State sanitary and epidemiological regulation Guidelines for sanitary and epidemiological assessment of the safety and functional potential of probiotic microorganisms used for food production Guidelines MU 2.3.2.2789-10

1. Авторский коллектив: Научно-исследовательский институт пита­ ния РАМН (В. А. Тутельян, С. А. Шевелёва, С. А. Хотимченко, В. А. Иса­ ков, И. Я. Конь, В. К. Мазо, Н. Р. Ефимочкина, Э. Н. Трушина, С. Ю. Бати­ щева, А. В. Черкашин, А. В, Булахов); Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (Н. К. Янковский, В. Н. Даниленко, С. Г. Ботина, О. В. Аверина); ФГУН «Московский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Габри­ чевского» Роспотребнадзора (В. А. Алешкин, Б. А. Шендеров, А. М. Амер- ханова, О. Г. Жиленкова, А. В. Алёшкин, М. С. Бляхер, И. М. Федорова, Е. А. Воропаева, Ю. В, Черепанова); ФГБУ Научно-исследовательский ин­ ститут эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика РАМН Н. Ф, Гамалеи Минздравсоцразвития России (А. Л. Гинцбург, Ю. В. Анань­ ина, Б. С. Народицкий, Н, А. Зигангирова, Л. Н. Нестеренко, И. А. Шаги- нян, М. Ю. Чернуха, А. А. Ховаев); ГОУ ВПО Тверская государственная медицинская академия «Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (В. М. Червинец, Ю. В. Червинец); Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова (В. В. Зинченко, Е. А. Карбышева); при участии ВНИМИ РАСХН (В. Д. Харитонов, В. Ф. Семенихина, И. В. Рожкова, В. Г. Будрик), ООО «Бактотех» (А. И. Туркин).

2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпиде­ миологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, (протокол от 14.10.2010 №2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным госу­ дарственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 декабря 2010.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые. ББК 51.23 © Роспотребнадзор, 2011 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 МУ 2.3.2.2789— 10 Содержание Введение................................................................................................................... 6

1. Область применения........................................................................................... 7

2. Общие положения................................................................................................7

3. Нормативные ссылки.........................................................................................11

4. Термины и определения................................................................................... 12

5. Методы исследования таксономической принадлежности пробиотических штаммов................................................................................ 13 5.1. Микробиологические исследования фенотипических свойств штаммов.........................................................................................14 5.2. Биохимические исследования фенотипических свойств штаммов........................... 14 5.2.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды................................................................... 15 5.2.2. Методика проведения биохимической идентификации штамма........................................................................................... 18 5.3. Молекулярно-генетическое подтверждение таксономического статуса штаммов, установленного на основании фенотипических свойств.................................... 19 5.3.1. Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности бифидобактерий............. 19 5.3.2. Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности лактобактерий................. 26

6. Методы исследования биологических свойств пробиотических штаммов.................... 29 6.1. Основные методы исследования безопасности штаммов в тестах in vitro........................................................................................................... 29 6.1.1. Определение фенотипического профиля.................................... 29 6.1.2. Определения отсутствия трансмиссивных генов антибиотикорезистентности...................................................... 34 6.1.3. Определение отсутствия (наличия) плазмидного материала...................................................................................... 36 6.1.4. Определение профиля органических продуктов (кислот, биогенных аминов, аммиака, пероксида водорода), продуцируемых штаммом.......................................................... 41 6.1.5. Определение способности к деконъюгации желчных солей...............................................................................................49 6.1.6. Определение способности к гидролизу муцина......................... 49 3 МУ 2.3.2.2789— 10 6.1.7. Определение способности пробиотических штаммов ингибировать представителей нормофлоры кишечника in vitro............................................................................................ 51 6.1.8. Определение степени иммуномодуляции................................... 53 6.1.8.1. Методы скрининга пробиотических штаммов в отно­ шении их иммуномодулирующей активности...............53 6.2. Основные методы исследования безопасности штаммов в тестах in vivo............................................................................................ 55 6.2.1. Определение способности к гидролизу мукозного слоя стенки кишечника....................................................................... 55 6.2.2. Способность к транслокации у иммунодефицитных животных......................................................................................56 6.2.3. Изучение фагоцитарной активности штаммов...........................56 6.3. Дополнительные методы исследования безопасности штаммов........58 6.3.1. Тестирование in vitro......................................................................58 6.3.1 Л. Определение гемолитической активности......................58 6.3.2. Тестирование in vivo................................... 62 6.3.2Л. Определение безвредности штаммов бифидобактерий и лактобацилл....................................62 6.4. Основные методы исследования пробиотического потенциала штаммов................................................................................. 62 6.4.1. Тестирование in vitro.................................................................. 62 6.4Л .1. Исследование антагонистической активности Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. в отношении тест-культур патогенных и условно-патогенных микроорганизмов различных групп методом отсроченного антагонизма.............................................. 62 6.4.1.2. Определение антагонистической активности штаммов к тест-культурам энтеропатогенных микроорганизмов.............................................................. 64 6.4.1.3. Определение антагонистической активности бифидобактерий в отношении патогенных и условно- патогенных микроорганизмов методом развивающихся смешанных популяций.......................................... 69 6.4.1.4. Тестирование кислотоустойчивости штаммов (к действию желудочного сока)............................................. 70 6.4.1.5. Тестирование устойчивости штаммов к желчи и способности к деструкции холестерина, триглицеридов.................................................................. 70 4 МУ 2.3.2.2789— 10 6.5. Дополнительные методы исследования пробиотического потенциала штаммов................................. 74 6.5.1. Тестирование in v itro ............... 74 6.5.1.1. Изучение антиадгезивных свойств штаммов на клеточных моделях......................................................74 6.5.1.2. Исследование адгезивности на клеточных моделях....78 6.5.2. Тестирование in vivo.......................................................................83 6.5.2Л. Определение адгезивности......................................................... 83

7. Методы исследования технологических свойств пробиотических штаммов............................................................................................................. 86 7.1. Определение постокислительной активности штаммов молочнокислых бактерий.......................................................................... 86 7.2. Определение способности к образованию экзополисахаридов.......... 86 7.3. Тестирование хранимоспособности........................................................ 87 7.3.1. Определение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл методом конечных разведений........................... 87 7.3.2. Количественное определение ацидофильных лактобацилл.................................................................................. 88 7.3.3. Контроль микробной культуры на наличие посторонней микрофлоры.................................................................................. 89 7.3.4. Изучение морфологии клеток....................................................... 90 7.3.5. Определение активности кислотообразования........................... 90

8. Библиография.....................................................................................................91 Приложение L Микробиологический и молекулярно-генетический паспорт штамма микроорганизма.................................................................. 96 Приложение 2. Пограничные значения чувствительности к антимикробным веществам лактобактерий в микрометоде серийных разведений [по I.KIareet al., 2007]................................................. 98 Сокращения.......................................................................................................... 103 5 МУ 2.3.2.2789— 10 УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 декабря 2010 г. Дата введения: с момента утверждения 2.3.2. ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ Методические указания по санитарно- эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов М етодические указания _______________________М У 2.3.2.2789— 10_______________________ Введение Опыт широкого применения пробиотиков в пищевой промышлен­ ности в целом подтверждает историю безопасного употребления в пищу человека микроорганизмов-симбионтов кишечной микрофлоры, к кото­ рым относится большинство пробиотиков, и отсутствие у них способно­ сти обусловливать у потребителей заболевания инфекционного и инва­ зионного характера. В то же время, как признают эксперты ФАО-ВОЗ, пробиотики потенциально могут быть ответственны за ряд побочных эффектов (септические инфекции, избыточная метаболическая актив­ ность, гиперстимуляция факторов локального иммунитета, передача генов представителям нормофлоры организма человека). Наибольшую актуальность в этом аспекте на сегодняшний день приобретает требова­ ние к контролю отсутствия у штаммов трансмиссивных генов, прежде всего антибиотикорезистентности. Накопленные в области нутрициологии и микробиологии данные также свидетельствуют о штаммоспецифичности благоприятного воз­ действия пробиотиков на здоровье человека. В связи с этим, согласно международным требованиям таксономическая принадлежность про- 6 МУ 2.3.2,2789— 10 биотических штаммов должна устанавливаться с использованием со­ временных воспроизводимых молекулярно-генетических методов. Под­ тверждение пробиотического потенциала стартерных культур пробио­ тиков должно быть основано на научной доказательной базе. Настоящие методические указания разработаны с целью обеспече­ ния единого, научно-обоснованного подхода к оценке качества и безо­ пасности штаммов пробиотических микроорганизмов {далее - штам­ мов), предназначенных для производства пробиотических заквасок пря­ мого внесения, бактериальных концентратов и микробной биомассы, являющейся компонентом пробиотических пищевых и биологически активных добавок или используемых для обогащения традиционных пищевых продуктов и биологически активных добавок; совершенство­ вания нормативной базы, регулирующей оборот продукции, выработан­ ной с использованием живых пробиотических микроорганизмов.

1. Область применения 1.1. Методические указания устанавливают требования к микро­ биологической, биохимической, молекулярно-генетической и гигиени­ ческой оценке штаммов, используемых в качестве стартовых культур для изготовления пробиотических заквасок, включая закваски прямого внесения, бактериальных концентратов и микробной биомассы для про­ изводства пробиотических пищевых продуктов и биологически актив­ ных добавок к пище, и необходимые методы лабораторных исследова­ ний для её осуществления. 1.2. Методические указания предназначены для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, деятельность которых связана с разработкой, производством и обращением биотехнологической про­ дукции, а также для испытательных лабораторных центров, осуществ­ ляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов и БАД к пище и аккредитованных в установленном порядке на данный вид деятельности. 2* Общие положения 2.1. Санитарно-эпидемиологическая оценка штаммов, отобранных по специфическим функциональным пробиотическим свойствам, вклю­ чает в себя комплекс микробиологических, биохимических, молекуляр­ но-генетических и гигиенических исследований для подтверждения их безопасности (безвредности), а также наличия у них свойств, обуслов­ ливающих пробиотический эффект в организме, и поэтому пригодных 7 МУ 2.3.2.2789— 10 для создания пробиотических продуктов питания и биологически актив­ ных добавок к пище. 2.2. Положения, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются при разработке технической документации на продукцию, а также на этапе предрегистрационных испытаний (исследований) впер­ вые разрабатываемой или впервые ввозимой на территорию Российской Федерации продукции. 2.3. В составе пробиотических заквасочных культур, бактериаль­ ных концентратов и микробной биомассы для производства пробиоти­ ческих пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, содержащих живые микроорганизмы, могут использоваться отдельные штаммы (или консорциумы штаммов), принадлежащие к родам бифидо­ бактерий (Bifidobacterium spp.), лактобацилл {Lactobacillus spp.\ пропио- новокислых бактерий {Propionibacterium spp.) и др., за исключением ро­ дов и видов микроорганизмов, перечисленных в СанПиН 2.3.2.2567—09 «Дополнение 15 к СанПиН 2.3.2. 1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». 2.4. Для обеспечения безопасности и пригодности пробиотических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, содер­ жащих живые микроорганизмы, штаммы для производства должны от­ вечать следующим требованиям: 2.4.1) должны быть преимущественно изолированы (без примене­ ния каких-либо биотехнологических воздействий на штамм) из предста­ вителей симбиотической резидентной микрофлоры желудочно- кишечного тракта здоровых людей. В иных случаях и в случаях, когда потенциальная пробиотическая культура изолирована из пищевого про­ дукта, организма животного или другого объекта окружающей среды, наряду с происхождением штамма, должен быть известен способ селек­ ции (индуцированный мутагенез, адаптация к определенным факторам, генно-инженерные манипуляции, в том числе самоклонирование, и др.) этих микроорганизмов; 2.4.2) таксономическая принадлежность должна быть установлена до уровня штамма путем изучения широкого спектра фенотипических характеристик и подтверждена с использованием воспроизводимых мо­ лекулярно-генетических методов; 2.4.3) номенклатурное название штамма должно приводиться в со­ ответствии с кодами современной международной классификации (по Approval Lists o f Bacterial Names in International Journal o f Systematic Bacteriology, 1980, v. 30, 225— 420 http://www.Z>acter/o.cicifrf) или Vali- 8 МУ 2.3.2.2789— 10 dation Lists in the International Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology) и включать обозначение рода, вида и штамма; 2.4.4) должны быть задепонированы в национальных или междуна­ родных коллекциях микробных культур Российской Федерации на усло­ виях контрольного хранения (для отечественных производителей - ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика или ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габри­ чевского, Москва; для зарубежных - международная коллекция микро­ организмов при ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), сопровождаться справкой о депонировании и паспортом штамма с указанием подробной таксономической характеристики, источника и даты выделения, анато­ мической области изоляции, присущих штамму фенотипических и гене­ тических характеристик, в т. ч. наличия внехромосомного генетического материала. Форма паспорта на штамм и перечень включаемых в него характеристик приведены в прилож. 1; 2.4.5) должны принадлежать к видам, имеющим документирован­ ную историю применения в пищу человеку, не должны обладать факто­ рами патогенности, токсигенности и не вызывать заболеваний у людей и теплокровных животных; 2.4.6) должны иметь изученный профиль антибиотикорезистентно- сти в отношении современных применяемых в медицине антибиотиков и не обладать антибиотикорезистентностью трансмиссивного типа; 2.4.7) должны иметь стабильные фенотипические, генотипические и технологические характеристики; иметь изученный профиль внехро- мосомных элементов (плазмид, транспозонов, бактериофагов и др.), при наличии внехромосомных элементов их функциональная роль должна быть охарактеризована и доказана неспособность к генному трансферу; 2.4.8) не должны обладать способностью к транслокации в лимфо­ узлы, паренхиматозные органы, кровь у человека и теплокровных жи­ вотных, обладающих иммунодефицитностью; 2.4.9) не должны обладать способностью к иммуносупрессии или избыточной иммуностимуляции, а также генерации провоспалительного эффекта in vitro и in vivo; 2.4.10) не должны обладать способностью образовывать новые ме­ таболические продукты или избыток известных продуктов, в количест­ вах, способных вызывать побочные эффекты; 2.4.11) не должны ингибировать рост представителей нормальной резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и теп­ локровных животных. 9 МУ 2.3.2.2789— 10 2.5. Изучение штаммов по показателям, указанным в п.п. 2.4.5— 2.4.11, характеризующим их безопасность, проводится путем тестирова­ ния in vitro и в экспериментах in vivo (на моделях конвенциональных линейных лабораторных животных обоего пола, обычно применяемых в нутрициологии - мышах, крысах, морских свинках, кроликах, с перо­ ральным введением стандартных и аггравированных доз (до ЮпКОЕ и более в 1 г инокулята, но не менее 109 КОЕ на животное). В необходимых случаях могут быть использованы животные- гнотобионты. 2.6. В случае использования генно-инженерно-модифицированных пробиотических штаммов оценка их безопасности проводится в соот­ ветствии с требованиями, включенными в МУ 2.3.2.1830—04 «Микро­ биологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микро­ организмов» и СанПиН 2.3.2.2340—08 «Дополнения и изменения 6 к СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пи­ щевой ценности пищевых продуктов». 2.7. Для штаммов зарубежного производства, впервые ввозимых на территорию Российской Федерации, в т. ч. в составе заквасок, пробио­ тических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище с живой микрофлорой, необходимо документальное подтверждение раз­ решения их использования в пищевой промышленности и/или в свобод­ ной продаже населению, со стороны компетентных органов страны- изготовителя. 2.8. Потенциальные пробиотических штаммы должны быть охарак­ теризованы на наличие у них функциональных (пробиотических) свойств. Тестирование функциональных свойств должно совмещать скрининг in vitro с экспериментальной оценкой in vivo на животных, указанных в п. 2.5; в необходимых случаях должны предусматриваться клинические испытания выработанных с включением штаммов опытно­ промышленных образцов пробиотических продуктов и БАД к пище. 2.8.1. У всех штаммов должна быть изучена выживаемость в про­ ксимальных отделах ЖКТ и пролиферация в толстом кишечнике, устой­ чивость к действию кислотности желудка, желчи, адгезия к эпителиаль­ ным клеткам человека и клеточным культурам, антагонистическая ак­ тивность против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов- возбудителей острых кишечных инфекций и других инфекций с пище­ вым путем передачи, способность снижать их адгезию в кишечнике, способность к гидролизу желчных кислот. 10 МУ 2.3.2.2789— 10 2.8.2. В необходимых случаях штаммы должны быть охарактеризо­ ваны на способность к продукции биологически активных веществ и других факторов, обусловливающих пробиотический эффект (иммуно­ пептидов, антимикробных веществ, в т. ч. бактериоцинов, органических кислот, в т. ч. короткоцепочечных жирных кислот, экзополисахаридов, профиль взаимодействия с клетками иммунной системы и модуляции цито­ кинов, расщеплению холестерина, антиоксидантной активности и т. д.). 2.9. У потенциальных пробиотических штаммов должны быть оха­ рактеризованы технологические характеристики. 2.9.1. Штаммы, отбираемые для заквасок, бакконцентратов или био­ масс, должны сохранять жизнеспособность, генетическую стабильность, функциональные пробиотические характеристики на всех этапах произ­ водства, транспортировки и хранения, не сообщать продукту неудовле­ творительных вкусов и запахов. 2.9.2. Штаммы, отбираемые для производства мультипробиотиче- ских консорциумов, многокомпонентных продуктов, включающих ин­ гредиенты с антимикробной активностью (эфирные масла, лекарствен­ ные растения, йод и его соединения, пищевые волокна-адсорбенты и др.) должны быть испытаны на совместимость и хранимоспособность в течение всего срока годности. 2.10. Все исследования и эксперименты на лабораторных животных проводятся по принципам доказательности (наличие контрольных штаммов и групп интактных животных, количество подопытных живот­ ных, достаточное для получения статистически значимых результатов).

3. Нормативные ссылки 3.1. Федеральный закон от 02.01.2000 № 29-ФЗ «О качестве и безо­ пасности пищевых продуктов» (с изменениями и дополнениями). 3.2. Федеральный Закон от 07.02.1992 № 2300-1 «О защите прав по­ требителей» (с изменениями и дополнениями). 3.3. Федеральный Закон от 23.09.1992 № 3520-1 «О товарных зна­ ках, знаках обслуживания и наименованиях мест происхождения това­ ров» (с изменениями и дополнениями). 3.4. Федеральный закон от 27.12.2002 № 184-ФЗ «О техническом регулировании» (с изменениями и дополнениями). 3.5. Федеральный закон от 12.06.2008 № 88-ФЗ «Технический рег­ ламент на молоко и молочную продукцию» (с изменениями и дополне­ ниями). 11 МУ 2.3.2.2789— 10 3.6. Федеральный закон от 24.06.2008 № 90-ФЗ «Технический рег­ ламент на масложировую продукцию». 3.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 22 ноября 2000 г. № 883 «Об организации и проведении мониторинга качества, безопасности пищевых продуктов и здоровья населения». 3.8. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 де­ кабря 2000 г. № 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов». 3.9. Постановление Правительства РФ от 14.12.2009 № 1009 «О по­ рядке совместного осуществления Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Министерством сель­ ского хозяйства Российской Федерации функций по нормативно­ правовому регулированию в сфере контроля за качеством и безопасно­ стью пищевых продуктов и по организации такого контроля». ЗЛО. СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования к качест­ ву и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» (с изменениями и дополнениями). 3.11. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические тре­ бования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому над­ зору (контролю) Таможенного союза ЕврАзЭС. 3.12. СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

4. Термины и определения Пробиотические микроорганизмы - живые непатогенные, неток- сигенные микроорганизмы, представители защитных групп нормального кишечного микробиоценоза человека и природных симбиотических ас­ социаций, благотворно влияющие на организм человека путем улучше­ ния (оптимизации) состава и биологической активности микрофлоры его пищеварительного тракта. Антагонизм - подавление жизнедеятельности одной микробной культуры (микробной популяции) другой за счет выделения в среду культивирования или совместного обитания веществ (антибиотиков, бактериоцинов, органических и жирных кислот), препятствующих росту или задерживающих размножение. Симбиоз - благоприятное влияние друг на друга двух и более по­ пуляций микроорганизмов при совместном существовании путем улуч­ шения условий своей жизнедеятельности. 12 МУ 2.3.2.2789— 10 Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы (ГММ) - бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы, вирусы, в которых генетиче­ ский материал изменен с использованием методов генной инженерии, то есть путем, который не имеет места в природе при размножении и/или при естественных рекомбинациях. Антибиотикорезистентность трансмиссивная (трансферабельная) - устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, закодированная на внехромосомных генных элементах микробной клетки, наиболее часто встречающийся селективный маркер рекомбинантной ДНК ГММ. Пробиотические закваски прямого внесения - чистые культуры специально подобранных отдельных штаммов живых пробиотических микроорганизмов, а также смесей штаммов в питательных средах, ис­ пользованных для их выращивания, либо суспензии вегетативных кле­ ток (в т. ч. концентрированные) без или со средой культивирования, приготовленные на специализированных предприятиях, и предназна­ ченные для прямого внесения в подготовленное сырье непосредственно в резервуарах для производства пробиотического продукта. Пробиоти­ ческие закваски прямого внесения могут выпускаться в сухом виде, вт. ч. лиофилизированном из замороженного состояния, или в жидком, в т. ч. замороженном.

