Ministerial Decree approving the Methods for the analysis of feedstuffs - Supplement No. 9

Ci\//111\ lJJll("J\11 Jllll \ R:J>I llllll( \ 11\11\'\ DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALi Dl:CRLTO 11 aprik 199-l. Apprm·azione dei «\1etodi di analisi per ii conlrollo ufficiak dei,:li alimmti per animali - Supplemmto n. 9». MINISTERO DLLLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTAl.l ISPETTORATO CFNTRALE REPRESSIONE FRODI Ill COV I.RTO CO\. II !\11\.ISI LIW 1)1111.11'\,\\./L. II !\1J'\JSI 11<0 llLl.1 \ S.-\'\JT.\ 111 M!'s!SITRO llFl.l .l'slll STRL\. DIJ l0\·1\11.RCIO I DI.I.I ·,\R II < ;J ,\ '\YI 0 Vistn ii dccn:lo lcgislatirn 3 lebbraio I 993. 11. 29. conccrncntc normc per la razionalizzazi()nc dc11·organiz 1azio11c dcllc a111ministrazioni ruhhlichc c rcvisionc dclla disciplina in matcri:1 di puhblico ,mpicgo. ,1 norm:1 dcll"art. 2 dclla lcggc 23 oltobrc 1992. 11. 421: Vi>ti l"an. 43 dcl rcgio dccrcw-lcggc I 5 ottobrc 1925. n. 2033. con,crtilo nclla lcggc IX marlll 1926. 11. 562. riguardanlc la rcprcssionc dcllc !'rndi nclla prcpara1ionc c ncl n1mmercio di sosta111e di u,o agrariti e di prodotti agrari. e l"art. IOX de! regolamento per l"esccu1io11e dcllo slesso regio lkcreto-lcgge. appnl\ ato con rcgio dee re Lo I'' luglio 1926. n. 1361. i quali prcscrirnno che le analisi occorrcnti in applicazione delle norme conlenule ncl rcgio dccreto-lcgge e ncl regolamento di esecu1ione suddctti doHanno essere eseguile dai laborattiri incaricali con i mctodi di analisi pre,criLLi da quc,to \lini,Lern. di concerto con ii Ministcro dcllc ti11a111c. il !\:1iniqero dclla sanit,i cd ii Ministcro dclrindustria. dcl c<1111mcrci\1 e dclrartigianato: \'isli i decrcLi mini,LL'riali IX luglio 1975. pubblicato nclla Ga:.:.,•lfa l "!/iciulc 11. 21-l de! 12 agoslo 1975. c 30 setlemhre 197(,. puhblicato nclh (io::::eli<1 l"t/ici11/c n. XI dcl 24 rn:1r10 1977. U)ll i qu,!li son,.) ~l,ili apprn'.c1,i rispctli\:lmcntc i «Mctodi t:fill·ia!i di cin:disi tkgli a!imcn,i per uso fl)Otccnic,)» - Surplcmcnt,i 11. 2 e 11. 3: \'isl,) ii dccr•.:lo kgi-;l.ili\C) 3 m:irzo J l)l)3 11. gl), pubhlicalo nclla (i,i::::e/lu l//iciule 11. 78 dcl 3 aprilc 1993. attu,llionc dclL1 diretti\a 90,4.:.1 CEE, concerncntc la e,)I111l1ercializza1ione degli alimcnti co:11posti per animali. ed in particolare la disp,isizione rcbti\a alla dichiarazione facoltaliva in clichclla de] \·,ilnrc encrgctico per i mangimi dcstinati al pollame: Vista la dirctti\a 92 95, CEE della Commissione de] 9 110\emhrc 1992. pubblicata nella «Gazzetta Uffi ciale» Jelle Comunit,1 europee n. L 327 de! 13 novem bre 1992. chc modifica l'allegato della settima direttiva 76 372.TEE n.:lativamentc al 111etodo per ii dosaggio dell'alla tossina B 1: Vista la diretti\a 92, 89. CEE della Com111issione dcl 3 novembre 1992, pubblic,1 ta nella «Gazzetta U fficia le» delle Comunita europec n. L 344 de! 26 novembre 1992, che modifiea l'allcgato Idella quarta direttiva 73/46/CEE rclativamente al metodo per ii dosaggio della eellulosa grezza ncgli alimenti per gli animali; Vista la diretti\a 86,'l 7../T[E tklLI Commi~::;ione del 9 aprile 1986, pubblicata nella «Gazzetta U fficiale» de Ile Comunit,1 europee n. L 130 de] 16 maggio I 986, che fissa ii mctodo di calcolo dcl valore energetico degli alimenli composti destinati al pollame: Ritenuto nccessario adottare le opportune disposizioni per conformare le norme nazionali a quelle dcllc predeltc direttive comunitarie; Sentito ii parere della commissionc per l'aggiornamcn to periodico dci mctodi ufficiali di analisi per i prodotti agrari c le sostanze di uso agrario - sottocommissionc per i mangimi - di cui al dccrcto ministcrialc 11 fcbbraio 1981, c successive modificazioni; Visto J'art. 2 della legge 4 dicembre 1993, n. 491, che istituisce ii l\:linistero delle risorse agricole, alimcntari e forcstali: Dccrcta: Art. I. I. Sono :1pprornti i <<Melodi di analisi per ii controllo ufficiale dcgli alimenti per animali» dcscritti ncl supplcmcnto n. 9. allegato al presenle decreto. .-\rt. 2. I. l\cl mctodo «Dctcrminazio;ic dell'Anatossina B1, A mctodo per cromatogralia monodimcnsionalc su strato sottile» descritto nci «Metodi ufficiali di analisi degli alimcnti per uso zootccnico - Supplcmcnto n. 3» di cui al ckcrcto ministeriale 30 scttemhre 1976 citato nellc pi-..:m·~-:--,:. h p:; nc «I. S..:opll c c:rn1 pn d ·;: Pi"li,·;i1it '!lC•> c \o,tituita L~:il corrispondcntc pun lo ,< l. Sct11~:) e ctmpo cL1ppliL·:11io11c,> Jc:;critto 1,cli'alkg:1lo al prcs,ntc dccreln. 2. JI n,clodo <,Dctermina1i,1ne dcll'Allalossina B1, B m-.:todo per crnmatogral!a bidimen\i,,nalc su stralo sottilc» descritto nei prcdctti <,;\:1ciodi unieiali di an:liisi dcgli :ilimcnti per lhO 1ootcrnico - Supplcmento n. 3». c :--ostituito dal corri~pon,kntc mcic,do «B - Dclcrminazio ne dcll'Afl: :tossina B1 - mctodo per crornatogral'ia liquida ad alla risolu1ionc» dcscritto nell'alleg:.1to al prcsente dccrcto. 