State sanitary and epidemiological regulation Methods for the rapid determination of bacteria of the genus Campylobacter in food products and assessment of their antibiotic resistance Guidelines MU 4.2.3545-18

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности Методические указания МУ 4.2.3545—18 Издание официальное Москва *2019 коклюшечное кружево https://meganorm.ru/Index2/1/4293777/4293777893.htm Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности Методические указания МУ 4.2.3545—18 ББК 51.23 М54 М54 Методы ускоренного определения бактерий рода Campy­ lobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорези стентности: М етодические указания.— М.: Федеральная служ­ ба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благопо­ лучия человека, 2019.— 32 с. ISBN 978-5-7508-1699-6 1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (С. А. Шевелева, Н. Р. Ефимочкина, Л. П. Минаева, В. В. Стеценко, И. Б. Быкова, Т. В, Пичугина, Ю. М. Маркова, Ю. В. Ко роткевич, А. С. Полянина, А. И. Алешкина). 2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным го­ сударственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Попо­ вой 25 декабря 2018 г, 3. Введены впервые. ББК 51.23 Компьютерная верстка Е. В. Ломановой Подписано в печать 9.09.19 Формат 60x84/16 Печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковекий пер,, д. 18, стр. 5, 7 Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел./факс: 8 (495) 952-50-89 О Роспотребнадзор, 2019 МУ 4.2.3545— 18 Содержание I. Общие положения и область применения..............................................................4 II. Основные методы..................................................................................................... 5 III. Средства измерения, оборудование и реактивы.................................................. 7 IV. Подготовка к проведению испытаний................................................................13 V. Создание микроаэрофильных условий культивирования................................. 17 VI. Отбор и подготовка проб для анализа................................................................18 VII. Проведение анализа............................................................................................21 VIII. Учет результатов................................................................................................ 25 DC. Оценка чувствительности выделенных штаммов кампилобактерий к антимикробным препаратам.............................................................................25 X. Требования безопасности и квалификации операторов....................................28 XL Условия выполнения измерений........................................................................ 29 Нормативные и методические документы............................................................... 31 3 МУ 4.2.3545— 18 УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 25 декабря 2018 г. 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Методы ускоренного определения бактерий рода Cam pylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности Методические указания МУ 4.2.3545—18 I. Общие положения и область применения 1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее МУК) устанавливают ускоренные методы определения термофильных бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и смывах с объектов окружающей среды, а также порядок проведения микробиологического контроля на наличие бактерий рода Campylobacter на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности. МУК носят рекомендательный характер. 1.2. В группу термофильных бактерий рода Campylobacter с опти­ мальной температурой роста +42 °С входят возбудители кампилобакте риоза С. jejuni ssp. jejuni, С. jejuni ssp. doylei, C. coli, C. lari, C. upsaliensis и C. helveticus, обладающие способностью инфицировать человека и теплокровных животных. Наибольшую эпидемиологическую значи­ мость представляют С. jejuni, которые обусловливают основную часть случаев кампилобактериоза. 1.3. МУК устанавливают методы оценки чувствительности к анти­ микробным препаратам термофильных бактерий рода Campylobacter, выделенных из пищевой продукции и смывов с объектов окружающей среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности, для це 4 МУ 4.2.3545— 18 лей мониторинга антибиотикорезистентных возбудителей кампилобак териоза и разработки мер ограничения их циркуляции. 1.4. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль безопасности пищевой продукции, в том числе импортируемой в Российскую Федерацию, для проведения производственного контроля на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, для лабораторной диагностики зараженности кампи лобактериями пищевой продукции при расследовании вспышек заболе­ ваний с пищевым путем передачи, а также могут использоваться други­ ми лабораторными центрами (лабораториями), осуществляющими про­ изводственный контроль основного и вспомогательного сырья, произ­ водственных процессов, контроль безопасности пищевой продукции в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно эпидемиологического благополучия населения1. 1.5. МУК распространяются на пищевую продукцию и смывы с объектов окружающей среды на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, подлежащие исследованиям на наличие термофиль­ ных бактерий рода Campylobacter, для оценки санитарно-гигиеническо­ го состояния производства и эффективности проводимых санитарно­ противоэпидемических (профилактических) мероприятий, а также в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля) - для целей мониторинга заболеваемости населения кампило бактериоз ом с пищевым путем передачи. 1.6. МУК применяются для исследования продуктов убоя птицы, продукции ее переработки, полуфабрикатов из птицы; смывов с обору­ дования и инвентаря, контактных поверхностей в производственных, складских, моечных помещениях, с рук и санитарной одежды персонала, с тары и упаковки для пищевой продукции. II. Основные методы 2.1. МУК устанавливают ускоренные методы определения термо­ фильных бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и смывах на основе: 1 Статья 40 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологичес­ ком благополучии населения»; постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицирован­ ных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах». 5 МУ 4.2.3545— 18 ~ бактериологического анализа (качественного и количественного, с идентификацией до рода); фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа (качествен­ ного недифференцированного суммарного определения бактерий видов С. jejuni, С. coli, С. lari); ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Применение указанных МУК позволяет сократить время анализа в сравнении со стандартными методами на 3—4 суток. 2.2. Бактериологический (культуральный) метод определения бак­ терий рода Campylobacter в пищевой продукции предусматривает посев определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содер­ жащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пере­ севом на поверхность агаризованных селективных сред, инкубирование посевов, выявление в этих посевах бактерий, способных расти и образо­ вывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с после­ дующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности культуральных, морфологических и биохимических признаков, определяющих принадлежность к бактери­ ям рода Campylobacter. 