Order on the implementation of special surveillance to determine the presence of the bacterium ralstonia solanacearum (smith) yabuuchi et al. and laboratory testing procedures

МИНИСТЕРСТВО ЗА ЗЕМЈОДЕЛСТВО, ШУМАРСТВО И ВОДОСТОПАНСТВО Врз основа на член 69 алинеја 5 од Законот за здравјето на растенијата („Службен весник на Република Македонија“ бр. 29/05, 81/08, 20/09, 57/10 и 17/11), министерот за земјоделство, шумарство и водостопанство, донесе НАРЕДБА ЗА СПРОВЕДУВАЊЕ НА ПОСЕБЕН НАДЗОР ЗА УТВРДУВАЊЕ НА ПРИСУСТВОТО НА БАКТЕРИЈАТА ВА! ОТОМА ФОГАМАСЕАВИЏМ (5МТН) УАВЏЏСН! ЕТ А!. И ПОСТАПКИТЕ ЗА ЛАБОРАТОРИСКО ИСПИТУВАЊЕ “ х Со оваа наредба се врши усогласување со одребите на Директивата на Советот бр. 98/57/ ЕЕЗ од 20 јули 1998 за контрола на Кајкопѓа 5оѓапасеагит (5тиН) УаБиисНт ек а!. СЕГЕХ број 5199810057, изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2006/63/ЕЗ од14 јули 2006 година, СЕГЕХ број 220061.0063. Член 1 Со оваа наредба се определува спроведување на посебен надзор за утврдување на присуството на бактеријата Ќа!окопѓа 5о апасеагит (оти) УаБииснѓека!. предизвикувач на кафеаво гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите, одредување на распространетоста и во случај на појава мерките кои треба да се превземат за да се спречи ширењето и контролата, со цел ерадикација на кафеаво гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите, како и на постапките за лабораториско испитување. Член 2 Мерките кои се преземат заради уништување на бактеријата Ка/окопѓа 5ојапасеагит (5ткП) ХариисНт ек а!. претходно познат како Рееидотопа5 5оѓапасеагит (оти) 5ткНИ која го предизвикува кафеавото гниење на кртолите и бактериското венење на компирот и доматите (во натамошниот текст штетен организам), како и други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам (во натамошниот текст растителен материјал), дадени во Прилог1 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба, се со цел да се: (а) лоцира и одреди нејзината раширеност и дистрибуција; (6) спречи нејзиното појавување и ширење и (в) ако се пронајде, да се спречи нејзното ширење и да се контролира заради целосна елиминација. Член 5 () Посебниот надзор фитосанитарниот инспектор го врши за да утврди присуство на штетениот организам во кртолите и кога е потребно на растенијата од компир (5оѓапит ќирБегозит |.) кои потекнуваат од местото на производство, кај наведениот растителен материјал како и кај растенија кои не припаѓаат во наведениот растителен материјал, вклучувајќи диви растенија домаќини од фамилијата Фо|апасеае, како и на површинската вода која се користи за наводнување или прскање за наведениот растителен материјал, почвата, тврдиот и течниот отпад исфрлен од преработувачките капацитети или погоните за пакување за да се потврди отсуството на штетниот организам. (2) При вршењето на посебниот надзор треба да зема примероци-мостри од кртоли од семенски, меркантилен компир и на наведениот растителен материјал. Препорачливо е да се земаат примероци-мостри посебно од секоја партија во складиштата и да се испитаат со лабораториско тестирање по методот утврден во Прилог 2 кој е составен дел од оваа наредба. Каде е соодветно, фитосанитарниот инспектор може да врши посебен надзор со визуелен преглед со сечење на кртолитена и наведениот растителен материјал; (а) за наведениот растителен материјал согласно Прилог 1 точка 2 од оваа наредба и (6) за растенијата домаќини кои не припаѓаат во наведениот растителен материјал и на водата вклучувајќи го течниот отпад, согласно одобрените методи и доколку е потребно, треба да се земаат примероци-мостри за лабораториско тестирање; (в) каде што е соодветно за друг материјал, согласно утврените методи. (5) Посебниот надзор, во случај на растенија од компир и за наведениот растителен материјал се спроведува со примена на соодветни методи за земање на примероци-мостри кои подлежат на соодветно лабораториско тестирање или може да се користат и методи препорачани од страна на Европската и медитеранската организација за заштита на растенијата. (4) Бројот, потеклото, стратификацијата и времето на собирање на примероците- мострите се одредува врз основа на сигурни научни принципи, биологијата на штетниот организам и земајки го во предвид начинот на производство на компир, производство на наведениот растителен материјал и доколку е погодно, на други растенија домаќини на штетниот организам за потврдување на отството на штетниот организмот. Член 4 При вршење на посебен надзор фитосанитарниот инспектор треба да утврди дека нема сомнителната појава или потврдена присутност на штетен организам кај растенијата од компир, кртоли и за наведениот растителен материјал, кога се берат, складираат или пласираат на пазар, од сопственици регистрирани согласно Правилникот за формата, содржината и начинот на водење на Регистарот на производители, преработувачи, увозници и дистрибутери на растенија, растителни производи и други објекти и предмети (2). () Правилникот за формата, содржината и начинот на водење на Регистарот на производители, преработувачи, увозници и дистрибутери на растенија, растителни производи и други објекти и предмети е усогласен со одребите на Директивата на Советот бр.2000/29/ЕЗ од 8 мај 2000 за заштитните мерки против воведување во Заедницата на организми штетни за растенијата или растителните производи и против нивното ширење во Заедницата, се|ех број 2200010029; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2001/35/ЕЗ на 8 Мај 2001 година, се|ех број 2001/0055; изменета и дополнета со Директивата бр. 2002/28/ЕЗ од 19 март 2002 година, сејех број 52002/0028; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2002/56/ЕЗ на 29 април 2002 година, се|ех број 52002100356; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр. 2002/89/ЕЗ од 28 ноември 2002 година, се|ех број 2200210089; изменета и дополнета со Директивата бр. 2005/22/ЕЗ од 24 март 2005 година, сеѓех број 5200510022; изменета и дополнета со Регулативата на Советот (ЕЗ) бр.806/2005 од 14 април 2005 година, сејех број 22003К0806; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/47/ЕЗ на 4 јуни 2005 година, сејех број 3200310047; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2003/116/ЕЗ од 4 декември 2005 година, се|ех број 5200 510116; изменета и дополнета со Директивата бр.2004/51/ЕЗ од 17 март 2004 година, сеѓех број 52004/10051; изменета и дополнета со Директивата бр.2004/70/ЕЗ од 28 април 2004 година, се/ех број 220041 0070; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2004/102/ЕЗ на 5 октомври 2004 година, се|ех број 2200410102; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр. 2005/15/ЕЗ од 28 февруари 2005 година, сеѓех број 52005/0015;изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/16/ЕЗ на 2 март 2005 година, се|ех број 5200510016; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/77/ЕЗ од 11 ноември 2005 година, сејех број 2200510077; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2006/14/ЕЗ од 6 февруари 2006 година, сеѓех број 5200610014, изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2006/55/ЕЗ од 24 март 2006 година, сејех број 3200610055; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2007/41/ЕЗ од 28 јуни 2007 година, се|ех број 220071 0041; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2008/64 /ЕЗ од 27 јуни 2008 година, сејех број 52008 10064; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата 2008/109/ЕЗ од 28 ноември 2008 година, се|ех број 5200810109; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2009/7/ЕЗ на10 февруари 2009 година, се|ех број 5200910007; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2009/118/ЕЗ на 9 септември 2009 година, сејех број 2200910118; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр.2009/145/ЕЗ од 26 ноември 2009 година, сејех број 3200910143; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2010/1/ЕУ од 8 јануари 2010 година, сеѓех број 5201010001; Директивата на Комисијата бр.1992/90/ЕЗ од 5 ноември 1992 година за утврдување на обврските кои се однесуваат на производителите или увозниците на растенија, растителни производи и други објекти и за утврдување на деталите за нивна регистрација, се|ех број 51992/0090; Директивата на Комисијата бр.995/50/ЕЗ од 24 јуни 1995 година за определунање на одредени растенија кои не се во Анекс У дел А од Директивата на Советот бр.77/95/ЕЗ, чии производители или складишта, дистрибутивни центри во производните зони на вакви растенија, треба да бидат внесени во службен регистар, се|ех број 2199510050. Член 5 () Во случај на сомневање за појава на штетниот организам, фитосанитарниот инспектор по пријавен случај за сомневање, треба да изврши посебен надзор. При лабораториски тестирања се користи методот утврден во Прилог 2 од оваа наредба и согласно условите од Прилог 3 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба, за да се потврди или да се побие сомневањето за појавата на штетниот организам. Во случај, да се потврди сомневањето на штетниот организам, треба да се превземат мерките од Прилог 5 точка 2 од оваа наредба. (2) Заради потврдување или побивање на сомневањето за појава на штетен организм од став (1) од овој член, каде: 1. биле забележани сомнителни дијагностички и визуелни симптоми од болеста, односно биле забележани видливи знаци на болеста; или 2. имунофлуоросцентниот тест од Прилог 2 од оваа наредба или други соодветни тестови биле позитивни од брзиот тест за анализа, наведен во Прилог 2 Дел 1 точка 1 и Дел 2 од оваа наредба или од скининг тестот од Прилог 2 Дел 1 точка 2 и Дел 3 од оваа наредба, фитосанитарниот инспектор треба да: го забрани пуштањето во промет или преместување на сите растенија и кртоли од сите посеви, партии или пратки на растенија и кртоли од кои се земени примероците, освен оние кои се под нивна контрола и ако е утврдено дека нема опасност од ширење на штетниот организам; преземе мерки за откривање на можниот извор заради утврдување и следење на потеклото на сомневањето за појавата на штетниот организам; преземе мерки за откривање на можниот извор од контаминација на наведениот растителен материјал или површинската вода заради утврдување и следење на потеклото на сомневањето за појавата на штетниот организам; воведе соодветни дополнителни заштитни мерки врз основа на проценка на ризик, за да се спречи секакво ширење на штетниот организам. Таквите мерки може да вклучат контрола на местото на производство на наведениот растителен материјал или површинска вода, семенски и меркантилен компир и негово пуштањето во промет, како и преместување на сите други кртоли или растенија внатре или надвор од просторите, кои се поврзани со сомневањето за појавата и воведе карантин на местото на производство со посебен фитосанитарен надзор. Член 6 Ако со посебениот надзор или лабораториски тестирања користени по методот утврден во Прилог 2 од оваа наредба, се потврди присутноста на штетениот организам во примероците мострите на наведениот растителен материјал, кртоли од компир или делови од растенија, фитосанитарниот инспектор имајќи ја во предвид биологијата на штетениот организам, посебно производството, маркетингот, промет и преработувачките капацитети, треба: (а) за наведениот растителен материјал: 1. да спроведе посебен надзор за да го определи степенот и примарните извори на контаминација согласно одредбите од Прилог 4 кој е составен дел од оваа наредба, дополнителни тестирања согласно член 5 став (1) од оваа наредба, на целата клонски сродна резерва од семенски компир и 2. да ги прогласи за контаминирани наведениот растителен материјал, кртолите, пратката и/или партијата, машините, опремата, превозните средства, садовите, складиштето или сите делови од нив, како и други предмети, вклучувајки ја амбалажата и материјалот за пакување, од кои се земени примероците, местото(ата) на производство и полетојињата) од каде бил земен наведениот растителен материјал или кртолите и 5. да одреди, земајќи ги предвид одредбите од Прилог 5 точка 1 и точка 2 кој е составен дел од оваа наредба, степенот на можната контаминација преку контакт пред или по бербата или преку производството, системите за наводнување или прскање со означената контаминација и можното ширење на штетниот организам; 4. да демаркира зона врз основа на објавената контаминација до : степенот на можната контаминација и можното ширење на штетениот организмот согласно Прилог 5 точка 2 и точка 3 од оваа наредба. (6) во однос на посевите со растенија домаќини кои не припаѓаат во оние наведени во точка (а) од овој член каде производството на наведениот растителен материјал се идентификува како ризичен, да: спроведе посебен надзор согласно точка (а) од овој члени ги прогласат за контаминирани растенијата домаќини на штениот организам од кои што е земена мостратаи ја определат можната контаминација и да демаркира зона согласно точка (а) од овој член во однос на производството на наведениот растителен материјал; (8) во однос на површинската вода (вклучувајќи го течниот отпад исфрлен од преработувачките капацитети или погоните за пакување кои располагаат со наведениот растителен материјал) и придружните диви растенија домаќини од фамилијата Фо|апасеае, каде производството на наведениот растителен материјал се идентификува како ризичен поради наводнувањето, прскањето или течењето на површинската вода, да спроведе официјално испитување во погодно време на примероци-мостри од површинската вода и од дивите растенија домаќини од фамилијата 5о|апасеае, доколку се присутни, со цел да се одреди степенот на контаминација и ја прогласат за контаминирана површинската вода од која се земени примероците- мострите, до определен степен и врз основа на испитувањата и определи можна контаминација и да ја демаркира зоната врз основа на објавената контаминација и можното ширење на штетниот организам земајќи ги предвид одредбите од Прилог 5 точките Т и 2 од оваа наредба. Член 7 () Таму каде што наведениот растителен метеријал бил прогласен за контаминиран согласно член 6 точка (а) од оваа наредба да не се садат и под контрола на фитосанитарниот инспекторт да биде подложен на една од одредбите од Прилог 6 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба, со цел дека не постои ризик за ширење на штетниот организам и отпадот од истите да биде отстранет согласно Прилог 7 кој е составен дел од оваа наредба. (2) Таму каде што наведениот наведениот растителен метеријал кој е прогласен за можно контаминиран согласно член б точка (а) и точка (в) од оваа наредба, вклучувајќи го растителниот материјал од кој е идентификуван ризикот, произведен на местата на производство кои се прогласени за можно контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба, да не се садат и под контрола на фитосанитарниот инспекторт, да биде ставен под соодветна употреба согласно Прилог 6 точка 2 од оваа наредба, со цел дека не постои ризик за ширење на штетниот организам. (5) Под надзор на фитосанитарниот инспекторт секоја машина, превозно средство, опрема, садови, складишта и делови од нив или други предмети, амбалажа и материјалот за пакување, кои се прогласени за контаминирани согласно член б точка (а) од оваа наредба или одредени за можно контаминирани согласно член 6 точка (а) и точка (в) од оваа наредба треба да бидат уништени или исчистени и дезинфицирани со употреба на соодветни методи, согласно Прилог 6 точка 3 од оваа наредба. По извршената дезинфекцијата, ваквите предмети нема да се сметаат како контаминирани. (4) Како резултат од тестирањето понатамошното назначување на контаминацијата, определувањето на степенот од можното заразување и демаркирање на зоната, согласно член 6 од оваа наредба. (5) Без оглед на ставовите 1, 2 и 5 од овој член фитосанитарниот инспекторт во зоната која е демаркирана согласно член 6 точка (а) и точка (в) од оваа наредба, утврдува серии од мерки, согласно Прилог 4 точка 4.1 и точка 4.2 од оваа наредба. Член 8 Семенскиот компир треба да се тестира за да се утврди дали ги исполнува посебните фитосанитарни барања и дали потекнува непосредно од материјал, кој е добиен во рамките на официјално одобрена програма, со официјални контролирани тестови по методот од Прилог 2 од оваа наредба, дека е слободен од штетниот организам. Ова тестирање се спроведува во случаи кога: (а) било потврдено присуство на штетниот организам во семенски компир кои самите го произведуваат: со тестирање во раната фаза на размножување, вклучувајќи ја почетна клонска селекција и систематско тестирање на основното клонирано семе од компир; или каде било утврдено дека не постои клонска поврзаност, со помош на тестирање на основното клонирано семе од компир или тестирањата во раната фаза на размножување вклучувајќи ја почетна клонска селекција и (6) во случаи кога треба да се утврди отсуството на штетниот организам на секое растение од почетна клонска селекција или на репрезентативните примероците-мострите од основниот семенски компир или компирот од претходните размножувања. Член 9 Без оглед на одредбите од оваа наредба согласно Правилникот за научни и технички капацитети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи (?), по одобрување од страна на Фитосанитарната управа може да се изврши увоз за внесување или движење на штетни организми, растенија, растителни производи и други објекти и предмети наменети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи, во кои случаи не се применуваат одредбите од членовите б и 7 од оваа наредба, под услов да не се наруши контролата врз штетниот организам и да не се предизвика ризик од ширење на штетниот организам. (2) Правилникот за научни и технички капацитети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи е усогласен со одребите на Директивата на Комисијата бр. 2008/61/ЕС на 17 Јуни 2008 за утврдување на условите под кои одредени штетни организми, растенија, растителни производи и други објекти наведени во анексите од | до У Директивата на Советот 2000/29/ЕС може да се внесат во или движат во рамките на Заедницата или одредени заштитени зони од него, за експерименти или научни цели и за работа на сортната селекција, се|ех број 2200810061. Член 10 (1) Доколку условите тоа го налагаат може да се применат и други дополнителни или построги мерки заради уништување на штетниот организам или да се спречи неговото ширење. (2) Дополнителните мерки наведени од став (1) од овој член можат да вклучат упатство дека може да се сади само семенскиот компир, кој е официјално потврден или официјално прегледан и ги исполнува бараните фитосанитарни стандарди за здравствената состојба на растението и истото се однесува и за наведениот растителен метеријал. Член 1 Со денот на влегувањето во сила на оваа наредба престанува да важи Наредбата за систематски контроли и мерки за спречување на ширењето и за сузбивање на бактериското венење и кафеавото гниење на компирот предизвикано од бактеријата Кај5копѓа 5оГапасеагит (5ткН) Харииснтека!. („Службен весник на Република Македонија“ бр. 52/07). Член 12 Оваа наредба влегува во сила осмиот ден од денот на објавувањето во „Службен весник на П Република Македонија“. Бр.17- 522/4 Министер за земјоделство, септември 2011 година шумарство и водостопанство, Скопје ЈБупчо Димовски, ср. ПРИЛОГ1 Ва|5копѓа 5оГапасеагит (от) УаБииснт ек а. ПРЕДИЗВИКУВАЧ НА КАФЕАВОТО ГНИЕЊЕ НА КРТОЛИТЕ И БАКТЕРИСКО ВЕНЕЕЊЕ НА КОМПИРОТ И ДОМАТИТЕ И НЕГОВИ РАСТЕНИЈА ДОМАЌИНИ 1. Кабкопѓа зоѓапасеагит (5тиН) УаБиисН! ек а!. предизвикувач на кафеавото гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите, е еден од значајните организми кои се штетни за компирите и доматите. Со официјална инспекција или посебен надзор се вршат испитувања кои се потребни за локализирање на патогенот, но земајќи го предвид фактот дека под определени климатски услови оваа болест може да остане латентна и незабележана како при растењето на надземните делови од компирот така и кај кртолите и земање на примероци мостри, бидејќи патогенот може да се прошири преку површинската вода или дивите растенија од фамилијата Фо|апасеае, особено со наводнување на посеви од компир и домати со контаминирана вода може да претставува ризик за инфекција и негово ширење во овие насади. Штетниот организам може да опстане преку зима кај самоникнати растенија (волонтери) од компири и домати и тие може да претставуваат главен извор за пренесување на инфекцијата од една година во друга, односно од една вегетациона сезона во друга. Штетниот организам се пренесува и шири и преку контаминирање на компири кои дошле во контакт со заразени и заболени компири за време на садењето, бербата, опремата за ракување, превозните средства или садовите за складирање кои биле контаминирани со штетниот организам од претходно заразени и заболени компири. Листата на растенија домаќини на Ка/окопѓа 5оГапасеагит (5тиН) УариисН! еќ а!. наведени во членот 2 од оваа наредба. Растенија (вклучувајќи кртоли), освен вистинско семе на Фо|апит ќирегозит |., - компири Растенија, освен плодови и семе од | усорегојсоп Гусореготсит (1..) Кагокеп ех Еагм. - домати 2. При вршење на посебен надзор фитосанитарниот инспектор треба да изврши испитувања согласно член 3 став (2) точка (а) од оваа наредба кои се базираат на биологијата на штетниот организам и соодветни производни системи ,каде : (а) во случај на компир: во соодветно време, визуелна инспекција на посевот, и/или земање примероци- мостри од семето и други компири во вегетационата сезона или во складиштата. Овие примероци-мостри треба да бидат предмет на официјална инспекција и посебен надзор со визуелна инспекција со сечење на кртолите; и во случај на семе од компири и доколку е возможно за други компири, официјални лабораториско тестирање со употреба на методот согласно Прилог 2 од оваа наредба. (6) во случај на домат: визуелна инспекција, во соодветно време на посевот од растенијата наменети за пресадување за професионална употреба. 