Turkish Food Codex Notification No. 2013/11 on the analysis of spirits drinks

11 Nisan 2013 PERŞEMBE Resmî Gazete Sayı : 28615 TEBLİĞ Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığından: TÜRK GIDA KODEKSİ DİSTİLE ALKOLLÜ İÇKİLER ANALİZ METOTLARI TEBLİĞİ (TEBLİĞ NO: 2013/11) Amaç ve kapsam MADDE 1 – (1) Bu Tebliğin amacı, distile alkollü içkilerin resmi kontrolleri için uygulanacak analiz metotlarını düzenlemektir. Dayanak MADDE 2 – (1) Bu Tebliğ; a) 29/12/2011 tarihli ve 28157 üçüncü mükerrer sayılı Resmî Gazete’de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine dayanılarak, b) Avrupa Birliğinin 19/12/2000 tarihli ve 2870/2000/EC sayılı Distile Alkollü İçkilerin Analizi ile İlgili Topluluk Referans Metotları Komisyon Tüzüğüne paralel olarak, hazırlanmıştır. Tanımlar MADDE 3 − (1) Bu Tebliğ’de geçen; a) CAS: Bilimsel literatürde tanımlanmış her bir kimyasal bileşik için verilen, Amerikan Kimya Derneği'nin kayıt numaralarını, b) Distile Alkollü İçkiler Tebliği: 16/3/2005 tarihli ve 25757 sayılı Resmî Gazete’de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Distile Alkollü İçkiler Tebliği (Tebliğ No: 2005/11)’ni, c) EIPT: Uluslararası Pratik Sıcaklık Ölçeğini, ç) FID: Alev iyonlaşma dedektörünü, d) GC: Gaz kromatografisini, e) HMCE: İngiliz Gümrük ve Vergi Kurumunu, f) HPLC: Yüksek performanslı sıvı kromatografisini, g) ISO: Uluslararası Standardizasyon Teşkilatını, ğ) IUPAC: Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliğini, h) Kesinlik: Analiz sonucu ve kabul edilen referans değer arasındaki yakınlığı, ı) OIML: Uluslararası Yasal Metroloji Organizasyonunu, i) OIV: Uluslararası Bağcılık ve Şarapçılık Örgütünü, j) Splitli enjeksiyon: Girişte bölünmeli enjeksiyon sistemini, k) Splitless enjeksiyon: Bölünmesiz enjeksiyon sistemini, l) Split/Splitless enjektör: Bölünmeli/Bölünmesiz enjektörü, m) Tekrar edilebilirlik sınırı: Aynı numune, aynı uygulayıcı, aynı cihaz, aynı laboratuvar gibi tekrar edilebilirlik koşulları altında kısa zaman aralıklarıyla yapılan iki analiz sonucu arasındaki (genellikle % 95 olan belirli bir güven aralığında) mutlak farka eşit veya mutlak farkın altındaki bir değeri, n) TS: Türk standartlarını, o) Yeniden üretilebilirlik sınırı: Aynı numunede, aynı metot kullanılarak, farklı uygulayıcı, farklı cihaz, farklı laboratuvar gibi yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen iki analiz sonucu arasındaki (genellikle % 95 olan belirli bir güven aralığında) mutlak farka eşit veya mutlak farkın altındaki bir değeri, ö) UV: Ultraviyoleyi ifade eder. Analiz metodu MADDE 4 − (1) Distile Alkollü İçkiler Tebliğine uygunluğunun resmi kontrollerinde uygulanacak referans analiz metotları eklerde yer almaktadır. a) Eklerde yer alan referans metotların haricindeki diğer analitik metotlar; bir laboratuvar yöneticisinin sorumluluğu altında, sonuçların doğruluğu ve kesinliği (tekrar edilebilirliği ve yeniden üretilebilirliği) eklerde verilen ilgili referans metotlardan elde edilen sonuçlara eşdeğer olması şartıyla kabul edilir. Şahit analizlerde, bu metotlar eklerde verilen referans analitik metotların yerini alamazlar. b) Özel bir distile alkollü içkinin içerdiği maddelerin saptanması ve miktarının belirlenmesi için eklerde analitik referans metotlar düzenlenmemişse aşağıdaki metotlar kullanılır: 1) Uluslararası kabul edilen prosedürler düzeyinde geçerli kılınmış ve özellikle 29/12/2011 tarihli ve 28157 üçüncü mükerrer sayılı Resmî Gazete’de yayımlanarak yürürlüğe giren Gıda Kontrol Laboratuvarlarının Kuruluş, Görev, Yetki ve Sorumlulukları ile Çalışma Usul ve Esaslarının Belirlenmesine Dair Yönetmeliğin 21 inci maddesinin ikinci fıkrasındaki kriterleri karşılayan analitik metotlar, 2) ISO’nunöngördüğü standartlara uygun metotlar, 3) OIV’nin tanıdığı ve bu Örgüt tarafından yayımlanan analitik metotlar, 4) (1), (2) ve (3) numaralı alt bentlerde sözü edilen metotların olmadığı durumda; kesinlik, tekrar edilebilirlik ve yeniden üretilebilirlik koşullarını sağlaması şartıyla, uygun başka bir analitik metot. Uyum zorunluluğu GEÇİCİ MADDE 1 – (1) Halen faaliyet gösteren ve bu Tebliğ kapsamında yer alan ürünlerde resmi kontroller için analiz yapan kurum ve kuruluşlar, bir yıl içerisinde bu Tebliğ hükümlerine uymak zorundadırlar. Yürürlük MADDE 5 – (1) Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme MADDE 6 – (1) Bu Tebliğ hükümlerini Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanı yürütür. Ek-1 HACMEN ALKOL MİKTARININ BELİRLENMESİ Bu referans metot iki bölümden oluşur. Bölüm 1: Distilatın hazırlanması Bölüm 2: Distilatın Yoğunluğunun Ölçülmesi 1. Kapsam Bu metot, distile alkollü içkilerin hacmen gerçek alkol miktarının belirlenmesi için kullanılır. 2. Tanımlar Analizlerde kullanılacak su, TS EN ISO 3696 (Su - Analitik Laboratuvarında Kullanılan - Özellikler ve Deney Metotları)’da tanımlanmıştır. Bu metot içerisindeki “alkol”, “etil alkol” ü ifade eder. 2.1. Referans Sıcaklık: Distile alkollü içkilerde özgül ağırlık, yoğunluk ve hacmen alkol miktarının belirlenmesi için referans sıcaklık 20 °C’dir. Referans sıcaklıktan farklı sıcaklıklarda yapılan tüm ölçümler (hacmen alkol miktarı veya yoğunluk ölçümleri) için “t °C” ifadesi kullanılır. 2.2. Yoğunluk: Yoğunluk, 20 °C’de bir metreküp distile alkollü içkinin kilogram cinsinden (kg/m3) kütlesi olarak ifade edilir ve ρ20 veya ρ20 °C olarak gösterilir. 2.3. Özgül ağırlık: Özgül ağırlık, bir ondalık sayı ile ifade edilen, 20 °C’de distile alkollü içkinin yoğunluğunun aynı sıcaklıktaki suyun yoğunluğuna oranıdır. Sonuç, d 20°C/20°C veya d 20/20 veya karışma olasılığı yok ise d şeklinde gösterilir. Ölçülen karakteristik özellik, sadece tanımlanan bu simgeler kullanılarak analiz sertifikasında belirtilir. Not: Özgül ağırlığın, 20 °C’deki yoğunluktan ρ20’den elde edilmesi mümkündür: ρ20 °C = 998,203 x d20°C/20°C veya d20°C/20°C = ρ20 °C /998,203 Formülde 998,203 değeri, suyun 20 °C’deki yoğunluğudur. 2.4. Hacmen gerçek alkol miktarı: Distile alkollü içkilerin hacmen gerçek alkol miktarı, distilat ya da alkol ile aynı yoğunluğa sahip 100 litre alkol-su karışımı içindeki etil alkolün litre olarak miktarıdır. Kullanılacak farklı alkol-su karışımlarının 20 oC’de yoğunluğunun fonksiyonu olarak 20 oC’de hacmen (%hacmen) alkol miktarının değerini veren “Alkol Tabloları”, OIML tarafından kabul edilmiş olan uluslararası tablolardır (OIML 22 no’lu Tavsiye Kararı, 1975 ). Belirli bir sıcaklıkta hacmen alkol miktarı ile bir alkol-su karışımının yoğunluğu arasındaki ilişkiyi gösteren genel formül aşağıda verildiği gibidir. Alkol-su karışımlarının alkol miktarı tablolarının hesaplanmasında kullanılan formül: t°C sıcaklığındaki bir alkol-su karışımının m3 başına kilogram olarak (kg/m3) yoğunluğu aşağıdaki formülle şu bilgiler ışığında hesaplanır: Ondalık olarak ifade edilen kütlece alkol miktarı, p (örneğin, kütlece %12 alkol miktarı için p = 0,12) °C olarak ifade edilen sıcaklık, t (EIPT 68) Formüldeki Sayısal Katsayılar Tablosu’nda (Tablo-1) verilen sayısal katsayılar Formül (− 20) ile + 40 °C arasındaki sıcaklıklar için geçerlidir. ρ = A1 + ∑ = 12 2k Ak pk – 1 + ∑ = 6 1k Bk (t – 20 ͦC)k + ∑ = n i 1 ∑ = m k 1 Ci,k pk(t – 20 ͦC)i n = 5, m1 = 11, m2 = 10, m3 = 9, m4 = 4, m5 = 2 Tablo-1 Formüldeki Sayısal Katsayılar Tablosu k Ak kg/m3 Bk 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 9,982 012 300 . 102 1,929 769 495 . 102 3,891 238 958 . 102 1,668 103 923 . 103 1,352 215 441 . 104 8,829 278 388 . 104 3,062 874 042 . 105 6,138 381 234 . 105 7,470 172 998 . 105 5,478 461 354 . 105 2,234 460 334 . 105 3,903 285 426 . 104 2,061 851 3 . 10-1 kg/(m3 . oC) 5,268 254 2 . 10-3 kg/(m3 . oC2) 3,613 001 3 . 10-5 kg/(m3 . oC3) 3,895 770 2 . 10-7 kg/(m3 . oC4) 7,169 354 0 . 10-9 kg/(m3 . oC5) 9,973 923 1 . 10-11 kg/(m3 . oC6) k C1,k kg/(m3. oC) C2,k kg/(m3. oC2) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1,693 443 461 530 087 . 10-1 1,046 914 743 455 169 . 101 7,196 353 469 546 523 . 101 7,047 478 054 272 792 . 102 3,924 090 430 035 045 . 103 1,210 164 659 068 747 . 104 2,248 646 550 400 788 . 104 2,605 562 982 188 164 . 104 1,852 373 922 069 467 . 104 7,420 201 433 430 137 . 103 1,285 617 841 998 974 . 103 1,193 013 005 057 010 . 10-2 2,517 399 633 803 461 . 10-1 2,170 575 700 536 993 1,353 034 988 843 029 . 101 5,029 988 758 547 014 . 101 1,096 355 666 577 570 . 102 1,422 753 946 421 155 . 102 1,080 435 942 856 230 . 102 4,414 153 236 817 392 . 101 7,442 971 530 188 783 k C3,k kg/(m3. oC3) C4,k kg/(m3. oC4) C5,k kg/(m3. oC5) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6,802 995 733 503 803 . 10-4 1,876 837 790 289 664 . 10-2 2,002 561 813 734 156 . 10-1 1, 022 992 966 719 220 2,895 696 483 903 638 4,810 060 584 300 675 4,672 147 440 794 683 2,458 043 105 903 461 5,411 227 621 436 812. 10-1 4,075 376 675 622 027 . 10-6 8,763 058 573 471 110 . 10-6 6,515 031 360 099 368 . 10-6 1,515 784 836 987 210 . 10-6 2,788 074 354 782 409 . 10-8 1,345 612 883 493 354 . 10-8 Not: Hacmin doğru olarak ölçülmesinin çok zor olduğu likörler ve krem likörler için, numuneler tartılmalı ve alkol miktarı ilk önce kütle üzerinden hesaplanmalıdır. Dönüşüm formülü: Hacmen alkol miktarı (%hacim) = KAM(%kütle)x ρ20 (numune) ρ20 (Alkol) KAM = Kütlece alkol miktarı ρ20 (alkol) = 789,24 kg/m3 3. Prensip Distilasyonu takiben, distilatın hacmen alkol miktarı piknometre, elektronik dansimetre veya hidrostatik terazili dansimetre kullanılarak belirlenir. Bölüm 1: Distilatın Hazırlanması 1. Kapsam Bu metot, distile alkollü içkilerin hacmen gerçek alkol miktarının belirlenmesinde kullanılacak olan distilatların hazırlanması için kullanılır. 2. Prensip Yüksek alkollü içkiler, etil alkol ve diğer uçucu bileşenleri ekstrakte edilebilen maddelerden (distile edilmeyen maddeler) ayırmak için distile edilir. 3. Reaktifler ve materyaller 3.1. Kaynama taşı 3.2. Yoğunlaştırılmış köpük önleyici emülsiyon (krem likörler için) 4. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 4.1. 10-15 °C arasında ayarlanabilir su banyosu 20 °C’ye (± 0,2 °C) ayarlanabilir su banyosu 4.2. Sırasıyla %0,1 ve %0,15’e kadar hassasiyette, sertifikalı 100 mL ve 200 mL hacimli A sınıfı balon jojeler 4.3. Distilasyon düzeneği 4.3.1. Genel şartlar Distilasyon düzeneği aşağıdaki koşulları karşılamalıdır: Sistemden alkol kaçışını engelleyecek en az sayıda bağlantı noktası içermelidir. Kaynayan sıvının buharla birlikte sürüklenmesini önleyecek ve alkolce zengin buharın distilasyon oranını düzenleyecek şekilde dizayn edilmiş bir cihaz içermelidir. Alkol buharının hızlı ve tam yoğuşması sağlamalıdır. İlk distilasyon fraksiyonlarının sulu bir ortam içinde toplanmasını sağlamalıdır. Kaynatma amacıyla kullanılan ısı kaynağı, alkollü içki içerisindeki ekstrakte edilebilen maddenin herhangi bir pirojenik reaksiyonunu önleyecek uygun bir ısı dağıtıcısına sahip olmalıdır. 4.3.2 Uygun distilasyon düzeneğinin bir örneği Şekil 1’de gösterilmiş olup aşağıdaki kısımlardan oluşmaktadır: 1 litrelik, standardize küresel şilifli, tabanı yuvarlak balon (distilasyon balonu) En az 20 cm yükseklikte bir rektifiye kolonu (örneğin bir Vigreux kolonu) Yaklaşık 10 cm uzunluğunda, her iki ucu küresel şilifli ve rektifiye kolonu ile geri soğutucu arasında dik dirsek bağlantısı bulunan düz çerçeveli yoğuşturucu (West yoğuşturucu) 40 cm uzunluğunda geri soğutucu Distilatı, az miktarda su içeren distilat toplama balonunun (balon joje) dibine ileten ağzı küresel şilifli boşaltma tüpü Not: Yukarıda tarif edilen düzenek en az 200 mL’lik bir numune için tasarlanmıştır. Ancak, daha az miktardaki numuneler (örneğin 100 mL), sürüklenmeyi önleyecek sıçratma başlığı ya da buna benzer başka bir cihaz içeren daha küçük bir distilasyon balonu kullanılarak distile edilebilir. 5. Analiz numunelerinin depolanması Numuneler, analiz öncesi oda sıcaklığında saklanır. 6. İşlem Ön bilgi: Distilasyon işlemi IUPAC (1968) tarafından yayımlanan işlemle de yapılabilir. 