2.3. Бактериологический (культуральный) метод определения бак­ терий рода Campylobacter в смывах с объектов окружающей среды пре­ дусматривает комплексный анализ трех проб в исследуемой зоне (3 х 100 см2) с применением трех видов сред для накопления и транс­ портирования, с последующими пересевами на поверхность агаровых дифференциально-диагностических сред. 2.4. Метод фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорби­ рованными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компо­ нентов, добавлении антител, меченых щелочной фосфатазой, к адсорби­ рованному комплексу антиген-антитело и флуоресцентно-меченого суб­ страта, и измерении флуоресценции продукта гидролиза флуоресцентно­ меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализи­ руется щелочной фосфатазой. Интенсивность флуоресценции измеряет­ ся при длине волны 450 нм. 2.5. Метод детекции термофильных бактерий рода Campylobacter на основе ПЦР предусматривает высев определенных количеств иссле­ дуемых проб пищевых продуктов или смывов в селективные питатель 6 МУ 4.2.3545— 18 ные среды, инкубирование посевов, экстракцию ДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК со специфичными праймерами и постановку ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ампли конов в режиме реального времени. 2.6. Оценку антибиотикочувствительности штаммов термофильных кампи л о бактерий, выделенных из пищевой продукции или объектов окружающей среды, проводят диско-диффузионным методом, с исполь­ зованием дисков с антибиотиками и измерением зон ингибирования роста исследуемой культуры. При необходимости определяют мини­ мальную концентрацию антибиотика, подавляющую рост штамма (МИК, минимальная ингибирующая концентрация) методом серийных разведений в планшете или с применением Е-тестов, представляющих собой модифицированный вариант диффузионного метода тестирования с применением полосок, пропитанных убывающими концентрациями антибиотиков. III. Средства измерения, оборудование и реактивы 3.1. Оборудование и средства измерений Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения pH от 3,0 до 8,0 с точностью ± 0,01 ед. pH при температуре +25 °С ГОСТ 27987 Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) или ламинарный шкаф класса биологической безопасности II тип А Весы лабораторные общего назначения, 2 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 1 000 г ГОСТ Р 53228 Встряхиватель вибрационный типа «Вортекс» со скоростью вращения до 3 000 об./мин Денситометр для бактериальных суспензий, калиброванный по стандартам мутности МакФарланда Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды, соответствующей ГОСТ 6709 Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом дозирования от 0,1 мм3 до 1 000 мм3 с точностью ± 0,8 % 1 МУ 4.2.3545— 18 Гомогенизатор бактериологический перисталь­ тического типа Инкубаторы-анаэростаты, С 02-инкубаторы или другие устройства, создающие анаэробные/мик роаэрофильные условия культивирования Микроскоп биологический бинокулярный с увеличением 900х— ЮООх с иммерсионной системой Микроцентрифуга настольная типа эппендорф (частота вращения не менее 13 000 мин-1) Камера морозильная, обеспечивающая температуру не выше минус 20 °С Камера морозильная, обеспечивающая температуру не выше минус 70 °С, для хранения выделенных культур кампилобактерий Насос вакуумный (водоструйный) Облучатель бактерицидный настенный с мощностью бактерицидных ламп 30 Вт и производительностью (95 % обеззараживания) не менее 300 м3/ч. Автоматический ИФА анализатор для фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа Амплификатор программируемый для проведения качественного и количественного анализа ДНК методом полимеразной реакции в режиме «реального времени» и «по конечной точке», с использованием различных комбинаций реагентов - флуорофоров и с возможностью регистрации флуоресцентного сигнала не менее чем по четырем каналам Системы экстракции ДНК/РНК роботизированные Стерилизатор паровой медицинский (автоклав) Термостат твердотельный для пробирок типа эппендорф вместимостью 1,5 см3, диапазон тем­ ператур от 25 до 100 °С Термостат электрический суховоздушный с диапазоном рабочих температур от 20 до 60 °С и отклонением от заданной температуры не более ± 1 °С ГОСТ 28489 ГОСТ РЕН 13060 ГОСТ 31598 8 МУ 4.2.3545—18 Холодильник с температурой от 2 до 8 °С.с морозильной камерой не выше минус 16 °С для хранения выделенных проб ДНК Часы механические сигнальные Шкаф сушильно-стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру в диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью ±2 °С ГОСТ 16317 ГОСТ 14919 3.2. Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная Вата медицинская гигроскопическая Зонд-тампоны для отбора, транспортировки и хранения биологических проб в комплекте с пробиркой стерильные Колбы стеклянные плоскодонные конические или круглые различной вместимости Контейнеры стерильные из полимерных материалов с крышками для отбора проб Марля медицинская Микропробирки для ПЦР стерильные тонкостенные 0,2 см3 (плоская крышка, коническое дно) - для ам'плифнкаторов с детекцией через дно пробирки; 0,2 см3 (куполообразная крышка) - для амплификаторов с детекцией через крышку Наконечники одноразовые с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования от 0,1 мм3 до 1 000 мм3 Ножницы медицинские ГОСТ 21239 Оптические стандарты МакФарланда N° 1,2, 3 Пакеты полимерные для стерилизации лабораторных принадлежностей и обеззараживания отходов Пакеты бумажные для стерилизации лабораторных принадлежностей Пакеты газогенераторные для кампилобактерий Пакеты полимерные ГОСТ 12302 Петли бактериологические калиброванные на 1 мм3 Пергамент ГОСТ 1341 ГОСТ 12026 ГОСТ 5556 ГОСТ 1770 ГОСТ 9412 9 МУ 4.2.3545— 18 Пипетки градуированные вместимостью 1,2, 5 и 10 см3 ки типа эппендорф вместимостью и 1,5 см3 Пробки силиконовые, целлюлозные, ватно-марлевые для стеклянных колб, флаконов, пробирок Планшеты иммунологические 96-луночные стерильные Пробирки центрифужные конические стерильные вместимостью 15 см3 и 50 см3 Пробирки стеклянные типов П1, П2 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) Термоконтейнер (сумка-холодильник) Флаконы и колбы стеклянные вместимостью 250 см3, 500 см3, 1000 см3, 2000 см3 Халаты, шапочки, маски, бахилы одноразовые, перчатки резиновые или латексные неопудрнные Чашки биологические (Петри) стеклянные или одноразовые из полимерных материалов диаметром 90 мм или 100 мм Пробир 0.5 см^; ГОСТ 29227 ГОСТ 25336 ГОСТ 13646 ГОСТ 25336 ГОСТ 23932 3.3. Реактивы, питательные среды, дезинфицирующие средства 3.3.1. Реагенты для ПЦР и иммуноанализа Иммунохроматографические тесты для выявления Campylobacter spp. Комплекты реагентов (наборы) для выделения ДНК/РНК из пище­ вой продукции Комплекты реагентов для роботизированных систем экстракции ДНК/РНК (силика магнитная, буфер лизирующий, буферы для экстракции) Комплекты реагентов (наборы) для проведения ПЦР с гибридиза ционно-флуоресцентной детекцией, обеспечивающие аналитическую чувствительность на уровне 1 х 103 ГЭ/см3 в отношении выявляемых фрагментов ДНК бактерий Campylobacter spp., содержащие: смеси о ли­ гонуклеотидных праймеров на участки ДНК бактерий и флуоресцентно­ меченых олигонуклеотидных зондов, комплементарных участкам ам плифицируемых ДНК-мишеней; полимеразу (TaqF), смесь буфера и нук леозидтрифосфатов, ДНК-буфер, положительные контрольные образцы этапа ПЦР со специфическими фрагментами ДНК искомых микроорга­ низмов и внутренним контрольным образцом, отрицательный контроль 10 МУ 4.2.3545—18 ный образец и внутренний неконкурентный контрольный образец этапа выделения, минеральное масло для ПЦР Наборы реагентов для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа по мето­ дическим указаниям2. 