5. При вршење на посебен надзор фитосанитарниот инспектор треба да извести од официјалното испитување согласно член 3 став (5) од оваа наредба кое содржи: (а) во случај на испитување на компири: проценка на вкупната површина, во хектари, засадена со семе и други компири; стратификација по категорија односно семенската категорија од семе и меркантилен компири, и каде што е соодветно по региони; број и време на земање на примероци/((мостри) за тестирање; број на визуелни инспекции во полето и број (и големина на примерокот/(мострата) од визуелната инспекција на кртолите. (6) во случај на испитување на псеви од домати наменети за пресадување за професионална употреба: вкупниот број од проценети растенија и број на визуелни инспекции. (8) во случај на испитување на растенијата домаќини кои не се домати и компири, вклучувајќи ги дивите растенија домаќини од фамилијата о|апасеае: видовите; бројот и времето на земените примероци-мостри; областа/реката од која се земаат примероците-мострите и методот на анализи; () во случај на испитување на водата и течениот отпад испуштен од преработувачките капацитети или погоните за пакување: бројот и времето на земените примероци-мостри; областа/реката/локацијата на објектите од кои се земени примероците - мострите и методот на анализи. ПРИЛОГ 2 ТЕСТ ШЕМА ЗА ДИЈАГНОЗА, ОТКРИВАЊЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЈА НА БАКТЕРИЈАТА НА КАФЕАВО ГНИЕЊЕ НА КРТОЛИТЕ И БАКТЕРИСКО ВЕНЕЕЊЕ НА КОМПИРОТИ ДОМАТИТЕ ВаЊкопта 5о|апасеагит (5тИКП) УаБиисН! ек а!. ОПСЕГ НА ТЕСТ ШЕМАТА Следната шема ги опишува различните постапки вклучени во: (1) дијагнозата на кафеавото гниење кај кртолите и бактериско венеење кај компирот, доматот и некои други растенија-домаќини; (2) откривање и детекција на Ка/екопѓа 5оГапасеагит (5тН) УаБииснт ек а|во примероци на кртоли, компир, домат и други растенија-домаќини, водата и почвата; (5) идентификација на Ва/екопѓа зоѓапасеагит (Ф5тП) УабиисНт ес а!. (оп. Реидотопа5 оо|апасеагит), (во натамошниот текст како Ќ. 5оГапасеагит). ОПШТИ ПРИНЦИПИ Во додатоците обезбедени се оптималните протоколи за различни методи, потврдени реагенси и детали за подготовка на материјалите за тестирање и контрола. Лаборатории вклучени во оптимизирањето и потврдувањето на протоколите се наведени во Додаток 1. Бидејќи протоколите вклучуваат откривање на карантински организам и ја вклучуваат употребата на живи култури на Ќ. 5о|апасеагит како контролен материјал, потребно е да се спроведат постапките под соодветни карантински услови со соодветни средства за отпадните материјали и според условите со соодветни одобренија, издадени од Фитосанитарната управа. Параметрите за тестирање мора да обезбедат веродостојна и репродуктивна детекција на нивоата на Ќ. 5о|апасеагит на поставените прагови од избраните методи. Најважно е да се изврши соодветна подготовка на позитивните контроли. Тестирањето според бараните прагови, исто така укажува на точни поставки, одржување и калибрирање на опремата, внимателно ракување и чување на реагенсите и сите мерки за спречување контаминација помеѓу примероците, т.е. одделување на позитивните контроли од примероците за тестирање. Мора да се применуваат стандардите за контрола, со цел да се избегнат административни и други грешки, особено во врска со означувањето и документацијата. Сомневањето за појавата како што е наведено во член 5 став (2), доколку укажува на позитивен резултат во дијагностицирањето или тестовите за анализа кои се извршени на примерокот, наведено е во графиконите. Ако првиот тест за анализа е позитивен (ГЕ тест, РСК /ЕоН, селективна изолација), треба да се потврди со втор тест за анализаврз врз основа на различни биолошки принципи. Ако првиот тест за анализа (Е или РСВ /Е5Н ) е позитивен, тогаш постои сомнеж за контаминација со Ќ. зоѓапасеагит и затоа мора да се направи второ тестирање. Ако второто тестирање е позитивно, тогаш се потврдува сомнежот (сомневањето за појавата) и мора да се продолжи тестирањето според шемата. Ако вториот тест за анализа е негативен, тогаш примерокот се смета дека не е заразен со ЌК. 5о|апасеагит. Потврдено присуство, како што е наведено во член 6 став (1), од наредбата, укажува на изолација и идентификација на чиста култура на Ќ. 5оГапасеагит, со потврда на патогеноста. ДЕЛ1 1. ДИЈАГРАМСКИ ПРИКАЗ 1.1. Шема на откривање за дијагноза на кафеаво гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите Ка!окопѓа 5оГапасеагит кај кртоли и компир, домат или други растенија домаќини со симптоми на кафеаво гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите Постапката за тестирање е наменета за кртолите и растенија со симптоми типични за или кои упатуваат на сомневање на кафеаво гниење на кртолите и бактериско венење на компирот и доматите. Постапката вклучува брз тест за анализа, изолација на патогенот од заразеното спроводното ткиво на медиум за дијагностицирање и во случај на позитивен резултат, идентификација на култура на Ќа/екопѓа 5о|апасеагит. (1) За опис на овие симптоми видете Дел 11. (2) Брзите дијагностички тестови ја олеснуваат веројатноста на поставувањето на дијагнозата, но не се од суштинско значење. Негативниот резултат не гарантира секогаш отсуство на патогенот. (5) Тест за ексудација на стеблото (стриминг тест) на бактериски исцедок од спроводното ткиво на стеблото е опишан во Дел 6. А.. (4) Тестот за поли-?-хидроксибутират гранули во бактериски клетки е опишан во Дел 6. А.2. (5) Серолошките тестови за аглутинација на бактериски исцедок или екстракти од симптоматично ткиво се опишани во Дел 6. А.5. (6) Е тестот за бактериски исцедок суспендиран во вода или екстракти од симптоматично ткиво е опишан во Дел б. А.5. (7) ЕН тестот за бактериски исцедок суспендиран во вода или екстракти од симптоматично ткиво е опишан во Дел 6. А.7. (8) Е(5ФА тестот за бактериски исцедок суспендиран во вода или екстракти од симптоматично ткиво е опишан во Дел б. А.8. (9) РСВ тестот за бактериски исцедок суспендиран во вода или екстракти од симптоматично ткиво е опишан во Дел б. А.б. (10) Патогенот најчесто лесно се изолира од симптоматичниот растителен материјал со растворена размаска во Дел 2.5. (0) Типичната морфологија на колоната е опишана во Дел 2. 3.(г.) (12) Одгледувањето култури може да не биде успешно во случаи на напреден стадиум на инфекцијата што се должи на натпреварување или пребрзо растење на сапрофитските бактерии. Ако симптомите на болеста се типични, но тестот на изолација е негативен, тогаш изолацијата мора да се повтори, првенствено користејќи тест на селективна размаска. (15) Веродостојна идентификација на чисти култури на веројатност на изолатите на ВЌ. 5о|апасеагит се постигнува со користење на тестовите опишани во Дел б. Б. Субспецифичната карактеризација е изборна, но се препорачува во за секој нов случај. (14) Тестот за патогеност е опишан во Дел 6. В. 2. Шема за откривање и идентификација на Ка/екопѓа 5о|апасеагит (5) УаБиисНГ ека. во примероци од кртоли на компири без симптоми Принцип Постапката за тестирање е наменета за откривање на латентни инфекции во кртоли на компирот. Мора да се потврди позитивен резултат од најмалку два теста, врз основа на различни биолошки принципи, преку изолација на патогенот, проследено со изолација на типичн колонии, потврда за чиста култура на Ка|екопѓа 5оГапасеагит. Позитивниот резултат од само еден тест за анализа не е доволен да се смета за сомнителен тој примерок. Тестовите за анализа и тестовите со изолација мора да овозможуваат праг на откривање од 105 до 104 клетки/мл на гранулат(талог), вклучувајки како и позитивни контроли во секоја серија тестови. () Стандардната големина на примерокот е 200 кртоли, иако постапката може да се искористи и со помали примероци/мостри , ако нема 200 кртоли. (2) Методите за екстракција (ексудација на стеблото) и концентрација на патогенот наведени во Дел 3.11. (5) Ако најмалку два теста направени врз основа на различни биолошки принципи се позитивни, треба да се изврши изолација и потврдување. Треба да се направи најмалку еден тест за анализа. Кога овој тест е негативен, примерокот се смета за негативен. Во случај овој тест да биде позитивен, потребно е да се направи втор или повеќе тестови врз основа на различни биолошки принципи со цел да се потврди позитивниот резултат. Ако вториот или другите тестови се негативни, примерокот се смета за негативен. Понатамошни тестови не се потребни. (4) ГЕ тестот е опишан во Дел б. А.5. (5) Тестот на селективна изолација е опишан во Дел б. Ад. (6) РСВ тестовите се опишани во Дел 6. А.б. (7) ЕН тестот е опишан во Дел 6. А.7. (8) ЕЦ5А тестовите се опишани во Дел б. А.8. (9) Биоанализата е опишана во Дел 6. А.9. (10) Типичната морфологија на колоната е опишана во Дел 2. 3.(г.) (0) Одгледувањето култури или биоанализата може да не биде успешна поради конкуренцијата или попречувањето од сапрофитските бактерии. Ако со тестовите за анализа се постигнат позитивни резултати, но тестовите за изолација се негативни, треба да се повторат тестовите од истите пелети т.е. подлоги или со земање дополнително од спроводно ткиво во близина на окцето од пресечените кртоли од истиот примерок и ако е потребно да се тестираат дополнителни примероци. (12) Веродостојна идентификација на чисти култури на веројатност на изолати на В. зоГапасеагит се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел 6. Б. (15) Тестот за патогеност е опишан во Дел 6. В. 5. Шема за откривање и идентификација на Ка/окопѓа 5оГапасеагит (Џ5тиП) Харииснт ек а|во примероци од компир, домат или други растенија-домаќини без симптоми () Видете Дел 5.2.1. за препорачаната големина на примерокот. (2) Методите за екстракција (ексудација на стеблото) и концентрирање на патоген се опишани во Дел 5.2.1. (5) Ако најмалку два теста направени врз основа на различни биолошки принципи се позитивни, треба да се изврши изолација и потврдување. Треба да се направи најмалку еден тест за анализа. Кога овој тест е негативен, примерокот се смета за негативен. Во случај овој тест да биде позитивен, потребно е да се направи втор или повеќе тестови врз основа на различни биолошки принципи со цел да се потврди позитивниот резултат. Ако вториот или другите тестови се негативни, примерокот се смета за негативен Понатамошни тестови не се потребни. (4) Тестот на селективна изолација е опишан во Дел 6. А.А. (5) Е тестот е опишан во Дел б. А.5. (6) РСВ тестовите се опишани во Дел 6. А.б. (7) ЕН тестот е опишан во Дел 6. А.7. (8) ЕЦФА тестовите се опишани во Дел б. А.8. (9) Биоанализата е опишан во Дел 6. А.9. (10) Типичната морфологија на колоната е опишана во Дел 2.3.г. (П) Одгледувањето култури или биоанализата може да бидат неуспешни поради конкурентност или инхибирање на сапрофитски бактерии. Ако со тестовите за анализа се добијат позитивни резултати, а тестовите на изолација се негативни, тогаш тестовите за изолација се повторуваат. (12) Веродостојна идентификација на чисти култури на веројатност на изолати на В. 5о|апасеагит се постигнува со користење на тестовите опишани во Дел 6. Б. (15) Тестот за патогеност е опишан во Дел б. В. ДЕЛ 2 ДЕТАЛНИ МЕТОДИ ЗА ДЕТЕКЦИЈА НА ВАГОТОМА ФОГАМАСЕАВЏМ ВО КРТОЛИ ОД КОМПИР, РАСТЕНИЈА ОД КОМПИР, ДОМАТ И ДРУГИ РАСТЕНИЈА ДОМАЌИНИ СО СИМПТОМИ НА КАФЕАВО ГНИЕЊЕ ИЛИ БАКТЕРИСКО ВЕНЕЊЕ 11. Симптоми кај компирот Растенија од компир. Раниот стадиум на инфекцијата во поле се препознава по венеење на листовите кон врвот на растението на високи температури во текот на денот и опоравување преку ноќта. Во раните стадиуми на венењето, листовите остануваат зелени, но подоцна жолтеат и се развива кафеава некроза. Епинасти исто така се појавуваат. Венењето на еден изданок или на цело растение за кратко време станува неповратно и доведува до колапс и смрт на растението. Спроводното ткиво на попречно пресечените стебла од овенатите растенија вообичаено се појавува кафеав и млечен бактериск исцедок (ексудат) кој истекува од пресечената површина или се појавува при притискање. Кога пресеченото стебло се става вертикално во вода, од спроводните снопови протекуваат слузести нишки односно конци. Кртоли од компир. Кртолите мора да се исечат попречно блиску до окцето или по должината преку окцето на кртолата. Раниот стадиум на заразата се препознава по стаклестото жолто до светлокафеаво обојување на васкуларниот прстен од каде спонтано истекува блед кремав бактериски исцедок (ексудат) по неколку минути. Понатаму, васкуларното обезбојување станува уште поистакнато кафеаво и некрозата може да се прошири во паренхимското ткивото. Во понапредните стадиуми, заразата се шири нанадвор од окцето и "ркулците од каде што може да се исцеди бактериски слуз предизвикувајќи спојување на честички земја. Црвеникаво кафеави, донекаде вдлабнати лезии може да се појават на лушпата, што се должи на внатрешниот колапс на спроводното ткиво. Секундарниот развој од габи и бактерии предизвикувачи на меко гниење е вообичаено за напредните стадиуми на болеста. 1.2. Симптоми кај доматот Растенија од домат. Првиот видлив симптом е млитавиот изглед на најмладите листови. При поволни услови во средината за патогенот (температура на почвата приближно 25"С и заситена влажност) се појавуваат епинастии и венеење на едната страна или на целото растение, проследено за неколку денови што доведува до целосен колапс на растението. Ако условите не се поволни (температура на почвата под 21"О), се јавува помалку венење, но може да се развијат голем број на адвентивни корени на стеблото. Може да се набњудуваат како во вода натопени дамки од основата на стеблото, што укажува на некроза на васкуларниот систем. Кога стеблото е пресечено напречно, од обезбоените кафеави васкуларни ткива се цеди бел или жолтеникав бактериски исцедок. 1.5. Симптоми кај други домаќини Растенија на 5ојапит дијсатага и Фо|јапит пидгит. Во природни услови, симптомите на венење ретко се забележуваат кај овие плевелни растенија- домаќини, доколку температурата на почвата е повисока од 25“С или нивото на инокулација е екстремно високо (на пример, за 5. птагит што расте со заболени растенија на компир или домат). Во случај да се појави венење, симптомите се исти како кај доматот. Растенија на 5оѓапит дијсатага кои не венеат, растат со стеблото и корените во вода може да покажуваат светлокафеаво обезбојување на васкуларните ткива на попречен т.е дијагонален пресек на основата на стеблото или на подводните делови на стеблото. Може да има бактериски исцедок (ексудат) од пресечените спроводни ткива или може да се формираат слузести нишки односно конци ако пресеченото стебло се стави вертикално во вода, дури и во отсуство на симптоми на венење. 2. Брзи тестови за анализа (скрининг тестови) Брзите дијагностички тестови ја олеснуваат веројатноста на поставувањето на дијагноза, но не се од суштинско значење. Искористете еден или повеќе од следниве потврдени тестови: 2.1. Тест на ексудација на стеблото (стриминг тест) (видете Дел б. А.1.) 2.2. Откривање на поли-? -хидроксибутират (РНВ) гранули. Карактеристичните РНВ гранули во клетките на В. 5о|апасеагит се врши фиксирање со топлина и боење на размаската на бактериски исцедок од инфицираното ткиво, со бои на Нил сино А или Судан црно (видете Дел 6. А.2.) и се визуализира на микроскопско стакленце. 2.5. Серолошки тестови за аглутинација (видете Дел 6. А.3.) 2.4. Останати тестови Натамошните соодветни брзи тестови за анализа вклучуваат |Е тест (видете Дел 6. А.5.), ЕН тест (видете Дел 6. А.7.), ЕЦФА тест (видете Дел 6. А.8.) и РСВ тестови (видете Дел 6. А.б). 5. Постапки за изолирање (а) Отстранете исцедок или делови од обезбоеното ткиво од васкуларниот прстен на кртолите или од васкуларните садови на стеблото на компирот, доматот или други растенија-домаќини кои венеат. Суспендирајте ги во мала количина стерилна дестилирана вода или 50тМ фосфатен пуфер (Додаток 4) и оставете ги од 5 до 10 минути. (6) Подгответе серија децимални раствори на суспензијата. (в) Префрлете 50-100 џ! на суспензијата и растворите во општ хранлив медиум (МА, УРОА или ОРА; видете Додаток 2) и/или во Келманов тетразолиум медиум (Додаток 2) и/или потврден селективен медиум (на пример, 5М5А; видете Додаток 2). Се развлекува или размачкува на плочката со соодветна техника. Доколку е корисно, подгответе посебни плочки со растворена клеточна суспензија на К. оГапасеагит биовар 2 за позитивна контрола. (г) Плочките се инкубираат за два до шест дена на температура од 28“С. На општиот хранлив медиум/(хранлива подлога), вирулентните изолати на Ќ. 5о апасеагит развиваат бисерно кремаво-бели, плоснати, неправилни и флуидни колонии, често со карактеристично венче во центарот. Авирулентните форми на В. 5оГапасеагит формираат мали, кружни, нефлуидни маслени колонии кои се целосно кремаво-бели. На Келмановиот тетразолиум и 5М59А медиум/подлога, бојата на венчињата е крваво црвена. Авирулентните форми на Ќ. 5о|апасеагит формираат мали, кружни, нефлуидни маслени колонии кои се целосно темноцрвени. 4. Тестови за идентификација за Ќ. 5оГапасеагит Тестовите кои го потврдуваат идентитетот на пресумптивните- веројатните изолати на В. 5о|апасеагит се дадено во Дел б. Б. ДЕЛ! 1. Детални методи за откривање и идентификување на Ва|окопѓа 5о|апасеагит во примероци на кртоли без симптоми 11. Подготовка на примерокот Забелешка: Стандардната големина на примерокот е 200 кртоли по тест. Поинтензивното земање примероци бара повеќе тестови на примероци со оваа големина. Поголемиот број кртоли во примерокот доведува до инхибирање (запирање) или тешко толкување на резултатите. Меѓутоа, постапката може лесно да се примени за примероци со помалку од 200 кртоли, каде на располагање се помалку кртоли. Потврдувањето на сите методи за откривање наведени подолу се заснова врз тестирање на примероци од 200 кртоли. Екстрактот добиен од компир наведени подолу може да биде искористен и за откривање на бактерии на прстенесто гниење кај компирот, СамБаскег гисНидапеп515 5иБор. зередоп!си5. Изборно предтретман во однапред подготвен примерок: (а) Инкубација на примероци на температура од 25 до 50“С, до две недели пред тестирањето, за да се охрабри размножувањето на евентуална популација на Ќ. 5о|апасеагит. (6) Кртолите се мијат. Користете соодветни средства за дезинфекција (соединенија на хлор кога треба да се користи РСВ тест со цел да се отстрани патогената ДНК) и детергенти помеѓу секој примерок. Кртолите се сушат на воздух. Оваа постапка на миење е особено корисна (но не е задолжителна) за примероци со многу почва и ако треба да се изврши РС тест или постапка на директна изолација. 