d' essai dans le bulbe étroit de la fiole. Après addition de l' hydroxyde d' ammonium, effectuer la détermination sans attendre. 4.5.2. Ajouter 10 ml d' éthanol et mélange doucement, mais convenablement, en laissant le contenu de la fiole aller et venir entre les deux bulbes : éviter d' amener le liquide trop près du col de la fiole. Ajouter, éventuellement, deux gouttes de solution de rouge congo ou de rouge de crésol. 4.5.3. Ajouter 25 ml d' oxyde diéthylique fermer la fiole avec un bouchon en liège saturé d' eau ou avec un bouchon mouillé avec de l' eau, agiter la fiole vigoureusement, mais sans excès (afin d' éviter la formation d' émulsions persistantes), pendant une minute en position horizontale, le bulbe étroit étant en haut. De temps en temps, laisser le liquide du bulbe large passer dans le bulbe étroit. Si nécessaire, refroidir la fiole à l' eau courante puis retirer avec précaution le bouchon en liège ou le dispositif de fermeture et le rincer ainsi que le col de la fiole avec une petite quantité de mélange de solvants en se servant du flacon de lavage, de facon à ce que les liquides de rincage coulent dans la fiole. 4.5.4. Ajouter 25 ml d' éther de pétrole, obturer la fiole à l' aide du bouchon en liège réhumidifié (réhumidification par trempage dans de l' eau) ou d' un autre dispositif de fermeture et agiter doucement la fiole pendant 30 secondes comme décrit, au point 4.5.3. 4.5.5. Centrifuger la fiole bouchée pendant 1 à 5 minutes à une vitesse de rotation de 500 à 600 tr/min-1. En l' absence d' une centrifuguese, laisser la fiole bouchée reposer dans le portoir pendant 30 minutes au moins jusqu'à ce que la couche surnageante soit claire et nettement séparée de la couche aqueuse. Si nécessaire, refroidir la fiole à l' eau courante. 4.5.6. Enlever avec précaution le bouchon en liège ou tout autre dispositif de fermeture et le rincer ainsi que l' intérieur du col de la fiole avec un peu de mélange de solvants de facon à ce que les liquides de rincage coulent dans la fiole. Si l' interface se situe au-dessous du fond du col de la fiole, le faire monter à ce niveau en ajoutant doucement de l' eau par le côté de la fiole, afin de faciliter la décantation du solvant. 4.5.7. En tenant la fiole d' extraction par le bulbe étroit, décanter avec soin le plus possible de la couche surnageante dans le récipient préparé, destiné à la récupération de la matière grasse contenant quelques régulateurs d' ébullition dans le cas des fioles (facultatif avec les capsules métalliques), en évitant de décanter une partie quelconque de la couche aqueuse. 4.5.8. Rincer l' extérieur du col de la fiole d' extraction avec un peu de mélange de solvants en receuillant les liquides de rincage dans le récipient destiné à la récupération de la matière grasse et en veillant à ce que le mélange de solvants ne soit pas projeté sur l' extérieur de la fiole d' extraction. Le solvant peut, éventuellement, être éliminé totalement ou partiellement du récipient par distillation ou évaporation comme écrit au point 4.5.12. 4.5.9. Ajouter 5 ml d' éthanol au contenu de la fiole d' extraction en se servant de l' éthanol pour rincer l' intérieur du col de la fiole et mélanger comme décrit au point 4.5.2. 4.5.10. Effectuer une deuxième extraction en recommencant les opérations décrites aux points 4.5.3. à 4.5.8., mais en utilisant seulement 15 ml d' xyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole : utiliser l' oxyde diéthylique pour rincer l' intérieur du col de la fiole d' extraction. Si nécessaire, faire monter l' interface au milieu du col de la fiole, pour permettre à la décantation finale des solvants d' être aussi complète que possible. 4.5.11. Effectuer une troisième extraction en répétant à nouveau les opérations décrites aux points 4.5.3. à 4.58., mais en utilisant seulement 15 ml d' oxyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole : utiliser l' oxyde diéthylique pour rincer l' interieur du col de la fiole d' extraction. Si nécessaire, faire monter l' interface au milieu du col de la fiole d' mélanger comme décrit au point 4.5.2. 