Ministerial Joint Decree No. 388/2001 harmonizing the national legislation with Commission Directives 2000/21/EC, 2000/32/EC and 2000/33/EC

F ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ ÔÇÓ ÅËËÇÍÉÊÇÓ ÄÇÌÏÊÑÁÔÉÁÓ ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ Áñ. Öýëëïõ 170 18 Öåâñïõáñßïõ 2002 ÁÐÏÖÁÓÅÉÓ Áñéè. 388/2001 Åíáñìüíéóç ôçò ÅèíéêÞò Íïìïèåóßáò ðñïò ôéò Ïäçãßåò 2000/21/Å.Ê., 2000/32/Å.Ê., 2000/33/Å.Ê. ôçò Åðéôñï ðÞò ôùí Åõñùðáúêþí ÊïéíïôÞôùí. Ï ÕÐÏÕÑÃÏÓ ÅÈÍÉÊÇÓ ÏÉÊÏÍÏÌÉÁÓ Ï ÕÖÕÐÏÕÑÃÏÓ ÏÉÊÏÍÏÌÉÊÙÍ ¸÷ïíôáò õðüøç: 1. To Ýããñáöï ôçò Äéåýèõíóçò ÐåñéâÜëëïíôïò ôïõ Ãå íéêïý ×çìåßïõ ôïõ ÊñÜôïõò áñéè. 3080/27.7.2001. 2. Ôéò äéáôÜîåéò ôïõ Üñèñïõ 1 (ðáñ. 1, 2 êáé 3) ôïõ Í. 1338/1983 «ÅöáñìïãÞ ôïõ Êïéíïôéêïý Äéêáßïõ» (Ö.Å.Ê. 34/Á/1983) üðùò ôñïðïðïéÞèçêå áðü ôï Üñèñï 6 ôïõ Í. 1440/1984 «Óõììåôï÷Þ ôçò ÅëëÜäïò óôï ÊåöÜëáéï, óôá áðïèåìáôéêÜ êáé óôéò ðñïâëÝøåéò ôçò ÅõñùðáúêÞò ÔñÜ ðåæáò Åðåíäýóåùí, óôï ÊåöÜëáéï ôçò ÅõñùðáúêÞò Êïé íüôçôïò ¢íèñáêïò êáé ×Üëõâïò êáé ôïõ Ïñãáíéóìïý Åöï äéáóìïý ÅÕÑÁÔÏÌ» (Ö.Å.Ê. 70/Á/1984) êáèþò êáé ôï Üñ èñï 65 ôïõ Í. 1892/1990 (Ö.Å.Ê. 101/Á/1990). 3. Ôï åäÜöéï ä ôçò ðáñ. 8 ôïõ Üñèñïõ 6 ôïõ Íüìïõ 4328/1929 (Ö.Å.Ê. 272/Á/1929) «Ðåñß óõóôÜóåùò Ãåíéêïý ×çìåßïõ ôïõ ÊñÜôïõò», üðùò áíôéêáôáóôÜèçêå áðü ôçí ðáñÜãñáöï 6 ôïõ Üñèñïõ 11 ôïõ Íüìïõ 2343/95, (Ö.Å.Ê. 211/Á/11.10.1995). 4. Ôï Üñèñï 4 ôïõ ÄéáôÜãìáôïò ôçò 31çò Ïêôùâñßïõ 1929 «Ðåñß êáíïíéóìïý ôçò ëåéôïõñãßáò êáé ôùí åñãáóéþí ôïõ ÁíùôÜôïõ ×çìéêïý Óõìâïõëßïõ» (Ö.Å.Ê. 391/Á/1929). 5. Ôï Üñèñï 1 ôïõ Íüìïõ 115/1975 «Ðåñß ôñïðïðïéÞóå ùò äéáôÜîåùí ôéíþí ôïõ Í. 4328/1929» (Ö.Å.Ê. 172/Á/1975). 6. Ôá Ð.Ä. 284/1988 êáé 543/1989 «Ïñãáíéóìüò ôïõ Õðïõñãåßïõ Ïéêïíïìéêþí» (Ö.Å.Ê. 128 êáé 165/Á/1988 êáé 229/Á/1989). 7. Ôçí áðüöáóç 1078204/927/0006 Á/6.8.1992 «Ðåñéï ñéóìüò Óõëëïãéêþí ÏñãÜíùí ôïõ Õðïõñãåßïõ Ïéêïíïìé êþí» ôùí Õðïõñãþí Ðñïåäñßáò êáé Ïéêïíïìéêþí» (Ö.Å.Ê. 517/Â/1992). 8. Ôçí õð� áñéè. 1100383/1330/Á 0006/31.10.2001 ÊïéíÞ áðüöáóç ôïõ Ðñùèõðïõñãïý êáé ôïõ Õðïõñãïý Ïéêïíï ìéêþí «ÁíÜèåóç áñìïäéïôÞôùí Õðïõñãïý Ïéêïíïìéêþí óôïõò Õöõðïõñãïýò Ïéêïíïìéêþí» (Ö.Å.Ê. 1485/Â/ 31.10.2001). 9. Ôéò äéáôÜîåéò ôïõ Üñèñïõ 29 Á ôïõ Í. 1558/1985 (Ö.Å.Ê. 137/Á/1985) üðùò ôï Üñèñï áõôü ðñïóôÝèçêå ìå ôï Üñèñï 27 ôïõ Í. 2081/1992 (Ö.Å.Ê. 154/Á/1992) êáé áíôéêáôáóôÜèçêå áðü ôï Üñèñï 1 ðáñ. 2á ôïõ Í. 2469/1997 (38 Á) êáé ôï ãåãïíüò üôé áðü ôçí ðáñïýóá áðüöáóç äåí ðñïêáëåßôáé äáðÜíç óå âÜñïò ôïõ Êñáôé êïý Ðñïûðïëïãéóìïý, áðïöáóßæïõìå: Åãêñßíïõìå ôçí áðüöáóç áñéèì. 388 ôïõ ÁíùôÜôïõ ×ç ìéêïý Óõìâïõëßïõ, ç ïðïßá åëÞöèç êáôÜ ôç Óõíåäñßáóç ôçò 11.9.2001 êáé ç ïðïßá Ý÷åé ùò áêïëïýèùò: ÃÅÍÉÊÏ ×ÇÌÅÉÏ TOY ÊÑÁÔÏÕÓ ÁÍÙÔÁÔÏ ×ÇÌÉÊÏ ÓÕÌÂÏÕËÉÏ Åãêñßíïõìå ôçí ôñïðïðïßçóç ôïõ Üñèñïõ 1, ôïõ Üñ èñïõ 13 ðáñÜãñáöïò 1 ðÝìðôç ðåñßðôùóç ôçò áðüöá óçò Á.×.Ó. 378/1994 (Ö.Å.Ê. 705/Â/20.9.94) êáèþò êáé ôçò ðñïóáñìïãÞò óôçí ôå÷íéêÞ ðñüïäï ôùí ðáñáñôçìÜôùí É, V êáé IX ôçò áðüöáóçò Á.×.Ó. 378/1994 (Ö.Å.Ê. 705/Â/20.9.1994) üðùò Ý÷åé ôñïðïðïéçèåß êáé éó÷ýåé, óå åíáñìüíéóç ðñïò ôá Üñèñá êáé ôá ÐáñáñôÞìáôá ôùí Ïäçãéþí 2000/21/Å.Ê., 2000/32/Å.Ê. êáé 2000/33/Å.Ê. ùò åîÞò: ¢ñèñï 1 Ç ðáñïýóá áðüöáóç åíáñìïíßæåé ôçí ÅëëçíéêÞ Íïìï èåóßá ðñïò ôéò Ïäçãßåò 2000/21/Å.