111. Со чист и дезинфициран скалпел или нож се отстранува кората од окцето на секоја кртола, така што ќе се гледа спроводното ткиво. Внимателно се сече мал дел од спроводното ткиво во подножјето на окцето и внимавајки да се зафати што помалку соседно неспроводно ткиво. Забелешка: Сите (изгниени) кртоли со сомнителни симптоми на кафеаво гниење се ставаат настрана и се тестираат посебно. Ако за време на отстранувањето на делот на сржта (кортекс) од окцето се забележат симптоми на кафеаво гниење, кртолата треба визуелно да се испита откако ќе се пресече во близина на окцето. Секоја пресечена кртола со сомнителни симптоми треба да се чува на собна температура во период од два дена за да се овозможи суберизација и се чува во фрижидер (на температура од 4 до 10“О) во соодветни услови на карантин. Сите кртоли, вклучувајќи ги и оние со сомнителни симптоми, треба да се чуваат според Прилог 5. 1.1.2. Соберете ја сржта (кортекс) од окцата во неискористени садови за една употреба кои може да се затворат и/или да се запечатат (во случај садовите да се користат повторно, тие треба темелно да се исчистат и да се дезинфицираат со употреба на соединенија од хлор). По можност, веднаш да се обработи. Ако ова не е можно, треба да се чуваат во сад без додавање на заштита или пуфер, да бидат ставени во фрижидер не подолго од 72 часа или не подолго од 24 часа на собна температура. Окцата на сржта (кортексот) се обработуваат со една од следниве постапки: или, (а) Сржта (кортексот) се покриваат со доволна количина (околу 40 т!) на пуфер за екстракција (Додаток 4) и се врши миксација со ротирачки мешач (50-100 врт/ мин) во период од 4 часа на температура под 24“С, или за 16 до 24 часа во фрижидер, или (6) Сржта (кортекс) од окцето се хомогенизираат со доволна количина (околу 40 т!) на пуфер за екстракција (Додаток 4), или во блендер/ миксер (на пример, МЈаппд или Џкга ТНигах) или со кршење во затворена ќесе за смекнување за една употреба (на пример, 5котасНег или ВтогеБа цврст политен, 150 тт х 250 тт; стерилизирани со радијација), користејќи гумен чекан или соодветна апаратура за ситнење (на пример, Нотех). Забелешка: Ризикот од напречна контаминација на примероците е голем кога тие се хомогенизираат со миксер. Преземете мерки на претпазливост за да избегнете создавање аеросоли или истурање за време на процесот на екстракција. Осигурете ја употребата на свежо стерилизирани ножеви на миксерот и садовите за секој примерок. Ако се користи РСВ тест, избегнете пренесување на ДНК на садовите или апаратурата за ситнење. Се препорачува кршење во ќесиња за една употреба и користење епрувети за една употреба кога се користи РС тест. 11.5. Површинскиот флуид се декантира. Ако е премногу заматен, се разбиструва или со бавно центрифугирање (не повеќе од180 д, 10 минути на температура помеѓу 4 до 10“С), или со вакумска филтрација (40 до 100 џт), миејќи го филтерот со дополнителен (околу 10 т!) пуфер за екстракција. 1.1.4. Концентрирајте го бактерискиот дел со центрифугирање на 7.000 д, 15 минути (или 10.000 д за 10 минути) на температура од 4 до 10“Си отстранете го чистиот флуид без да го попречите гранулатот и да не се помеша талогот. 1.1.5. Ресуспендирајте го гранулатот во пуфер за гранулат од 1.5 т! (Додаток 4). Се користат 500 џ за тестирање за Ќ. 5оГапасеагит, 500 џ! за СТамраскег тисИтдапеп5/5 5иБор. зередоп!си5 и 500 и за референтни цели. Се додава стерилен глицерол на конечната концентрација од 10 до 2596 (у/и) на 500 џ! од референтниот коефициент и со остатокот од количеството за тестирање, вортекс и силно се промешува и се чува на температура од -16 до -24“С (со недели) или на температура од -68 до -86“С (со месеци). Зачувајте ги аликвотните броеви на тестот на температура од 4 до 10?С за време на тестирањето. Не се препорачува повторно замрзнување и одмрзнување. Доколку екстрактот треба да се транспортира, истиот треба да се изврши во разладена комора во период од 24 до 48 часа. 11.6. Важно е сите позитивни контроли на Ќ. 5о|апасеагит и примероците да се третираат одделно, со цел да се избегне контаминација. Ова се однесува на |Е слајдовите и на сите тестови. 1.2. Тестирање Видете го дијаграмот и описот на тестовите и оптмизираните протоколи во соодветните додатоци: Селективна изолација (видете Дел 6. А.4.) ГЕ тест (видете Дел 6. А.5). РСВ тест (видете Дел 6. А.6.) ЕоН тест (видете Дел 6. А.7.) ЕНА тест (видете Дел 6. А.8.) Биоанализа тест (видете Дел 6. А.9.) 2. Детални методи за откривање и идентификување на К. 5о|апасеагит во примероци на компир, домат и други растенија-домаќини без симптоми 2.1. Подготовка на примерокот Забелешка: За откривање на латентни популации на Ќ. 5о|апасеагит, се препорачува тестирање на композитни (сложени) примероци. Постапката може да се користи за композитни (сложени) примероци до 200 делови од стебла. Онаму каде што се вршат истражувања, тие треба да се прават врз основа на статистички соодветен примерок од растителната популација која се испитува. 2.11. Ставете ги сегментите (деловите) од стеблото со големина од 1 до 2 ст во стерилен сад, според следните постапки за собирање примероци: Садниците на домат од расад: Со чист дезинфициран нож, отстранете 1 ст сегмент (дел) од основата на секое стебло, веднаш над нивото на почвата. Растенија од домат одгледани во поле или во стакленици: Со чист дезинфициран нож, се отстранува најдолниот изданок од секое растение, засекувајќи веднаш над спојот со главното стебло. Се отстранува 1 ст од најдолниот дел на секој страничен изданок. Други домаќини: Со чист дезинфициран нож или ножици за режење, отстранете 1 ст сегмент (дел) од основата на секое стебло, веднаш над нивото на почвата. Во случајот на Џо|апит Чијсатага или други растенија-домаќини кои растат во вода, отстранете делови од 1-2 ст од подводното стебло или столони со корени во вода. Кога се зема примерок од одередена локација, се препорачува да се тестира статистички репрезентативен примерок од најмалку 10 растенија на земање на примероци од местото од секој потенцијален плевел-домаќин. Откривањето на патогенот ќе биде веродостојно за време на доцна пролет, лето и есен, иако природните инфекции може да се откријат во текот на целата година кај многугодишните растенија како Џо|апит Чијсатага која расте во водени текови (водотеци). Познати како домаќини се вбројуваат самоникнати растенија од компир, Фо|апит дијсатага, 5оѓапит пјагит, ЈОаќига 5кгатоптит и други видови на фамилијата о|апасеае. Останати домаќини се Ре|агдопјит 5рр. и Рогкијаса оГегасеа. Некои видови европски плевел кои може да бидат потенцијални домаќини како засолниште на популации на Ќ. 5о|апасеагит биовар 2/раса 3 во корењата и/или ризосфери под посебни услови на околината се: Акпрѓех Пазкака, Веп5 риоза, СегазНит дотегаќит, СПепородит африт, Еираќоит саппабјпит, Оајпоода рагмиПога, Капипсии5 5с|егаќи5, Копрра 5рр, Китех 5рр. ФИепе аГфа, 5. пикап5., Тизоѓадо ѓагагта и Џгиса дојса. Забелешка: Визуелно испитување за внатрешни симптоми (васкуларно обојување или бактериски исцедок/(ексудат)) може да се направи во оваа фаза. Евентуалните сегменти на стеблото со симптоми се ставаат настрана и се тестираат одделно (видете Дел 2). 2.1.2. Дезинфицирајте ги деловите од стеблото со 7096 етанол и веднаш исушете ги со впивачка хартија. Обработете ги деловите од стеблото со една од следниве процедури: или (а) Покријте ги деловите со доволно количество (приближно 40 т!) пуфер за екстракција (Додаток 4) и извршете мешење со ротирачки мешач (50 до 100 врт/мин) во период од 4 часа, на температура под 24"С или 16 до 24 часа чување во фрижидер, (6) Обработете веднаш со кршење на деловите во цврсто ќесе за гмечење , (мацерирање) (на пр. 5котаснег или ВѓогеБа) со соодветно количество пуфер за екстракција (Додаток 4), со користење на гумен чекан или соодветна апаратура за ситнење (на пр. Нотех). Ако ова не е можно, деловите од стеблото треба да се чуваат замрзнати не подолго од 72 часа или не подолго од 24 часа на собна температура. 2.1.5. Претурете го чистиот флуид откако ќе отстои за 15 минути. 2.14. Вообичаено, не е потребно понатамошно прочистување на екстрактот или концентрацијата на бактерискиот дел, но тоа може да се постигне со филтрација и/или центрифугирање, како што е опишано во Дел 5. од 1.1.3. до 11.5. 2.1.5. Поделете го концентрираниот екстракт за примерок на два еднакви дела. Едната половина чувајте ја на температура од 4 до 10“С за време на тестирањето, а другата половина чувајте ја со 10 до 259 (џ/у) стерилен глицерол на температура од -16 до -24“С (со недели) или на -68 до 86“С (со месеци), ако е потребно понатамошно тестирање. 2.2. Тестирање Видете го дијаграмот и описот на тестовите и оптмизираните протоколи во соодветните додатоци: Селективна изолација (видете Дел 6. А.4.) Е тест (видете Дел 6. А.5). РСВ тест (видете Дел 6..А.6) ЕГоН тест (видете Дел 6. А.7) ЕЦЧА тест (видете Дел б..А.8.) Биоанализа /Биотест (видете Дел 6. А.9.) ДЕЛ 4 1. Шема за откривање и идентификување на Ќ. 5о|апасеагит во вода () Видете Дел 4. 2.1. за препорачани процедури за земање примероци. (2) Методите за концентрирање на патоген се опишани Дел 4.2.1. Концентрацијата ги зголемува популациите и на патогенот и на конкурентните сапрофитски бактерии и се препорачува само доколку не резултира до запирање на тестот на изолација. (5) Тестот на селективна изолација е опишан во Дел б. А.Д. (4) Биоанализата е опишан во делот 6. А.9. (5) РСВ методи за збогатување се опишани во Дел 6. А.4.2 и Дел 6. А.б. (6) ЕЦ5А методи за збогатување се опишани во Дел 6. А.4.2 и Дел б. А.8. (2) Во Дел 2. 3.(г) е содржан опис на типична морфологија на колонија. (8) Одгледувањето култури може да не биде успешно поради конкуренцијата или попречувањето од сапрофитските бактерии. Доколку постои сомнение дека сапрофитски популации влијаат врз веродостојноста на изолацијата, тогаш тестот на изолација се повторува по растворање на примерокот во стерилна вода. (9) Веродостојна идентификација на чиста веројатност на култура на Ќ. 5о|апасеагит се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел 6. Б. (10) Тестот за патогеност е опишан во Дел 6. В. 2. Методи за откривање и идентификување на В. 5о|апасеагит во вода Принцип Потврдената шема за откривање, опишана во овој дел, се применува за детекција на патогенот во примероци на површинска вода, а исто така, може да се примени за тестирање на примероци на вода од преработки на компир на или отпадни води. Сепак, важно е да се забележи дека очекуваната осетливост на откривањето ќе варира во зависност од супстратот. Осетливоста на тестот на изолација е под влијание на популациите на конкурентните сапрофитски бактерии кои вообичаено ги има повеќе во водата добиена од преработката на компирот и отпадните води отколку кај површинската вода. Додека шемата која е долунаведена се очекува да открие најмалку 10? клетки на литар во површинската вода, осетливоста на откривањето во води од преработка на компир или отпадни води најверојатно ќе биде значително пониска. За таа цел, се препорачува да се тестираат отпадните води по третмани за прочистување (на пример, седиментирање или филтрирање) и за тоа време се намалуваат популациите на сапрофитските бактерии. Ограничувањата на шемата на осетливост на тестот треба да се има предвид кога се проценува веродостојноста на евентуалните негативни резултати. Додека оваа шема за откривање успешно се користени при посебниот надзор за да утврди присуство или отсуство на патоген во површинска вода, нејзините ограничувања треба да се реалзираат кога се слични примероците од преработка на компир или отпадни води. 2.1. Подготовка на примерокот Забелешка: Детектирање на Ќ. 5о|апасеагит во површинска вода е најверодостојно за време на доцна пролет, лето и есен, кога температурата на водата е повисока од 15“С. Повторно земања на примероци во различни периоди од гореспоменатиот период на одредени примероци укажува на зголемена веродостојноста на детекција со намалувањето на последиците на климатските варијации. Да се земат предвид ефектите на обилните дождови и географијата на водените текови за да се избегне ефектот на растворање што може да го замагли присуството на патогенот. Се земаат примероци од водата во близина на растенијата-домаќини доколку се присутни домаќините. 2.11. На избраните места за земање примероци, соберете примероци од водата со полнење на стерилни епрувети или шишиња, со земање ако е можно, на длабочина, под 20 сти околуд2т од брегот на водената површина. За индустриските и отпадните води, земете примероци од местото на испуштање на тие води. Се препорачува големината на примероците да биде до 500 гп! по место. Доколку се претпочитаат помали примероци, се советува да се земат примероци на најмалку три наврати од место за земање на примероците, а секој примерок се состои од две повторувачки потпримероци од најмалку 50 т!. При интензивен посебен надзор, изберете најмалку три места за земање примероци на секои 3 Кт од текот на водата и бидете сигурни дека сте зеле примероци од притоките кои се влеваат во водниот тек. 2.1.2. Примероците се транспортираат во ладни и темни услови (4 до 10"С) и се тестираат во рок од 24 часа. 2.1.5. Доколку е потребно, бактерискиот дел може да се концентрира со користење на следниве методи: (а) центрифугирајте од 50 до 50 т! на потпримероци од 10 ООО д, за 10 минути (или 7 000 4 за 15 минути), се препорачува температура од 4 до 10“С, се отстранува делот кој плива (супернатант) и гранулатот се ресуспендира во 1 т! пуфер за екстракција (Додаток 4). (6) мембранско филтрирање (минимална големина на порите 0,45 џт) по што следува миење на филтерот во 5 до 10 т! пуфер на гранулатот и задржување на измиениот дел. Овој метод е соодветен за поголеми количества вода што содржи мал број сапрофити. Концентрирањето најчесто не се препорачува за примероци на вода од обработен компир или отпадни води, токму поради зголемените популации на конкурентните сапрофитски бактерии кои го попречуваат детектирањето на Ќа/окопѓа 5оГапасеагит. 2.2. Тестирање. Видете го дијаграмот и описот на тестовите во соодветните додатоци. ДЕЛ 5 1. Шема за откривањеи идентификување на В. 5оГапасеагит во почвата ( Примерок од почва (13 ) ( Екстракција на патогенот ) СКРИНИНГ ТЕСТ НА ЈАДРО Селективна изолација (2) Изборен дополнителен тест: РСЕ збогатување (3) 7 биоанализа (4) Колонии со типична морфологија (5) по : Сите направени тестови се изолација негативни Не е откриена Ќ.зојапасеатит примерокот не е заразен со Неа Рзовпасеатит ( Прочисти со супкултури ) ТЕСТОВИ ЗА ИДЕНТИФИКАЦИЈА (7) уна ТЕСТ ЗА ПАТОГЕНОСТ (8) ) И двата теста потврдуваат чиста култура како Ќ.зојапасеанит Примерокот не е заразен со ср В.5ојапасеагит Примерокот е заразен со В.5ојапасеагит () Видете Дел 5.2.1. за препорачаните постапки за земање примероци. (2) Тестот на селективна изолација е опишан во Дел 6. АА. (5) РСВ методи за збогатување се опишани во Дел 6. А.4.2 и Дел б. А.б. (4) Биоанализата е опишана во Дел 6. А.9. (5) Во Дел 2.3.(г) е содржан опис на типична морфологија на колонија. (6) Одгледувањето на култури може да не биде успешно поради конкуренцијата или попречувањето од сапрофитските бактерии. Доколку постои сомнение дека сапрофитски популации влијаат врз веродостојноста на изолацијата, тогаш тестот на изолација се повторува по растворање на примерокот. (7) Веродостојна идентификација на чиста веројатна култура на Ќ. 5о апасеагит се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел б. Б. (8) Тестот за патогеност е опишан во Дел 6. В. 2. Методи за откривање и идентификување на Ќ. 5о|апасеагит во почва Принципи Потврдената шема за откривање, опишана во овој дел, се применува за откривање патогени во примероци на почвата, а исто така, може да се примени за тестирање цврсти примероци од преработка на компир или отпадни води. Сепак, треба да се забележи дека овие методи не се доволно осетливи за да гарантираат откривање на ниски и/или неправилно распространети популации на Ка|окопѓа 5оГапасеагит кои може да се јават во природно заразени примероци на овие супстрати. Ограничувањата на осетливоста на оваа шема на тестирање треба да се земат предвид кога се проценува веродостојноста на добиените негативни резултати, а исто така, и кога се користат во истражувања за одредување на присуството или отсуството на патогени во почвата или отпадот. Најверодостојниот тест за присуство на патоген во почвата е да се засади осетлив домаќин и да се мониторира при инфекцијата, но дури и со овој метод нема да може да открие ниското ниво на контаминација. 2.1. Подготовка на примерокот 2.11. Земањето примероци на почва од поле треба да се следат стандардните принципи кои се користат за земање примероци на нематоди. Соберете 0,5 до 1 Ка почва по примерок од 60 места од 0,5 На од длабочина од 10 до 20 ст (или во мрежа 7 х 7 метри). Ако постои сомнение за присуство на патоген, зголемете го бројот на места на 120 за површина од 0,5 На. Чувајте ги примероците на температура од 12 до 15"С пред тестирањето. Земете примероци од обработките од компирот и отпадните води преку собирање на вкупно 1 Кд од местата кои претставуваат вкупно количество отпад што треба да се тестира. Измешајте го добро секој примерок пред тестирањето. 2.1.2. Потпримероците од 10 до 25 9 почва или отпад се дисперзираат со ротирачки мешач (250 врт/мин) во 60 до 150 т! пуфер за екстракција (Додаток 4) до два часа. Доколку е потребно, додавањето 0,022 стерилен Тиееп-20 и 10 до 20 4 стерилен чакал може да помогне при дисперзирањето. 2.1.3. Задржете ја суспензијата на 4"С за време на тестирањето. 2.2. Тестирање Видете го дијаграмот и описот на тестовите во соодветните додатоци. ДЕЛ 6 ОПТИМИЗИРАНИ ПРОТОКОЛИ ЗА ОТКРИВАЊЕ И ИДЕНТИФИКУВАЊЕ НА В. ООГАМАСЕАВЏМ А. ТЕСТОВИ ЗА ДИЈАГНОСТИЦИРАЊЕ И ОТКРИВАЊЕ 1. Тест за ексудација на стеблото (стриминг тест) Присуството на Ќ. 5оѓапасеагит во стеблата на компир, домат или други растенија-домаќини што венеат, може да се наведе со следниов едноставен тест на веројатност: исечете го стеблото веднаш над нивото на почвата. Суспендирајте ја пресечената површина во епрувета со чиста вода. Набњудувајте за карактеристично спонтано протекување на нишки/конци на бактериски слуз од пресечените васкуларните садови после неколку минути. 2. Детекција на поли-?-хидроксибутират гранули /(талог) 1. Подгответе размаска на бактериски исцедок од инфицираното ткиво или од 48- часовна култура на УРОА или 5РА медиум (Додаток 2) на микроскопска плочка. 2. Подгответе размази за позитивна контрола на биовар 2 сојот на Ќ. зоГапасеагит и доколку се смета за корисно, размаска за негативна контрола на познат РНВ негативен вид. 5. Дозволете да се исуши на воздух и префлрете ја долната површина на секоја плочка над пламен за да се фиксираат размаските. 4. Препаратот се бои или со Нилско сино или Судан црно и се набњудува под миркоскоп на следниов начин: Тест со Нилско сино: (а) Потопете ја секоја плочка со 196 воден раствор на Нилско сино 1 и инкубирајте 10 минути на температура од 55“С. (6) Исушете го растворот за боење. Кратко измијте го под слаб млаз со водоводна вода. Отстранете го вишокот вода со впивачка хартија. (в) Потопете ја плочката со 896 воден раствор на оцетна киселина и инкубирајте една минута на собна температура. (г) Кратко измијте го под слаб млаз водоводна вода. Отстранете го вишокот вода со впивачка хартија. (д) Повторно навлажнете со капка вода и покријте со плочка. () Испитајте ја обоената размаска со епифлуоресцентен микроскоп на 450 пт маслено потопување, при зголемување од 600 до 1000, користејќи објектив потопен во масло или во вода. (е) Набњудувајте за јако портокалово обоени флуоресцентни гранули на РНВ. Исто така, набњудувајте под природно светло за да се осигурите дека гранулите се интрацелуларни и дека морфологијата на клетката е типична за Ќ. 5о|апасеагит. Тест со Судан црно: (а) Потопете ја секоја плочка со 0,525 раствор на Судан црно В во 7096 етанол и инкубирајте 10 минути на собна температура. (6) Исушете го растворот за обојување и кратко измијте со водоводна вода, отстранувајќи го вишокот вода со впивлива хартија. (в) Потопете ги накратко плочките во ксилол и исушете со тапкање со впивлива хартија. Внимание: ксилолот е штетен, па затоа преземете мерки на претпазливост и работете во ламинар (дигесториум). (г) Потопете ги плочките со 0,526 (/и) воден раствор на шафранин и оставете ги 10 секунди на собна температура. Внимание: шафранинот е штетен, па затоа преземете мерки на претпазливост и работете во ламинар (дигесториум). (д) Измијте ги на слаб млаз со водоводна вода, исушете со впивлива хартија и покријте со друга плочка. (“) Испитајте ги обоените размаски со светлосен микроскоп користејќи природно светло со потопување во масло (имерзија), со зголемување од 1000, и објективот да е потопен во масло. (е) Набњудувајте за сино-црно обојување на РНВ гранули во клетки на В. 5о|апасеагит со розово обоени клеточни 5идови. 