5. Методы исследования таксономической принадлежности пробиотических штаммов Таксономическая принадлежность штаммов устанавливается на ос­ нове полифазного таксономического подхода, использующего комплекс генотипических и ключевых фенотипических тестов, что позволяет с наибольшей степенью точности установить принадлежность микроорга­ низмов к таксону на уровне вида и штамма. Разработчиком (поставщиком) должны быть предоставлены данные о сравнения фенотипических свойств штамма с характерными феноти­ пическими свойствами его вида, описанными в определителе Берги (Вегg e y ’s manual o f systematic bacteriology. Eds. Sneaht P.N.D. et al. Balti­ more; Williams and Wilkins, 1986, v. 2). Исследования проводятся при использовании контрольных (рефе­ рентных) штаммов данного вида из официальных депозитариев. Результаты тестирования таксономической принадлежности по фе­ нотипическим признакам одновременно могут использоваться для оцен­ ки штаммов в соответствии с требованиями п. 2.4 настоящих методиче­ ских указаний. 13 МУ 2.3.2.2789— 10 5.1. Микробиологические исследования фенотипических свойств штаммов На данном этапе идентификации определяются основные феноти­ пические признаки чистой культуры штамма: культуральные свойства колоний, морфология клеток в микроскопических препаратах (в живом и зафиксированном виде), отношение к окраске по Граму, способность к спорообразованию, а также каталазная и нитратредуцирующая активность при использовании общепринятых в микробиологии методов анализа. Чистую культуру штамма выделяют на рекомендованной для дан­ ного вида микроорганизмов питательной среде, позволяющей получать изолированные колонии. Например, выделение чистой культуры лакто­ бактерий должно осуществляться со среды MRS, термофильных стреп­ тококков - со среды типа M l7 по ГОСТ Р 51331—99, бифидобактерий - со среды Блаурокка, среды для бифидобактерий (г. Оболенск) или тиог- ликолевой среды. Потенциальные пробиотические штаммы должны обладать типич­ ными для рода культуральными признаками на всех типах сред (твер­ дых, полужидких и жидких) без признаков диссоциации, а также одно­ родными морфологическими, тинкториальными свойствами, окраши­ ваться по Граму положительно, не иметь спор и капсул, не восстанавли­ вать нитраты, не продуцировать каталазу. 5.2. Биохимические исследования фенотипических свойств штаммов Исследования проводятся для подтверждения принадлежности к роду и дифференциации видов. Оптимальными для данной цели явля­ ются методы идентификации микроорганизмов с помощью биохимиче­ ских диагностических тест-панелей одноразового пользования, отечест­ венного и зарубежного производства, зарегистрированных в РФ в уста­ новленном порядке. Для лактобактерий анализируется профиль ферментации расши­ ренного набора углеводов и аминокислот (не менее 49 наименований). Биохимическая идентификация бифидобактерий включает рутин­ ную предварительную дифференциацию с определением их фермента­ тивного профиля по укороченному спектру углеводов и многоатомных спиртов: лактоза, глюкоза, ксилоза, целлобиоза, рамноза, инулин, ман­ ноза, маннит, сорбит, инозит. С этой целью используют 1 %-е растворы десяти вышеперечисленных углеводов, приготовленных на основе по­ лужидкой питательной среды (пептон - 10 г, кукурузный экстракт - 14 МУ 2.3.2.2789— 10 30 мл, цистин солянокислый - 0,2 г, хлористый натрий - 2,0 г, агар-агар - 0,75 г на 1 л дистиллированной воды и соответствующего индикатора pH). После проверки чистоты культуры с помощью микроскопии, с по­ верхности агаровой пластины снимают выросшие колонии петлей и ре- суспендируют в стерильном растворе хлорида натрия для получения взвеси, содержащей 1 миллиард клеток бактерий в 1 мл по стандарту мутности (ОСО 42-28-59—85). Полученную взвесь бактерий в количест­ ве 0,01 мл вносят в 1 мл основы (т. е. концентрация взвеси клеток в ос­ нове среды равна 107). Растворы тестируемых углеводов и многоатомных спиртов вносят по 0,1 мл каждого в ряд лунок планшета для иммунологических иссле­ дований. В каждую из лунок затем добавляют по ОД мл взвеси испы­ туемой культуры бифидобактерий. В последнюю очередь в каждую лун­ ку добавляют по 1 капле стерильного вазелинового масла. Для контроля среды в одну лунку помещают по ОД мл основы среды, по ОД мл взвеси испытуемой культуры и по 1 капле вазелинового масла. Для контроля жизнеспособности культуры во взвеси ее вносят в БС-среду. Все посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч в анаэробных ус­ ловиях, после чего осуществляют предварительный учет результатов; окончательно результаты учитывают через 48 ч. Результаты учитывают по изменению окраски среды в лунках: по­ ложительный результат - желтое окрашивание, отрицательный - фиоле­ товое. Детальное изучение биохимических свойств штаммов, показавших положительные реакции с соответствующими субстратами, изучают при использовании параллельно трех биохимических тест-систем: а) типа API-20CHL (bioMerieux, Франция) б) типа API-50CHL (bioMerieux, Франция) б) типа АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия) 5.27. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды* А) аппаратура и инструментарий Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 ГОСТ 19881—74 * Допускается использование других аппаратуры, материалов, реактивов, питательных сред и диагностических тест-систем с аналогичными характеристиками, прошедших реги­ страцию в РФ в установленном порядке. При их применении необходимо руководство­ ваться рекомендациями изготовителя. 15 МУ 2.3.2.2789— 10 Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С ТУ 64-1-28-70—76 Термостат, позволяющий поддерживать рабо­ чую температуру 28—37 °С с отклонением от заданной ± 1 °С ТУ 64-1-1382—72 Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026—76 Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104— 88 Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284—78 Стерилизаторы паровые медицинские и аналогичные ГОСТ 19569—89Е Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с ГОСТ 6709—72 Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов ТУ 16-535— 84 Холодильник бытовой электрический Пинцет медицинский ГОСТ 21241—89 Ножницы медицинские ГОСТ 21239—89 Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240—89 Микробиологические петли Штативы для пробирок Часы механические сигнальные ГОСТ 3145—84 Микроволновая печь Б) лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026—76 Бутыли стеклянные для химических реактивов Кастрюли эмалированные ГОСТ 24778—81 Марля медицинская ГОСТ 9412—77 Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770—74 Воронки стеклянные ГОСТ 25336—82 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556—81 Полистироловые планшеты U-образные Пробирки типов типов П1,П2 ГОСТ 25336—82 Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672—75 Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147— 80 16 МУ 2.3.2.2789— 10 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) ГОСТ 13646—68 Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932—90 Книга-каталог кодов или комплект программ­ ного обеспечения для идентификации Бланки для регистрации результатов Микробиологические петли Фломастеры-маркеры В) реактивы и питательные среды Агар микробиологический ГОСТ 17206— 84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709—72 D-глюкоза, ч ГОСТ 6038—79 D-лактоза, 1 -водная ТУ 6-09-22-98—79 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198— 75 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493— 75 Кислота соляная, хч ГОСТ 3118— 77 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328—77 Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739—78 Набор реактивов для окраски по Граму Спирт этиловый ректификованный техниче­ ский ГОСТ 18300— 87 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652—2000 Экстракт дрожжевой Триптон Антибиотики разных групп Диски с антибиотиками Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке. Г) питательные среды Среды для выращивания бифидобактерий, НД изготовителя молочнокислых и пропионовокислых бактерий: ГМС, M l7, MRS, БС-среда (для культивирова­ ния и выделения бифидобактерий НИИ ПМ, г. Оболенск) Д) тест-панели для идентификации культур AP1-20CHL и API-50CHL по спецификации изготовителя АНАЭРОтест 23 по спецификации изготовителя 17 МУ 2.3,2.2789— 10 Е) стандарт мутности по McFarland гит ОСО Питательные среды и биологические препараты импортного произ­ водства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29 000. 5.22. Методика проведения биохимической идентификации штамма Из чистой 18—24-часовой культуры готовят суспензию в стериль­ ной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от вида исследуемого штамма. Неправильно приготовлен­ ная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов. Параллельно суспензию штамма или контрольного штамма высе­ вают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее росто­ вых свойств и/или постановки дополнительных тестов. Планшет для идентификации извлекают из упаковки и на прила­ гаемом к планшету бланке регистрируют номер испытуемого штамма и контрольного штамма. Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0, 1—0,2 см3) в зависимо­ сти от требований фирмы-изготовителя и вида исследуемого штамма. После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазе­ линовое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий. После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5— 24 ч при оптимальной температуре для исследуемого вида (например, 42 °С - лактобациллы). По окончании инкубации результаты учитывают визуально, отме­ чая цвет каждой лунки, и заносят в прилагаемые бланки. В некоторые лунки (например, для ферментация индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу про­ водят дважды: через 3—5 и 18—24 ч. Идентификацию проводят с помощью таблиц, книг-каталогов ко­ дов, компьютерного обеспечения соответствующих фирм-изгото- вителей, в заключении, учитывая данные, полученные по п. 5.1.1, указы­ вают род и вид штамма. Тестирование биохимических свойств используют для проверки стабильности фенотипических свойств штамма. Для этого культуру подвергают пассированию на жидких и плотных питательных средах и повторному через 3—5 пассажей тестированию биохимических свойств. 18 МУ 2.3.2.2789— 10 Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное при пассировании культур (не менее 10 пассажей), свиде­ тельствует о стабильности фенотипических признаков. Вариабельность результатов по 1—2 реакциям свидетельствует о необходимости поста­ новки дополнительных тестов на стабильность фено- и генотипических признаков штамма. Вариабельность результатов по большему числу ре­ акций является свидетельством нестабильности фенотипических при­ знаков и непригодности штамма для использования в пищевой промыш­ ленности. 5.5. Молекулярно-генетическое подтверждение таксономического статуса штаммов, установленного на основании фенотипических свойств Для подтверждения таксономического положения штамма разра­ ботчик должен представить информацию об уровне его гомологии с штаммами этого вида, допущенными для использования в пищевой промышленности при создании аналогичной продукции. Разработчик (поставщик) должен представить информацию о нуклеотидной последо­ вательности не менее двух локусов генома штамма, а также другие ма­ териалы, отражающие молекулярно-биологические характеристики. 5.3.1. Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности бифидобактерий Принцип метода. Молекулярно-генетическая идентификация штам­ мов молочнокислых бактерий базируется на определении последова­ тельностей информационного гена 16S рРНК и фрагментов операцион­ ных генов, кодирующих ферменты у бифидобактерий. Поскольку фило­ гения по 16S рРНК в значительной степени соотносится с эволюцион­ ной историей организмов, формируемые группы по последовательности гена 16S рРНК, как правило, подтверждаются данными анализов фено­ типических свойств. Для более детальной штаммоспецифической иден­ тификации используется подход двухлокусного секвенирования, в част­ ности с использованием р-субъединицы FoFj АТФазы, или гена транс- апьдолазы [4] в случае отсутствия ПРЦ- фрагментов с видоспецифиче­ скими праймерами. 19 МУ 2.3.2.2789— 10 5.3.1.1. Оборудование, материалы, лабораторная посуда, реактивы* A) аппаратура и инструментарий Анаэростат для анаэробного выращивания микроорганизмов или система газогенераторная настольная; Термостат суховоздушный; Высокоскоростная микроцентрифуга; Микротермостат «Термит»; Амплификатор типа «Терцик» или РТС-0150; Камера для горизонтального электрофореза «SE-2»; Источник питания; Трансиллюминатор TCP-20 МС. Б) питательные среды Бульон и агар МРС с 0,5 % цистеина B) реактивы и материалы Трис НС1 ЭДТА NaCl Тритон-ХЮО саркозил додецилсульфат натрия (SDS) фенол оксихинолин хлороформ изоамиловый спирт изопропанол этиловый спирт уксусная кислота, агароза, этидиум бромид, бромфеноловый синий, ксиленцианол, глицерин, лизоцим, РНКаза, протеиназа К, ДНК-маркер - ДНК фага лямбда /EcoRI+Hindlll маркер («Fermentas», Литва). Набор «Амплификация»: 10 * ПЦР буфер, 2,5шМ XdNTPs, 50mM MgCb, фермент Taq -полимераза (5 ед/мкл), минеральное масло (Компа­ ния «Dialat Ltd», Россия); набор для выделения фрагментов из агарозно­ го геля QIAquick Gel Extraction Kit (фирма «Qiagen»). 53.1.2. Ход определения

1. Условия выращивания. Культуру бифидобактерий выращивают в высоких пробирках с 20 мл бульона в анаэростате в течение 48 ч при 37 °С. * Допускается использовать других оборудование, материалы, лабораторную посуду, реак­ тивы с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 20 МУ 2.3.2.2789— 10

2. Выделение геномной ДНК из Bifidobacterium. На данной стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в ре­ зультате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплифика­ ции. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером обрабатываемого материала. За основу взят метод выделе­ ния ДНК из клеток бифидобактерий Regnault В. et al.[5]; модифициро­ ванный метод разработан в лаборатории генетики микроорганизмов Ин­ ститута общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Методика выделения. Культуру бактерий центрифугировать при 8 000 об/мин в течение 10 мин. Осадок суспендировать в 0,6 мл буфера TEST (трис НС1 pH 8,0 10 шМ; ЭДТА pH 8,0 5 mM; NaCl 1М; Тритон- X I00 1/200 объема). Осторожно перемешать. Инкубировать при 37 °С в течение 12 ч. Добавить 150 мкл свежеприготовленного раствора лизо­ цима (исходная концентрация 100 мг/мл); добавить 10 мкл раствора РНКазы (исходный раствор 10 мг/мл). Осторожно перемешать. Инкуби­ ровать при 37 °С в течение 3 ч (суспензия должна стать слегка вязкой). Добавить 150 мкл раствора протеиназы К (исходный раствор 20 мг/мл) и 150 мкл 10% саркозила. Осторожно перемешать. Инкубировать при 37 °С в течение 24 ч до полного лизиса. Добавить 100 мкл 25 % доде- цилсульфата натрия, перемешать, инкубировать при 55 °С в течение 2,5 ч (суспензия должна посветлеть). Очистку ДНК следует проводить в эппендорфах объемом 2 мл. К лизату клеток добавить 1 объем фенола (свежеперегнанный фенол предварительно насытить сначала трис НС1 pH 8,0 1М, а затем трис НС1 pH 8,0 0,1М, добавить оксихинолин). Содер­ жимое эппендорфа интенсивно, но осторожно перемещать переворачи­ ванием в течение 1 мин. Центрифугировать 10 мин при 12 000 об ./мин. Водную фазу отобрать в новый эппендорф, обработку фенолом повто­ рить. Водную фазу отобрать в чистый эппендорф и добавить 1 объем хло­ роформа с изоамиловым спиртом (24 хлороформа: 1 изоамилового спирта). Содержимое эппендорфа перемещать переворачиванием в течение 1 мин. Центрифугировать 5 мин при 12 000 об./мин. Водную фазу пере­ нести в чистый эппендорф, добавить 1 мл изопропанола, перемешать переворачиванием (появится осадок в виде тяжей). Центрифугировать в течение 1 мин при 10 000 об./мин, удалить супернатант. Осадок промыть 70 % этиловым спиртом, высушить и растворить в 150 мкл воды. Учет результатов. Результаты исследования учитываются путем анализа исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле. 21 МУ 2.3.2.2789— 10

3. Амплификация ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro) [6]. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце, ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок гене­ тической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной приро­ ды, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследова­ телю. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетически­ ми олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матри­ цы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК- полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Важнейшая характеристика праймеров— температура плавления (Тт) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой праймер присоединился к половине возможных сайтов связывания. Тт можно приблизительно определить по формуле Тт = 2 • (пА + пТ) + 4 *(по + пс), где пх — количество нуклеотидов X в праймере. Если праймер корот­ кий и Тт мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению не­ специфических продуктов. Верхний предел температуры плавления ог­ раничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность ко­ торой падает при температурах выше 80 °С. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: 1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94— 96 °С (или до 98 °С, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5— 2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. 2. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта ста­ дия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава прай­ меров и обычно выбирается на 4—5 °С ниже их температуры плавления. 22 МУ 2.3.2.2789— 10 Время стадии - 0,5— 2 мин. 3. Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от З’-конца прай­ мера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Темпе­ ратура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полиме­ разы Taq и Р/и наиболее активны при 72 °С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фраг­ мента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто про­ водят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7— 10 мин. Подготовка к анализу. Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10 х ПЦР буфера, 10 мкл смеси 2,5mM SdNTPs, 4 мкл 5 0 тМ MgCl2> 300 нг геномной ДНК и 0,8 мкл фермента Tag-полимеразы. Олигонукле- отидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси. Проведение исследования. Параметры ПЦР реакции: денатурация геномной ДНК при 95 °С в течение 5 мин; затем 30 циклов амплифика­ ции: 94 °С в течение 1 мин (денатурация), 56— 58—60 °С (в зависимости от праймеров) в течение 1 мин (отжиг олигонуклеотидов), 72 °С в тече­ ние 2 мин (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагмен­ тов при 72 °С в течение 10 мин, хранение при 4 °С.

4. Праймеры, используемые для идентификаг\ии рода и вида бифи­ добактерий приведены в табл. 1 и 2. Таблица 1 Ожидаемый Название Название Структура размер ПЦР рода, вида олигонуклеотида олигонуклеотида 5;—3/ фрагмента, нуклеотиды 1 2 3 4 Bifidobacterium g-Bifid-1 CTCCTGGAAACGGGTGG 549-563 g-Bifid-2 GGTGTTCTTCCCGATATCTACA В. adolescentis BiADOg-la -1 CTCCAGTTGGATGCATGTC BiADOg-lb -1 TCCAGTTGACCGCATGGT 279 BiADO-2 CGAAGGCTTGCTCCCAGT В. angulatum BiANG-1 CAGTCCATCGCATGGTGGT 275 BiANG-2 GAAGGCTTGCTCCCC AAC В. breve BiBRE-1 CCGGATGCTCCATCACAC 288 BiBRE-2 ACAAAGTGCCTTGCTCCCT 23 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение табл. 1 1 2 3 4 В. catenulatum BiCATg-1 CGGATGCTCCGACTCCT 285 BiCATg-2 CGAAGGCTTGCTCCCGAT B.bifidum BiBIF-i CCACATGATCGCATGTGATTG 278 BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA В. infantis BiINF-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 828 BiINF-2 GGAAACCCCATCTCTGGGAT В. longum BiLON-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 831 BiLON-2 GGGAAGCCGTATCTCTACGA Таблица 2 Название Ожидаемый олигонуклеотида Структура олигонуклеотида 57 З7 размер фрагмента, нуклеотиды Для амплификации генов 16S рРНК 16SN GTGGAGGGTTCGATTCTGGCT 1550 16SC AGAAAGGAGGTGATCCAGCCG Для амплификации генов р-субъединиц F0Fj АТФаз BLpN ATGGCTGACAACCAGACCACT 1550 BLpC TCACGCACCCAGTTCCTTCTG Для амплификации гена трансальдолазы BtalFor CGTCGCCTTCTTCTTCGTCTC 301 BtalRev CTTCTCCGGCATGGTGTTGAC

5. Визуализация результатов методом электрофореза в агарозном геле. Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агароз­ ном геле. В результате амплификаций должны быть наработаны фраг­ менты, соответствующие размерам, указанным в табл. 1 и 2. Для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) применяют метод ДНК-электрофореза в агарозном геле [7]. Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигри­ ровать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отри­ цательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отри­ цательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигриру­ ют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. После разделения (краситель вносят в расплавлен­ ную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи 24 МУ 23.2.2789— 10 флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресци­ рует в УФ-лучах. Определение размеров производят путем сравнения полученных фрагментов с коммерчески доступными препаратами ДНК (ДНК-маркерами), содержащими линейные фрагменты ДНК известной длины. Подготовка к анализу А. Приготовление агарозного геля: 0,8—2,0 %-ю суспензию агаро­ зы в буфере для электрофореза доводят до кипения и охлаждают до 45 °С, добавляют этидиум бромид до концентрации 0,5 мкг/мл. Залива­ ют в специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть, гребёнку осто­ рожно вынимают и форму с гелем переносят в аппарат для горизонталь­ ного электрофореза и погружают в буфер. Б. Приготовление 1 л 10-кратного ТАЕ буфера для электрофореза: навеску 4,04 г Трис растворяют в 200 мл дистиллированной воды, до­ бавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8,0 и доводят объём буфера до 3 000 мл дистиллированной водой. Для проведения электрофореза 10-кратный ТАЕ буфер разводят дистил­ лированной водой в 10 раз. Проведение исследования В пробирки с исследуемыми образцами после завершения ампли­ фикации вносят аккуратно под масло V5 объема раствора, содержащего 0,25 % раствора бромфенолового синего и 0,25 % раствора ксиленциа- нола в 50 %-м глицерине, перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и 8 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки. Электрофорез проводят при напря­ жении 120 вольт в течение 60 мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учи­ тывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светя­ щихся красноватых полос. Положительными считаются пробы, содер­ жащие фрагменты необходимой длины (1 550 нуклеотидов).

6. Выделение и очистка амплифицированной ДНК. Проводят с ис­ пользованием наборов для выделения фрагментов из агарозного геля (типа QIAquick Gel Extraction Kit фирмы «Qiagen»), согласно протоколу изготовителя. 25 МУ 2.3.2.2789— 10

7. Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, трансальдолазы и /?-субъединицы F qF j АТФазы. Проводят по ме­ тоду Сэнгера [8]. Анализ таксономической принадлежности бифидобактерий проводят с использованием компьютерной программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Для сравнения последовательностей генов рибосомальных РНК у бифидобактерий используют последовательности этого гена, характерные для разных видов Bifidobacterium, депонированные в GenBank NCBI. Сравнение последовательностей проводят с использова­ нием программы ClustalW (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html). 5,3.2. Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности лактобактерий 5.3.2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК для идентификации видовой принадлежности Lactobacillus spp. Сущность метода. Секвенированием ДНК называют комплекс ме­ тодов, позволяющих определить нуклеотидную последовательность ДНК или ее фрагментов. Для идентификации и классификации бактерий определяют нуклеотидную последовательность наиболее консерватив­ ных участков бактериального генома. Изучение полных нуклеотидных последовательностей отдельных генов дает дополнительную информа­ цию об эволюции таксона. Родственные представители обычно облада­ ют гомологичными по последовательности генами. Поэтому на данный момент таксономия базируется в основном на данных секвенирования малой субъединицы рРНК, как наиболее информационном виде анализа (Ботина и др., 2005, 2007). 5.3.2.2. Оборудование, материалы, лабораторная посуда, реактивы. А. Реактивы: 50мМ Трис-НС1 ЮмМ ЭД ТА- Na2 хлороформ лизоцим РНКаза 10% SDS 5М NaCl фенол изопропанол деионизированная вода 26 МУ 2.3.2.2789— 10 Гад-полимераза праймеры (фирма «Синтол») агароза Б. Оборудование: термостатный бокс для выращивания микроорганизмов центрифуга центрифуга вортекс водяная баня амплификатор Отп~Е фирмы Hybaid камера для электрофореза. 5.3.2.3. Выделение ДНК Выращивание всех штаммов лактобактерий проводят в жидкой стандартной среде МРС при 37 °С в течение 24— 48 ч. Клетки из 14 мл культуры осаждают центрифугированием при 4 400 g в течении 12 мин и ресуспендируют в 7 мл буфера 50 мМ Трис- НС1, 10 мМ ЭДТА- Na2, pH 8,0. Суспензию клеток центрифугируют в тех же условиях и осадок ресуспендируют в 500 мкл указанного выше буфера; суспензию переносят в 2-мл центрифужную пробирку и добав­ ляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек), вносят 100 мкл лизоцима (60 мг/мл) и инку­ бируют 30 мин при 37 °С; затем добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин при 37 °С. Для лизиса клеток суспензию мягко смешивают с 200 мкл 10 % ДСН (SDS) и 200 мкл 5 М NaCl; смесь инку­ бируют 16 ч при 65 °С. Полученный грубый лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ ( 1 : 1) и тщательно смешивают в течение 5 мин до состояния гомогенной эмульсии; смесь центрифугируют при 12 000 g 15 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1,5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной тем­ пературе и центрифугируют при 12 000 g 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0,5 мл 75 %-го этанола (центрифугирование по 5 мин при 12 000 g) и растворяют в 100 мкл деионизованной воды. ДНК хранят при -20 °С. 5.3.2.4. Анализ 16S рибосомной нуклеиновой кислоты.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Гены 16S рРНК амплифицируют с помощью ПЦР с использова­ нием праймеров 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1 492г (GGTTACCTTGTTACGACTT) [Lane, 1991]. Каждую реакцию проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг хромосомной ДНК, по 27 МУ 2.3.2.2789— 10 20 пмоль праймеров, 200 мкМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8) и 1,25 единицы активности 7а<зг-полимеразы. Реакцию проводят в амплификаторе Omn-E фирмы Hybaid. Сначала об­ разцы ДНК подвергают денатурации при 94°С в течение 5 мин. Затем проводят 35 циклов, включающих денатурацию ДНК при 94 °С в тече­ ние 30 с, отжиг праймеров при температуре 55 °С в течение 40 с и поли­ меразную реакцию в течение 1 мин. Заключительный этап элонгации проводят при 72 °С в течение 4 мин. Праймеры для ПЦР синтезируются по предварительному заказу в специализированном предприятии (ООО «Синтол», РФ).

2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля Гель-электрофорез ДНК проводят в горизонтальном 0,7 %-м ага­ розном геле в трис-ацетатном буфере при напряженности электрическо­ го поля 5 В/см, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Для опреде­ ления размеров фрагментов ДНК в качестве стандартов использут ДНК- маркер типа GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 фирмы Fermentas. Фрагменты ДНК выделяют из геля методом электроэлюции на по­ лоску DEAE бумаги Serva. Бумагу вставляют перед полосой фрагмента в прорезь в геле и проводят электрофорез в течение 7 мин при 10 вольт/см. Бумагу со связавшейся с ней ДНК помещают в 500 мкл 2 М раствора NaCl и инкубируют 40 мин при 65 °С. После удаления бумаги ДНК оса­ ждают из раствора 1 мл 96 % этанола. Осадок ДНК промывают 2 раза 70 % этанолом и растворяют в 40 мкл буфера ТЕ.