3.3,2. Реактивы, питательные среды для селективного обогащения микроорганизмов и их компоненты Агар микробиологический Агар Мюллера-Хинтона Амфотерицин Ацетон Добавка ростовая аэротолерантная на основе натрия пировинограднокислого, железа (II) сернокислого, натрия метабисульфита для кампилобактерий в соответствии с методическими указаниями Бульон Престона для накопления кампилобактерий Бульон для бруцелл Вода дистиллированная Гидролизат казеина ферментативный Диски с антибиотиками: эритромицином, гентамицином, ципрофлоксацином, налидиксовой кислотой, амикацином, тетрациклином, доксициклином, клиндамицином, хлорамфениколом (при необходимости могут быть использованы диски с другими антибиотиками) Добавки селективные антибиотиков для кампилобактерий, модифицированные Железо (И) сернокислое Калий фосфорнокислый однозамещенный Кампилобакагар Кислота соляная ГОСТ 17206 ГОСТ 2768 МУК 4.2.2321—08 МУК 4.2.2321—08 ГОСТ 6709 ГОСТ ISO 10272-1—2013 ГОСТ 4148—78 ГОСТ 4198—75 ТУ 9398-057-7895326—2007 ГОСТ 3118—77 2 МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продук­ тах», утвержденные Роспотребнадзором 24.01.2008, с изменениями МУК 4.2.2878— 11 «Дополнения и изменения № 1 к МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах», утвержденным Роспотребнадзором 24.06.2011 (да­ лее-М УК 4.2.2321—08). 11 МУ 4.2.3545— 18 Колумбийский кровяной агар (основа) Кристалвиолет Кровь дефибринированная для питательных сред, стерильная Мультимикротесты для биохимической иденти­ фикации Campylobacter spp. Набор реагентов для окраски по Граму Натрий хлористый ГОСТ Натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный Натрия гидросульфит Натрия гидроокись ГОСТ Натрий метабисульфит ГОСТ Пептон мясной ферментативный ГОСТ Пептон соевый Полимиксин В сульфат Рифампицин Сафранин Стандарт мутности МакФарланда 0,5 ед. Тест-системы для определения минимальных ингибирующих концентраций антибиотика3 (например, Е-тесты, MIC Tests, Sensititre Сашруи) Транспортная среда Кэрри - Блера Трафарет для отбора смывов площадью 100 см2 Трехсахарный железосодержащий агар (на основе сред № 13, Клиглера, Олькеницкого) Экстракт дрожжевой сухой L-цистеина гидрохлорид Приготовление и контроль качества питательных сред осуществ­ ляют в соответствии с ГОСТ ISO 11133—2016. 3.3.3. Тест-штаммы Контрольные тест-штаммы бактерий Campylobacter jejuni, С со И, С. lari, типичные по культуральным, морфологическим и биохимичес­ ким свойствам 4233 4328—77 11683—76 13805—76 3 Примечание: Допускается использование тсст-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. 12 МУ 4.2.3545— 18 Тест-штаммы должны быть снабжены «Паспортом штамма», вы­ данным национальной или между нар одной коллекцией микроорганиз­ мов, видовая принадлежность контрольных штаммов должна быть под­ тверждена с использованием биохимических итенотипических методов. Тест-штаммы необходимо сохранять в лиофильно высушенном ви­ де. При регулярном использовании допускается сохранять в полужид­ ком агаре для бруцелл или в полужидкой среде по п. 4.3.12, в пробирках с плотно притертыми пробками, в защищенном от света месте, при тем­ пературе (5 ± 1) °С с еженедельным пересевом, или замораживать при температуре (-70 ± 2) °С, хранение в течение 2—3 мес. 33 А. Дезинфицирующие средства Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962—2013 Средства дезинфицирующие на основе трихлоризоциануровой ки­ слоты, натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты. Допускается использование других средств измерений с метрологичес­ кими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими ха­ рактеристиками не хуже указанных в настоящем стандарте. Допускается ис­ пользование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных. IV. Подготовка к проведению испытаний 4.1, Приготовление растворов и реактивов 4.1.1. Изотонический 0,85 % водный раствор натрия хлорида гото­ вят в соответствии с ГОСТ 10444.1—84. 4.1.2. Растворы и реактивы для окраски микроскопических препа­ ратов по Граму, растворы гидроокиси натрия и соляной кислоты готовят в соответствии с инструкциями изготовителя или по ГОСТ 10444.1—84. 4.1.3. Фосфатно-буферный раствор (далее - ФБР). Приготовление концентрированного раствора: (34 dt 0,4) г одноза мещенного фосфорнокислого калия (КН2Р 04) растворяют в 500,0— 700,0 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см3 по ГОСТ 1770—74. Активную кислотность раствора (7,2 ±0,1) ед. pH устанавливают добавлением 1 Н раствора гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1 000,0 см3. Полученный раствор хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника не более 30 сут. Приготовление разбавленного раствора: 1,25 см3 концентрирован­ ного раствора вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 1 000 см3 по ГОСТ 1770—74 и доводят объем дистиллированной водой до мет­ ки, проверяют активную кислотность, которая должна составлять (7,1 ± 0,1) ед. pH. 13 МУ 4.2.3545— 18 ФБР разливают по 9,0 см3 в пробирки, по 90,0 см3 в колбы вмести­ мостью 250 см3 по ГОСТ 1770, и по 900,0 см3 в колбы вместимостью 2 000 см3 по ГОСТ 1770, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121± 1)°С в течение (20 ±1) мин. 4.1.4. При добавлении к 1 дм3 ФБР натрия хлорида в количестве 9 г до стерилизации получают фосфатный буферный 0,9 % раствор NaCl. 4.1.5. Аэротолерантная (ростовая) добавка. Аэротолерантную добавку готовят по следующему порядку: натрий пировинограднокислый - 6,25 г; железо (И) сернокислое — 6,25 г; натрий метабисульфит - 6,25 г; стерильная дистиллированная вода - 100 см3. Натрий пировинограднокислый растворяют в 10—20 см3 стериль­ ной дистиллированной воды, добавляют железо (II) сернокислое и на­ трия метабисульфит, доводят объем раствора до 100 см3. Разливают в пробирки по 4 см3. Хранят в защищенном от света месте при температу­ ре минус 20 °С не более 1 мес. Раствор чрезвычайно чувствителен к воз­ действию света, после его добавления к питательным средам их необхо­ димо сохранять в защищенном от света месте. 4.2. Подготовка посуды и материалов Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160 ± 5) °С в течение 2 ч или в паровом стерилизаторе (автоклаве) при (121 ± 1)°С в течение (30 ± 1)мин с последующим подсушиванием в стерилизационном сушильном шкафу. Чашки Петри и пипетки стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предвари­ тельно вкладывают кусочек ваты. Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпа­ чок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют ре­ зиновым колечком. Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в авто­ клаве упакованными в бумагу. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 суток при ненарушенной упаковке или в невскрытых пеналах. Перед применением одноразовых наконечников с фильтром для до­ заторов и чашек Петри одноразовых необходимо проверить герметич­ ность их упаковки. 14 МУ 4.2.3545— 18 4.3. Приготовление питательных сред 4.3.1. Приготовление и контроль качества питательных сред осуще­ ствляют в соответствии с ГОСТ ISO 11133—2016 согласно инструкции изготовителя. Допускается применение сред лабораторного приготовле­ ния из отдельных компонентов. 4.3.2. Селективный бульон Престона готовят в соответствии с по­ рядком, изложенным в МУК 4.2.2321—08. 4.3.3. Жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий. Жидкую селективную среду для накопления кампилобактерий го­ товят в соответствии со следующим порядком: Основа среды (г/дм3): Пептон мясной ферментативный 12,0 Гидролизат казеина 10,0 Дрожжевой экстракт 2,0 Натрия хлорид 5,0 Натрий пировинограднокислый 0,25 Натрия метабисульфит 0,25 Железо сернокислое (II) 0,25 L-цистеина гидрохлорид 0,1 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 8,75 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,4 Компоненты среды растворяют в 1 000 см3 дистиллированной во­ ды, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, уста­ навливают pH (7,0 ±0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121 °С. Стериль­ ную основу среды охлаждают до температуры 45—50 °С и асептически вносят в нее кровь стерильную дефибринированную в количестве 50 см3, антибиотики - полимиксин В сульфат (5000Е), рифампицин (10 мг) и амфотерицин (10 мг). Готовая среда должна быть прозрачной, светло-соломенного цвета, после добавления крови - темно-красного цвета. Готовую к применению питательную среду хранят при 2—8 °С не более5 дней. 4.3.4. Селективный агар Престона готовят в соответствии с поряд­ ком, изложенным в МУК 4.2.2321—08. 4.3.5. Дифференциально-диагностический агар для выделения и ко­ личественного учета Campylobacter spp. (далее - ДДА Campy). Среду ДДА Campy готовят в соответствии со следующим порядком: Основа среды (г/дм3): Пептон мясной ферментативный 15,0 15 МУ 4.2.3545— 18 Пептон соевый ферментативный 8,0 D-глюкоза 5,0 Агар микробиологический 15,0 Натрия хлорид 5,0 Натрий пировинограднокислый 0,25 Натрия метабисульфит 0,25 Железо сернокислое (II) 0,25 Натрий углекислый 0,5 Аскорбиновая кислота 0,75 Компоненты среды растворяют в 1 000 см3 дистиллированной во ды, нагревают до полного расплавления агара, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH (7,0 ±0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют авто­ клавированием 15 мин при 121 °С. В стерильную основу среды, охлаж­ денную до температуры 45—50 °С, вносят асептически кровь стериль­ ную дефибринированную в количестве 50 см3, антибиотики - полимик сина В сульфат (5000Е), рифампицин (10 мг) и амфотерицин (10 мг). 4.3.6. Кампилобакагар. Кампилобакагар готовят из сухой среды в соответствии с инструк­ цией изготовителя. 4.3.7. Колумбийский кровяной агар. Колумбийский кровяной агар готовят из сухой среды в соответст­ вии с инструкцией изготовителя. К охлажденной до 45—50 °С стерили­ зованной среде асептически добавляют 70 см3 стерильной дефибрини рованной крови, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 5 см. 4.3.8. Бульон для бруцелл. Бульон для бруцелл готовят из сухой среды в соответствии с инст­ рукцией изготовителя. 4.3.9. Транспортная среда Кэрри - Блера. Используют готовую жидкую среду в пробирках промышленного производства, или готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя. 4.3.10. Агар Мюллера - Хинтона. Агар Мюллера — Хинтона готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя. К охлажденной до 45—50 °С стерилизован­ ной среде асептически добавляют 70 см3 стерильной дефибринирован ной крови, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 5 см. 4.3.11. Трехсахарный железосодержащий агар (на основе сред №13, Клиглера, Олькеницкого). 16 МУ 4.2.3545—18 Готовят из соответствующих сред промышленного изготовления согласно инструкций изготовителя. 4.3.12. Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campy­ lobacter spp. готовят в соответствии со следующим порядком: Основа среды (г/дм3): Пептон мясной ферментативный 11,0 Гидролизат казеина 10,0 Дрожжевой экстракт 2,0 Агар микробиологический 1,25 Натрия хлорид 5,0 Натрий пировинограднокислый 0,25 Натрия метабисульфит 0,25 Железо сернокислое (И) 0,25 Компоненты среды растворяют в 1 000 см3 дистиллированной во ды, нагревают до полного расплавления агара, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH (7,0 ± 0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют авто­ клавированием 15 мин при 121 °С. Стерильную среду инокулируют культурой Campylobacter spp, инкубируют посевы в течение (48 ± 2) ч в микро аэро фильных условиях (N2 - 85 %, СО2 - 10 %, 0 2 — 5 %) при тем­ пературе (41,5 ± 0,5) °С, после чего к инокулированной среде добавляют стерильный глицерин в соотношении 15 : 85, перемешивают и хранят в холодильнике или замораживают при температуре (-70 =ь 2) °С. V. Создание микроаэрофильных условий культивирования 5.1. Оптимальная газовая среда для культивирования бактерий рода Campylobacter имеет состав: двуокись углерода (С02) - 10 %, кислород (02) - 5 %, азот (N2) - 85 %. Посевы помещают в контейнеры для анаэробного культивирования определенного объема, в анаэростат или в стерильные газонепроницае­ мые пакеты, куда вкладывают газогенераторные пакеты для кампило бактерий. Газогенераторные пакеты рассчитаны на определенный объем анаэростата (газонепроницаемых систем настольных), что необходимо учитывать при их применении. Инкубирование посевов проводят при температуре (42,0 ± 0,5) °С. Культивирование посевов допускается осуществлять непосредст­ венно в анаэробном инкубаторе или С02-инкубаторе, позволяющем под­ держивать температуру (42 ± 1) °С и оптимальный состав газовой среды. 17 МУ 4.2.3545— 18 VI. Отбор и подготовка проб для анализа 6.1. Отбор и подготовка проб пищевой продукции для анализа Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с МУК 4.2.2321—08, ГОСТ 3190^-2012, ГОСТ 26669—85, ГОСТ ISO 7218—2015, ГОСТ Р 50396.0—2013, ГОСТ Р 51447—99. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать размер анали­ тического^) образца(ов). Учитывая, что кампилобактерии очень чувствительны к воздейст­ вию факторов окружающей среды,-таких как воздействие кислорода, высушивание, снижение pH, нагревание, УФ-излучение и длительное хранение в аэробных условиях, при отборе проб пищевых продуктов на наличие бактерий рода Campylobacter необходимо соблюдать следую­ щие правила: отбор проб и их доставку в лабораторию для исследования про­ водят в максимально короткие сроки, по возможности не более 1 часа; отбор проб твердых пищевых продуктов осуществляют в сте­ рильные газонепроницаемые пакеты, удаляют избыток воздуха, герме­ тизируют путем перекручивания свободных краев пакета и фиксации при помощи обхвата, пробы жидких продуктов отбирают в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную посуду; отбор проб расфасованной пищевой продукции осуществляют в оригинальной упаковке, не допуская нарушений ее целостности; доставку проб в лабораторию осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими вкладышами (в сумке-холодильнике); до проведения анализа пробы сохраняют в защищенном от света месте, при температуре (5 ± 1) °С, пробы замороженных продуктов раз­ мораживают в защищенном от света месте при температуре (5 ± 1) °С в течение не более 18 часов или в течение 1 часа при температуре (19 ± 1) °С; после вскрытия упаковки пробы подвергают исследованию не­ медленно, приготовление объединенной пробы, навесок продукта и по­ сев осуществляют в максимально короткие сроки. Для приготовления объединенной пробы продукт измельчают, не допуская активного пере­ мешивания пробы во избежание воздействия кислорода. 