5. Серолошки тестови за аглутинација Аглутинацијата на клетките на Ќ. зоѓапасеагит во бакерискиот исцедок или екстракт од симптоматично ткиво најдобро се забележува со користење на потврдени антитела (види Додаток 5) обележани со соодветни обоени маркери како, на пример, црвените клетки на окарпујососси5 аигеи5 или честички на обоен латекс. Доколку користите достапен комплет на пазарот (видете Додаток 5), следете ги упатствата на производителот. Во спротивно, следете ја нареднава процедура: (а) Измешајте капки суспензија на обележено антитело и бактериски исцедок (приближно 5 Џ! за секој) на зидовите на плочките за тестирање со повеќе вдлабнатини. (6) Подгответе позитивни и негативни контроли користејќи суспензија на Ќ. 5о|апасеагит биовар 2 и хетерологен (различен) сој. (в) Набњудувајте за аглутинација во позитивните примероци по нежно мешање 15 секунди. 4. Селективна изолација 44. Селективно посејување на плочка Забелешка: Пред да го користите овој метод за првпат, изведете прелиминарни тестови за да се осигури повторливо детектирање на 103 до 104 клетки на В. 5о|апасеагит кои формираат колонија во милилитар, додадени во екстракти на примероците кои претходно биле негативни на тестовите. Употребете соодветно потврден селективен медиум како 5М5А (како што е модифициран од ЕГрнтоќопе ек а!,, 1996 г.; (видете Додаток 2). Потребно е внимателно да се направи разлика помеѓу К. 5оГапасеагит од други бактерии кои се способни да развијат колонии на медиумот/ подлогата. Понатаму, колониите на Ќ. 5о|апасеагит може да покажат атипична морфологија ако плочките се пренатрупани или ако се присутни и антагонистички бактерии. Кога постои сомнение за конкуренција или анатонизам, примерокот треба повторно да се тестира користејќи различен тест. Најголема чувствителност на детектирање со овој метод може да се очекува кога се користат свежо подготвени екстракти на примерокот. Меѓутоа, овој метод се применува кај екстракти кои се чувале во глицерол на температура од -68 до - 86“С. Како позитивни контроли, подгответе децимални раствори од 106 сѓи/ тт! од вирулентен биовар 2 сој на В. 5о|апасеагит (на пример, МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 5857). За да се избегне евентуална можност од контаминација, подгответе позитивни контроли целосно одделно од примероците кои треба да се тестираат. За секоја ново подготвена серија на селективен медиум/подлога, треба да е погодна за растењето на патогенот пред да се користи за тестирање на рутински примероци. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како примерокот (примероците). 4411. Изведете соодветна техника на разредена размаска со цел да се осигури дека се сведени на минимум евентуалните ефекти на популациите кои формираат колонии во позадината. Нанесете 50-100 џ! на плочка од екстрактот на примерокот и од секое разредување. 41.2. Инкубирајте ги плочките на 28“С. Прочитајте ги плочките по 48 часа и потоа, секој ден во период од шест дена. Типичните колонии на Ќ. 5о|апасеагит на 5М5А медиум се млечно бели, плоснати, неправилни и флуидни и по тридневна инкубација добиваат розова до крв црвена боја во центарот со внатрешно набраздување или создавање венче. Забелешка: Понекогаш на овој медиум се формираат атипични колонии на Ќ. зо|апасеагит. Тие може да бидат мали, заоблени, целосно црвени и нефлуидни или само делумно флуидни, па затоа тешко се разликуваат од сапрофитските колонии кои формираат бактерии. 4.1.5. Прочистете ги веројатните колонии на В. 5оГапасеагит по нанесувањето или разредената размаска на општ хранлив медиум/(хранлива подлога) за да се добијат изолирани колонии (видете Додаток 2). 414. Чувајте ги културите краткорочно во стерилна вода (рН 6 до 8, без хлор) на собна температура на темно место или долгорочно, на соодветен смрзнувачко издржлив медиум на 68 до -86"С или со лиофилизација. 41.5. Идентификувајте ги веројатните култури (видете Дел 6. Б.) и изведете тест за патогеност (видете Дел 6. В) Толкување на резултатите од тестот на селективно засејување. Тестот на селективно засејување на плочка е негативен ако не се забележани бактериски колонии по шест дена или ако не се најдени веројатни колонии типични за Ќ. 5о|апасеагит, под услов да нема сомневање за инхибирање што се должи на конкурентноста или антагонизмот на други бактерии и да бидат најдени типични колонии на Ќ. 5о|апасеагит на позитивните контроли. Тестот на селективно заејување на плочка е позитивен ако се изолирани претпоставени колонии на В. зоГапасеагит. 4.2. Постапка за збогатување Употребете соодветно потврден збогатен медиум, како што е модифицираната хранлива средина на (УИЛБппк Бгокн) (видете Додаток 2). Оваа постапка може да се искористи за селективно зголемување на популациите на Ќ. 5о|апасеагит во екстрактите на примерокот и да се зголеми осетливоста на откривање. Исто така, постапката ефикасно ги разредува инхибиторите на РСК реакцијата (1:100). Треба да се забележи дека збогатувањето на Ќ. 5о|апасеагит може да биде не успешно поради конкурентноста или антагонизмот на сапрофитски организми кои често истовремено се развиваат. Поради тоа, изолирањето на Ќ. 5ојапасеагит од збогатени хранливи култури може да биде тешко. Понатаму, поради тоа што популациите на серолошки поврзаните сапрофити може да се зголемат, употребата на специфични моноклонални антитела отколку поликлонални тела се препорачува онаму каде што се користи ЕЦ5А тестот. 4.2.1. За збогатување-РСК, пренесете 100 Џ! од екстрактот на примерокот во 10 т! збогатена хранлива подлога (Додаток 2) претходно поделена на алокворни делови во епрувети или лабораториски колби без ДНК. За збогатување-ЕЦ5А, може да се употребат поголеми делови на екстрактот на примерокот во хранлив медиум/ подлога (на пример, 100 џ!во 1,0 т! збогатена хранлива подлога). 4.2.2. Инкубирајте 72 часа на температура од 27 до 50"С во агитирана или статичка култура со капачиња кои не се затвораат целосно за да се дозволи проветрување. 4.2.5. Добро да се измеша пред да се употреби во ЕЦ5А или РС тестови. 42.4. Третирајте ја збогатената хранлива подлога на ист начин како и примероците во горенаведените тестови. Забелешка: Ако се очекува инхибиција на збогатувањето на Ќ. 5о апасеагит, поради високите популации на одредени конкурентни сапрофитски бактерии, збогатувањето на екстрактите на примерокот пред центрифугирање или други чекори за концентрирање може да даде подобри резултати. 5. |Е тест Принцип Употребата на !Е тестот како основен тест за анализа (скрининг тест) се препорачува поради неговата способност за постигнување на бараните гранични вредности. При употреба на |Е тестот како основен тест за анализа, ако резултатот е позитивен мора да се направи РСК или Е5Н тест, како втор тест за анализа. Кога се користи |Е тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира анализата. Забелешка: Користете потврден извор на антитела на Ќ. 5о|апасеагит. Се препорачува да се утврди титер за секоја нова серија антитела. Титерот се дефинира како највисокото ниво на разредување на кое се јавува оптимална реакција кога се тестира суспензија што содржи 105 до 106 клетки во милилитар на хомологен вид на Ќ. 5оѓапасеагит и кога се користи соединение на флуоресцентен изотиоцијанат конјугат (ЕГО), според препораките на производителот. Сите потврдени поликлонални антисеруми имаа |Е титар од најмалку 1:2000. За време на тестирањето, антителата треба да се користат во работен раствор /раствори (М/О) блиску до, или на нивото на титерот. Тестот треба да се изведе на свежо подготвени екстракти од примерокот. Доколку е потребно, тестот може успешно да се изврши кај екстракти кои се чувале во глицерол на температура од 68 до -86"С. Глицеролот може да се отстрани од примерокот со додавање 1 т! гранулатен пуфер (Додаток 4), повторно да се центрифугира 15 минути на 7000 д и да се ресуспендира во подеднаква количина на гранулатен пуфер. Ова често не е неопходно, особено ако примероците се фиксирани на плочките со пламен. Подгответе одделни плочки за позитивни контроли со хомологени видови или други референтни видови на Ќ. 5о апасеагит, суспендирани во екстрактот на компир, како што е наведено во (Додаток 3. Б.) и по избор, во пуфер. Природно инфицираното ткиво (кое се одржува со лиофилизација или замрзнување на -16 до 24"С) треба да се користи секаде каде што е можно како слична контрола на истата плочка. Како негативна контрола може да се користат аликвотните делови на екстракт на примерок што претходно дал негативен резултат на тестирање за Ќ. 5о|апасеагит. Стандардизираните позитивни и негативни контролни материјали достапни за употреба со овој тест се наведени во Додаток 5. Употребете микроскопски плочки со повеќе вдлабнатини, по можност со 10 прозорчиња со минимален дијаметар од 6 тт. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како примерокот (примероците). 5.1. Подгответе ги плочките за тестирање користејќи една од следниве постапки: (а) За гранулатите (талог) со релативно мал седимент на скроб: Со пипета ставете измерено стандардно количество (15 џ!е доволно за прозорец од 6 тт - за поголеми прозорци користете поголеми количества) од 1/100 раствор на ресуспендираната гранулат од компирот и ставете го на првиот прозорец. Понатаму, со пипета додавајте слично количество неразредена пелета (1/1) и ставете го врз другите прозорци во редот. Вториот ред може да се искористи како дупликат или како втор примерок, како што е прикажано на слика 1. (6) За останатите гранулати (талози): Подгответе децимални раствори (1/10 и 1/100) од ресуспендираниот гранулат во пуфер за гранулати. Со пипета земете стандардно количество (15 џл е соодветно за прозорец со дијаметар од 6 мм - за поголеми прозорци користете поголеми количества) од ресуспендираниот гранулат и секој раствор во редот прозорци. Вториот ред може да се користи како дупликат или како втор примерок, како што е прикажано на слика 2. 5.2. Исушете ги капките на собна температура или со загревање на температура од 40 до 45“С. Фиксирајте ги бактериските клетки на плочката или со загревање (15 минути на температура 60“С), запалување на пламен со 9596 етанол или според упатствата од добавувачите на антитела. Ако е неопходно, фиксираните плочки потоа може да се чуваат замрзнати во сува кутија во колку што е можно пократок период (максимално до 3 месеци) пред да се продолжи со понатамошно тестирање. 5.5. |Е постапка (а) Според подготовката на плочки за тестирање наведено во 5.1(а): Подгответе сет двократни раствори антитела во !Е пуфер. Првата комора треба да содржи ? од титерот (1/2), а другите ? од титерот (Т/4), ? од титерот (Т/2), титерот (Т) и двојно од титерот (21). (6) Според подготовката на плочката за тестирање, наведено во 5.1(6): Подгответе го работниот раствор (М/О) на антителата во !Е пуфер. Работниот раствор влијае на специфичноста. Слика 1. Подготовка на плочката за тестирање, според 5.1(а) и 5.3(а) или примерокот 2 Дупликат примерокот 1 Раствори на ресуспендиран гранулат 1/100 ШЕ! 4 ал 1Л Растаори на ресуспендиран гранулат (Тетитер) | Т/2 | Т/А 1/2 Т 2Т Двократни раствори на антисерум/антитела Примерок 1 е. е. е. е. е. гееШее. Слика 2. Подготовка на плочката за тестирање, според 5.1(6) и 5.3(6) Работен раствор од антисерум/антитело 14 140 41/00 ресуспендиран гранулат Празно Празно децимален раствор на Примерок 1 или примерокот 2 Дупликат примерокот 1 е. е. е. е. Ф. гееШее. 5.4.1. Распоредете ги плочките на влажна хартија. Целосно покријте го секој тест прозорец со растворот од антитела. Количеството антитела што се применува на секој прозорец мора да биде најмалку колку количеството екстракт што се користи. Следната постапка треба да се изврши ако нема специфични упатства од добавувачите на антитела: 5.5.2. Извршете инкубација на плочките на влажна хартија, покриени, во период од 40 минути на собна температура (18 до 25“С). 5.5.3. Протресете ги капките од секоја плочка и внимателно измијте со |Е пуфер. Измијте со потопување за 5 минути во |Е пуфер - (Тмееп) (Додаток 4) и потоа за време од 5 минути во |Е пуфер. Избегнувајте предизвикување аеросоли или пренос на капките, кое може да резултира со напречна контаминација. Внимателно отстранете ја влажноста со нежно бришење. 5.5.4. Распоредете ги плочките на влажна хартија. Покријте ги тест прозорците со раствор од ЕТС конјугат кој се користи за определување на титерот. Количеството конјугат што се применува на секој прозорец мора да биде идентично како количеството антитела што се користи. 5.5.5. Инкубирајте ги покриените плочки на влажна впивлива хартија 50 минути на собна температура (18 до 25"О). 5.5.6. Истресете ги капките конјугат од плочката. Измијте како што е наведено во (5.3.3). Внимателно отстранете го вишокот влага. 5.5.7. Со пипета додадете 5 до 10 џ!| од ОДМ глицерол со фосфатен пуфер (Додаток 4) или комерцијално средство против избледнување во секој прозорец и покријте со микроскопско стакленце. 5.4. Читање на !|Е тест 5.441. Разгледајте ги плочките на епифлуоресцентен микроскоп со филтри соодветни за екситација на ЕТС, со потопување во масло или вода, со зголемување од 500 до 1000. Скенирајте ги прозорците по два дијаметри под прав агол и околу периметарот. За примероците кои не покажуваат или покажуваат мал број клетки, набњудувајте најмалку 40 микроскопски полиња. Проверете ја прво позитивната контролна плочка. Клетките мора да бидат светли флуоресцентни и целосно прекриени со титерот од антитела или работниот раствор. |Е тестот (Дел 6. А.5) мора да се повтори ако прекриеноста не е доволна. 5.4.2. Набњудувајте за светлите флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија на В. 5о|апасеагит во тест прозорците на тест плочките Интензитетот на флуоресцентноста мора да биде еднаков од сојот на позитивната контролна на истиот раствор на антитела. Клетките со нецелосно прекривање или со слаба флуоресценција мора да се отфрлат. Ако има сомнеж за контаминација, тестот мора да се повтори. Ваков може да биде случајот кога сите плочки во групата покажуваат позитивни клетки поради контаминацијата на пуферот или ако се забележат позитивни клетки (надвор од прозорците на плочката) на прекривката на плочката. 5.4.3. Постојат неколку проблеми што се карактеристични за тестот со имунофлуоресценција. Основните популации флуоресцентни клетки со атипична морфологија и сапрофитски бактерии со големина и морфологија слична на Ќ. 5о|апасеагит, најверојатно ќе се појават во сржта (кортексот) на компирот и на сегментите од стеблото. 5.4.4. Треба да се земат предвид само клетки со типична големина и морфологија на титерот или работниот раствор на антитела, како што е во 5.4.5. Толкување на читањето на |Е тестот: (а) Ако се забележат светли флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија, пресметајте го просечниот број типични клетки по микроскопско поле и пресметајте го бројот на типични клетки по т! ресуспендиран гранулат (Додаток 5). |Е читањето е позитивно за примероците со намалку 5? 10? типични клетки на га| ресуспендиран гранулат. Примерокот се смета за потенцијално контаминиран и потребно е понатамошно тестирање. (6) ГЕ читањето е негативно за примероците со помалку од 5 ? 10? клетки на т! ресуспендиран гранулат и примерокот се смета за негативен. Не е потребно понатамошно тестирање. 6. РСК тест Принципи Кога се користи РСК тест како прв тест за анализа и истиот е позитивен, мора да се направи изолациски или |Е тест, како втор задолжителен тест за анализа. Кога се користи РСК тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира дијагнозата. Целосно искористување на овој метод како основен тест за анализа се препорачува само кога постои специјализирана експертиза. Забелешка: Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 103 до 104 клетки од Ќ. 5оѓапасеагит на т! додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат. Експериментите за оптимизација може да бидат потребни за да се постигнат максимални нивоа на чувствителност и специфичност во сите лаборатории. Користете соодветно потврдени РСК реагенси и протоколи (види Додаток б). Пожелно е да изберете метод со внатрешна контрола. Користете соодветни мерки на претпазливост за да избегнете контаминација на примерокот со целна ДНК. РСВ тестот треба да го вршат искусни техничари во специјални лаборатории за молекуларна биологија, со цел да се минимизира можноста за контаминација со целната ДНК. Негативните контроли (за ДНК екстракција и РСК постапките) треба секогаш да се третираат како конечни примероци во постапката, за да се види дали се појавило пренесување на ДНК. Следните негативни контроли треба да бидат вклучени во РСВ тестот: екстракт на примерок што претходно бил тестиран и се покажал како негативен за В. оо|апасеагит. пуфер контроли кои се користат за екстракција на бактеријата и ДНК од примерокот, РСВ - реактивен микс. Треба да се вклучат следните позитивни контроли: аликоти на суспендиран гранулат на кој е додаден В. 5о апасеагит (препарација, види Додаток 5. Б.), суспензија од 106 клетки на т! од В. 5о|апасеагит во вода од вирулентен изолат (на пр. МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 5857; види Додаток 3 Б). ако е можно, исто така, користете ја ДНК извадена од позитивните контролни примероци во РСВ тестот. Со цел да избегнете можна контаминација, подгответе ги позитивните контроли во одделна средина од онаа во којашто ќе се тестираат примероците. Екстрактите од примероци треба да бидат исчистени од земја. Затоа, во одредени случаи, се препорачува да се подготват екстрактите од измиени компири, во случај кога се користат РСК протоколи. Стандардизирани позитивни и негативни контролни материјали, коишто може да се користат со овој тест, се наведени во Додаток 3). 6.1. Методи за прочистување на ДНК Користете позитивни и негативни контролни примероци, како што е прикажано погоре (види Додаток 3). Подгответе го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). Достапни се разновидни методи за прочистување на ДНК од сложените супстрати на примероците, така што се отстрануваат инхибиторите на РСК и другите ензиматски реакции и концентрирање на целната ДНК во екстрактот на примерокот. Следниот метод е направен за да се употребува со потврден РСК метод, прикажан во Додатокот 6. (а) Метод според Пастрик(Ра5кик) (2000) 1) Со пипета земете 220 џ! пуфер за лизирање (100 тМ МаС!,,10 тМ Тие-НС рН 8,0), 1 тМ ЕОРТА (рН 8,0)) во 1.5 т! Епендорфова епрувета. 2) Додадете 100 џ| екстракт од примерок ии ставете го на грејач или водена када, на температура од 95“С за време од 10 минути. 5) Оставете ја епруветата на мраз 5 минути. 4) Додадете 80 џ! раствор од лизозим (50 тд лизозим на т! во 50 тМ Тито НС, рН 10)и инкубирајте на температура од 57“С, 50 минути. 5) Додадете 220 џ! од Еазу ВМА“ раствор А (инвитроген), добро промешајте и инкубирајте на температура од 65"С за време од 50 минути. 6) Додадете 100 Џ! од Еагу ДОМА“ раствор Б (инвитроген), силно измешајте се додека преципитатот слободно не протече во епруветата и примерокот е еднакво вискозен. 7) Додадете 500 џ! хлороформ и мешајте се додека не се намали вискозноста и додека смесата не стане хомогена. 8) Центрифугирајте на 15000 4 за 20 минути на температура од 4"С за да ги одделите фазите и да се формира интерфазата. 9) Пренесете ја горната фаза во нова Епендорфова епрувета. 