3. Секвенирование ДНК Секвенирование фрагментов ДНК проводится в специализирован­ ном предприятии на базе Центра коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН) с помо­ щью набора реактивов АВ1 PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с после­ дующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК С целью идентификации видовой принадлежности исследуемые последовательности ДНК анализирют на сходство с известными после­ довательностями генов 16S рРНК в базе данных GeneBank с помощью программы BLASTN (http://blast.псЫnlm.nih.gov/Blast.cgi) [Zhang et aL, 2000]. Идентичность последовательностей устанавливают на основе статистической значимости совпадений последовательностей. До­ полнительный анализ последовательностей проводят с помощью их 28 МУ 2.3.2.2789— 10 выравнивания с использованием программы Clustal X (http://www.ebi. ас. ик/Тools/clustalw/index.html).

6. Методы исследования биологических свойств пробиотических штаммов Санитарно-эпидемиологическая оценка штаммов должна базиро­ ваться на обязательных характеристиках безопасности и потенциальных пробиотических свойств видов культур, указанных в п. 2.3 настоящих Методических указаний, а также на дополнительных характеристиках, получение которых является необходимым для определенных изучае­ мых микроорганизмов. Дополнительное тестирование проводится в случаях, если: а) штаммы относятся к видам, среди представителей которых известно о наличии болезнетворных для человека штаммов, б) - у штамма, наряду со способностью улучшать состав и биологическую активность микро­ флоры ЖКТ или помимо таковой, предполагается наличие дополни­ тельной (специфической) функциональной активности. 6Л. Основные методы исследования безопасности штаммов в тестах in vitro 6.1.1. Определение фенотипического профиля чувствительности/резистентности штамма к антимикробным препаратам Чувствительность/резистентность штаммов к антимикробным пре­ паратам определяют диско-диффузионным методом (ДДМ) с наложени­ ем стандартных бумажных дисков, пропитанных антимикробными пре­ паратами, на поверхность плотной среды и/или методом серийного раз­ ведения антибиотика в жидкой питательной среде. Метод основан на способности антимикробных препаратов, диффундирующих в питатель­ ную среду, угнетать рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара, вокруг дисков с образованием зон задержки роста, или подавлять рост микробов в жидкой среде с внесенными в неё различными концен­ трациями препаратов. В этом случае для характеристики чувствительно­ сти штаммов к антимикробным препаратам устанавливают минималь­ ную ингибирующую концентрацию (МИК), при которой отсутствует видимый рост культуры. Эта концентрация определяет степень чувстви­ тельности штамма к антибиотику. Для оценки следует использовать не менее 25— 30 наименований из числа основных употребляемых в медицине групп антимикробных пре­ паратов (пенициллины, цефалоспорины 1 и 3 поколений, карбапинемы, 29 МУ 2.3.2.2789— 10 аминогликозиды 1,2,3 поколений, тетрациклины, макролиды, линкоза- мины, гликопептиды, полимиксины, хинолоны и фторхинолоны). А. Тестирование бифидобактерий диско-диффузионным методом Используют модифицированный в лаборатории биологии бифидо­ бактерий ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпи­ демиологии и микробиологии им. Габричевского» диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL, 2002 г., США. Используют диски с антибиотиками производства НИИЭМ им. Пастера (Россия, Санкт-Петербург). Бактериальную культуру готовят общепринятым методом из лио- филизированного материала. Третью генерацию бульонной культуры из разведения 10”4 в количестве 0,1 мл наносят на поверхность агаризован- ной БС-среды для культивирования и выделения бифидобактерий про­ изводства НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск, разлитой в чашки Петри слоем не меньше 4—5 мм непосредственно перед поста­ новкой опыта. Круговыми движениями шпателя быстро равномерно втирают материал в агаризованную среду, раскладывают антибиотики по трафарету (не более 5 дисков с антибиотиками на чашку), с учетом зон задержки роста культур для каждого из антибиотиков (зоны оцени­ вали в предварительном эксперименте). Чашки помещают в анаэростаты с атмосферой, содержащей 10 % С 02, генерируемой газпаками фирмы Биомерье. Учет зон задержки роста бактериальной культуры проводят через 24 ч выращивания при (37,5 ± 1) °С. Интерпретацию полученных результатов проводят при использова­ нии пограничных значений чувствительности бифидобактерий, разде­ ляющих их на три категории, установленных в табл. 2. Таблица 2 Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности бифидобактерий [по Жиленковой О. Г., Амерхановой А. М., 2009; Назыровой Н. Р., 2008] Диаметр зоны ингибиции роста, мм, и категории Доза чувствительности бифидобактерий Препарат вещества в диске, мкг устойчивые промежуточно чувствительные устойчивые 1 2 3 4 5 Доксициклин 30 < 8—10 11—20 >21 Полимиксин 300 <8—10 11—20 >21 30 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение табл. 2 1 2 3 4 5 Стрептомицин 10 <16 17— 19 >20 Гентамицин 10 <12 13— 14 >15 Тетрациклин 30 <16 17—21 >22 Ципрофлоксацин 5 <15 16—20 >21 Пенициллин 10 <8— 10 11—20 >21 Цефалоспорин 30 < 8—10 11—20 >21 Карбапинем 10 ОО 00 Т Т 1Т о о 0 о 11—20 >21 Линкомицин 15 00 11—20 >21 Ванкомицин 30 11—20 >21 Эритромицин 15 VI VI Vi VI 11—20 >21 Хлорамфеникол 30 <8—10 11—20 >21 Имипенем 10 <8—10 11—20 >21 Ампициллин 10 Vi 00 Т о 11—20 >21 Цефалотин 30 <8— 10 11—20 >21 Б. Тестирование лактобактерий диско-диффузионным методом Используют агаризованную питательную среду МРС, которую вно­ сят в чашки диаметром 90 мм в объеме 20 мл для достижения слоя агара (4,0 ± 0,5) мм. Из тестируемых культур готовят суспензии, соответствующие по плотности оптическому стандарту мутности на 5 единиц (с содержанием микробных тел около 1,5—5 х 108 КОЕ/мл), которые наносят на поверх­ ность агара по стандартной методике. Диски с антимикробными препаратами наносят по 5 штук на по­ верхность агара через 15 мин после его инокуляции взвесью испытуемо­ го штамма. Инокулированные чашки с дисками инкубируют при температуре 35 °С в течение 18—24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста кронциркулем с точностью до 1 мм. Исследование осуществляют в трехкратной повторности, результаты выражают в виде средней ариф­ метической. Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности лактобактерий (пограничные значения зон торможения роста) приведе­ ны в табл. 3. 31 МУ 2.3.2.2789— 10 Таблица 3 Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности лактобактерий по [Назыровой Н. Р. с соавт,, 200S] Диаметр зоны ингибиции роста, мм, Доза и категории чувствительности лактобактерий Препарат вещества в диске, мкг устойчивые промежуточно чувствительные устойчивые Доксициклин 30 < 8— 10 11— 20 >21 Полимиксин 300 < 8— 10 11— 20 >21 Стрептомицин 10 <16 17— 19 >20 Гентамицин 10 <12 13— 14 >15 Тетрациклин 30 <16 17—21 >22 Ципрофлоксацин 5 < 15 16—20 >21 Пенициллин 10 < 8— 10 11— 20 >21 Цефалоспорин 30 < 8— 10 11— 20 >21 Карбапинем 10 < 8— 10 11— 20 >21 Линкомицин 15 < з—ю 11— 20 >21 Ванкомицин 30 < 8— 10 11— 20 >21 Эритромицин 15 < 8— 10 11— 20 >21 Хлорамфеникол 30 < g— 1Q 11— 20 >21 Имипенем 10 < 8— 10 11— 20 >21 Ампициллин 10 < 8— 10 11— 20 >21 Цефалотин 30 < §— ю 11— 20 >21 В. Тестирование чувствительности бифидобактерий и лактобак­ терий методом серийных разведений. Тестирование проводится в соответствии с методическим указа­ ниями МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорга­ низмов к антибактериальным препаратам». Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотико- резистентности включает следующие этапы: а) приготовление растворов антибиотиков; б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков; в) приготовление суспензии исследуемого штамма и контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция; г) инкубация; д) интерпретация результатов исследования. Общими этапами в методе серийных разведений являются: приго­ товление растворов антибиотиков, питательных сред, смешивание рас­ творов антибиотиков и питательных сред. 32 МУ 2.3.2.2789— 10 Приготовление растворов антибиотиков Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для хра­ нения) и рабочие, используемые «ех tempore» для приготовления пита­ тельных сред. Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1 000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основ­ ных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибио­ тика для приготовления основного раствора проводят по формуле: Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл) Вес (мг) = Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл) Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется сте­ рильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для при­ готовления основного раствора в случае, если активность антибиотика измеряется в ЕД, производится аналогично. Приготовление сред, содержащих антибиотики для серийных раз- ведений Наиболее предпочтительным для метода серийных разведений в бульоне при исследовании штаммов-пробиотиков является микрометод (в планшетах), для которого серийные разведения антимикробных пре­ паратов делают не в дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая питательная среда, прошедшая контроль качества, гото­ вится в соответствии с инструкцией изготовителя. При постановке методов серийных разведений проводят контроль роста культуры на среде без препарата, а качество среды и антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. Контролируется также чистота суспензии микроорганизма, использо­ ванного для инокуляции, путем высева на неселективные среды. Допускается использование готовых тест-систем для определения МИК, зарегистрированных в РФ в установленном порядке. Учет результатов Учет результатов при постановке микрометода проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МИК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление види­ мого роста. Интерпретацию полученных результатов для лактобактерий прово­ дят при использовании пограничных значений чувствительности, разде­ ляющих их на три категории, приведенных в прилож. 2. 33 МУ 23.2.2789— 10 6J.2. Определения отсутствия трансмиссивных генов антибиотикорезистентности 6.1.2.1. Отсутствие у штамма генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность, дополнительно к фенотипическому профи­ лю антибиотикорезистентности (в случае необходимости), устанавлива­ ется в соответствии с методикой, включенной в МУК 4.2.2305—07 «Оп­ ределение генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные ана­ логи, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией». Тестирование наличия последовательностей ДНК, кодирующих транс­ миссивную устойчивость к медицинским и ветеринарным антибиоти­ кам - егшС (к эритромицину, плазмиды рЕ194 Staphylococcus aureus)y tetO (к тетрациклину, хромосомы Streptococcus pneumoniae), amp (к ам­ пициллину, плазмиды pBR322 Esherichia coli), hph (к гигромицину, хро­ мосомы Streptomyces hygroscopicus), sh Ые (к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus) проводится многокомпонентным набором прай­ меров производства НИЙЭМ им. Гамалеи РАМН «ГМ-БАКТ-1» по ТУ 9398-001-01897357—08 по инструкции, прилагаемой к тест-системе. Допускается для определения генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность у бифидобактерий, использовать праймеры согласно табл. 4. Таблица 4 Праймеры для ПЦР-анализа бифидобактерий на наличие генов устойчивости к антибиотикам Ожидаемый Название Структура олигонуклеотида 5/—37 размер ПЦР олигонуклеотида фрагмента, нуклеотиды TetW-N GATCGACCAGGCTGGCGTTG 250 TetW-C GGCTGATTGGTTCTCCTGCG Catl-N ATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGA 420 Catl-C AGCATTTTTCAGGTATAGGTG Ery-N TATAGCTATTGAAAAGAGATAAG 705 Ery-C ACACAGTCAAAACTTTATTACTTC 6Л .2.2, Гены, кодирующие трансмиссивную антибиотикорези­ стентность, могут также быть выявлены методом определения нуклео­ тидной последовательности ДНК штамма (секвенирование). 34 МУ 2.3.2.2789— 10 Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger. Реакцию проводят по протоколу фирмы «Promega» в 3 стадии:

1. Радиомаркирование (кинирование) праймера. Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в сле­ дующих условиях: 50 мМ Tris-HCl pH 7,5; 10 мМ MgCl2; 5 мМ DTT; 0,1 мМ спермидина; 10 pmol праймера; 10 рМ [y32P]dATP; 5ед. Т4-поли- нуклеотид киназы. Инкубировать 30 мин на 37 °С, затем активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до 90 °С в течение 2 мин.

2. Синтез меченых цепей методом ПЦР. Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых 32Р цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP. Реакция проводится в 17, 5 мкл в условиях: 50 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 10 мМ MgCl2; 1, 5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5 ед. 7ад-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие ddNTP, 50 мМ NaCl, раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит в следующих условиях: плавление цепей - 95 °С - 0,5 мин; отжиг затравок - 42 °С - 0,5 мин; элонгация цепей ДНК - 70 °С - 1 мин. Продолжительность амплификации состав­ ляет 30 циклов. Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95 % формамида, 20мМ ЭДТА; 0,05 % бромфенолового си­ него и 0,05 % ксиленцианола FF).

3. Электрофорез. Полученные образцы прогревают 2 мин при 70 °С и наносят на 6 %-й полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слот геля наносят по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при постоянном напряжении (25—30 V/cm) при температуре 55 °С. По окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10 %-й уксус­ ной кислоте, затем гель сушат 30 мин на стекле при температуре 60 °С. Экспонирование с рентгеновской пленкой «Кодак» проводят в течение 15—48 ч при комнатной температуре. Секвенирование генома испытуемого штамма сопоставляют с базой данных для референс-штаммов вида, используемых в пищевых продук­ тах, для выявления генов, кодирующих трансмиссивную антибиотико- резистентность. 35 МУ 2.3.2.2789— 10 6,1.3. Определение отсутствия (наличия) плазмиды ого материала Сущность метода определения плазмидного материала, в т. ч. плазмид, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность, заключается в выделении плазмидного материала и визуализации ре-* зультатов с использованием электрофореза в агарозном геле для опреде­ ления наличия плазмидной ДНК и плазмид, кодирующих признаки ус­ тойчивости к антибиотикам. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, инструменты, питательные среды, реагенты* Набор реагентов GeneJET™ для выделения плазмидной ДНК Наконечники Omnitip до 300 мкл, 10 х 96 запасной блок Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл Наконечники Omnitip до 200 мкл, 10 х 96 запасной блок GeneRuler™ 100+ п.н. ДНК-маркер 10Х ТВЕ буфер для электрофореза TopVision™ LE GQ агароза Пипетка Research. Объем 0,5— 10 мкл Пипетка Research. Объем 2,0—20 мкл Пипетка Research. Объем 10— 100 мкл Пипетки Research. Объем 20—200 мкл Пипетка Research. Объем 100— 1 000 мкл Источник питания Эльф-4 Весы Scout Pro, 120 г/0,001 г Центрифуга/вортекс Микроспин Камера, 170 х 120 мм UV-cleaner box Центрифуга MiniSpin plus Система регистрации результатов электрофореза Gel Imager Подготовка к анализу Исследование должно проводиться в специально оборудованных помещениях, состоящих из комнаты для работы с микроорганизмами, ПЦР-оборудованного помещения для работы с препаратами ДНК и ком­ наты для постановки электрофореза и учета результатов. Не допускается проведение микробиологических этапов исследования, выделения ДНК, * Допускается использовать других аппаратуру, материалы, лабораторную посуду, реакти­ вы, инструменты, питательные среды, реагенты с аналогичными характеристиками, про­ шедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 36 МУ 2.3.2.2789— 10 и анализа присутствия плазмидной ДНК в образцах в помещениях, не предназначенных для этих целей во избежание контаминации и невер­ ной интерпретации результатов. Методика выделения плазмидной ДНК обеспечивает получение низкоразмерной ДНК с высокой степенью чистоты из культур клеток бактерий. Для анализа используется набор типа К0503, основной со­ ставной частью которого является микроколонка, протекание жидкости через неё обеспечивается центрифугированием. Колонка содержит спе­ циальную мембрану на силикатной основе. Набор позволяет получить до 20 мкг высококопийной плазмидной ДНК за одно выделение. Опти­ мальный объем клеточной культуры, используемой на начальном этапе, и реальное количество выделяемой ДНК зависит от среды, применяемой для роста клеточной культуры, и количества копий плазмиды. Проведение анализа: 1) Отбор и подготовка проб Выращенная при оптимальной температуре инкубации культура исследуемого штамма бактерий анализируется на присутствие в составе плазмидной ДНК. Процедура выделения ДНК производится с использованием опи­ санного выше лабораторного оборудования и набора реагентов GeneJET™ для выделения плазмидной ДНК (Ферментас), строго в соот­ ветствии с прилагаемой инструкцией фирмы-производителя. 2) Принцип метода Осажденные бактериальные клетки ресуспендируют и подвергают щелочному лизису в присутствии додецилсульфата натрия для высво­ бождения плазмидной ДНК. Полученный лизат нейтрализуют. Клеточ­ ный дебрис и додецилсульфат натрия удаляют центрифугированием. Раствор, содержащий плазмидную ДНК, наносят на мембрану микроко­ лонки GeneJET™. Адсорбированную ДНК промывают для удаления примесей. Очищенную плазмиду элюируют небольшим объемом буфера или воды. 3) Применяемые растворы и материалы • раствор для ресуспендирования бактериальных клеток (70 мл) • раствор для щелочного лизиса клеток (70 мл) • раствор для нейтрализации клеточного лизата (100 мл) • концентрированный раствор для промывки плазмидной ДНК, ад­ сорбированной на мембране (100 мл) • рибонуклеаза А (700 мкл) 37 МУ 2.3.2.2789— 10 • буфер для элюирования плазмидной ДНК (30 мл) • микроколонки GeneJET™ (250 штук). Набор реагентов типа GeneJET™ может храниться при комнатной температуре (15—25 °С), если срок хранения не превышает 12 месяцев. При более длительном использовании рекомендуется хранить набор при 4 °С. Если в процессе хранения в растворах выпадает осадок, то его сле­ дует растворить прогреванием раствора при 37 °С. Перед использовани­ ем растворы охладить до 25 °С. Не рекомендуется интенсивно переме­ шивать раствор для щелочного лизиса клеток. После добавления рибонуклеазы А раствор для ресуспендирования бактериальных клеток должен храниться при 4 °С и быть использован в течение 6 месяцев. 4) Ход определения Все процедуры очистки должны выполняться при комнатной тем­ пературе. Центрифугирование проводится в настольной мини-центри­ фуге. Скорость вращения ротора должна превышать 12 000 об./мин. Для выделения высококопийных плазмид достаточно использовать 1—-5 мл культуры Е. colU выращенной в среде LB. Для выделения низкокопий- ных плазмид следует использовать 10 мл культуральной жидкости. Анализ осуществляется строго поэтапно:

1. Перед первым использованием набора добавить рибонуклеазу А к раствору для ресуспендирования бактериальных клеток и перемешать. Ресуспендировать осажденные клетки в 250 мкл этого раствора, пере­ мешивая до исчезновения комков. Перенести клеточную суспензию в пробирку для микроцентрифугирования.

2. Добавить к клеточной суспензии 250 мкл раствора для щелочно­ го лизиса клеток и перемешать, переворачивая пробирку 4—6 раз. Рас­ твор должен стать вязким и слегка прозрачным. Нельзя перемешивать смесь на шейкере-встряхивателе типа « Vortex», так как это может спо­ собствовать разрушению хромосомной ДНК. Нельзя инкубировать смесь дольше 5 мин, чтобы избежать денатурации суперскрученной плазмидной ДНК.

3. Добавить к клеточному лизату 350 мкл раствора для нейтрализа­ ции, немедленно тщательно перемешать, переворачивая пробирку 4—6 раз.

4. Центрифугировать смесь 5 мин для осаждения клеточного деб- риса и хромосомной ДНК.

5. Нанести полученный раствор на мембрану микроколонки GeneJET™. 38 МУ 2.3.2.2789— 10

6. Центрифугировать 1 мин. Удалить прошедший через мембрану раствор из пробирки и поместить микроколонку в ту же пробирку.

7. Перед первым использованием набора к концентрированному раствору для промывки плазмидной ДНК, адсорбированной на мембра­ не (100 мл), добавить 170 мл 96— 100 %-го этанола. 500 мкл полученно­ го раствора нанести на мембрану микроколонки GeneJETгм. Центрифу­ гировать 30—60 с и удалить раствор, прошедший через мембрану. По­ местить микроколонку в ту же пробирку.

8. Повторить процедуру промывки (стадия 7).

9. Удалить раствор, прошедший через мембрану. Центрифугиро­ вать микроколонку еще 1 мин для удаления раствора для промывки плазмидной ДНК. Эта операция необходима для того, чтобы избежать следовых количеств этанола в препарате ДНК.

10. Перенести микроколонку GeneJET™ в чистую пробирку на 1,5 мл (не включена в набор). Нанести 50 мкл буфера для элюирования плаз­ мидной ДНК в центр мембраны. Нельзя касаться мембраны наконечни­ ком пипетки. Выдержать 2 мин и центрифугировать 2 мин. Дополни­ тельное проведение стадии 10 с использованием буфера для элюирова­ ния или воды позволяет увеличить выход выделенной плазмидной ДНК на 10—20 %.