4.5.10. Effectuer une deuxième extraction en recommencant les opérations décrites aux points 4.5.3. à 4.5.8., mais en utilisant seulement 15 ml d' xyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole : utiliser l' oxyde diéthylique pour rincer l' intérieur du col de la fiole d' extraction. Si nécessaire, faire monter l' interface au milieu du col de la fiole, pour permettre à la décantation finale des solvants d' être aussi complète que possible. 4.5.11. Effectuer une troisième extraction en répétant à nouveau les opérations décrites aux points 4.5.3. à 4.58., mais en utilisant seulement 15 ml d' oxyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole : utiliser l' oxyde diéthylique pour rincer l' interieur du col de la fiole d' extraction. Si nécessaire, faire monter l' interface au milieu du col de la fiole d' extraction pour permettre à la décantation finale des solvants d' être aussi complète que possible. La troisième extraction peut être supprimée dans le cas du lait écrémé. 4.5.12. Eliminer les solvants (éthanol y compris), aussi complètement que possible, de la fiole par distillation ou du bécher ou de la capsule par évaporation, en rincant l' intérieur du col de la fiole avec un peut de mélange de solvants avant de commencer la distillation. 4.5.13. Chauffer le récipient destiné à la récupération de la matière grasse (la fiole étant penchée pour permettre aux vapeurs de solvants de s' échapper) durant une heure dans l' étuve. Retirer le récipient destiné à la récupération de la matière grasse de l' étuve, laisser refroidir (pas dans un dessiccateur, mais à l' abri de la poussière) à la température de la salle des balances (pendant une heure au moins pour les récipients en verre, pendant 30 minutes au moins pour les capsules métalliques) et peser à 0,1 mg près. Ne pas essuyer le récipient juste avant la pesée. Placer le récipient sur la balance à l' aide de pinces pour éviter notamment les variations de température. 4.5.14. Répéter les opérations décrites en 4.5.13. jusqu'à ce que la masse du récipient destiné à la récupération de la matière grasse diminue de 0,5 mg ou moins, ou augmente, entre deux pesées successives. Noter la masse minimale comme étant la masse du récipient de récupération de la matière grasse et de la matière extraite. 4.5.15. Ajouter 25 ml d' éther de pétrole au récipient d' extraction de la matière grasse, de facon à vérifier si oui ou non la matière extraite est entièrement soluble. Chauffer doucement et agiter le solvant par un mouvement rotatoire jusu'à dissolution de toute la matière grasse. Si la matière extraite est entièrement soluble dans l' éther de pétrole, relever la masse de la matière grasse comme étant la différence entre la masse finale de la fiole contenant l' extrait (4.5.14) et sa masse initiale (4.4). 4.5.16. Si la matière extraite n'st pas entièrement soluble dans l' éther de pétrole, ou en cas de doute, extraire complètement la matière grasse du récipient par des lavages répétés avec de l' éther de pétrole chaud. Laisser déposer les matières insolubles et décanter soigneusement l' éther de pétrole sans enlever les matières insolubles. Répéter cette opération trois fois en utilisant l' éther de pétrole pour rincer l' intérieur du col du récipient. Enfin, rincer l' extérieur du sommet du récipient avec le mélange de solvants, de telle sorte que le solvant ne se répande pas à l' extérieur du récipient. Chasser les vapeurs d' éther de pétrole en chauffant le récipient pendant 1 heure dans l' étuve, laisser refroidir et peser comme décrit aux points 4.5.13 et 4.5.14. Relever la masse de la matière grasse comme étant la différence entre la masse déterminée au point 4.5.14 et cette masse finale. Art. 5N12. 5. Expression des résultats. 5.1. Calcul et formule. Calculer la teneur en matières grasses, exprimée en pourcentage en masse, selon la formule : (m1 - m2) - (m3 - m4) F = --------------------- x 100 m0 où F = est la teneur en matière grasse. m0 = représente la masse, en grammes, de la prise d' essai (4.2). m1 = représente la masse, en grammes, du récipient destiné à la récupération de la matière grasse et de la matière extraite, déterminée au point 4.5.14. m2 = représente la masse, en grammes, du récipient préparé pour la récupération de la matière grasse ou, dans le cas de matières non dissoutes, du récipient destiné à la récupération de la matière grasse et du résidu insoluble, déterminée au point 4.5.16. m3 = représente la masse, en grammes, du récipient de récupération de la matière grasse utilisé pour l' essai à blanc (4.4.) et de la matière extraite, déterminée au point 4.5.14. m4 = représente la masse, en grammes, du récipient de récupération de la matière grasse (4.4.) utilisé pour l' essai à blanc (4.3) ou, dans le cas des matières non dissoutes, du récipient de récupération de la matière grasse et du résidu insoluble déterminée au point 4.5.16. Noter le résultat à 0,01 % près. 5.2. Fidélité. 