6.1. Distilasyon düzeneğinin doğrulanması: Kullanılan düzenek en az aşağıdaki yeterlilikte olmalıdır: %50’ye yakın bilinen bir konsantrasyondaki alkol-su karışımının 200 mL’sinin distilasyonundaki alkol kaybı hacmen %0,1’den daha fazla olmamalıdır. 6.2. Hacmen alkol miktarı %50’den düşük olan distile alkollü içkiler: Bir balon joje içerisine 200 mL numune alınır. Numunenin sıcaklığı kaydedilir ya da standart sıcaklığa (20 oC) getirilir. Numune, distilasyon balonuna aktarılır ve balon joje üç kez her seferde yaklaşık 20 mL distile su ile çalkalanır. Her bir bölüm çalkalama suyu, distilasyon balonu içeriğine eklenir. Not: Bu 60 mL’lik sulandırma, litre başına 250 g’dan daha az kuru madde içeren distile alkollü içkiler için yeterlidir. Aksi halde, pirolizin önlenmesi için, kuru madde konsantrasyonu 300 g/L ise çalkalama suyunun hacminin en az 70 mL; 400 g/L için, 85 mL ve 500 g/L (bazı meyve likörleri veya krem likörler) için, 100 mL olması gerekmektedir. Farklı hacimlerdeki numuneler için bu hacimler oransal olarak ayarlanır. Birkaç adet kaynama taşı (3.1) eklenir (Krem likörler için köpük önleyici eklenir). Distilatın içinde toplanacağı 200 mL’lik balon joje içerisine 20 mL distile su aktarılır. Balon joje daha sonra bir soğuk su banyosuna (4.1) yerleştirilmelidir (anason aromalı distile alkollü içkiler için 10-15 oC). Sürüklenmeye ve kömürleşmeye izin vermeden distilasyon balonu arada bir çalkalanarak; distilat seviyesi, balon jojenin kalibrasyon işaretinin birkaç mL altına ulaşana kadar distile edilir. Distilatın sıcaklığı, başlangıç sıcaklığından 0,5 oC aşağı düştüğü zaman, işaretli seviyeye kadar distile su ile doldurulur ve iyice karıştırılır. Distilat, hacmen alkol miktarının belirlenmesi (Bölüm 2) için kullanılır. 6.3. Hacmen alkol miktarı %50’nin üzerinde olan distile alkollü içkiler: 100 mL’lik bir balon joje içerisine 100 mL numune alınır. Numune, distilasyon balonuna aktarılır ve balon joje, distile su ile birkaç kez çalkalanır ve çalkalama suyu distilasyon balonu içeriğine eklenir. Balon joje içeriği yaklaşık 230 mL olacak kadar su kullanılır. Distilatın içinde toplanacağı 200 mL’lik balon joje içerisine 20 mL distile su aktarılır. Balon joje daha sonra bir soğuk su banyosuna (4.1) yerleştirilmelidir (anason aromalı distile alkollü içkiler için 10-15 oC). Distilasyon balonu arada bir çalkalanarak, Distilat seviyesi 200 mL’lik balon jojenin kalibrasyon işaretinin birkaç mL altına ulaşana kadar distile edilir. Distilatın sıcaklığı, başlangıç sıcaklığından 0,5 oC aşağı düştüğü zaman, işaretli seviyeye kadar distile su ile doldurulur ve iyice karıştırılır. Distilat, hacmen alkol miktarının belirlenmesi (Bölüm 2) için kullanılır. Not: Distile alkolü içkinin hacmen alkol miktarı, distilatın alkol miktarının iki katıdır. Şekil 1. Distile alkollü içkilerin hacmen gerçek alkol miktarının ölçülmesi için kullanılan distilasyon düzeneği 1. Küresel şilifli, tabanı yuvarlak bir litrelik balon 2. Vigreux rektifiye kolonu, 20 cm 3. Düz çerçeveli West yoğuşturucu, 10 cm 4. Geri soğutucu, 40 cm Bölüm 2: Distilatın Yoğunluğunun Ölçülmesi Metot A: Distile Alkollü İçkilerin Hacmen Gerçek Alkol Miktarlarının Belirlenmesi - Piknometre İle Ölçüm 1. Prensip Hacmen alkol miktarı, piknometre ile ölçülen distilatın yoğunluğundan elde edilir. 2. Reaktifler Analizlerde aksi belirtilmedikçe, yalnızca analitik saflıkta çözeltiler kullanılır. Analizlerde kullanılacak su, TS EN ISO 3696’da tanımlanmıştır. 2.1. Sodyum klorür çözeltisi (%2 ağırlık/hacim): 1 litre çözelti hazırlamak için, 20 g sodyum klorür tartılır ve 1 litre su içinde çözülür. 3. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 3.1. 0,1 mg hassasiyette analitik terazi 3.2. Şilifli, 10 oC’den 30 oC’ye kadar 0,1 hassasiyetle derecelendirilmiş termometre. Bu termometre sertifikalı ya da sertifikalı bir termometre ile kalibre edilmiş olmalıdır. 3.3. Yaklaşık 100 mL kapasiteli, şilifli olarak tutturulmuş, çıkarılabilir özellikte bir termometreli (3.2) sıcağa dayanıklı cam piknometre (Şekil 2). Piknometre, 25 mm uzunluğunda ve iç çapı 1 mm (en fazla) olan, konik şilifli bir yan tüpe sahiptir. Eğer uygunsa TS ISO 3507’de tarif edilen biçimdeki diğer piknometreler de kullanılabilir (örneğin 50 mL). 3.4. Piknometre ile aynı dış hacme sahip (1 mL toleransla) ve özgül ağırlığı 1,01 olan bir sıvıyla (sodyum klorür çözeltisi, 2.1.) doldurulmuş piknometrenin kütlesine eşit bir kütleye sahip bir dara şişesi. 3.5. Piknometrenin gövdesini tam olarak saran ısı yalıtımlı bir kap Şekil 2. Piknometre ve darası 4. İşlem Ön bilgi: Bu işlem alkol miktarının belirlenmesi için 100 mL’lik piknometre kullanımını tarif eder. Bu en iyi doğruluğu verir. Ancak, 50 mL gibi daha küçük hacimli piknometre kullanımı da mümkündür. 4.1. Piknometrenin kalibrasyonu Piknometre aşağıdaki parametrelerin belirlenmesi ile kalibre edilir: Boş piknometrenin darası 20 oC’de piknometrenin hacmi 20 oC’de su ile dolu piknometrenin kütlesi 4.1.1. Tek kefeli terazi kullanılarak kalibrasyon Temiz ve kuru piknometrenin kütlesi, (P) t oC’de su ile dolu piknometrenin kütlesi, (P1) Dara şişesinin kütlesi, (T0), belirlenir. 4.1.1.1. Temiz ve kuru piknometre tartılır. (P) 4.1.1.2. Piknometre, ortam sıcaklığında distile su ile dikkatlice doldurulur ve termometre sabitlenir. Dikkatlice piknometre silinerek kurulanır ve ısı yalıtımlı kap içerisine yerleştirilir. Termometrenin sıcaklığı sabit okumaya gelene kadar, kap alt üst edilerek karıştırılır. Yan tüpün üst kısmındaki seviye çizgisinden dışarı çıkmayacak şekilde, piknometre ayarlanır. t oC sıcaklık dikkatlice okunur ve gerekiyor ise sıcaklık skalasındaki herhangi bir hata için düzeltme yapılır. Daha sonra su ile dolu piknometre tartılır.(P1) 4.1.1.3. Dara şişesi tartılır. (T0) 4.1.1.4. Hesaplama: Boş piknometrenin darası = P - m m; piknometredeki havanın kütlesi m = 0,0012 × (P1 – P) Not: 0,0012; 20 oC’de ve 760 mm Hg basınçta kuru havanın yoğunluğudur. 20 oC’de piknometrenin hacmi V Co20 = [P1 – (P – m)] × Ft,,1 Ft; Tablo-2’den alınan t oC sıcaklık için faktördür. V Co20 , 0,001 mL hassasiyetinde olmalıdır. Tablo-2 F faktörleri (20 oC’de piknometre hacmini hesaplamak için; t oC’deki piknometrenin içerdiği suyun kütlesi bu faktörle çarpılır) t oC F t oC F t oC F t oC F t oC F t oC F t oC F 10,0 ,1 ,2 ,3 ,4 10,5 1,000398 1,000406 1,000414 1,000422 1,000430 1,000439 13,0 ,1 ,2 ,3 ,4 13,5 1,000691 1,000703 1,000714 1,000726 1,000738 1,000752 16,0 ,1 ,2 ,3 ,4 16,5 1,001097 1,001113 1,001128 1,001144 1,001159 1,001175 19,0 ,1 ,2 ,3 ,4 19,5 1,001608 1,001627 1,001646 1,001665 1,001684 1,001703 22,0 ,1 ,2 ,3 ,4 22,5 1,002215 1,002238 1,002260 1,002282 1,002304 1,002326 25,0 ,1 ,2 ,3 ,4 25,5 1,002916 1,002941 1,002966 1,002990 1,003015 1,003041 28,0 ,1 ,2 ,3 ,4 28,5 1,003704 1,003731 1,003759 1,003787 1,003815 1,003843 ,6 ,7 ,8 ,9 11,0 ,1 ,2 ,3 ,4 11,5 ,6 ,7 ,8 ,9 12,0 ,1 ,2 ,3 ,4 12,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,000447 1,000456 1,000465 1,000474 1,000483 1,000492 1,000501 1,000511 1,000520 1,000530 1,000540 1,000550 1,000560 1,000570 1,000580 1,000591 1,000601 1,000612 1,000623 1,000634 1,000645 1,000656 1,000668 1,000679 ,6 ,7 ,8 ,9 14,0 ,1 ,2 ,3 ,4 14,5 ,6 ,7 ,8 ,9 15,0 ,1 ,2 ,3 ,4 15,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,000764 1,000777 1,000789 1,000803 1,000816 1,000829 1,000842 1,000855 1,000868 1,000882 1,000895 1,000909 1,000923 1,000937 1,000951 1,000965 1,000979 1,000993 1,001008 1,001022 1,001037 1,001052 1,001067 1,001082 ,6 ,7 ,8 ,9 17,0 ,1 ,2 ,3 ,4 17,5 ,6 ,7 ,8 ,9 18,0 ,1 ,2 ,3 ,4 18,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,001191 1,001207 1,001223 1,001239 1,001257 1,001273 1,001290 1,001306 1,001323 1,001340 1,001357 1,001374 1,001391 1,001409 1,001427 1,001445 1,001462 1,001480 1,001498 1,001516 1,001534 1,001552 1,001570 1,001589 ,6 ,7 ,8 ,9 20,0 ,1 ,2 ,3 ,4 20,5 ,6 ,7 ,8 ,9 21,0 ,1 ,2 ,3 ,4 21,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,001722 1,001741 1,001761 1,001780 1,001800 1,001819 1,001839 1,001859 1,001880 1,001900 1,001920 1,001941 1,001961 1,001982 1,002002 1,002023 1,002044 1,002065 1,002086 1,002107 1,002129 1,002151 1,002172 1,002194 ,6 ,7 ,8 ,9 23,0 ,1 ,2 ,3 ,4 23,5 ,6 ,7 ,8 ,9 24,0 ,1 ,2 ,3 ,4 24,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,002349 1,002372 1,002394 1,002417 1,002439 1,002462 1,002485 1,002508 1,002531 1,002555 1,002578 1,002602 1,002625 1,002649 1,002672 1,002696 1,002720 1,002745 1,002769 1,002793 1,002817 1,002842 1,002866 1,002891 ,6 ,7 ,8 ,9 26,0 ,1 ,2 ,3 ,4 26,5 ,6 ,7 ,8 ,9 27,0 ,1 ,2 ,3 ,4 27,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1,003066 1,003092 1,003117 1,003143 1,003168 1,003194 1,003222 1,003247 1,003273 1,003299 1,003326 1,003352 1,003379 1,003405 1,003432 1,003458 1,003485 1,003513 1,003540 1,003567 1,003594 1,003621 1,003649 1,003676 ,6 ,7 ,8 ,9 29,0 ,1 ,2 ,3 ,4 29,5 ,6 ,7 ,8 ,9 30,0 1,003871 1,003899 1,003928 1,003956 1,003984 1,004013 1,004042 1,004071 1,004099 1,004128 1,004158 1,004187 1,004216 1,004245 1,004275 20 oC’de piknometredeki suyun kütlesi M Co20 = V Co20 × 0,998203 0,998203; 20 oC’de suyun yoğunluğudur. Not: Gerekli ise suyun havadaki yoğunluğu olan 0,99715 değeri kullanılabilir ve HMCE Tablolarında bu yoğunluğa karşılık gelen referans ile alkol miktarı hesaplanır. 4.1.2. İki kefeli terazi kullanılarak kalibrasyon metodu 4.1.2.1. Terazinin sol kefesine dara şişesi ve sağ kefesine toplayıcı kapağı ile birlikte temiz, kuru piknometre yerleştirilir. Piknometre tarafına ağırlıklar eklenerek (p gram) denge sağlanır. 4.1.2.2. Ortam sıcaklığında piknometre distile su ile doldurulur ve termometre sabitlenir. Piknometre silinerek kurulanır ve ısı yalıtımlı kap içerisine yerleştirilir. Termometrenin sıcaklığı sabit okumaya gelene kadar kap alt-üst edilerek karıştırılır. Yan tüpün üst kısmındaki seviye çizgisine ayarlama yapılır. Yan tüp temizlenir, toplayıcı kapak sabitlenir, t oC sıcaklık dikkatlice okunur ve gerekiyor ise sıcaklık skalasındaki herhangi bir hata için düzeltme yapılır. Daha sonra su ile dolu piknometre tartılır [p´,(g)]. 4.1.2.3. Hesaplama: Boş piknometrenin darası = p + m m; piknometredeki havanın kütlesi m = 0,0012 × (p – p´) 20 oC’de piknometrenin hacmi V Co20 = (p + m - p´) × Ft,1 Ft; Tablo-2’den alınan t oC sıcaklık için faktördür. V Co20 , 0,001 mL hassasiyetinde olmalıdır. 20 oC’de piknometredeki suyun kütlesi M Co20 = V Co20 × 0,998203 0,998203; 20 oC’de suyun yoğunluğudur. 4.2. Numunenin alkol miktarının belirlenmesi 4.2.1. Tek kefeli terazi kullanılarak: 4.2.1.1. Dara şişesi tartılır. (T1) 4.2.1.2. Hazırlanan distilat (Bölüm 1) ile piknometre tartılır (t oC’de ağırlığı P2). 4.2.1.3. Hesaplama dT = T1 – T0 Ölçüm anında boş piknometrenin kütlesi = P – m + dT t oC’de piknometredeki sıvının kütlesi = P2 – (P – m + dT) t oC’de g/mL olarak yoğunluk P Cto = [P2 – (P – m + dT)]/ V Co20 Yoğunluk; ρ t oC değeri 1000 ile çarpılarak, t oC’de kg/m3 olarak ifade edilir ve değer ρt olarak bilinir. Alkol-su karışımları için ρT yoğunlukları tablosu (OIV, analiz metotları kılavuzu, 1. Cilt Ek-II/Tablo-II, sayfa 11, 2012) kullanılarak ρt, 20 oC’ye düzeltilir. Tabloda, t oC sıcaklık değerinin hemen altındaki tam sayı sıcaklık değerindeki T sıcaklığına karşılık gelen yatay satır ve ρt’nin üstündeki en küçük yoğunluk değeri bulunur. Bu yoğunluğun altında bulunan tablo farkı kullanılarak, T sıcaklıktaki distilatın ρt yoğunluğu hesaplanır. Sıcaklık satırı kullanılarak, ρt’nin hemen üzerinde tabloda ρ´ yoğunluğu ve hesaplanan ρt yoğunluğu arasındaki fark bulunur. Bu fark, ρ´ yoğunluğunun sağında bulunan tablo farkı ile bölünür. Bu oran; alkol miktarının tamsayı kısmı ρ´ yoğunluğunun bulunduğu kolonun üstünde bulunurken alkol miktarının ondalıklı kısmını verir. (Dt, alkol miktarı) Not: Alternatif olarak piknometre işarete tamamlanana kadar 20 oC’deki (± 0,2 oC) su banyosunda bekletilir. 4.2.1.4. Sonuç ρ20 yoğunluğu kullanıldığında, “Alkol Tabloları” yardımıyla gerçek alkol miktarı hesaplanır. Alkol-su karışımlarının 20 oC’de yoğunluğunun fonksiyonu olarak 20 oC’de hacmen (%hacmen) alkol miktarının değerini veren “Alkol Tabloları”, OIML tarafından kabul edilmiş olan uluslararası tablolardır ( OIML 22 no’lu Tavsiye Kararı, 1975 ). 4.2.2. Tek kefeli terazi kullanılan metot 4.2.2.1. Hazırlanan distilat ile dolu olan piknometre tartılır; p´´, t oC’deki kütledir. 4.2.2.2. Hesaplama t oC’de piknometredeki sıvının kütlesi = p + m - p´´ t oC’de g/mL olarak yoğunluk; P Cto = (p + m - p´´)/ V Co20 Yoğunluk, t oC’de kg/m3 olarak ifade edilir ve tek kefeli terazi kullanımında tarif edildiği gibi 20 oC’de alkol miktarını hesaplamak için sıcaklık düzeltmesi yapılır. 5. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) 5.1. Laboratuvarlararası analizin istatiksel sonuçları Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 20 Numune sayısı 6 Numuneler A B C D E F Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 19 20 17 19 19 17 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 1 − 2 1 1 3 Kabul edilen sonuç sayısı 38 40 34 38 38 34 Ortalama değer ( x ), (%hacmen) 23,77 40,04 40,29 39,20 42,24 57,03 26,51* 42,93* 45,73* 63,03* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) (% hacmen) 0,106 0,176 0,072 0,103 0,171 0,190 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 0,42 0,44 0,18 0,25 0,39 0,32 Tekrar edilebilirlik sınırı (% hacmen) (r) 0,30 0,49 0,20 0,29 0,48 0,53 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) (%hacmen) 0,131 0,236 0,154 0,233 0,238 0,322 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 0,52 0,59 0,38 0,57 0,54 0,53 Laboratuvarlararası yeniden üretilebilirlik sınırı (% hacmen) (R) 0,37 0,66 0,43 0,65 0,67 0,90 Numune türleri A Meyve likörü; split oranı (*) B Brendi; kör tekrarlar C Viski; kör tekrarlar D Grappa; split oranı (*) E Aquavit; split oranı (*) F Rom; split oranı (*) Metot B: Distile Alkollü İçkilerin Hacmen Gerçek Alkol Miktarının Belirlenmesi – Elektronik Dansimetre İle Ölçüm (Osilasyon Hücresindeki Numunenin Rezonant Sıklık Salınımına Dayalı Ölçüm) 1. Prensip Sıvının yoğunluğu, titreşen U-tüpünün salınımlarının elektronik ölçümü ile belirlenir. Bu ölçümü gerçekleştirmek için; numune, bir salınım sistemine eklenir. Böylece, sistemin spesifik salınım sıklığı, kütlenin eklenmesi ile değişir. 2. Reaktifler Analizlerde aksi belirtilmedikçe, yalnızca analitik saflıkta çözeltiler ve en az TS EN ISO 3696’da tanımlanan sınıf 3 su kullanılır. Aseton ya da mutlak alkol (hacmen %100’lük etil alkol). Kuru hava 3. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 3.1. Dijital görüntülü dansimetre Bu tür ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan elektronik dansimetre, yoğunluğu 5 ondalıklı olarak g/mL cinsinden ifade edebilmelidir. Not: Dansimetre, tüm titreşimlerden izole edilmiş çok iyi sabitlenmiş bir stand üzerine yerleştirilmelidir. 3.2. Sıcaklık düzenlemesi Dansimetrenin performansı, sadece ölçüm hücresi ± 0,02 oC ya da daha hassas sapma ile aynı sıcaklık stabilitesini mümkün kılabilen sabit sıcaklık düzenleyicisine bağlı ise geçerlidir. Not: Ölçüm hücresinde sıcaklığın doğru ayarlanması ve izlenmesi çok önemlidir. 0,1 oC’lik bir hata, yoğunlukta 0,1 kg/m3 (0,0001 g/mL) bir sapmaya neden olabilir. 3.3. Numune enjeksiyon şırıngaları ya da otomatik örnekleyici. 4. İşlem 4.1. Dansimetrenin kalibrasyonu Dansimetre ilk kullanımında talimatına göre kalibre edilmelidir. Düzenli olarak tekrar kalibre edilmeli ve sertifikalı referans standarda ya da sertifikalı referans standart bazlı iç laboratuvar referans çözeltisine karşı kontrol edilmelidir. 4.2. Numune yoğunluğunun belirlenmesi 4.2.1. Ölçüm öncesinde gerekli ise; hücre, aseton ya da mutlak alkol ve kuru hava ile temizlenir ve kurulanır. Hücre, numune ile çalkalanır. 4.2.2. Şırınga ya da örnekleyici kullanılarak tamamen dolacak şekilde hücreye numune enjekte edilir. Bu işlem sırasında, hava kabarcıklarının tamamen uzaklaştırıldığından emin olunmalıdır. Numune homojen olmalıdır ve katı partiküller içermemelidir. Analiz öncesinde, herhangi bir partikül filtrasyon gibi işlemlerle uzaklaştırılmalıdır. 4.2.3. Okuma sabitlendikten sonra, ρ20 yoğunluğu ya da dansimetre ile gösterilen alkol miktarı kaydedilir. 4.3. Sonuç ρ20 yoğunluğu kullanıldığında, “Alkol Tabloları” yardımıyla gerçek alkol miktarı hesaplanır. Alkol-su karışımlarının 20 oC’de yoğunluğunun fonksiyonu olarak 20 oC’de hacmen (% hacmen) alkol miktarının değerini veren “Alkol Tabloları”, OIML tarafından kabul edilmiş olan uluslararası tablolardır ( OIML 22 no’lu Tavsiye Kararı, 1975 ). 5. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) 5.1. Laboratuvarlararası analizin istatiksel sonuçları Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 16 Numune sayısı 6 Numuneler A B C D E F Aykırı değer gösteren laboratuvarların 11 13 15 16 14 13 çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 2 3 1 2 1 ־ Kabul edilen sonuç sayısı 22 26 30 32 28 26 Ortalama değer ( x ), (%hacmen) 23,81 40,12 40,35 39,27 42,39 56,99 26,52* 43,10* 45,91* 63,31* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) (% hacmen) 0,044 0,046 0,027 0,079 0,172 0,144 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 0,17 0,12 0,07 0,19 0,39 0,24 Tekrar edilebilirlik sınırı (%hacmen) (r) 0,12 0,13 0,08 0,22 0,48 0,40 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) (%hacmen) 0,054 0,069 0,083 0,141 0,197 0,205 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 0,21 0,17 0,21 0,34 0,45 0,34 Laboratuvarlararası yeniden üretilebilirlik sınırı (%hacmen) (R) 0,15 0,19 0,23 0,40 0,55 0,58 Numune türleri A Meyve likörü; split oranı (*) B Brendi; kör tekrarlar C Viski; kör tekrarlar D Grappa; split oranı (*) E Aquavit; split oranı (*) F Rom; split oranı (*) Metot C: Distile Alkollü İçkilerin Hacmen Gerçek Alkol Miktarlarının Belirlenmesi – Hidrostatik Terazi Kullanılarak Dansimetre ile Ölçüm 1. Prensip Distile alkollü içkilerin alkol miktarı Arşimet prensibine (Bir sıvının içine batırılan kütle, içine konduğu sıvının ağırlığına eşit miktarda sıvının yükselmesine sebep olur.) dayanan hidrostatik terazi kullanılarak dansimetre ile ölçülebilir. 2. Reaktifler Analizlerde aksi belirtilmedikçe, yalnızca analitik saflıkta çözeltiler ve en az TS EN ISO 3696’da tanımlanan sınıf 3 su kullanılır. Dansimetre temizleme çözeltisi (sodyum hidroksit, %30 ağırlık/hacim) 100 mL çözelti hazırlamak için; 30 g sodyum hidroksit tartılır ve hacmen % 96’lık etil alkol ile 100 mL’ye tamamlanır. 3. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 3.1. Tek kefeli hidrostatik terazi (1 mg ölçüm hassasiyetinde) 3.2. En az 20 mL hacimli dansimetre (teraziye göre özel olarak adapte edilmiş ve çapı 0,1 mm’yi geçmeyen bir iple asılı) 3.3. Seviye işareti taşıyan bir ölçü silindiri (Dansimetrenin, işaretin altına yerleştirilmiş silindirin hacmine tamamen sığabilecek durumda olması gerekir. İp yardımıyla dansimetre sıvının içine daldırılır. Ölçü silindirinin iç çapı dansimetrenin çapından en az 6 mm daha geniş olmalıdır.) 3.4. Termometre ya da sıcaklık ölçer sonda (10 oC’den 40 °C’ ye kadar onarlı olarak derecelenmiş ve 0,05 °C’ye kalibre edilmiş) 3.5. Ağırlıklar (yetkili bir sertifikalandırma kuruluşu tarafından kalibre edilmiş) Not: OIV analiz metotlarının “20 °C’ de Yoğunluk ve Özgül Ağırlık Analizi” başlıklı (OIV, analiz metotları kılavuzu, 1. Cilt Bölüm-II/Tip 1 Metodu, sayfa 20, 2012) metodunda tarif edilen prensip ile iki kefeli terazi kullanımı da mümkündür. 4. İşlem Dansimetre ve ölçü silindiri her ölçüm arasında distile suyla temizlenmeli, yumuşak kurutma kâğıdıyla kurulanmalı ve yoğunluğu belirlenecek çözeltiyle çalkalanmalıdır. Evaporasyon ile alkol kaybını engellemek için düzenek stabil duruma geldikten hemen sonra ölçümler yapılmalıdır. 4.1. Terazinin kalibrasyonu Her ne kadar terazilerin genelde iç kalibrasyon sistemleri olsa da, hidrostatik terazilerin yetkili bir sertifikalandırma kuruluşu tarafından kontrol edilmiş ağırlıklarla kalibre edilmesi gereklidir. 4.2. Dansimetrenin kalibrasyonu 4.2.1. Ölçü silindiri, 15 oC – 25 oC arasındaki, ancak tercihen 20 oC’deki, iki kere distile edilmiş suyla (ya da eşit saflıkta suyla,18,2 MΩ/cm iletkenliğe sahip mikrofiltre edilmiş su) işarete kadar doldurulur. 4.2.2. Dansimetre ve termometre daldırılır, karıştırılır ve düzenekten sıvının yoğunluğu okunur. Gerekirse ölçüm sıcaklığındaki suyun yoğunluğuna göre yoğunluk düzeltmesi yapılır. 4.3. Alkol-su çözeltisi kullanılarak yapılan kontrol 4.3.1. Ölçü silindiri, 15 °C - 25 °C arasındaki, ancak tercihen 20 °C’deki, hacmen alkol miktarı bilinen alkol-su karışımı ile işarete kadar doldurulur. 4.3.2. Dansimetre ve termometre daldırılır, karıştırılır ve düzenekten sıvının yoğunluğu (ya da mümkünse alkol miktarı) okunur. Okunan alkol miktarı, daha önceden bilinen alkol miktarına eşit olmalıdır. Not: Dansimetreyi kalibre etmek için iki kere distile edilmiş su yerine alkol miktarı bilinen bu çözelti de kullanılabilir. 4.4. Distilatın yoğunluğunun (ya da düzenek olanak sağlıyorsa alkol miktarının) ölçümü 4.4.1. Numune, ölçü silindirinin derecelendirme işaretine kadar doldurulur. 4.4.2. Dansimetre ve termometre daldırılır, karıştırılır ve düzenekten sıvının yoğunluğu (ya da mümkünse alkol miktarı) okunur. Eğer yoğunluk t °C’de ölçüldüyse; ρt sıcaklık not edilir. 4.4.3. Alkol-su karışımları için ρt yoğunlukları tablosu kullanılarak ρt, 20°C’ye düzeltilir (OIV, analiz metotları kılavuzu, 1. Cilt Ek-II/Tablo-II, sayfa 11, 2012) 4.5. Dansimetrenin ve ölçü silindirinin temizlenmesi 4.5.1. Dansimetre, ölçü silindirinin içindeki dansimetre temizleme çözeltisi içine daldırılır. 4.5.2. Bir saat boyunca dansimetre düzenli aralıklarla çevrilerek ıslanması sağlanır. 4.5.3. Önce bol miktarda musluk suyuyla, daha sonra da distile suyla durulanır. 4.5.4. Kurutma kâğıdıyla kurulanır. Bu işlem, dansimetrenin ilk kullanımında ve daha sonra da gerekli sıklıkta gerçekleştirilir. 4.6. Sonuç ρ20 yoğunluğu kullanıldığında, “Alkol Tabloları” yardımıyla gerçek alkol miktarı hesaplanır. Alkol-su karışımlarının 20 oC’de yoğunluğunun fonksiyonu olarak 20 oC’de hacmen (% hacmen) alkol miktarının değerini veren “Alkol Tabloları”, OIML tarafından kabul edilmiş olan uluslararası tablolardır ( OIML 22 no’lu Tavsiye Kararı, 1975 ). 5. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) 5.1. Laboratuvarlararası analizin istatiksel sonuçları Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 12 Numune sayısı 6 Numuneler A B C D E F Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 12 10 11 12 11 9 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 2 1 ־ 1 2 ־ Kabul edilen sonuç sayısı 24 20 22 24 22 18 Ortalama değer ( x ), (% hacmen) 23,80 26,51* 40,09 40,29 39,26 43,09* 42,38 45,89* 57,16 63,44* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) (% hacmen) 0,048 0,065 0,042 0,099 0,094 0,106 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 0,19 0,16 0,10 0,24 0,21 0,18 Tekrar edilebilirlik sınırı (% hacmen) (r) 0,13 0,18 0,12 0,28 0,26 0,30 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) (% hacmen) 0,060 0,076 0,073 0,118 0,103 0,125 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 0,24 0,19 0,18 0,29 0,23 0,21 Laboratuvarlararası yeniden üretilebilirlik sınırı (% hacmen) (R) 0,17 0,21 0,20 0,33 0,29 0,35 Numune türleri A Meyve likörü; split oranı (*) B Brendi; kör tekrarlar C Viski; kör tekrarlar D Grappa; split oranı (*) E Aquavit; split oranı (*) F Rom; split oranı (*) Ek-2 GRAVİMETRİK METOTLA TOPLAM KURU MADDENİN BELİRLENMESİ 1. Kapsam Bu metot, yalnızca Distile Alkollü İçkiler Tebliği’nde geçen 15 g/L ile sınırlı kuru madde içeren “akvavit” veya “aquavit”ler için kullanılır. 2. Tanım Toplam kuru madde, belirli fiziksel koşullar altında uçucu olmayan bütün maddeleri içerir. Analizlerde kullanılacak su, TS EN ISO 3696’da tanımlanmıştır. 3. Prensip Gravimetrik yolla gerçekleştirilen bu metodun prensibi, kaynayan su banyosunda distile alkollü içkinin evaporasyonu ve etüvde kurutulması ile ayrılan kalıntıların tartımına dayanır. 