11. Удалить микроколонку и хранить выделенную плазмидную ДНК при -20 °С. Электрофорез выделенной плазмидной ДНК проводится с исполь­ зованием камеры для электрофореза SE-2 (Хеликон) строго в соответст­ вии с прилагаемой к аппарату инструкцией фирмы производителя. Пре­ парат выделенной ДНК наносится в лунки агарозного геля и разгоняется в электрическом поле в течение 45 мин при напряжении 15В\см. При проведении электрофореза должны соблюдаться следующие требования: • при проведении электрофореза температура буферного раствора не должна превышать 45 °С; • необходимо менять буфер после 2—3 электрофорезов; • не допускается контакт составных частей изделия с органически­ ми растворителями; • при подключении к блоку питания соблюдать полярность; • перед заливкой геля в заливочное устройство раствор агарозы ос­ тужать до 60 °С. 39 МУ 23.2.2789— 10 5) Учет результатов Учет результатов анализа проводится с использованием гель- документирующей системы типа Gel Imager-2 в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы-производителя. В тех дорожках, где обнаруживается светящийся в УФ-свете фрагмент - присутствует плаз- мидная ДНК того штамма, чей образец наносился. Система типа Gel Imager-2 предназначена для ввода в компьютер изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием. Изображение выводится непосредственно на ком­ пьютер. Сигнал изображения формируется ПЗС-камерой с ручной на­ водкой на резкость, диафрагмированием и 2-кратным плавным масшта­ бированием. При работе не требуется дополнительного затемнения по­ мещения. Программное обеспечение Gel-Imager поддерживает функции контрастирования, масштабирования, преобразования позитив/негатив, позволяет накапливать кадры в буфер приложения, что значительно поднимает соотношение сигнал/шум. Имеется возможность записи в файл, сжатия, ведения базы данных и печати на принтере полученных изображений. Системные требования к компьютеру: • Intel 166 MHz процессор (или выше); • 200 МВ свободной памяти на жестком диске; • не менее 16 MB RAM; • Microsoft Windows 95(98)/ХР и выше; • видеоадаптер, поддерживающий режим True ColorQ.4 бит); • PCI - слот; • Microsoft Office 97(с компонентами DAO 3.5 для работы базы дан­ ных). 6) Интерпретация результатов Положительным результатом, говорящем о присутствии плазмид- ной ДНК, служит наличие плазмидного материала в геле после проведе­ ния электрофореза, визуализации в УФ-свете и его фиксирования с ис­ пользованием компьютерной системы гель-документирования. Длина фрагментов ДНК, полученных после электрофоретического разделения продуктов ПЦР, сопоставляется с низкоразмерными маркерами 16— 500 п.н. Требования безопасности При осуществлении данного анализа должны соблюдаться требо­ вания, предъявляемые к исследовательской работе с микроорганизмами III—IV групп патогенности. 40 МУ 23.2.2789— 10 Раствор для щелочного лизиса клеток и раствор для нейтрализации клеточного лизата содержат вещества, вызывающие раздражение кожи. Работать с ними необходимо в перчатках. 6.1.4. Определение профиля органических продуктов (кислот, биогенных аминов, аммиака, пероксида водорода), продуцируемых штаммом 6.1.4.1. Определение карбоновых кислот. Сущность метода Органические кислоты определяют в условиях газовой хромато­ графии. Разделение органических кислот происходит в капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms фирмы Agillent technologies. Концентрацию веществ определяют по масс-спектрам, ис­ пользуя стандартную программу идентификации прибора, основанную на базе данных NIST. Аппаратура, материалы и реактивы* Хроматографическая система: инжектор ГХ-МС системы AG- 59730 фирмы Agillent technologies (США), капиллярная колонка фирмы Agillent technologies длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм, масс- спектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв), сис­ тема для обработки хроматографических данных база данных NIST. Подготовка к испытанию Карбоновые, фенилкарбоновые кислоты и спирты экстрагируют из 1 мл подкисленной до pH = 2 культуральной жидкости эфиром. Эфир высушивали при температуре до 40 °С, а сухой остаток обрабатывают в 20 мкл (БСТФА) в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилси- лильных эфиров кислот и спиртов. Проведение испытания Реакционную смесь в количестве 2 мкл вводят в инжектор ГХ-МС системы AG-5973D фирмы Agillent technologies (США). * Допускается использовать других аппаратуру, материалы и реактивы с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 41 МУ 2.3.2.2789— 10 Пример анализа 1. М етаболиты микроорганизмов в образце объек­ та окружающей среды (болотной воде). мкгУмл Ns Compounds OS25(1)8ES OS25(1VCHL 1Meptanoic 0,0 74,0 2 3M)vtar»ic 7,5 0,0 3 Urea 32,9 2,6 L ! M 4 Benzoic 32,9 14,7 Ш=э i i 5 Phosphoric ac 0,0 0,0 6 Octanoic 21,1 58,1 7 Cvclohexerw-dioxv 6 Phenvlacetic 41,7 100,7 9 Cyclohexanone-carboxyl 0.0 0,7 ! 10 3*oxycaproic 24,5 1,5 11 succinic 43.5 39,4 Щ т , j j 12 o-dioxy-Benzote 0,0 0,0 13 Normnok 2.4 3,4 14 4-Me-catechole 30,0 15 p-dioxy-phenyte 16 2-OH-fllutaric 9.2 11,9 7,9 Г16,7 6,4 В j 1 i 17 3-hydroxy-octanoic 3,2 0,7 1S 3-oxy-benzoic 2,5 4.4 19 4-oxy-ph«ny!*tfwnole 20 hepiandioic 8,2 6,3 L 3,3 4,7 ! : i 21 p-oxy-Banzoic 17,8 0.9 L1—* :! s eosniJKrt, 22 Butendioic 0.0 0,0 23 oto 0.0 i 24 C10:0 0.0 0,0 25 Phenyjpropiomc 9,1 22,4 ЙГ" тятя j 26 m-OH-Ph-propionic 55,9 87,0 27 p-OH-Ph-propionic 10,9 0,8 b 28 m-oxyphenyi-acebc 1,1 2,1 ; 29 C12:0 3,5 8,4 30 octandioic 12,6 13,7 31 Azelaic 23,7 31,1 f i r ! ! 32 S14 ..........0,3 1.3 11 1 : 33 3,4-dioxy-benzoic 9,9 ............0,0 a 34 C14:0 7,3 12.8 q“ 35 Sebacink (C10DKK) 0.0 2,8 f 36 vanvlflproptonic 10,5 ........_ P,0 P —WMm 37 2-oxyphenyt-propanoic 30,7 64,0 \ 38 tindecandioic 3.0 1,4 39 C16:0 36,3 73,3 40 Bu-benzoate-ST 2,4 2,4 1. .. i _ J 516,3 719,0 V $0 )M ISO 42 МУ 2.3,2.2789— 10 Для управления и обработки данных используют штатные про­ граммы приборов. Хроматографическое разделение пробы осуществляют на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms фирмы Agillent technologies длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм. Масс-спектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв) работа в режиме полного сканирования. Режим хроматографирования: 7 мин при 80 °С, далее программирование температуры до 250 °С. Ве­ щества на хроматограмме определяют по масс-спектрам, используя стандартную программу идентификации прибора, основанную на базе данных NIST. Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрируют автоматически по заранее составленной программе. Для выборочного детектирования целевых минорных компонентов на превалирующем фоне биологической жидкости используют метод масс-хроматографии. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в элек­ тронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета в качестве внутреннего стандарта используют 3-дейтеро-тридекановую кислоту, D5 бензойную кислоту или бутилбензоат. Пример анализа 2. Культуральная жидкость бифидобактерий в процессе хранения. мкг/мл Ns Кислота Свежий Старый 1 05_БензоЙная „(Стандарт) 10.00 10,00 2 Бензойная 0.77 0,76 3 Фенил-уксусная 0,00 0,05 1 t i 4 п-Гидроксифенил-уксусная 0,00 0,06 ’ i ! 5 Фенил-молочная, кислота 0.96 0,47 * ; i 6 п-Гидроксифенил-молочная 3,89 0,92 ^ ; ■ Старый 7 п-Гидроксифенил-лировин оградная 0,11 0,00 i П Свежий 8 Янтарная 18,96 10,08 9 Фумаровая 3.03 1,49 h I i j 10 2-Гидрокси-глутаровая Г" 0,25 0,21 11 2-Гидрокси-масляная 0,11 0,06 I ! 1 1 12 Молочная 97.23 39,60 13 2-Гидрокси-3-метил-бута новая 0.16 0,04 14 2-Гидрокси-гексановая 1.60 0,71 15 Яблочная 0.23 0,16 [ ! ... L i . J 0.00 20,00 *0,09 60,00 80.00 100,00 43 МУ 2.3.2.2789— 10 Полный список анализируемых карбоновых кислот и сопутствую­ щих соединений кислой эфирной фракции № Вещество 1 2 1 D5 Бензойная кислота СТ (400ng) 2 Фенол 3 п-Крезол 4 Бензиловый спирт 5 Бензойная кислота 6 п-Гидрокси-бензойная кислота 7 2,4-Дигидрокси-бензойная кислота 8 3,4-Дигидрокси-бензойная кислота 9 Фенил-уксусная кислота 10 п-Гидроксифенил-уксусная кислота 11 2-Гидрокси-фенил-уксусная кислота 12 Фенил-пропионовая кислота 13 п-Гидроксифенил-пропионовая кислота 14 Цинамовая кислота (Ph-3:2) 15 п-Гидроксифенил-цинамовая кислота 16 Фенил-молочная кислота 17 п-Гидроксифенил-молочная кислота 18 Фенил-пировиноградная кислота 19 п-Гидроксифенил-пировиноградная кислота 20 N-Ацетил-тирозин 21 о-Гидроксифенил-уксусная кислота 22 п-Г идрокси-бензальдегид 23 1-Индол-уксусная кислота 24 3-И ндол-уксусная кислота 25 Антраниловая кислота 26 Янтарная кислота 27 Фумаровая кислота 28 2-Кето-глутаровая кислота 29 2-Гидрокси-глутаровая кислота 30 2-Гидрокси-масляная кислота 31 Молочная кислота 44 МУ 2.32.2789— 10 Продолжение 1 2 32 2-Гидрокси-3-метил-бутановая кислота 33 2-Гидрокси-гексановая кислота 34 Яблочная кислота 35 Гомованилиновая кислота 36 Метилмалоновая кислота 37 Дигидрокси-уксусная кислота 38 Метилциклоундецен 39 Нонановая кислота 40 Декагидронафталин 41 Тетрадекан 42 Додеканол 43 Метоксициннамовая кислота 44 Лауриновая кислота 45 Миристиновая кислота 46 Пальмитолеиновая кислота 47 ПимелиноваяС7дкк кислота 48 Пальмитиновая кислота 49 Фталевая кислота 50 АзелаиноваяС9дкк кислота 51 СебациноваяСЮдкк кислота 52 Стеариновая кислота 53 Эйкозанол(С20 спирт) 54 Эйкозановая кислота 55 Докозанол 56 Сквален 57 Ситостерол 58 Urs-12-en 59 Friedoolean-6-en 60 Лакостерилацетат 61 Fridoolean-4-en-3-on 62 Углеводороды Примечание. Список расширяется при появлении новых веществ в про­ бах, так как масс-спектрометрический анализ позволяет идентифицировать но­ вые соединения по их масс-спектру в базе данных NIST. 45 МУ 2.3.2.2789— 10 Требование техники безопасности • Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. лету­ чими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу. • Необходимо соблюдать требования техники безопасности при ра­ боте с электроприборами. 6. 1. 4.2. Упрощенный метод анализа органических кислот Метод состоит из следующих этапов:

1. Пробоподготовка. Во флакон объемом 20 мл на аналитических весах отбирают объем культуральной жидкости, соответствующий на­ веске 500 мг и добавляют 20 мл дистиллированной воды. Для более луч­ шей экстракции пробы помещают сначала на шейкер, а затем в УЗ-баню. Затем пробы центрифугируют и отбирают 1 мл в пробирки-виалы для дальнейшего анализа на ВЭЖХ.

2. Приготовление фосфатного буфера для хроматографии. 0,10 г дигидрофосфата калия растворяют примерно в 80 мл бидистиллирован- ной воды, добавляют ортофосфорную кислоту до pH 2,5 и доводят объ­ ем бидистиллированной водой до 100 мл, фильтруют через фильтр с размером пор 45 мкм.

3. Определение. Используется ВЭЖХ в сравнении со стандартами органических кислот в соответствии с Р 4.1.1672-03 «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных до­ бавок к пище», Минздрав России, Москва 2004. Приготовленную пробу помещают в термостат вместе со стандар­ том, при этом делают две параллельных постановки. Объём ввода 20 мкл. Длина волны 210 нм. Подвижная фаза: 100 % элюирование фосфатным буфером (А). Ко­ лонка: Atlantis С 18, 4 ,6 x 2 5 0 мм, 5мкм; скорость потока -0,9 мл/мин. Общее время анализа составляет 12 мин. Ошибка метода ± 10 %. 6.1. 4. 3. Метод анализа биогенных аминов состоит из следующих этапов

1. Пробоподготовка. Штаммы выращивают на оптимальных для их роста питательных средах, при необходимости культивируют в пище­ вых субстратах, составляющих основу пробиотического продукта (мо­ локо, соевое молоко). Культуральную жидкость обрабатывают трихлоруксусной кисло­ той (ТХУ) при нагревании, доводя её концентрацию до 5 %, отбирают аликвоту, которую последовательно обрабатывают в соответствии с ме­ тодикой определения содержания биогенных аминов (тирамина, кадаве- 46 МУ 2.3,2.2789— 10 рина, путресцина, спермидина, спермина, гистамина), включающим в себя стадию получения дане ил-производных биогенных аминов.

2. Определение. Проводят разделение дансил-производных методом ВЭЖХ в сравнении с вводимыми стандартами, согласно Р 4.1.1672—03 «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологиче­ ски активных добавок к пище», Минздрав России, Москва 2004, с. 222. Подвижная фаза: 55 % гексан : 45 % этилацетат, колонка «Kromasil S ib 4,6 х 250 мм, флуориметрический детектор, длина возбуждающего излучения 335 нм, длина волны эмиссии 470 нм. Предел обнаружения 0,03 мг/кг для тирамина и 0,1 мг/кг для гиста­ мина. Работа проводится с использованием защитных средств и в вытяж­ ном шкафу.

3. Для интерпретации используют контроль питательной среды (субстрата) без культуры (фон), вычитая полученные значения из значе­ ний для штамма. 6.1.4.4. Метод анализа аммиака и других продуктов разложения белка (индола, сероводорода) Допускается проводить анализ качественным способом при куль­ тивировании штаммов, при этом об образовании газообразных побоч­ ных продуктов разложения белка (аммиак, индол, сероводород) судят по изменению цвета индикаторной бумаги, помещенной под пробку про­ бирки с исследуемой культурой. Готовят индикаторную бумагу из нарезанной на полоски фильтро­ вальной бумаги размером 3 x 1 0 мм, которую пропитывают следующи­ ми индикаторными растворами: а) Индикаторная бумага на аммиак по методу Крупа: смешивают 2 мл 1 %-го водного раствора фуксина, приготовленного из насыщенного спиртового раствора, с 1 мл 3 %-й серной кислоты. После того как рас­ твор приобретет бурую окраску, им пропитывают фильтровальную бу­ магу и высушивают. Бумага должна быть бесцветной или слегка желтой. Хранят бумагу в банке с притертой пробкой. б) Индикаторная бумага на сероводород: полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца (в 100 мл дис­ тиллированной воды 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислой соды) и высушивают. в) Индикаторная бумага на индол по Морелю: полоски фильтро­ вальной бумаги пропитывают насыщенным водным раствором щавеле­ вой кислоты и высушивают. 47 МУ 2.3.2.2789— 10 Для культивирования штаммов используют мясо-пептонный буль­ он на переваре Хоттингера, содержащий повышенное количество сво­ бодного триптофана. В пробирки с бульоном вносят по 1 петле суточной исследуемой культуры, выросшей на чашках с МПА (среде МРС, среде БС). Тотчас же после посева приготовленные полоски индикаторной бумаги помещают в пробирку так, чтобы они не касались питательной среды. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в те­ чение 24—48 ч. При образовании аммиака индикаторная бумага красне­ ет, сероводорода - чернеет, при выделении индола бумага приобретает сиреневый или малиновый цвет. При постановке методов используют контроль реакции на среде без культуры, а качество среды и реагентов на полосках - контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. 6.1.4.5. Продукция пероксида водорода

1. Сущность метода При культивировании бактерий на питательной среде, содержащей фермент пероксидазу и индикатор на кислород, образование пероксида водорода бактериями определяется по специфическому окрашиванию колоний в синий цвет.

2. Перечень аппаратуры, материалов, лабораторной посуды, реак­ тивов, инструментов, питательных сред, реагентов и т. п. Аппаратура: автоклав, термостат (инкубатор), эксикатор. Лабораторная посуда: чашки Петри, пробирки. Реактивы: фермент пероксидаза хрена, тетраметилбензидин (бензи- дин). Инструменты: бактериологическая петля, спиртовка.

3. Подготовка к анализу Контрольные культуры микроорганизмов: Bifidobacterium bifidum 791, В.bifidum 1, B.longum В379М, B.longum 2C, L acidophilus (helveticus TI1DNKI. Питательные среды. Для бифидобактерий - среда БС (ФГУП Госу­ дарственный научный центр прикладной микробиологии, г. Оболенск); для лактобацилл - МРС (DifcoTM Lactobacilli MRS Agar, BD, USA). В питательные среды предварительно вводятся: 5 мг тетраметил- бензидина (бензидина) и 0,5 мг пероксидазы хрена на 20 мл агара. Условия культивирования: для бифидобактерий - в анаэробных ус­ ловиях с использованием анаэростата (BBL® USA) и газогенераторных 48 МУ 2.3.2.2789— 10 пакетов GasPak Plus (BBL® USA). Лактобациллы выращиваются как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Оптимальная температура культивирования 37 °С, время культивирования 24— 48 ч.

4. Методика проведения исследования 1 этап - посев петлей исследуемой культуры методом штрихов на питательную среду, содержащую пероксидазу хрена и бензидин (тетра- метилбензидин). 2 этап - культивирование лактобацилл при 37 °С в течение 24— 48 ч в эксикаторе со свечей. Бифидобактерии культивируются в анаэро- стате. 3 этап - учет результатов: колонии, образующие пероксид водоро­ да (Н20 2), синего цвета. Остальные колонии бесцветные.

5. Требования безопасности Микробиологические исследования проводятся с соблюдением Санитарных правил по безопасности работ с микроорганизмами III— IV групп патогенности. 6.1,5. Определение способности к деконъюгации желчных солей Устанавливается путем анализа на скорость роста штамма- кандидата в среде с добавлением пузырной желчи. 6.1.6. Определение способности к гидролизу муцина Устанавливается но способности штамма деградировать in vitro муцин желудка свиньи или гликопротеины кишечника человеческого происхождения. Количество муцина в культуральной жидкости опреде­ ляют спектрофотометрическим методом по разнице концентрации белка в исходной среде и надосадочной жидкости, образовавшейся после ки­ слотного осаждения муцина. Для опыта используется две параллельных пробы - культуральной жидкости предварительно выращенного в среде с добавленным гликопротеином штамма и аналогичной питательной среды с добавленным гликопротеином без штамма. Аппаратура, материалы и реактивы * Фотоэлектроколориметр Весы лабораторные 2 класса точности с наи­ большим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104 Весы лабораторные 3 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г ГОСТ 24104 * Допускается использовать других аппаратуру, материалы и реактивы с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 49 МУ 2.3,2.2789— 10 Весы лабораторные 4 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г ГОСТ 24104 Пробирки стеклянные с притертыми пробками диаметром 2 см, высотой 20 см ГОСТ 25336 Колбы мерные 2-го класса точности вместимо­ стью 100— 1 000 см3 с притертыми пробками ГОСТ 1770 Воронки стеклянные диаметром 7 см ГОСТ 25336 Цилиндры мерные 2-ого класса точности вместимостью 100,250, 500, 1 000 см3 ГОСТ 1770 Колбы конические вместимостью 150 см3 ГОСТ 25336 Пипетки 2-го класса точности вместимостью 1,2,5,10, 20, 25 см3 ГОСТ 20292 Палочки стеклянные длиной 18—20 см Дозаторы вместимостью 10 см3 с погрешно­ стью не более I % Бумага фильтровальная лабораторная марки ФОБ ГОСТ 12026 Вода дистиллированная ГОСТ 6709 Препарат свиного гликопротеина (муцина) Препарат гликопротеина (муцина) человека Подготовка материалов Готовят параллельно по две опытные пробы (культуральной жид­ кости с штаммом и культуральной жидкости без штамма), первая из ко­ торых содержит культуральный фильтрат и рабочий реагент, вторая - надосадочную жидкость культурального фильтрата и рабочий реагент; стандартную пробу, содержащую водный раствор гликопротеина кон­ центрацией 0,25 г/л и рабочий реагент; и контрольную пробу, содержа­ щую дистиллированную воду и рабочий реагент. Рабочий реагент полу­ чают смешиванием раствора бромфенолового синего в концентрации 1,2 г/л и буферного раствора (pH 3,0), содержащего 320 ммоль/л лимон­ ной кислоты и 160 ммоль/л натрия фосфата в соотношении 2 :23. Со­ держимое каждой пробы перемешивают, инкубируют 10 мин. Ход определения Определяют оптическую плотность опытных и стандартной проб против контрольной пробы при длине волны 620 нм. Концентрацию белка в фильтрате и надосадочной жидкости рассчитывают, г/л: С = (0/7оп. : ОПСТ) х 0,25, где ОПоа - оптическая плотность опытной пробы; £>#ст - оптическая плотность стандартной пробы. 50 МУ 2.3,2.2789— 10 За окончательный результат принимается разность значений кон­ центрации белка в культуральной жидкости с штаммом и без штамма. Исследование проводится в трехкратной повторности. При получении статистически значимой разности в пользу штамма, последний призна­ ют способным к деградации муцина. Требования безопасности • Работы с концентрированными кислотами, щелочами и другими летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу. • Необходимо соблюдать требования техники безопасности при ра­ боте с электроприборами. б. /. 7. Определение способности пробиотических штаммов ингибировать представителей нормофлоры кишечника in vitro Определение взаимодействия пробиотических штаммов с предста­ вителями индигенной микрофлоры определяют одновременно двумя методами: перпендикулярных штрихов и путем натекания бляшек.

1. Сущность метода При одновременном посеве исследуемой и тестовой культуры мик­ роорганизмов путем перпендикулярных штрихов можно выявить их влияние друг на друга. При антагонизме через сутки совместного куль­ тивирования будут наблюдаться зоны задержки роста.

2. Перечень аппаратуры, материалов, лабораторной посуды, реак­ тивов, инструментов, питательных сред, реагентов и т. п. Аппаратура: автоклав, термостат (инкубатор), эксикатор со свечей, ультрафиолетовая лампа Лабораторная посуда: чашки Петри, пробирки Реактивы: 0,9 % раствор NaCl Инструменты: бактериологическая петля, спиртовка.

3. Подготовка к анализу Исследуемые культуры микроорганизмов: бифидобактерии и лак­ тобациллы. Тест-культуры: Lactobacillus acidophilus, выделенная из иммуноби­ опрепарата «Линекс» (Словения), производственный пробиотический штамм человеческого происхождения L.plantarum 8RA-3, музейные штаммы лактобацилл (№№ 7, 11,12, 35, 39, 98, 291, 17, 32, 46) и энтеро­ кокков (№№ 16, 37, 42, 68), выделенных из полости рта и фекалий здо­ ровых людей (музей кафедры микробиологии, вирусологии и иммуноло­ гии Тверской медицинской академии). 51 МУ 2.3.2.2789— 10 Питательные среды. Для бифидобактерий среда БС (ФГУП Госу­ дарственный научный центр прикладной микробиологии, г. Оболенск); для лактобацилл - MFC (DifcoTM Lactobacilli MRS Agar, BD, USA). Условия культивирования: для бифидобактерий - в анаэробных ус­ ловиях с использованием анаэростата (ВВШ USA) и газогенераторных пакетов GasPak Plus (BBLd> USA). Лактобациллы выращиваются как в аэробных, так и в анаэробных условиях, а также в эксикаторе со свечей. Оптимальная температура культивирования 37 °С, время культивирова­ ния 24— 48 ч.

4. Методика проведения исследования 1 этап. Посев перпендикулярными штрихами Посев исследуемой культуры в виде штриха по диаметру на чашку с оптимальной питательной средой. Перпендикулярно первому посеву делаются штрихи других исследуемых микроорганизмов. Посев методом совместного культивирования путем натекания бляшек одной культуры на другую На питательную среду петлей наносят суточную бульонную куль­ туру исследуемых микроорганизмов. После подсушивания рядом на расстоянии 0,5 см нанося петлей каплю другой исследуемой культуры так, чтобы вторая капля затекла на первую до середины и подсушивают. 2 этап. Культивирование при 37 °С в течение 24—48 ч. 3 этап. Учет результатов: измеряют зону задержки роста культур в мм. Пример записи результатов для штаммов Bifidobacterium bifidum 791, В. bifidum 1, В. longum В379М, B.longum 2C, L. acidophilus {helveticus ТШ) NK\ приведен в табл. 5. Таблица 5 Пример записи результатов изучения способности ингибиции нормофлоры методом штрихов Зоны задержки роста в мм № Тестируемые п/п культуры В. bifidum В. bifidu В. longum В. longum L. acidophilus 791 m1 В379М 2С (helveticus ТШ) NK1 1 2 3 4 5 6 7 1 Lactobacillus 0 0 0 0 0 acidophilus (шт. Линекс) 2 L. plantarum 0 0 0 0 0 8RA-3 3 Lactobacillus 0 0 0 0 0 acidophilus 7 52 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение табл. 5 1 2 3 4 5 6 7 4 L. acidophilus 11 0 0 0 0 0 5 L. acidophilus 12 0 0 0 0 0 6 L. acidophilus 35 0 0 0 0 0 7 L. acidophilus 39 0 0 0 0 0 8 L. acidophilus 98 0 0 0 0 0 9 L. acidophilus 291 0 0 0 0 0 10 L. acidophilus 17 0 0 0 0 0 11 L. acidophilus 32 0 0 0 0 0 12 L. acidophilus 46 0 0 0 0 0 13 Enterococcus 0 0 0 0 0 faecalis 16 14 E. faecalis 37 0 0 0 0 0 15 E. faecalis 42 0 0 0 0 0 16 E. faecalis 68 0 0 0 0 0

5. Требования безопасности Микробиологические исследования проводятся с соблюдением Са­ нитарных правил безопасности работ с микроорганизмами III—IV групп патогенности. 6.1.8. Определение степени иммуномодуляции 6.1.8.1. Методы скрининга пробиотических штаммов в отношении их иммуномодулирующей активности Для оценки влияния производственно перспективных штаммов не­ посредственно на лимфоциты и на фагоциты, осуществляющие презен­ тацию бактериального антигена лимфоцитам, используют модели in vitro 2 вариантов стимуляции лейкоцитов человека пробиотическими штаммами:

1. Прямая стимуляция лимфоцитов в культуре инактивированными бактериями: • регистрация эффекта по продукции цитокинов ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-6, ФНОа; • сравнение эффекта со стимуляцией Л ПС, ФГА и ФМА с иономи- цином; • сравнение уровня продукции цитокинов лейкоцитами цельной крови и лимфоцитами, выделенными из нее.