5.2.1. Répétabilité (r). pour le lait entier et le lait partiellement écrémé : 0,02 g de matière grasse pour 100 g de produit, pour le lait écrémé : 0,01 g de matière grasse pour 100 g de produit. 5.2.2. Reproductibilité (R). pour le lait entier : 0,04 g de matière grasse pour 100 g de produit, pour le lait partiellement écrémé : 0,03 g de matière grasse pour 100 g de produit, pour le lait écrémé : 0,025 g de matière grasse pour 100 g de produit. Art. 6N12. 6. Autre mode opératoire avec tubes d' extraction de la matière grasse, munis d' un siphon ou d' un dispositif de lavage. 6.1. Mode opératoire. 6.1.1. Préparation de l' échantillon pour essai : cf. 4.1. 6.1.2. Prise d' essai. Procéder comme précisé au point 4.2, mais en utilisant les tubes d' extraction de la matière grasse. La prise d' essai doit être transférée aussi complètement que possible au fond du tube d' extraction. 6.1.3. Essai à blanc : cf. 4.3. 6.1.4. Préparation du récipient destiné à la récupération de la matière grasse : cf. 4.4. 6.1.5. Détermination. 6.1.5.1. Ajouter 2 ml de solution d' hydroxyde d' ammonium ou un volume équivalent d' une solution d' hydroxyde d' ammonium plus concentrée et mélanger convenablement avec la prise d' essai prétraitée au fond du tube. Après addition de l' hydroxyde d' ammonium, effectuer la détermination sans attendre. 6.1.5.2. Ajouter 10 ml d' éthanol et mélanger doucement, mais convenablement, au fond du tube. Ajouter, éventuellement, deux gouttes de solution de rouge congo ou de rouge de crésol. 6.1.5.3. Ajouter 25 ml d' oxyde diéthylique, fermer le tube avec un bouchon en liège saturé d' eau ou avec un bouchon en une autre matière mouillé avec de l' eau et agiter vigoureusement le tube, mais pas trop fort (afin d' éviter la formation d' émulsions persistantes), par des retournements répétés pendant une minute. Si nécessaire, refroidir le tube sous l' eau courante, retirer avec précaution le bouchon en liège ou en une autre matière, le rincer ainsi que le col du tube avec une petite quantité de mélange de solvants en utilisant le flacon de lavage, de facon à ce que les liquides de rincage coulent dans le tube. 6.1.5.4. Ajouter 25 ml d' éther de pétrole, fermer le tube avec le bouchon en liège réhumidifié (réhumidifié en le trempant dans de l' eau) ou en une autre matière et agiter soigneusement le tube pendant 30 secondes comme décrit au point 6.1.5.3. 6.1.5.5. Centrifuger le tube ferme pendant 1 à 5 minutes à une vitesse de rotation de 500 à 600 tr min-1. Si l' on ne dispose pas d' une centrifugueuse (cf. note au point 3.2), laisser le tube bouché reposer dans le portoir pendant au moins 30 minutes jusqu'à ce que la couche surnageante soit claire et nettement séparée de la couhe aqueuse. Si nécessaire, refroidir le tube sous l' eau courante. 6.1.5.6. Retirer avec précaution le bouchon en liège ou en une autre matière et le rincer, ainsi que le col du tube, avec une petite quantité de mélange de solvants, de sorte que les liquides de rincage coulent dans le tube. 6.1.5.7. Introduire un siphon ou un dispositif de lavage dans le tube et enfonder la longue tubulure à l' intérieur jusu'à ce que l' orifice se trouve environ 3 mm au-dessus de l' interface des couches. La tubulure intérieure doit être parallèle à l' axe du tube d' extraction. Transvaser avec précaution la couche surnageante du tube dans le récipient préparé pour la récupération de la matière grasse et contenant quelques régulateurs d' ébullition dans le cas de fioles (facultatif dans le cas de capsules métalliques) en évitant de transvaser une partie quelconque de la couche aqueuse. Rincer l' orifice avec une petite quantité de mélange de solvants en recueillant les liquides de rincage dans le récipient servant à la récupération de la matière grasse. 