3. II metodo «Deterrflina1io11c della ccllulosa grena» dcscrillo nci «Melodi uffici:tli di anali~i dcgli alimenti per uso zootccnico - Supplemcnto n. 2» di cui al decreto ministeriale 18 luglio 1975, citato nelle preme:;sc. c sostituito dal corrispondente mctodo «Determinazionc dclla fibra grezza» dcscritto nell'allegato al prcscntc dccreto. Art. 3. I. II presentc decrcto cntra in vigore ii giorno successivo alla sua pubblieazionc nella Cia::::cllu l,ffi'cio!c della Repuhblica italiana. 2. II prescntc dccreto sad pubbiicat1) nella (iu::::cllu Ufliciu!e dcl!a Rcpubblica italiana. Roma, 11 aprile 1994 /, 'ispct tore gc11crulc capo pa !u rcprcssio11c dc!lc fi·odi GRl\1.-\1.1)1 Ii cliret/orc ccntra!e de! dip11rtin1c1110 dclll' dngunc c de/le i111postc indirctle L\ \',\ LE II dircttore gc11cra!c c!ei scni::i 1't!lcri11uri M.\R,\BLLl.1 II clirct/orc gcncru!e clc!la proclu::io11e illilusrriu!e AMMASS.-\RI AU.I 0\IO METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO UITICl:\LE DEGLI ALIMENT! PER ANIMAL! - SUPPLEM[NTO N. 9 Detcrminaziom: Jdl'AOaiossina B 1 - moJifica <ld rnctoJ,, A per cromatLigrafia mono<limcnsionak su strato sottilc . Dctcrminazionc Jcll'Ana tossina B 1 - mctoJo B per cronw l<.>grafia liquida ad alta risoluzionc. Dctcnninazionc ddla fihra grczza. i\.ktodo di calcolo de! valorc cncrgctico dcgli alimrnli co111pos1i dcstinati al pollamc. 5 21-4-19';)4 G.\//1 TIA UH ICl·\I £: f)f!LA RFPl lll!L:CA [ f\1.1,\', \ DETERMINAZIONE DELL'~.2Ll\TOSSINA B~ - METODO A PER CROHATOGRl'.FIA MONODIMENSIONALE SU STRATO SOTTILE fl t~!Uo Jd p1inro '"!. :)c:apr; e campo di appiica;;one" e so\·ncww Jai usw 1eg1unu: ·I. Scopo c campo di ,q,plicaztonc Serie ge11erc1/c - n. 92 11 metodo permett<: di d<'lcrminare ,! tasso di a11awss1na B, dclle matcric: prime e de, mangimi sempli ci. Questo metodo non si applica in presenZll di pclpc di agrumi. II !:mite ,r.ienore de! do saggio e di 0.01 mg/kg (10 ppb). In prcsenza di sostAnze interierenti che intra.lciano le dctermmazicn,. occ;:irre r1petere l 'anal isi scccndo ,I metodo B (cromauignliia liqu:da ad al~ pressionei. • DETERMINAZIONE DELL'AFLATOSSINA Bl - METODO 8 PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE I ' Scope C c:unpo di applicaz.ioae Vicne ?roposto un mctcdo per la detc:m:na2ionc Jcil'Jrlarossin:i 3, negii .1iimenC? Ji ·150 .uumale, ,nc!us1 quelli contenenrt polpe di Jgrumt. fl iimice :mn,mo di de,ecminn1one , 0.001 mg1kg /l ?no). Principia [I ampione v1ene estnmo con cloroiorm,c. L\,strJCto e ,iltr:1co ed un'Ji:quou e puniic:iu su c:irruccia di tloristl e ooi su c:irtUccia di C,.. Li seoaraz1one !in:iie e '.ietermtn:iz1one sono oa:e nutc per c."Omatograiia liquida Jd alca risoluzio~e (HPLq usancio una ;oionna C,, in fase inver.sa, seguic:i da una reuione di denvntizzazione ;,ost...:olonna con ;oluzione 1cquosa di ,odio e riveluionc per fluorescenzi .Vora: Le mico10 .. in.= sono S05tanZC motto cossiche. Li determinazione si devc ~eguire socto cappa per fumi adibica a questo scope. Speciali preouzioni si dcvono orenderc quando le ,OS$ine si crovano 11!0 stato =co 1 c:iusa della loro narur:i eleru-oscaac:i e la ,endenza a disoer dersi nell'orea di lavoro. 3. Re2ttivi 3. I. Coroicrmio, st:1biii.u2to con 0,5 ¾-I '·'• di ,canolo. in peso. Vederc osscr1;;z1onc ai punco 10.2.. 3.2. Metanoio, gr.do HPLC. per !a ?repan::c::e Je!la m1scela ,I p1mto 3.6. 3.3. .\atone. 3.4. .\c,:onitrilc. gr.,do nPLC. 3.5. Solvenri duenn · dl prep~rare : g,•.;mo ?rtm!t ,je!l'uso. ,1o~ur~ ci.ez-.,.ss:uli ~ediance :.,a?':10 1ci uitnsuoni. ~isceh di uqua. :netancto .,3 • .:) e .1cecon:mk 13 .;\, : :00 -- 70 - ,.C : -, - v - v1. .V .. }l: L:i corr,r,ns,:t1one (',.e!la iase :n::,:i1!~ ?i:o ~$!ere :-nocitii:-2ta a seconda ae'.!~ ::::1rartensa("~e Jdla cclonna HPLC t=r.a. J.7'. Scluz! □nc Jcquosa s;.;:t1i.-a :.:.i !OC.:o .. \ggiunge!":: ~ 3 cti :oc!o a -l(J0 :7i! .:i lcqu;i. ~\g1t::ir~ rnediante Jgit:>tore ma<!fletico per J!meno ~O minuu e filtr:1re attr:1ver.;o 'iimi a rnemorana (4.15}. ?roteggere !a soiuzicne sarur.i daiia l'.lre ~er ?reven1re ~ikcu ciovuu 1 i'.J\o,je~rialione. ;.9 C..mic:::a di ilorisil (Waters SEP-P:\.K~ o scu1va1c:1te. 3.!0. C.,micc;a C, 1 !Wa= SEP-?.A.K; o e9uiva!ente. 3. i l. Ga.s inen:e. p("r ~(:m~:o .uoto. 6 21-4-1994 GAZZETTA UFFIUALE DELLA REPUBBLICA I rALIANA Serie generate - n. 92 3.12. Soluzione standard di :iflatoSSina B., in clorolorm10. concentrlllonc 10 µgi ml. Controllare ia concencrazione dclla soiuzione come segue : dcrcrminare lo spcttro di assorbimento della soiu zione fra 330 e 370 nm mediante soettroiocometro (4.2.3); misurare l':usorbanza (A) ai massimo vicino a 363 nm ; cakolare la ·concenuazione di aflacossina B, in microgramm1 ;,er milliiicro di soiuzione medianre la formula : · ( !) 312 X A X 1000 conccncraz1one µgJm ----::.23-,, 0 0 13,991 x A 3. ! 