18 МУ 4.2.3545— 18 6.2. Взятие смывов 6.2.1. При проведении контроля на загрязненность возбудителями кампилобактериоза проводят отбор и анализ смывов с поверхностей оборудования, инвентаря, рук и одежды персонала. 6.2.2. Производственный контроль эффективности мер, направлен­ ных на предотвращение перекрестной контаминации кампилобактерия ми на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, осуще­ ствляется в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения4, с учетом порядка и периодичности контроля санитарного состояния предприятий на патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы. Требования к организации работ по производственному контролю в целях профилактики кампилобактериоза установлены в санитарно эпидемиологическими правилами5. Ориентировочная частота проведения анализа смывов на наличие кампилобактерий для оценки санитарного состояния конкретного пред­ приятия представлена в табл. 1. Отбор смывов производится после санитарной обработки, перед началом работы оборудования. При обнаружении бактерий рода Campy­ lobacter в смывах периодичность контроля на соответствующем участке увеличивают в 2 раза. 4 Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благопо­ лучии населения»; санитарные правила СП 1.1.1058—01 «Организация и проведение про­ изводственного контроля за соблюдением Санитарных правил и выполнением санитарно­ противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденные постановлени­ ем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 13.07.2001 Х° 18 (зарегистрировано Минюстом России 30.10.2001, регистрационный номер 3000), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 27.03,2007 № 13 (зарегистрировано Минюстом России 26.04.2007, регистрационный номер 9357); санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816—10 «Профилактика кампилобактериоза среди людей», утвержденные поста­ новлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.12.2010 № 188 (зарегистрировано Минюстом России 14.03.2011, регистрационный но­ мер 20085) (далее - СП 3.1.7.2816— 10 от 29.12.2010 Х° 188). 5 Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816— 10 «Профилактика кампилобак­ териоза среди людей», утвержденные постановлением Главного государственного сани­ тарного врача Российской Федерации от 29.12.2010 Ха 188 (зарегистрировано Минюстом России 14.03.2011, регистрационный номер 20085) (далее - СП 3.1.7.2816— 10 от 29.12.2010 Х° 188). 19 МУ 4.2.3545— 18 Таблица 1 Рекомендуемый порядок взятия смывов на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности Объекты контроля Периодичность контроля Цеха* убоя, пер­ вичной перера­ ботки мяса и птицы Крупное оборудование, включая конвейеры, поверхности столов, ванны охлаждения Не реже 1 раза в две не­ дели, не менее 5 проб Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием еди­ ниц оборудования Не реже 1 раза в две не­ дели, не менее 5 проб Цеха производ­ ства сырых по луфабрикатов из мяса и птицы Крупное оборудование Не реже 1 раза в месяц, не менее 3 проб Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием еди­ ниц оборудования Не реже 2 раз в месяц, не менее 3 проб Цеха упаковки Тара, упаковочное оборудование, поверхности, контактирующие с продукцией Не реже 2 раз в квартал, не менее 3 проб Руки персонала, одежда у работников, соприкасающихся с продукцией, в середине и в конце смены Не реже 2 раз в квартал, не менее 5 проб 6.2.3. При обнаружении термофильных кампилобактерий в смывах с технологического оборудования, инвентаря убойных, яйцеобрабатываю­ щих цехов проводят внеочередную тщательную механическую и сани­ тарную обработку, дезинфекцию оборудования, включая холодильные камеры. При последующем контроле за проведенными мероприятиями термофильные кампилобактерии в смывах не должны обнаруживаться, 6.2.4. Для взятия смывов используют зонд-тампоны стерильные в комплекте с пробирками. Предварительно в промаркированные пробир­ ки асептически вносят по 5 см3 стерильных жидких сред по п. 4.3 бульон Престона с кровью, бульон для бруцелл, среду Кэрри - Блера. Пробы смывов в исследуемой зоне отбирают трижды, с участка площадью 100 см2 для каждого тампона, используя стерильный трафа­ рет из металла 10 х 10 см. Трафарет фламбируют перед каждым упот­ реблением. Смывы с мелкого оборудования берут со всей поверхности. После взятия смыва каждый зонд-тампон быстро погружают в пробирку с соответствующей средой, избегая встряхивания. Полученные пробы помещают в стерильный газонепроницаемый пакет, вкладывают газоге­ нераторный пакет для кампилобактерий и герметично запаковывают. Доставку проб в лабораторию для исследования проводят в максималь­ но короткие сроки. 20 МУ 4.2.3545— 18 VII. Проведение анализа 7.1. Проведение анализа бактериологическим (культуральным) методом 7.1.1. Посев и культивирование проб пищевой продукции Для определения наличия или отсутствия термофильных бактерий рода Campylobacter подготовленные пробы продуктов в количестве 10 г (см3) или 25 г (см3) вносят в 9-кратный объем одной из жидких сред по п. 4.3.2 или 4.3.3. Инокулированную среду инкубируют в течение 4 ча­ сов при 37 °С. В случае посевов замороженных продуктов или продук­ тов, которые хранились более 10 дней, - в течение 3 часов при темпера­ туре 32 °С, потом 2 часов - при температуре 37 °С. Затем все посевы продолжают инкубировать в течение 18 часов при температуре 42 °С. После этого делают пересев петлей на поверхность одной из дифферен­ циально-диагностических сред по п. 4.3.4, 4.3.5, 4.3.6 и вновь инкуби­ руют при температуре 42 °С в течение 18—24 часов. Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях. Количественный анализ проб проводят методом наиболее вероят­ ного числа (НВЧ) в соответствии со схемой, приведенной в МУК 4.2.2321—08. Для этого от каждой исследуемой пробы засевают в жид­ кую среду не менее трех масс (объемов) продукта в трехкратной по­ вторности: 10 г (см3) х 3; 1 г (см3) х 3; 0,1 г (см3) х З ; а при необходимо­ сти - четвертую в количестве 0,01 г (см3) х 3 раза. 7.1.2. Идентификация выделенных культур Кампилобактерии при росте в микроаэрофильных условиях на по­ верхности селективного агара образуют мелкие округлые колонии или колонии средних размеров, неправильной формы, как бы растекающие­ ся по ходу штриха, серые или полупрозрачные с сероватым оттенком, гладкие, влажные, блестящие. Отбирают не менее 3 типичных или подозрительных на принад­ лежность к Campylobacter spp. изолированных колоний, пересевают на поверхность кровяного колумбийского агара по п. 4.3.7 и инкубируют в течение 18—20 ч в микроаэрофильных условиях. Выросшие культуры окрашивают по Граму и микроскопируют, оп­ ределяют наличие оксидазы и каталазы. Бактерии рода