2. Фагоцитоз исследуемых штаммов-пробиотиков: 53 МУ 2.3*2.2789— 10 • регистрация эффекта по продукции ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа; • сравнение эффекта с эффектом, наблюдаемым при фагоцитозе S.aureus. Степень и характер активации лимфоцитов и фагоцитов определя­ ется по продукции ими провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека Лимфоциты выделяют центрифугированием в градиенте плотности. Гепаринизированную кровь, разведенную 1 : 1 фосфатно-солевым буфе­ ром (ФСБ) до объема 6 мл, наслаивают на 2 мл Immunoprep (d - 1,077) в центрифужной пробирке, центрифугируют при 400 g 20 мин. Слой лимфоцитов (интерфазу) собирают пипеткой, отмывают сре­ дой RPMI 1 640, центрифугируя 10 мин при 200 g. Рабочая взвесь лим­ фоцитов имеет концентрацию 2 * 106 в пулированной сыворотке чело­ века. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека Осадок лейкоцитов и эритроцитов, полученный на предыдущем этапе, доводят до исходного объема взятой крови и смешивают с 1/10 объема 10% желатина. Смесь инкубируют при 37 °С 30 мин для рас­ слаивания на лейкоциты и эритроциты, затем собирают верхний слой, не содержащий эритроцитов, отмывают ФСБ, центрифугируя 10 мин при 200 g. Рабочая взвесь нейтрофилов имеет концентрацию 3 х 106 в пули­ рованной сыворотке человека. Контроль чистоты фракций на гематологическом анализаторе Micros АВХ60 показывает значения 90—95 % для лимфоцитов и нейтро­ филов крови, полученных описанным методом. Фагоцитоз пробиотических бактерий 200 мкл рабочей взвеси нейтрофилов и 100 мкл рабочей взвеси бак­ терий смешивают в центрифужной пробирке, и серию таких пробирок с разными штаммами бактерий или с лейкоцитами от разных доноров ин­ кубируют при 37 °С 20 ч. Данный срок в ходе подготовительного этапа был определен как оптимальный для определения продукции ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа. По окончании инкубации пробирки центрифугируют 10 мин при 200 g, супернатант собирают дня определения концентрации цитокинов, из осадков приготовляют мазки. При микроскопии мазков возможно оценить параметры фагоцитоза (%, фагоцитарное число). Продукцию цитокинов в процессе фагоцитоза следует соотносить со спонтанной продукцией нейтрофилами того же донора. 54 МУ 2.3.2.2789— 10 Стимуляция культуры лимфоцитов пробиотическими бактериями В лунку 96-луночного культурального планшета вносят 140 мкл RPM1 1640 с гентамицином, 20 мкл рабочей взвеси лимфоцитов или цельной крови, 20 мкл стимулятора (рабочей взвеси бактерий или ФГА или ЛПС). Планшет инкубируют при 37 °С в инкубаторе С02 от 24 до 96 ч. По окончании этого срока супернатанты собирают, разливают пор­ циями и хранят при -3 0 °С до исследования. Продукцию цитокинов, стимулированную пробиотическими штаммами, сравнивают с их спон­ танной продукцией. Для определения концентрации цитокинов (ИФНу, ФНОа, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-8) методом ИФА используют тест-системы: ЗАО«Вектор-Бест» (Новосибирск), ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). По спектру и интенсивности продукции цитокинов судят об имму­ номодулирующих свойствах того или иного штамма. б. 1.8.2. Способность к стимуляции секреции цитокинов Штаммы подвергают исследованию на их способность стимулиро­ вать секрецию цитокинов in vitro при стимуляции культуры перифери­ ческих мононуклеарных клеток человека (ЬРВМС). Уровни цитокинов ИЛ-10, ИЛ-12, ТНФ альфа, интерферон гамма измеряют в ИФА в супер­ натантах штаммов, проинкубированных совместно с ЬРВМС 24 ч. Опре­ деление проводится в соответствии с прилагаемой инструкцией к тест- системам для ИФА. Полученный профиль уровней цитокиновой активности устанавливает­ ся для минимально 3-х концентраций штаммов - 107, 108 и 5 * 109 КОЕУмл питательной среды. Исследование проводится с использованием референтных штаммов аналогичных видов в 5-кратной повторности. Рассчитывается соотношение величин активности ИЛ-10 и ИЛ-12, по величине которого штаммы подразделяют на высоко активные - 90— 110%, средние - 20— 40 %, низкоактивные - 0—20 %. Активность выше 110 % является избыточной. 6.2. Основные методы исследования безопасности штаммов в тестах in vivo 6.2.1. Определение способности к гидролизу мукозного слоя стенки кишечника Устанавливается по способности деградировать гликопротеины кишечника у крыс при кормлении (или интрагастральном введении) взвесью штамма с концентрацией клеток от 5 х Ю8 до 1011 КОЕ/мл(г). 55 МУ 2.3.2.2789— 10 Используется методика по п. 6,1.7 после предварительной подго­ товки кусочков слизистой оболочки слепой кишки крыс. 6.2.2. Способность к транслокации у иммунодефицитных животных Проводится при использовании общепринятых методов посева внутренних органов (печень, селезёнка, лимфоузлы) иммунодефицит­ ных лабораторных животных, получавших интрагастрально взвесь ис­ пытуемых штаммов по п. 6.3.2Л. Органы животных должны быть сте­ рильны. 6.2.3. Изучение фагоцитарной активности штаммов Фагоцитарную активность штаммов изучают, используя макрофаги периферической крови, или перитонеальные макрофаги. Изучение проводится на элементах белой крови кроликов, белых мышей, реже морских свинок. Количество животных в группе определя­ ется условиями эксперимента, но не должно быть менее 2—3 для круп­ ных (кролики) и 6 для мелких животных. Контролем служат интактные животные. Сущность метода Выращенные на плотной или жидкой питательной среде культуры штамма доводят стерильным физиологическим раствором по оптиче­ скому стандарту мутности до концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarlane (N1-7). Подготовленные взвеси хранят в холодильнике не более 3 сут, затем, в зависимости от условий эксперимента, готовят но­ вые разведения культур. Животным опытных групп ежедневно через иглу с наплавленной оливой вводят внутрижелудочно по 0,5 см3 взвеси с концентрацией кле­ ток, зависящей от условий анализа. Длительность введения определяет­ ся предполагаемой длительностью потребления пробиотика. Контроль­ ным животным в тех же объемах и в те же сроки выпаивают через иглу стерильный физиологический раствор. Изучение фагоцитарной активности макрофагов периферической крови По окончании исследований у животных опытных и контрольных групп проводят забор периферической крови - у кроликов из ушной ве­ ны, у мышей - из хвостовой. Если невозможен забор крови из перифе­ рической вены, животных наркотизируют эфиром и кровь берут мето- 56 МУ 2.3.2.2789— 10 дом декапитации. Для получения больших порций крови используют объединенные пробы. Для предотвращения свертывания крови шприц и иглы для забора крови промывают гепарином с активностью 5— 10 ед/мл или цитратом натрия (0,8 % раствор лимонно-кислого натрия). Края пробирки и саму пробирку смачивают гепарином или цитратом натрия. Полученную кровь центрифугируют 10 мин при 150 g. На границе между осадком эритроцитов и плазмой отбирают тонкую белую про­ слойку, содержащую лейкоциты. Примесь эритроцитов можно разру­ шить добавлением 0,83 %-го раствора хлорида аммония. Клетки дважды отмывают изотоническим буферным раствором. Отмытые клетки ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе и подсчитывают их концентрацию в камере Горяева. Стерильным забуфе- ренным фосфатами физиологическим раствором доводят количество лейкоцитов до 2— 4 х 106/мл. Суточные культуры живых или убитых прогреванием при темпера­ туре (90 ± 2) °С микроорганизмов отмывают центрифугированием при 1 500 об./мин 0,9 %-м раствором хлорида натрия. Концентрацию суспен­ зии микробных клеток доводят по оптическому стандарту мутности до значения 10 ед. В пробирки с коническим дном вносят по 2 мл взвеси лейкоцитов и 0,1 мл взвеси объектов фагоцитоза (микробные культуры). Смесь лейко­ цитов с объектами фагоцитоза помещают в термостат при (37 ± 1) °С на 30 мин при встряхивании на шуттель-аппарате. По окончании сроков культивирования из пробирок готовят мазки, фиксируют метанолом или этанолом, окрашивают по Романовскому-Гимза и проводят микроско­ пию. При учете результатов необходимо просмотреть под микроскопом не менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количе­ ство микробов в одном макрофаге. Подсчитывают процент фагоцити­ рующих клеток (фагоцитарная активность, ФА), среднее число погло­ щенных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ) и фагоцитарное число. Допускается равные количества цитратной (0,8 % лимонно-кислого натрия) крови лабораторного животного и суспензии объектов фагоци­ тоза смешивать в пробирке, и смесь инкубировать при 37 °С в течение 30 мин, а затем готовить мазки, подсчитывая 25 нейтрофильных грану- лоцитов в различных секциях препарата. 57 МУ 2.3.2.2789— 10 Определение макрофагальной активности на модели перитонеаль­ ных макрофагов От забитых животных опытных и контрольных групп получают пе­ ритонеальный экссудат (ПЭ) путем 2—3-кратного промывания брюш­ ной полости мышей средой 199, содержащей 5 ME гепарина в 1 мл. ПЭ собирают в центрифужные пробирки, стоящие на льду. После центри­ фугирования ПЭ при 150 g в течение 10 мин клетки ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Концентрацию клеток доводят до 2 млн кл/мл и разливают по 2 мл в пробирки. Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температу­ ре (90 ± 2) °С микроорганизмов отмывают центрифугированием 0,9 %- ным раствором хлорида натрия. Определяют концентрацию суспензии микробных клеток по стандарту оптической плотности, доводят сте­ рильным физиологическим раствором или фосфатным буфером по оп­ тическому стандарту мутности до значения 10 ед. В пробирки с клетками ПЭ вносят 1 мл взвеси микроорганизмов и ставят в термостат при (37 ± 1)°С на 30— 60 мин, после чего делают мазки, высушивают на воздухе, фиксируют метанолом, этанолом. Затем окрашивают азурэозином по Романовскому-Гимза. При учете результа­ тов необходимо просмотреть под микроскопом не менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количество микробов в одном макрофаге. Подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и фагоци­ тарное число. Контролем служат показатели фагоцитарной активности, установ­ ленные у контрольных животных. Учет результатов Оценивают фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцити­ рующих клеток из общего числа макрофагов и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество микробных частиц, поглощенных 1 активным макрофагом. Полученные по опытной группе данные сравнивают с ре­ зультатами, полученными от контрольных животных и разницу выра­ жают в процентах, 6.3. Дополнительные методы исследования безопасности штаммов 6.3.1. Тестирование in vitro 6.3.1.1. Определение гемолитической активности Продукция гемолизинов считается фактором патогенности, в связи с чем продукция гемолизина во многих случаях является маркером ви­ рулентности. 58 МУ 2.3.2.2789— 10 О пределение гем олитической активности проводится на 5 % -м кровяном агаре. П ри продукции гем олизина через 18— 24 ч при культи­ вировании чаш ек П етри при оптим альной температуре развития гем оли­ за вокруг колоний образуется видимая зон а гемолиза. А ппарат ура, м ат ериалы г лаборат орная посуда, реакт ивы и пит ат ельны е среды , используем ы е для определения пат огенны х свойст в ш т ам м а и конт рольного ш т ам м а аналогичного ви д а Аппаратура и инструментарий А нализатор потенциом етрический, погреш ность изм ерений PH ± 0,01 ГОСТ 19881— 74 Ш каф суш ильны й стерилизационны й С С -80П или других м арок, позволяю щ ий поддерж ивать тем пературу (160 ± 5) °С ТУ 64-1-28-70— 76 Терм остат, позволяю щ ий поддерж ивать рабочую тем пературу 28— 37 °С с отклонением от заданной ± 1 °С Баня водяная с подогревом ГО СТ 12026— 76 Весы лабораторны е общ его назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольш им пределом взвеш ивания 200 г ГО СТ 24104— 88 С терилизаторы паровы е м едицинские или аналогичны е ГОСТ 19569— 89Е Д истиллятор, обеспечиваю щ ий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709— 72 Х олодильник бы товой электрический М икроцентриф уга типа «Э ппендорф » П инцет м едицинский ГО СТ 21241— 89 Н ожницы м едицинские ГО С Т 21239— 89 С кальпель хирургический, 15 см ГО С Т 21240— 89 Ш тативы для пробирок * Допускается использовать других аппаратуру, материалы, реактивы и питательные сре­ ды с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. Питательные среды и биологические препараты импортного производства долж­ ны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, ут­ вержденной в установленном порядке. 59 МУ 2.3.2.2789— 10 Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026—76 Бутыли стеклянные для химических реактивов Марля медицинская ГОСТ 9412— 11 Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770—74 Воронки стеклянные ГОСТ 25336— 82 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556—81 Полистироловые планшеты U-образные Пробирки типов П1, П2 ГОСТ25336— 82 Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147—80 Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932—90 Микробиологические петли Фломастеры-маркеры Реактивы и питательные среды Агар микробиологический ГОСТ 17206— 84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709—72 D-глюкоза, ч ГОСТ 6038—79 D-манноза, хч ТУ 6-09-22-98—79 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198—75 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493—75 Кислота соляная, хч ГОСТ 3118—77 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328—77 Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300— 87 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652—2000 Экстракт дрожжевой Триптон Питательные среды для опытного и контрольных штаммов: для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97 для определения энтеробактерий ТУ 9229-072-00419785-97 для определения дрожжей и микроскопических ТУ 9229-083-00419785-97 грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.) для определения S. aureus (типа Байрд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1, п. 5.4 для выращивания бифидобактерий, 60 МУ 2.3.2.2789— 10 молочно-кислых и пропионово-кислых бактерий (ГМС, М17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95 Дезинфицирующий раствор Микробиологические петли Стандарт мутности по McFarland Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-85П 5 % взвесь эритроцитов человека, барана, кролика, морской свинки Проведение анализа Взвесь эритроцитов барана добавляют к охлажденной до 50—55 °С плотной питательной среде с таким расчетом, чтобы взвесь эритроцитов составляла в агаре 5 %. Смесь аккуратно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания чашек на поверхность 5 %-го кровя­ ного агара высевают в разведениях культуру штамма для формирования отдельных колоний. После посева чашки инкубируют в зависимости от вида микроорганизма в течение 24—48 ч при оптимальной для него температуре развития. Затем чашки Петри вынимают из термостата и осуществляют учет результатов. При продукции гемолизина вокруг ко­ лоний формируются зоны гемолиза и тем большие, чем больше гемоли­ зина продуцирует штамм. При выявлении феномена продукции с колонии петлей осуществ­ ляют взятие материала, который высевают в пробирку с 3 мл обогащен­ ной жидкой питательной среды (например, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты). Пробирки инкубируют в течение 24—48 ч при оптимальной темпе­ ратуре, после чего выращенные бактериальные клетки центрифугируют в центрифуге при 6 000 об ./мин в течение 15 мин. Супернатант аккуратно отбирают наконечником микропипетки и переносят в чистую пробирку. Затем готовят 1 %-ю взвесь эритроцитов барана или человека и разливают в пробирки по 1 см3 (макрометод) или в U-лунки планшет по 0,1 см3 (микрометод). Добавляют равный объем супернатанта исследуемого штамма. Ин­ кубируют в течение 1 ч при (35—37) °С и производят предварительный учет результатов. Окончательный учет результатов осуществляют через 18—24 ч инкубации смеси эритроцитов и супернатанта при температуре 18—20 °С. При положительном результате наблюдается гемолиз эритроцитов, представляющий визуально окрашенный прозрачный бульон. Последняя 61 МУ 2.3.2.2789— 10 пробирка или лунка, в которой наблюдается гемолиз, отражает титр (ко­ личество) гемолизина, продуцируемого штаммом. При отрицательном результате на дне пробирки или лунки формируется «пуговка» эритро­ цитов без изменения цвета бульона. Контроли: отрицательный - вместо супернатанта добавляется равный объем стерильного бульона, в кото­ ром проводилось выращивание культур; положительный - штамм гемо- лизпродуцирующей кишечной палочки, выращиваемый в тех же усло­ виях, 6.3,2. Тестирование in vivo 6.3.2.1. Определение безвредности штаммов бифидобактерий и лактобацилл Колонии 24-часовой культуры бифидобактерий или лактобацилл, выращенных на агаризованной МРС-среде, снимают с агара петлей, суспендируют в 0,5 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида до концентра­ ции 100 млн/мл и выдерживают 30 мин при температуре (37 ± 1) °С. По 0,5 мл полученной взвеси вводят с помощью специальной насадки на шприц в желудок 5 белым мышам массой (15 ± 1) г. Наблюдения за мы­ шами осуществляют в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши опыт повторяют на удвоенном количестве животных. Если в повторном опыте ни одна из мышей не погибнет, штамм считают безвредным. В противном случае штамм бракуется, 6.4. Основные методы исследования пробиотического потенциала штаммов 6.4.1. Тестирование in vitro 6.4.1.1. Исследование антагонистической активности Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. в отношении тест-культур патогенных и условно-патогенных микроорганизмов различных групп методом отсроченного антагонизма Сущность метода Сущность метода заключается в том, что при культивировании ис­ следуемой культуры лактобацилл или бифидобактерий на питательной среде при оптимальных условиях в течение суток происходит выделение в среду антибактериальных факторов - комплексных продуктов, состав­ ной частью которых является белковый или полипептидный компонент, ответственный за бактерицидную активность. После ингибиции бакте­ рий парами хлороформа наслаивают полужидкий агар с тестовыми культурами патогенных и условно-патогенных бактерий с последующей 62 МУ 2.3.2,2789— 10 инкубацией при 37 °С 18—24 ч. Антибактериальные вещества задержи­ вают рост тест-культуры и над бляшкой исследуемых микроорганизмов регистрируется прозрачная зона на фоне сплошного роста. Результаты оценивают по диаметру зоны задержки роста в мм. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, инструменты, питательные среды, реагенты* Аппаратура: автоклав, термостат (инкубатор), водяная баня, ульт­ рафиолетовая лампа Лабораторная посуда: чашки Петри, пробирки Реактивы; хлороформ Инструменты: бактериологическая петля, спиртовка, пипетка- дозатор, наконечники Тест-штаммы: S. aureus АТСС 25923, В. subtilis 534, Е. coli АТСС 25922, Sh. sonnei I фазы 941, Р. aeruginosa АТСС 27853, Klebsiella pneu­ moniae К {5054, С. albicans АТСС 885-653. Питательные среды: Для бифидобактерий - среда БС (ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, г. Оболенск); Для лактобацилл - МРС (Difco™ Lactobacilli MRS Agar, BD, USA). Подготовка к анализу Условия культивирования: для бифидобактерий - в анаэробных ус­ ловиях с использованием анаэростата (BBL® USA) и газогенераторных пакетов GasPak Plus (BBL® USA). Лактобациллы выращиваются как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Оптимальная температура культивирования 37 °С, время культивирования 24—48 ч. Ход определения 1 этап. Посев исследуемых культур бляшками размером не более 10 мм, не более трех бляшек на чашку с оптимальной питательной средой. 2 этап. Культивирование при 37 °С в течение 18—24 ч. 3 этап: А. Ингибиция выращенных культур парами хлороформа или УФ-лучами 30 мин; Б. В полужидкий 0,7 %-й МПА при температуре 50 °С вносится 1 мл суспензии тест-культуры, размешивается и наслаивается на выра­ щенные в виде бляшек и убитые исследуемые культуры. 4 Допускается использовать других аппаратуру, материалы, реактивы и питательные сре­ ды с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. Питательные среды и биологические препараты импортного производства долж­ ны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, ут­ вержденной в установленном порядке. 63 МУ 2.3.2.2789— 10 В. Через 15— 20 мин после кристаллизации полужидкого агара чашки переворачивают и культивируют 18— 24 ч при температуре 37 °С. Учет результатов Измеряют диаметр зоны задержки роста тестовой культуры крон­ циркулем в мм. Пример записи результатов испытаний антагонизма приведен в табл. 6. Таблица 6 Запись результатов определения антагонизма Зоны подавления роста тест-культур в мм Ха Исследуемые S.aureus Sh.son- Р. aeru­ Kleb­ C.albi- п/п культуры B.subti- E.coli nei I ginosa siella cans АТСС lis 534 АТСС фазы АТСС pneu­ ATCC 25923 25922 moniae 941 27853 Kt 5054 885-653 1 B.bifldum 791 20 10 12 23 27 20 0 2 B.bifldum 1 20 30 28 26 28 22 6 3 B.longum 25 23 26 26 23 21 6 В379М 4 B.longum 2C 20 26 30 24 28 21 6 5 L. acidophilus 20 >80 36 >80 >80 50 0 (helveticus TUI) NK1 Интерпретация результатов За положительный результат (наличие антагонистической активно­ сти) принимается размер зоны задержки роста 20 мм. Требования безопасности Микробиологические исследования проводятся с соблюдением Са­ нитарных правил по безопасности работ с микроорганизмами I I I — I V групп патогенности. 6.4.1.2, Определение антагонистической активности штаммов к тест- культурам энтеропатогенных микроорганизмов Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды* Аппаратура и инструментарий Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 ГОСТ 19881— 74 Допускается использовать другие аппаратуру, материалы, реактивы, диагностические тест-системы и питательные среды с аналогичными характеристиками, прошедшие реги­ страцию в РФ в установленном порядке. 64 МУ 2.3.2.2789— 10 Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026—76 Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104—88 Горелка спиртовая ГОСТ 25336 Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709—72 Микроволновая печь для быстрого плавления плотных питательных сред Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284—78 Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов ТУ 16-535—84 Смеситель лабораторный или ступка фарфоровая ГОСТ 9147 Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные ГОСТ 19569—89Е Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру (28—37) °С отклонением от заданной ± 1 °С Холодильник бытовой электрический Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру ( 160 ± 5) °С ТУ 64-1 -28-70—76 Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026—76 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556—81 Воронки стеклянные ГОСТ 25336—82 Колбы мерные, пробирки ГОСТ 25336 Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770—74 Марля медицинская ГОСТ 9412—77 Микробиологические петли Ножницы, скальпель, пинцет ГОСТ 21241 Пипетки вместимостью от 1 до 10 см3 ГОСТ 29227—91 Полистироловые планшеты U-образные Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные 65 МУ 2.3.2.2789— 10 Часть 1. Общие требования ГОСТ 29227—91 Приборы мерные лабораторные стеклянные. Бюретки, пипетки. Технические условия ГОСТ 29162—92 Стекла предметные ГОСТ 9284 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) Холодильник бытовой Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932—90 Стандартный образец мутности на 10 ед ОСО 42-28— 85П Стандарт мутности по McFarland (JSfe 1—7) Реактивы и питательные среды Агар микробиологический ГОСТ 17206— 84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709—72 D-глюкоза, ч ГОСТ 6038—79 D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98—79 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198—75 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493—75 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328—77 Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739—78 Набор реактивов для окраски по Граму Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300—87 Питательные среды Питательные среды ГОСТ 10444.1 и гост 10444.11 Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785—97 Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176—94 Питательные среды для определения ТУ 9229-072-00419785—97 энтеробактерий ГОСТ 29184—91 Среды для определения дрожжей и ТУ 9229-083-00419785—97 микроскопических грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.) Среды для определения S. aureus (типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1, п. 5.4 Среды для выращивания бифидобактерий, молочно-кислых и пропионово-кислых бактерий (ГМС, M l7, MRS) ТУ 10-02-02-789-192—95 66 МУ 2.3.2.2789— 10 Молоко обезжиренное ГОСТ 10444.1 Мясо-пептонный агар ГОСТ 10444.1 Штаммы Штаммы контрольные (референтные) одного и того же вида с ис­ пытуемым, тест-культуры энтеропатогенных штаммов. Тест-культуры энтеропатогенных штаммов, используемые в на­ стоящем разделе, должны иметь паспортные данные и принадлежать к Американской типовой коллекции культур (АТСС) или получены из музея культур Государственного НИИ стандартизации и контроля меди­ цинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и пита­ тельных сред по ГОСТ 10444.1. Культивирование микроорганизмов - по ГОСТ 26670—91. Питательные среды и биологические препараты импортного произ­ водства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установ­ ленном порядке. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя. Сущность метода Антагонистические свойства изолятов молочнокислых бактерий устанавливают методом отсроченного антагонизма и методом лунок. В качестве индикаторных культур (тест-культур) используют виру­ лентные штаммы эшерихий, сальмонелл, стафилококков и др. микроор­ ганизмов, с паспортами, характеризующими их свойства.

