Decree-Law No. 243/2000 adopting an official method in order to determinate sodium lasalocite to be used in animal feed

Decreto-Lei n.º 243/2000 de 27 de Setembro A legislação aplicável aos princípios relativos à organização dos controlos oficiais no domínio da alimentação animal dispõe que na análise das amostras de produtos destinados à alimentação animal são utilizados os métodos oficiais de análise definidos em legislação comunitária ou em norma portuguesa. Atendendo a que não existe norma portuguesa relativa ao método para a determinação do lasalocido de sódio nos alimentos para animais e nas pré-misturas e tendo em conta a adopção da Directiva n.º 1999/76/CE, da Comissão, de 23 de Julho, que fixa o método de análise comunitário para a determinação do lasalocido de sódio nos alimentos para animais e nas pré misturas, a utilizar aquando da realização das determinações analíticas previstas no controlo oficial da alimentação animal, importa transpor para o ordenamento jurídico nacional as disposições da referida directiva. Ouvidos os órgãos do governo próprio das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira. Assim, nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 198.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte: Artigo único É adoptado o método oficial de análise a utilizar na determinação do teor de lasalocido de sódio nos alimentos para animais e nas pré-misturas, no âmbito dos controlos oficiais no domínio da alimentação animal, constante do anexo ao presente diploma, do qual faz parte integrante. Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 20 de Julho de 2000. - Jaime José Matos da Gama - Joaquim Augusto Nunes Pina Moura - Luís Manuel Capoulas Santos. Promulgado em 6 de Setembro de 2000. Publique-se. O Presidente da República, JORGE SAMPAIO. Referendado em 4 de Setembro de 2000. O Primeiro-Ministro, António Manuel de Oliveira Guterres. ANEXO Determinação do lasalocido de sódio Sal sódico de um ácido monocarboxílico poli-eterificado produzido por Streptomyces lasaliensis 1 - Objectivo e campo de aplicação. - O método destina-se à determinação do lasalocido de sódio em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 5 mg/kg; o limite de determinação é de 30 mg/kg. 2 - Princípio. - O lasalocido de sódio é extraído da amostra com metanol acidificado e determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de fluorescência. 3 - Reagentes: 3.1 - Di-hidrogenofosfato potássico (KH(índice 2)PO(índice 4)). 3.2 - Ácido ortofosfórico, w = 85%. 3.3 - Solução de ácido ortofosfórico, (sigma) = 205: Diluir 23,5 ml de ácido ortofósfórico (3.2) para 100 ml com água. 3.4 - 6-metil-2-heptilamina (1,5-dimetil-hexilamina) w = 99%. 3.5 - Metanol para HPLC. 3.6 - Ácido clorídrico, (ró)20 = 1,19 g/ml. 3.7 - Solução-tampão de fosfatos, c = 0,01 mol/l: Dissolver 1,36 g de KH(índice 2)PO(índice 4) (3.1) em 500 ml de água (3.11); adicionar 3,5 ml de ácido ortofosfórico (3.2) e 10 ml de 6-metil-2-heptilamina (3.4). Ajustar o pH para 4 com solução de ácido ortofosfórico (3.3) e diluir para 1000 ml com água (3.11). 3.8 - Metanol acidificado: Transferir 5 ml de ácido clorídrico (3.6) para um balão graduado de 1000 ml, completar até ao traço com metanol (3.5) e agitar. A solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização. 3.9 - Fase móvel para HPLC: solução-tampão de fosfatos-metanol 5 + 95 (v + v): Misturar 5 ml de solução-tampão de fósfatos (3.7) com 95 ml de metanol (3.5). 3.10 - Lasalocido de sódio-padrão de pureza garantida (C(índice 34)H(índice 53)O(índice 8)Na, sal sódico de ácido monocarboxílico poli-eterificado produzido por Streptomyces lasaeliensis), E763. 3.10.1 - Solução-padrão de reserva, 500 (mi)g/ml, de lasalocido de sódio: Em balão aferido de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de lasalocido de sódio (3.10) e dissolver em metanol acidificado (3.8). Completar o volume até ao traço com o mesmo solvente e homogeneizar. A solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização. 3.10.2 - Solução-padrão intermédia, 50 (mi)g/ml, de lasalocido de sódio: Pipetar 10 ml da solução de reserva (3.10.1) para um balão aferido de 100 ml, completar o volume até ao traço com metanol acidificado (3.8) e homogeneizar. A solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização. 3.10.3 - Soluções de calibração: Transferir 0,1 ml, 2 ml, 4 ml, 5,9 ml e 10 ml da solução-padrão intermédia (3.10.2) para uma série de balões aferidos de 50 ml. Completar o volume até ao traço com metanol acidificado (3.8) e homogeneizar. As soluções obtidas contêm 1 (mi)g, 2 (mi)g, 4 (mi)g, 5 (mi)g e 10 (mi)g de lasalocido de sódio por mililitro e são preparadas imediatamente antes da utilização. 3.11 - Água para HPLC. 4 - Equipamento: 4.1 - Banho ultra-sons. 4.2 - Filtros de membrana de 0,45 (mi)m. 4.3 - Equipamento de HPLC com sistema de injecção com capacidade de injecção de volumes de 20 (mi)l. 4.3.1 - Coluna para cromatografia líquida com 125 mm x 4 mm e enchimento de fase reversa C18 com granulometria de 5 (mi)m, ou equivalente. 4.3.2 - Detector de fluorescência com possibilidade de ajustamento dos cumprimentos de onda de emissão e de excitação. 5 - Procedimento: 5.1 - Generalidades: 5.1.1 - Alimento para animais branco: Na determinação da recuperação (5.1.2), analisa-se um alimento para animais branco, para comprovar a ausência de lasalocido de sódio e de substâncias interferentes. O alimento para animais branco deve ser de tipo similar ao da amostra e não deve ser detectado lasalocido de sódio ou substâncias interferentes. 