6.1.5.8. Desserrer le dispositif du col du tube, puis le soulever légèrement et rincer la partie inférieure de sa longue tubulure interne avec un peu de mélange de solvants. Abaisser et réintroduire le dispositif et transvaser les liquides de rincage dans le récipient de récupération de la matière grasse. Rincer l' orifice externe du dispositif avec un peu de mélange de solvants, recueillir ensuite les liquides de rincage dans e récipient. Le solvant peut éventuelement être éliminé partiellement ou totalement du récipient par distillation ou évaporation comme décrit au point 4.5.12. 6.1.5.9. Desserrer à nouveau le dispositif du col, soulever légèrement le dispositif et ajouter 5 ml d' éthanol dans le tube en utilisant l' éthanol pour rincer la longue tubulure interne : mélanger comme décrit au point 6.1.5.2. 6.1.5.10. Effectuer une deuxième extraction en répétant les opérations décrites aux points 6.1.5.3. à 6.1.5.8., mais en utilisant seulement 15 ml d' oxyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole. Utiliser l' oxyde diéthylique pour rincer la longue tubulure interne pendant le retrait du dispositif du tube après la première extraction. 6.1.5.11. Effectuer une troisième extraction en répétant à nouveau les opérations décrites aux points 6.1.5.3. à 6.1.5.8. en utilisant 15 ml d' oxyde diéthylique et 15 ml d' éther de pétrole et en rincant la longue tubulure interne du dispositif comme décrit en 6.1.5.10. La troisième extraction peut être supprimée dans le cas du lait écrémé. 6.1.5.12. Procéder comme décrit aux points 4.5.12 à 4.5.16. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N13. Annexe 13. - Détermination de la teneur en azote total du lait. Art. 1N13. 1. Définition. Par teneur en azote total du lait, on entend la teneur en azote, exprimée en pourcentage en masse, obtenue par application de la méthode Kjeldahl. Art. 2N13. 2. Principe. Une quantité pesée de l' échantillon de lait est minéralisée à l' aide d' acide sulfurique concentré et de sulfate de potassium en présence de sulfate en cuivre (II) faisant fonction de catalyseur, afin de convertir l' azote des composés organiques en sulfate d' ammoniaque. L' ammoniaque libéré par adjonction d' une solution d' hydroxyde de sodium est distillé et recueilli dans une solution d' acide borique. Cette solution est ensuite titrée avec une solution acide. Art. 3N13. 3. Réactifs. 3.1. Sulfate de potassium (K2SO4). 3.2. Solution de sulfate de cuivre. Dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre (II) pentahydrate (CuSO4.5H2O) dans e l' eau et compléter à 100 ml (à 20 °C) dans une fiole jaugée. 3.3. Acide sulfurique, au moins 98,0 % (m/m), H2SO4. 3.4. Solution d' hydroxyde de sodium, 47 % (m/m) 704 g NaOH/1 (à 20 °C). Note. On peut également utiliser une solution d' hydroxyde de sodium moins oncentrée, par exemple 40 % (m/m) 572 g/l, 20 °C ou 30 % (m/m) 399 g/l, 20 C. 3.5. Solution d' acide borique. Dissoudre 40 g d' acide borique (H3BO3) dans un litre d' eau chaude, aisser et conserver dans une bouteille en verre borosilicaté. 3.6. Indicateur. Dissoudre 0,01 g de rouge de méthyle, 0,02 g de bleu de bromothymol et 0, 6 g de vert de bromocrésol dans 100 ml d' alcool éthylique. Conserver la olution dans une bouteille bouchée brune dans un endroit frais et sombre. 3.7. Solution volumétrique acide normalisée, c (1/2 H2SO4) ou c (HCl) = ,05 mol/l titrée à 0,0001 mol/l près. 3.8. Saccharose exempt de composés azotés. 3.9. Sel d' ammonium, pur, tel que l' oxalate d' ammonium (NH4)2C2O4.H2O ou le sulfate d' ammonium (NH4)2SO4. 3.10. Tryptophane (C11H12N2O2), phénacétine (C10H7CH2CONH2) ou mono- ou dichlorhydrate de lysine (C6H14N2O2.2HCl ou C6H14N2O2.2HCl). Note. Le degré de pureté des réactifs visés aux points 3.9 et 3.10 devrait être supérieur à la " qualité analytique ". Pour le point 3.9 utiliser, si possible, une solution de sels d' ammonium certifiés. Art. 4N13. 4. Appareillage et verrerie. Matériel courant de laboratoire, et notamment : 4.1. Ballons Kjeldahl de 500 ml de capacité. 4.2. Régulateurs d' ébullition, par exemple billes de verre d' environ 5 mm de diamètre, granules d' Hengar et pierre ponce. 4.3. Burette ou pipette automatique, délivrant 1,0 ml. 4.4. Eprouvettes graduées en verre, d' une capacité de 50, 100 et 250 ml. 4.5. Appareil de digestion en position inclinée (à environ 45°) équipé d' un dispositif de chauffage électrique ou de brûleurs à gaz réglables pour que le contenu du ballon ne monte pas au-dessus de 1/3 du col, et d' un dispositif d' extraction des fumées. 