Ê. ôçò ÅðéôñïðÞò ôçò ÅõñùðáúêÞò Êïéíüôçôáò (ÅÅ L 103 ôçò 28/04/2000) «ó÷å ôéêÜ ìå ôïí êáôÜëïãï ôùí Êïéíïôéêþí ðñÜîåùí ðïõ áíá öÝñïíôáé óôï Üñèñï 13 ðáñÜãñáöïò 1 ðÝìðôç ðåñßðôù óç ôçò Ïäçãßáò 67/548/Å.Ï.Ê. ôïõ Óõìâïõëßïõ», Ïä. 2000/32/Å.Ê. êáé Ïä. 2000/33/Å.Ê. ôïõ Åõñùðáúêïý Êïé íïâïõëßïõ êáé ôïõ Óõìâïõëßïõ (ÅÅ L 136 ôçò 8.6.2000) «ãéá ôçí ðñïóáñìïãÞ óôçí ôå÷íéêÞ ðñüïäï, ãéá åéêïóôÞ Ýêôç êáé åéêïóôÞ Ýâäïìç öïñÜ áíôßóôïé÷á, ôçò Ïäçãßáò 67/548/Å.Ï.Ê. ôïõ Óõìâïõëßïõ ðåñß ðñïóåããßóåùò ôùí íïìïèåôéêþí, êáíïíéóôéêþí êáé äéïéêçôéêþí äéáôÜîåùí ðïõ áöïñïýí ôçí ôáîéíüìçóç, óõóêåõáóßá êáé åðéóÞìáí óç ôùí åðéêßíäõíùí ïõóéþí». Ôï ÐáñÜñôçìá ôçò Ïäçãßáò 2000/21/Å.Ê. ôñïðïðïéåß ôïí êáôÜëïãï ôùí Êïéíïôéêþí ðñÜîåùí ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï Üñèñï 13 ðáñÜãñáöïò 1 ðÝìðôç ðåñßðôùóç ôçò áðüö. Á.×.Ó. 378/1994 (Ö.Å.Ê. 705/Â720.9.1994). Ôá ÐáñáñôÞìáôá ôùí Ïäçãéþí 2000/32/Å.Ê. êáé 2000/33/Å.Ê. ðñïóáñìüæïõí óôçí ôå÷íéêÞ ðñüïäï ôá Ðá ñáñôÞìáôá É, V, êáé IX (ãéá ôçí åëëçíéêÞ ãëþóóá) ôçò Ïäç ãßáò 67/548/Å.Ï.Ê. (ÅÅ L 196/18.6.1967), üðùò Ý÷åé ôñï 1821 Administrator Barra ðïðïéçèåß êáé éó÷ýåé êáé ðñïò ôçí ïðïßá Ý÷åé åíáñìïíéóèåß ç ÅëëçíéêÞ Íïìïèåóßá ìå ôçí áðüöáóç ôïõ Á.×.Ó. 378/1994, (Ö.Å.Ê. 705/Â720.9.1994) «Åðéêßíäõíåò ïõóßåò, ôáîéíüìçóç, óõóêåõáóßá êáé åðéóÞìáíóç áõôþí óå óõì ìüñöùóç ðñïò ôçí Ïäçãßá ôïõ Óõìâïõëßïõ ôùí Åõñù ðáúêþí ÊïéíïôÞôùí 67/548/Å.Ï.Ê. üðùò Ý÷åé ôñïðïðïéç èåß êáé éó÷ýåé». ¢ñèñï 2 Ç áðüö. Á.×.Ó. 378/1994, (Ö.Å.Ê. 705/BV20.9.1994), üðùò Ý÷åé ôñïðïðïéçèåß êáé éó÷ýåé, ôñïðïðïéåßôáé ùò åîÞò: 1. Áðü ôï Üñèñï 1 äéáãñÜöåôáé ç Ïäçãßá 93/90/Å.Ï.Ê. (EEL 277 10.11.93 ó. 33). 2. Ôï êåßìåíï ôïõ Üñèñïõ 13, ðáñÜãñáöïò 1, ðÝìðôç ðåñßðôùóç áíôéêáèßóôáôáé áðü ôï êåßìåíï: Ïé ïõóßåò ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé áðïêëåéóôéêÜ ùò åíåñ ãÜ óõóôáôéêÜ óå Üëëïõò ôïìåßò ðñïúüíôùí ãéá ôïõò ïðïß ïõò éó÷ýïõí ÊïéíïôéêÝò äéáäéêáóßåò ãíùóôïðïßçóçò Þ Ýãêñéóçò êáé ãéá ôéò ïðïßåò ïé áðáéôÞóåéò ó÷åôéêÜ ìå ôéò ðëçñïöïñßåò åßíáé ßäéåò ìå ôéò ðñïâëåðüìåíåò óôçí ðá ñïýóá üðùò: Á. ÖõôïðñïóôáôåõôéêÜ ðñïúüíôá ðïõ êáëýðôïíôáé áðü ôçí Ïäçãßá 91/414/Å.Ï.Ê. ôïõ Óõìâïõëßïõ, ôçò 15çò Éïõëß ïõ 1991, ó÷åôéêÜ ìå ôç äéÜèåóç öõôïðñïóôáôåõôéêþí ðñïúüíôùí. Â. Âéïêôüíá ðñïúüíôá ðïõ êáëýðôïíôáé áðü ôçí Ïäçãßá 98/8/Å.Ê. ôïõ Åõñùðáúêïý Êïéíïâïõëßïõ êáé ôïõ Óõìâïõ ëßïõ, ôçò 16çò Öåâñïõáñßïõ 1998, ãéá ôç äéÜèåóç âéïêôü íùí ðñïúüíôùí óôçí áãïñÜ. 3. Ôï ÐáñÜñôçìá É ôñïðïðïéåßôáé ùò åîÞò: á) Ïé óåéñÝò óôï ÐáñÜñôçìá 1 Á ôçò ðáñïýóáò áðüöá óçò, áíôéêáèéóôïýí ôéò áíôßóôïé÷åò óåéñÝò óôïí ðßíáêá Á. â) Ïé êáôá÷ùñÞóåéò ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 1 ôçò ðáñïý óáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôïýí ôéò áíôßóôïé÷åò êáôá÷ùñÞ óåéò. ã) Ðñïóôßèåíôáé ïé êáôá÷ùñÞóåéò ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 1 à ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò. 4. Ôï ìÝñïò  ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò V ôñïðïðïéåßôáé ùò åîÞò: á) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2 Á ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôï êåöÜëáéï Â.10. â) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2  ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôï êåöÜëáéï Â.11. ã) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2 à ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôï êåöÜëáéï Â. 12. ä) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2 Ä ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôá êåöÜëáéá Â. 13 êáé Â.14. å) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2 Å ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôï êåöÜëáéï Â. 17. óô) Ôï êåßìåíï ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò 2 ÓÔ ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áíôéêáèéóôÜ ôï êåöÜëáéï Â.23. ÁëëÜæåé áíôé óôïß÷ùò ï ôßôëïò ôïõ êåöáëáßïõ Â.23 óôçí åðåîçãçìáôé êÞ óçìåßùóç. ç) Ðñïóôßèåôáé ôï êåßìåíï ôùí ÐáñáñôçìÜôùí 2 Æ, 2 Ç êáé 2 È ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò. 5. ÄéáãñÜöåôáé ç ôÝôáñôç ðåñßðôùóç ôçò ãåíéêÞò åéóá ãùãÞò óôï ìÝñïò Ã~ ôïõ ÐáñáñôÞìáôïò V. 6. Ôï ÐáñÜñôçìá IX ôñïðïðïéåßôáé üðùò êáèïñßæåôáé óôï ÐáñÜñôçìá 3 ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò. ¢ñèñï 3 Ç ðáñïýóá áðüöáóç óõíïäåýåôáé áðü ôá ÐáñáñôÞìá ôá 1 Á, 1 Â, 1 Ã, 2 Á, 2 Â, 2 Ã, 2 Ä, 2 Å, 2 ÓÔ, 2 Ç, 2 Æ, 2 È êáé 3, ôá ïðïßá áðïôåëïýí áíáðüóðáóôï ìÝñïò áõôÞò. 1822 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1823 1824 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1825 1826 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1827 1828 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1829 1830 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1831 1832 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1833 1834 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1835 1836 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1837 1838 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1839 1840 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1841 1842 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1843 1844 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1845 1846 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1847 1848 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1849 1850 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1851 ÐáñÜñôçìá 2A B.10. ÌÅÔÁËËÁÎÉÃÅÍÅÓÇ - IN VITRO ÄÏÊÉÌÇ ×ÑÙÌÏÓÙÌÉÊÙÍ ÅÊÔÑÏÐÙÍ ÓÅ ÈÇËÁÓÔÉÊÁ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Óêïðüò ôçò in vitro äïêéìÞò ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí åßíáé ï åíôïðéóìüò ðáñáãüíôùí ðïõ ðñïêáëïýí äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óå êáëëéåñãçìÝíá êýôôáñá èç ëáóôéêþí (1)(2)(3). Ïé äïìéêÝò åêôñïðÝò ìðïñåß íá åßíáé äýï ôýðùí, ÷ñùìïóùìéêÝò Þ ÷ñùìáôéäéêÝò. Ôá ðåñéóóü ôåñá ÷çìéêÜ ìåôáëëáîéãüíá ðñïêáëïýí åêôñïðÝò ÷ñùìá ôéäéêïý ôýðïõ, áðáíôþíôáé üìùò êáé åêôñïðÝò ÷ñùìïóù ìéêïý ôýðïõ. Ôõ÷üí áýîçóç óôçí ðïëõðëïåéäßá ìðïñåß íá óçìáßíåé üôé ìßá ÷çìéêÞ ïõóßá Ý÷åé ôç äõíáôüôçôá íá åðÜ ãåé áñéèìçôéêÝò åêôñïðÝò. Åíôïýôïéò, ç ðáñïýóá ìÝèï äïò äåí Ý÷åé ó÷åäéáóôåß ãéá ôç ìÝôñçóç áñéèìçôéêþí åêôñïðþí êáé äåí ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞèùò ãéá ôï óêïðü áõôü. Ïé ÷ñùìïóùìéêÝò ìåôáëëÜîåéò êáé ôá óõíáöÞ óõì âÜíôá áðïôåëïýí áßôéï ðïëëþí ãåíåôéêþí áóèåíåéþí ôïõ áíèñþðïõ êáé õðÜñ÷ïõí óçìáíôéêÝò åíäåßîåéò üôé ïé ÷ñù ìïóùìéêÝò ìåôáëëÜîåéò êáé ôá óõíáöÞ óõìâÜíôá ðïõ ðñïêáëïýí áëëïéþóåéò óå ïãêïãïíßäéá êáé ïãêïãåíÞ áðï êáôáóôáôéêÜ ãïíßäéá óùìáôéêþí êõôôÜñùí ó÷åôßæïíôáé ìå ôçí åìöÜíéóç êáñêßíïõ óå áíèñþðïõò êáé óå ðåéñáìáôü æùá. Óôçí in vitro äïêéìÞ ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáëëéÝñãåéåò êáèéåñùìÝíùí êõôôáñé êþí óåéñþí, êõôôáñéêþí óôåëå÷þí Þ êáëëéÝñãåéåò áñ÷Ýãï íùí êõôôÜñùí. Ôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá êýôôáñá åðéëÝãï íôáé ìå âÜóç ôçí éêáíüôçôá áíÜðôõîÞò ôïõò óôçí êáëëéÝñ ãåéá, ôç óôáèåñüôçôá ôïõ êáñõïôýðïõ, ôïí áñéèìü ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí, ôçí ðïéêéëüôçôá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí êáé ôçí áõèüñìçôç óõ÷íüôçôá ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí. Ïé äïêéìÝò ðïõ äéåîÜãïíôáé in vitro áðáéôïýí åí ãÝíåé ôç ÷ñÞóç åîùãåíïýò ðçãÞò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôï óýóôçìá áõôü ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò äåí ìðïñåß íá ìéìçèåß åî ïëïêëÞñïõ ôéò in vivo óõíèÞêåò ôùí èçëáóôé êþí. ÐñÝðåé íá ëáìâÜíåôáé ðñüíïéá þóôå íá áðïöåýãåôáé ç ÷ñÞóç óõíèçêþí ðïõ ìðïñåß íá ïäçãÞóïõí óôç ëÞøç èåôéêþí áðïôåëåóìÜôùí ôá ïðïßá ìðïñåß íá ìçí ïöåßëï íôáé óå åããåíÞ ìåôáëëáîéãÝíåóç áëëÜ íá ðñïÝñ÷ïíôáé áðü áëëáãÝò óôï pH, ôçí ùóìùìïñéáêüôçôá Þ õøçëÜ åðß ðåäá êõôôáñïôïîéêüôçôáò (4)(5). Ç ðáñïýóá äïêéìÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí åíôïðéóìü ðé èáíþí ìåôáëëáîéãüíùí êáé êáñêéíïãüíùí ïõóéþí óôá èç ëáóôéêÜ. ÐïëëÝò åíþóåéò ðïõ åìöáíßæïíôáé èåôéêÝò óôçí ðá ñïýóá äïêéìÞ åßíáé êáñêéíïãüíåò ãéá ôá èçëáóôéêÜ. Äåí õðÜñ÷åé üìùò áðüëõôç óõó÷Ýôéóç ìåôáîý áõôÞò ôçò äïêé ìÞò êáé ôïõ öáéíïìÝíïõ ôçò êáñêéíïãåíåôéêüôçôáò. Ç óõ ó÷Ýôéóç åîáñôÜôáé áðü ôç ÷çìéêÞ ôÜîç êáé õðÜñ÷ïõí áý îïõóåò åíäåßîåéò üôé õðÜñ÷ïõí êáñêéíïãüíá ðïõ äåí áíé ÷íåýïíôáé áðü ôç äïêéìÞ áõôÞ ãéáôß äñïõí ìÝóù ìç÷áíéóìþí ðïõ äåí Ý÷ïõí ó÷Ýóç ìå Üìåóç âëÜâç ôïõ DNA. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ åéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ÅêôñïðÞ ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç ìåìïíùìÝíùí ÷ñùìáôé äþí Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç ìåôáîý ÷ñùìáôéäþí. ÅêôñïðÞ ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç, Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç, êáé ôùí äýï ÷ñùìáôéäþí óôçí ßäéá èÝóç. Åíäïáíáäéðëáóéáóìüò: äéåñãáóßá êáôÜ ôçí ïðïßá Ýðåé ôá áðü ìßá S öÜóç áíôéãñáöÞò DNA, ï ðõñÞíáò äåí õöß óôáôáé ìßôùóç áëëÜ îåêéíÜ ìßá íÝá S öÜóç. Ôï áðïôÝëå óìá åßíáé ÷ñùìïóþìáôá ìå 4, 8, 16, ... ÷ñùìáôßäåò. ×Üóìá: á÷ñùìáôéêÞ âëÜâç ìéêñüôåñç áðü ôï ðëÜôïò ìéáò ÷ñùìáôßäçò êáé ìå åëÜ÷éóôç áðåõèõãñÜììéóç ôùí ÷ñùìáôéäþí. Méôùôéêüò äåßêôçò: ï ëüãïò ôùí êõôôÜñùí óå ìåôÜöáóç äéá ôïõ óõíïëéêïý áñéèìïý ôùí êõôôÜñùí ðïõ ðáñáôç ñïýíôáé óå Ýíá êõôôáñéêü ðëçèõóìü áðïôåëåß Ýíäåéîç ôïõ âáèìïý ðïëëáðëáóéáóìïý ôïõ ðëçèõóìïý áõôïý. ÁñéèìçôéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôïõ áñéèìïý ôùí ÷ñù ìïóùìÜôùí áðü ôïí êáíïíéêü ÷áñáêôçñéóôéêü áñéèìü ôùí ÷ñçóéìïðïéïõìÝíùí êõôôÜñùí. Ðïëõðëïåéäßá: ðïëëáðëÜóéï ôïõ áðëïåéäïýò ÷ñùìï óùìéêïý áñéèìïý (n) ðÝñáí ôïõ äéðëïåéäïýò áñéèìïý (äçë. 3n, 4n ê.