4. Araç ve gereçler 4.1. Düz tabanlı, 55 mm çapına sahip silindirik evaporasyon kabı 4.2. Kaynar su banyosu 4.3. A sınıfı 25 mL’lik pipet 4.4. Etüv 4.5. Desikatör 4.6. 0,1 mg hassasiyetinde analitik terazi 5. Numuneler Numuneler analiz öncesi oda sıcaklığında saklanır. 6. İşlem 6.1. Önceden tartılmış evaporasyon kabına kuru madde miktarı 15 g/L’den az olan numuneden 25 mL aktarılır. Evaporasyonun birinci saati sırasında, sıçramalar nedeniyle kayıplar olabileceği için sıvının kaynamaması için evaporasyon kabı kaynar su banyosunun kapağının üzerine yerleştirilir. Bir saat daha kaynar su banyosunun buharı ile doğrudan temasa bırakılır. 6.2. Evaporasyon kabı daha sonra 105 ± 3 oC’de 2 saat etüvde tamamen kurutulur. Evaporasyon kabı desikatörde soğumaya bırakılır ve içeriği ile birlikte kap tartılır. 7. Hesaplama Kalıntının kütlesi 40 ile çarpıldığında, distile alkollü içkideki kuru madde miktarına eşittir ve g/L cinsinden tek ondalıklı olarak ifade edilir. 8. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) 8.1. Laboratuvarlararası analizin istatiksel sonuçları Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 10 Numune sayısı 4 Numuneler A B C D Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 9 9 8 9 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 1 1 2 ־ Kabul edilen sonuç sayısı 18 18 16 18 Ortalama değer ( x ), (% hacmen) 9,0 9,1 7,8 10,0 9,4 11,8 11,1 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) (% hacmen) 0,075 0,441 0,028 0,123 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 0,8 5,2 0,3 1,1 Tekrar edilebilirlik sınırı (% hacmen) (r) 0,2 1,2 0,1 0,3 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) (%hacmen) 0,148 0,451 0,058 0,210 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 1,6 5,3 0,6 1,8 Laboratuvarlar arası yeniden üretilebilirlik sınırı (% hacmen) (R) 0,4 1,3 0,2 0,6 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Rom; split oranı C Grappa; split oranı D Aquavit; split oranı Ek-3 DİSTİLE ALKOLLÜ İÇKİLERİN METİL ALKOL VE UÇUCU BİLEŞİKLERİNİN BELİRLENMESİ 1. Genel hükümler 1.1. Tanımlar Distile alkollü içkilerde etil alkol ve metil alkol dışındaki toplam uçucu bileşiklerin minimum miktarları Distile Alkollü İçkiler Tebliği’nde belirtilmiştir. Bu içkilerde toplam uçucu miktarı uçucu asitler, aldehitler, esterler ve yüksek alkollerin miktarlarının toplanmasıyla bulunur. Burada; i) Uçucu asitler; asetik asit cinsinden ifade edilir. ii) Aldehitler; asetaldehit (etanal) ve asetal (1,1-dietoksietan)’in toplamı olarak asetaldehit cinsinden ifade edilir. iii) Yüksek alkoller; n-propanol, 2-bütanol (sekbütanol), izobütanol (2-metil-1-propanol), n-bütanol, aktif amil alkol (2-metil 1-bütanol) ve izoamil alkol (3-metil-1-bütanol) toplamı olarak izobütanol cinsinden ifade edilir. Amil alkoller; aktif amil alkol ve izoamil alkol’ün toplamı olarak verilebilir. iv) Esterler; etil asetat (etiletanoat) ve metil asetatın toplamı olarak etil asetat cinsinden ifade edilir. Uçucu bileşiklerin analizi için uygulanan metotlar a) Uçar asit tayini b) GC metodu ile aldehit (etanal ve asetal), etil asetat ve yüksek alkollerin tayini 1.2. Uçucu bileşiklerin GC ile analizi Yukarıda bahsedilenlerin haricindeki diğer uçucu bileşiklerin GC ile çalışılması, aynı zamanda distilasyonda kullanılan hammaddenin kaynağının belirlenmesinde ve distilasyon koşullarının saptanmasında kullanılabilir. Bazı distile alkollü içkiler, aromatik bileşikler gibi diğer uçucu bileşikleri içerir. Bu aromatik bileşikler; hazırlanan distile alkollü içkilerin hazırlanmasının özel şartları, distile alkollü içkilerin aromasının ve alkol eldesinde kullanılan ham maddenin karakteristiğini yansıtır. Bu bileşikler, Distile İçkiler Alkollü Tebliği’nde belirtilen hükümlerin değerlendirilmesinde önemlidir. 2. Aldehitler, yüksek alkoller, etil asetat ve metil alkolün GC ile analizi: 2.1. Kapsam Bu metot, GC ile distile alkollü içkilerde bulunan aktif amil alkol, izoamil alkol, metil alkol (metanol), etil asetat, n-bütanol, 2-bütanol, izobütil alkol, n-propanol ve asetaldehitin belirlenmesi için uygundur. Metotta 3-pentanol gibi bir iç standart kullanılır. Analitlerin konsantrasyonu; mutlak alkolün (hacmen %100 alkolde) 100 litresinde gram olarak ifade edilir. Bunun için numunedeki hacmen alkol miktarının önceden belirlenmesi gerekir. 2.2. Tanım İçeriği oluşturan bu maddeler; distile alkollü içkilerde, fermentasyon, distilasyon ve olgunlaştırma sırasında etil alkol ile birlikte oluşan uçucu bileşiklerdir. Analizlerde kullanılacak su, TS EN ISO 3696’da tanımlanmıştır. 2.3. Prensip Distile alkollü içki numunesi GC’ye doğrudan enjekte edilerek (veya seyreltildikten sonra) uçucu bileşikler belirlenir. Enjeksiyondan önce numune içerisine uygun bir iç standart (örneğin 3-pentanol) ilave edilir ve uçucu bileşikler uygun bir kolon ve sıcaklık programıyla birbirinden ayrılır ve alev iyonlaşma dedektöründe (FID) tespit edilir. Her bir uçucu bileşiğin konsantrasyonu, analiz edilen distile alkollü içki ile aynı kromatografik koşullarda kalibrasyonla elde edilen tepki faktörleri de dikkate alınarak hesaplanır. 2.4. Reaktifler ve materyaller Aksi belirtilmedikçe yalnızca en az % 97 saflıkta çözeltiler olmalıdır. Asetaldehit ve asetal buzdolabında 5 ºC’nin altında karanlıkta saklanmalıdır. Diğer kimyasal maddeler ise oda sıcaklığında saklanabilir. Tüm çözeltilerin hazırlanmasında ve GC analizlerinde ultra saf su (18,2 MΩ/cm iletkenliğe sahip mikrofiltre edilmiş su) kullanılır. 2.4.1. Mutlak (susuz) etil alkol (CAS 64-17-5) 2.4.2. Metil alkol (CAS 67-56-1) 2.4.3. Propan-1-ol (CAS 71-23-8) 2.4.4. 2-metilpropan-1-ol (CAS 78-33-1) 2.4.5. Uygun iç standartlar; pentan-3-ol (CAS 584-02-1), pentan-1-ol (CAS 71-41-0), 4-metilpentan-1-ol (CAS 626-89-1) veya metil nonanoat (CAS 1731-84-6) 2.4.6. 2-metilbütan-1-ol (CAS 137-32-6) 2.4.7. 3-metilbütan-1-ol (CAS 123-51-3) 2.4.8. Etil asetat (CAS 141-78-6) 2.4.9. Bütan-1-ol (CAS 71-36-3) 2.4.10. Bütan-2-ol (CAS 78-92-2) 2.4.11. Asetaldehit (CAS 75-07-0) 2.4.12. Asetal (CAS 105-57-7) 2.4.13. Hacmen %40’lık etil alkol çözeltisi (Bundan sonra sadece “etil alkol çözeltisi” olarak ifade edilecektir.) 1 litrelik balon jojeye 400 mL mutlak etil alkol alınır. Distile su ile 1 litreye tamamlanır ve karıştırılır. 2.4.14. Standart çözeltilerin hazırlanması ve saklanması (Geçerli kılınmış metot için kullanılan prosedür): Tüm standart çözeltiler buzdolabında 5 ºC’nin altında saklanmalıdır ve her ay tekrar hazırlanmalıdır. Bileşen ve çözeltilerin kütleleri, 0,1 mg hassasiyette kayıt edilmiş olmalıdır. 2.4.14.1. Standart çözelti - A 100 mL’lik balon joje içerisine, bileşen evaporasyonunu önlemek için 60 mL etil alkol çözeltisi ilave edilir ve üzerine aşağıdaki reaktiflerden 3’er mL konulur ve etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanarak iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen her bir bileşiğin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. Bileşen Hacim (mL) Metil alkol (2.4.2) 3,0 Propan-1-ol (2.4.3) 3,0 2-metilpropan-1-ol (2.4.4) 3,0 2-metilbütan-1-ol (2.4.6) 3,0 3-metilbütan-1-ol (2.4.7) 3,0 Etil asetat (2.4.8) 3,0 Bütan-1-ol (2.4.9) 3,0 Bütan-2-ol (2.4.10) 3,0 Asetaldehit (2.4.11) 3,0 Asetal (2.4.12) 3,0 Not: Evaporasyonla oluşan kaybı en aza indirmek için, asetal ve asetaldehit en son ilave edilir. 2.4.14.2. Standart çözelti - B 100 mL balon joje içerisine 80 mL etil alkol çözeltisi ilave edilir ve üzerine iç standart olarak kullanılacak 3 mL pentan-3-ol veya başka bir uygun iç standart ilave edilir. Etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen pentan-3-ol (veya başka bir iç standart)’ün ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.4.14.3. Standart çözelti - C 100 mL’lik balona 80 mL etil alkol çözeltisi alınır ve üzerine 1 mL Standart çözelti – A (2.4.14.1) ve 1 mL Standart çözelti – B (2.4.14.2) ilave edilir. Etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen her çözeltinin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.4.14.4. Standart çözelti - D Analizlerde sürekliliği sağlamak için, önceden hazırlanmış Standart çözelti – A (2.4.14.1) kullanılarak bir kalite kontrol standart çözeltisi hazırlanır. 100 mL’lik balona 80 mL etil alkol çözeltisi alınır ve üzerine 1 mL Standart çözelti – A’dan ilave edilir. Etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen her bileşenin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.4.14.5. Standart çözelti - E 100 mL’lik balon joje içerisine 80 mL etil alkol çözeltisi ilave edilir ve üzerine 10 mL Standart çözelti - B (2.4.14.2) konulur. Etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen her bileşenin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.4.14.6. FID’ın tepki doğrusallığını kontrol etmek için kullanılan standart çözeltiler Beş ayrı 100 mL’lik balona 80 mL etil alkol çözeltisi ilave edildikten sonra her bir balona 0 - 0,1 - 0,5 – 1,0 ve 2,0 mL Standart çözelti – A (2.4.14.1) ve 1 mL Standart çözelti – B (2.4.14.2) ilave edilir. Etil alkol çözeltisiyle 100 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. Balonun darası, ilave edilen her bileşenin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.4.14.7. Kalite kontrol standart çözeltisi Bir tartı kabı içerisine pipetle Standart çözelti – D (2.4.14.4)’den 9 mL ve üzerine Standart çözelti – E (2.4.14.5)’den 1 mL alınır ve iyice karıştırılır. Kabın darası, ilave edilen her bileşenin ağırlığı ve son ağırlık kaydedilir. 2.5. Araç ve gereçler 2.5.1. Yoğunluk ve hacmen alkol miktarını ölçmeye yarayan cihazlar 2.5.2. Analitik terazi (4 ondalıklı hassasiyette tartım yapabilen) 2.5.3. GC – FID’a bağlı, fırın sıcaklığı programlanabilen, pik alanını veya yüksekliğini ölçebilen bilgisayar programına sahip. 2.5.4. En azından Madde 1.1.’in (iii) bendinde belirtilen analitleri (2-metilbütan-1-ol ve 3-metilbütan-1-ol hariç) birbirinden ayırabilen GC kolonu. Not: Analize uygun bazı örnek kolon ve GC koşulları aşağıda verilmiştir. 1. CP-WAX 57CB kolonuna bağlı (50 m uzunluk ve 0,32 mm iç çap ve 0,2 µm film kalınlığı, polietilen glikol sabit fazlı) 1 m uzunlukta ve 0,32 mm iç çapında bir ön kolon (gard kolon) ve bu kolona bağlı Carbowax 400 kolonu (50 m ve 0,32 mm iç çap, 0,2µm film kalınlığı). Kolonlar presle geçirilmiş bağlayıcı ile birbirine bağlanır. Taşıyıcı gaz ve basınç: Helyum (135 kPa) Kolon sıcaklığı: 35 oC’de 17 dakika, 35 oC’den 70 oC’ye kadar 12 oC/dk artış, 70 oC’de 25 dakika bekleme. Enjektör sıcaklığı: 150 oC Dedektör sıcaklığı 250 oC Enjeksiyon miktarı: 1 µL, split 20 den 100:1’e kadar. 2. CP- WAX 57 CB kolonuna bağlı (50 m ve 0,2 µm film kalınlığına sahip, polietilen glikol sabit fazlı)1 m uzunlukta ve 0,32 mm iç çapta bir ön kolon. Ön kolon presle geçirilmiş bağlayıcı ile birbirine bağlanır. Taşıyıcı gaz ve basınç: Helyum (65 kPa) Kolon Sıcaklığı: 35 oC’de 10 dakika, 35 oC’den 110 oC’ye kadar 5 oC/dk artış, 110 oC’den 190 oC’ye kadar 30 oC/dk artış ve 190 oC’de 2 dakika bekleme. Enjektör sıcaklığı: 260 oC Dedektör sıcaklığı: 300 oC Enjeksiyon hacmi: 1µL, split 55:1 3. Dolgulu kolon ( %5 CW 20M; Carbopak B) (2 m uzunluk ve 2 mm iç çap) Kolon sıcaklığı: 65 oC’de 4 dakika, 65 oC’den 140 oC’ye kadar 10 oC/dk artış, 140 oC’de 5 dakika bekleme, 140 oC’den 150 oC’ye kadar 5 oC/dk artış, 150 oC’de 3 dakika bekleme. Enjektör sıcaklığı: 65 oC Dedektör sıcaklığı: 200 oC Enjeksiyon hacmi: 1µL 2.6. Numune 2.6.1. Laboratuvar numunesi: Analize başlamadan önce numunenin hacmen alkol miktarı belirlenir(2.5.1). 2.7. İşlem Uçucu maddeler ile çalışıldığı için dara alma işlemi de dahil olmak üzere her madde ilavesinden sonra tartı kabının kapağı kapalı tutulmalıdır. 2.7.1. Test kısmı 2.7.1.1. Tartı kabı darası belirlenir ve ağırlık kaydedilir. 2.7.1.2. Tartı kabı içerisine 9 mL numune alınır ve ağırlık kaydedilir (Mnumune). 2.7.1.3. Üzerine 1 mL Standart çözelti -E (2.4.14.5)’den eklenir ve ağırlık kaydedilir (Miç standart). 