4.6. Appareil de distillation, en verre borosilicaté, auquel peut être adapté le ballon Kjeldahl, se composant d' un déflegmateur efficace relie à un réfrigérant efficace à tube intérieur droit, à la partie inférieure duquel est relié un tube d' évacuation; le tube de raccordement et le(s) bouchon(s) doivent être étanches et de préférence en néoprène. 4.7. Pipette ou pipette automatique, délivrant 0,10 ml. 4.8. Fioles coniques de 500 ml de capacité, graduées à 200 ml. 4.9. Burette de 50 ml de capacité, graduée tous les 0,1 ml, avec une erreur maximale de +/- 0,05 ml. 4.10. Loupe grossissante pour une lecture précise de la burette. 4.11. pH-mètre. 4.12. Burette automatique. Art. 5N13. 5. Mode opératoire. 5.1. Introduire successivement dans le ballon Kjeldahl les régulateurs d' ébullition (par exemple 3 billes de verre), 15 g de sulfate de potassium, 1,0 ml de solution de sulfate de cuivre, environ 5 g de lait (pesé à 0,001 g près) et 25 ml d' acide sulfurique. Utiliser l' acide pour entraîner les résidus de la solution de sulfate de cuivre, de sulfate de potassium ou de lait qui seraient restés sur le col du ballon et mélanger le contenu du ballon. Note. Etant donné que les matières organiques absorbent de l' acide sulfurique lors de l' ébullition, il est conseillé d' utiliser, pour la digestion, 30 et non 25 ml d' H2SO4 si le lait contient plus de 5,0 % (m/m) de matière grasse. Il en va de même pour l' essai à blanc. 5.2. Chauffer chaque ballon Kjeldahl sur l' appareil de minéralisation très doucement au début, de facon à ce que toute la mousse noire reste dans le ballon. Lorsque la mousse initiale disparaît pour faire place à de fortes fumées blanches, porter à forte ébullition (les vapeurs d' acide se condensent à mi-chemin dans le col du ballon) jusqu'à ce que les particules noires disparaissent complètement et que le contenu du ballon devienne limpide et bleu-vert pâle. Poursuivre l' ébullition plus modérément pendant au moins 1 h 30. Veuillez noter les points suivants : a) la période de clarification ne doit pas dépasser 1 heure et la durée totale de la minéralisation ne doit pas être inférieure à 2 h 30. S' il faut plus d' une heure pour obtnir la clarification, le temps de minéralisation doit être augmenté en conséquence; b) le sulfate de potassium favorise la minéralisation, étant donné qu' il élève la températuve d' ébullition du mélange. Si le volume résiduel de H2SO4 est inférieur à 15 ml environ à la fin du temps de minéralisation, il se peut qu' il y ait eu perte d' azote due à un chauffage excessif. Dans le cas d' un chauffage au gaz, utiliser une plaque en matériau isolant pourvue d' une ouverture circulaire ayant un diamètre tel que la flamme lire ne touche que la partie du ballon qui se trouve sous la surface du contenu liquide; c) si des particules noires entrent dans le col du ballon et ne sont pas toutes entraînées à l' intérieur du ballon par l' acide refluant au cours de la phase initiale de forte ébullition (reflux que l' on peut faciliter en faisant tourner le ballon) laisser refroidir le ballon suffisamment et entraîner soigneusement les particules avec un minimum d' eau. Poursuivre ensuite la minéralisation comme décrit ci-dessus. 5.3. Lorsque les ballons Kjeldahl sont refroidis, ajouter 300 ml d' eau (voir note) dans chacun des récipients, de facon à entraîner toutes les particules adhérant au col du ballon. Mélanger soigneusement le contenu jusqu'à dissolution des cristaux qui se sont séparés. Ajouter quelques régulateurs d' ébullition pour obtenir une ébullition homogène. Ajouter ensuite dans chaque ballon 70 ml de solution d' hydroxyde de sodium (voir note) en tenant le ballon incliné, de manière à ce que la solution d' hydroxyde de sodium forme la couche inférieure dans le ballon. Veiller à ne pas en répandre sur le dessus du col. Note. Le volume combiné d' eau et de solution d' hydroxyde de sodium doit être de 370 ml pour pouvoir recueillir environ 150 ml de distillat avant que le contenu du ballon ne présente des soubresauts (5.4). Si on ajoute une plus grande quantité de solution d' hydroxyde de sodium concentrée à moins de 47 % (m/m), le volume d' eau ajouté doit