2.1. Soiuzione standard stock in allatossma B, in cloroform,o. Trasierirc quanticaavamente 2.5 ml della soluzione standard di allatossina 8, (3.12) in un mauaccio tarato da 50 ml portando a volume con cloroiormio (3.1). Conservare quesca so!u zione. ben chiusa ed avvolta in un foglio di alluminio, in un posco fresco (4 ° C) al buio. 3. 13. Soluzione di c.alibruione di aflacosstna B, per HPLC. .V.E. : Per la pre;>arazione di questa soluzione usare veueria prevenavamente iavata con acido (vedi al punro 4, ap;>arecchiacura). 3.13.1. Soluzione di calibrazione, 4 ng/ml. Lasctar condizionare per quaJche ora a tempcratura ambiente la soluzione standard stock (3.12.l) avvolca in un foglio di alluminio. Trasferire 400 µI di quesca soluzionc (200 ng di afla tossin:a 8 1) in un pallone tarato da 50 ml ed evaporate la soluzione fino a sccchcz:a per mezzo di una corrence di gas inerce (3.11). Scioglicre ii residua octcnuto con circa 20 ml dcl11 miscela acqua-acccone e miscela:-e bene, por:are quindi a volume. 3.13.2. Soluzione di c.alibrazione 3 ng/ml. Tra.sferire quanriwivamente 7,5 ml della soluzione di c.alibrazione (3.13.!) in un mauaccio cia 10 ml e pomre a volume con la miscela acqua-acecone (3.5.3) e miscelarc bene. 3.13.3. Solu:aone di c:tlibraz1one, 2 ng/ml. Trasferire quantit:ativamence 25 ml del!a soluzione di cruibr-..zionc (,1.13.l) in un m:icraccio da 50 ml e porcare a voiumc con la misceia acqua-acetone (35.3) e miscclare bene. Questa soiurionc viene us:ata anche durante i' analisi per HPLC come stand:.rd di riferimenro per le iniaioni ripetir.ive (5-1). 3.13.4. Soluzi-.:,.ie di calihrll!one l ng/mL Trasierire quantitativamente 2.5 ml de!la soluzione di c.alibrazione (3.13.l) in un macraccio d,. IO ml e poruire a volume con la misccia ,cqua-acetone (3.5..3) e miscelare bene. 3.14. Fiah :s::;:~n~'l!Ce una mi5':ela de!le ailamssinc B,. B::, G, e G2 la cui concentI2rione e aooros5i• mativameme di l, 0.5, l e 0,5 µg/ml ris;:x:trivamente in I ml di cloroiormio. · · 3.14.l. Soiuz;one per il controilo cromacografico. Tra.sienre ii comenurn deli• fiala (3.14) in una provetta con cappo di vecro o in una fiaia con tappo a vice. Trasfeme 40 µ.I di questa soiw:.ione in un mamccio di l O ml o in una provecca con :.:n c:!ppo di vetro CTzvati con acido). Evaporarc il cloroformio mediancc una correme di gas inerte (3.11) e ridisc:ogiiere in 10 m: della miscella acqua-acet0nc (3.5.3). 3.15. Reagcnri per la prova com,-oiio di· conferma (6). 3.15.!. Soluz1one acquosa sacura di cloruro di sodio. 3.151.. Solfaco di socio anidro, granulare. 4. App"recchia.tura .1:um:,cn, : L' uso di verreria non lava ca con ac1di puo causare perclite di :iflatossina in solu zione acquosa. Particolare attenzione necc;;sitano la vecreria nuova, le pipette Pasteur e la vecreria dei dispensatori automatici come ad e5em;>io le fiale degli autocampionacori. Per questa ragione la vecreria da usare con le soluzioni acquose di at1acossina dovra csscre immem in acidi diluiti (ad esempio acido solforico :! moli/1) per parecchie ore e sciacquaca poi oene con acqua distillata c,e~ :imuovcre ogni traccia di acido (ad escm;>io ere voice e concrollo con ~artine al tomasole). in pratic:t.. questo crattamenco e necessario ;,er i macracc1 a inncio condo (4.4), oalloni tarati. ciiindri graduati. iiale e provccce per sohwoni di calibrazione ed estraru finaii (in particolarc. fialctte per autocampionatori) e pipette Pasteur se usare per ii prelievo di soluz,oni di c.alibruione o di escratri. 4. l. Mulino/ miscelatore. 7 2 ! -4-199-t G,vLl:TL\ Un,n-\:: n 1 11.-\ REPl'HBI.IC.-\ ITAI.IA:S:A .',jeric g<'llcro!c - n. 92 :..::. Setac,io con fcri da 1,0 mm jj diametro (!SO R 5651. 4..3. .->:.giuro~e mecc~nico. 4.4. Evaporatore ,o:.ame da v-,.ioto, munito di pall one a fondo ton do da l 50-250 ml. 4.5. Apparecchiarur:, per cromatcgraiia liquida ad alta risoiuzicne, ini~ttore con un awolgimento a spiraie ad.atto per inie~ione cia 250 µ.!. Vedere le istru.z.1oni della dicta costruttm:e peril parziaie e compleco nempimento de!l'avvcigimemo a spiraie. 4.6. Color.na analitica ps:r HPLC: C,. imp~ccar.a., gnznuli da 3 o 5 µ.m. l.7. Pompa a pulsazioni libere p~r l'erog-azionc pcs,-colonna de:la scluzicr,-~ di iodio. 4.8. Tubo a T per volume morco Valeo z,~:o. acciaio i,10ss1dabile (l/16" x 0,75 mm). 4.9. Siste~a di rc:u.ione a spirJ.ie : teflcn o acciaio ir.ossidabilc. u: dim~nsior.i da 3 000 x 0,5 mm a 5 000 x 0,5 mm scno nsulute appr-:>pri2te in ccmbinauone con colonne HPLC da 3 o 5 µm. 4.!0. B2gno ad acqua con t~:-mosnco rego!aco a 60 °C. cap2ce di una rego!azione di tcmpera:- ,r:, superiore a 0,l O C. .q , . Rivelaco~ a fluo=ce,1za, regolato aila !ungh-:zza d' oncia di 365 nm di eccitazione ed a 435 r,m d.i emi£Sionc (per scrumcmo a filtri utilizzare un filcro con lunghezu d'onda mar,giore di 400 ;1m). Devone e:sse~ possibili rivclazioni di almeno 0,C5 ng di aflacossina B,. Una leggera c:intropressione ;,u.'l esscre consigliabile (ad escmpio per mezzo di rescr:izione o connessione deil'uscita del rivelacore con una spirale di ceflon o acciaio incssidabile) allo scope di evicarc form:u.ione di boiie ,faria ndh fotocellul.a. •!.! 