2.7.1.4. Analiz numunesi şiddetli bir şekilde karıştırılır (en az 20 kez çevrilir). Numuneler analiz öncesi uçucu kaybını minimize etmek için 5 oC’nin altında saklanmalıdır. 2.7.2. Kör deneme 2.7.2.1. 4 ondalıklı hassasiyete sahip hassas terazi kullanılarak tartı kabının darası alınır ve ağırlık kaydedilir. 2.7.2.2. Tartı kabı içerisine 9 mL etil alkol çözeltisi (2.4.13) alınır ve ağırlık kaydedilir. 2.7.2.3. Standart çözelti – E (2.4.14.5)’den 1 mL ilave edilir ve ağırlık kaydedilir. 2.7.2.4. Numune şiddetli bir şekilde karıştırılır (an az 20 kez çevrilir). Numuneler analiz öncesi uçucu kaybını minimize etmek için 5 oC’nin altında saklanmalıdır. 2.7.3. Ön test Madde 1.1.’in (iii) bendinde belirtilen tüm analitlerin (2-metilbütan-1-ol ve 3-metilbütan-1-ol hariç) kolonda iyi bir şekilde ayrılmalarını sağlamak için Standart çözelti – C (2.4.14.3), GC’ye enjekte edilir. 2.7.4. Kalibrasyon Kalibrasyon aşağıdaki işlemle kontrol edilir: İç standart (IS) içeren doğrusallık standart çözeltilerinin (2.4.14.6) her biri, 3 tekerrürlü analiz edilerek, doğrusal tepki sağlanır. Her bir enjeksiyonda her bir bileşen için elde edilen alan iç standardın alanına oranlanarak R değeri bulunur. Her bir bileşenin konsantrasyonunun iç standardın (IS) konsantrasyonuna oranı da C olarak ifade edilir. R ile C arasındaki korelasyon katsayısı en az 0.99 olmalıdır. R = Bileşenin pik alanı/İç standardın pik alanı C = Bileşenin konsantrasyonu (µg/g)/İç standardın konsantrasyonu (µg/g) 2.7.5. Belirleme Standard çözelti – C’den (2.4.14.3) enjekte edilir ve iki defa kalite kontrol standart çözeltisinden (2.4.14.7) enjekte edilir. Ardından bilinmeyen her 10 numune (2.7.1 ve 2.7.2’ye göre hazırlanan) enjeksiyonundan sonra bir defa kalite kontrol standart çözeltisi enjekte edilir. Her 5 numuneden sonra da bir defa Standart çözelti - C (2.4.14.3) enjekte edilir. 2.8. Hesaplama Cihazla yapılan işlemlerde otomatik olarak elde edilen sonuçlar aşağıda prensibi verilen metot ile kontrol edilebilir. Her bir bileşenin ve iç standardın pik alanları ya da pik yüksekliği ölçülür. 2.8.1. Tepki faktörünün hesaplanması Standart çözelti – C’den (2.4.14.3) enjekte edilir ve her bir bileşenin pik alanı hesaplanır. Daha sonra her bir bileşen için aşağıdaki formül kullanılarak tepki faktörü hesaplanır. Formül (1); Tepki faktörü (RF)=[ İç standardın pik alanı ya da yüksekliği/Bileşenin pik alanı ya da yüksekliği] x [Bileşenin konsantrasyonu (µg/g)/İç Standardın konsantrasyonu (µg/g)] Bileşenin konsantrasyonu = C çözeltisindeki (2.4.14.3) bileşenin konsantrasyonu İç standardın konsantrasyonu = C çözeltisindeki (2.4.14.3) iç standardın konsantrasyonu 2.8.1.1. Numune analiz Aşağıdaki formül kullanılarak numunelerdeki her bir bileşenin konsantrasyonu hesaplanır. Formül (2); Bileşenin konsantrasyonu, (µg/g) = [Bileşenin pik alanı ya da yüksekliği/İç standardın pik alanı ya da yüksekliği] x [İç standardın kütlesi (MIS) (g) / Numunenin kütlesi (Mnumune) (g)] x İç standardın konsantrasyonu (µg/g) x RF M numune = numunenin ağırlığı (2.7.1.2) M iç standart = İç standardın ağırlığı (2.7.1.3) İç standardın konsantrasyonu = E çözeltisindeki (2.4.14.5) iç standardın konsantrasyonu RF = Formül (1) yardımıyla hesaplanan tepki faktörü 2.8.1.2. Kalite kontrol standart çözeltisinin analizi Aşağıdaki formül kullanılarak kalite kontrol standart çözeltisindeki (2.4.14.7) her bir bileşen için hedef değerin % geri alması hesaplanır. Formül (3); Kalite kontrol numunesinin % geri alması = (Kalite kontrol standart çözeltisindeki analitin konsantrasyonu / D çözeltisindeki analitin konsantrasyonu) x 100 Kalite kontrol standart çözeltisindeki analit konsantrasyonu yukarıda belirtilen formül (1) ve formül (2) yardımıyla hesaplanır. 2.8.2. Sonuçların açıklanması Elde edilen sonuçlar aşağıdaki formül (4) yardımıyla µg/g’ dan g/L mutlak Alkole (mA) çevrilir. Mutlak Alkol = Hacmen %100’lük alkol Formül (4); Konsantrasyon (Mutlak alkolün 100 L ‘sinde g olarak, g/L mA) = Konsantrasyon (µg/g) x ρ x 10 / (Hacmen % alkol miktarı x 1000) ρ = yoğunluk (kg/m3) Sonuçlar, üç basamaklı ve en fazla tek ondalıklı olarak, g/L mA şeklinde verilir. Örneğin, 100 L mutlak alkolde 11,4 g olarak. 2.9. Metot validasyonu için kullanılan kalite güvence ve kontrolü Formül (2) kullanılarak, 2.7.1.’deki işlemlere göre hazırlanan kalite kontrol standart çözeltilerindeki her bir bileşenin konsantrasyonu hesaplanır. Daha sonra formül (3) kullanılarak hedef değerin geri alması hesaplanır. Eğer analiz sonuçları her bileşen için onların beklenen teorik değerlerinden ± %10 sapma sınırındaysa sonuçlar kabul edilebilir olarak değerlendirilir. Aksi takdirde, analizdeki yanlışlık tespit edilir ve düzeltilir. 2.10. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) Laboratuvarlararası analizin istatistiksel sonuçları: Aşağıdaki tablo etanal, etil asetat, asetal, toplam etanal, metil alkol, bütan-2-ol, propan-1-ol, bütan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-bütan-1-ol, 3-metil-bütan-1-ol’un değerlerini verir. Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Etanal Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 28 26 27 27 28 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 2 4 3 3 2 Kabul edilen sonuç sayısı 56 52 54 54 56 Ortalama değer ( x ), µg/g 63,4 71,67 130,4 38,4 13,8* 28,6 52,2* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 3,3 1,9 6,8 4,1 3,6 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 5,2 2,6 5,2 15,8 8,9 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 9,3 5,3 19,1 11,6 10,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) ,µg/g 12 14 22 6,8 8,9 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 18,9 19,4 17,1 26,2 22,2 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 33,5 38,9 62,4 19,1 25,1 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Etil asetat Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 24 24 25 24 24 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 2 2 1 2 2 Kabul edilen sonuç sayısı 48 48 50 48 48 Ortalama değer ( x ), µg/g 96,8 1046 120,3 112,5 91,8* 99,1 117,0* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) ,µg/g 2,2 15 2,6 2,1 2,6 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 2,3 1,4 2,1 2,0 2,4 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 6,2 40,7 7,2 5,8 7,3 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR) ,µg/g 6,4 79 8,2 6,2 7,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 6,6 7,6 6,8 6,2 6,6 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 17,9 221,9 22,9 17,5 20,0 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Asetal Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 20 21 22 17 21 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 4 3 2 4 3 Kabul edilen sonuç sayısı 40 42 44 34 42 Ortalama değer ( x ), µg/g 35,04 36,46 68,5 20,36 6,60* 15,1 28,3* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 0,58 0,84 1,6 0,82 1,9 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,7 2,3 2,3 6,1 8,7 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 1,6 2,4 4,4 2,3 5,3 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 4,2 4,4 8,9 1,4 3,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 12,1 12,0 13,0 10,7 14,2 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 11,8 12,2 25,0 4,0 8,7 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Toplam etanal Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 23 19 22 21 22 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 1 5 2 3 2 Kabul edilen sonuç sayısı 46 38 44 42 44 Ortalama değer ( x ), µg/g 76,5 85,3 156,5 45,4 15,8* 32,7 61,8* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 3,5 1,3 6,5 4,4 3,6 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 4,6 1,5 4,2 14,2 7,6 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 9,8 3,5 18,3 12,2 10,0 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 13 15 24,1 7,3 9,0 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 16,4 17,5 15,4 23,7 19,1 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 35,2 41,8 67,4 20,3 25,2 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Metil alkol Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 26 27 27 28 25 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 4 3 3 1 4 Kabul edilen sonuç sayısı 52 54 54 56 50 Ortalama değer ( x ), µg/g 319,8 2245 1326 83,0 61,5* 18,6 28,9* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 4,4 27 22 1,5 1,3 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,4 1,2 1,7 2,1 5,6 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 12,3 74,4 62,5 4,3 3,8 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 13 99 60 4,5 2,8 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 3,9 4,4 4,6 6,2 11,8 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 35,2 278,3 169,1 12,5 7,9 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 4 Analit Bütan-2-ol Numuneler A B C E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 21 27 29 22 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 4 3 1 3 Kabul edilen sonuç sayısı 42 54 58 44 Ortalama değer ( x ), µg/g 5,88 250,2 27,57 5,83 14,12* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 0,40 2,2 0,87 0,64 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 6,8 0,9 3,2 6,4 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 1,1 6,1 2,5 1,8 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 0,89 13 3,2 0,87 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 15,2 5,1 11,5 8,7 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 2,5 35,5 8,9 2,4 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit Propan-1-ol Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 29 27 27 29 29 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 2 4 3 2 2 Kabul edilen sonuç sayısı 58 54 54 58 58 Ortalama değer ( x ), µg/g 86,4 3541 159,1 272,1 229,3* 177,1 222,1* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 3,0 24 3,6 2,3 3,3 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma 3,4 0,7 2,3 0,9 1,6 (RSDr) (%) Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 8,3 68,5 10,0 6,4 9,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 5,3 150 6,5 9,0 8,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 6,1 4,1 4,1 3,6 4,1 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 14,8 407,2 18,2 25,2 22,7 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 3 Analit Propan-1-ol Numuneler A B C Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 20 22 22 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 4 4 6 Kabul edilen sonuç sayısı 40 44 44 Ortalama değer ( x ), µg/g 3,79 5,57 7,54 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 0,43 0,20 0,43 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 11,2 3,6 5,6 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 1,1 0,6 1,2 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 0,59 0,55 0,82 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 15,7 9,8 10,8 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 1,7 1,5 2,3 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit 2-metilpropan-1-ol Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 28 31 30 26 25 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 3 0 1 5 6 Kabul edilen sonuç sayısı 56 62 60 52 50 Ortalama değer ( x ), µg/g 174,2 111,7 185,0 291,0 246,8* 115,99 133,87* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), 2,3 1,6 2,5 1,8 0,74 µg/g Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,3 1,4 1,3 0,7 0,6 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 6,4 4,5 6,9 5,0 2,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 8,9 8,9 9,7 6,0 6,2 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 5,1 8,0 5,2 2,2 5,0 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 24,9 24,9 27,2 16,9 17,4 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit til-bütan-1-ol Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 25 26 25 27 25 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 