5.1.2 - Determinação da recuperação: Para determinar a recuperação, procede-se à análise de um alimento para animais branco ao qual terá sido adicionada uma quantidade de lasalocido de sódio semelhante à presente na amostra. Para obter uma concentração de 100 mg/kg no branco, transferir 10 ml da solução padrão de reserva (3.10.1) para um erlenmeyer de 250 ml e concentrar por evaporação até cerca de 0,5 ml. Adicionar 50 g do alimento para animais branco, misturar bem e deixar em repouso durante dez minutos, misturando de novo várias vezes antes de proceder à extracção (5.2). Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.l.), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de lasalocido de sódio semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção. 5.2 - Extracção: 5.2.1 - Alimentos para animais: Em erlenmeyer de 250 ml, pesar com uma aproximação de 0,01 g, 5 g a 10 g de amostra e adicionar, com uma pipeta, 100 ml de metanol acidificado (3.8). Tapar o erlenmeyer, agitar e colocar no banho de ultra-sons (4.1) a cerca de 40ºC, durante vinte minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e arrefecer à temperatura ambiente. Deixar repousar durante cerca de uma hora, até à deposição das matérias em suspensão, e filtrar uma alíquota com um filtro de membrana de 0,45 (mi)m (4.2) para um recipiente adequado. Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3). 5.2.2 - Pré-misturas: Num erlenmeyer de 250 ml, pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 2 g da pré mistura e adicionar 100 ml de metanol acidificado (3.8), homogeneizando por agitação. Colocar o erlenmeyer no banho de ultra-sons (4.1) a cerca de 40ºC, durante vinte minutos, retirar o erlenmeyer do banho e arrefecer à temperatura ambiente. Diluir até ao traço com metanol acidificado (3.8) e agitar. Deixar repousar durante cerca de uma hora, até à deposição das matérias em suspensão, e filtrar uma alíquota com um filtro de membrana de 0,45 (mi)m (4.2). Diluir um volume adequado do filtrado com metanol acidificado (3.8), de modo a obter uma solução de ensaio com cerca de 4 (mi)m/ml de lasalocido de sódio. Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3). 5.3 - Determinação por HPLC: 5.3.1 - Parâmetros. - As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes. Coluna para cromatografia (4.1.1): 125 mm x 4 mm e enchimento de fase reversa C18 com granulometria de 5 (mi)m, ou equivalente; Fase móvel (3.9): mistura de solução-tampão de fosfatos (3.7) e metanol (3.5)+ 5 + 95 (v + v); Fluxo: 1,2 ml/minuto; Comprimentos de onda de detecção: Excitação - 310 mm; Emissão - 419 mm; Volume injectado - 20 ll. Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.10.3) com 4,0 (mi)g/ml até se obterem alturas (ou áreas) de pico e tempos de retenção constantes. 5.3.2 - Curva de calibração: Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.10.3) e determinar a altura ou área média dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, representando em ordenadas as alturas ou áreas médias dos picos das soluções de calibração e em abcissas as concentrações correspondentes em microgramas por mililitro. 5.3.3 - Solução da amostra: Injectar várias vezes volumes dos extractos da amostra obtidos em 5.2.1 e 5.2.2, idênticos ao volume utilizado para as soluções de calibração e determinar a altura ou área média dos picos da lasalocido de sódio. 6 - Cálculo dos resultados: A partir da altura ou área média dos picos obtidos por injecção da solução da amostra (5.3.3), determinar a concentração de lasalocido de sódio em miligrama por quilograma, com base na curva de calibração. 6.1 - Alimentos para animais: O teor de lasalocido de sódio, w, da amostra, expresso em miligramas por quilograma, é dado pela seguinte fórmula: (ver fórmula no documento original) 6.2 - Pré-misturas: O teor de lasalocido, w, da amostra, expresso em miligramas por quilograma, é dado pela seguinte fórmula: (ver fórmula no documento original) 7 - Validação dos resultados: 7.1 - Identidade: Os métodos baseados na detecção por fluorescência são objecto de menos interferências que os métodos que utilizam um detector de ultravioletas. A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia. 7.1.1 - Co-cromatografia: Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.10.3) a um extracto da amostra (5.2.1 ou 5.2.2). A quantidade de lasalocido de sódio adicionada deve ser semelhante à existente no extracto da amostra. Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico de lasalocido de sódio, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10% da largura inicial do pico do lasalocido de sódio do extracto da amostra sem adição. 7.2 - Repetibilidade: A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas para a mesma amostra não deve exceder: Para teores de lasalocido de sódio compreendido entre 30 mg/kg e 100 mg/kg: 15% do maior dos valores; Para teores de lasalocido de sódio compreendido entre 100 mg/kg e 200 mg/kg: 15 mg/kg; Para teores de lasalocido de sódio superiores a 200 mg/kg: 7,5% do maior dos valores. 7.3 - Recuperação: Utilizando uma amostra (branco) de alimento para animais adicionada, a recuperação deve ser pelo menos de 80%. Utilizando amostras de pré-misturas adicionadas, a recuperação deve ser pelo menos de 90%. 8 - Resultados de um teste interlaboratorial: Apresentam-se no quadro seguinte (ver nota 1) os resultados das análises efectuadas a duas pré-misturas (amostras 1 e 2) e cinco alimentos para animais (amostras 3 a 7) no âmbito de um teste interlaboratorial com 12 laboratórios. Para cada amostra, efectuaram-se análises em duplicado. (nota 1) Analyst 1995, 120, 2175-2180. (ver quadro no documento original)