être proportionnellement réduit. Ainsi, si on ajoute 85 ml de solution à 40 % (m /m) ou 125 ml de solution à 30 % (m/m), le volume d' eau ajouté doit être respectivement de 285 ml et de 245 ml. 5.4. Raccorder immédiatement chaque ballon Kjeldahl à un appareil de distillation. Veiller à ce que l' extrémité du tube du réfrigérant plonge dans 50 ml de solution d' acide borique et 0,20 ml (5 à 6 gouttes) d' indicateur contenus dans la fiole conique. Agiter le contenu de chaque ballon Kjeldahl pour bien mélanger et porter à ébullition tout d' abord à feu doux, pour éviter la formation excessive de mousse. Après avoir recueilli entre 100 et 125 ml de distillat, abaisser chaque fiole d' Erlenmeyer jusqu'à ce que l' extrémité du tube du réfrigérant se trouve environ 40 mm au-dessus du trait repère de 200 ml. Poursuivre chaque distillation jusqu'à ce que le contenu du ballon présente des soubresauts et couper immédiatement la source de chaleur. Enlever chaque ballon Kjeldahl et rincer l' extrémité de chaque tuyau d' évacuation du réfrigérant avec un peu d' eau en recueillant l' eau de rincage dans une fiole d' Erlenmeyer. Veuillez noter les points suivants : a) la vitesse de distillation doit être telle qu' environ 150 ml de distillat doit avoir été recueilli lorsque les soubresauts commencent, correspondant à un volume total dans la fiole d' Erlenmeyer de 200 ml environ. b) l' efficacité de chaque réfrigérant doit être telle que la température du liquide contenu dans chaque fiole n' excède pas 25 °C au cours de la distillation. 5.5. Titrer chaque distillat avec une solution volumétrique jusqu'à pH 4, 6 +/- 0,1, en utilisant un pH-mètre et une burette automatique. L' addition d' un indicateur permet de contrôler si le tirage se déroule correctement. Relever les indications de chaque burette à 0,01 ml près en utilisant une loupe grossisante pour éviter toute erreur de parallaxe. Le titrage peut être réalisé à l' aide du seul indicateur. Titrer jusqu'à ce que la couler du distillat corresponde à celle d' une solution récemment préparée à partir de 150 ml d' eau additionnée de 50 ml de la solution d' acide borique et de 0,20 ml de l' indicateur contenus dans une fiole d' Erlenmeyer. 5.6. Effectuer un essai à blanc conformément aux points 5.1 à 5.5 inclus en utilisant 5 ml d' eau distillée avec environ 0,1 g de saccharose au lieu de l' échantillon de lait. Note. Pour le titrage du distillat blanc, il ne faut qu' une très faible quantité de solution volumétrique acide normalisée. 5.7. Vérifier régulièrement l' exactitude des résultats en effectuant deux essais de récupération en suivant la procédure décrite aux points 5.1 à 5.5. 5.7.1. S' assurer qu' il n' y a eu, au cours de la distillation, aucune perte d' azote due à une chaleur excessive ou à des fuites mécaniques en utilisant une prise d' essai composée de 0,15 g d' axolate d' ammonium ou de sulfate d' ammonium pesé à 0,001 g près et de 0,1 g de saccharose. Le pourcentage d' azote récupéré doit être de 99 à 100 %. Des résultats inférieurs ou supérieurs sont l' indication d' une erreur de procédure et/ou d' une erreur de concentration de la solution normalisée. 5.7.2. Vérifier que la procédure de minéralisation est capable de libérer tout l' azote protidique, en utilisant une prise d' essai composée de 0,20 g de tryptophane pur, 0,35 g de phénacétine ou 0,20 g de chlorhydrate de lysine. Tout doit être pesé à 0,001 g près. Le taux de récupération de l' azote doit être au moins de 98 à 99 %. Art. 6N13. 6. Mesures de sécurité. Lors de la manipulation d' acide sulfurique concentré, d' hydroxyde de sodium concentré et de ballons Kjeldahl, veiller à toujours porter un tablier de laboratoire, des lunettes de protection et de gants résistants aux acides. Au cours de la distillation, surveiller les ballons Kjeldahl en permanence. En raison des risques, arrêter immédiatement la distillation si le contenu de la bouteille présente de violents " soubresauts ". En cas de panne du système de chauffage de distillation pendant plus de deux à trois minutes, abaisser le ballon collecteur, de facon à ce que l' extrémité du réfrigérant émerge du liquide. Art. 7N13. 7. Expression des résultats. 