10) Додадете 1 т! од 1006 етанол (-20“С), кратко мешајте и инкубирајте на мраз 10 минути. 11) Центрифугирајте на 15.000 д за 20 минути на температура од 4?С и отстранете го етанолот од пелетата. 12) Додадете 500 џ! од 8096 етанол (-20“С) и мешајте со превртување на епруветата. 15) Центрифугирајте на 15000 4 за 10 минути на температура од 4"С, отстранете го етанолот и задржете ја плочката. 14) Дозволете плочката да се исуши или користете ДНК комора. 15) Ресуспендирајте ја плочката во 100 џ! стерилна ЏРМ/ и оставете ја на собна температура најмалку 20 минути. 16) Чувајте на температура од -20“С се додека не е потребна за РСВ. 17) Со центрифугирање, отстранете ги белите преципитати и користете 5 Џ| од супернатантот кој содржи ДНК за РСВ. (6) Други методи Други методи за екстракција на ДНК, (на пр. Отадеп ОМеазу РГапк КК) може да се применат под услов ако се докаже дека се еднакво ефикасни во прочистувањето на ДНК од контролните примероци што содржат 103 до 104 патогенски клетки на т|. 6.2. РСК 6.2.1. Подгответе ги тест и контролните шаблони за РСК според потврден протокол (Дел М|.А.б). Подгответе еден децимален раствор на ДНК екстракт на примерок (1:10 во ЏРМУ). 6.2.2. Подгответе соодветен РСМ реактивен микс во неконтаминирана средина, според објавените протоколи (Додаток б). Каде што е можно, се препорачува да се користи повеќеслоен РСВ протокол со внатрешна РСВ контрола. 6.2.5. Додадете 2-5 џ! ДНК екстракт на 25 џ! РСК реакција во стерилни РСК епрувети според РСВ протоколи (види Додаток б). 6.2.4. Вклучете го негативниот контролен примерок што содржи само РСК реактивен микс и додадете го истиот извор на ЏРМ/, како што е направено во РСК миксот на местото од примерокот. 6.2.5. Ставете ги епруветите во истиот термоциклатор кој се користеше во прелиминарното тестирање и спроведете ја соодветно оптимизираната РСК програма (Додаток б). 6.5. Анализа на РСК производот 6.5.1. Разложете ги РСК ампликоните/ производите со електрофореза со агарозен гел. Излејте најмалку 12 џ! амплифицирана ДНК реактивна мешавина од секој примерок измешан со 5 Џ| пуфер за полнење (Додаток б) во 2,026 (ми/и) агарозни гелови во трис-ацетат-ЕОТА (ТАЕ) пуфер (Додаток б) на 5 до 8 У на см. Користете соодветен ДНК маркер, на пр. 100 Бр скала. 6.5.2. Откријте ги ДНК врските со обложување со етидиум бромид (0,5 та на !) за време од 30 до 60 минути, имајќи предвид соодветни мерки за претпазливост при ракувањето со овој мутаген. 6.5.5. Набњудувајте го обложениот гел на ЏУ трансилуминација на кратки бранови (? - 302 пт) за засилени РСК производи со очекувана големина (Додаток б) и документирајте. 6.3.4. За сите нови наоди/случаи треба да ја потврдите автентичноста на РСК ампликонот, преку изведување рестриктивна ензимска анализа на примерок од останатата амплифицирана ДНК, со инкубација на оптимална температура и време, со соодветен ензим и пуфер (види Додаток 6). Растворете ги обработените фрагменти со електрофореза со агарозен гел како претходно и набњудувајте ја карактеристичната рестриктивна шема на „ фрагментот под ЏУ трансилуминација, по обложување со етидиум бромид и споредете со дијагностицираните и недијагностицираните позитивни контроли. Толкување на резултатите од РСК тестот: РСВ ќе биде негативен ако Ќ. 5оГапасеагит-специфичниот РСВ производ со очекувана големина не се забележи на примерокот, но се забележува за сите позитивни контролни примероци (во случај на повеќеслојна РСК анализа со внатрешни контролни параметри карактеристични за растенија: вториот РСК производ со очекувана големина мора да се засили со примерокот што се анализира). РСК тестот ќе биде позитивен ако се забележи Ќ. 5о|апасеагит-специфичниот РСВ производ со очекувана големина и рестриктивна шема (кога е потребно), под услов да не се засили со која било од негативните контролни примероци. Исто така, може да се добие веродостојна потврда со повторување на тестот со вториот комплет РСК параметри (Додаток б). Забелешка: Може да се посомневате на инхибиција на РСК ако очекуваниот производ се добие од позитивен контролен примерок со Ќ. 5о|апасеагит во вода, но се добиваат негативни резултати од позитивните контроли со Ќ. 5о|апасеагит кај екстрактот од компир. Кај повеќеслојните РСК протоколи со внатрешни РСЌК контроли, инхибицијата на реакцијата е индицирана кога не се добива ниту еден од производите. Може да има сомневање за контаминација ако очекуваниот производ се добие од еден или од повеќе негативни контроли. 7. Н5Н тест Принцип Кога се користи Е 5Н тест како прв тест за анализа и ако истиот е позитивен, мора да се направи |Е тест, како втор задолжителен тест за анализа. Кога се користи Н5Н тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира дијагнозата. Забелешка:Користете верификувани специфични олиго-проби за Ќ. 5оѓапасеагит (види Додаток 7). Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 103 до 104 клетки од Ќ. 5оѓапасеагит на т! додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат. Следната постапка пожелно е да се врши на свежо подготвен екстракт од примерок, но, исто така, може успешно да се изврши и на екстракт од примерок што се чува во глицерол на температура од -16 до -24"С или -68 до -86“С. Како негативни контроли, користете ги аликотите на екстрактот од примерокот што претходно покажал негативен резултат за В. зоГапасеагит. Како позитивни контроли, подгответе суспензии кои ќе содржат 105 до 106клетки на т! од В. соГапасеагит Бѓоуаг 2 ( на пр. МСРРВ А156 - РО 2762 - СЕВР 5857, види Додаток 5), во 0,01 М фосфатен пуфер (РВ) од три до пет дневна култура). Подгответе одделни позитивни контролни плочки од хомогената низа или која било друга референтна низа на Ќ. 5оГапасеагит, ставена во екстракт од компир, како што е наведено во (Додаток 5. Б). Користењето на ЕТС означена еубактериска олиго-проба нуди контрола за процесот на хибридизација, бидејќи ќе ги прекрие сите еубактерии што се присутни на примерокот. Стандардизирани позитивни и негативни контролни материјали, коишто може да се користат со овој тест, се наведени во (Додаток 3.А). Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). 7.1. Фиксирање на екстрактот од компир Следниот протокол се базира на Миа“ ека!, (1998), 7.11. Подгответе раствор за фиксирање (види Додаток 7). 7.1.2. Со пипера земете 100 Џ! од секој екстракт на примерок во Епендорфова епрувета и центрифугирајте 7 минути на 7000 грама. 7.1.5. Отстранете го чистиот флуид (супернатантот) и растворете го гранулатот во 200 Џџ! фиксатор, претходно подготвен за помалку од 24 часа. Мешајте и инкубирајте еден час во ладилникот. 7.1.4. Центрифугирајте 7 минути на 7000 грама, отстранете го чистиот флуид и ресуспендирајте го гранулатот во 75 џ! 0,О1М РВ (види Додаток 7). 7.1.5. Нанесете 16 џГод фиксираните суспензии на чиста плочка за повеќекратно тестирање, како што е прикажано на сликата 7.1. Нанесете два различни нерастворени примероци по плочка и користете 10 џ!за да направите 1:100 раствор (во 0,01 М РВ). Останатиот раствор од примерокот (49 џ) може да се чува на температура од -20?С по додавање на количество од 966 етанол. Во случај да треба да се повтори ЕГ5Н анализата, отстранете го етанолот со центрифугирање и додадете еднакво количество 0,01 РВ (измешајте во вортекс - вртечка мешалица). Слика 7.1. Приказ на Е!Г5Н плочка Примерок 1 Празно Празно Празно Примерок 2 Прозорец1 Прозорец 2 Прозорец 3 Прозорец 4 Прозорец 5 Примерок 1 Празно Празно Празно Примерок 2 Прозорецб Прозорец7 Прозорец 8 Прозорец 9 Прозорец 10 Плочка 1 Плочка 2 7.1.6. Со вентилирање исушете ги плочките (или со сушач на плочки на температура од 57"С) и фиксирајте ги со запалување. Во оваа фаза, постапката може да се прекине и да се продолжи со хибридизација наредниот ден. Плочките треба да се чуваат на собна температура, на суво место каде што нема прав. 7.2. Хибридизација 7.2.1. Дехидрирајте ги клетките во серија етанол од 5075, 8025 и 965, по минута во секоја од нив. Исушете ги плочките на држач за плочки со вентилирање. 7.2.2. Подгответе влажна комора за инкубација со покривање на дното на вакуумска кутија користејќи марамче или филтер хартија натопена во Тх хибмикс(нуБткх (Додаток 7). Претходно инкубирајте ја кутијата во печка за хибридизација на температура од 45?С за време од 10 минути. 7.2.5. Нанесете 10 џГ од растворот за хибридизација (Додаток 7) на осум прозорци (прозорци 1, 2, 4, 5, 6, 7,9 и10; види слика 7.1.) на секоја плочка и оставете ги празни двата централни прозорци (фи8). 7.2.4. Користете плочки (24? 24 тт) за првите и последните четири прозорци без да се пропушта воздух. Ставете ги плочките во претходно загреана влажна комора и хибридизирајте пет часа во печка на температура од 45“С на темно. 7.2.5. Подгответе три лабораториски чаши со 1 | МИКО вода (за молекуларна анализа), 1 од 1 х (нуБтрд (54 т! Зх (пуБтрд и 666 т! МИКО вода) и 11 од 1/8х (пурткх (42 т! Зх (пуБтру) и 958 го! МЕКО вода). Претходно инкубирајте ја секоја од нив во водена када на температура од 45“С. 7.2.6. Отстранете ги плочките од слајдовите и ставете ги на држач за плочки. 7.2.7. Измијте го вишокот на сондата со инкубација од 15 минути во лабораториска чаша со 1х (уБтрд, на температура од 45“С. 7.2.8. Пренесете го држачот на плочки во раствор за миење од 1/8 (нуртру) и извршете инкубација дополнителни 15 минути. 7.2.9. Кратко потопете ги плочките во МИТО вода и ставете ги на филтер хартија. Отстранете го вишокот влажност со покривање на површината со филтер хартија. Со пипета земете 5 до 10 џ! раствор од засилувач против бледеење (на пр. МескаНте!4, Уеска ГарогаќоПе5, или еднакви) на секој прозор и користете голема плочка (24? 60 тт) на целата површина. 7.5. Читање на Е5Н тестот 7.5.1. Набњудувајте ги плочките под микроскоп опремен за епифлуоресценција на 650 или 1000 х зголемување потопени во масло. Со филтер соодветен за флуоресцентни изотиоцинатни (ЕТО) еубактериски клетки (вклучително повеќето грам негативни клетки) во примерокот се прекриени со флуоресцентно зелено. Со филтер за тетраметилродамин-5-изотиоцијанат, клетки обложени со Суз на В. 5оГапасеагит имаат флуоресцентна црвена боја. Споредете ја морфологијата на клетката со таа на позитивните контроли. Клетките мора да бидат светли флуоресцентни и целосно прекриени. Е5Н тестот (дел МГ.А.7) мора да се повтори ако прекриеноста не е доволна. Скенирајте ги прозорците по два дијаметри под прав агол и околу периметарот. За примероците кои не покажуваат или покажуваат мал број клетки, набњудувајте најмалку 40 микроскопски полиња. 7.5.2. Набњудувајте за светлите флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија на Ќ. 5о|апасеагит во тест прозорците на тест плочките. Интензитетот на флуоресцентноста мора да биде еднаков или подобар од позитивната контрола. Клетките со нецелосно прекривање или со слаба флуоресценција мора да се отфрлат. 7.5.5. Ако има сомневање за контаминација, тестот мора да се повтори. Ваков може да биде случајот кога сите плочки во групата покажуваат позитивни клетки поради контаминацијата на пуферот или ако се забележат позитивни клетки (надвор од прозорците на плочката) на прекривката на плочката. 7.5.4. Постојат неколку проблеми што се карактеристични за ЕГ5Н тестот. Основните популации флуоресцентни клетки со атипична морфологија и сапрофитски бактерии со вкрстено дејство, со големина и морфологија слична на Ќ. 5оѓапасеагит, најверојатно ќе се појават од сржта (кортексот) од окцата во компирот и на сегментите од стеблото, иако многу поретко во споредба со |Е тестот. 7.5.5. Разгледајте ги само флуоресцентните клетки со типична големина и морфологија. 7.3.6. Толкување на резултатите од Е ОН тестот: (а) Валидни резултати од ЕН тестот се постигнуваат ако се разгледуваат светли зелени флуоресцентни клетки со големина и морфологија типична за Ќ. 5о апасеагит, со употреба на ЕТС филтер, и ако се разгледуваат светли црвени флуоресцентни клетки со употреба на родамински филтер кај сите позитивни контроли и не кај негативните контроли. Ако се забележат светли флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија, пресметајте го просечниот број типични клетки по микроскопско поле и пресметајте го бројот на типични клетки по т! ресуспендиран гранулат (Додаток 4). Примероците со најмалку 5 ? 105 типични клетки на т!! ресуспендиран гранулат се сметаат за потенцијално контаминирани. Потребно е понатамошно тестирање. Примероците со помалку од 5 ? 103 типични клетки на т!| ресуспендиран гранулат се сметаат за негативни. (6) Е5Н тестот е негативен ако не се забележат светли црвени флуоресцентни клетки со големина и морфологија типична за В. зо|апасеагит, користејќи родамински филтер, под услов тие типични светли флуоресцентни клетки да се набњудуваат во позитивните контролни кога се користи родаминскиот филтер. 8. ЕЦ59УА тестови Принцип ЕЦ5А тестови може да се користат како оптимални тестови покрај |Е, РСК или Е5Н поради нивната релативно мала чувствителност. Кога се користи ПА5 ЕЦШ5А задолжително е збогатување и употреба на моноклонски антитела. Збогатувањето на примерокот пред користење на ЕЦ5А може да биде корисно со цел да се зголеми чувствителноста на овој тест, но може и да не биде успешно како резултат на конкуренцијата од другите организми во примерокот. Забелешка: Користете проверен извор на антитела на Ќ. 5о|апасеагит. Се препорачува да се одредува титерот за секоја група на антитела. Титерот се дефинира како највисок раствор на кој се јавува оптимална реакција кога се врши тестирање на суспензија што содржи 105 до 106 клетки на т! од хомогената низа на Ќ. 5оГапасеагит и кога се користат соодветни секундарни соединенија на антитела според препораките на производителот. За време на тестирањето, антителата треба да се користат на работните раствори (М/О) во близина на, или во титерот на комерцијалната формулација. Одредете го титерот на антителата на суспензија од 105 до 106 клетки на т! од хомогената низа на В. 5оГапасеагит. Вклучете екстракт на примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат за Ќ. оо|апасеагит и суспензија од бактерија без вкрстено дејствување во фосфатен солен пуфер (РВ5) како негативни контроли. Како позитивна контрола, користете ги аликотите на екстрактот од примерокот што претходно покажал негативен резултат, заедно со 103 до 104 клетки на т! од В. зоГапасеагит Бомаг 2 ( на пример, низа МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 5857, види Додаток 2 А и Б). За споредба на резултатите на секоја плочка користете стандардна суспензија од 105 до 106 клетки на т! во РВ5 на Ќ. 5о|апасеагит. Проверете дали позитивните контроли се добро одделени на микротитерната плочка од примерокот (примероците) што се тестираат. Стандардизирани позитивни и негативни контролни материјали, коишто може да се користат со овој тест, се наведени во Додаток 3 А. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). Два ЕЦ5А протоколи се валидни. (а) Индиректен ЕЦ5А (ВорБипооп 5ткН ек а!, 1995) 1) Користете 100 до 200 џ| аликоти на екстрактот од примерокот. (загревањето на 100“С четири минути во водено купатило или грејач може да ги намали неспецифичните резултати во некои случаи.) 2) Додадете еднакво количество обложен пуфер со двојна сила (Додаток 4) и промешајте. 5) Нанесете 100 Џ| аликоти на секоја од најмалку две комори на микротитерната плоча (на пр. Мипс-Роѓу5огр или слично) и инкубирајте еден час на температура од 37"С или преку ноќ на температура од 4“С. 4) Извадете ги екстрактите од коморите. Трипати измијте ги коморите со РВ5- Тиееп (Додаток 4), и последниот раствор за миење оставете го во коморите најмалку пет минути. 5) Подгответе соодветен раствор на антитела против Ќ. 5о|апасеагит во блокирачки пуфер (Додаток 4). За потврдени комерцијални антитела, користете ги препорачаните раствори (вообичаено двапати поконцентрирани од титерот). 6) Додадете 100 џ! на секоја комора и инкубирајте еден час на температура од 57“С. 7) Извадете го растворот од антитела од коморите и измијте ги коморите на ист начин како во точка (4). 8) Подгответе соодветен раствор од секундарни соединенија на антитела од алкална фосфатаза во блокирачкиот пуфер. Додадете 100 џ! на секоја комора и инкубирајте еден час на температура од 57“С. 9) Извадете го соединетото антитело од коморите и измијте ги коморите на ист начин како во точка (А). 10) Додадете 100 џ! алкален фосфатазен супстратен раствор (Додаток 4) на секоја комора. Инкубирајте во темно на собна температура и читајте ја апсорпцијата на 405 пт на редовни интервали од 90 минути. (6) ПАФГЕЦОА 1) Подгответе го соодветниот раствор од анти-Ќ. 5о|апасеагит поликлонални имуноглобулини во обложен пуфер рН 9.6 (Додаток 4). Додадете 200 Џ! на секоја комора. Инкубирајте на температура од 57"С четири или пет часа или на температура од 4"С шеснаесет часа. 2) Коморите измијте ги трипати со РВ5-Тиееп (Додаток А). Додадете 190 џ! од екстрактот од примерокот на најмалку две комори. Исто така, додадете позитивни и негативни контроли во две комори на секоја плочка. Инкубирајте 16 часа на температура од 4“С. 5) Коморите измијте ги трипати со РВ5-Туееп (Додаток 4). 4) Подгответе соодветен раствор на моноклонски антитела специфични за В. 5о апасеагит во РВ5 (Додаток 4), којшто ќе содржи 0,596 говедски серум албумин (В59А) и додадете 190 џ! на секоја комора. Инкубирајте на температура од 57"С два часа. 5) Коморите измијте ги трипати со РВ5-Туееп (Додаток 4). 6) Подгответе соодветен раствор од анти- имуноглобулини од глувци со алкална фосфатаза во РВ5. Додадете 190 џ! на секоја комора. Инкубирајте на температура од 57“С два часа. 7) Коморите измијте ги трипати со РВ9-Тиееп (Додаток 4). 8) Подгответе алкален фосфатазен супстратен раствор кој содржи 1 та п- нитрофенил фосфат на т! супстратен пуфер (Додаток 4). Додадете 200 Џ! на секоја комора. Инкубирајте во темно на собна температура и читајте ја апсорпцијата на 40 пт на редовни интервали од 90 минути. Толкување на резултатите од ЕЦ5А тестот: ЕЦ5А тестот е негативен ако читањето на просечната оптичка густина (ОП) од двојни комори е с 2х ОД од читањето на контролната комора со екстракт од негативен примерок, под услов ОД за позитивните контроли да биде над 1,0 (по 90-минутна инкубација со супстратот), а да биде двапати поголем од ОП добиен за екстракти од негативни примероци. ЕЦФА тестот е позитивен ако читањата на просечната оптичка густина од двојни комори е “ 2Х ОО во екстрактот на негативен примерок под услов сите читања на ОП во сите негативни контролни комори се с 2х читањата во позитивните контролни комори. Негативните ЕЦ5А читања во позитивни контролни комори покажуваат дека тестот не бил точно извршен или бил прекинат. Позитивни ЕЦ5А читања во негативни контролни комори покажуваат дека се појавила вкрстена контаминација или неспецифично врзување на антитела. 9. ТЕСТ СО БИОАНАЛИЗА Забелешка: Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 105 до 104 клетки кои формираат колонии од Ќ. 5о|апасеагит на т! додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат (подготовка, види Додаток 3). Највисоко ниво на чувствителност при откривање може да се очекува кога се користи свежо подготвен екстракт од примерок и кога има оптимални услови за растење. Меѓутоа, методот може успешно да се користи за екстракти што се чувале во глицерол на температура од -68 до 86"“С. Следниот протокол се базира на Јапе (1988): 9.1. Користете 10 растенија за тестирање од осетлива сорта на домати (на пр. МопеутакКег или друга осетлива сорта, определена од лабораторијата за тестирање) во третата фаза на вистинит лист за секој примерок. За детали во врска со културите, (види Додаток 8). Како алтернативна можност, може да користите модри патлиџани (на пример, сортата В|аск Веаиќу или сорта со еквивалентна осетливост), користете само растенија во втора или трета фаза на листови до целосно развивање на третиот вистински лист. Се покажа дека Симптомите шти се развиваат се помалку тешки и развојот е побавен кај модрите патлиџани. Онаму каде што е можно, се препорачува да се користат расад од домати. 9.2. Распределете 100 џ! од екстракт на примерок помеѓу растенијата за тестирање. 9.2.1. Инокулација со шприц Инокулирајте ги стеблата на растенијата веднаш над котиледоните, со користење на шприц со хиподермичка игла (не помалку од 250). Распределете го примерокот помеѓу растенијата за тестирање. 