Acuerdo Nº 510/05 - Norma para la determinación de coliformes totales en el agua

NUMER085 DIARIOde CENTROAMERICA Guatemala, MIERCOLES 19 de octubre2005 5 MINISTERIO DE ECONOMiA Acuerdase aprobar la Norma Guatemalteca Obligatoriasiguiente: COGUANOR NGO 29018 h21. Aguas. Prueba de sustrato eneimatlco para determinacibn de coliformes totales y Escherichia coli, adoptada por la Comision Guatemalteea de Normas en el Punto segundo, acta'12-2004 de fecha 24 de septiembre del afio 2004, resolucion numero 12.2004. ARTiCULO 2. EI registro olicial de Ia norma indieada queda ;'cargo d':.!lI~ ~,omisionGualemalteca de Normas (COGUANOR) ARTiCULO 3. EI presente acuerdo empezara a regir ocho (8) dias despues de su publicaci6n en el Diario de Centro America. COMUNiQUESE ACUERDO GUBERNATIVO No. 510-2005 Guatemala, 26 de septiembre de 2005 .!!... .EL PRESIDENTE DE LA REPUBLICA """,........................."'1 CONSIDERANDO: ~ Que corresponde a la Comision Guatemalteca de Nonnas (COGUANOR), estudiar, elaborar, adoptar y proponer al Organismo Ejecutivo, por conducto del Ministerio de Economia.Ta aprobaci6n de nonnas que se consideren de utilidad para el pais y contribuyan al desarrollo industrial, estableciendo principios de equidad en las relaciones entre productores y consumidores. CONSIDERANDO: Que el Consejo Direetivo de la Cornision Guatemalteca deNormas, convoc6 cn su oportunidad a los sectores publico y privados involucrados en pruebas de sustrato enzimatico para determinacion de colifonnes totales y ESCherichia coli, asi como otras entidades relacionadas con el tema, a efecto de que se pronunciaran sobre la propuesta de norma que tiene por objeto establecer el metodo para la determinacion de colifonnes totales de Escherichia coli en agua por cl procedimiento de sustrato enzimatico. CONSIDERANDO: MINISTRO DE ECONOMiA NORMA GUATEMALTECA OBLIGATORIA COGUANOR NGO 29 018 h21 Aguas. Prueba de sustrato enzimattco para determinacion de collformes totates y Escherichia coli Que consultados los sectores interesados y tecnicos en la materia, emitieron opiniones, las cuales fueron conocidas por el Consejo Directive de la Comision Guutemalteca de Normas y babiendose sometido a estudio, ese Cuerpo Colegiado, en el punto segundo, acta 12-2004, de fecha 24 de septiembre del ailo 2004, emitio In resolucion numero 12-2004, en la que ' adopta la norma COGUANOR NG029 018 h21. Aguas, Prueba de susstralo enzimatico para determinacion de coliformes totales y Escherichia coli. Por 10 .que cstando satisfechos todos los requisitos necesarios para la adopcion de esta n~nna, es procedente acordar su aprobacion en forma legal. POR TANTO: En el ejercicio de las funciones que Ie conliere el Articulo 183, inciso e) de la Constituei6n Politiea de la Republica de Guatemala y con base en los I C001isi6n Guatemalteca de Normas Mimstenode Economia Calzada Atanasio TZ~1127~32. zona 12 Segundonlvet, Guatemala.Guatemala reieronos: +5022476-6784 al 87 Fax: +502 2476-6777 CONTENIDO Rererenca ICS 0710020 Articulos 2°, literal b) y 6°. del Decreto 1523 del Congreso de la Republica, Ley de Creacion de la Comision Guatemalteea de Nonnas (COGUANOR). ACUERDA: ARTiCULO I, Aprobar la Norma Guatemalteca Obligatoria siguiente.: COGUANQR NGO 29 018 h21. Aguas, Prueba de sustrato enzimatico para determinacion de coliformes totales y Escherichia coli, adoptada por la Comision Guaternalteca de Normas en el punto segundo, acta 12-2004 de fecha 24 de septiembre del ailo 2004 resolucion numero 12-2004. 1. OBJETO .. 2. CAMPO DEAPUCACION" . 3. DEFINICIONES.. 4. PRINCIPIO DEL METODO.. 5. EQUIPO Y MATERIALES, 6. MEDIO CON SUSTRATO 7. PROCEDIMIENTO.. 8, INTERPRETACIONDE RESULTADOS... " 9. INFORME. . 10. CONTROL DE CAUDAD .". 11. CORRESPONDENCIA BIBUOGRAFIA" . " 6 Guatemala, MIERCQLES 19 de octubrs2005 DIARIO de CENTRO AMERICA NUMER085 Aguas. Prueba de sustrato enzimatico para coliformes totales y Escherichia coli 5. EQUIPO Y MATERIALES 1. OBJETO Esta norma tiene por objeto eslablecer el rnetodo para la determinaci6n de coliformes totales y Escl1erichia coli' en agua por el procedimiento de sustrato enzimatico. 