7.1. Calcul et formule. Calculer la teneur en azote, en grammes d' azote pour 100 g de produit à l' aide de la formule : 1,40 (V - Vo) c N = m où N représente la teneur en azote. V représente le volume en ml de la solution volumétrique acide normalisée utilisée pour le dosage. V0 représente le volume en ml de la solution volumétrique acide normalisée utilisée pour l' essai à blanc. c représente la concentration, en mol/l, de la solution volumétrique acide normalisée. m représente la masse en g de la prise d' essai. Arrondir le résultat à 0,001 g près pour 100 g. 7.2. Fidélité. Répétabilité (r) : 0,007 g par 100 g. Reproductibilité (R) : 0,015 g par 100 g. Art. 8N13. 8. Mode opératoire modifié. 8.1. Utilisation d' un bloc chauffant de minéralisation au lieu du système de minéralisation avec ballon Kjeldahl. Dans ce cas, pour repérer les pannes éventuelles, vérifier chaque point individuellement (5.7.). 8.2. Utilisation d' un système de distillation par entraînement à la vapeur au lieu d' un chauffage direct (5.4.). Si l' appareillage ne permet pas d' utiliser de l' eau distillée, s' assurer que l' eau ne contient pas de matière volatiles acides ou alcalines. 8.3. Il est possible d' utiliser une prise d' essai de 1 g de lait (semi macro Kjeldahl) au lieu de 5 g (5.1) à condition que : les quantités de réactifs utilisées pour la minéralisation (5.1) : H2SO4, CuSO4, 5H2O, K2SO4, soient réduites dans le même rapport (un cinquième). la durée totale de la minéralisation (5.2) soit réduite à 75 minutes. la quantité d' hydroxyde de sodium (5.3) soit réduite dans le même rapport (un cinquième). une solution acide normalisée de plus faible concentration (0,02 - 0,03 mol/l) soit utilisée. Note. L' emploi de l' une ou l' autre de ces options n' est acceptable que si la répétabilité (7.2.) et les résultats des deux essais de contrôle de la précision (5.7) correspondent aux valeurs données dans la norme. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N14. Annexe 14. - Détermination de la teneur en matière grasse et en protéines du lait par sepctrophotométrie dans l' infrarouge moyen. Art. 1N14. 1. Principe. La matière grasse et les protéines comportent des liaisons chimiques spécifiques qui absorbent la lumière à des longueurs d' onde déterminées dans l' infrarouge moyen. L' absorption électromagnétique, mesurée à ces longueurs d' onde et corrigée pour l' influence réciproque des constituants du lait par l' application de facteurs d' interrorection, permet la détermination quantitative de la matière grasse et des protéines du lait. Art. 2N14. 2. Réactifs. Aucun réactif n' est nécessaire pour l' exécution de la spectrophotométrie dans le moyen infra-rouge. Art. 3N14. 3. Appareillage. 3.1. Spectrophotomètre dans l' infrarouge moyen. En analyse spectrophotométrique dans l' infrarouge moyen, on peut utiliser les filtres suivants : 3,5 micromètres (filtre B) ou 5,7 micromètres (filtre A) pour la matière grasse. 6,5 micromètres pour les protéines. 9,6 micromètres pour le lactose (seulement nécessaire pour l' intercorrection). 3.2. Bain-marie à circulation d' eau, réglable à 40 °C (précision de +/ 2 °C. Art. 4N14. 4. Mode opératoire. 4.1. Préparation de l' échantillon. Les échantillons à analyser sont préalablement réchauffés dans un bain marie à 40 +/- 2 °C et ensuite soigneusement mélangés. Les échantillons doivent être analysés dans un délai de 15 minutes après mélange. 4.2. Mise en route du spectrophotomètre dans l' infrarouge moyen. Avant de commencer les analyses, on procède d' abord au nettoyage des tuyauteries et de la cuvette avec une solution détergente. Ensuite, on contrôle le point zéro avec de l' eau distillée et on l' ajuste éventuellement. Le calibrage de l' appareil est alors contrôlé avec l' échantillon de lait cru étalon et avec un échantillon de lait écrémé. Ces opérations de réglage doivent être effectuées conformément aux spécifications du constructeur de l' appareil. 4.3. Conduite des analyses. Après la mise en route de l' appareil, on peut commencer les analyses. L' appareil doit être contrôlé avec l' échantillon étalon au minimum tous les 50 échantillons lors des analyses en série. L' interprétation des résultats pour les échantillons étalons s' effectue selon la norme FIL 141 la plus récente. Si les résultats de l'(des) échantillon(s) étalon(s) divergent selon la norme ci-dessus, la raison en est immédiatement recherchée et le problème doit être résolu avant de continuer les analyses. Chaque flacon d' échantillon étalon ne peut être utilisé qu' une seule fois. Au minimum tous les 400 échantillons, il faut contrôler le point zéro et, si nécessaire, procéder à un lavage des tuyauteries et de la cuvette avec une solution détergente. Toutes les opérations ci-dessus seront exécutées conformément aux spécifications du constructeur de l' appareil. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS Art. N15. Annexe 15. - Détermination de la masse volumique. Art. 1N15. 1. Définition. La masse volumique du lait est le quotient de la masse d' un certain colume de lait, à 20 °C, à ce volume. Art. 2N15. 2. Principe. La masse volumique à 20 °C est déterminée par aréométrie. Art. 3N15. 3. Appareillage et verrerie. Matériel courant de laboratoire, et notamment : 3.1. Aréomètre. L' aréomètre à masse volumique est un instrument se composant d' un flotteur en verre, large et lesté à son extrémité inférieure et d' une tige cylindrique en verre, soudée à la partie supérieure du flotteur et coaxial à celui-ci, l' extrémité supérieure de la tige étant fermée. Le flotteur en verre contient le lest (plomb, mercure, etc.) destinée à ajuster la masse de l' aréomètre. La tige comporte une échelle graduée de 1,025 à 1,035 g/ml. L' aréomètre doit être contrôlé par la méthode pycnométrique, en utilisant un pycnomètre de 100 ml environ de capacité, équipé d' un thermomètre de précision. 3.2. Eprouvettes cylindriques (en verre ou en acier inoxydable) ayant les dimensions minimales suivantes : diamètre interne du cylindre : 35 mm environ. hauteur interne du cylindre : 225 mm environ. 3.3. Bain d' eau réglé à 20 +/- 0,1 °C. 3.4. Bain d' eau réglé à 40 +/- 2 °C. 3.5. Thermomètre gradué au moins par 0,5 °C. Art. 4N15. 4. Mode opératoire. 4.1. Mélanger l' échantillon en le retournant pour disperser la matière grasse. Placer l' échantillon dans le bain d' eau (3.4) jusqu'à ce qu' il atteigne 40 °C et le laisser à cette température pendant 5 minutes. Mélanger convenablement par retournements successifs pour obtenir une répartition homogène de la matière grasse. Refroidir à 20 °C dans le deuxième bain d' eau (3.3.). 4.2. Mélanger convenablement l' échantillon en le retournant soigneusement pour éviter l' incorporation d' air. Verser le lait dans l' éprouvette cylindrique maintenir en position inclinée, pour éviter la formation de mousse ou de bulles. Utiliser suffisamment de lait pour provoquer un débordement de liquide lors de l' introduction de l' aréomètre dans l' éprouvette. Plonger avec précaution l' aréomètre dans le lait et le laisser flotter librement jusqu'à ce qu' il atteigne son point d' équilibre. Placer l' éprouvette en position verticale. L' aréomètre doit être placé au milieu de la colonne de liquide et ne doit pas toucher les parois de l' éprouvette. 4.3. Lorsque l' aréomètre a atteint son point d' équilibre, effectuer la lecture de la graduation à la partie supérieure du ménisque. 4.4. Immédiatement après la lecture de l' aréomètre, introduire le thermomètre dans l' échantillon et lire la température par 0,5 °C. La température ne doit pas différer de plus de +/- 2 °C par rapport à 20 °C. Art. 5N15. 5. Correction de la température. Si la température du lait à analyser n' est pas exactement de 20 °C lors de la mesure de la masse volumique, le résultat obtenu doit être corrigé en ajoutant à la masse volumique lue 0,0002 par degré Celsius au-dessus de 20 °C ou en retranchant 0,0002 par degré Celsius au-dessous de 20 °C. Cette correction est uniquement valable si la température de l' échantillon diffère de 5 °C au maximum par rapport à 20 °C. Art. 6N15. 6. Expression des résultats. Le calcul de la masse volumique de l' échantillon, exprimée en g/ml de lait écrémé à 20 °C, s' effectue selon la formule suivante : 1000 mv - MG.mv 0,92 mv (100 - MG) = 1000 - MG.mv 920 - MG.mv 0,92 où : mv est la masse volumique de l' échantillon, résultant de la lecture de l' aréomètre (4.4) en g/l. MG est la teneur en matière grasse de l' échantillon (g/l). 0,92 est la densité de la matière grasse. Art. 7N15. 7. Fidelité. 7.1. Répétabilité (r) : 0,0003 g/ml.) 7.2. Reproductibilité (R) : 0,0015 g/ml. Vu pour être annexé à l' arrêté ministériel du 14 octobre 1994. Le Ministre de l' Agriculture, A. BOURGEOIS