9.2.2. Надолжна инокулација Со држење на растението меѓу двата прста, пипетирајте една капка (приближно 5 до 10 џЏ!) од суспендираната плочка врз стеблото меѓу котиледоните и првиот лист. Со употреба на стерилен скалпер направете дијагонален пресек, околу 1.0 ст долг и приближно длабок 2/3 од дебелината на стеблото, почнувајќи со нанесување на капки од ресуспендираниот талог од плочката. Затворете го пресекот со стерилен вазелин од шприц. 9.5. Инокулирајте со истата техника пет садници со водна суспензија од 105 до 106 клетки на т!| подготвени од 48-часовна култура на вирулентна биовар 2 низа на Ќ. 5о|апасеагит како позитивна контрола и со пуфер за гранулат (Додаток 4) како негативна контрола. Одделете ги растенијата од позитивна и негативна контрола од другите растенија за да се одбегне вкрстена контаминација. 9.4. Растенијата за тестирање одгледувајте ги во карантински простории во време од четири недели на температура од 25 до 50"С и висока влажност со соодветно наводнување за да се спречи презаситување со вода или овенување заради недоволно количество на вода. За да избегнете контаминација, инкубирајте ги растенијата од позитивната и негативната контрола на одделни маси/полици во оранжерија или комора за растење, во случај ако нема доволно простор, обезбедете строга поделеност помеѓу третманите. Ако растенијата за различни примероци мора да се инкубираат заедно, одделете ги со соодветни прегради. При фертилизација, наводнување, испитување и друг вид манипулации, внимавајте да избегнувате напречна контаминација. Важно е оранжеријата и коморите за растење да бидат слободни од сите штетни организми, бидејќи тие може да ја пренесуваат бактеријата од еден примерок на друг. Набњудувајте ги симптоми на венеење, епинастии, хлороза и/или запирање на развој. 9.5. Изолирајте од заразени растенија (Дел 2.5) и идентификувајте исчистени култури од К. 5о|апасеагит (Дел б.Б). 9.6. Ако не се забележат симптоми по 3 недели, направете |Е/РСК/изолација на композитен примерок од 1 ст од стеблото дел на секое растение за тестирање земено над местото на инокулација. Ако тестот е позитивен, извршете обложување со раствор (Дел 4.1.) 9.7. Идентификувајте исчистени култури од В. 5о|апасеагит (Дел б.Б). Толкување на резултатите од тестот со биоанализа. Валидни резултати од биоанализа се добиваат кога растенијата од позитивната контрола покажуваат типични симптоми, бактериите може да се реизолираат од тие растенија и нема симптоми на негативните контроли. Тестот со биоанализа е негативен ако растенијата што се тестираат се заразени со В. 5о|апасеагит, и ако се забележи В. 5о|апасеагит во позитивни контроли. Тестот со биоанализа е позитивен ако тест растенијата се инфицирани со К. зоГапасеагит. Б. ТЕСТОВИ ЗА ИДЕНТИФИКАЦИЈА Идентификувајте чисти култури на претпоставени изолати на Ќ. 5о апасеагит со користење на најмалку два од следните тестови, врз основа на различни биолошки принципи Вклучете ги познатите референтни соеви онаму каде што е соодветно за секој извршен тест (вид Додаток 5). Забелешка: Ако изведувате само 2 тестови за идентификација, не користете друг серолошки тест покрај овој метод. 5.1. Подгответе суспензија од приближно 108 клетки на т! во 1Х РВ5 (Додаток А). 5.2. Изведете соодветна ЕШ5А постапка со специфично моноклонско антитело на В. 5о|апасеагит. 3.5. Се остварува позитивен ЕЦ5А тест ако ЕЦФА читањето што се добива од културата е барем половина од она што се добива за позитивната контрола. 4. РСВ тестови 4.1. Подгответе суспензија од приближно 106 клетки на т! во молекуларна стерилизирана вода. 4.2. Загрејте 100 џл од клеточната суспензија во затворени епрувети во термостат или водена када на температура од 100“С во време од четири минути. Тогаш, примероците може да се чуваат на температура од -16 до -24?С се додека не бидат потребни. 4.45. Применете соодветни РСК постапки за засилување на производи специфични за ВВ. соГапасеагит (на пр. еа! ек а!. (1993); Ра5ЕпК апа Мај55 (2000); Ра5кик ек а!. (2002); Воидагтп ек а!. (999); Орта ека!. (1997), М/ејег ек а!. (1999). 44. Позитивна идентификација на В. зоѓапасеагит се добива ако РСК производи се со иста големина и имаат полиморфизми со иста рестриктивна должина на фрагмент како и кај сојот од позитивната контрола. 5. Н5Н тест 5.1. Подгответе суспензија од приближно 106 клетки на мл во ултра чиста вода (ЏРМИ). 5.2. Применете ја Е5Н процедурата (Дел УА.7), со најмалку 2 олиго-проби специфични за Ќ. 5о|апасеагит (Додаток 7). 5.5. Позитивен ЕГ5Н тест се добива ако се постигнат истите реакции од културата и позитивната контрола. 6. Профилирање на масните киселини (ПМК) 6.1. Одгледувајте ја културата на трипитказен соин агар (Охојд) за време од 48 часа на температура од 28“С. 6.2. Користете ја соодветната постапка за ЕАР (Јапзе, 1991; 5ѓеад, 1992). 6.5. Позитивен ЕАР тест се постигнува ако профилот на претпоставената култура е идентичен со оној на позитивната контрола. Присуството на карактеристични масни киселини е следново 14:0 3ОН,16:0 20Н, 161 20Н и 1811 20Н, а отсуството на 16:0 ЗОН е индикативно за Ка|окопѓа 5р. 7. Методи за карактеризирање на соевите Карактеризирање на соевите со користење на еден од следниве методи се препорачува за секој нов случај на изолирање на Ќ. 5о|апасеагит. Вклучете ги познатите референтни соеви онаму каде што е соодветно за секој извршен тест (вид Додаток 5). 7.1. Определување на биовариетети К. зоѓапасеагит е поделен на биовариетети(понатаму како биовари) врз основа на можноста да користи и/или да оксидира три дисакариди и три хексозни алкохоли (Наужаг4, 1964 апд Наумаг еѓ а!.. 1990. Медиумите за растење на биовар за тестови се опишани во Додаток 2. Тестот може успешно да се изврши ако медиумите се инокулираат со чисти култури на изолати на Ќ. 50/апасеатшт и нивна инкубација на температура од 28"С. Ако медиумите се распределат во стерилни плочки на клеточни култури со 96 комори (200 Џ на комора) може да се забележи промена на боја од маслинесто зелена на жолта во период од 72 часа, што укажува на позитивен резултат. Употреба на: Малтоза Лактоза Манитол Сорбитол Со дополнителни тестови се разграничуваат биовар 2 под-фенотипа Биовар 2А Биовар 2А Биовар 2Т (распределба низ (распространет во "(распространет во целиот свет) Чиле и Колумбија) тропски области) Користење на -. 4 1 трехазол Користење на - - 1 мезо-иноситол Користење на ГО - - 4 рибоза Пектолитска ниска ниска ниска активност (1) (1) Види (е!оќ апа 5геад (1987) 7.2. Анализа на геном Може да се направи молекуларна диференцијација на соевите во В. 5оГапасеагит со користење на неколку техники, и тоа: 7.2.1. Анализа на полиморфизми со ограничена должина (ВЕГР) (СооКк ек а, 1989). 7.2.2. РСВ со низа што се повторува со користење на ЌЕР, ВОХ и ЕВ.С параметри (Гоим5 ека!, 1995; 5тКП ека, 1995). 7.2.5. Анализа на полиморфизми по должина на зголемени фрагменти (АЕГР) (Јап дег М/оЌ ес а|, 1998). 7.5. РСК методи Може да се користат специфични РСВ параметри (Ра5кик ек а!, 2002; види Додаток 6) за разграничување на соеви од оддел 1 (биовар 3, чи 5) и оддел 2 (биовари 1, 2А и 21) на В. соГапасеагит, првично определени со МЕР анализа ((СооК ек а!, 1989) и 165 рДНК секвенцирање (Таднамт ес а!,, 1996). В. ТЕСТ ЗА ПОТВРДУВАЊЕ Тестот за патогеноста мора да се изведе како конечна потврда за дијагнозата на В. оГапасеагит и за процена на вируленцијата на културите идентификувани како В. зоГапасеагит. 1) Подгответе инокулум од приближно 106 клетки по т! од 24 до 48-часовни култури од изолат што треба да се тестира и соодветна низа од позитивна контрола од Ќ. 5о|апасеагит (на пр. МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 3857; види Додаток 3). 2) Инокулирајте 5 до 10 осетливи садници од домати или модри патлиџани во фаза на три вистински листови (види Дел М.А.О). 5) Инкубирајте во период од две недели на температура од 25 до 28?С и висока влажност со соодветно наводнување, со цел да се избегне исушување или стрес од дехидрирање. Со чисти култури на типично венеење би требало да се случи во рок од 14 дена. Ако и по овој период не се присутни симптомите, културата не може да се потврди како патогена форма од Ќ. 5о|апасеагит. 4) Внимателно набњудувајте за симптоми на венеење и/или епинастии, хлороза и/или запирање на развој. 5) Изолирајте од симптоматските растенија, со отстранување на дел од стеблото, 2 ст над точката на инокулација. Пулверизирајте и суспендирајте мало количество стерилна дестилирана вода или 50 тМ фосфатен пуфер (Додаток 4). Изолирајте од суспензијата со раствор несувајќи на соодветен медиум, по можност на селективен медиум (Додаток 2), инкубирајте 48 до 72 часа на температура од 28?С и набњудувајте го формирањето на колонии типични за В. 5оГапасеагит. В. ТЕСТ ЗА ПОТВРДУВАЊЕ В. ТЕСТ ЗА ПОТВРДУВАЊЕ Додаток 1 Лаборатории вкпучени во оптимизацијата и потврдувањето на протоколите (За контакт со научните центри: посетете ја интернет страница Пир“ Ногит.еигора .еи "ПИРирислго/запсо/Ноте/тап. Додаток 2 Медиуми за изолација и култура на Ќ. 5о/апасеагит (а) општ медиуми за растење Агар за потхранување (МА) Агар за потхранување (ОИсо) 2309 Дестилирана вода 1,01 Растворете ги состојките и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. Квасен пептонски гликозен агар (УРОА) Квасен екстракт (ОИсо) 50д Бакто-пептон (Оисо) 509 р(н) гликоза (монохидрат) 10,09 Бакто-агар (ОИсо) 15049 Дестилирана вода 10! Растворете ги состојките и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. Сукрозен пептонски агар (5РА) Сукроза 2004 Бакто-пептон (Оќсо) 504 К:НРО; 0.549 М950:.7Н;О 0.254 Бакто-агар (ОИсо) 1504 Дестилирана вода 1,01 РН 7.2- 7.4 Растворете ги состојките и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. Келманов Тетразолиумски медиум Касамино киселини (ОЌсо) 104 Бакто-пептон (Оисо) 10.049 Декстроза 5049 Бакто-агар (Оисо) 15.049 Дестилирана вода 1,01 Растворете ги состојките и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. Разладувајте до температура од 50"С и додадете раствор на 2,3,5-трифенил тетразолиум хлорид (5ита) стерилизиран со филтер за постигнување концентрација од 50 та на литар. (6) Потврдени селективни медиуми за раст 5М5А медиум (Енгелбрехт, 1994, изменето со Елфинстон и сораб., 1996) Базален медиум Касамино киселини (Оќсо) 104 Бакто-пептон (ОИсо) 10.04 Глицерол 50т Бакто-агар (ОИсо); види белешка бр. 2 1509 Дестилирана вода 1,01 Растворете ги состојките и стерилизирајте со автокпав на температура од 121“С за време од 15 минути. Разладете до 50"С и додадете водени готови раствори стерилизирани со филтер од спедните состојки, за да се постигнат назначените конечни концентрации: Кристално виолетово (Бата) 5 та на литар Полимиксин- Б-сулфат (5јата Р-1004) 600000 Џ (приближно 100 та) на литар Бацитрацин (5јЧта В-0125) 1250 Џ (приближно 25 тд) на литар Хлорамфеникол (5јата С-3175) 5 тд на литар Пеницилин-б (5ата Р-3032) 825 Џ (приближно 0,5 тд) на литар 2,3.5-трифенил тетразолиум хлорид (5ата) 50 тд на литар Забелешка: 1. Користењето реагенси надвор од она што е наведено погоре може да предизвика раст на Ќ. 5оѓапасеагит. 2. Оксоидниот агар 21 може да се користи наместо бакто-агарот (ОИсо). Во овој случај растот на Ќ. Боѓапасеагит ќе биде побавен, иако растот на конкурентните сапрофити може, исто така, да биде намален. За типичните колонии на Ќ. Фоѓапасеагит потребни се 1 до 2 дена подолго за да се формираат, а црвеното обојување може да биде посветло и подифузно во споредба со бакто-агарот. 3. Зголемувањето на концентрацијата на бацитрацин на 2500 Џ на литар може да ги намали популациите на конкурентните бактерии без да влијае врз растот на Кајопа 5оѓапасеагит. Чувајте повеќе медиуми и готови раствори на температура од 4"С и искористете ги во рок од еден месец. Плочките пред употреба треба да се исчистат од површинската кондензација. Избегнувајте прекумерно сушење на плочките. Контролата на квалитетот треба да се изврши по подготовка на секоја нова група медиум. со нанесување на суспензија од референтна култура од Ќ. 5о/апасеагит (види Додаток 3) и набтудување на формирањето на типичните колонии по инкубација на температура од 28"С во период од два до пет дена. (в) Потврдени медиуми за збогатување ОМ5А мешавина (ЕГрпупоѓопе еѓа!., 1996) Подгответе како за 5М5А селективен агар медиум, но испуштете бакто-агари 2, 3, 5-тетразолиум хлорид. Модифицирана Випбринк(ИИИБппк) мешавина (Сагизо еѓа!., 2002) Сукроза 10 д Протеозен 5 пептон К;НРОЈ 0.5 9 М950. 0.25 9 Мамо; 0.25 Дестилирана 1! вода Стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути и разладете до 50"С. Додадете антибиотски готови раствори, како и за 5М5А мешавината. Додаток 3 А. Комерцијално достапен стандардизиран контролен материјал (а) Бактериски изолати Следните бактериски изолати се препорачуваат за употреба како стандарден референтен материјал, како позитивни контроли (табела 1) или за време на оптимизација на тестовите за да се избегнат напречните реакции (табела 2). Сите соеви се комерцијално достапни од: Табела 1 5МТ референтен панел изолати на Ќ. 5о0/ѓапасеагит МСРРВ |5МТ Други шифри Земја на|Био шифра потекло вар УХСРРВ б СЕВР „4582, Рг 3020,|Египет 4153 ЕЏВ511 к о НОТ 10 |СЕВР 4585, 550, ЕЏВ521 Турција 1 к о МСРРВ (| |(СЕВР 4587, Рг 1140,|Англија Шј 3857 ЕЏВ526 МСРРВ 3 |СЕВР 4598, ЕЏВ549 Кипар 2 1584 МСРРВ |ј24 |СЕВР 4599, ЕЏВ550 Шведска 2 2505 МСРРВ је Ј|СЕВР 4601, 502, ЕЏВ555 ЏБелгија 2 4155 МСРРВ Џио |РР 2762, СЕВР 3857 Холандија "|; 4156“) МСРРВ је ЕМРм 15.59 Франција "ГБ 4157 МСРРВ 4158 МСРРВ 4160 МСРРВ 4161 МСРРВ 325 МСРРВ 3967 МСРРВ 4028 МСРРВ 3985 МСРРВ 3989 МСРРВ 3996 МСРРВ 3997 МСРРВ 4029 МСРРВ 4005 МСРРВ 4011 39 69 76 4 43 46 47 49 СЕВР 4608, ЕЏВ580 Роќ 448, МА-1632-2 ВЗВ СЕВР 2047, КЕ! 60-1, В842 СЕВР 4610, К285, ООМд7 СЕВР 4611, СТР310, 5ЕО205 В303/571, СЕВР 4612, К578, СТРЗ12 СЕВР 4613, В568, СТР226 СЕВР 3928, „ В276/355, СТР72, 5ЕО225 СЕВР 4614, В280/363, СТР49, НАУО131а СЕВР 4615, „ В297/349, СТР121, СМр2861 СЕВР 4616, В470 СЕВР 4617, В288, НЕтр52 Португалија Шпанија Германија САД Костарика Колумбија Перу Бразил Перу Австралија Шри Ланка Филипини Кина 2 2Т 2Т 4 4 (") Користете како стандардна референтен сој на Ќ. 5оѓапасеашт Бјоуаг 2 (раса 3) Забелешка: Автентичноста на горенаведените низи може да се гарантира само ако се добијат од автентнична колекција култури. Табела 2 5МТ референтен панел серолошки или генетски поврзани бактерии за употреба во оптимизацијата на тестовите за детекција МСРРВ. |5МТ Други Идентификација шифра сс шифри МСРРВ 4162 | 51 |СЕВР 1954 |Васии5 роѓутуха () МСРРВ 4163| 52 Ј|СЕВР 1538 ЏРзешдфотопа5 тагдпањ ру. тагапаЊ (") МСРРВ 4164 | -- Џ|СЕВР 2227 ЏВитжнојаепа серасѓа (?) МСРРВ 4165| -- Ј(СЕВР 2459 |Ња/опѓа рекеќи (?) МСРРВ 4166 | 58 |СЕВР 3567|Ма/опѓа рескеќи (") С5!. Рг1150 МСРРВ 4167| 60 |(СЕВР 4618|Ња/чѓопа 5р. (") РО 2778 МСРРВ 1127 | 53 |СЕВР 3575 ЏВигкноќепа апагородопњ (") МСРРВ 353 54 (|СЕВР3572 ЏВитнокепа сагуорнуи! (") МСРРВ 945 55 |СЕВР 3569 ЏВигтојдепа серасѓа (") МСРРВ 3708| 56 (СЕВР 3574 (Витпојдепа дитае () МСРРВ 3590| 57 (СЕВР 3573 (Витпојдепа рѓапѓат! (") МСРРВ 3726| 59 Џ|СЕВР 3568 Вапапа Вооа Ојеазе Вастепит МСРРВ 4168 | 61 |СЕВР 4619|Епѓегорасѓег 5р. (") РО 5339 МСРРВ 4169| 62 ЏРО 1695 Епѓегорасѓег р. (") МСРРВ 4170| 63 |СЕВР 4621|Оспгораскит апѓторт (")(?) РО 5306 МСРРВ 4171 | 64 |СЕВР 4622|Сипорастепит 5р. (")(2) РО 1693 МСРРВ 4172 | 65 ЏРО 1696а "| Рзешаотопаз 5р. (") МСРРВ 4173 | -- |РО 2318 Аигеорвастепит 5р. (9 МСРРВ 4174 | 81 ЈЏЛЛА 1844.06 |Еѓаиорастепит р. (!)(2) () Сој со потенцијал за напречно реагирање при серолошките тестови (1Е и/или ЕЦ5А) поликлонални антисеруми. (?) Сој од која може да се засили РСВ производот во некои лаборатории со слична големина во однос на онаа очекувана со користење на прајмерите ОЦ-1 и У-2 (види Додаток б). () Веројатност дека напречно ќе реагира кај повеќето тестови, но познато е дека се појавува само кај бананите во Индонезија. (6) Комерцијално достапен стандардизиран контролен материјал Следниот стандарден контролен материјал е достапен од колекцијата за МСРРВ културата. Пелета исушени со замрзнување на екстракт од компир која содржи 200 здрави кртоли од компир како негативна контрола за сите тестови. Пелета од екстракт од компир исушена со замрзнување, која содржи 200 здрави тубери од компир со 10“ до 10“ и 10“ до 10“ клетки Ќ. зо/апасеагит Џоуаг 2 (низа МСРРВ 4156 “- РО 2762 “ СЕВР 3857) како позитивни контроли за серолошки и РСВ тестови. Бидејќи има влијанија врз видливоста на клетката за време на сушењето со замрзнување, тие не се соодветни како стандардни контроли за изолација и тестови со биоанализа. Суспензиите фиксирани со формалин за Ќ. 5оѓапасеагит Џоуаг 2 (низа МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 3857) на 10“ клетки на т! како позитивни контроли за серолошки тестови. Б. Подготовка на позитивни и негативни контроли за скрининг тестови на кортексот(сржта) РСКЛЕ и ЕГБН Одгледувајте 48-часовна куптура од вирулентни соеви на Ќ. зоѓапасеашт гасез/рјоуаг2 (на пр, МСРРВ 4156 - РО 2762 - СЕВР 3857) на 5М5А базален медиум и суспендирајте во 10 тМ фосфатен пуфер за да постигнете клеточна густина од приближно 2 х 108 сји на т!. Ова вообичаено се постигнува со спабо матна суспензија еднаква на оптичка густина од 0.15 на 600 пт. Отстранете ги сржта (кортексот) на окцата од 200 кртоли земени од сорти со бела кора, за кои е познато дека не се заразени од Ќ. 5ојапасеагит.. Обработете ги окцата со вообичаени методи и ресуспендирајте го талогот во 10 го. Подгответе 10 стерилни 1,5 т! микроепрувети со 9ООџ! од ресуспендираниот талог. Пренесете 100 Џ! од суспензијата Ќ. 5оѓапасеашт во првата микроепруветка. Измешајте со вртечка мешалица. Дефинирајте ги децималните нивоа на контаминација со понатамошно растворање во наредните пет микроепрувети. Шесте контаминирани микроепрувети ќе се искористат како позитивна контрола. Четирите неконтаминирани микроепрувети ќе се искористат како негативни контроли. Соодветно означете ги микроепруветите. Подгответе аликоти од 100 Џ! во стерилни микроепрувети од 1.5 т!, така што ќе добиете девет дупликати од секој контролен примерок. Чувајте на температура од 16 до -24"С се до употребата. Присуството и количината на Ќ. 5о/апасеагит во контролните примероци треба најпрво ла се потврди со |Е. Додаток 4 Пуфери за постапките за тестирање ОПШТО: Неотворени стерилизирани пуфери може да се чуваат до една година. 1. Пуфери за постапката за екстракција 1.1. Пуфер за екстракција (50 тМ фосфатен пуфер, рН 7.0) Овој пуфер се користи за екстракција на бактеријата од ткивата на растенијата со помош на хомогенизација или протресување. Ма;:НРО; (анхидрозен) "4.264 КЊРО: 2.724 Дестилирана вода 1.001 Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. Може да бидат корисни и дополнителни компоненти како што се следните: Цел Количина (на литар) Снегулки од Луброл Дефлокулација |") 054 ОС силиконска антипена Агенс против пенење |") от Тетрасодиум пирофосфат Антиоксидант 1049 Поливинилпиролидон - 4000 (РУР-40) Врзување на РСВ инхибиторите 50 4 1.2. Пуфер за плочката (10 тМ фосфатен пуфер, рН 7.2) Овој пуфер се користи за ресуспензија и растворање на јадрата од подножјето на туберот на компирот, по концентрација на пелета со помош на центрифугирање. Маг:НРО..12ЊО 279 МањрРоО..2Н-0 044 Дестилирана вода 101 Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. 2. Пуфери за |Е тест 2.1. ГЕ- пуфер (10 тМ фосфатен солен пуфер (РВ5), рН 7.2) Овој пуфер се користи за растворање на антитела. Ма;?НРО,.12Н;О 279 МанрРО.2Н;0 049 Мас! 8049 Дестилирана вода 1,01 Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. 2.2. |Е-пуфер -Туееп Овој пуфер се користи за миење на плочките. Додадете 0.175 Тмееп 20 на !Е пуферот. 2.3. Глицерол третиран со фосфатен пуфер, рН 7,6 Овој пуфер се користи како флуид за зголемување на прозорците на !Е плочките за да се зголеми флуоресценцијата. Ма?НРО..12Њ;20 329 МанРО..2Н;О 0.1549 Глицерол 50 т! Дестилирана вода 100т! Растворите на засилувач против бледеење се комерцијално достапни, на пр. Мескачнтејдо) (Уестог Царогаќтопе5) или СМИиог? (|ејса). 