3 2 3 1 2 Kabul edilen sonuç sayısı 50 52 50 54 50 Ortalama değer ( x ), µg/g 113,0 48,3 91,6 72,1 45,2* 39,5 61,5* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 2,1 1,5 1,7 2,3 2,3 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,9 3,1 1,8 3,9 4,5 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 6,0 4,2 4,7 6,4 6,3 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 7,4 3,8 6,6 4,7 4,5 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart 6,6 7,9 7,2 8,1 8,8 sapma (RSDR) (%) Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 20,8 10,7 18,4 13,3 12,5 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Laboratuvarlararası analiz yılı 1997 Laboratuvar sayısı 32 Numune sayısı 5 Analit 3-metil-bütan-1-ol Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 23 23 24 27 21 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 5 5 4 1 6 Kabul edilen sonuç sayısı 46 46 48 54 42 Ortalama değer ( x ), µg/g 459,4 242,7 288,4 142,2 120,4* 212,3 245,6* Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr), µg/g 5,0 2,4 3,4 2,4 3,2 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,1 1,0 1,2 1,8 1,4 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), µg/g 13,9 6,6 9,6 6,6 9,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), µg/g 29,8 13 21 8,5 6,7 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 6,5 5,2 7,3 6,5 2,9 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), µg/g 83,4 35,4 58,8 23,8 18,7 Numune türleri A Brendi; kör tekrarlar B Kirsch; kör tekrarlar C Grappa; kör tekrarlar D Viski; split oranı (*) E Rom; split oranı (*) Ek-4 DİSTİLE ALKOLLÜ İÇKİLERDE TRANS-ANETOL’ÜN GAZ KROMATOGRAFİSİ İLE BELİRLENMESİ 1. Kapsam Bu metot kapiler GC kullanılarak anason aromalı distile alkollü içkilerdeki trans-anetolün belirlenmesi için kullanılır. 2. Prensip Yüksek alkollü içkilerdeki trans-anetol konsantrasyonu, GC yardımıyla belirlenir. Eşit miktarda bir iç standart [örneğin, numunede doğal olarak estragol bulunmuyorsa 4-allilanisol (estragol)], analiz edilecek numuneye ve konsantrasyonu bilinen referans trans-anetol çözeltisine eklenerek % 45’lik etil alkol çözeltisiyle seyreltildikten sonra GC sistemine doğrudan enjekte edilir. Yüksek miktarlarda şeker içeren likör numunelerinin hazırlanması ve analizinden önce doğrudan ekstraksiyon gereklidir. 3. Reaktifler ve materyaller Analiz esnasında yalnızca en az %98 saflıkta reaktifler ve en az TS EN ISO 3696’da tanımlanan sınıf 3 su kullanılır. Referans kimyasallar soğukta (4 oC), ışıktan uzakta, alüminyum kaplarda veya amber renkli cam reaktif şişelerinde saklanmalıdır. Alüminyum sızdırmaz conta yerleştirilmiş kapaklar tercih edilmelidir. Kullanmadan önce trans-anetolün kristal halinden ısıtılarak eritilmesi gerekir, fakat bu durumda sıcaklık kesinlikle 35 oC’ yi geçmemelidir. 3.1. Hacmen %96’lık etil alkol (CAS 64-17-5) 3.2. 1-metoksi-4-(1-propenil)-benzen; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8) 3.3. 4-allilanisol (estragol); iç standart olarak kullanılır. (CAS 140-67-0) 3.4. Hacmen %45’lik etil alkol Hacmen %96’lık etil alkolün 378 g’ına 560 g distile su eklenir. 3.5. Standart çözeltilerin hazırlanması Tüm standart çözeltiler oda sıcaklığında (15-35 oC), ışıktan uzakta, alüminyum kaplarda veya amber renkli cam reaktif şişelerinde saklanmalıdır. Alüminyum sızdırmaz conta yerleştirilmiş kapaklar kullanılmalıdır. Trans-anetol ve 4-allilanisol pratikte suda çözünmez ve bu nedenle hacmen %45’lik etil alkol (3.4) eklemeden önce; bir miktar hacmen %96’lık etil alkol (3.1) içerisinde çözülmesi gerekir. Stok çözeltiler her hafta yeniden hazırlanmalıdır. 3.5.1. Standart çözelti A Trans-anetolün stok çözeltisi (konsantrasyon 2 g/L) 20 mL hacimli balon jojeye 40 mg trans-anetol (3.2) aktarılır (ya da 200 mL hacimli balon jojeye 400 mg), bir miktar hacmen %96’lık etil alkol (3.1) ilave edilir ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanarak iyice karıştırılır. 3.5.2. İç standart çözeltisi B İç standart stok çözeltisi, örneğin estragol (konsantrasyon 2 g/L) 20 mL hacimli balon jojeye 40 mg estragol (3.3) aktarılır (ya da 200 mL hacimli balon jojeye 400 mg), bir miktar hacmen %96’lık etil alkol (3.1) ilave edilir ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanarak iyice karıştırılır. 3.5.3. FID doğrusallık tepkisini kontrol etmek için kullanılan çözeltiler FID doğrusallık tepkisi, yüksek alkollü içkilerde bulunan trans-anetolün 0 ile 2,5 g/L aralığındaki konsantrasyonları dikkate alınarak kontrol edilir. Analiz işleminde, analiz edilecek olan yüksek alkollü içkilerin bilinmeyen numuneleri 10 kat seyreltilir (7.3). Metotta tanımlanan analiz koşulları için, analiz edilecek numunedeki trans-anetolün 0 - 0,05 - 0,1 - 0,15 - 0,2 ve 0,25 g/L konsantrasyonlarına eş değer stok çözeltileri şu şekilde hazırlanır: Stok çözelti A’dan (3.5.1) 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ve 2,5 mL alınır ve 20 mL’lik balon jojeler içerisine aktarılır. Sonra her bir balon jojeye 2 mL iç standart çözelti B’den (3.5.2) eklenir ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanarak iyice karıştırılır. Kör çözeltisi (7.4), 0 g/L çözelti olarak kullanılır. 3.5.4. Standart çözelti C Standart çözelti A’dan (3.5.1) 2 mL alınır ve 20 mL’lik balon jojeye aktarılır, sonra 2 mL iç standart çözeltisi B’den (3.5.2) eklenir ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanır, iyice karıştırılır. 4. Araç ve gereçler 4.1. FID’a bağlı kapiler GC, piklerin alanını ve yüksekliğini ölçebilen bilgisayar programı ya da veri işleme sistemi ve bir otomatik örnekleyici veya manuel numune enjeksiyonu için gerekli aletler. 4.2. Split/splitless enjektörü 4.3. Kapiler kolon, örneğin: Uzunluk 50 m, iç çap: 0,32 mm, film kalınlığı: 0,2 µm, sabit faz: FFAP-poröz polimere çapraz bağlı modifiye TPA polietilen glikol. 4.4. Genel laboratuvar gereçleri: A sınıfı ölçülü cam kap/A sınıfı dereceli ölçü silindiri, analitik terazi (± 0,1 mg hassasiyette) 5. Kromatografi koşulları Kolon tipi ve boyutları ve GC koşulları, anetol ve iç standardın birbirlerinden ve diğer karışan maddelerden en iyi şekilde ayrılmasına olanak sağlayacak özellikte olmalıdır. Madde 4.3’te örnek olarak verilen kolon için tipik koşullar aşağıda verilmiştir: 5.1. Taşıyıcı gaz: Analitik helyum 5.2. Akış hızı: 2 mL/dk 5.3. Enjeksiyon sıcaklığı: 250 oC 5.4. Dedektör sıcaklığı: 250 oC 5.5. Fırın sıcaklık koşulları: izotermal, 10 dakikada 180 oC’ye erişebilen 5.6. Enjeksiyon hacmi: 1µL, split oranı 1:40 6. Numuneler Numuneler oda sıcaklığında, cam kaplarda, güneş ışığından uzakta (mümkünse karanlıkta soğukta) saklanmalıdır. 7. İşlem 7.1. Estragol için numune taraması Numunede doğal olarak estragol bulunmadığından emin olmak için, iç standart eklenmeden bir kör analiz gerçekleştirilir. Eğer doğal olarak estragol bulunuyorsa o zaman farklı bir iç standart seçilmelidir (örneğin mentol). 20 mL’lik balon jojeye 2 mL numune pipetle aktarılır ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. 7.2. Bilinmeyen numunelerin hazırlanması 20 mL’lik balon jojeye 2 mL numune pipetle aktarılır. Sonra iç standart çözeltisi B (3.5.2)’den 2 mL ilave edilir ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanarak iyice karıştırılır. 7.3. Kör 20 mL’lik balon jojeye iç standart çözeltisi B (3.5.2)’den 2 mL pipetle aktarılır ve hacmen %45’lik etil alkol (3.4) ile 20 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. 7.4. Doğrusallık testi Analize başlamadan önce FID tepki doğrusallığı, doğrusallık standart çözeltilerinin (3.5.3) her birinin üç kez başarıyla analiz edilmesiyle kontrol edilmelidir. Her enjeksiyon için, bilgisayar programının pik alanları ve yüksekliklerinden; her biri için R oranına karşılık, onların ana çözeltilerinin g/L olarak konsantrasyonunun grafiği çizilir. R = Estragol pik yüksekliği veya alanı ile bölünen trans-anetol pik yüksekliği veya alanı. Doğrusal bir eğri elde edilmelidir. 7.5. Belirleme Kör çözelti (7.3) enjekte edilir. Sonra standart çözelti C (3.5.4) enjekte edilir ve bunu kalite kontrol numunesi olarak (Bu numune bilinmeyen numunedeki trans-anetolün muhtemel konsantrasyonunun referansı ile seçilebilir.) hareket eden doğrusallık standart çözeltilerinin birisi (3.5.3) ve 5 tane bilinmeyen numune (7.2) takip eder. Her bilinmeyen numuneden sonra analitik kararlılığı saptamak için bir doğrusallık (kalite kontrol) numunesi enjekte edilir. 8. Tepki faktörünün hesaplanması Trans-anetol ve iç standart pikleri için; pik alanları (bilgisayar sistemi ya da başka bir veri sistemi kullanarak) ya da pik yükseklikleri (manuel integrasyon) ölçülür. 8.1. Tepki faktörü (RFi ) hesaplama Tepki faktörü şu şekilde hesaplanır: RFi =( Ci/alani ya da yüksekliki ) x (alanis ya da yükseklikis /Cis ) Burada, Ci: Standart çözelti A (3.5.1) içerisindeki trans-anetolün konsantrasyonu Cis: İç standart çözeltisi B (3.5.2) içerisindeki iç standardın konsantrasyonu Alani: Trans-anetol pikinin alanı (ya da yüksekliği) Alanis: İç standart pikinin alanı (ya da yüksekliği)’nı ifade eder. RFi, standart çözelti C’nin (3.5.4) 5 numunesinden hesaplanır. 8.2. Test çözeltilerinin doğrusallık tepkisinin analizi Doğrusallık tepki test çözeltileri (3.5.3) enjekte edilir. 8.3. Numunenin analizi Bilinmeyen numune çözeltisi enjekte edilir. 9. Sonuçların hesaplanması Trans-anetol konsantrasyonunun hesaplaması için kullanılan formül şu şekildedir: Ci= Cis x (alani ya da yüksekliki / alanis ya da yükseklikis) x RFi Ci: Bilinmeyen trans-anetol konsantrasyonu Cis: Bilinmeyen çözelti (3.5.2) içerisindeki iç standardın konsantrasyonu Alani ya da yüksekliki: Trans-anetol pikinin alanı ya da yüksekliği Alanis ya da yükseklikis: İç standart pikinin alanı ya da yüksekliği RFi:Tepki faktörü (8.1’deki gibi hesaplanır) Trans-anetol konsantrasyonu, g/L şeklinde tek ondalıklı olarak verilir. 10. Kalite güvence ve kontrolü Kromatogramlar anetol ve iç standardın birbirlerinden ve diğer karışan maddelerden en iyi şekilde ayrılmasına olanak sağlayacak nitelikte olmalıdır. RFi değeri, çözelti C’nin (3.5.4) 5 enjeksiyon tekrarından hesaplanır. Eğer varyasyon katsayısı [%CV = (standart sapma/ortalama)x100] ± %1 ise, RFi ortalama değeri kabul edilebilir. Yukarıdaki hesaplama, doğrusallık kontrol çözeltilerinden (3.5.3) kalite kontrol için seçilmiş numunedeki trans-anetol konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılır. İç kalite kontrol numunesi için seçilmiş doğrusallık çözeltisinin analiz sonuçlarından hesaplanan ortalama; teorik değerlerinin ± %2,5’u ise, bilinmeyen numunelerin sonuçları kabul edilebilir olarak değerlendirilir. 11. GC analizinden önce likör numunelerinin ve yüksek miktarlarda şeker içeren yüksek alkollü içki numunesinin analize hazırlanması Kapiler GC kullanılarak, trans-anetol konsantrasyonunun belirlenebilmesi için, yüksek miktarda şeker içeren alkollü içkilerden alkolün ekstraksiyonu: 11.1. Prensip Bir miktar likör numunesi alınır ve likördeki analitin (trans-anetol) konsantrasyonuna benzer konsantrasyonda iç standart eklenir. Buna, sodyum fosfat dodekahidrat ve susuz amonyum sülfat eklenir. Oluşan karışım iyice çalkalanır ve soğutulur. İki tabaka oluşur, üstteki alkol tabakası uzaklaştırılır. Bu alkol tabakasından bir kısım alınır ve % 45’lik etil alkol çözeltisi (3.4) ile seyreltilir (Bu aşamada iç standart eklenmez çünkü daha önce zaten eklenmiştir.). Elde edilen çözelti GC’de analiz edilir. 11.2. Reaktifler ve materyaller Alkolün ekstraksiyonu sırasında yalnızca %99’dan daha yüksek saflıkta reaktifler kullanılır. 11.2.1. Susuz amonyum sülfat, (CAS 7783-20-2) 11.2.2. Dibazik sodyum fosfat, dodekahidrat (CAS 10039-32-4) 11.3. Araç ve gereçler Erlenler, ayırma hunileri, buzdolabı. 11.4. İşlem 11.4.1. Estragol için numune taraması Numunede doğal olarak estragol bulunmadığından emin olmak için herhangi bir iç standart eklenmeden kör ekstraksiyon ve analiz gerçekleştirilir. Eğer doğal olarak estragol bulunuyorsa o zaman farklı bir iç standart seçilmelidir. 