2. CAMPO DE APLICACI6N 2.1 La presente norma se recomienda para el analisis de muestras de agua potable y de fuentes naturales. No es aplicable en formulaciones para ~I anallsis de aguas marinas, las cuales no se inguyen. 2.2 No sadebe utilizar la prueba de sustrato enzimatico para verificar cultivos presuntivas de coliformes a colonias presentes en los filtros de membrana. debido a que el sustrato puede sobrecargarse can una gran cantidad. de bacterias no coliformes que son productoras debiles de II-D-galactosidasa, produciendo resultados talsos positives. 3. DEFINICIONES 3.1 Grupo coUforme (coliformes totales). Las bacterias coliformes totales pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Se caracterizan por ser de forma bacilar. Gram neqativo, aerobicas y anaer6bicas facultativas, no forman esporas y fermentan el azucar lactosa con produccion de acido y gas a 35 C dentro de 48 h. A este grupo pertenecen bacterias de' los .generos Escherichie. Etiterobacter. Citrobacter y Klebsiella, entre otros. 3.2 Escherichia coli. Eschettcbie coli es una bacteria perteneciente al grupo coliforme que ferments la lactosa a 44.5 ·C ± 0.2 ·C con produccion de acido y gas en 48 h. Es el indicador de contaminacion fecal mas precise debido a que su unico habitat es el intestine de animales de sangre caliente. por 10que se ha utiiizado . como indicadorbiol6gicode contamlnacion fecal. 3.3 Enzimas. Son protelnas de alto peso molecular que se distinguen del resto de protelnas por sus propiedades cataliticas. Son entonces, proteinas que tienen la propiedad de acelerar la velocidad de reacciones quimicas, llevandolas bacia el equilibrio y sin ser consumidas en el proceso. Esta accion catalitica es, por 10 general. altamente especifica al material 0 sustrato sobre el que actus. tanto biotoqicamente como en condiciones de laboratono. 3.4 Sustratoenzimatico". Es una sustancia qulrnica que essusceptible de call1biar sus propiedades, COmo resultado de la aed6n de una enzima especifica para ella. 4. PRINCIPIO DEL METODO 4.1 Generalidades. La enumeraci6n de microorganismos del grupo coliforme.en agua es \IOa herral11ienta util en la determinaci6n de la potabilidad del agua EI metodo descrito en esta normautiliza sustratos facilmente hidrolizados por las enzimas del grupo coliforl'ne y par EscfJenc/1,a coli. Los cohfarmes totales comprenden el gr~po que posee la enzima II-D galactosidasa. que separa el sustrato cromogEmico, produciendo la Iiberaci6n del crom6geno, Escherichia coli se define COInO miembro del grupo de coliformes totales y ademas, posee laenzima f\ glucLlronidasa que escinde LIn sustrato fillorogenico. produciendo la liberacion del f1uor6geno. Laprueba se puede utilizar ya sea en un formata de tubas multiples, pozos multiples, 0 de presenCia-ausencia (muestra simple de 100 ml) Los laboratorios que pretenden implementar este procedimiento deben condllcir en un inicio, una prueba cuantitativa paralelamente con lIno de los metodos convencionales para colifonnes. para evaluar la efectividad de la prueba en el tipo especifico de agua an~liiada y para camparaI' las das tecnicas, Estacomparaci6n debe incluir variacianes estacionales. Esto es particularm~nte importante cuando se'" 'analizan muestras~de fuentes de agua. Las muestras de agua· que contienen humus II otro· ma~erial, pueden estar coloreadas, Si existeun color de fondo, se co'mparanlos tubosinoculados con un tobo control conteniendo solamente la muestra de agua. En algunas aguas. e1alto contenido de sales de calcio puede causar precipitacion pero esto no debe afectar la reacci6n. 4.2 Bacterias coliformes totates. Sustratos cromogenicos. tales como orto nitrofenil-/~D-galactopiranosido (ONPG) a rojo clorofenol-/I-O-galactopiranosido (CPRG). se utilizan para detectar la enzima /~O-galactosidasa. la cual es producida par bact~rias coliformes totales. La enzima /~D-galactosidasa hidroliza el sustrato y produce un cambia de color. el cual indica una prueba positiva para coliformes tolales a las 24 h (ONPG) 0 28 h (CPRG) de incubacion. sin procedimientos adicionales, Las bacterias· no coliformes, tales