2. Regist.ra:ore con sta.mpi!Tl!e. 4.13. Inrcgnoo~ elettroni,:o (opzicnal<). 4.14. Fiicro di caru picghectato cli cliametro H cm dd tipo Mache~-Nagd 617 1/4 o equivalence. 4. l 5. filcro a membram con porosici 0,45 µm, (HA WP 04700) Milli po~ o equivalence. 4.16. Betita ch 500 ml con t:!ppo a smeriglio. 4.17. Colonna di vecro (diamecro intemo circa l cm, lunghezza circa 3-0 cm) con seri::acoio ruperiore da 50 ml. 4.18. Rubineno di rr.aceriale rcsiscence al cloroiormio (per esempio Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 o equivalence). 4.19. Siringa chimicarnence resistcnce, capaciti 10 ml. 4.20. Siringa idonea per iniezioni in HPLC di 2.50 µ.I. 4.21. Microsiring,i da I 00 µ.l per la prepan:ione delle soluzioni di c.alibruione (controllare m:diance pesata che l'accurace:zza sia entro ii 2 %). 4.22. Palloncini tarati da l O ml con cappo a smeriglio. 4.23. Spetroiotomecro, idoneo per misure nella regione UV. 4.24. Apparecchiarura per la prova di conierma (6). 4.24.l. [mbuco separaco~ da I 00 ml, lavaco con acidi, con rubinetto in ceflon. 4.24.2. Piascra riscalchnte, 4-0-50 ° C. 5. Procedimcnto 5.1. Prepara.zione del campione Macmare il camp,one in modo chc esso pass, aru:averso , fori da mm di luce del secaccio (4..;), 5.: Porzione di ::.omp1one per l'anaiis1 Pesare 50 g de! camo1one in esame in una beuca (4.16). 5 .3. Esuu.ione Aggiungere 2.5 g di celite (3.8), :!50 ml di doro1ormio (3.1) e 2.5 mi cii acqua. Tappare la beuu ed agic.are per 30 minuu su ag1tatore meccanico (4.3). Filtrare su caru da iilcro p1eghettata (4.14). Raccogiiere 50 ml de! filtr:?to. Per campioni che richiedono dilu1zion1 pre!cevare un ·aii quota de! iiltrato e ciiluire fino a 50 ml con cloroiorm10 in modo che la concemraz,one di aflalo!>s1na B, non su~en i 4 ng1mi. 5 .; PunficaZJone (il ;,rcceciimenro non dovra suinre s1gn1iicative ,merruz,on,) Att·m~icne: protegg~re acic:gu.aumcn=e il laborntorio dcve v;enc eseguJt:l !'anaEsi dalla luce diuma con 1 segueno .1c~arg1rnc:u1 : V () 21-4-1994 GAZZF,TTA Ul·FICII\I.[ DEU ,\ REPUBBLICA ITAI.IANA Serie grncrale - n. 92 I) Fogli assorbenti raggi UV sulla iir.estra in presenza di luce menuaca (evicare ia luce direaa de! sole) ; ::!) tcncie o persiane m combinazione con luce artiiiciaie (sono idonei ancite , cub, fluore scenti). le soluzioni contenenti aflacossina dcbbono essere protette ii p1u possibile daila luce (tenere al buio con fogli di allummio). 5.4.L Plurificazione con florisil SEP-PAK 5.4.!.l. Preparuione dell'assemblaggio coionna-carruccia Attaccarc un rubinetto (4.l 3) al gambo piu corto della cartuc::ia di florisil (3.8) (vedi fi gura ! ). Lavue la cartuccia e rimuov~re I' aria con i O ml di cloroior:nio iacendone oassare 8 ml acm verso la curuccia con l'aiuto di una siringa (4.19). Collegare ii gambo iungo 0 della carruccia aila colonna (4.17) e far passarc i rimanenti l ml ddla carruc::ia alla colonna. Chiudere ii rub111ecto. Rimuovere la siringa. 5.4.l .l. Purificazione Aggiungere il filtrate raccolto in 5.3 alla colonna-carruccia giii assemblace e scancare per gr.avita. Lava.re con 5 m! di doroform10 (3.1) seguiti da 20 ml di mecanolo (3.2). Scamre gli eluati. Ourante aueste o;,crazioni l'assemblaggio colonr.a-carmccia non d~ rirtnnere a :iecco. Eluire l'aflatossina B, con 4-0 ml dclla miscela acetone-acqua (3.5.1) e raccogiiere I'intero eluate nel pallone da 150 ml dell'evtpomorc rotante (4.4). C.incenmre l'elua10 ne!J'evapora core a 40-50 •c sino al term.inc de!la 01$tillazione dell'acetone (NB: A questo punco riman gono ne.l pallone cira 0.5 ml di liquido. Pro~ sperimenali hanno dimosmto chc un'ulteriore evaporuione i: opportuna e che oei rimanenti 0.5 ml di liquido non c'e signiiicativs t.raccia di acetone. Residui di acetone pottci:>bero caus ... 'e perdiie di aflatossina 8, nella c..rrucc1a C,.). Aggiungere I ml di metanoio (32). agitare ii pallone allo scope di dissoivere l'aflatossina sulle pareti nel pallone, aggiungere 4 ml di acqua e mis,:elare. Disinserire e sca..-ure la carruccia. Lavare la colonna di vetro con acqua. e conservaria per la successiva purificu:cne su C, 1• 5.42. Purficazioae su SEP-PAK C,. 5.4.2.1. Prepar.wone dell' assemblaggio colonna-carruccia C.illegare un rubinetro (4.18) al gambo piu com, di un:1 carruccia C,. (3.J 0) (ve<li figc:ra I). Caricare la carruccia rirnuo,.-e11do l' aria c facendo passare rapida.mcmc IO ml di mctanolo (3.2) via rubinet:t.'