1. Метод лунок включает следующие этапы: • подготовку исследуемого антагонистического штамма; • подготовку тест-культур микроорганизмов; • приготовление взвести испытуемого антагонистического штамма; • приготовление взвеси тест-культур (эшерихий, сальмонелл, ста­ филококков или любой другой культуры); • внесение взвеси тест-культур в расплавленный агар; • внесение в лунки в агаре с тест-культурами взвеси антагонисти­ ческого штамма; • инкубацию в термостате; • учет результатов. 67 МУ 2.3.2*2789— 10 Подготовка исследуемых штаммов Отбирают колонию исследуемого штамма 3— 5 генерации двухсу­ точного роста и переносят в бульон МРС. Выращивают при (39,1 ± ОД) °С в течение 46—48 ч. Посевы просматривают на активность роста. Затем двухсуточные расплодки каждого штамма пересевают в полужидкий агар МРС (0,75 % агар) из расчета одна петля культуры на 4,5 мл агара и выдерживают в анаэробном термостате при (39,1 ± ОД) °С в течение 26— 28 ч. Подготовка тест-культур микроорганизмов Отбирают колонии S-формы тест-культуры суточного роста на МПА и готовят взвеси на физиологическом растворе, которые доводят по оптиче­ скому стандарту мутности до значения 10 ед стандарта. Вносят подго­ товленные взвеси в расплавленный и остуженный агар МПА из расчета 2,5—3 мл взвеси на 100 мл агара, разливают по пластиковым чашкам Петри с диаметром дна 9 см (30— 35 см3 агара в каждую чашку), уста­ новленным на строго горизонтальной поверхности, после чего ставят для застывания в бытовой холодильник, затем стерильным пробойником 0 7 мм делают лунки. В каждую лунку вносят мерно по 0,2 мл взвеси испытуемого штамма лактобацилл или бифидобактерий. Чашки помещают в аэробный термостат при температуре (39,05 ± 0,5) °С на 22—24 ч, после чего замеряют зоны задержки роста тест-культур (мм) вокруг лунок с посевами. Учет результатов Учитывают наличие зон задержки роста и диаметры зон с точно­ стью до 1 мм с учетом диаметра самой лунки. К слабым антагонистам относят лактобациллы и бифидобактерии, метаболиты которых образо­ вывают зоны задержки роста тест-культур от 10 до 15 мм, к средним - от 15 до 20 мм, к сильным - более 20 мм.

2. Метод отсроченного антагонизма включает следующие этапы: • подготовку исследуемого антагонистического штамма; • подготовку тест-культур микроорганизмов; • приготовление взвести испытуемого антагонистического штамма; • приготовление взвеси тест-культур (эшерихий, сальмонелл, ста­ филококковой или любой другой культуры); • штриховой посев взвеси штамма антагониста на агар; • инкубация в термостате; • штриховой подсев взвеси тест-культур; • инкубация в термостате; • учет результатов. 68 МУ 2.3.2.2789— 10 Отбирают колонию исследуемого штамма лактобацилл 3—5 гене­ рации двухсуточного роста и переносят в бульон МРС. Термостатируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч. Расплавленный агар Хоттингера разли­ вают по пластиковым чашкам Петри с диаметром дна 9 см (30—35 см3 агара в каждую чашку) и подсушивают в термостате. Культуры штамма лактобацилл, выросшие на жидкой питательной среде, штрихом высе­ вают на поверхность плотной питательной среды. Термостатируют в течение 48 ч, затем 48 ч выдерживают при комнатной температуре (20— 22 °С). Подготовка тест-культур микроорганизмов Отбирают колонии S-формы тест-культуры суточного роста на МПА и готовят взвеси на физиологическом растворе, которые доводят по оптическому стандарту мутности до значения 10 ед стандарта. После этого на поверхность среды перпендикулярно к штриху ан­ тагонистического штамма высевают штрихами индикаторные культуры тест-штаммов. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 24 ч и из­ меряют длину задержки роста тест-культур по штриху в мм. Учет результатов При исследовании антагонизма методом штриховых подсевов к слабым в антагонистическом отношении лактобациллам и бифидобакте­ риям относят культуры, образующие зоны задержки роста индикаторно­ го штамма от 4 до 9 мм, к средним в антагонистическом отношении микроорганизмам относят культуры, образующие зону от 9 до 14 мм, от 14 мм и более - к высокоактивным антагонистам. 6.4.1.3. Определение антагонистической активности бифидобактерий в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов методом развивающихся смешанных популяций Метод пригоден для определения антагонизма консорциума бифи­ добактерий. Антагонистическую активность бифидобактерий определяют мето­ дом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест- штаммов в монокультурах. Для этого 18—24 ч культуру бифидобакте­ рий, выращенную на среде ГМК-2, нейтрализуют 5 %-м раствором ам­ миака до pH 7,0 ± 0,2. Количество клеток 18— 20 ч культуры тест- штаммов 2— 3 генерации смывают со скошенного агара физиологиче­ ским раствором и разводят до густоты 5 ед. по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича (что соответствует 0,5 млрд клеток в 1 мл). Тест культурами служат: Е. coli 0147, S. aureus 209р, Sh.flexneri 337, 69 МУ 2.3.2.2789— 10 Sh. sonnei 174, Proteus vulgaris F-30, полученные из официальных депо­ зитариев микробных культур. В пробирки с 18 мл питательной среды ГМК-2 вносят 2 мл суспен­ зии каждого тест штамма (в одну пробирку засевают один штамм). Для контроля роста этих штаммов пробирки с монокультурами инкубируют при 37 °С в течение 72 ч. В опытные пробирки, засеянные тест-штаммами тем же способом, вносят культуру консорциума бифидобактерий в объеме 1 мл на 18 мл питательной среды. Подготовленные таким образом смешанные посевы инкубируют при 37 °С в течение 72 ч. Через 24, 48 и 72 ч в контрольных и опытных пробирках определя­ ют количество тест-штаммов высевом их на МПА и рассчитывают ко­ эффициент их выживаемости. 6.4.1.4. Тестирование кислотоустойчивости штаммов (к действию желудочного сока) Исследуемый штамм засевают на целлофан, наложенный на агари- зованную среду МРС, с последующим инкубированием при температуре 37 °С в течение 16— 18 ч (для бифидобактерий - в условиях анаэробио­ за). Выросшую культуру смывают забуференным физиологическим рас­ твором и доводят концентрацию до 109 КОЕ/мл. В пробирку с 1 мл бак­ териальной взвеси добавляют 9 мл медицинского препарата желудочно­ го сока, в контроль - 9 мл буферного раствора. Пробирки выдерживают в термостате при 37 °С в течение двух часов, затем определяют количе­ ство жизнеспособных клеток методом серийных разведений с после­ дующим высевом на среду МРС или тиогликолевую. 6.4.1.5. Тестирование устойчивости штаммов к желчи и способности к деструкции холестерина, триглицеридов Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды* Лабораторная посуда и материалы Пробирки стеклянные узкие и широкие ГОСТ 25336—82Е Флаконы стеклянные на 250 и 500 мл ГОСТ 10782—77 Пипетки стеклянные градуированные на 1, 2, 5, 10 мл Чашки Петри стеклянные и пластиковые ГОСТ 25336— 82Е *Допускается использовать другие аппаратуру, оборудование, материалы, реактивы, диаг­ ностические тест-системы и питательные среды с аналогичными характеристиками, про­ шедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 70 МУ 2.3.2.2789— 10 Спиртовки стеклянные лабораторные ГОСТ 25336—82Е Штативы пластмассовые на 6— 40 гнезд Корнцанги и пинцеты для обжига пламенем Спирт 96 % ректификат ГОСТ 5962—67 Набор красителей для окраски препаратов по Граму Масло иммерсионное (кедровое) ГОСТ 137389—78 Наконечники 1—5 мл Бумага фильтровальная ГОСТ 12026—76 Вата медицинская ГОСТ 5556— 81 Марля медицинская ГОСТ 9412—87 Растворы и питательные среды Вода дистиллированная Раствор физиологический Агар мясо-пегтгонный Среда Сабуро плотная Питательные среды для накопления биомассы лактобацилл и бифидобактерий Среда Блаурокка Желчь медицинская консервированная Субстраты холестерина, триглицеридов (донорская плазма, яичный желток) Аппаратура Термостат суховоздушный с диапазоном измерений рабочих температур от комнатной до 60 °С Автоматический биохимический анализатор Центрифуга с угловым ротором на 8 стаканов по 70 мл Питательные среды и биологические препараты импортного произ­ водства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установ­ ленном порядке. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя. Подготовка исследуемых штаммов микроорганизмов Получение культуры 1-й генерации Для получения маточной культуры ампулу или флакон каждого из лиофилизированных штаммов вскрывают стерильно и стерильной пи­ петкой вносят 3—5 мл 0,9 % NaCl. По 0,5— 1 мл полученной взвеси той же пипеткой вносят в 2 пробирки с 9 мл среды Блаурокка. Таким обра­ зом, соотношение культур посевного материала к объему среды состав- 71 МУ 2.3.2.2789— 10 ляло 1 :1 0 или 1:20. Инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ч. Контроль. Для контроля посеянной культуры содержимое каждого флакона высевают по 0,5 мл в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром (МПА) и средой Сабуро. Посевы на МПА инкубируют при темпе­ ратуре (37 ± 1) °С в течение 1 суток, на среде Сабуро - при температуре (22 ± 2) °С в течение 8 суток. Предварительный учет результатов прово­ дят через 48—72 ч. Проводят также микроскопию мазков, окрашенных по Граму. В мазках должны присутствовать только грамположительные лактобактерии и бифидобактерии характерной морфологии. Указанным контролем сопровождают все дальнейшие пересевы культуры. Через сутки инкубации в пробирках наблюдается интенсивный рост с характерным помутнением и частичным обесцвечиванием в верх­ ней части до светло-желтого цвета. При окраске по Граму и микроско­ пии наблюдают средние грамположительные палочки, без спор, распо­ ложенные небольшими цепочками (лактобациллы) и зернистые прямые или изогнутые с утолщением или ветвлением на одном или двух концах, булавовидной или лопатовидной формы, располагающиеся в виде скоп­ лений или отдельных клеток (бифидобактерии). Получение культуры 2-й генерации Из пробирок с выросшими в среде Блаурокка культурами делают пересевы в широкие пробирки со средами для бифидо- и лактобактерий из расчета 6— 8 % к объему среды. Из засеянных пробирок переносят 1 мл культуры в ряд из 10 пробирок со средой Блаурокка, для определе­ ния количества живых микробных клеток культуры 1-й генерации мето­ дом серийных разведений. Ряд последовательных десятикратных разве­ дений готовят до 10~9. Культуры 2-й генерации инкубируют при темпе­ ратуре (37 ± 1) °С в течение суток. Пробирки с десятикратными разведе­ ниями инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 30—40 ч. Затем проводят подсчет выросших характерных колоний в пробирках с последними раз­ ведениями. Через сутки в пробирках наблюдается интенсивный рост с характерным помутнением и частичным обесцвечиванием в верхней части до светло-желтого цвета. Получение культуры 3-й генерации После контроля на отсутствие посторонней микрофлоры в выра­ щенных культурах 2-й генерации, делают засев культур из расчета 6— 8 % от объема среды. Культуру смеси лактобацилл инкубируют в термостате при темпе­ ратуре (37 ± 1) °С в течение 20—24 ч. Посевы штаммов сопровождают 72 МУ 23.2.2789— 10 всеми перечисленными контролями, число микробных клеток в среде устанавливают по оптическому стандарту мутности. Определение устойчивости бактерий к действию желчи Для определения используют свежую культуру 3-й генерации с концентрацией клеток 108—109 КОЕ/мл. В пробирку с 1 мл бактериаль­ ной взвеси добавляют 9 мл желчи медицинской консервированной; кон­ троль - 9 мл физраствора. Все пробирки выдерживают в термостате при 37 °С в течение двух часов, затем определяют количество жизнеспособ­ ных клеток методом серийных разведений. Метод серийных разведений Для определения количества жизнеспособных клеток разливают по 9 мл среды Блаурокка для титрования в 10 пробирок вместимостью 15 мл. В первую пробирку добавляют 1 мл культуры и после перемеши­ вания пипеткой не менее 10 раз, проводят серию 10-кратных разведений. Пипетки меняют после каждого разведения. Пробирки инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 30—72 ч в аэробных или анаэробных условиях в зави­ симости от вида микроорганизма, затем проводят подсчет выросших ха­ рактерных колоний в пробирках с последними разведениями. Опреде­ ляют количество живых бактерий в 1 мл по формуле: X - а ■10", где х - количество живых особей в 1 мл; а - количество колоний в последней пробирке, в которой отмечает­ ся рост; п - степень разведения. При отсутствии дифференцированных колоний рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности, а также контролируют выборочно по микроскопическому препарату. По количеству жизнеспособных клеток делают выводы об устойчи­ вости бактерий к желчи. Определение способности культур к деградации холестерина Способность бактерий к деградации холестерина определяют в пи­ тательной среде, оптимальной для испытуемого микроорганизма. Суб­ страт, содержащий холестерин, добавляют к среде до конечной концен­ трации холестерина 1,5 ммоль/л, но не более 30 %. Культуры бактерий 3-й генерации, содержащих 109 КОЕ/мл, вносят в питательную среду с холестерином в количестве 10% от общего объема. Инкубирование проводят в микроаэрофильных условиях при 37 °С в течение 24 ч. После этого микробные клетки осаждают центрифугированием при 4 000 об./мин 73 МУ 2.3.2.2789— 10 30 мин и определяют содержание холестерина в супернатанте общепри­ нятыми биохимическими методами или на биохимическом анализаторе. Определение способности пробиотических культур к деградации триглицеридов Способность бактерий к деградации триглицеридов определяют в питательной среде, оптимальной для испытуемого микроорганизма. Субстрат, содержащий триглицериды, добавляют к среде до конечной концентрации холестерина 8,5 ммоль/л. Культуры бактерий 3-й генера­ ции, содержащих 109 КОЕ/мл, вносят в питательную среду с триглицери­ дами в количестве 8— 10 % от общего объема. Инкубирование проводят в микроаэрофильных условиях при 37 °С в течение 24 ч. После этого мик­ робные клетки осаждают центрифугированием при 4 000 об./мин 30 мин и определяют содержание триглицеридов в супернатанте общепринятыми биохимическими методами или на биохимическом анализаторе. 6.5. Дополнительные методы исследования пробиотического потенциала штаммов 6.5.1. Тестирование in vitro 6.5.1.1. Изучение антиадгезивных свойств штаммов на клеточных моделях Изучение антиадгезивных свойств лактобацилл и бифидобактерий проводят двумя методами. В первом методе используют прямую реак­ цию антиадгезивной активности культур, во втором - косвенную, ис­ пользуя супернатанты культур лактобацилл и бифидобактерий. 6.5.1.1.1. Прямая антиадгезивная активность. Прямую антиадгезивную активность лактобацилл и бифидобакте­ рий изучают на эритроцитах крови человека, используя культуры лакто­ бацилл, бифидобактерий и культуры тест-штаммов. Метод включает следующие этапы: • приготовление взвести микроорганизма; • приготовление взвеси тест-культур (эшерихий, сальмонелл, стафи­ лококковое или любой другой интересующей исследователя культуры); • приготовление взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки или в лунки планшет суспензии культур микроорганизмов и тест-штамма; • аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии кулыур; • инкубация в термостате; • приготовление мазков; • учет результатов. 74 МУ 2.3.2.2789— 10 Приготовление взвеси микроорганизма Колонии штамма лактобацилл, выращенные на плотной питательной среде, снимают бактериологической петлей и на стерильном забуферен- ном фосфатами изотоническом растворе хлорида натрия готовят суспен­ зию клеток в концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутно­ сти, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Культуры бифидобактерий, выращенные на полужидкой или жид­ кой питательной среде, осаждают центрифугированием при 1 500— 2 000 об./мин в течение 25—30 мин и дважды отмывают от среды куль­ тивирования стерильным забуференным раствором. Полученные взвеси доводят забуференным раствором до концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Приготовление взвеси тест-культур Колонии тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микро­ организмов, выращенные на плотной питательной среде, снимают бак­ териологической петлей и на стерильном забуференном фосфатами изото­ ническом растворе хлорида натрия готовят суспензию клеток в концентра­ ции 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Приготовление взвеси эритроцитов Эритроциты человека 0 (I) группы Кн+ дважды отмывают центри­ фугированием при 1 000 об./мин в течение 30 мин от консервирующего раствора в забуференном фосфатами изотоническом растворе хлористо­ го натрия и готовят 1 %-ю взвесь в стерильном физиологическом рас­ творе. С этой целью к 1 см3 эритроцитов, помещенных в 200 см3 колбу, добавляют 99 см3 стерильного физиологического раствора. Взвесь акку­ ратно перемешивают до образования однородной суспензии. Постановка реакции Приготовленную взвесь эритроцитов вносят по 1 см3 в пробирки или по 0,2 см3 в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензии культур лактобацилл или бифидобактерий и тест- штамма. В параллельный ряд пробирок или лунок вносят по 0,1 см3 взвеси эритроцитов и равный объем взвеси тест-штаммов. Взвеси аккуратно перемешивают и выдерживают в термостате при (39,1 ± 0,1) °С в течение 30 мин при постоянном встряхивании на шут- тель-аппарате. 75 МУ 2.3.2,2789— 10 Для открепления слабо связанных бактерий используют стандарт­ ную процедуру двукратного отмывания центрифугированием при 1 000 об./мин в течение 10 мин в забуференном фосфатами растворе хлорида натрия. Из осадка готовят мазки, высушивают на воздухе, фиксируют эти­ ловым спиртом и окрашивают по Граму, допускается проводить окраску по Романовскому-Г имза. Учет результатов В препаратах подсчитывают число тест-культур, прикрепившихся к 50 эритроцитам в одном поле зрения. Параллельно подсчитывают коли­ чество микроорганизмов, прикрепившихся к эритроцитам в параллель­ ной пробе, в которую не добавляли культуры лактобацилл и бифидобак­ терий. Сравнивают полученные данные и проводят учет результатов в процентах. Если количество клеток тест-штамма, прикрепившихся к 50 эритроцитам в смешанной с культурами лактобацилл или бифидобакте­ рий, меньше, чем в чистой пробе, считается, что культуры лактобацилл или бифидобактерий обладают антиадгезивными свойствами. 6.5.1.1.2. Непрямой метод изучения антиадгезивных свойств Метод включает следующие этапы: • приготовление супернатантов микроорганизма; • приготовление взвеси тест-культур; • приготовление взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки супернатантов и суспензии культуры тест- штамма; • внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов и суспензии культуры штамма; • аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии куль­ туры тест-штамма; • инкубация в термостате; • приготовление мазков; • учет результатов. Приготовление супернатантов микроорганизма Двухсуточные культуры лактобацилл и бифидобактерий на жидкой среде осаждают центрифугированием при 5 000 об./мин в течение 20 мин. Приготовление взвеси тест-культур Колонии тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микро­ организмов, выращенные на плотной питательной среде, снимают бак- 76 МУ 2.3.2.2789— 10 териологической петлей и на стерильном забуференном фосфатами изото­ ническом растворе хлорида натрия готовят суспензию клеток в концентра­ ции 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Приготовление взвеси эритроцитов Эритроциты человека 0 (I) группы Rh+ дважды отмывают центри­ фугированием при 1 000 об./мин в течение 30 мин от консервирующего раствора в забуференном фосфатами изотоническом растворе хлористо­ го натрия и готовят 1 %-ю взвесь в стерильном физиологическом рас­ творе. С этой целью к 1 см3 эритроцитов, помещенных в 200 см3 колбу, добавляют 99 см3 стерильного физиологического раствора. Взвесь акку­ ратно перемешивают до образования однородной суспензии. Внесение в пробирки супернатантов и суспензии культуры тест-штамма Полученные супернатанты лактобацилл или бифидобактерий раз­ ливают по 5,0 см3 в два параллельных ряда пластиковых пробирок, по­ сле чего в них добавляют по 1,0 см3 взвеси культур тест-штаммов. Контролем служит взвесь культур тест-штаммов, подготовленных аналогично и внесенных в пробирки со стерильным забуференным фос­ фатами изотоническим раствором хлорида натрия. Посевы выдерживают в термостате при (39,1 ± 0,1) °С в течение 60 и 90 мин при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате. Культуры осаждают центрифугированием при 1 500—2 000 об./мин в течение 25— 30 мин. Полученные взвеси доводят забуференным фи­ зиологическим раствором до концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1— 7). Внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов и суспензии культуры штамма Приготовленную взвесь эритроцитов вносят по 1 см3 в пробирки или по 0,1 см3 в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензии культуры тест-штамма. В параллельный ряд пробирок или лунок вносят по 0,1 см3 взвеси эритроцитов и равный объем контрольной взвеси тест-штамма. Взвеси аккуратно перемешивают и выдерживают в термостате при (39,1 ± 0,1) °С в течение 30 мин при постоянном встряхивании на шут­ тель-аппарате. Из препаратов готовят мазки, окрашивают их по Граму или по Ро- мановскому-Гимза и подсчитывают количество грамотрицательных 77 МУ 2.3.2.2789— 10 микроорганизмов, прикрепившихся к 50 попавшим в поле зрения эрит­ роцитам. Сравнивают полученные данные и проводят учет результатов в процентах. Если количество клеток тест-штамма, прикрепившихся к 50 эритроцитам в системе метаболит + тест-штамм, меньше, чем в кон­ трольной пробе, считается, что культуры лактобацилл или бифидобак­ терий вырабатывают метаболиты, подавляющие адгезию. 6.5J.2. Исследование адгезивности на клеточных моделях Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды* Аппаратура и инструментарий Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 ГОСТ 19881—74 Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026—76 Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104— 88 Горелка спиртовая ГОСТ 25336 Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709—72 Микроволновая печь для быстрого плавления плотных питательных сред Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284—78 Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов ТУ 16-535—84 Смеситель лабораторный или ступка фарфоровая ГОСТ 9147 Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные ГОСТ 19569—89Е Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру (28—37) °С отклонением от заданной ± 1 °С Холодильник бытовой электрический *Допускается использовать другие аппаратуру, материалы, питательные среды и реактивы с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном по­ рядке, 78 МУ 2.3.2.2789— 10 Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С Центрифуга лабораторная Шуттель-аппарат Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026—76 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556— 81 Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770—74 Марля медицинская ГОСТ 9412—77 Микробиологические петли Ножницы, скальпель, пинцет ГОСТ 21241 Пипетки вместимостью от 1 до 10 см3 ГОСТ 29227- -91 Полистироловые планшеты U-образные Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные ГОСТ 29227—91 Приборы мерные лабораторные стеклянные Бюретки, пипетки ГОСТ 29162— 92 Стекла предметные ГОСТ 9284 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932—90 Стандартный образец мутности на 10 ед ОСО 42-28—85П Стандарт мутности по McFarland Реактивы и питательные среды Агар микробиологический ГОСТ 17206— 84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709—72 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198— 75 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493—75 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328—77 Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739—78 Набор реактивов для окраски по Граму Набор реактивов для окраски по Романовско- му-Гимза Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300— 87 79 МУ 2.3.2.2789— 10 Питательные среды Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176—94 Питательные среды для определения энтеробактерий ТУ 9229-072-00419785—97 Среды для выращивания бифидобактерий, молочно-кислых и пропионово-кислых бактерий (ГМС, M l7, MRS) ТУ 10-02-02-789-192- ■95 Мясо-пептонный агар, приготовленный ГОСТ 10444.1 Материалы и штаммы •формалинизированные эритроциты человека 0 (I) группы Rh+ • 20-дневные куриные эмбрионы • исследуемые штаммы лактобацилл или бифидобактерий • тест-штаммы - в качестве индикаторных используют штаммы видов микроорганизмов, по отношению к которым изучается антиадгезивная ак­ тивность. Питательные среды и биологические препараты импортного произ­ водства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установ­ ленном порядке. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя. Сущность метода Адгезивные свойства лактобацилл определяют на формалинизиро- ванных эритроцитах человека 0 (1) группы Rh+ и на энтероцитах тонко­ го отдела кишечника эмбрионов поросят или 20-дневных эмбрионов цыплят птицы. Выполнение метода включает следующие этапы: • приготовление суспензии микроорганизма; • приготовление взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки или в лунки планшет суспензии культуры штамма; • аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии культур; • инкубация в термостате; • приготовление мазков; • учет результатов. Приготовление суспензии микроорганизма Колонии штамма лактобацилл, выращенные на плотной питатель­ ной среде, снимают бактериологической петлей и на стерильном забуфе- 80 МУ 2.3.2.2789— 10 ренном фосфатами изотоническом растворе хлорида натрия готовят сус­ пензию клеток в концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Культуры бифидобактерий, выращенные на полужидкой или жид­ кой питательной среде, осаждают центрифугированием при 1 500— 2000 об./мин в течение 25—30 мин и дважды отмывают от среды куль­ тивирования стерильным забуференным раствором. Полученные взвеси доводят забуференным раствором до концентрации 1 х 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Приготовление взвеси эритроцитов. Эритроциты человека 0 (I) группы Rh+ дважды отмывают центри­ фугированием при 1 000 об./мин в течение 30 мин от консервирующего раствора в забуференном фосфатами изотоническом растворе хлористо­ го натрия и готовят 1 %-ю взвесь в стерильном физиологическом рас­ творе. С этой целью к 1 см3 эритроцитов, помещенных в 200 см3 колбу, добавляют 99 см3 стерильного физиологического раствора. Взвесь акку­ ратно перемешивают до образования однородной суспензии. Приготовленную взвесь эритроцитов вносят по 1 см3 в пробирки или по 0,1 см3 в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензии штаммов, и взвеси аккуратно перемешивают и выдер­ живают в термостате при (39,1 ± 0,1) °С в течение 30 мин при постоянном встряхивании на шутгель-агтарате. Для открепления слабо связанных бактерий используют стандарт­ ную процедуру двукратного отмывания центрифугированием при 1 000 об./мин в течение 10 мин в забуференном фосфатами растворе хлорида натрия. Из осадка готовят мазки, высушивают на воздухе, фиксируют эти­ ловым спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимза. В препаратах подсчитывают число микроорганизмов, прикрепив­ шихся к 50 эритроцитам в одном поле зрения. Учет реакции проводят по среднему показателю адгезии (СПА). При СПА от 0 до 1,0 микроорга­ низм считали неадгезивным, от 1,01 до 2,00 - низкоадгезивным, от 2,01 до 4,00 - среднеадгезивным и от 4,01 и в более -высокоадгезивным. 6.5.1.2.1. Определение адгезивности штамма и референтного штамма в отсутствии D-маннозы Адгезивные свойства штамма и контрольного штамма первона­ чально определяются методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных (мыши, крысы, кролика, барана и др.) в отсутствии 81 МУ 2.3.2.2789— 10 D-маннозы (маннозо-чувствительная адгезия). При этом метод может выполняться в макро- (пробирках) и микровариантах (планшетах). Выполнение метода включает следующие этапы: • приготовление взвеси эритроцитов; • приготовление суспензии микроорганизма; • внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов; • внесение в пробирки или в лунки планшет суспензии культуры штамма; • аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии культур; • инкубация в термостате при 37 °С в течение 1 ч; • предварительный учет результатов; • инкубация смеси эритроцитов и суспензии микроорганизма при комнатной температуре в течение 18 ч; • окончательный учет результатов. Постановка реакции гемагглютинации с эритроцитами челове­ ка или животных включает следующие этапы. Приготовление взвеси эритроцитов Из тщательно отмытых эритроцитов готовят 1 %-ю взвесь в сте­ рильном физиологическом растворе. С этой целью к 1 cmj эритроцитов, помещенных в 200 см3 колбу, добавляют 99 см3 стерильного физиологи­ ческого раствора. Взвесь аккуратно перемешивают до образования од­ нородной суспензии. Приготовление суспензии культуры штамма Культуру штамма, выращенную на плотной питательной среде, смывают стерильным физиологическим раствором и готовят суспензию клеток в концентрации 1 * 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Приготовлен­ ную 1 %-ю взвесь эритроцитов вносят по 1 см3 в пробирки или по 0,1 см3 в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензию штамма, и взвесь аккуратно перемешивают. Пробирки за­ крывают пробками, планшет - крышкой и помещают в термостат при температуре, оптимальной для исследуемого вида культуры, на 1 ч. После инкубации пробирок или планшета в термостате их выни­ мают и проводят предварительный учет результатов. При наличии адге­ зивных свойств у штамма эритроциты распределяются равномерно по всей поверхности дна. При отрицательном результате все эритроциты собираются в виде точки в середине дна пробирки или лунки планшета. Окончательные результаты исследования учитывают через 18 ч после инкубации пробирок или планшета при комнатной температуре. 82 МУ 2.3.2.2789— 10 6.5.1.2.2. Определение адгезивности штамма и референтного штамма в присутствии D-маннозы При выявлении выраженной гемагглютинационной активности штамма ту же реакцию проводят с использованием D-маннозы для оп­ ределения маннозо-чувствительной или маннозо-резистентной адгезии. Постановка метода в данном варианте проводится аналогично пре­ дыдущему пункту, к которому добавляется ряд пробирок или лунок, в которые внесена 1 % £>-манноза. В случае маннозо-чувствительной гемагглютинации (адгезии) на­ блюдается оседание эритроцитов в виде точки в середине дна пробирки или лунки. Маннозо-устойчивая гемагглютинация наблюдается и при добавлении D-маннозы в реакционную взвесь. При выявлении гемоли­ тической и адгезивной активности у штамма в экспериментах in vitro необходимы исследования на экспериментальных моделях in vivo. 6.5.1.2.3. Адгезивный процесс на энтероцитах куриных эмбрионов изучают по описанной методике. Подготовка энтероцитов кишечника куриных эмбрионов Эмбрионы цыплят 20-дневного возраста осторожно извлекают из скорлупы, предварительно обработанной этиловым спиртом. Эмбрионы умерщвляют и извлекают кишечник по всей длине. Кишечник вскрыва­ ют и стерильным скальпелем соскабливают всю его поверхность. Полу­ ченные соскобы переносят в стерильный, забуференный фосфатами изо­ тонический раствор хлорида натрия и пропускают через капроновый фильтр для освобождения от кусочков ткани. Полученные взвеси осаж­ дают центрифугированием при 1 500—2000 об./мин в течение 25— 30 мин и готовят взвесь с концентрацией по оптическому стандарту мутности, равную 10 ед, используя стандарты мутности ГИСК им. Тара- севича, или стандарт McFarland (№ 1—7). Постановку реакции адгезии осуществляют вышеописанным спо­ собом. 6.5.2. Тестирование in vivo 6.5.2.1. Определение адгезивности Адгезивные свойства могут быть исследованы на ряде биологиче­ ских моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально заражен­ ные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов) и методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных. Наиболее простым и универсальным методом определения адге­ зивных свойств бактерий является выявление способности микроорга­ низмов вызывать гемагглютинацию эритроцитов человека и животных. 83 МУ 2.3.2.2789— 10 В связи с этим адгезивность штамма первоначально определяется методом гемагглютинации. При выявлении способности штамма агглю­ тинировать эритроциты человека и животных далее, в зависимости от вида культуры, будет использоваться одна из биологических моделей на животных. Определение адгезивности штамма in vivo При подтверждении гемагглютинационной активности штамма с использованием D-маннозы возможно количественное определение ад­ гезии in vivo при использовании биологических моделей (развивающие­ ся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевя­ занная петля тонкого кишечника кроликов). Ниже приведено описание модели для исследования адгезивной активности штаммов микроорга­ низмов на модели перевязанной петли тонкого кишечника 12— 14- дневных крольчат. Материалы, аппаратура и инструментарий* Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 28— 37 °С с отклонением от заданной ± 1 °С ТУ 64-1-1382— 72 Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284— 78 Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ил и других видов ТУ 16-535— 84 Пинцет медицинский ГОСТ 21241— 89 Ножницы медицинские ГОСТ 21239—89 Скальпель медицинский хирургический, 15 см ГОСТ 21240— 89 Шприцы медицинские 1 или 0,1 см3 Штативы для пробирок Животные и штаммы 12— 14-дневные крольчата Культура штамма или контрольного (референтного) штамма того же вида Сущность метода В каждый опыт берут не менее 3 крольчат. Животных фиксируют на специальном столе и внутримышечно во внутреннюю область бедра вводят тиопентал натрия (0,1 мл 1 %-го раствора на 50 г веса животно­ го). Наркотический эффект наступает через 2— 3 мин. По средней линии живота крольчонка делают разрез брюшины по 1 см в обе стороны от * Допускается использовать другие аппаратуру, материалы и инструментарий с аналогич­ ными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 84 МУ 2.3.2.2789— 10 пупка. Извлекают петли дистального отдела тонкого кишечника и в его просвет на расстоянии 3— 5 см от уровня верхушки аппендикса, имею­ щего общую брыжейку с подвздошной кишкой, вводят с помощью иглы шприца (1,0 см3) 0,1см 3 микробной взвеси, содержащей ЮКОЕ/см3. Одновременно делают 10-кратные разведения взвеси штамма и из 3, 4 и 5-го разведений производят посевы по 0,5 см3 на плотную питательную среду, делая параллельные высевы по 2 чашки Петри на каждое разве­ дение. Через 1,5 ч после заражения животных усыпляют хлороформом и вскрывают. Отступя 5— 7 см от слепой кишки, извлекают участок под­ вздошной кишки длиной 20 см и переносят в чашку Петри. Чтобы пре­ дупредить элиминацию штамма со слизистой кишечника исследуемый материал помещают на лед и дальнейшие процедуры проводят опера­ тивно. Отрезки кишечника разрезают вдоль, трижды промывают в ох­ лажденном при 4 °С растворе 0,9 %-го хлористого натрия, растирают в ступке или специальном гомогенизаторе. К растертой ткани добавляют 1 см3 0,9 %-го раствора хлористого натрия, полученные суспензии пере­ носят в пробирки и делают 10-кратные разведения. Из 3, 4, 5-го разведе­ ний делают посевы по 0,5 см3 на плотную питательную среду, делая па­ раллельные высевы по 2 чашки Петри на каждое разведение. Через 18— 24 ч после инкубации при температуре, оптимальной для выращивания исследуемого вида штамма, подсчитывают число выросших колоний, изолированных со слизистой тонкого кишечника и высеянных непо­ средственно из пробирки до заражения кроликов. Таким образом опре­ деляется число бактерий, прикрепившихся к слизистой тонкого кишеч­ ника. Учет и интерпретация результатов Коэффициент адгезии для количественной оценки адгезивной ак­ тивности штамма и контрольного штамма высчитывают по следующей формуле: К = - 1 0 0 % , где а К - коэффициент адгезии - процент адгезивных клеток в популя­ ции исследуемого штамма; а - число жизнеспособных клеток, введенных в кишечник крольчат; в - число клеток, прикрепившихся к стенке кишечника. По степени адгезивности они оцениваются следующим образом: а) высокоадгезивные с коэффициентом адгезии 3,0 и выше, б) адгезивные - от 1 до 3 и в) слабоадгезивные - 0,001— 0,9. 85 МУ 2.3.2.2789— 10 Слабоадгезивные штаммы, как правило, авирулентны, а адгезивные и высокоадгезивные штаммы обычно обладают определенными виру­ лентными свойствами.