Como especies de AeromoIJ8s y Pseudomonas, pueden producir pequefias Gantidades de la enzima {"O galactosidasa,. pero estan suprimidas:t generalmente no produciran una respuesta positlva.dentro del tiempo de incubacian, a menos que estempresentes mas de 10" unidades formadoras de .colonias (UFC)/mL 0 1D· UFC/100 mL. 4.3 Escherichia call. Un sustrato fluorogenico, tal como el 4-metn-umbeliferil-/~ D-glucuronido (MUG). es utilizado para detectar la enzima /;.glucuronidasa, la cual es producida par E. coli. La enzima {;.glucuronidasa hidroliza el sustrato y genera '; un producto fluorescente cuando se ve bajo luz·ultravioleta de onda larga (366 nm) La presencia de fluorescencia indica un resultado positivo para E. coli. Algunas . cepas de Shigella spp. tambien pueden producir una respuesta fluorescenle "positiva. Debido a que las' especies de Sl1igella spp. son reconocidas como pat6genos para seres humanos, esto no se considera un inconveniente para analizar la calidad sanitaria del agua. Jncubadora a 35·C ± 0.5 ·C. Liimpara UV 366 nm. Tubos a bandejas y sellador de bandeja, si se utiliza metodo cuentitativo, Botellas, si se utiliza ei metodo cualitativo. 6. MEDIO CON SUSTRATO 6.1 Las formulaciones estan disponibles comercialmente en tubosoesechatnes para la tecruca de- tubos multiples, en placas desechables para la tecnica multi cetdas. a en recipientes para 100 rnl, de muestra para la prueba presencia ausencia. Tarnbien estan disponibles porciones apropiadas prepesadas del reactive para mezclar y dispensar en tubos multiples para pruebas can porciones de 10 mt, u otros recipientes para 100 mL de rnuestra. Es valida la aplicaci6n ae cualquier juego de reactivos comercial que utilice el principio de sustrato enzlmattco y sea.aprooado par una instituci6n reconocfda internacionalmente en este campo. 6.2" La necesidad del buen aseguramiento de calidad y uniformidad requiere de la utllizacion de un medio con sustrato comercial, evitar la exposicion directa y prolongada a la luz solar, almacenar el medio de acuerdo a las instrucciones y utilizarto antes de la fecha de expiracicn. Se deben descartar los medias en que se observe camoio de color. . 7. PROCEDIMIENTO 7.1 Procedimiento de Tubos Multiples.. Se selecciona la cantidad apropiada de tubes par muestra conteniendo el medio ya preparado y se rotulan. Se siguen las instrucciones del fabricante para la preparacion de las diluciones seriadassequn la formuJaci6n. Se agregan asepticamente 10 mL de muestra a cada tube, y se clerran perfectamente, se aqitan vigorosamente para disolverlo. La mezda permanece incolora con pruebas a base de ONPG y se torna amarilla con el sustrato CPRG. Algunas particulas pueden quedar,insolubl~s durante toda ta prueba: esto no altera SU desempeno. Se incuban a 35 C ± 0.5 C por el periodo de tiempo especificado par el fabricante del sustrato. EI procedimiento tambien puede ser lIevado a cabo anadiendo las cantidades apropiadas del medio can sustrato a la muestra, se agita vigorosamente. y se distribuye en 5 6 10 tubos estenles, Se incuba segun 10 establectdo en el procedimiento de tubos multiples. 7.2 Procedimiento de pozos multiples. EI procedimiento de pozos multiples se realiza con bandejas desechablesesteriles. Se agrega la muestra al recipients de 1(10 ml., se agrega el sustrato. se agita vigorosamente y se dispensa dentro de la bandeja. EI sellador de bandeja dispensara ta muestra dentro de las celdas y seltara la bandeja. Se incuba a 35 "c:,: 0.5·C por el periodo de tiempo especificado por el fabricante del sustrato, EI valor de numera mas probable (NMP) se abtiene a partir de una tabla de referencia proporcionada por el fabricante. 7.3 Procedimienta de presencia-ausencia'(P/AI. Aseptical11ente se agrega el media enzimatico prepesado a 100 mL de muestra en una botella de borosilicato, esteril, transparente y no f1uorescentea un recipiente equivalente. Si se cuenta con el recipienle esteril can el media can sustrato provisto por el fabricante. se agregan 100 I11L de. muestra. Se cierra el recipiente de manera aseptica y se agila vlgorosalTIentehasta disolver. Se incuba segun 10especificado en las insfrucciones del fabricante. 