> con l'aiuw delfa siringa (4.1.9) (le belle d'aria nella cam,ccia sono visibili come macchie di luce sul fondo altrimenti uniiotmemente grigiastro). Aspiratt lO ml di acqua e fame passare 3 ml nella cmuccia (ne! passaggio da mecanolo ad acqua mca.rc introdw:ioni di aria nella carrucci2). C.illegare i! gambo piu lungo della ca.rruccia aila coionna di vecro (4.17) e iar passare i rimanrnti 2 ml dalla c:mucca alla colonna. Chiudere il ru!:nnetto. Rimuovere la siri'1gn. 5.42.2. Purificazione Tr25ferire quantit:iuvamente I'estntto r.zccolto in 5.4.12 nella co!onr:a di vetro (4.l 7) !avando due \'Olte il matraccio con 5 rnl de!la miscela acqua-mcr.anolo (3.5.2.) e scaricare per gravici. L'insicme colonna-carruccia non deve rimanere mai secco. (Se le bolle d' aria si sviluppano in prossim1ci dell:1 a.nuccia inter:rcmpcre ii flusso e picchierrare la sommici ddla·colonna per rimuovere le bo!le d"aria. Poi continuare). Eluire con l5 ml della miscela acqua-mecanolo. Scari::are reluaro. Eluire I'aflarossina B1 con 50 ml cella mi~r.:e!a acqua/acetone (3:5.3), e :acco gliere !'imero eluaco in un pailoncino =to da 50 ml. Portare a volume con acq.a eci agnare : quesi:a soluzion:, e usat.1 per la cromatograiia (5.5). Aumztont: General.meme non e nec~saria la fiitraz1one di queste escratto !inale. In case contnrio non w:are filtn di cell:.:losa pcrci.e causerebbero pcrdicc di .ulacossina ma. per esempio, film di ceflon. 5.5. Coma1ografia iiqu,da ad a/ta nsolu::;iont (HPLC) (Vedi figura ! per la messa in opera dell'acoarecduarural. Prima aeil'uso iar condizionare per un tempo suificiente lo strumento. Nota i: Le vciocici di flusso indicaca per i solvenci ed i reagenu post-coionna sono inciic:mve. Esse possono CSSCt'e variate in dipendenza dcl cipo di colonna disponibilc. C"iv1111 ,, l.J111n,1;, 11111, R11'LBB1.1u, l"!.-,11,-.;A Serie gcncrnfc - n. 92 I p!cch1 ddi-2 atlar.css:na B, ciir.,~ndo,--:o d;;.Ua tcmper.uura~ quindi s1 dovci effc~uare una comoemazione della denva (vecii hg-~r-:, 3). h:caar.do ad intervatli rego!a1i una quanm:i iiss. ciello stnnd.trd cii riierimenw cii ail::toss1r.a (3.13.J) (~r e!;Cffi!)iO ogrn u:e inie~1oni). i valcri de, Ficchi di aJhtoS!in• B, u-:1 due successive ir.iezionz di standard possono esser~ correm usando il v~ore media dei risult:ati, 5cmpreche l.i diffen:aza in i du.: valori delle risposte sia molto piccol~ ( < IO%). Percii, dcbbono essere iatte inier.ioni scnza imerruzioni. Se e necessaria un'imerruzione. I'ultima iniezione pri:na dell'intcrruz.ione e la prima iniezione dope l'imerru :z:1one devono esscre car.sider>.•~ stand.ud di riierimento (3..13.3). Dato che la curva di caiibr.i zione e line3re e pa.ssa per i'origme, le quantita di arhtossina B, nei campioni ~tr.mi sono detenninate direrr.amente riferendosi agli standards adiacenti. 5.5.,. Messa in funzione della pomp• HPLC Rego!are la pompa HPLC (4.5) per avere un flusso di 0,5 o 0.3 mlimm per una colonna HPLC. rispcrtivamentc di µm o 3 µm (4.6) usando la iase mobile inciicata al pumo 3.6. 5.5.l. Messa in funzione della pompa posr-colonna Regola.re la pompa (4.7) in mode da avere un flusso di 0.2--0,4 ml/min ciella soluzione acquosa sacura di iodio (3.7). Come guida approssimativa : Fhwi di circa 0,4 o 0.2 ml/min circa sono consigli~ti in combinazione con flussi delta lase mobile (3.6) di 0,5 o 0,3 ml/min cispettiva mentc. 5.5.J. Rivelacore a fluorescenza Regolare ii rivelacore e fluorcscenza (4.1 I) ad un eccitaz.ione - 365 nm ed un emissione 435 nm (per strumenti a filcri, lunghezza d'onda > 400 nm). Regola.re l'attenuacore del rivela tore in :node da ottcnere, per l ng di illatossina B,. circa 1'80 ¾ di deflessione dell'inter.i scala de! pcnnino dd regismcore. 5.5.4. Inicuore lnieCiare, per tutte le sol11zi01;ii, 2.50 µl seguendo sempre le indicuioni della di:ta coscrunnce dello scrumento. 5.5.5. Concrollo della separazionc cromategrafica lniettare la soluzione di controllo crom,cogt-afico (3.14.I). Le valli dci picchi dovrebbero essere meno dd 5 ¾ della somm• del!e ,ll.czze dei picchi ,diacrnu. 5.5.6. Conc,ollo delia 1:abilici1 del sisrema Prima di ogni serie di analisi ini~ttare riperucarnentc lo st:md.trd di riferimento (3.14.J} sino al r:iggiungimcnto delfa scabiliti del valore delle aree dei picchi (NB: la ri:posta dei picchi per l'aflacossina B, cn due iniezioni con$CcuUve dovri esse~ meno del 6 %. Procedere senza rit:mio con ii controi!o ddb lineariti) (5.5.7). 5.5.7. Controilo della linearica lniettare le solu:i:iom di calibru:one dell',flato.!Sina B, (3.13.1-3.13.4). Ogni 3 inieziom usarc lo standard di riferimento (3.13.J) per la coiTc::1one dclla deriva nella risposta (NB, in 90 mmuu 1 ·,alc:i ciel p1cchi degli su.ndards di riferimento non devono differire piu dcl 10 %). Correg gere per la deriva sc:ondo le indicazior.i del!e formule al punco 7. 11 gniico di calibrazione dovrebbc essere lineare e pc..sare per l'origine encro 2 x l'errore standard de! v-,iore di Y stimato. l v~ori rrovati non cievono diffenre piu dd 3 'lo de, valori ceonci. Sc qpanco 1ichiesro ; soddisfatto, proseguirr senza nu.rdo. Se non, icienuiicare e quindi correggere le cause del!'a nomillia prima di cor..inuare. 5.5.8. In1ez1one de1 ca.mpion1 escratt: lnierure gli estram de1 campioni purifiou ;5.