Campylobacter - грамотрицательные мелкие, тонкие палочки с одним или более завитками. В мазке имеют вид запятой, бук­ вы S, либо галочки при соединении двух клеток. Тест на оксидазу. Полоску фильтровальной бумаги смачивают 2—3 каплями оксидазного реагента. На обработанную реактивом полоску 21 МУ 4.2.3545— 18 платиновой петлей наносят исследуемую культуру. При появлении си­ реневой, фиолетовой или глубокой синей окраски в течение 10 секунд реакцию считают положительной. Допускается применение бумажных дисков/полосок промышленного производства. Бактерии рода Campy­ lobacter оксидазоположительны. Тест на каталазу. В каплю 3 % раствора перекиси водорода на чис­ том предметном стекле вносят петлю исследуемой культуры. Появление пузырьков воздуха свидетельствует о положительной реакции. Термо­ фильные бактерии рода Campylobacter каталазаположительны, за ис­ ключением редко встречающегося вида С. upsaliensis. При обнаружении роста на агаровой селективной среде колоний с типичными культуральными свойствами, в которых обнаруживаются клетки с типичной для кампилобактерий морфологией, обладающие ферментами каталазой и оксидазой, делают вывод об обнаружении тер­ мотолерантных бактерий рода Campylobacter. В качестве дополнительного подтверждающего теста принадлеж­ ности выделенной культуры ктермофильным кампилобактериямдопус кается использовать иммунохроматографические тесты для детекции Campylobacter spp. промышленного изготовления, в соответствии с ин­ струкцией изготовителя. При необходимости определения видовой принадлежности выде­ ленных культур исследования проводят в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2321—08. Допускается применение мультимик ротестов/микрообъемных тест-систем для биохимической идентифика­ ции кампилобактерий промышленного изготовления, анализ проводят в соответствии с инструкцией изготовителя. При необходимости резервирования культур, в том числе для по­ следующей оценки их антибиотикочувствительности, штаммы кампило­ бактерий пересевают с поверхности кровяного агара в полужидкую сре­ ду для криохранения по п. 4.3.12. Культуры хранят в холодильнике не более 5 суток или замораживают при температуре (-70 ± 2) °С и хранят не более 3 месяцев. 7.1.3. Посев и культивирование смывов Пробы инокулированных смывами сред, подготовленных по п. 6.2, не открывая герметично закрытый пакет, помещают в термостат и инку­ бируют в течение 18 часов при температуре 42 °С. После этого из каж­ дой жидкой среды делают пересев петлей на поверхность одной из диф­ ференциально-диагностических сред по п. 4.3.4, 4.3.5, 4.3.6, посевы ин­ кубируют при температуре 42 °С в течение 18—24 часов. Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях. Далее опре 22 МУ 4.2.3545— 18 деление присутствия термофильных бактерий рода Campylobacter прово­ дят по п. 7.1.1 и 7.1.2. Результаты высева из трех жидких сред оценивают как одну пробу, то есть при обнаружении роста термофильных кампило бактерий в любой из трех сред результат считается положительным. 7.2. Проведение анализа методом фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа Инокулированные в селективном бульоне по п. 7.1.1 пробы пище­ вой продукции или инокулированные по п. 7.1.3 пробы смывов отбира­ ют в стерильные пробирки по 1—2 см3, закрывают и нагревают на водя­ ной бане (15 ±1) мин при 95— 100 °С. Охлаждают в течение 10 мин, перемешивают и вносят 0,5 см3 в стрип из тест-набора реагентов для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа. Оставшуюся часть инокулированного бульона хранят в холодильнике при 2—4 °С для подтверждения поло­ жительных образцов. Далее определение проводят в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2321—08. При проведении внутреннего производственного контроля и для оценки санитарно-гигиенического состояния производства допускается не проводить подтверждение положительного результата культураль­ ным методом. В иных случаях подтверждение положительного результата прово­ дят путём высева 0,1 см3 бульона обогащения, хранившегося при 2—4 °С (без прогревания), на поверхность одной из селективных сред по п. 4.3.4, 4.3,5, 4.3.6. Инкубацию образцов проводят при температуре (42 ± 0,5) °С в течение 18—24 ч, при отсутствии роста инкубируют ещё 24 ч. При обнаружении подозрительных колоний проводят их иденти­ фикацию (не менее 3 колоний) на принадлежность к термофильным бак­ териям рода Campylobacter по п. 7.1.2. При получении противоречивых результатов (положительные ре­ зультаты фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа не под­ тверждены культуральным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы. 7.3. Проведение анализа методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией Для подращивания находящихся в пробах пищевой продукции и смывов термофильных кампилобактерий, образцы подготовленные по п. 6, засевают в бульон Престона по п. 4.3.2 в соотношении 1 : 9 и инку­ бируют в соответствии с п. 7.1.1. Инкубация осуществляется в микроаэ рофильных условиях. 23 МУ 4.2.3545— 18 Материалом для ПЦР-анализа являются пробы культуральной жид­ кости. Экстракцию ДНК из культуральной жидкости проводят без допол­ нительной обработки, применительно к используемым наборам реаген­ тов и в соответствии с инструкцией изготовителя. Для экстракции ДНК применяются комплекты реагентов на основе методов сорбции ДНК на силикагеле или преципитации ДНК при возможности их сочетания с наборами реагентов для проведения ПЦР. Использование автоматических экстракторов нуклеиновых кислот допускается при наличии указаний в инструкции к прилагаемым набо­ рам реагентов о возможности их применения при анализе данного вида образцов. Не допускается применение упрощенных методик экстракции ДНК на основе термокоагуляции. ПЦР-анализ проводят в соответствии с методическими указания­ ми6. Для выявления ДНК термофильных Campylobacter spp. используют наборы реагентов, обеспечивающие постановку ПЦР с гибридизацион но-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме ре­ ального времени. Постановка ПЦР осуществляется с обязательным при­ менением внутренних контрольных образцов, начиная с этапа экстрак­ ции ДНК. Оставшуюся часть-инокулировакного бульона хранят в холодиль­ нике при 2—4 °С для подтверждения положительных образцов культу­ ральным методом или с помощью ПЦР-анализа парных проб по п. 9.2 МУК 4.2.2872— 11. При проведении внутреннего производственного контроля и для оценки санитарно-гигиенического состояния производства допускается не проводить подтверждение положительного результата культураль­ ным методом. В иных случаях подтверждение положительного результата прово­ дят культуральным методом или с помощью ПЦР-анализа по п. 9.2 МУК 4.2.2872— 11. При использовании культурального метода 0,1 см3 бульона обога­ щения, хранившегося при 2—4 °С (без прогревания), переносят на по­ верхность одной из селективных сред по п. 4.3.4, 4.3.5, 4.3.6. Инкубацию образцов проводят при температуре (42 ± 0,5) °С в течение 18—24 ч, при отсутствии роста инкубируют еще 24 ч. 6 МУК 4.2.2872— II «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбу­ дителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией», утвержденные Роспотребнад­ зором 15.06.2011 (далее-МУК 4.2.2872— 11). 