3. Пуфери за индиректен ЕЦА тест 3.1. Двојно засилен пуфер за обојување, рН 9 6. Ма?СО: 6.3649 Мансо; 11,729 Дестилирана вода 1,00! Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. Калиум сулфит (0.295) може да се додаде како антиоксидант, ако е потребно да се спречи наталожување на оксидирани ароматски соединенија. 3.2. 10Х фосфатен солен пуфер (РВ5), рН 7.4 Мас! 8004 КНРО; 2049 МагНРО..12Н;2О0 2904 КС! 209 Дестилирана вода 1,01 3.3. РВ5-Тмееп 10Х РВ5 100 ти! 1075 Тмееп 20 5! Дестилирана вода 895 т! 3.4. Блокирачки (антитела) пуфер (мора свежо да се подготвува). 10Х РВ5 10.0 т! Попивинилпиролидон -- 4000 (РУР-44) 209 1075 Тмееп 20 05 т Млечен прашок 059 Дестилирана вода До 100 т! 3.5. Субстрат од алкална фосфатаза, рН 9,8 Диетаноламин 97 т! Дестилирана вода воо т! Мешајте и приспособете на рН 9.8, со концентрирана НС!. До 1 | со дестилирана вода. Додадете 0.2 4 М9С! Растворете 2 супстрати фосфатаза од 5 та таблети (бата) на 15 т! раствор. 4. Пуфери за ПА5! ЕЦА тест 4.1. Пуфер за обложување, рН 9,6 Ма;СО; 1,594 Мансо 2934 Дестилирана вода 1000 т! Растворете ги состојките и проверете за рН 9,6 4.2. 10Х фосфатен солен пуфер (РВ5) рН 7.2 до 7.4 Мас! 8004 МанРО,.2 НО 4049 Ма;НРО..12Њ;О0 270д Дестилирана вода 1000 т! 4.3. РВ5-Туееп 10Х РВ5 50 т! 1075 Тмееп 20 5 Дестилирана вода 950 т! 4.4. Субстратен пуфер, рН 9,8 Диетаноламин 100 т! Дестилирана вода 900 т! Мешајте и приспособете на рН 9,8, со концентрирана НС!. Додаток 5 Определување на нивото на контаминација кај !Е и ЕГ5Н тестовите 1. Пресметајте го средниот број на типични флуоресцентни кпетки по поле на набтудување (с) 2. Пресметајте го бројот на типични флуоресцентни клетки на секој прозорец од микроскопските слајдови (С) С“ с х 5/5 Каде што: 5 “ површината на прозорецот на слајд со повеќе места, и 5 - површината на полето на објективот. 5“ тИ2/4О2К2 каде што ѓ “ коефициент на полето (варира од 8 до 24, во зависност од типот на окуларот) К“ коефициент на епруветата (1 или 1,25) О “ зголемување на објективот (100х, 40х итн.). 3. Пресметајте го бројот на типични флуоресцентни клетки на мл суспендирана плочка (М) МеСх1000ухЕ Каде што: у“ волуменот на ресуспендираната плочка на секој прозорец, и Е “ факторот на растворање на ресуспендираната плочка. Додаток 6 Потврдени РСВ протоколи и реагенси Забелешка: Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи откривање на 10“ до 10“ клетки од Ќ. 5оѓапасеагит на т! екстракт од примерок. Прелиминарното тестирање, исто така, не покажува лажни позитивни резултати со панел селектирани бактериски низи (види Додаток 3). 1. РСВ протокол на еа! ек а!. (1993) 1.1. Олигонуклеотидни прајмери Преден прајмер ОЦ-1 5-ООО ООТ АОС ТТО СТА ССТ ОСС-3" Заден прајмер У-2 5-ССС АСТ ОСТ ОСС ТСС СОТ АОО АОТ-3" Очекувана големина на ампликонот/продуктот на шаблонот на Ќ. 5оѓјапасеагит ДНК “ 288 Бр 1.2. РСВ реактивен микс Реагенс Количина по|Конечна реакција концентрација Стерилна ЏРМИ 17.65 р! 10х РСВ пуфер (") (15 тМ|2,5 ри Тх (1,5 тМ Мас) М9СК) АМТР ти (20 тМ) 0.25 р 0.2 тМ Прајмер ОЦ-1 (20 рМ) 1,25! рМ Прајмер У-2 (20 рМ) 1.25р! рМ Так полимераза (5Џ/рѓ) (") (0 р 05Џ Волумен на примерокот |2.Ор! Вкупно |25р! волумен 1.3. Услови на РСВ реакција Спроведете ја следната програма: 1 циклус од: (1.) 2 минути на температура од 96"С (денатурација на шаблон ДНК) 35 циклуси од: (2.) 20 секунди на температура од 94"С (денатурација на шаблон ДНК) (3.) 20 секунди на температура од 68"С (хибридизација на прајмерите) 4) 30 минути на температура од 72“С (продолжување на копија) 1 циклус од: (5.) 10 минути на температура од 72"С (завршно продолжување) (6.) држете на температура од 4"С. Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со Режп Е!тег 9600 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на циклусите (2.), (3.) и (4.) за примена со другите модели. 1.4. Анализа на ампликон/продуктот со рестриктивен ензим. РСК производите, засилени од ДНК на Ќ. 5оѓапасеагит. генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Ача |, по инкубација на температура од 37“С. 2. РСВ протокол на Ра5јк апд Мај5 (2000) 2.1. Олигонуклеотидни прајмери Преден прајмер Р5-1 Заден прајмер Р5-2 5- ад сда асд дса дсд 999 4 -3" 5- ддд да! нс аса (са аќс На са -3" Очекувана големина на ампликонот на шаблонот на Ќ. 5оѓапасеатшт ДНК 553 Бр 2.2. РСВ реактивен микс Реагенс Количина по реакција |Конечна концентрација Стерилна ЏР 16.025 и 10Х РСВ пуфер (") 25и Тх (1,5 тМ М9аСЕ) В5А (дел У) (100) (0,25џ! 190 4-пТР тук (20 тМ) 0,125 и! 0.1 тм Прамер Р5-1 (10 иМ) (0,5 и! 0.2 иМ Прамер Р5-2 (10 иМ) (0,5 џ! 0.2 им Так полимераза (5Џ/01 и 05Џ м)() Волумен нај50и примерокот Вкупно (25.0 волумен () Методи каде што е потврдено користење Тад полимераза од страна на Режп Ете (АтритТаа ) и ОБсо ВИ. Забелешка: Првично оптимизирано за МЈ Везеагсп РТС 200 термоциклаторот со Офсо Тад полимераза. Режп Етег АтриТад и пуферот, исто така, може да се користат со истите концентрации. 2.3. Успови на РСК реакција Спроведете ја следната програма: 1 циклус од: (1.) 5 минути на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК) 35 циклуси од: (2.) 30 секунди на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК) (3.) 30 секунди на температура од 68"С (хибридизација на прајмерите) 4.) 45 минути на температура од 72"С (продолжување на копија) 1 циклус од: (5.) 5 минути на температура од 72“С (завршно продолжување) (6.) држете на температура од 4"С. Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со МЈ Везеагси РТС 200 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на циклусите (2.), (3.) и (4.) за примена со другите модели. 2.4. Анализа на ампликон/продуктот со рестриктивен ензим. РСВ производите, шнзасилени од ДНК на ЊЌ. мојапасеашт, генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Тад |, по инкубација на температура од 65"С, за 30 минути. Рестриктивните фрагменти добиени од Ќ. 5ојапасеагит-специфичните фрагменти имаат големина од 457 бр и 96 Бр. 3. Мултипликација на РСВ протокол со внатрешна РС контрола (Ра5Шк еѓ а/., 2002) 3.1. Олигонуклеотидни прајмери Преден прајмер В5-1-Е 5- АСТ ААС ОДА ОСА ОДО АТО САТ ТА -3" Заден прајмер В5-1-В 5- ССС АОТ САС ООС АОА ОАС Т -3" Преден прајмер М5-5-Е 5- ААС ТТА ААО ОДА ТТО АСО САА б -3" Заден прајмер М5-6-В 5- ОСА ТСА САО АСС ТОТ ТАТ ТОС СТС -3" Очекувана големина на ампликонот/продуктот на шаблонот на Ќ. Боѓапасеагит ДНК “ 718 Бр (В5-прајмерски сет) Очекувана големина на ампликонот/продуктот од 185 ГЕМА внатрешна РСК контрола “ 310 Бр (М5-прајмерски збир). 3.2. РСВ реактивен микс Реагенс Количина по реакција | Конечна . . концентрација Стерилна ЏРМИ 12.625 р! 10х РСВ пуфер (") (15/2,5р 1х (1,5 тМ М9СЕ) тМ МаСЕ) В5А (дел М) (10 “0) 0.25р! 0.17, 4-пТР тк (20 тМ) 0.125р! 0,1 пм Прајмер НВ5-1-Е (10/|20р 08 рм рМ) Прајмер В5-1-Ќ (10ј20р! 0,8 рм М) Прејмер М5-5-Е (10|0,45р! 0.06 рМ им) (2) Прајмер М5-6-В (10/045р! 0.06 рМ им) (?) Так полимераза (5|О02р! 1,0Џ им) С) Волумен на|5,Ор! примерокот Вкупно |250Ор! волумен () „Методи каде што е потврдено користење Тад полимераза од страна на Реќип ЕГте (АтритТаа ) и СБсо ВВ. (ѓ) Концентрацијата на прајмерите М5-5-Е и М5-6-В се оптимизирани за јадрата на подножјата кај компирите, со користење на методот за хомогенизација и прочистување на ДНК, според (РаеШтк еѓ а!/, (види дел М.Аб41.а.). Реоптимизација на концентрациите на реагенсот ќе биде потребна ако се користи екстракција со протресување или други методи за изолација на ДНК. 3.3. Услови на РСВ реакција Спроведете ја следната програма: 1 циклус од: 5 минути на температура од .95“С (1.) (денатурација на шаблон ДНК) 35 циклуси 30 секунди на температура од „95"С од: (2.) (денатурација на шаблон ДНК) 30 секунди на температура од .58"С (3.) „(хибридизација на прајмерите) 45 секунди на температура од 72"С (4) „(продолжување на копија) 1 циклус од: 5 минути на температура од 72"С (завршно 5: продолжување) и држете на температура од 4“С. (6.) Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со МЈ Везеагсп РТС 200 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на циклусите (2.), (3.) и (4.) за примена со другите модели. 3.4. Анализа на ампликон со рестриктивен ензим. РСВ производите, засилени од ДНК на Т. мојапасеашт, генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Вот | или изошизомер (на пр. Муа 1269 Г) по инкубација на температура од 65"С за време од 30 минути. 4. К. 5оѓапасеагит Бомапејерспецифичен РСВ протокол (Ра5Шк еѓа!., 2001) 4.1. Опигонуклеотидни прајмери Преден прајмер В5-1-Е 5- АСТ ААС ОДА ОСА СДО АТО САТ ТА -3" Заден прајмер В5-1-В 5- ССС АОТ САС ООС АОА САС Т -3" Заден прајмер В5-3-В 5- ТТС АСО ОСА АОА ТСОб СТС -3" Очекувана големина на ампликонот/продуктот на шаблонот на Ќ. 5оѓапасеашт ДНК: со В5-1-Е/Ња-1-В “ 718 Бр со В5-1-Е/Њо-3-В - 716 Бр 3.3. Услови на РСВ реакција Спроведете ја следната програма: 1 циклус од: 5 минути на температура од .95“С (1.) (денатурација на шаблон ДНК) 35 циклуси 30 секунди на температура од „95"С од: (2.) (денатурација на шаблон ДНК) 30 секунди на температура од .58"С (3.) „(хибридизација на прајмерите) 45 секунди на температура од 72"С (4) „(продолжување на копија) 1 циклус од: 5 минути на температура од 72"С (завршно 5: продолжување) и држете на температура од 4“С. (6.) Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со МЈ Везеагсп РТС 200 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на циклусите (2.), (3.) и (4.) за примена со другите модели. 3.4. Анализа на ампликон со рестриктивен ензим. РСВ производите, засилени од ДНК на Т. мојапасеашт, генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Вот | или изошизомер (на пр. Муа 1269 Г) по инкубација на температура од 65"С за време од 30 минути. 4. К. 5оѓапасеагит Бомапејерспецифичен РСВ протокол (Ра5Шк еѓа!., 2001) 4.1. Опигонуклеотидни прајмери Преден прајмер В5-1-Е 5- АСТ ААС ОДА ОСА СДО АТО САТ ТА -3" Заден прајмер В5-1-В 5- ССС АОТ САС ООС АОА САС Т -3" Заден прајмер В5-3-В 5- ТТС АСО ОСА АОА ТСОб СТС -3" Очекувана големина на ампликонот/продуктот на шаблонот на Ќ. 5оѓапасеашт ДНК: со В5-1-Е/Ња-1-В “ 718 Бр со В5-1-Е/Њо-3-В - 716 Бр 4.2. РСВ реактивен микс (а) Биовариетет 1/2-специфичен РСВ Реагенс Количина пој|Конечна реакција концентрација Стерилна ЏРМИ 12.925 Ш 10Х РСВ пуфер (") |25Ш Тх (1,5 тМ Маск) В5А (дел У) (10-70) |025и! 0,1 96 4-МТР тук(20тМ) (0,125џ! 0,1 тм Прајмер В5-1-Е (10/2ш 0.8 иМ им) Прајмер НВ5-1-В (10/2Шш (0,8 иМ им) Так полимераза (5Џ10.2 и тџ ка) () : Волумен нај50 и примерокот Вкупно (25,0и! волумен (") Методи каде што е потврдено користење Тад полимераза од страна на Режјп Е!тег (АтритТаа ) и ОБсо ВВ. (6) Биовариетет 3/4/5-специфичен РСВ Реагенс Количина појКонечна реакција концентрација Стерилна ЏРМИ 14.925 и 10Х РСВ пуфер(") (|25Шш Тх (1,5 тМ Мас) В5А (дел У) (100) (0,25 ш 0,19 АМТР тк(20тМ) |0,125и! 0.1 пм Прајмер В5-1-Е (10/(1ш 0.4 иМ им) Прајмер В5-3-В (10/1ш 0,4 им им) Так полимераза (5/02и ТЏџ Џи)() Волумен нај50ш примерокот Вкупно (250иџ! волумен () Методи каде што е потврдено користење Тад полимераза од страна на Реѓип Ејтег (АтриТаа ) и СБсо ВВ. 4.3. Успови на РСВ реакција Извршете ја следната програма за биовариетет 1/2- и биовариетет 3/4/5 специфичните реакции: 1 циклус од: (1) 5 минути на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК) 35 циклуси од: (2.) 30 секунди на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК) (3.) 30 секунди на температура од 58"С (хибридизација на прајмерите) (4) 45 минути на температура од 72“С (продолжување на копија) 1 циклус од: (5) 5 минути на температура од 72"С (завршно продолжување) (6.) држете на температура од 4“С. Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со МЈ Везеагсн РТС 200 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на циклусите (2.), (3.) и (4.) за примена со другите модели. 4.4. Анализа на ампликон/продуктот со рестриктивен ензим. РСВ производите, засилени од ДНК на Ќ. з5оѓапасеашт, со користење на прајмерите В5-1-Е и В5-1-В. генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Вот ! или изошизомер (на пр. Муа 1269 ГП) по инкубација на температура од 65"С за време од 30 минути. РСВ производите од ДНК на Ќ. зо/апасеагит, користејќи ги прајмерите В5-1-Е и В5-3-В немаат места на рестрикција. 5. Подготовка на пуфер за електрофореза 5.1. Бромфенол сино (1090-готов раствор) Бромфенол сино 5 Дестилирана вода (Бие51) 50 т! 5.2. Пуфер за електрофореза Гпицерол (8675) Зот! Бромфенол сино (5.1) 300 џ! Дестилирана вода (Бие51) ба2т 6. 10Х Трис ацетат ЕОТА (ТАЕ) пуфер, рН 8.0 Трис пуфер 48.40 Глацијална оцетна киселина 11,42 т! ЕОТА (дисодиумова сол) 3,72 4 Дестилирана вода 1,001 Растворете до Тх пред употреба. Исто така, комерцијално е достапен (на пр. Инвитроген или еднаков на него). Додаток 7 Потврдени реагенси за ЕГ5Н тестот 1. Олиго-проби Специфична проба за Ќ. 5оѓапасеатшт-орестс ОШЦ-1-СУЗ: 5-дас адд кад саа дс асс ссс-3" Неспецифична еубактериска проба ЕЏВ-338-ЕТС: 5"-дс! дсс (сс сат ада адк3" 2. Раствор за фиксирање (ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ! ФИКСАТОРОТ СОДРЖИ ПАРАФОРМАЛДЕХИД КОЈ Е ТОКСИЧЕН (ОТРОВЕН). НОСЕТЕ РАКАВИЦИ, НЕМОЈТЕ ДА ГО ВДИШУВАТЕ. ПРЕПОРАЧЛИВА Е РАБОТА ВО ИЗОЛИРАНА КОМОРА. (1) Загрејте 9 мл вода за молекуларна анализа (на пр. ултра чиста вода (ЏРМ/) на приближно 60"С и додадете О.4г параформалдехид. Параформалдехидот се раствора по додавање неколку капки 1М МаОН и промешување со магнетен мешач. (2) Усогпасете ја рН вредноста на 7,0 со додавање на Тмл од 0,1М фосфатен пуфер (РВ; рН 7,0) и пет капки од 1 М НС!. Проверете ја рН вредноста со индикаторски ленти и усогласете ако е неопходно со НС! или МаОН. ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ! НЕ КОРИСТЕТЕ рН МЕТАР ЗА РАСТВОРИТЕ СО ПАРАФОРМАЛДЕХИД. (3) Филтрирајте го растворот преку мембрански филтер од 0,22 џм и заштитете го растворот од прашина, се чува на температура од 4"С додека не се употреби. 3. ЗхНуртк Мас! 27М Тп5-НОС! 60 тМ (рН 7.4) ЕОТА (филтрирајте стерилпизирано и загреано во 15 тМ автоклав) Разредите до Тх ако е потребно 4. Раствор за хибридизација Тх Нуртих Натриум додецил сулфат (505) 0.019, Формамид 305, сонда ЕЏВ 338 5 па/џ! сонда ОЦ-1 или ОЦГ-2 5 па/џ! Подгответе количини од растворот за хибридизација според пресметките во табелата. За секој слајд (кој содржи два различни примерока во дупликат) потребен е 90 џл раствор за хибридизација. ВАЖНО: ФОРМАМИДОТ Е МНОГУ ОТРОВЕН, ТАКА ШТО ТРЕБА ДА НОСИТЕ РАКАВИЦИ И ДА ГИ ПРЕЗЕМЕТЕ НЕОПХОДНИТЕ МЕРКИ НА ПРЕТПАЗЛИВОСТ! Табела 1 Предложени количества за изготвување на хибридизирачката смеша Број на стакленца: 1 4 6 8 10 Стерилна ултра чиста вода -"|23,1 92.4 138,6 184,8 231.0 Зх Нуртј 30.0 120.0 180,0 240.0 300.0 1 95 505 0,9 3.6 5,4 7,2 9.0 Формамид 27,0 108,0 162,0 216.0 270.0 Сонда ЕЏВ 338 (100 пал) 4,5 18.0 27.0 36.0 45.0 Сонда ОЦ-1 или ОЦ-2 (1004 5 18,0 27.0 36.0 45.0 пал) Вкупен 90.0 360,0 540.0 720,0 900,0 волумен (џП) Забелешка: Сите раствори што содржат олиго-сонди што се чувствителни на светлина треба да се чуваат на темно, на -20“С. Заштитете ги од директна сончева светлина или електрична светлина за време на употребата. ќ. 0.1М фосфатен пуфер, рН Ма;НРОЈ 8.529 КЊРО; 5449 Дестилирана вода 1,001. Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со обработка во автоклав на 121"С за време од 15 минути. Додаток 8 Култури од модар патлиџан и домат Засадете семе од домат (Гусорег5/соп е5сиепѓит) или модар патлиџан (боѓапит теѓопдепа) во пастеризиран семенски компост. Пресадете го расадот со целосно развиените котиледони (10 до 14 дена) во пастеризиран компост за садење. Модрите патлиџани или доматите треба да се одгледуваат во оранжерија со следниве услови на животната средина пред инокулацијата: Должина на денот 14 часа или природна должина на денот доколку е подолга; Температура Ден: од 21 до 24"С, Ноќ: од 14 до 18“С. Осетпива сорта домати -„Мопеутакег“ Осетлива сорта модри „Вааск Веаику“ патлиџани ПРИЛОГ 3 1. Во случај на сомнителна појава за која е идентификуван позитивен резултат на тестот за наведените растителни материјали и за сите останати случаи, се применува методот од Прилог 2 од оваа наредба. се чека потврда или негирање од добиените резултати, при што треба да се задржат и соодветно да се конзервираат: сите кртоли што се земени примероци-мостри, кога тоа е возможно, сите растенија земени како примероци; останатите екстракти и дополнително изготвениот материјал за тестот, на пример стаклата за имунофлуоресценција и сите документи, се додека не се завршат наведените методи. Задржувањето на кртолите ќе овозможи разновидно тестирање кое се врши по потреба. 2. Во случајот на позитивна потврда на штетниот организам, треба соодветно да се задржи и да се конзервира: материјалот од точка (1) од овој Прилог; примерок од заразениот материјал од модриот патлиџан или од доматот, инокулиран со кртола или растителен екстракт, во зависност од случајот и изолираната култура на штетниот организам, се додека не помине најмалку еден месец по постапката. ПРИЛОГ 4 1. Елементите што треба да се земат предвид во определувањето на степенот на можна контаминација согласно член б точка (а) и член 7 став (1) од оваа наредба го вклучуваат следното: (а) местото на производство каде: се одгледуваат или се одгледувале компири кои се клонално поврзани со компирите за кои е пронајдено дека се заразени со штетниот организам; се одгледуваат или се одгледувале домати кои потекнуваат од истиот извор како доматите за коие пронајдено дека се заразени со штетниот организам; се одгледуваат или се одгледувале компири или домати кои биле ставени под официјална контрола поради сомневање за појава на штетниот организам; се одгледуваат или се одгледувале компири кои се клонално поврзани со компирите што биле одгледувани на места на производство за кои е пронајдено дека се заразени со штетниот организам; се одгледуваат компири или домати лоцирани во близина на заразените места на производство, вклучувајќи ги оние места на производство кои користат заедничка производна опрема и објект или имаат заеднички изведувач на работите; се употребува површинска вода за наводнување или прскање од кој било извор за кој е потврдено или за кој постои сомневања дека е контаминиран со штетниот организам; се употребува површинска вода за наводнување или прскање од извор што го користат други, каде на местата за производство за кои е потврдено или постои сомневања дека се заразени со штетниот организам и е или било поплавено со површински води за кои е потврдено или постои сомневање дека се контаминирани со штетниот организам. (6) површинските води користени за наводнување или прскање или ги поплавиле полето (та) или местото(та) на производство, за кои е потврдено дека се заразени со штетниот организам. ПРИЛОГ 5 1. Елементите што треба да се земат предвид во определувањето на степенот на можната контаминација согласно член б точка (а) и точка (в) од оваа наредба, го вклучуваат следното: наведените растителни материјали одгледувани на местото на производство определено како контаминирано согласно член 6 точка (а) од оваа наредба; местото (та) на производство од одредена производна единица со наведените растителни материјали, определени како контаминирани согласно членот 6 точка (а) од оваа наредба, како и оние кои директно ја користат производната опрема и објект или имаат заеднички изведувач на работите; наведените растителни материјали произведени на местото(та) на производство што се наведени во претходната алинеја или се присутни на такви места на производство, за време кога наведените растителни материјали означени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба биле присутни на местото на производство што е наведено во првата алинеја; просторите, складиштата каде што се чуваат наведените растителни материјали од местата на производство, наведени во претходните алинеи; сите машини, опрема, превозни средства, садови, алати, складови или делови од нив и какви било други предмети, вклучувајки и материјали и амбалажа за пакување кои можеле да бидат во контакт со наведените растителни материјали определени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба; наведените растителни материјали складирани или доаѓаат во контакт со кои било објекти или предмети наведени во претходната алинеја, пред чистење и дезинфекцијата на на ваквите објекти и предмети; како резултат на тестирањата согласно член б точка (а) од оваа наредба во случајот на компирот, оние кртоли или растенија со сестринска или родителска врска и во случајот на домат, оние растенија што потекнуваат од истиот извор како наведениот растителен материјал одреден како контаминиран согласно член 6 точка (а) од оваа наредба и за кои, иако можеби на тестот покажале негативен резултат од штетниот организам, појавата на контаминација е веројатна преку клоналната врска. Може да се извршат различни тестови на сортите за да се потврди идентитетот на контаминираните и клонално поврзаните кртоли или растенија; местото(та) на производство на наведените растителни материјали наведени во претходната алинеа; местото(та) на производство на наведените растителни материјали што употребувале вода за наводнување или прскање која била определена како контаминирана согласно член б точка (в) од оваа наредба; наведените растителни материјали произведени на полеј(иња) поплавени со површинска вода за која е потврдено дека е контаминирана. 