7. Методы исследования технологических свойств пробиотических штаммов

7.L Определение постокислительной активности штаммов молочнокислых бактерий В три бутылочки заливают по 200 мл 9 %-го обезжиренного молока (90 г сухого обезжиренного молока + 1 000 мл водопроводной воды, растворяют при комнатной температуре 1,5—2 ч с последующим нагре­ ванием текучим паром), в каждую бутылочку вносят 2 % культуральной жидкости по объему и выдерживают до образования сгустка при темпе­ ратуре, оптимальной для исследуемого штамма. После термостатирова- ния в одной бутылочке определяют pH и вязкость, а две другие буты­ лочки переворачивают 5 раз и охлаждают в ледяной воде 15 мин, а за­ тем помещают в холодильник при температуре 4 °С. Через 1 сутки и через 28 дней хранения определяют в них вязкость и pH. Перед проведением измерения бутылочку достают из холодильни­ ка, выдерживают при комнатной температуре и при 20 °С проводят из­ мерения pH и вязкости. Другую бутылочку хранят 28 дней в холодиль­ нике. После хранения определяют вязкость и pH. 7.2. Определение способности к образованию экзополисахаридов Сущность метода Определение содержания ЭПС проводится с предварительным вы­ делением мешающих компонентов и последующим высушиванием до постоянной массы. Аппаратура, материалы и реактивы* Центрифуга MW-340 или Т 24 Janetzki Колбы мерные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 100— 1 000 см3 с притертыми пробками Раствор фенола ГОСТ 23519—93 Концентрированная серная кислота ГОСТ 2184—77 Кислота трихлоруксусная кристаллическая Эксикатор ГОСТ 25336— 82 " Допускается использовать другие аппаратуру, материалы и реактивы с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке. 86 МУ 2,3.2.2789— 10 Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспе­ чивающий постоянство температуры (105 ± 2 ) °С Подготовка к испытанию Питательную среду в количестве 25 см3 центрифугируют на цен­ трифуге MW-340 или Т 24 Janetzki при 3 000 об./мин в течение 30 мин. Центрифугат сливают в отдельную колбу. К осадку прибавляют не­ большое количество дистиллированной воды (2— 4 см3), тщательно пе­ ремешивают и снова центрифугируют, сливая центрифугат. Операцию промывания сгустка проводят 5—7 раз, пока центрифугат не даст отри­ цательной реакции на углеводы по фенол-серному методу, для чего к 1 см3 центрифугата прибавляют 1 см3 5 %-го водного раствора фенола и 5 см3 концентрированной химически чистой серной кислоты. В присут­ ствии углеводов жидкость в пробирке приобретает красное окрашива­ ние различной степени интенсивности в зависимости от количества углеводов. Проведение испытания. Все центрифугаты соединяют вместе, белки осаждают 50 %-м рас­ твором трихлоруксусной кислоты, для чего к 90 см3 центрифугата до­ бавляют 10 см3 кислоты. Выпавшие в осадок белки удаляют центрифу­ гированием при 3 000 об./мин в течение 90 мин. К центрифугату, содержащему слизистые биополимеры, добавляют 2-кратное количество 96 %-го этанола, выдерживают при температуре (4 ± 2) °С в течение 24 ч. Выпавший осадок полимера, после отделения надосадочной жидкости с помощью центрифугирования при 3 000 об./мин в течение 90 мин, сушат до постоянного веса в эксикаторе над хлористым кальцием в течение 48 ч, затем взвешивают. Требования безопасности. • Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. лету­ чими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу. • Необходимо соблюдать требования техники безопасности при ра­ боте с электроприборами. 7.5. Тестирование хранимоспособности 7.3,1. Определение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл методом конечных разведений Культуры пробиотических штаммов в виде закваски, бакконцен- трата, биомассы в герметизированной упаковке закладываются на хра­ нение при условиях как минимум двух температурных режимов (для 87 МУ 2.3.2.2789— 10 сухих - минус 18 °С, 4 °С и 25 °С, для жидких - 4 °С, 9 °С) и подверга­ ются периодическим испытаниям на жизнеспособность, наличие посто­ ронней микрофлоры, изучают морфологию клеток и активность кисло- тообразования. Культуры засевают в соответствующие питательные среды в соот­ ветствии с общепринятыми методами анализа (НВЧ или серийных раз- ведений) и по окончании инкубации культур, выросших на рядах проби­ рок с питательной средой, подсчитывали число колоний в трех конечных разведениях, в которых наблюдался рост изолированных колоний. Общее число жизнеспособных клеток высчитывали по формуле: X = а х 10"'1, где X - число колониеобразующих единиц бактерий в 1 мл пробы; а - число колоний в учитываемом разведении. 7.3.2. Количественное определение ацидофильных лактобацилл Данная методика основана на способности ацидофильных лактоба­ цилл сквашивать молоко. Из исследуемого образца делают 2 ряда последовательных десяти­ кратных разведений в стерильном обезжиренном молоке не менее, чем до КГ10. Посевы выдерживают в термостате при температуре 38 °С в течение 5 суток. За это время молоко, в котором содержались ацидо­ фильные лактобациллы, образует сгусток. Из сгустка готовят микроско­ пический препарат. Если в препарате видны характерные палочки, то данное разведение учитывают, как содержащее ацидофильные лакто­ бактерии. При подсчете количества ацидофильных лактобактерий поль­ зуются табл. 7. Таблица 7 Коэффициенты при подсчете ацидофильных лактобацилл Числовая характеристика Наиболее вероятное число микробов при засеве в две параллельные пробирки 1 2 001 0,5 011 0,9 020 0,9 101 1,2 ПО 1,3 ш 2.6 120 2,0 121 3,0 200 2,5 201 5,0 88 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение табл. 7 1 2 210 6,0 211 13,0 212 20,0 220 25,0 221 70,0 222 110,0 Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из трех цифр, указывающих количество пробирок со свернувшимся обезжирен­ ным молоком в трех последних разведениях. Первая цифра числовой характеристики соответствует тому разведению, при котором молоко свернулось во всех пробирках. По числовой характеристике находят в таблице наиболее вероятное число микробных клеток, которое умножа­ ют на разведение, с которого начиналась первая цифра числовой харак­ теристики. Полученное число соответствует количеству клеток ацидо­ фильных лактобацилл в одном образце. Пример. Молоко свернулось в двух пробирках разведения -6, в од­ ной пробирке разведения -7 и в одной пробирке разведения -8, тогда числовая характеристика результата будет 211. Она соответствует по таблице числу 13. Последнее надо умножить на число разведение 6, ко­ торому соответствует первая цифра числовой характеристики. Тогда количество живых ацидофильных лактобацилл в одном образце состав­ ляет 13 х 10 = 1,3 х 107. 7.3.3. Контроль микробной культуры на наличие посторонней микрофлоры Культуральную жидкость в количестве 0,1 мл высевают на агари- зованные среды: • МПА (мясопептонный агар) - для определения общего числа микроорганизмов посторонней микрофлоры; • Сабуро - дрожжей, плесеней; • стафилококковый агар - стафилококков, в т. ч. золотистого; • среду Эндо - энтеробактерии. Культуру в количестве 0,1 мл наносили на поверхность агаровой пластинки и круговыми движениями шпателя равномерно втирали. По­ севы инкубировали при температуре 37 °С в течение двух суток; на сре­ де Сабуро - при 28 °С в течение 5 суток. При обнаружении посторонней микрофлоры данный образец бра­ ковался. 89 МУ 2.3.2.2789— 10 7.3.4. Изучение морфологии клеток Данные исследования проводят с помощью микроскопии в бино­ кулярном микроскопе под масляной иммерсией с объективом хЮО; го­ товят два вида препаратов для микроскопии: • окраской по Граму с помощью стандартного набора реагентов и красителей; • раствором метиленовой сини. 7.3.5. Определение активности кислотообразования По две пробирки каждой культуры вынимают и ставят в холодиль­ ник для быстрого охлаждения с целью предотвращения дальнейшего продуцирования кислот. Затем по 10 мл культуральной жидкости вносят в стеклянные колбочки и по 1 капле добавляют фенолфталеин в качестве индикатора. Общую кислотность определяют титрованием децинормальной ще­ лочи NaOH, которую из бюретки по каплям добавляют в колбочки с на­ литой культуральной жидкостью до появления стойкого розового окра­ шивания. Количество децинормальной щелочи, которое ушло на титро­ вание, соответствует количеству образуемой децинормальной кислоты в 10 мл культуральной жидкости. Показатель активности кислотообразования, выраженный в граду­ сах Тернера /°Т/, вычисляют по формуле: °Т= а х к х 10, где а - количество миллилитров 0,1 М раствора натра едкого, пошед­ шее на титрование; к - поправка к титру 0,1 М раствора натра едкого; 10 - поправочный коэффициент на массу анализируемой пробы. Среднее значение активности кислотообразования рассчитывают для двух образцов. 90 МУ 2.3.2.2789— 10

8. Библиография Я. 5.7.5.

1. Cole JR, Chai В, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, McGarrell DM, Garrity GM, Tiedje JM. The Ribosomal Database Project (RDP-II): se­ quences and tools for high-throughput rRNA analysis. // Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1 ; 33.

2. Lilburn TG, Garrity GM\ Exploring prokaryotic taxonomy. // Int J Syst Evol Microbiol. 2004 Jan ; 54(Pt 1):7— 13.

3. Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, Cole JR, Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. // Appl Environ Microbiol. 2007 Aug;73(16):5261-7.

4. Ventura M., Canchaya C, Sinderen D., FitzgeraldG,F., Zink R. Bifi­ dobacterium lactis DSM 10140: Identification of the atp (atpBEFHAGDC) Operon and Analysis of Its Genetic Structure, Characteristics, and Phytogeny. // Appl Environ Microbiol. 2004 May, p. 3110-3121.

5. Regnault B., Grimont F,, Grimont H.F.D. Universal ribotyping me­ thod using a chemically labeled oligonucleotide probe mi[ture. // Res.Microbiol.1997.

6. Higuchi R„ Dollinger G., Walsh PS,, Griffith R, Simultaneous ampli­ fication and detection of specific DNA sequences. // Biotechnology. 1993. V.10. P 413-417.

7. SambrookJFritsch E.E., Maniatis T. Molekular Cloning: A Labora­ tory Manual. // Cold Sprind Harbor Laboratory Press, 1989.

8. Sanger F.t Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing chain­ terminating inhibitors. // Biotechnology. 1992. V. 24. P. 104— 108. Я .6.7./.

1. Субботина M. E. Разработка методики генотипирования бифидо­ бактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов. Дисс. канд. наук, М.—2009.

2. Амерханова А. М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффектив­ ности. Дисс. доктора наук, М.—2009.

3. Назырова Н. Р., Тимербаева Р. X., Туйгунов М. М. Антибиотико- резистентность штаммов, входящих в состав препаратов-пробиотиков.

4. I.Klare, C.Konstabel, G.Wemer, G.Huys, V. Vankerckhoven, G.Kahlmeter, B.Hildebrandt, S. Muller-Bertling, W.Witte and H.Goossens. Antimicrobial susceptibilities of Lactobacillus, Pediococcus and Lactococcus 91 МУ 2.3.2.2789— 10 human isolates and cultures intended for probiotic or nutritional use. J.of An­ timicrobial Chemotherapy Advance Access published March 16,2007, П.6.1.2.— 6.1.3. ТМаниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инже­ нерии. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984.479 с.

2. Botina SG, Tsygankov IuD, Sukhodolets VV. Identification of indus­ trial strains of lactic acid bacteria by methods of molecular genetic typing Genetika. 2006 Dec; 42(12): 1621—35.

3. Moon GS, Wegmann U, Gunning AP, Gasson MJ, Narbad A. solation and Characterization of a Theta-Type Cryptic Plasmid from Bifidobacterium longum FI 10564. J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr; 19(4): 403-8.

4. Van Hal SJ, Wiklendt A, Espedido B, Ginn A, Iredell JR. Immediate appearance of plasmid-mediated multiple antibiotic resistance upon antibiotic selection: an argument for systematic resistance epidemiology. J Clin Micro­ biol. 2009 May 6. [Epub ahead of print].

5. Feld L, Bielak E, Hammer K, Wilcks A. Characterization of a small erythromycin resistance plasmid pLFEl from the food-isolate Lactobacillus plantarum M345. Plasmid. 2009 May;61(3) : 159-70.

6. Вестник РАМН т. 16 № 7 стр. 25—31 Белобородова Н. В., Оси­ пов Г. А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. 1999 г.

7. Вестник РАМН № 2 стр. 141— 145 Ксоян Ж. А., Белобородова Н. В., Осипов Г. А. Спектр и уровень содержания низкомолекулярных соеди­ нений микробного происхождения при периодической болезни. 2002 г.

8. Р4.1.1672—03 «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище», Минздрав Рос­ сии, Москва 2004.

9. Pascual L.M., Daniele М.В., Ruiz F., Giordano W. et al. Lactobacil­ lus rhamnosus L60, a potential probiotic isolated from the human vagina. J.Gen.Appl.MicribioI., 54, 141-148 (2008). П.6.1.6.

1. Патент РФ 2250465 от 20.04.2005 Коробейникова Э. Н. и др. «Количественное определения содержания белка и муцина (гликопротеинов) в слюне». Патентообладатель ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» (ГОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России) (RU). 92 МУ 2.3.2.2789— 10 П. 6.L7.

1. Блинкова Л. П. Битехнологические условия синтеза бактериоци- нов /Блинкова Л. П., Машенцева Н. Г., Хорольский В. В., Горобец О. Б., Дорофеева Е. С.// Журн. микробиол. - 2006.-№ 2.- С. 83—89.

2. Бондаренко В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией /Бондаренко В. М., Воробьёв А. А Л Журн. микробиол. - 2004. - № 1 .-С . 84—92.

3. Бондаренко В. М., Чупринина Р. П., Аладышева Ж. И. и др. Про­ биотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. клин, гастро- энтерол. - 2004. - № 3. - С. 83—87.

4. Глушанова Н. А. Биосовместимость пробиотических и резидент­ ных лактобацилл. ГИУВ, Новокузнецк. Россия /Глушакова Н.А., Бли­ нов А. И. // Гастроэнтерол. - С.-Петербург. - 2005. - № 1 -2 2 с.

5. Никитин В.М. Справочник методов биохимической экспресс- индикации микробов /Никитин В. МЛ Кишинев, 1986. - 294 с.

6. Постникова Е. А. Поиск перспективных штаммов бифидобакте­ рий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов /Постни­ кова Е. А., Ефимов Б. А., Володин Н. Н., Кафарская Л. И.// Журн. мик­ робиол. - 2004. - № 2. - С. 64—69.

7. Хмель И.А. Микроцины - пептидные антибиотики энтеробакте­ рий: генетический контроль синтеза, структура, механизм действия /Хмель И. А.//Генетика. - 1999.-№ 35(1).- С . 5— 16.

8. Altermann Е. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus /Altermann E., Russell W.M., Azcarate- Peril M.A. et al.// NCFM. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - № 102(11). - P . 3906-12. 9. Atrih A. Detection and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19 /Atrih A., Reknif N., Milliere J.B. et al.// Can. J. Microbiol. - 1993. - № 39. - P.l 173-1179.

10. Jamuna M. Isolation and characterization Lactobacilli from some tra­ ditional fermented foods and evaluation of the bacteriocins /Jamuna M., Jee- varatnam К .// J. Gen. Microbiol. - 2004. - № 50(2). - P. 79—90.

11. Leal-Sanchez M.V. Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10 /Leal-Sanchez M.V., Jime- nez-Diaz R., Maldonado-Barragan A. et al.// Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - № 68(9). - P. 4465—4471.

12. Maldonado A. Induction of plantaricin production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is me- 93 МУ 2.3.2.2789— 10 diated by an autoinduction mechanism /Maldonado A., Jimenez-Diaz R., Ruiz-Barba J.L.// J. Bacteriol. - 2004. - № 186(5). - P. 1556— 1564. П.6.1.8.

1. Mercenier A., Foligne B., Derrnin V., Goudercourt D., Pot B., Roshat F. Selection of candidate probiotic strains protecting against murine acute colitis. ЛЛ3.1.

1. Блинкова Л. П. Битехнологические условия синтеза бактериоци- нов /Блинкова Л. П., Машенцева Н. Г., Хорольский В. В., ГоробецО. Б., Дорофеева Е. С.// Журн. микробиол. - 2006.~№ 2,- С. 83—89.

2. Бондаренко В. М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией /Бондаренко В. М., Воробьёв А. А.// Журн. микробиол. - 2004. - № 1. - С. 84—92.

3. Бондаренко В. М., Чупринина Р. П., Аладышева Ж. И. и др. Про­ биотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. клин, гастро- энтерол, - 2004. - № 3. - С. 83—87.

4. Глушанова Н. А. Биосовместимость пробиотических и резидент­ ных лактобацилл. ГИУВ, Новокузнецк. Россия /Глушакова Н. А., Бли­ нов А. И. // Гастроэнтерол. - С.-Петербург. - 2005. - № 1 - 22 с.

5. Никитин В. М. Справочник методов биохимической экспресс- индикации микробов /Никитин В. М.// Кишинев, 1986. - 294 с.

6. Постникова Е. А. Поиск перспективных штаммов бифидобакте­ рий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов /Постни­ кова Е. А., Ефимов Б. А., Володин Н. Н., Кафарская Л. И.// Журн. микро­ биол. - 2004. - №2. - С. 64—69.

7. Хмель И, А. Микроцины - пептидные антибиотики энтеробакте­ рий: генетический контроль синтеза, структура, механизм действия /Хмель И. А.//Генетика. - 1999.-№ 35(1).- С . 5— 16.

8. Altermann Е, Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus /Altermann E., Russell W.M., Azcarate- Peril M.A. et al.// NCFM. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - № 102(11). - P . 3906— 12.

9. Atrih A. Detection and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19 /Atrih A., Reknif N., Milliere J.B. et al.// Can. J. Microbiol. - 1993. - № 39. - P. 1173— 1179.

10. Jamuna M. Isolation and characterization Lactobacilli from some tra­ ditional fermented foods and evaluation of the bacteriocins /Jamuna M., Jee- varatnam KM J. Gen. Microbiol. - 2004. - JM° 50(2). - P. 79—90,

11. Leal-Sanchez M.V. Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10 /Leal-Sanchez M.V., Jime- 94 МУ 2,3.2.2789— 10 nez-Diaz R., Maldonado-Barragan A. et al.// Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - № 68(9). - P. 4465-4471.

12. Maldonado A, Induction of plantaricin production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is me­ diated by an autoinduction mechanism /Maldonado A., Jimenez-Diaz R., Ruiz-Barba J.L.// J. Bacteriol. - 2004. - № 186(5). - P. 1556— 1564. / 7. 6.4. L 5.

1. МУК 4.1/4.2.588—96 «Методы контроля медицинских иммуно­ биологических препаратов», 1996.

2. МУ 3.3.2.684—98 «Сертификация медицинских биологических препаратов», 1998.

3. Осипова И. Г. Экспериментально-клиническое изучение споро­ вых пробиотиков/ Дис. док. биол, наук, Москва, 2007 г.

4. Rifai, N., et al., Lipids Lipoproteins, and Apolipoproteins. Teitz Fun­ damentals of Clinical Chemistry, 5th Ed., Burtis, C.A and Ashwood, E.R. (W.B.Saunders eds.Philadelphia USA), (2001), 463. П.7

1. Dubois, M. Colorimetric method for determination of sugars and re­ lated substances / M. Dubois // Anal. Chem. - 28. - 1956. - P. 350—356. 95 МУ 2.3.2.2789— 10 Приложение 1 Микробиологический и молекулярно-генетический паспорт штамма микроорганизма Номер________________ Дата депонирования______________

1. Полное наименование организации-депозитора.

2. Юридический и фактический (для переписки) адреса и телефон, адрес электронной почты с указанием фамилии, имени и отчества кон­ тактного лица.

3. Авторский коллектив (фамилии, и.о. всех авторов штамма).

4. Причина депонирования: • для целей патентной процедуры; • хранение; • гарантийное хранение. (нужное подчеркнуть).

5. Родовое и видовое название культуры.

6. Номер или наименование штамма.

7. Родословная штамма, номер в другой коллекции (если он суще­ ствует).

8. Источник выделения штамма.

9. Где и когда (наименование организации и ее адрес) идентифици­ рована культура (данные, на основании которых было сделано заключе­ ние о родовой/ видовой принадлежности культуры должны прилагаться к паспорту).

10. Род, вид, подвид (вариант), штамм.

11. Индикация в коллекции: порядковый номер, шифр, номер кон­ тейнера.

12. Количество единиц хранения.

13. Журнальная запись о дате пересева культуры, серии, дате.

14. Характерные признаки: • морфология клеток; • реакция по Граму; • спорообразование.

15. Среды для культивирования: • бульонные; • полужидкие; • плотные. 96 МУ 2.3.2.2789— 10

16. Условия и время инкубации.

17. Биохимическая активность (с указанием метода и тест-системы, с помощью которой она определялась).

18. Антагонистическая активность (с указанием метода определе­ ния и тест-культур).

19. Устойчивость к антибиотикам.

20. Содержание ГЦ.

21. Генотипирование (с указанием нуклеотидной последовательно­ сти фрагментов минимально двух локусов генома штамма и метода оп­ ределения).

22. Способ длительного сохранения.

23. Условия хранения.

24. Гарантированное время хранения.

25. Среды контроля.

26. Среды накопления.

27. Характерный рост на селективных средах и средах накопления.

28. Состав защитной среды для обеспечения длительной консерва­ ции при сублимационном высушивании.

29. Назначение штамма. 97 МУ 2.3.2.2789— 10 Приложение 2 Пограничные значения чувствительности к антимикробным веществам лактобактерий в микрометоде серийных разведений [по LKlare et al., 2007] Диапазон ми­ Величины погра­ Антимикроб­ нимальной Вид штамма ингибирующей мик50, мик90, ничных ный препарат концентрации мг/л мг/л значений, (МИК), мг/л мг/л 1 2 3 4 5 6 Пенициллин Pc. acidilactici 0,125— 1 0,25 0,5 1 Pc. pentosaceus 0,25—0,5 0,5 0,5 1 L rhamnosus 0,125—2 0,25 1 2 L. paracasei 0,063— 1 0,25 0,5 1 L, plantarum 0,5—2 1 2 2 L. fermentum 0,063—0,5 0,25 0,25 0,5 L. gasseri <0,032—0,063 < 0,032 0,063 0,125 L. acidophilus <0,032—0,125 0,125 0,125 0,25 L. crispatus < 0,032—0,25 0,125 0,25 0,25 L johnsonii 0,063—0,125 0,125 0,125 0,25 L. delbrueckii <0,032—0,125 < 0,032 0,063 0,125 L reuteri 0,063— 16 0,5 4 IE Ампициллин Pc. acidilactici 1—2 1 2 4 Pc. pentosaceus 1—2 2 2 4 L. rhamnosus 0,25—4 1 2 4 L. paracasei 0,125—2 0,5 1 2 L. plantarum 0,125—2 0,25 1 2 L. fermentum 0,063—0,25 0,125 0,25 0,5 L. gasseri 0,063—0,25 0,125 0,25 0,5 L. acidophilus 0,125—0,5 0,25 0,5 0,5 L. crispatus 0,125— 1 0,5 1 1 L. johnsonii 0,125—0,5 0,5 0,5 1 L. delbrueckii h <0,032—0,5 0,063 0,25 0,5 L. reuteri 0,125—4 0,5 4 2 Ампициллин/ Pc. acidilactici 1—2 1 2 4 сульбактам Pc. pentosaceus 1—2 2 2 4 L. rhamnosus 0,25—4 1 1 4 L. paracasei 0,125—2 0,5 1 2 98 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение прилож. 2 1 2 3 4 5 6 L plantarum 0,125— 1 0,25 0,5 2 L fermentum 0,063—0,25 0,125 0,25 0,5 L. gasseri <0,032—0,25 0,125 0,25 0,5 L acidophilus 0,125—0,5 0,25 0,5 0,5 L. crispatus 0,063— 1 0,5 0,5 1 LJohnsonii 0,063—0,5 0,25 0,5 1 L. delbrueckii <0,032—0,25 0,063 0,125 0,5 L. reuteri 0,125—2 0,5 2 2 Гентамицин Pc. acidilactici 2—8 4 4 8 Pc. pentosaceus 2—4 2 2 4 L. rhamnosus < 1 —8 1 2 8 L. paracasei < 1—8 2 4 8 L. plantarum < 1—8 1 2 8 L. fermentum < 1—2 1 1 IE L. gasseri < 1—4 1 2 4 L. acidophilus < 1 —2 1 2 4 L. crispatus < 1 -4 2 4 4 L. Johnsonii < 1— 8 4 4 8 L. delbrueckii < 1 -4 1 2 4 L. reuteri < 1 I 1 IE Стрептоми- Pc. acidilactici 16— 128 64 128 128 цин Pc. pentosaceus 32— 128 32 64 128 L. rhamnosus < 2—> 4096 4 16 32 L. paracasei < 2—> 4096 16 32 64 L. plantarum 4— 128 16 32 64 L. fermentum 4—64 8 16 64 L. gasseri < 2 —8 2 4 8 L. acidophilus < 2 —8 2 4 8 L. crispatus < 2—32 4 16 16 L. johnsonii < 2 — 16 4 8 ^ 16 L. delbrueckii < 2— 16 4 8 16 L. reuteri < 2 — 16 4 8 16 Ванкомицин Pc. acidilactici >256 >256 >256 IE Pc. pentosaceus >256 >256 >256 IE L. rhamnosus >256 >256 >256 IE L. paracasei >256 >256 >256 IE L. plantarum >256 >256 >256 IE 99 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение прилож. 2 1 2 3 4 5 6 L. fermentum 32—> 256 256 >256 IE L. gasseri 0,25— 1 0,5 1 1 L. acidophilus 0,25—0,5 0,5 0,5 1 L. crispatus 0,25—0,5 0,5 0,5 1 L. johnsonii 0,25— 1 0,5 1 1 L. delbrueckii 0,25—0,5 0,25 0,5 1 L. reuteri 128—256 256 256 IE Тейкопланин Pc. acidilactici 64—> 256 >256 >256 IE Pc. pentosaceus >256 >256 >256 IE L. rhamnosus 64—>256 >256 >256 IE L. paracasei 64—> 256 256 >256 IE L. plantarum 32—>256 256 >256 IE L. fermentum 2—> 256 128 >256 IE L. gasseri <0,125—0,25 <0,125 <0,125 IE L acidophilus <0,125 <0,125 <6,125 IE L crispatus <0,125—0,25 <0,125 <0,125 IE L johnsonii <0,125—0,25 <0,125 <0,125 IE L delbrueckii <0,125—0,25 <0,125 <0,125 IE L. reuteri 64—256 128 256 IE Хинопре- Pc. acidilactici 0,063— 1 0,5 1 2 стин/ Pc. pentosaceus 0,5—2 1 ~1 2 2 дальфопри- L. rhamnosus <0,032— 1 0,25 0,5 1 СТИН L. paracasei < 0,032— 1 0,25 0,25 I L. plantarum 0,063— 1 0,25 1 1 L. fermentum 0,063—0,125 0,125 0,125 0,25 L. gasseri <0,032— 0,25 0,125 0,125 0,25 L. acidophilus < 0,032—0,5 0,125 0,25 0,5 L. crispatus <0,032—0,25 0,063 0,25 0,25 L. johnsonii 0,063—0,25 0,125 0,25 0,5 L. delbrueckii < 0,032—0,25 0,063 0,063 0,25 L. reuteri <0,032—0,125 0,125 0,125 0,25 Эритромицин Pc. acidilactici 0,063—0,25 0,063 0,5 0,25 Pc. pentosaceus 0,032—0,25 0,063 0,125 0,25 L. rhamnosus <0,016—>32 0,032 0,063 0,25 L. paracasei <0,016—0,25 0,032 0,063 0,25 L. plantarum <0,016—0,5 0,125 0,25 0,5 L. fermentum <0,016—0,125 0,032 0,063 0,125 100 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение прилож. 2 1 2 3 4 5 6 L. gasseri <0,016—0,032 <0,016 0,032 0,063 L. acidophilus <0,016—0,063 0,032 0,063 0,063 L crispatus <0,016—>32 0,032 > 32 0,063 L. johnsonii <0,016—0,063 <0,016 0,032 0,063 L. delbrueckii <0,016—0,125 <0,016 0,032 0,063 L. reuteri 0,032—0,25 0,032 0,125 0,25 Клиндамицин Pc. acidilactici < 0,032—0,5 < 0,032 0,063 IE Pc. pentosaceus < 0,032 <0,032 <0,032 IE L. rhamnosus < 0,032—8 0,063 0,125 0,5 L. paracasei < 0,032—0,25 < 0,032 0,063 0,25 L. plantarum < 0,032—1 0,125 0,5 0,5 L. fermentum <0,032—0,125 <0,032 <0,032 0,125 L. gasseri <0,032—2 0,5 2 IE L. acidophilus < 0,032—0,5 0,125 0,5 0,5 L. crispatus < 0,032-. 32 0,063 >32 0,25 L johnsonii <0,032—1 0,063 0,25 0,5 L. delbrueckii < 0,032—0,063 <0,032 < 0,032 IE L reuteri < 0,032—0,063 <0,032 < 0,032 IE Окситетра- Pc. acidilactici 4— 16 8 16 32 циклин Pc. pentosaceus 8— 16 16 16 32 L. rhamnosus 0,125— 16 0,5 0,5 1 L. paracasei 0,25— 16 0,5 1 2 L. plantarum 4—> 128 8 16 32 L.fermentum 0,5—4 2 4 8 L. gasseri 6,125— 4 1 2 4 L. acidophilus 0,25—2 0,5 1 2 L. crispatus 0,25—64 1 64 2 L. johnsonii 0,5—16 0,5 16 2 L. delbrueckii <0,063—2 0,5 2 2 L. reuteri 2—> 128 4 > 128 8 Хлорамфени- Pc. acidilactici 2—4 2 4 8 кол Pc. pentosaceus 1—4 2 4 4 L. rhamnosus 0,5—8 2 4 8 L. paracasei 1—8 2 4 8 L. plantarum 2—8 4 4 8 L. fermentum 2—4 2 4 8 L. gasseri 6,5—4 2 2 4 101 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение прилож. 2 1 2 3 4 5 6 L. acidophilus 0,5—4 2 4 8 L. crispatus 1—4 1 4 4 L. johnsonii 1—4 2 4 4 L. delbrueckii 1—4 2 2 4 L. reuteri 1—4 2 4 4 Фусидовая Pc. acidilactici 0,5— 16 4 4 8 кислота Pc. pentosaceus 2— 4 2 4 8 L. rhamnosus 2—> 32B 128 > 128 IE L paracasei 16—> 128 64 128 256 L. plantarum 2—32 16 16 32 L. fermentum 0,25— 1 0,5 1 1 L. gasseri 8—> 128 64 128 256 L. acidophilus 32—> 128 64 128 256 L. crispatus 4— 128 32 64 128 L. johnsonii 16—128 64 128 128 L. delbrueckii 32— 128 64 128 128 L reuteri 0,125—2 0,5 2 2 Линезолид Pc. acidilactici 0,5—2 3 2 4 Pc. pentosaceus 0,5—2 3 1 2 L. rhamnosus 0,125—2 1 1 2 L. paracasei 0,25—2 1 1 4 L. plantarum 1—2 1 2 4 L. fermentum 0,5—2 1 1 2 L. gasseri 0,5—2 1 2 2 L. acidophilus 0,5—4 1 4 4 L. crispatus 0,5—2 1 2 2 L. johnsonii 0,5—2 1 2 2 L. delbrueckii 0,5— 1 0,5 1 1 L. reuteri 0,5—2 1 2 2 Триметоприм Pc. acidilactici 8—>512 32 128 IE Pc. pentosaceus 8— 128 16 32 IE L. rhamnosus 1—>512 32 64 IE L. paracasei <0,25—>512 2 16 IE L. plantarum <0,25—>512 2 32 IE L. fermentum < 0,25—256 4 64 IE L. gasseri <0,25—>512 8 >512 IE L. acidophilus 0,5—>512 4 512 IE 102 МУ 2.3.2.2789— 10 Продолжение прилож. 2 1 2 3 4 5 6 L crispatus <0,25—>512 8 256 IE L. johnsonii <0,25—>512 256 >512 IE L. delbrueckii 128—>512 >512 >512 IE L. reuteri 16—>512 64 >512 IE Триметоприм Pc. acidilactici 64—512 256 512 IE /сульфоме- Pc. pentosaceus 128—512 256 256 IE токсазол L. rhamnosus 16—>512 256 512 IE L. paracasei 0,5—>512 16 128 IE L. plantarum 0,5—>512 4 256 IE L. fermentum 2—512 16 128 IE L. gasseri 0,5—>512 128 >512 IE L. acidophilus 4—>512 64 512 IE L. crispatus <0,25—>512 128 >512 IE L. johnsonii 1—>512 512 >512 IE L. delbrueckii 256—>512 512 >512 IE L. reuteri 32—>512 256 >512 IE С окращ ения ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ДНК -дезоксирибонуклеиновая кислота Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов МУ 2.3.2.2789— 10 Редактор Н. В. Кожока Технический редактор Г. И. Климова Подписано в печать 08.02.11 Формат 60x88/16 Печ. л. 6,5 Тираж 200 экз. Заказ 28 Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер,, д. 18, стр. 5, 7 Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89 МУ 2.3.2.2789-10