24 МУ 4.2.3545— 18 При обнаружении подозрительных колоний проводятих идентифи­ кацию (не менее 3 колоний) на принадлежность к бактериям рода Cam­ pylobacter по п. 8.1.2. При получении противоречивых результатов (положительные ре­ зультаты ПЦР-анализа не подтверждены культуральным методом или ПЦР-методом), для проверки следует использовать дополнительные методы. VIII. Учет результатов Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта от­ дельно. Если в результате проведенного исследования термофильные бак­ терии рода Campylobacter обнаружены, то результат выражают следую­ щим образом: «Бактерии рода Campylobacter обнаружены в соответст­ вующей массе (объеме) продукта». Если не обнаружены: «Бактерии ро­ да Campylobacter не обнаружены в соответствующей массе (объеме) продукта». При необходимости после проведения видовой идентификации по п. 7.1.2 в ответе указывается вид бактерий рода Campylobacter. Для количественной оценки содержания термофильных кампило бактерий регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий рода Campylo­ bacter, при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положи­ тельных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому находят наиболее вероятное число (НВЧ) кампилобактерий, соответст­ вующее их содержанию в 1 г (см3) продукта (приложение 1 к МУК 4.2.2321—08), результат указывают как содержание термофильных кам­ пилобактерий в КОЕ/г (см3) пищевого продукта. Результат исследования смывов выражают аналогично. IX. Оценка чувствительности выделенных штаммов кампилобактерий к антимикробным препаратам Основой для выбора антимикробных препаратов (далее - АМП), подлежащих включению в исследование, являются данные о природной чувствительности представителей рода Campylobacter, о распростране­ нии среди них приобретенной резистентности, о клинической эффек­ тивности антибиотиков и практике применения ветеринарных лекарст­ венных средств с антимикробным действием. 25 МУ 4.2.3545— 18 9.1. Оценка чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом Перечень препаратов для тестирования штаммов кампилобактерий и сведения о пограничных значениях зон подавления роста для опреде­ ления чувствительности кампилобактерий к АМП представлены в табл. 2. Таблица 2 Критерии оценки чувствительности Campylobacter spp. к АМП АМП Диаметр зоны, мм Порог чувстви тельности, мг/л Диапазон тестируе­ мых концентраций, мг/лS> R < Ципрофлоксацин 26 25 0,5 0,12—16 Эритромицин 20 19 4—8 1—128 Налидиксовая кислота 20 19 16 1—64 Тетрациклин 30 30 1—2 0,5—64 Г ентамицин 17 16 2 0,12—16 Доксициклин 30 30 - Хлорамфеникол 17 17 - Амикацин 18 16 - Для оценки чувствительности выделенных штаммов термофильных кампилобактерий диско-диффузионным методом используют агар Мюллера - Хинтона (далее - МХА) с добавлением 5 % дефибриниро ванной крови по п. 4.3.10. После добавления крови МХА разливают в чашки Петри таким об­ разом, чтобы толщина агара составляла (4 ± 0,5) мм, что приблизительно соответствует 25 см3 среды на чашку Петри диаметром 90 мм; 31 см3 на круглую чашку Петри диаметром 100 мм, 71 см3 на круглую чашку Пет­ ри диаметром 150 мм. Не следует перемещать и двигать чашки Петри до полного затвердевания среды. Чашки с МХА должны быть подсушены перед инокуляцией для уменьшения роения (при 20—25 °С в течение 10— 12 часов или при 35 °С со снятой крышкой в течение 15 мин). При высокой влажности поверхности среды возможно формирование нечет­ кого края зоны подавления роста. Нельзя пересушивать агар. Хранить готовые чашки с МХА необходимо при 8— 10 °С в вентилируемых пла­ стиковых боксах не более 7 суток. Для приготовления инокулята используют чистую культуру кампи­ лобактерий, выросшую на поверхности кровяного агара в течение 18— 24 ч. Для этого петлей или ватным тампоном собирают несколько мор 26 МУ 4.2.3545— 18 фологически схожих колоний и суспендируют в стерильном изотониче­ ском растворе. Плотность бактериальной суспензии доводят до величи­ ны 0,5 по стандарту мутности МакФарланда, что приблизительно соот­ ветствует 1,5 х 108 бактериальных клеток/см3. Использование большей или меньшей концентрации бактерий может приводить к формированию зоны подавления роста меньшего или большего диаметра. Для измерения концентрации суспензии рекомендуется использо­ вать фотометрическое устройство (денситометр), калиброванное по стандартам мутности МакФарланда, в соответствии с инструкцией про­ изводителя. Плотность суспензии также может быть определена путем визуального сравнения приготовленной суспензии со стандартом мутно­ сти 0,5 по МакФарланду на белом фоне с черными линиями. Перед ис­ пользованием стандарт мутности следует энергично встряхнуть на вор тексе. Суспензию следует использовать в течение 15 минут после приго­ товления. Суспензию инокулируют на поверхность МХА. Для этого погру­ жают стерильный ватный тампон в суспензию, удаляют избыток жидко­ сти, отжав тампон о стенки пробирки и растирают суспензию равномер­ но штриховыми движениями по поверхности среды в трех направлени­ ях, поворачивая чашку Петри на 60°, для получения сплошного газона роста культуры. Допускается использовать автоматический инокулятор. На поверхность инокулированного МХА помещают диски с анти­ биотиками, не позднее, чем через 15 мин после нанесения суспензии. Длительное нахождение инокулированных чашек при комнатной темпе­ ратуре может привести к началу роста бактериальной культуры и лож­ ному уменьшению зоны подавления роста. Контакт диска с агаром дол­ жен быть плотным. После нанесения на поверхность агара диски нельзя передвигать. На одну чашку диаметром 90 мм помещают не более 6 дисков, а на чашку диаметром 150 мм - не более12 дисков. После нанесения дисков с антибиотиками чашки Петри с МХА в течение 15 мин должны быть помещены в термостат вверх дном. Посе­ вы инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 48 ч или при температуре (41,5 ± 0,5) °С в течение 24 ч. На чашках должен сформи­ роваться равномерный сплошной слой бактериального роста (газон). При слабом росте после 24 ч следует продлить инкубацию до 40—48 часов, после чего провести учет результатов. Зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками должны иметь форму окружности. Края зон подавления роста должны быть ров­ ными. Формирование отдельных колоний вместо сплошного роста сви 27 МУ 4.2.3545— 18 детельствует о недостаточной плотности инокулята. В этом случае ис­ следование необходимо повторить. Для контроля качества оценки антибиотикочувствительности ис­ пользуют тест- культуру Campylobacter spp. по п. 3.3.3, чувствительную к антибиотикам. Оценку чувствительности тестируемого штамма к конкретному АМП проводят, измеряя диаметры зон подавления роста вокруг дисков при помощи линейки, штангенциркуля или автоматическими приборами для учета результатов определения чувствительности диско-диффузи­ онным методом. Для измерения зон чашки с МХА помещают дном кни­ зу, крышку снимают и смотрят под углом 45° в отраженном свете. 