11.4.2. Ekstraksiyon 5 mL hacmen %96’lık etil alkol (3.1) erlene aktarılarak erlen içerisine 50 mg iç standart (3.3) tartılır ve 50 mL numune eklenir. 12 g susuz amonyum sülfat (11.2.1) ve 8,6 g dibazik sodyum fosfat, dodekahidrat (11.2.2) eklenerek erlen kapatılır. Erlen en az 30 dakika çalkalanır. Mekanik karıştırıcı kullanılabilir ancak teflon kaplamalı manyetik karıştırıcı kullanılmaz. Çünkü teflon analitin bir kısmını absorbe edebilir. Eklenen tuzların bütünüyle çözünmesi beklenmez. Kapalı erlen buzdolabında 5 oC’den düşük sıcaklıkta en az 2 saat bekletilmelidir. Bu süre sonunda iki ayrı sıvı faz ve katı çöküntü oluşur. Alkol tabakası berrak olmalıdır. Değilse berrak tabaka oluşuncaya kadar buzdolabında bekletilmelidir. Alkol tabakası berrak olduğunda, sıvı fazını bozmadan dikkatlice bir miktar (örneğin 10 mL) alınır, amber renkli tartı kabına konulur ve sıkı bir şekilde kapatılır. 11.4.3. Ekstrakte edilen numunenin analize hazırlanması Ekstraktın (11.4.2) oda sıcaklığına erişmesi sağlanır. Ekstrakte edilmiş numunenin alkol fazından 2 mL alınarak 20 mL’lik balon jojeye konulur. %45’lik etil alkol ile (3.4) 20 mL’ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. 11.5. Belirleme Madde 7.5’teki işlem takip edilir. 11.6. Sonuçların hesaplanması Sonuçların hesaplanması için şu formül kullanılır: Ci = ( mis/V) x (alani/ alanis) x RFi Burada; mis: İç standardın ağırlığı (mg) (11.4.2’de tartılan ağırlık) V: Bilinmeyen numunenin hacmi (50 mL) RFi: Tepki faktörü (8.1) alani: Trans-anetol pikinin alanı alanis: İç standart pikinin alanı’nı ifade eder. Sonuçlar, g/L şeklinde tek ondalıklı olarak verilir. 11.7. Kalite kontrol ve güvence Madde 10’daki işlem takip edilir. 12. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) Laboratuvarlararası analizin istatistiksel sonuçları: Aşağıdaki tablolar anetol için değerleri verir. Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1998 Laboratuvar sayısı 16 Numune sayısı 10 Analit Anetol Pastis: Numuneler A B C D E F Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 15 15 15 13 16 16 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 1 1 1 3 − − Kabul edilen sonuç sayısı 30 30 30 26 16 16 Ortalama değer, g/L 1,477 1,955 1,940 1,833 1,741 1,754 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) g/L, 0,022 0,033 0,034 0,017 − − Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,5 1,7 1,8 0,9 − − Tekrar edilebilirlik sınırı (r), g/L 0,062 0,093 0,096 0,047 − − Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), g/L 0,034 0,045 0,063 0,037 0,058 0,042 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 2,3 2,3 3,2 2,0 3,3 2,4 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), g/L 0,094 0,125 0,176 0,103 0,163 0,119 Numune türleri A pastis, kör tekrarlar B pastis, kör tekrarlar C pastis, kör tekrarlar D pastis, kör tekrarlar E pastis, tek tekrar F pastis, tek tekrar Diğer anason aromalı distile alkollü içkiler: Numuneler G H I J Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 16 14 14 14 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı − 2 1 1 Kabul edilen sonuç sayısı 32 28 28 28 Ortalama değer, g/L 0,778 0,530(*) 1,742 0,351 0,599 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) g/L, 0,020 0,012 0,013 0,014 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 3,1 0,7 3,8 2,3 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), g/L 0,056 0,033 0,038 0,038 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), g/L 0,031 0,029 0,021 0,030 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 4,8 1,6 5,9 5,0 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), g/L 0,088 0,080 0,058 0,084 Numune türleri G ouzo, split oranı (*) H anis, kör tekrarlar I anason aromalı likör, tekrarlar J anason aromalı likör, tekrarlar Ek-5 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ KULLANILARAK GLİSİRHİZİK ASİTİN BELİRLENMESİ 1. Kapsam Bu metot, anason aromalı distile alkollü içkilerde glisirhizik asitin HPLC kullanılarak belirlenmesi için kullanılır. Distile Alkollü İçkiler Tebliği’nde “pastis” olarak adlandırılan anason aromalı distile alkollü içkilerde glisirhizik asit miktarının 0,05 g/L’den az, 0,5 g/L’den çok olmaması gerektiği belirtilmektedir. 2. Prensip Glisirhizik asit konsantrasyonu, UV detektörlü HPLC kullanılarak belirlenir. Standart çözelti ve test numunesi filtre edildikten sonra HPLC’ye ayrı ayrı doğrudan enjekte edilir. 3. Reaktifler ve materyaller Analiz sırasında sadece HPLC saflığında reaktifler ve TS EN ISO 3696’da tanımlanan sınıf 3 su kullanılır. 3.1. Hacmen %96’lık etil alkol, (CAS 64-17-5) 3.2. Amonyum glisirhizinat, C42H62O16.NH3 (Glisirhizik asit amonyum tuzu) (Molekül ağırlığı: 839,98)(CAS 53956-04-0): en az %90 saflıkta (Molekül ağırlığı: glisirhizik asit 822,94) 3.3. Buzlu asetik asit, CH3COOH, (CAS 64-19-7) 3.4. Metil alkol, CH3OH (CAS 67-56-1) 3.5. Hacmen %50’lik etil alkol, 20 oC’de 1000 mL için: Hacmen %96’lık etil alkol (3.1): 521 mL Su: 511 mL 3.6. HPLC elüsyon çözeltilerinin hazırlanması 3.6.1. Elüsyon çözücü A (örnek) Hacimce 80 birim su, 20 birim asetik asit (3.3). Elüsyon çözücünün 5 dakika süresince gazı alınır. Not: Eğer kullanılan su mikrofiltre edilmemiş ise hazırlanan elüsyon çözücünün filtrasyonunda, gözenek büyüklüğü en fazla 0,45 µm olan, organik çözücüler için kullanılan filtreler tavsiye edilir. 3.6.2. Elüsyon çözücü B Metil alkol (3.4) 3.7. Standart çözeltilerin hazırlanması Tüm standart çözeltiler her 2 ayda bir yeniden hazırlanmalıdır. 3.7.1. Referans çözelti C 100 mL’lik balon jojeye 0,1 mg hassasiyetle 25 mg amonyum glisirhizinat (3.2) tartılır. Bir miktar %50’lik etil alkol (3.5) eklenir ve amonyum glisirhizinat çözündürülür. Çözünmesinin ardından %50’lik etil alkol ile (3.5) hacmi tamamlanır ve organik çözücüler için kullanılan filtre ile filtre edilir. 3.7.2. Cihazın doğrusallık tepkisini kontrol etmek için kullanılan standart çözeltiler 1,0 g/L stok çözelti hazırlamak için 100 mL’lik balon jojeye 0,1 mg hassasiyetle 100 mg amonyum glisirhizinat tartılır. Bir miktar %50’lik etil alkol (3.5) eklenir ve amonyum glisirhizinat çözündürülür. Çözünmesinin ardından %50’lik etil alkol ile (3.5) hacmi tamamlanır. 0,05 - 0,1 - 0,25 ve 0,5 g/L amonyum glisirhizinata karşılık gelen en az dört başka çözelti, 100 mL’lik balon jojelere ayrı ayrı 1,0 g/L stok çözeltiden sırasıyla 5 mL, 10 mL, 25 mL ve 50 mL aktarılarak hazırlanır. Hacimleri %50’lik etil alkol ile (3.5) tamamlanır ve iyice karıştırılır. Tüm çözeltiler organik çözücüler için kullanılan filtre ile filtre edilir. 4. Araç ve gereçler 4.1. Ayırma sistemi 4.1.1. HPLC 4.1.2. Bir kez ayarlandığı akış hızında sabit kalabilen ya da yüksek duyarlılıkta akış hızına programlanabilen pompalama sistemi 4.1.3. 254 nm’ye ayarlı UV spektrofotometrik tespit/saptama sistemi 4.1.4. Çözücüdeki gazı giderici sistem 4.2. Sayısal bilgisayar programı ya da kaydedici, sistemin geri kalanı ile uyumlu bir performansa sahip. 4.3. Kolon (örnek); Paslanmaz çelik ya da cam materyalden yapılmış, iç çapı 4-5 mm, uzunluğu 100-250 mm, sabit fazı partikül boyutu en fazla 5 µm, (tercihen küresel) oktadesil fonksiyonel grup (C18) ile çapraz bağlı silika olan. 4.4. Laboratuvar gereçleri 4.4.1. 0,1 mg hassasiyetinde analitik terazi, 4.4.2. A sınıfı ölçülü cam kap/A sınıfı dereceli ölçü silindiri 4.4.3. Küçük hacimler için mikromembran filtrasyon düzeneği 5. Kromatografi koşulları 5.1. Elüsyon karakteristikleri (örnek) Akış hızı: 1 mL/dk Çözücü A = %30 Çözücü B = %70 5.2. Tespit/Saptama UV = 254 nm 6. İşlem 6.1. Yüksek alkollü içki numunesinin hazırlanması Eğer gerekli ise gözenek büyüklüğü en fazla 0,45 µm olan ve organik çözücüler için kullanılan filtre ile filtre edilir. 6.2. Belirleme Öncelikle kromatografi koşulları sabitlenir. 20 µL referans çözeltisi C (3.7.1) enjekte edilir, 20 µL numune çözeltisi enjekte edilir, İki kromatogram karşılaştırılır. Alıkonma sürelerinden glisirhizik asidin pikleri tanımlanır. Alanları ya da yükseklikleri ölçülür ve aşağıdaki eşitlik kullanılarak iki ondalıklı olarak g/L şeklinde konsantrasyon hesaplanır: c = C 840100 823 ×× ×× × H Ph Burada; c: Analiz edilen numunedeki glisirhizik asidin konsantrasyonu (g/L), C: Referans çözeltideki amonyum glisirhizinatın konsantrasyonu (g/L), h: Analiz edilen numunedeki glisirhizik asit pikinin alanı ya da yüksekliğini, H: Referans çözeltideki glisirhizik asit pikinin alanı ya da yüksekliğini, P: Referans amonyum glisirhizinatın % olarak saflığını, 823: Bir mol glisirhizik asitin kütlesini, 840: Bir mol amonyum glisirhizinatın kütlesini ifade eder. 7. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) Laboratuvarlararası analizin istatistiksel sonuçları: Aşağıdaki tablo glisirhizik asit için değerleri verir. Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1998 Laboratuvar sayısı 16 Numune sayısı 5 Analit Glisirhizik asit Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 13 14 15 16 16 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 3 2 1 − − Kabul edilen sonuç sayısı 26 28 30 32 32 Ortalama değer, g/L 0,046 0,092 (*)0,099 0,089 0,249 0,493 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) g/L, 0,001 0,001 0,001 0,002 0,003 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,5 1,3 0,7 1,0 0,6 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), g/L 0,002 0,004 0,002 0,007 0,009 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), g/L 0,004 0,007 0,004 0,006 0,013 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 8,6 7,2 4,0 2,5 2,7 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), g/L 0,011 0,019 0,010 0,018 0,037 Numune türleri A pastis, kör tekrarlar B pastis, split oranı (*) C pastis, kör tekrarlar D pastis, kör tekrarlar E pastis, kör tekrarlar Ek-6 PASTİSTE KALKONLARIN VARLIĞINI KANITLAMAK İÇİN YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİ METODU 1. Kapsam Bu metot, anason aromalı içkilerde kalkonların bulunup bulunmadığını belirlemek amacıyla kullanılır. Kalkonlar, meyan kökünde (Glycyrrhiza glabra) bulunan flavonoid ailesinin doğal renklendiricileridir. Anason aromalı bir distile içkinin “pastis” olarak adlandırılabilmesi için, kalkonlar içermesi gerekir. 2. Prensip Referans meyan kökü ekstrakt çözeltisi hazırlanır. Kalkonların bulunup bulunmadığı; UV detektörlü HPLC kullanılarak belirlenir. 3. Reaktifler ve materyaller Analiz sırasında, yalnızca HPLC saflığında reaktifler ve TS EN ISO 3696’da tanımlanan sınıf 3 su kullanılır. Etil alkol hacmen %96’lık olmalıdır. 3.1. Hacmen %96’lık etil alkol (CAS 64-17-5) 3.2. Asetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8) 3.3. Referans madde: Meyan kökü (Glycyrrhiza glabra) Kabaca öğütülmüş meyan kökü. Çubuk şeklindeki taneciklerin/parçacıkların ortalama boyutları; 10-15 mm uzunluğunda, 1-3 mm kalınlığında. 3.4. Sodyum asetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3) 3.5. Buzlu asetik asit, CH3COOH, (CAS 64-19-7) 3.6. Çözeltilerin hazırlanması 3.6.1. Hacmen %50’lik etil alkol 20 oC’de 1000 mL için: Hacmen %96’lık etil alkol (3.1): 521 mL Su: 511 mL 3.6.2. Çözücü A: asetonitril HPLC analitik saflığında, gazı alınmış asetonitril (3.2.) 3.6.3. Çözücü B: 0,1 M sodyum asetat tampon çözeltisi, pH 4,66. 8,203 g sodyum asetat (3.4) tartılır, 6,005 g buzlu asetik asit (3.5) eklenir ve balon jojede su ile 1000 mL’ye tamamlanır. 4. Glycyrrhiza glabra’dan (3.3) referans ekstraktın hazırlanması 4.1. 10 g öğütülmüş meyan kökü (Glycyrrhiza glabra) (3.3) tartılır ve tabanı yuvarlak distilasyon balonuna aktarılır. Hacmen %50’lik etil alkolden (3.6.1) 100 mL eklenir. 1 saat süresince geri akışta kaynatılır. Filtre edilir. Sonraki kullanım için filtrat bir tarafa alınır. 4.2. Filtreden meyan kökü ekstraktının geri eldesi Yuvarlak tabanlı distilasyon balonuna yerleştirilir. Hacmen %50’lik etil alkolden (3.6.1) 100 mL eklenir. 1 saat süresince geri akışta kaynatılır. Filtre edilir, sonraki kullanım için filtrat bir tarafa alınır. 