8, INTERPRETACION DE RESULTADOS 8.1 Collformes totaies. Se examinanlos tubas a placas despues del periodo minima de incubacion, para determinar el cambio de colorapropiado (Tabla 1). ONPG es hidrolizado par la enzima de la bacteria y produce un color am~rillo. CPRG es hidrolizado par la enzima de la bacteria y produce un color magenta a rojo. Si la respuesta del color no es uniforme·en el tubo, se mezda par inversion antes de interpretar. Se leen .Ias instrucciones del fabricante. Algunos fabricantes sugieren comparar las muestras contra comparadores de color proporcionadas por el mismo. Las muestras son negativas para coliformes totales si no se observa I1Ingun color para pn.lebas con ONPG 0 si el tuba es amarillo sl sa utiliza CPRG. Si una respuesta cromogenica es audosa despues d,i'18 h a 24 h para ONPG, se incuba hasta un maximo de 4 h adicionales, Si la respuesta es negativa despues de 28 h para CPRG, se incuba hasta un maximo de 20 h adicionales. 5i el cromogeno S8 intensifica, la muestra es positiva para coliformes fotales; de 10contrario, la muestta ' es negativa 8.2 Escherichia coli. Se examina la f1uorescencia de las tubas· 0 recipientes que ·resultaroil positivos para colifonnes fotales utilizando una Itunpara ultravioleta de onda larga (366 nm, preferiblemente con bombilla de 6 vatios). Se compara cada tuba contra el comparador de referenda disponible de la casa comercial del sustrato, Si la presencia de fluorescencia es dUdosa, se incuban 4 h' adicjonales para pruebas con ONPG y hasta 20 h adicionales can pruebas CPRG: la intensificaci6n de f1uorescenciaes un resultado positivo 9. INFORME 9.1. Si se realiza un procedimiento de NMP, Se calcula el valor de NMP para' collformes totales y E. coli a partir dj31 numero de tubos positivos como se describe en la Norma "COGUANOR NGO 29 001. l' revision. Agua potable Especificaciones". Si se utiliza el procedimiento de presencia-ausencia, se infonnan los resultados COmo coliformes totales y E. coli presentes a ausentes en 100 mL de muestra. Tabla 1.·Cambios de color para varios medios Su.trata Coliformes Totales E. coli RESULTADO POSiTIVO POSITIVO NEGATIVO ONPG-MUG Amarillo Fluorescencia azul Incoloro/no fluorescencia CPRG-MUG Rojo 0 Magenta Fluorescencia azul Amarillo/no fluor~scericia Guatemala, MIERCOLES 19deoctubre 2005 7DIARIOde CENTRO A~M:.:.:E~·R~IC~A~ --===~=:.:.==~::..=-:;;.:=:-=.:::.::=....--=- NUMERO 85 10. CONTROL DE CAUDAD 10.1 Se prueba cada nuevo late de media inoculando .Ires bacterias como controles: Escherichia coli, otra bacteria coliforme par ejemplo, Enlerobacler cloacae, y una no coliforrne. 10.2 Control de aqua esteri!. Se lncluye tambien un control de.agua esteril. Si este -control exhibe alguna fluorescencia 0 resultado positive para col1formes totales, aun de reacci6n debil, se descarta ei suslrato y se utiliza un nuevo late. Se debe. evitar utilizar un inoculo abundante. Si se utiliza Pseudomonas como representante del grupo no coutorme. se selecciona una especie no fluorescente. Sa incll~an estes controles a 35 "C :': 0.5 "C como se indic6 anteriormente. Se leen y se reqistran los resultados Otras gulas de control de calidad estan incluidas en manuales de orqanizaciones reconocidas internacionalmente (por ejemplo, Secci6n 9020 del Standard Methods for Ihe Examination of Water and wastewater, 20 edicion). 11. CORRESPONDENCIA Para la elaboraci6n de la presente norma se tom6 de referencia e! siguienle documento: Enzyme Substrate Coliform Test. 9223. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. [American Public Heallh Association. American WaterWorks Association, Water Environment Federation]. Clesceri, L.S.. A.E.. Greenberg, A.D., Eaton (ed): mIllimore, 1998. United Book Press. Inc. 20" ed. BIBLIOGRAFiA Clark. J, A & A.H. Shaarawi. 1993. E.valuation of commercial presence-absence test kits for detection of total coliforms. Escherichia, coli, and other indicator bacteria. Appl. Environ Microbial. 59:380. Covert, TC. EW. Rice, SA Johnson, D. 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