9.2. Определение минимальных ингибирующих концентраций к АМП у бактерий рода Campylobacter При необходимости, при обнаружении резистентности исследуемо­ го штамма кампилобактерий к одному или нескольким АМП диско­ диффузионным методом, определяют минимальные ингибирующие концентрации (далее - МИК) к соответствующим препаратам методом серийных разведений в соответствии с методическими указаниями7 и ГОСТ Р ИСО 20776-1—2010. Для анализа МИК антибиотиков в отношении тест-штаммов бакте­ рий рода Campylobacter допускается использовать наборы реагентов промышленного производства8 - планшетные тест-системы или Е-тесты (MIC Test), представляющие собой модифицированный вариант диффу­ зионного метода тестирования. Анализ проводят в соответствии с инст­ рукциями изготовителя. Для интерпретации результатов используют табл. 2. Полученные данные используют для целей мониторинга и наблю­ дения за циркуляцией антибиотикорезистентных штаммов бактерий ро­ да Campylobacter, выделенных из пищевых продуктов и смывов, в том числе при проведении профилактических мероприятий в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами . X. Требования безопасности и квалификации операторов 10.1. Исследования пищевых продуктов и объектов окружающей среды проводят в соответствии с законодательством в области обеспе 7 МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериаль­ ным препаратам», утвержденные Роспотребнадзором 04.03.2004. 8 Примечание: Допускается использование реагентов с аналогичными или лучшими харак­ теристиками. 9 СП 3.1.7.2816— 10 от 29.12.2010 № 188. 28 МУ 4.2.3545— 18 чения санитарно-эпидемиологического благополучия населения10, а также с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими веществами (ГОСТ 12.1.005— 88, ГОСТ 12.1.007— 76). Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям са­ нитарно-эпидемиологических правил11 и иметь боксы биологической безопасности 2 класса типа А. 10.2. При выполнении методики и работе с электроустановками не­ обходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019—2009. 10.3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно­ вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безо­ пасности по ГОСТ 12.1.004— 91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009— 83. 10.4. К выполнению методики допускают лиц с высшим или сред­ ним специальным образованием, прошедших соответствующую подго­ товку и имеющих навыки работы в области микробиологического и мо­ лекулярно-генетического анализа, способных после освоения техники анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности. XI. Условия вы полнения измерений Измерения проводятся в лабораторных условиях, соответствующих требованиям СанПиН 2.2.4.548— 96 и ГОСТ 12.1.005— 88: Температура окружающего воздуха (23 ± 1) °С; Атмосферное давление (97 ±10) кПа; Относительная влажность (65 ± 5) %. 10 Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с мик­ роорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2008 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 21.02.2008, регистрационный номер 11197), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 02,06.2009 № 42 (зарегист­ рировано Минюстом России 08.07.2009, регистрационный номер 14280), от 29.06.2011 № 86 (зарегистрировано Минюстом России 12.07.2011, регистрационный номер 21317). 11 Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318—03 «Порядок выдачи санитарно эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями ин­ фекционных заболеваний человека I—IV групп патогенности (опасности), геныо-инже нерно-модифицированньши микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 № 85 (зарегистрировано Минюстом России 19.05.2003, регистрационный номер 4558). 29 МУ 4.2.3545— 18 Приложение МУК 4.2.3545—18 Схема проведения анализа на наличие бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и смывах Смывы Пищевые продукты Бактериологический (культуральный) метод по п. 7.1 Метод фсрмент с вязан но го флуоресцентного иммуноанализа по п. 7.2 Инокуляция в жидких селективных средах по 7.1.1 или 7.1.3 Пересев инокулята на поверхность агаризованных дифференциально-диагностических сред Отбор подозрительных колоний \ Отсутствие роста или подозритель­ ных колоний положи­ отрица­ положи­ отрица­ тельный тельный тельный тельный резуль­ резуль­ резуль­ резуль­ тат тат тат тат ПЦР-анализ парных проб Учет результатов и выдача ответа Идентификация выделенных культур до рода по п. 7.1.2 Определение антибиотикочувствитсльности выделенных штаммов (при необходимости) по п. 9 Пересев выделенных культур рода Campylobacter в полужидкую среду для криохранения (при необходимости) 30 МУ 4.2.3545— 18 Нормативные и методические документы 1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпиде­ миологическом благополучии населения». 2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использо­ вания возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкну­ тых системах». 3. СП 1.1.1058—01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением Санитарных правил и выполнением санитар­ но-противоэпидемических (профилактических) мероприятий». 4. СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 5. СП 1,2.1318—03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологичес­ кого заключения о возможности проведения работ с возбудителями ин­ фекционных заболеваний человека I—IV групп патогенности (опаснос­ ти), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами». 6. СП 3,1,7.2816— 10 «Профилактика кампилобактериоза среди людей». 7. МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использую­ щих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материа­ лом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности». 8. МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campy­ lobacters пищевых продуктах» с изменениями МУК 4.2.2878— 11 «До­ полнения и изменения № 1 к МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах». 9. МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорга­ низмов к антибактериальным препаратам». 10. МУК 4,2.2872— 11 «Методы выявления и идентификации пато­ генных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно флуоресцентной детекцией». 11. ГОСТ 31904—2012 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний». 31 МУ 4.2.3545— 18 12. ГОСТ 26669—85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». 13. ГОСТ 12.1.005—88 «Общие санитарно гигиенические требова­ ния к воздуху рабочей зоны». 14. ГОСТ ISO 7218—2015 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микро­ биологическим исследованиям». 15. ГОСТ ISO 10272-1—2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения». 16. ГОСТ ISO 20838—2014 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к амплификации и обнаружению для качественного анализа». 17. ГОСТ ISO 20837—2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обна­ ружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требова­ ния к подготовке образцов для качественного обнаружения». 18. ГОСТ ISO 11133—2016 «Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред». 19. ГОСТ Р ИСО 20776-1—2010 «Клинические лабораторные ис­ следования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чув­ ствительности инфекционных агентов и оценка функциональных харак­ теристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни». 20. ГОСТ Р 50396.0—2013 «Мясо птицы, субпродукты и полуфаб­ рикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологиче­ ским исследованиям». 21. ГОСТ Р 51447—99 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб». 22. Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», 2018—03. МУ 4.2.3545-18 https://meganorm.ru/Index2/1/4293777/4293777893.htm