-1.2..2). Dopa ogni due camp1om ~rr-atri npetere J'imez,one de!lo sunclard cii nfenmemo (3.!3.J) secondo tale seauen~ : scandard di nicn men,o. esrr.mo. estr.itto, scan,fard di riier.memo. est:-2tto. estr:itto. s~ndud di nfe,,mento. ecc. 6. .'rova di confenna o.l. Ulterron rruttamtntu :,itil'tsr:-,1,110 /5.'t.2.:.J :\ggiungere 5 rr.1 ciella soluz:one cii cloruro di tociio (3.ii.1) ail'e.mmo im:.ic oner.uto ai ,;unw 5.4.2...1. Estr~rre 3 voice con 2 ml di doroforrnio (3.1) p~r 1 minuro. usar.do t.n ,mbuco separa 4 [Ore (4.24. I). 10 21-4-1994 ·---· :'iilrJrt' g:: estrlC1 Ji :-!0ro;0f'"!":-.10 .t~ ; -~-r ::ire:: d.i s::ibto di sociio (3 : 5.'.?) e :.iC-:':'.-.g!i-=r«: in un.1: prv•e·.t2 ~a l 0 rnl. ~i ?U,) u:;.:,.;~ un ;-i,·c.. ~!o irr;.s:.:r::, i,.ii:•rr.-:r..-n · 4 c~-;-:,i ;)Ol"!~r:cl0 t;.!1 ::n.:t:l{~:i::, ;::: ccr::.-ne .,ei pur:tv di !"<:Stri::cne Cdl'imt.i.:tc• ,:ne v:ene c~?crto co-r, t gr '4; sc!f;..:.v ,:.L .,,;('l~o. l av-.&.re lo scr:i.to rii soHHc (.h socivj cor. ?cc!--1 n:i d: ,-·~n.1to1~~)C (ht ·,e~gor.-; r::icc:):~1 ,"',•:.:a st~f:.:1 prov~:!, t ?();.~~:.i a c;r:::c') :.1..s· ·!•".!; IJ p,i:. ~ ""?:c:-!d.inr.:- 1..;. :-4 :) e •~~-..;-enJ-e1~ con ; ,-1: .J, dorotnm110. h2. Pr::oara.::~ont .iii:J .-it:·-iv"::•.:a t n·om.:i,o;rrcr';·a ::.: 1.:,cU;J so::;ie Vcdi !).!-.i. 30 >ettemb.:-! ,9-16 · Supp!. n. J. mclooo A. r,.mo 5.6.2. Cakolo dci nsuloti C.Ucol:uc 11 contcnuto dcll'.u1accssma 8 1 (µg/lc.gj presence ncl c.:m;::none us:111do la io,m-,ia . ularossin• B, (µg/kg) C1 X V., 11 v, V,.xMx-v; dove: m quantiu di a.t1atossina B, in ng, rapprcsentaca cial p,cco ciei Qmp,one e calco lat:a nd mode scguence : P(camo,onc) m P(c~moionel x 2 qst) ?(s:,) -,- P(st,i u-ca picco ailatOS1na B, del campionc P(sc,) = piece ;ularossina B , risultantc dalla precedence inie21onc dello scandird di rifcnmemo (3.13--3) P(sc,) are:a p1cco afl:icossina 8 1 risukant.: dalla succemva iniezicne dello ,canda.rd di rifcnmcnto (3.13--3) r(st) quaorita di aflatossina B1 dello standard di rifenmenro (3.13-3) iniccuro in g V,,. voh1mc del campione cstram> inicmto in ml V,,. volume finale dc!l'estntto de] ampionc in ml, ccnscgueme ad ogni diluzionc dfctruaca (vcd.i punto 5-3) M massa del ca..'llpionc in IJ V, vohime del filtrato aufcrito sulla canuccia di florisil (5.4. l .2) in ml V, vohunc del doroformio, UKID per l'~auione dci camp1one, in ml Sc il procedimer.to seguito i: lo stesso cii quesro prorocollo, la fonnuia ridocta finale i: la seguentc: ii concenuto di aibrossina 8 1 in (µg/kg) • 20 x m 7.1. II calcolo dei ruulwi si puo fare anchc misurando l'altcza dci picchi. 8. Ripetibiliai Vedi al punto 10.1 (osscrvazioni~ 9. Riproducibilici Vedi •I punto 10.:. 10. Osscrvuior.i !O.i. Pruuaz.Jone Un srudio colt::hor:invo fl). condoti:o l !jvcllo mte~-naz.ionale su mang~mi con,pcsr..:, h~ fr,r:-aio i valon ~Jaav, a.Ila ripe::ibilic.i e nproducibiiiti.. i cui nsulun sono indic:rn i:i ~cx,'i" 1. 11 termine ripetibiiici (r), qui Ulato, i: deiinito come ii r.pporta piu amp10 non sign:tic.:iuvo ai livello d.i probabilic.a dcJ 95 %, coni.oncar,do due lc:r..tre dello stc:so omp,c,1c nd me<l~imo laboracorio alle =se condinoni. ll tcrminc rip::oducibiiiii (R) e ddiruto allo st= mode confrontando due divers, labora:ori. In base a quanco stab11iro da ISO 3534-1977, 2-35 (') e dalla dccisone 89/610/CEE dell.a Commission,e ('). re R sono anche indiote in tabclla l in termini di cocfficicnu di -,:,riuione. Talniia I Ripetibiliaa (r) c riproducibiliai (R) csprasc come rappon:i e cocfficicnti di varia zionc corrispon~cnti (15 labor:itori) Livello R CV.(1 CV, (µg/kg) (¾) (¾) 8 e 14 1,4 l.i II 18 (1 CV • coctfic,cntc di vanazionc. (') Egmond. H.P. ~n. HctSterlcamp, S.H. and Paulscli, W.E. (199n Food Addi11ws and Con1.2mirtartu 8. 17-2'. (') ISO 3534- I 977. (') GU n. L 351 del 2. 12. 1989. pog. 3'. II 21 -4- I ()<)4 G,\//111.\ lJIIIC'I\I.Ll>l.1.1,-\ Rll'lBBll(A 11-\11\'-.\ I 0.2. Staoiii.=:z,on, d,! cioro ;orm,o (3.1) Le carattensachc di assorbimenco dell, carruccia di florisil si oossono camo1are sc vengono usat.1 alm subiliuamri diversi dall'alcol. Cio s; puo verificare in accordo al punco I 03 quando non e disponibile ii cioroiorm,o 1ndicato. )03. .~ccuratc.:za La corretT..a appiica..:ione de! metodo dovr.i essere veriiicata facencio nperute anahsi su matenali di ri(enmento certificati. Se questi non sono disponibili, l'idoneit:i del metodo si verifichera con alcre orove di recuperi effemati su campioni di concrollo. La d~azione della media dal valore reale. esoressa come percenruale de! valore r.,alc, non dovr.i porsi fuon dai limm 20 ¾, • 10 ¾. ~ / 1l / l i I I I I , , I \J J1 I l I (. ~ ::] . A A =s 8 B Q 2 ml t" ' ~ , 0 rn[ r 10ml 10ml I I ! 11 11 I 12 21 ---1-199--1 G.-\//1 ITI l:, Ill I \I I 1)111 .\ R, h HHI ll .\ Ii \j I\'-.\ ? p ,----, [f} 6 7 8 r---:-, ~ I I I I ' I lL LJ 9 111 13 l. Fasc mobile 8. Giunco a T 2. Pompa 9. Bagno con concrolio cermosc.auco 3. Valvola d'iniezione I 0. Avvolgimenco di reaz1one a s01r::ile 4. P~colonna (saivacolonna) 5. Colonna analitica HPLC 6. Soluzione saru.