2. Елементите што треба да се земат предвид за определувањето на степенот на раширеност согласно член б точка (а) и точка (в) од оваа наредба, треба да го вклучуваат следното: (а) во случаите согласно членот 6 точка (а) од оваа наредба: близината до другите места на производство на кои се одгледува наведениот растителен материјал; заедничкото производство, складирање и користење на семенски материјал; местата на производство што употребувале површинска вода за наводнување или прскање на наведените растителни материјали, во случаите кога постои или постоел ризик за истекување на површинските води од, или нивно поплавување на места на производство што биле определени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба. (6) во случај кога површинската вода била определена како контаминирана согласно член 6 точка (в) од оваа наредба: местото(та) на производство на кои се одгледувал наведениот растителен материјал кои се соседни или се под ризик да бидат поплавени од површинската вода определена како контаминирана; секој воден басен за наводнување што е поврзан со површинската вода определена како контаминирана; водните маси кои се поврзани со површинската вода определена како контаминирана, земајќи ги предвид: насоката на течењето и протокот на водата определена како контаминирана; присуството на диви растенија кои може да бидат носители на штетниот организам Ќ. оо|апасеагит. 5. Фитосанитарниот инспектор согласно членот 6 од оваа наредба, треба да извести: (а) по потврдувањето на присуството на штетниот организам при лабораториски тест со користење на методот од Прилог 2 од оваа наредба и барем: за компири: сортното име на партијата со компири и типот (меркантилен, семенски, итн.) и каде што е можно семенската категорија на компирите. за растенијата на домати: сортното име на партијата и каде што е можно, категоријата. (6) Кога постои ризик од контаминација на компирот и на наведениот растителен материјал, Државниот инспекторат за земјоделство треба да ги извести другите држави кои се засегнати и да достави информации кои треба да се усогласат и исполнат: сортното име на партијата со компири или домати; името и адресата на испраќачот и примачот; датата на доставената пратка компири или домати; големината на доставената пратка компири или домати и копија од пасошот за растенија или најмалку бројот на пасошот за растенија или фитосанитарниот сертификат или регистарскиот број на одгледувачот или дистрибутерот и копија од испратницата. 4. Фитосанитарниот инспектор по утврдување и завршување на сите испитувања на присуството на штетниот организам, треба да обезбебеди: дата на потврдување на контаминацијата; краток опис на извршените испитувања за идентификација на изворот на можно ширење на контаминацијата, вклучувајки и бројот на земени примероци; информации за идентификувани или претпоставени извори на контаминација; детали за степенот на определената контаминација, вклучувајки и бројот на местата на производство и бројот на пратките со назнака на сортата и ако се работи за семе, категоријата; податоци за демаркираната зона, вклучувајки и бројот на местата на производство, кои не се определени како контаминирани, но се вклучени во зоната; детали за определување на водата, вклучувајќи го називот и местоположбата на водената маса и степенот на заразата/забраната за наводнување; за секоја пратка или серија растенија на домати определени како контаминирана, сертификатите или бројот на пасошоти сите други податоци поврзани со утврдената појава од штетниот оргамнзам. ПРИЛОГ 6 1. Официјални контролни мерки, од членот 7 став (1) од оваа наредба, се: користење на кртолите од компир како сточна храна по третманот со загревање (варење на кртолите), така што да се елиминира ризикот за преживување на штетниот организам; или фрлање на официјално одобрени места за отпад каде што нема ризик за ширење на патогенот во животната средина, (на пример да се спречи продирањето во земјоделско земјиште или контакти со водени извори кои би можеле да се користат за наводнување на земјоделско земјиште); или палење; или индустриска преработка со директно и навремено пренесување во фабрика за обработка, на официјално одобрени места за фрлање на отпадот, за која е утврдено дека нема ризик од ширење на штетниот организам и каде има систем за чистење и дезинфекција на возилата; или други мерки, под услов да се утврди дека нема ризик за ширење на штетниот организам при таквите мерки. Останатиот отпад кој произлегува од точка 1 од овој Прилог се отстранува согласно Прилог 7 од оваа наредба. 2. Соодветната употреба или отстранување на наведените растителни материјали согласно членот 7 став (2) од оваа наредба, фитосанитарниот инспектор треба да спроведе контрола во секое време и каде компирите треба да се пакуваат или да се обработуваат во капацитети каде има соодветно отстранување на отпадот, наведени во првата и втората алинеа од точка 1 на овој Прилог се: (а) за кртоли на компир: џ употреба на меркантилните компири наменети за конзумација, пакувани за директен транспорт и нивно користење без препакување, на место со соодветни капацитети за отпад; компирите наменети за садење може да се ракува на истото место, ако тоа се врши одделно или по чистење и дезинфекција; или употреба на меркантилните компири за индустриска преработка и директна достава до фабриката за обработка, која располага со соодветен капацитет за отпадот и со систем за чистење и дезинфекција на возилата што излегуваат од фабриката; или друга употреба под услов да се утврди дека нема ризик од ширење на штетниот организам. (6) за други делови од растението, вклучувајќи го стеблото и остатоците од лисјата односно лисната маса: уништување, или друга употреба или отстранување, под услов да се утврди дека нема ризик од ширење на штетниот организам. 5. Соодветните методи за чистење и дезинфекција на предметите согласно член 7 став (3) од оваа наредба се тие за кои што е утврдено дека нема ризик за ширење на штетниот организам и се користат под надзор на фитосанитарниот инспектор. 4, Серијата мерки што ги спроведува фитосанитарниот инспектор во рамките на определената зона, согласно член б точка (а) и точка (в) и член 7 став (4) од оваа наредба, го вклучуваат следното: 4.1. на местата на производство определено како контаминирано согласно член 6 точка (а) од оваа наредба: (а) во поле или единица на производство во заштини простори определени како контаминирани : ИЛИ 4411. за време од најмалку четири години на одгледување, после годината кога е утврдена контаминацијата: се преземаат мерки за елиминација на самоникнатите растенија од компир и домати, како и други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организмот, вклучувајќи ги и плевелите од фамилијата Фо|апасеае и нема да се садат: меркантилен, растенија или семенски компир; растенија и семе од домати или други растенија домаќини; растенија од фамилијата Вгазојсасеае, кои може да бидат домаќини и овозможуваат преживување на штетноит организмот; во првата сезона на посевот на компири или домати по периодот утврден во претходната алинеја од точка 4.1.1. и под услов полето да биде исчистено од други самоникнати растенија на компир или домат и други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам, вклучувајќи и плевели од фамилијата Фо|апасеае за време на официјални инспекции за најмалку две последователни години на одгледување пред садење, ќе се дозволи само производство на меркантилен компир, а собраните кртоли од компирите или растенијата на доматите, ќе се тестираат сопоред методот од Прилог 2 од оваа наредба; за време на сезоната за собирење на компирите или доматите што следува по годината по извршување на активностите во претходната алинеја и по соодветен ротациски циклус, која изнесува најмалку две години ако се сади компири за семе, се врши официјално испитување и посебен надзор, согласно член 3 став (1) од оваа наредба; или (6) за време на пет години на одгледување, после годината кога е утврдена контаминацијата: се преземаат мерки за елиминација на самоникнатите растенија од компир и домати, како и други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организам, вклучувајќи ги и плевелите од фамилијата 5о|апасеае; полето треба да биде одржувано во текот на првите три години како угар или посеано со житарици или како пасиште со често ниско косење или испасување на животните или посеано со трева за производство на семе, по што следува одгледување последователно две години со растенија што не се носители на штетниот организам за кои не постои ризик дека ќе овозможат преживување или ширење на штетниот организам; за време на првата сезона на собирење на компирите или доматите, по извршување на активностите утврдени во претходната алинеја и под услов ако е утврдено дека во полето немало самоникнати растенија на компир или домат и други растенија домаќини на штетниот организам, вклучувајќи и плевели од фамилијата о|апасеае за време на официјални инспекции и посебен надзор во рок од најмалку две последователни години пред садењето; во случајот на компири се дозволува производството на мреркантилен компир или компир за семе; собраните кртоли од компири или растенијата на доматите, во зависност од случајот, се тестираат според методот од Прилог 2 од оваа наредба. (6) во сите други полиња од контаминираното место на производство кога фитосанитарниот инспектор утврдува дека условите се задоволени и е елиминиран ризикот од самоникнати растенија од компир, домати и други растенија домаќини на штетниот организам што може да се најдат во природата, вклучувајќи ги плевелите од фамилијата 5о|апасеае: во година на одгледување после годината кога е утврдена контаминацијата; или не се садат кртоли, растенија или семе од компир или останати растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам; или во случајот на кртоли на компир насадат одобрени сертифицирани семиња само за производство на меркантилен компи; во случајот на растенија на домат, растенијата на доматите се одгледани од семе кои може да се садат единствено за производство на плодови; во втората година на одгледување после годината кога што е утврдена контаминацијата; во случајот на компири се садат само одобрени сертифицирани семиња или компири за семе кои се официјално тестирани дека се без присуство на кафеаво гниење или бактериско венеење и се одгледувани под инспекциска контрола на местата на производство, различни од оние што се наведени во 4.1, без разлика дали се работи за производство на семе или меркантилен компир; во случајот на доматите, се садат растенија на домати што се одгледани од семе што ги исполнува барањата или во случај на вегетативно размножување, од растенија на домати што се произведени од вакво семе и се одгледувани под инспекциска контрола на места на производство, различни од оние што се наведени во 4.1, за производство на семе или плодови; најмалку во третата година на одгледување после годината кога е утврдена контаминацијата; во случај на компири, се садат одобрени сертифицирани семиња или компирите за семе што се одгледани под инспекциска контрола и посебн надзор без разлика дали се работи за производство за семе или мркантилен компир; во случај на домати, се садат растенијата на доматите што се одгледани од семе што ги задоволува барањата или садници на домат кои се одгледуваат под инспекциска контрола и посебн надзор без разлика дали се работи за производство на растенија или плодови; во сите вегетативните години што се наведени во претходните алинеи се преземаат мерки за елиминирање на самоникнати растенија на компир и други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организам ако се присутни, се спроведува фитосанитарна инспекција и посебен надзор на огледуваната култура во соодветни времиња и во секое поле во кое се одгледува компирот, со спроведување официјално тестирање на собраните компири согласно методот од Прилог 2 од оваа наредба. (вВ) веднаш по определувањето на контаминацијата согласно членот 6 точка (а) од оваа наредба и по првата година на одгледување: сите машини, механизаија и складиштата на местото на производство и оние што се вклучени во производството на компири или домати се врши чистење и дезинфиција со користење на соодветни методи, како што е наведено во точка 5 од овој Прилог, се воведува инспекциска контрола врз програмите за наводнување и прскање, вклучувајќи ја нивната забрана, заради спречување на ширењето на штетниот организам; () единица на производство во заштини простори што е определена како контаминирана согласно член 6 точка(а) од оваа наредба, потребна е целосната замена на медиумот-супстратот за одгледување; нема да се садат кртоли, растенија или оригинално семе од компир, или други растенија кои се носители на штетниот организам, вклучувајќи ги растенијата и семето од домати, освен ако производната единица била предмет на официјален надзор на мерки за елиминирање на штетниот организам и отстранување на сите носители домаќини на растителните материјали, вклучувајќи целосна промена на медиумот-супстратот за одгледување, чистење и дезинфекција на претходно наведената единица за производство, како и целата опрема, по што ќе следува одобрување за производство од страна на фитосанитарниот инспектор за производство на компири или домати и за производството на компири, ваквото производството се врши од одобрени сертифицирани семиња од компири или од миникртоли или микрорастенија добиени од тестирани извори; за производство на домати, ваквото производство се врши од семе што ги исполнува барањата „ ВО случај на вегетативно размножување, од растенија на домати што се произведени од семеи се одгледувани под официјална контролаи посебен надзор; се воведува официјална контрол и посебен надзор врз програмите за наводнување и прскање на забрана, заради спречување на ширењето на штетниот организам. 4.2. Во рамките на демаркираната зона, без оглед на мерките наведени во точка 4.1, под надзор на фитосанитарниот инспектор се врши: (а) веднаш по определувањето на контаминацијата, се врши чистење и дезинфекција на целокупната механизација и складиштата на местото на производство, како и на опремата вклучена во производството на компир и домати, со користење на соодветни методи, од точка 5 од овој Прилог; б) веднаш и за најмалку три вегетациони години на одгледување после годината кога е утврдена контаминацијата: (ба) во случаи кога зоната на распространување е утврдена согласно член 6 точка (а) од оваа наредба, треба да се: обезбеди посебен надзор над просториите каде што се врши производството, чувањето или манипулацијата со кртоли од компир или со домати, заедно со просториите каде што се ракува со механизацијата за производство на компири или домати; садење само на одобрени сертифицирани семиња или семе добиено со официјална контрола за сите посеви на компир во таа зона и тестирање после собирањето на сите компири, одгледани на местата на производство означени како можно контаминирани согласно член 5 точка (а) од оваа наредба; одделно ракување со собраните компири и оние наменети за преработка И конзумација во сите простории во рамки на зоната или се обезбедат систем за чистење и дезинфекција за оние наменети за семе и залихите од меркантилен компир; садење на растенија од домати одгледани од семе што ги задоволува барањата и во случај на вегетативно размножување, од растенија на домати произведени од семе и се одгледувани под официјална контрола на сите посеви на домати во рамките на таа зона; се спроведува посебен надзор со официлално испитување, согласно член 5 став () од оваа наредба; (66) во случаите кога некоја површинска вода е определена како контаминирана согласно член 6 точка (в) од оваа наредба или е вклучена во елементите за можното ширење на штетниот организам од Прилог 5 точка 2 од оваа наредба; спроведуваат годишно испитување во соодветни периоди, вклучувајќи земање примероци мостри од површинската вода и од растенијата домаќини на штетниот организам од фамилијата 5о|апасеае од водени извори и се тестираат според методите од Прилог 2 од оваа наредба, за наведените растителни материјали и за други случаи; се воведува официјална контрола и посебен надзор врз програмите за наводнување и прскање, вклучувајќи забрана на употребата на водата која е контаминирана за наводнување и прскање на наведениот растителен материјал заради спречување на ширењето на штетниот организам. Оваа забрана може да се укине врз основа на добиените резултати од претходно наведеното годишно испитување, по што ќе следува укинување на одредената забрана од страна на фитосанитарниот инспектор кој утврдил дека површинската вода повеќе не е контаминирана. Употребата на вода што е предмет на забрана може да се дозволи, под официјална контрола и посебен надзор за наводнување и прскање на наведените растенијата ако се употребени одобрени техники за елиминирање на штетниот организам и за спречување на неговото ширење; во случаите на контаминација на испуштените течни отпадоци, се воведува официјална контрола за отстранување на цврстиот или течниот отпад од погоните на индустриските капацитети или погоните за пакување кои работат со наведениот растителен материјал. (в) се воспоставуваат програма, за замена на целиот семенски материјал на компири во текот на определен временски период. ПРИЛОГ 7 Официјално одобрените методи за отстранување на отпадот, од Прилог 6 точка 1 од оваа наредба, треба да се во согласност со следните одредби, така што ќе се согледува секој ризик за ширење на штетниот организам што може да се идентификува: (а) отпадот од компирите и доматите (вклучува исфрлени и неупотребливи компири и кората од компирите и доматите), како и каков било друг цврст отпад што е поврзан со компирите (вклучувајќи почва, камења и други остатоци) се отстранува; или преку фрлање на официјално одобрени места за отпад каде што нема ризик за ширење на штетниот организам во животната средина, на пример, да се спречи продирањето во земјоделско земјиште или водени извори и текови. Отпадот се одвезува директно на место каде што има карантински услови, така што нема да има ризик од губење на отпадот; или палење; или други мерки, под услов да се утврди дека нема ризик за ширење на штетниот организам при таквите мерки. (6) течен отпад: пред отстранувањето, течниот отпад што содржи цврсти честици ќе се подложи на филтрирање или процес на обработка за да се отстрани цврстот материјал. Ваквиот цврст материјал се отстранува како што е наведено во точка (а) од овој Прилог. Потоа, течниот отпад: се загрева на минимум 60"С, целото количество за време од 30 минути пред фрлањето; или се отстранува на друг начин под официјално одобрување и контрола, така што не постои ризик дека отпадот може да дојде во контакт со земјоделското земјиште или со водени извори што може да се користат за наводнување на земјоделско земјиште. Можностите наведени во овој Прилог исто така, се однесуваат и на отпадот поврзан со ракување, отстранување и обработка на контаминираните пратки.