4.3. Meyan kökü ekstraksiyonu ardışık olarak 3 kez yapılır. 4.4. Üç filtrat birleştirilir. 4.5. Çözücü faz, döner buharlaştırıcıda uçurulur. 4.6. Çöküntü ekstrakt, 100 mL hacmen %50’lik etil alkol (3.6.1) ile alınır. 5. Araç ve gereçler 5.1. Ayırma sistemi 5.1.1. HPLC 5.1.2. Bir kez ayarlandığı akış hızında sabit kalabilen ya da yüksek duyarlılıkta akış hızına programlanabilen pompalama sistemi 5.1.3. UV/görünür spektrofotometrik tespit/saptama sistemi, 254 nm ve 370 nm’ye ayarlanabilen 5.1.4. Çözücüdeki gazı giderici sistem 5.1.5. 40 ± 0,1 oC sıcaklığa ayarlanabilen kolon fırını. 5.2. Sayısal bilgisayar programı ya da kaydedici, sistemin geri kalanı ile uyumlu bir performansa sahip. 5.3. Kolon Paslanmaz çelik ya da cam materyalden yapılmış, iç çapı 4-5 mm, sabit fazı partikül boyutu en fazla 5 µm, oktadesil fonksiyonel grup (C18) ile çapraz bağlı silika olan. 5.4. Genel laboratuvar gereçleri 5.4.1. ± 0,1 mg hassasiyetinde analitik terazi 5.4.2. Geri soğutuculu distilasyon düzeneği, örneğin aşağıdakileri içeren; Küresel şilifli 250 mL’lik yuvarlak tabanlı balon 30 cm uzunluğunda geri soğutucu ve Termostatlı ısı kaynağı (Uygun bir düzenek ile alkollü içki içerisindeki ekstrakte edilebilen maddenin herhangi bir pirojenik reaksiyonu önlenmelidir.) 5.4.3. Döner buharlaştırıcı (Rotary evaporatör) 5.4.4. Filtrasyon düzeneği (Buchner hunisi gibi) 5.5. Kromatografi koşulları (örnek) 5.5.1. Çözelti A (3.6.2) ve Çözelti B (3.6.3)’nin elüsyon karakteristikleri: 15 dakika içerisinde 20/80 (hacim/hacim)’den 50/50 (hacim/hacim) değerine ulaştıran 5 dakika içerisinde 50/50 (hacim/hacim)’den 75/25 (hacim/hacim) değerine ulaştıran 5 dakika için 75/25 (hacim/hacim)’de sabit Enjeksiyonlar arasında stabil kalabilen kolon 5 dakika için 20/80 (hacim/hacim)’de sabit 5.5.2. Akış hızı: 1 mL/dk 5.5.3. UV detektör ayarları: Detektör, kalkonların varlığının tespiti için 370 nm’ye ve daha sonra glisirhizik asidin tespiti için 254 nm’ye ayarlanmalıdır. Not: Dalga boyunun değişimi (370 nm’den 254 nm’ye), glisirhizik asidin elüsyon pikinin başlangıcından 30 saniye önce gerçekleştirilmelidir. 6. İşlem 6.1. Yüksek alkollü içki numunesinin hazırlanması Gözenek büyüklüğü en fazla 0,45 µm olan ve organik çözücüler için kullanılan filtre ile filtre edilir. 6.2. Çöküntü meyan kökü ekstraktının (4.6) hazırlanması Analiz öncesinde hacmen %50’lik etil alkol (3.6.1) ile 1:10 oranında seyreltilir. 6.3. Belirleme 6.3.1. Hazırlanan meyan kökü ekstraktından (6.2) 20 µL enjekte edilir. Madde 5.5’te tanımlanan kromatografi koşullarında analiz gerçekleştirilir. 6.3.2. 20 µL numune (6.1) (anason aromalı yüksek alkollü içki) enjekte edilir. Madde 5.5.’te tanımlanan kromatografi koşullarında analiz gerçekleştirilir. 6.3.3. İki kromatogram karşılaştırılır. Kalkonun çıkış bölgesinde iki kromatogram arasında büyük benzerlik olmalıdır (Bu benzerlik yukarıda tanımlanan analiz koşullarında 370 nm’de tespit sırasında görülebilir.) (Şekil 1’e bakınız). 7. Bir pastis için karakteristik kromatogram Şekil 1. ‘Pastis’ içerisinde bulunan kalkonların varlığını gösteren ve yukarıda tarif edilen metotla elde edilen kromatogram. Pik 1-8 kalkonlar ve pik 9 gilisirhizik asittir. 8. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) Laboratuvarlararası analizin istatistiksel sonuçları: Aşağıdaki tablo, pastis ve anason aromalı yüksek alkollü içkilerde kalkonların bulunup bulunmadığını belirlemek için performansı verir. Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1998 Laboratuvar sayısı 14 Numune sayısı 11 Analit Kalkonlar Numuneler A B C D E F Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 14 14 14 14 14 13 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı − − − − − 1(*) Kabul edilen sonuç sayısı 28 14 14 28 28 26 Kalkonların varlığını gösteren sonuçların sayısı 28 14 14 0 28 0 Kalkonların yokluğunu gösteren sonuçların sayısı 0 0 0 28 0 26 Doğru sonuçların yüzdesi (%) 100 100 100 100 100 100 (*) İki tekrar arasındaki tutarsız sonuçlar, numune alma hatası ile ilgili Numuneler G H I J K Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 14 14 14 14 14 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı − − − − − Kabul edilen sonuç sayısı 28 14 14 28 28 Kalkonların varlığını gösteren sonuçların sayısı 0 0 0 0 0 Kalkonların yokluğunu gösteren sonuçların sayısı 28 14 14 28 28 Doğru sonuçların yüzdesi (%) 100 100 100 100 100 Numune türleri A pastis, kör tekrarlar B pastis, tek numune C pastis, tek numune D ‘pastis’ (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar E ‘pastis’ (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar F anason aromalı likör (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar G anason aromalı likör (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar H ouzo (kalkonları içermeyen), tek numune I ouzo (kalkonları içermeyen), tek numune J anis (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar K ‘pastis’ (kalkonları içermeyen), kör tekrarlar Ek-7 DİSTİLE ALKOLLÜ İÇKİLERDE YUMURTA SARISI KONSANTRASYONUNUN BELİRLENMESİ - FOTOMETRİK METOT 1. Kapsam Bu metot, yumurta likörü ve yumurtalı likörde 40-250 g/L arasındaki yumurta sarısı konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılır. 2. Prensip Yumurta sarısında bulunan, etil alkolde çözünebilen fosfor bileşikleri ekstrakte edilir ve fosfor molibdat bileşiği olarak fotometrik metot ile analiz edilir. 3. Reaktifler ve materyaller Analizlerde kullanılacak su, TS EN ISO 3696’da tanımlanmıştır. 3.1. İki kere distile edilmiş su 3.2. Diyatome toprağı 3.3. Hacimce %96’lık etil alkol (CAS 64-17-5) 3.4. %15’lik magnezyum asetat çözeltisi (CAS 16674-78-5) 3.5. %10’luk sülfürik asit (CAS 7664-93-9) 3.6. 1 N sülfürik asit 3.7. 0,16 g/L potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi (CAS 778-77-0), KH2PO4 3.8. Fosfat belirleme reaktifi: 20 g amonyum molibdat (CAS 12054-85-2) [(NH4)6Mo7O24.4H2O], 50 oC’de 400 mL su içerisinde çözündürülür. Başka bir kapta, 1 g amonyum vanadat (CAS 7803-55-6) (NH4VO3), 300 mL sıcak su içerisinde çözündürülür, soğutulur ve sonra 140 mL derişik nitrik asit (CAS 7697-37-2) eklenir. Soğumuş olan çözeltiler 1000 mL’lik balon jojede birleştirilir ve hacim 1000 mL’ye tamamlanır. 4. Araç ve gereçler 4.1. Erlen, 100 mL’lik 4.2. Ultrasonik banyo ya da magnetik karıştırıcı 4.3. Balon joje, 100 mL’lik 4.4. Su banyosu, 20 oC’ye ayarlanabilir 4.5. Filtre (Whatman No 4 ya da eşdeğer) 4.6. Porselen (ya da platin) kroze 4.7. Kaynar su banyosu 4.8. Isı plakası 4.9. Kül fırını 4.10. 50 mL’lik balon joje 4.11. 20 mL’lik balon joje 4.12. 420 nm’de ölçüm yapabilen spektrofotometre 4.13. 1 cm’lik küvet 5. Numune Numuneler, analiz öncesi oda sıcaklığında saklanır. 6. İşlem 6.1. Numune hazırlama 6.1.1. 100 mL’lik erlen (4.1) içerisinde 10 g numune tartılır. 6.1.2. 70 mL etil alkol (3.3) küçük miktarlarda yavaş yavaş eklenir, her bir eklemede döndürülerek karıştırılır ve 15 dakika süresince ultrasonik banyoya (4.2) yerleştirilir (ya da oda sıcaklığında 10 dakika süresince magnetik karıştırıcı ile karıştırılır). 6.1.3. Erlenin içeriği etil alkol (3.3) ile yıkanarak 100 mL’lik balon jojeye (4.3) aktarılır. Etil alkol ile hacmi tamamlanır ve 20 oC’deki su banyosuna (4.4) yerleştirilir. 20oC’de hacmi tamamlanır. 6.1.4. Az miktarda diyatome toprağı (3.2) eklenir ve ilk 20 mL atılmak suretiyle filtre (4.5) edilir. 6.1.5. Süzüntünün 25 mL’si porselen (ya da platin) krozeye (4.6) aktarılır. Daha sonra filtrat, %15’lik magnezyum asetat çözeltisinden (3.4) 5 mL eklenerek kaynar su banyosunda (4.7) yavaş yavaş evapore edilerek konsantre edilmelidir. 6.1.6. Krozeler ısı plakası (4.8) üzerine yerleştirilir ve kuruyana kadar ısıtılır. 6.1.7. Isıtma sonucu kalan kısım, beyaz renkte kül elde edilene kadar akkor hale gelmiş kül fırınında (4.9) 600 oC’de bekletilir (En az 1,5 saat ancak bir gece boyunca bırakılabilir). 6.1.8. Kül, 10 mL %10’luk sülfürik asit (3.5) ile alınır ve distile su (3.1) ile yıkanarak 50 mL’lik balon jojeye (4.10) aktarılır ve distile su ile oda sıcaklığında hacmi tamamlanır. Bu kül çözeltisinin 5 mL’si, fotometrik fosfat analizi için numune çözeltisi hazırlamada kullanılır. 6.2. Fotometrik fosfat analizi 6.2.1. Karşılaştırma çözeltisi 6.2.1.1. %10’luk sülfürik asit (3.5) çözeltisinden 10 mL alınarak, 50 mL’lik balon jojeye (4.10) aktarılır ve distile su (3.1) ile hacmi tamamlanır. 6.2.1.2. Bu çözeltiden 5 mL alınarak 20 mL’lik balon jojeye (4.11) aktarılır, 1 mL 1 N sülfürik asit (3.6) ve 2 mL fosfat reaktifi (3.8) eklenir ve distile su (3.1) ile 20 mL’ye tamamlanır. 6.2.1.3. Kapağı gevşek bir biçimde kapatılır, çalkalanır ve kaynar su banyosunda (4.7) 10 dakika süresince ısıtılır. Daha sonra 20 oC’deki su banyosunda (4.4) 20 dakika soğutulur. 6.2.1.4. 1 cm’lik küvet (4.13), bu karşılaştırma çözeltisi ile doldurulur. 6.2.2. Numune çözeltisi 6.2.2.1. Kül çözeltisinden (6.1.8) 5 mL alınır ve 20 mL’lik balon jojeye (4.11) aktarılır. 1 mL 1 N sülfürik asit (3.6) ve 2 mL fosfat reaktifi (3.8) eklenir ve distile su (3.1) ile 20 mL’ye tamamlanır. 6.2.2.2. Kapağı kapatılır, çalkalanır ve kaynar su banyosunda (4.7) 10 dakika süresince ısıtılır. Daha sonra 20 oC’deki su banyosunda (4.4) 20 dakika soğutulur. 6.2.2.3. Oluşan sarı çözeltinin, karşılaştırma çözeltisine karşılık 420 nm’de 1 cm’lik küvette hemen spektrofotometrik (4.12) okuması yapılır. 6.2.3. Kalibrasyon eğrisi 6.2.3.1. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, fosfat reaktifinden (3.8) 2 mL’lik hacimler alınarak 20 mL’lik balon jojelere (4.11) aktarılır. Her birine 1 mL 1 N sülfürik asit (3.6) ve sırasıyla 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 mL potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi (3.7) eklenir ve distile su (3.1) ile hacimleri 20 mL’ye tamamlanır. 6.2.3.2. Kapağı gevşek bir biçimde kapatılır, çalkalanır ve kaynar su banyosunda (4.7) 10 dakika süresince ısıtılır. Daha sonra 20 oC’deki su banyosunda (4.4) 20 dakika soğutulur. Karşılaştırma çözeltisine karşılık 420 nm’de 1 cm’lik küvette hemen spektrofotometrik (4.12) okuması yapılır. 6.2.3.3. Kalibrasyon eğrisinin oluşturulması: Dihidrojen fosfat çözeltisi (mL) 0 2 4 6 8 10 P2O5 (mg) 0 0,167 0,334 0,501 0,668 0,835 7. Sonuçların ifade edilmesi Yumurta sarısı içeriği, g/L olarak aşağıdaki formül ile hesaplanır: g/L yumurta sarısı = mg P2O5 x [(110 x yoğunluk)/(E/40)] Burada; 110: Yumurta sarısının 100 g’ında “g” olarak toplam P2O5 için çevrim faktörünü, mg P2O5: Kalibrasyon eğrisinden belirlenen değeri, Yoğunluk: 20 oC’de yumurta bazlı likörün birim hacim başına kütlesini (g/mL), E: Yumurta bazlı likörün “g” olarak ağırlığını, 40: Kül çözeltisinin 5 mL’lik kısmı için seyreltme faktörünü ifade eder. 8. Metot performans karakteristikleri (kesinlik) Laboratuvarlararası analizin istatistiksel sonuçları: Aşağıdaki tablolar yumurta sarısı için değerleri verir. Aşağıdaki veriler, uluslararası kabul görmüş prosedürler için yürütülen uluslararası metot performans çalışmasından elde edilmiştir. Laboratuvarlararası analiz yılı 1998 Laboratuvar sayısı 24 Numune sayısı 5 Analit Yumurta sarısı Numuneler A B C D E Aykırı değer gösteren laboratuvarların çıkarılmasından sonra kalan laboratuvar sayısı 19 20 22 20 22 Aykırı değer gösteren laboratuvar sayısı 3 4 2 4 2 Kabul edilen sonuç sayısı 38 40 44 40 44 Ortalama değer ( x ), µg/g 147,3 241,1 227,4 51,9 (*) 72,8 (*) 191,1 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (Sr) g/L, 2,44 4,24 3,93 1,83 3,25 Tekrar edilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) (%) 1,7 1,8 1,8 2,9 1,7 Tekrar edilebilirlik sınırı (r), g/L 6,8 11,9 11,0 5,1 9,1 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan standart sapma (SR), g/L 5,01 6,06 6,66 3,42 6,87 Yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) (%) 3,4 2,5 2,9 5,5 3,6 Yeniden üretilebilirlik sınırı (R), g/L 14,0 17,0 18,7 9,6 19,2 Numune türleri A Advokat; kör tekrarlar B Advokat; kör tekrarlar C Advokat; kör tekrarlar D Advokat (seyreltilmiş); split oranı (*) E Advokat; kör tekrarlar