-a di iodio 7. Pompa del re:tgente 11. Rivelaco~ di /luorescenza 12. Tubo di nsmng,menco I 3. Scarico I 4. Registntore, incegracore Figura 2: Diagramma di f!UJJo dtl s,suma di cromatogra fia liquid,:; (CL) , dtnvatt==.::i· =ione post-coionna con iodio Risposu media degli standards di riienmenco adiacenn □ -----? 1----C I standard di riferimento esintto (o calibran1e) 1 I I I I I CSl:nl!O (o alibrantc) standard di riferimento cempo CS!nl!O (0 ~libr2nce) Figura J: Comperua%iont per la ,un·va ntJla roposta di aflalossina B, aJ/'inie=,ont de/lo standard di rifmmmto (J.:JJ) ad inurva/Ji regoiari • 13 21-4-1994 GAl.ZLTTA lJITICIALE DELLA REPL;llBLICA I1AUANA Serie generale - n. 92 DETERMINAZIONE DELLA FIBRA GREZZA Scopo e campo di applic:azione Questo metodo rende possibile la determinazione nei mangimi della quota di sostanza organica. esente da lipidi, insolubile in me:zi acidi e alcalini e convenzionalmente denominata fibn grezza. 2. Principio n c:ampione sgrusato, quando nccessario. e tr2aaco in SCf:!uenza con soluzioni bollenti di acido solfo rico e idrossido di po111SSio a determinate conceuazioni. n residue e sepamo per filuazione su filtro di veao simcrizza10, lavato. seccatO, pe,aro ed incenerit0 tra 475 e 500 •c. La perdita di peso. dopa incenerimento, corrisponde alla fibra grezza presence nel c:ampione in esame. 3. R•ai..-i 3.1. Acido solforica. c - 0.13 moli/L 3.2.. Antischiuma (per esempio n-oaanolo). 3..3. Aiuro-filtrazione (Cclirc 54S o equivalence) trartato a 500 • C per ♦ ore (8.6). 3.4. Acea>ne. 3.S. Etere di peaolio (per esempio -40-60 • q. 3.6. Actdo cloridrico, c - 0.S moli/L 3.7. Idrossido di pot2SSio, c - 0.23 moli/1. 4. Apparccchiamre 4.1. Unica a. caldo per il ua.aamento de! c:unpione in esame con la soluzione di acido solforico o di idra tato di pocassio, munita di un supporto per ii crogiolo filtrante (4.2) e di un condoao con la valvola a piu vie per lo scarico de! liquido e per ii collegamento al vuoto e possibilmente ad un sistema di aria compressa. Prima dell' u.so. ogni giomo, pttriscaldare per cinque minuti I' :tequa della caldaia. annessa ail' uni Ii per ii lavaggio del residua per ii preriscaldamento dei reattivi. 4.2.. Crogiolo di vetra filtrance. capacii:a 50 ml con setto di veuo filtrante sinterizzaco di porosii:a 40-90 J.Ull, condizionato a 500 • C per breve cempo, e raftteddato prim11 dell'uro. 4.3. Cilindro del!a capar.ii:a di almeno 270 ml po:unte un refrigerante a ricadere per l'ebollizione. 4.4. Srufa di essiccaziom: con termosu.to. 4.5. Forno a muffola con termost:110. 4.6. Unica di estr-z:tionc a freddo consisteme di un supporto per ii crogiolo filtrame (4 . .2) e munita di condotta con valvola per il vuoto e per !o scarico dei liquidi. 4.7. Anelli di connessione in gomma per collerre all'unita a caldo (4.1) ii crogiolo (4 . .2) e ii cilindro (4.3) e per collegare all'unii:a di escrazione · a ireddo (4.6) ii crogiolo. 5. Procedimento Pesan:, con la precisione di 1 mg, I g dcl c:ampione prepararo e introdur!o nel crogiolo (4..2) (veciere le osservazioni 8.1. 8..2 e 8.3) ed aggiungere I g di aiuto-filtrazione (3.3). Sistemare ii crogiolo nell'unira a caldo (4.2). collegarlo poi al cilindro (4.3). lntradurre nel cilinciro a crogiolo. gia collegati. I 50 ml di acido solforico (3.l) preriscaldato vicino al punto di ebolliz.ione e poche goccie di antischiuma (3.2). Porw-e ii liquido all'ebolliz.ione entro 5 :::: .2 minuti e far boilire in mode vigoroso esaaameme per 30 minuti. Aprire la valvola di sc.arico e filtrare l'acido solforico sotto vuoto (4.1) attrave!SO ii crogiolo filtrante. Lava.re il residua raccolto sul crogiolo tre volte consecutive con !)Orzioni di acqua bollente, impie gandone ogni volta 30 ml. cercare di eliminare sotto vuoto ii liquido fino a secchezz:1 dopa ciascun lavaggio. Disinserire ii vuoro e introdurre I 50 ml di idrossido di potassio (3.7) preriscaldato vicino ai punto di ebollizione, nel cilindro e crogiolo collegati. aggiungere poche gocce di antischiuma (3.2). Porwe ii liquido all'ebollizione 5 ::: 2 minuti c fare bollire in modo vigoroso esaaamcme per 30 minuti. Filtrare . e ripetere le O!)Crazioni di lavaggio usate per ii craaamenro con acido solforico. L4 (j,\/./111.\ Ut·l!(l.\l.l lllll.\ Rt.i'i Bill!(·\ l!-\11.\:,\ Sen<' gcn<'ruil' - n. 92 · -· ,·,.c-c::.--=-:-.==:-c--c===:c.~========== Dope il l2vaggio finale e i'ess,cc.az1one sotto vumo, scollcg:i.re il crogiolo concencme ii residua e colleg-arlo alJ'unici di cstrazione a freddo· (4.6). Applicare il ,,uoto e lavare ii residua nel crogiolo 3 volte con acetone (3.4), impicg-andone ogni volt.a 25 ml. Dope ciascun lavaggio fare sempre in modo che nmo il residue sia r.ccolto sui filrro, mamcncndo ii vuoco fine a complet.a eliminazione dell'ace tone. Ess1ccare il crogioio in stu\J a 130 ° C fine a peso cost.ante. Raffrtddarlo poi in essiccacore e pesarlo r.pidamentc. Trasferire ii crogiclo in muHola ed incenerire il co:nenu:o a 475-500 °C per almeno 30 minuti, sir.a a peso ccsi:,,nce. Dopo ogni incenerimemo raffredd:ire il crog1olo priroa in :nuifola e poi in essiccatorc prim• dclla pcsar.a. Eseguire una prova in bianco con scio i re2mvi. La perd1t.a di peso risult.inte dopo l'inccnenmenco non deve superarc i 4 mg. 6. Ca.lcolo dei risultari ll comenuco percenrualr. di fibr:a gre= ncl campione i: dato da!l'espressione . [b-<:] X 100 dove a - ma.ssa del campionc in g. b pcrdita de Ila massa dopo incenerimemo a 47 5-500 ° C de! residua del campione cssiccato a 130 °C in g. c - perdita de Ila massa dopo inccRerimento del residua de! bianco essiccaco a 130 ° C in g. Riperibilita La differenza tra due determinazicr:i parallc!.m~me efk(tuate sullo srcs,o c.imp1onc non dcve ecce dere: 03 val ore a,;:.oiuro per co:ucnuto in fibn1 g.,-czz.a piu b..sso eel l O % , 3 % sul risult.ato pii: el~v:rn, per contenuto in fibra gre::::.a uguale o maggiore di 10 ¾. 8. Osservs.zioni 8. l. ! mangimi comenenti piu de! IO % di lipidi greui debbono cssere, pnma de!l'analisi, sgr:,.ssati co:, ecere di petrolio (JS). A r.aie scope, porre ii crogiolo (4.2) comenente ii campione pcsaco ne!J'unici di estraz.ione a freddo (4.6), applicare il vuoto a lavare per tre voice consecutive con 30 ml di etere di pctroiio (3.5). Mamenere ii crogioio sono vuoto fino a cornpkl2 climinazione de! solven:e dal campicne, e trask:-:rlo poi nd!'uniti di es1ra::ione a c~ldc (4.1) e continu:t.e come dcscrino al punro 5. S.2. I m:lngimi. conrenenti hp1di che non posscno es.sere eS.!.02.ai dirertame1ict con et~re di perrolio {3.5). debbono essece sgrassac, come ,ndicato al pu'lto 8.1 e sg~issati un'airra volt.a dope ebollizione con acido. Dopo ebollizione con acido e success1;0 1.,1ggio. ccllegare ii crog'olo ne!!'uniti di esmzione a treddo (4.6) e lavarlo tre v')lte con acetone irr.p,eganaone :igr,i volca 30 ml. Lava~ poi con e:~re di petro!io sempre 3 voite con a!lqucte cli 30 ml. Mantenen~: il campicne sorta vuoro fine a completa elirrirnaz1on~ dd solventt e continuarc !'anaiis1 come ckscrino a! pu!"!t•J 5 ini~iando con ii tr.lt~ men:o con ,c:ross,do di porJssio. 6.3. Se i m2nr:1m1 con(engono piu ciel 5 °/o di GtrOC:lati. (',::press1 cc~1~ carbon;:i.ro di c:::lc10. por.e il c:og1oio conu~nenre il camp1ont- {4.2) ne!l"un:ci di estrazione a cali .. {o (4.I) e iavare il campwnc- tr~ volte con ac:Go duricinco (3.6) uszndo :iiiauoce di 30 ml. Dopa ciascur:2 addizione !a":-::1a:?. npcsare il ca.rnp1,:,nt" pe; aim~nc 1 minute pnm4i deli.1 fi!tr1z:onc. Lav:.i..rr una vv!ta con acqua e poi C.)nt1nu2rc come desc:-:tto :ii punro 5. 8 4 Se viene imp1egJ~O un appGrcc.:hio a piU pos(i { ... ~iv:rsi crog1oi; posti nl"'.l!:J stec;s..1 u:1it3 a caldo) .10n deve- cssere estgu1ta nella stessa sene Ji anahsi la determ1naziCH1e in dopp10 ddlo stess-::> campione. 8.5. Se dopo eDoli:r1ont ~ diffic.ile filtrnre I.; sciu1.10n.:- acid~ o bas1ca. ir.lrodurrt ana compressa 3ai.1vers.o :i condorro cii sc:::11 ico dell'unna a caicio prcs~guendo ~01 lJ fi!traz1one. Ss Li temoeraru,a cii 1ncenenmenw non dcvt suoerar~ i 5(1(1 °C olio scopo di allun~,;ire la vita dc1 film ci1 vc:rc cit1 cro!!1ol1. Ev1:are car. ::irtenz1one ,Ji ~rocurar~ sbaiz: tcr.111ci durance, , cicli di nsc~icia me-!1co e rafircddamento a, crog1ol1, 15 21--+-l'i'>-+ .'i,n,, .~,·11crili<' - 11. 92 MKTODO DI CAI.COLO DEL VALORK EHERGETICO DEGLI ALDmNTI COKPOSTI DESTINATI AL POLI.AME I . Mctodo di calcolo cd esprcssionc de! valore cnergctico II valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame e calcolato secondo la formula che segue, in base alle percentuali di alcuni componenti analitici degli alimenti; il valore I, espresso in megajoules (M J) di energia metabolizzabile (EM), corretta in a.zoto, per chilogrammo di alimento composto: M J /kg di EM = 0, 1551 X % proteins greggia + 0,3431 X % sostanze grasse gregge + 0, 1669 X % amido + 0, 1301 X % zuccheri totali (espressi in saccarosio). 2. Tolleranze applicabili ai valori dichi.arati Sc, a seguito dc:i controlli ufficiali. si consta.ta una diffcrenza di valore energetico dell'alimento in piu o in meno frail risultato del controllo e ii valore energetico dichiarato, viene applicata una tollcranza minima di 0,4 M j /kg di EM. 3. E.spressione del risultato Previa e.pplica.zione dells formula suindicata, ii risultllto ottenuto e e.pprossimato al primo decimale. 4. Mctodi di prelicvo dci campioni c mctodi d'analisi da appliu.re II prelievo del ce.mpione dc!l'e.limento composto e ii dosaggio dei tenori dei componenti analitici impiegati nel mctodo di calcolo sono effettuati rispettivamente sccondo i mctodi di prelicvo dci campioni e i metodi di analisi per ii controllo ufficiale degli alimenti per animali. Si devono e.pplicare: per ii dosaggio delle sostanze grassc gregge: ii procedimento B del metodo di cui al D.M. 5.10.1984 suppl. n. 7, GU 30.11.1984, n. 330; per ii dosaggio dell',unido: ii metodo polarimetrico di cui al D.M. 18.07.1975 suppl. n. 2, GU 12.08.1975, n. 214. 94A2600 I. i,p<'lton· l.!c·111•rt1!1· n1po per lo fl'/H'<''·'i"ni· dt'l!f· /rot!: ( iRI\I \I Ill 16