ï.ê). ÄïìéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôçò äïìÞò ôùí ÷ñùìïóùìÜ ôùí ðïõ åíôïðßæåôáé ìå ðáñáôÞñçóç óôï ìéêñïóêüðéï ôïõ óôáäßïõ ôçò ìåôáöÜóåùò ôçò äéáßñåóçò ôùí êõôôÜñùí êáé ãßíåôáé áíôéëçðôÞ ìå ôç ìïñöÞ áðáëåßøåùí êáé èñáõ óìÜôùí, åíäïáíôáëëáãþí Þ áíôáëëáãþí. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ ÊõôôáñéêÝò êáëëéÝñãåéåò åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõ óßá ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç. Óå ðñïêáèï ñéóìÝíá äéáóôÞìáôá ìåôÜ ôçí Ýêèåóç ôùí êõôôáñéêþí êáë ëéåñãåéþí óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, áõôÝò õðïâÜëëïíôáé óå êáôåñãáóßá ìå ìßá ïõóßá áíáóôïëÞò ôçò ìåôÜöáóçò (ð.÷. Colcemid® Þ êïë÷éêßíç), óõëëÝãïíôáé, ÷ñùìáôßæïíôáé êáé ôá ìåôáöáóéêÜ êýôôáñá åîåôÜæïíôáé ìå ìéêñïóêüðéï ãéá íá äéáðéóôùèåß áí õðÜñ÷ïõí ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 Êýôôáñá Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí äéÜöïñåò êõôôáñéêÝò óåéñÝò, óôåëÝ÷ç Þ êáëëéÝñãåéåò áñ÷Ýãïíùí êõôôÜñùí, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé áíèñþðéíùí êõôôÜñùí (ð.÷. éíïâëÜóôåò êéíÝæéêùí êñéêçôþí, áíèñþðéíá ðåñéöåñéêÜ ëåìöïêýôôáñá áßìáôïò Þ ëåìöïêýôôáñá áßìáôïò Üëëùí èçëáóôéêþí). 1.4.1.2 ÌÝóï êáé óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò Ãéá ôéò êáëëéÝñãåéåò ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáôÜë ëçëï ìÝóï êáëëéÝñãåéáò êáé óõíèÞêåò åðùÜóåùò (äï÷åßá êáëëéÝñãåéáò, óõãêÝíôñùóç CO2 , èåñìïêñáóßá êáé õãñáóßá). Ïé êáèéåñùìÝíåò êõôôáñéêÝò óåéñÝò êáé óôåëÝ ÷ç ðñÝðåé íá åëÝã÷ïíôáé óå ôáêôéêÞ âÜóç ùò ðñïò ôç óôá èåñüôçôá ôïõ õðïèåôéêïý ÷ñùìïóùìéêïý áñéèìïý êáé ôçí áðïõóßá ìüëõíóçò áðü ìõêüðëáóìá êáé äåí èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé åöüóïí Ý÷ïõí ìïëõíèåß. Èá ðñÝðåé íá åßíáé ãíùóôüò ï êáíïíéêüò ÷ñüíïò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ãéá ôá êýôôáñá êáé ôéò ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò óõíèÞêåò êáë ëéÝñãåéáò. 1.4.1.3 Åôïéìáóßá ôùí êáëëéåñãåéþí ÊáèéåñùìÝíåò êõôôáñéêÝò óåéñÝò êáé óôåëÝ÷ç: êýôôáñá ðïëëáðëáóéÜæïíôáé áðü Ýôïéìåò êáëëéÝñãåéåò, áíáêáë ëéåñãïýíôáé óå ìÝóï êáëëéÝñãåéáò ìå ðõêíüôçôá ôÝôïéá þóôå ïé êáëëéÝñãåéåò íá ìç öèÜíïõí óå êáôÜóôáóç óõñ ñïÞò ðñéí áðü ôï ÷ñüíï óõëëïãÞò êáé åðùÜæïíôáé óôïõò 37°C. Ëåìöïêýôôáñá: ðëÞñåò áßìá êáôåñãáóìÝíï ìå Ýíá áíôé èñïìâùôéêü (ð.÷. çðáñßíç) Þ äéá÷ùñéóìÝíá ëåìöïêýôôá 1852 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ñá ëçöèÝíôá áðü õãéÞ õðïêåßìåíá ðñïóôßèåíôáé óôï ìÝóï êáëëéÝñãåéáò ðïõ ðåñéÝ÷åé Ýíá ìéôùãüíï (ð.÷. öõôïáéìï óõãêïëëçôßíç) êáé åðùÜæïíôáé óôïõò 37°C. 1.4.1.4 MåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç Ôá êýôôáñá ðñÝðåé íá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ðáñïõóßá êáé áðïõóßá êáôÜëëçëïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâï ëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôï óõíçèÝóôåñá ÷ñçóéìïðïéïýìå íï óýóôçìá åßíáé Ýíá ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜóìá åìðëïõôéóìÝíï ìå óõìðáñÜãïíôá (S9) ðïõ ðáñáóêåõÜ æåôáé áðü Þðáñ ôñùêôéêþí ðïõ Ý÷åé õðïâëçèåß óå êáôåñ ãáóßá ìå åíæõìïåðáãùãéêïýò ðáñÜãïíôåò üðùò : Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9) Þ ìßãìá öáéíïâáñâéôüíçò êáé â-íáöèï öëáâüíçò (10)(11)(12). Ôï ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜóìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞ èùò óå óõãêåíôñþóåéò ôçò ôÜîåùò ôïõ 1-10% v/v óôï ôå ëéêü ìÝóï äïêéìÞò. Ç êáôÜóôáóç åíüò óõóôÞìáôïò ìåôá âïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò ìðïñåß íá åîáñôÜôáé áðü ôçí ôÜ îç ôçò õðü äïêéìÞ ÷çìéêÞò ïõóßáò. Óå ïñéóìÝíåò ðåñéðôþóåéò ìðïñåß íá ÷ñåéÜæåôáé íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ðåñéóóüôåñåò áðü ìßá óõãêåíôñþóåéò ìåôáìéôï÷ïíäñéá êïý êëÜóìáôïò. Ìå ïñéóìÝíåò áëëáãÝò, óôéò ïðïßåò ðåñéëáìâÜíåôáé êáé ç ðáñáóêåõÞ åðåîåñãáóìÝíùí ìå ìåèüäïõò ãåíåôéêÞò ìç÷áíéêÞò êõôôáñéêþí óåéñþí ðïõ åêöñÜæïõí åéäéêÜ åíåñãïðïéçôéêÜ Ýíæõìá, åíäÝ÷åôáé íá ìðïñåß íá ãßíåé êáé åíäïãåíÞò åíåñãïðïßçóç. Ç åðéëïãÞ ôùí ÷ñçóéìïðïéïõ ìÝíùí êõôôáñéêþí óåéñþí ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé åðéóôç ìïíéêþò (ð.÷. áðü ôç ó÷Ýóç ôïõ êõôï÷ñùìéêïý P450 éóï åíæýìïõ ìå ôï ìåôáâïëéóìü ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò). 1.4.1.5 Õðü äïêéìÞ ïõóßá/Ðñïåôïéìáóßá Ïé óôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéá ëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé, åöüóïí áðáéôåßôáé, ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá ôùí êõôôÜñùí. Ïé õãñÝò ïõóßåò ìðïñïýí íá ðñïóôßèåíôáé áðåõèåßáò óôá óõóôÞìáôá äï êéìÞò êáé/Þ íá áñáéþíïíôáé ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá. ÐñÝ ðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìáôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôá èåñüôçôá ôçò ïõóßáò óôïé÷åßá åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïé ìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí. 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Äåí ðñÝðåé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñáóç ôïõ äéáëýôç/öïñÝá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá åíþ áõôüò èá ðñÝðåé íá åßíáé óõìâáôüò ìå ôçí åðéâßùóç ôùí êõôôÜñùí êáé ôç äñáóôéêüôçôá S9. Åöüóïí ï ÷ñçóé ìïðïéïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åßíáé áðü ôïõò ãíù óôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé÷åßùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. Óõíé óôÜôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá áí ìðï ñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß õäáôéêüò äéáëýôçò/öïñÝáò. ¼ôáí åîåôÜæïíôáé ïõóßåò ðïõ äåí åßíáé óôáèåñÝò óôï íåñü, ïé ÷ñçóéìïðïéïýìåíïé ïñãáíéêïß äéáëýôåò èá ðñÝðåé íá åßíáé áðáëëáãìÝíïé ýäáôïò. Ôï íåñü ìðïñåß íá áöáéñåèåß ìå ôçí ðñïóèÞêç ìïñéáêïý êïóêßíïõ. 1.4.2.2 Óõãêåíôñþóåéò åêèÝóåùò Ìåôáîý ôùí êñéôçñßùí ðïõ ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðü øç üôáí êáèïñßæåôáé ç ìÝãéóôç ðñïò ÷ñÞóç óõãêÝíôñùóç åßíáé ç êõôôáñïôïîéêüôçôá, ç äéáëõôüôçôá óôï óýóôçìá äïêéìÞò êáé ïé ìåôáâïëÝò óôï pH Þ ôçí ïóìùìïñéáêüôçôá. Ç êõôôáñïôïîéêüôçôá èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç óôï êýñéï ðåßñáìá ÷ñçóéìïðïéþíôáò ðñïò ôïýôï ìßá êáôÜëëçëç Ýíäåéîç ôçò áêåñáéüôçôáò êáé áíÜðôõîçò ôùí êõôôÜñùí üðùò ï âáè ìüò óõññïÞò, ï áñéèìüò ôùí âéþóéìùí êõôôÜñùí Þ ï ìé ôùôéêüò äåßêôçò. ×ñÞóéìï ìðïñåß íá åßíáé ï ðñïóäéïñé óìüò ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé äéáëõôüôçôáò íá ãßíåé óå Ýíá ðñïêáôáñêôéêü ðåßñáìá. Ãéá ôçí áíÜëõóç èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôñåéò ôïõëÜ÷éóôïí óõãêåíôñþóåéò. Åöüóïí åìöáíßæïíôáé öáé íüìåíá êõôôáñïôïîéêüôçôáò, ïé óõãêåíôñþóåéò áõôÝò èá ðñÝðåé íá êáëýðôïõí ìßá ðåñéï÷Þ áðü ôç ìÝãéóôç ìÝ÷ñé ìé êñÞ Þ êáé ìçäåíéêÞ ôïîéêüôçôá. Áõôü óçìáßíåé óõíÞèùò üôé ïé óõãêåíôñþóåéò äåí èá ðñÝðåé íá äéáöÝñïõí ðåñéóóü ôåñï áðü Ýíá óõíôåëåóôÞ ìåôáîý 2 êáé Ö10. ÊáôÜ ôï ÷ñü íï ôçò óõëëïãÞò, ç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç èá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé óçìáíôéêÞ ìåßùóç óôï âáèìü óõññïÞò, ôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí Þ ôï ìéôùôéêü äåßêôç (üëá ðåñéóóü ôåñï áðü 50%). Ï ìéôùôéêüò äåßêôçò áðïôåëåß Ýììåóç ìü íï ìÝôñçóç ôùí êõôôáñïôïîéêþí/êõôôáñïóôáôéêþí áðï ôåëåóìÜôùí êáé åîáñôÜôáé áðü ôï ÷ñüíï ðïõ ìåóïëÜâçóå áðü ôçí êáôåñãáóßá. Åíôïýôïéò, ï ìéôùôéêüò äåßêôçò åßíáé áðïäåêôüò ãéá êáëëéÝñãåéåò ìïñöÞò åíáéùñÞìáôïò ãéá ôéò ïðïßåò Üëëåò ìåôñÞóåéò ôïîéêüôçôáò ìðïñåß íá åßíáé Üâïëåò êáé ìç ðñáêôéêÝò. Óôïé÷åßá ó÷åôéêÜ ìå ôçí êéíçôéêÞ ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ, üðùò ï ìÝóïò ÷ñüíïò ãåíåÜò (Ì×Ã), ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ùò óõìðëçñùìáôé êÝò ðëçñïöïñßåò. Åíôïýôïéò, ï Ì×à åßíáé ìßá ãåíéêÞ ìÝóç ôéìÞ ðïõ äåí áðïêáëýðôåé ðÜíôïôå ôçí ýðáñîç êáèõóôå ñçìÝíùí õðïðëçèõóìþí, áêüìç äå êáé ðïëý ìéêñÝò áõ îÞóåéò óôï ìÝóï ÷ñüíï ãåíåÜò ìðïñïýí íá óõíäÝïíôáé ìå ðïëý óçìáíôéêÞ êáèõóôÝñçóç óôï ÷ñüíï ôçò Üñéóôçò áíÜðôõîçò ôùí åêôñïðþí. Ãéá ó÷åôéêÜ ìç êõôôáñïôïîéêÝò ïõóßåò, ç ìÝãéóôç óõ ãêÝíôñùóç äïêéìÞò èá ðñÝðåé íá åßíáé 5 µl/ml, 5 mg/ml Þ 0.01 M, üðïéá áðü ôéò ôñåéò åßíáé ÷áìçëüôåñç. Ãéá ó÷åôéêÜ áäéÜëõôåò ïõóßåò ðïõ äåí åßíáé ôïîéêÝò óå óõãêåíôñþóåéò ÷áìçëüôåñåò áðü ôç óõãêÝíôñùóç ìÝãé óôçò äéáëõôüôçôáò, ç ìÝãéóôç ÷ñçóéìïðïéïýìåíç äüóç èá ðñÝðåé íá áíôéóôïé÷åß óå óõãêÝíôñùóç ìåãáëýôåñç áðü ôï üñéï äéáëõôüôçôáò óôï ôåëéêü ìÝóï êáëëéÝñãåéáò óôï ôÝëïò ôçò ðåñéüäïõ êáôåñãáóßáò. Óå ïñéóìÝíåò ðåñé ðôþóåéò (ð.÷. üôáí öáéíüìåíá ôïîéêüôçôáò åìöáíßæïíôáé ìüíï óå õøçëüôåñåò áðü ôç ÷áìçëüôåñç óõãêÝíôñùóç ìÝãéóôçò äéáëõôüôçôáò) óõíéóôÜôáé íá äéåîÜãåôáé äïêéìÞ óå ðåñéóóüôåñåò áðü ìßá óõãêåíôñþóåéò ìå ïñáôÞ ðôþ óç éæÞìáôïò. Ìðïñåß íá åßíáé ÷ñÞóéìï íá åêôéìçèåß ç äéá ëõôüôçôá óôçí áñ÷Þ êáé ôï ðÝñáò ôçò êáôåñãáóßáò êáèþò ç äéáëõôüôçôá ìðïñåß íá áëëÜæåé êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò Ýê èåóçò óôï óýóôçìá äïêéìÞò ëüãù ôçò ðáñïõóßáò êõôôÜ ñùí, S9, ïñïý, êëð. Ç ìÝãéóôç äéáëõôüôçôá ìðïñåß íá áíé ÷íåõèåß ìå ãõìíü ïöèáëìü. Ôï ßæçìá äåí ðñÝðåé íá ðá ñåìâáßíåé óôçí åêôßìçóç áõôÞ. 1.4.2.3 Áñíçôéêïß êáé èåôéêïß ìÜñôõñåò Óå êÜèå ðåßñáìá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ðáñÜë ëçëá èåôéêïß êáé áñíçôéêïß (äéáëýôçò Þ öïñÝáò) ìÜñôõ ñåò, ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç. ¼ôáí ÷ñçóé ìïðïéåßôáé ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç, ùò èåôéêüò ìÜñôõ ñáò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ïõóßá ðïõ áðáéôåß åíåñãïðïßçóç ãéá ôçí ðáñï÷Þ ìåôáëëáîïãüíïõ áðüêñé óçò. ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1853 Ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ãíùóôÜ êëáóôïãüíá óå åðßðåäá Ýêèåóçò ðïõ áíáìÝíåôáé íá äþóïõí áíáðáñáãþãéìç êáé áíé÷íåýóéìç áýîçóç ðÜíù áðü ôï âáóéêü üñéï ðïõ áðïäåéêíýåé ôçí åõáéóèçóßá ôïõ óõóôÞìáôïò äïêéìÞò. Ïé óõãêåíôñþóåéò ôùí èåôéêþí ìáñôýñùí èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé Ýôóé þóôå ôá áðïôåëÝóìáôá íá åßíáé óáöÞ áë ëÜ íá ìçí áðïêáëýðôïõí áìÝóùò ôçí ôáõôüôçôá ôùí êù äéêïðïéçìÝíùí áíôéêåéìåíïöüñùí óôïí ðáñáôçñçôÞ. Ðá ñáäåßãìáôá ïõóéþí - èåôéêþí ìáñôýñùí åßíáé: Ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò êáôÜëëçëåò ïõóßåò. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç äõíáôüôçôá ÷ñÞóçò ùò èåôéêþí ìáñôý ñùí ïõóéþí ó÷åôéêÞò ÷çìéêÞò ôÜîçò Óå êÜèå óõëëïãÞ, èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñ íçôéêïß ìÜñôõñåò, áðïôåëïýìåíïé áðü ìüíï ôïí äéáëýôç Þ öïñÝá óôï ìÝóï êáôåñãáóßáò êáé êáôåñãáóìÝíïé ìå ôïí ßäéï ôñüðï ìå åêåßíï ôùí êáëëéåñãåéþí ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, ÅðéðëÝïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé ìç õðïóôÜíôåò êáôåñãáóßá ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí ðñüôåñá óôïé÷åßá ðïõ êáôáäåéêíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéá ëýôçò äåí åðéöÝñåé åðéâëáâÞ Þ ìåôáëëáîéãüíá áðïôåëÝ óìáôá. 1.4.3 Äéáäéêáóßá 1.4.3.1 Êáôåñãáóßá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ÐïëëáðëáóéáóìÝíá êýôôáñá õðïâÜëëïíôáé óå êáôåñ ãáóßá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ðáñïõóßá êáé áðïõóßá óõ óôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ç êáôåñãáóßá ôùí ëåìöïêõôôÜñùí ðñÝðåé íá áñ÷ßæåé 48 þñåò ðåñßðïõ ìåôÜ ôç ìéôùãüíï äéÝãåñóç. 1.4.3.2 Ãéá êÜèå óõãêÝíôñùóç èá ðñÝðåé êáíïíéêÜ íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáëëéÝñãåéåò åéò äéðëïýí, åíþ ôï ßäéï óõíéóôÜôáé Ýíèåñìá êáé ãéá ôéò áñíçôéêÝò/ìå äéáëýôç êáë ëéÝñãåéåò. ¼ôáí áðü ðñüôåñá õöéóôÜìåíá óôïé÷åßá ìðï ñåß íá áðïäåé÷èåß üôé ç äéáöïñïðïßçóç ìåôáîý ôùí äé ðëþí êáëëéåñãåéþí åßíáé åëÜ÷éóôç (13)(14), ìðïñåß íá ãß íåé äåêôÞ ç ÷ñÞóç ìéáò ìüíçò êáëëéÝñãåéáò ãéá êÜèå óõãêÝíôñùóç. Ïé áÝñéåò Þ ðôçôéêÝò ïõóßåò ðñÝðåé íá õðïâÜëëïíôáé óå äïêéìÞ ìå êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò üðùò ð.÷. óå óöñáãé óìÝíá äï÷åßá êáëëéåñãåéþí (15)(16). 1.4.3.3 ×ñüíïò óõëëïãÞò êáëëéÝñãåéáò Óôï ðñþôï ðåßñáìá, ôá êýôôáñá èá ðñÝðåé íá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãï ðïßçóç, ãéá 3-6 þñåò êáé íá ëáìâÜíåôáé äåßãìá Ýðåéôá áðü ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ðïõ áíôéóôïé÷åß ìå ôï 1,5 ðåñßðïõ ôçò êáíïíéêÞò äéÜñêåéáò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ìåôÜ ôçí Ýíáñîç ôçò êáôåñãáóßáò (12). ÅÜí ôï ðñùôüêïëëï áõôü äßíåé áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, ôüóï ìå üóï êáé ÷ùñßò åíåñãïðïßçóç, èá ðñÝðåé íá äéåîÜãåôáé ìßá ðñüóèåôç äï êéìÞ ÷ùñßò åíåñãïðïßçóç, ìå óõíå÷Þ êáôåñãáóßá ìÝ÷ñé ôç äåéãìáôïëçøßá óå ÷ñüíï ðïõ éóïäõíáìåß ìå ôï 1,5 ðåñß ðïõ ôçò êáíïíéêÞò äéÜñêåéáò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ. Ïñé óìÝíåò ïõóßåò ìðïñåß íá áíé÷íåýïíôáé åõêïëüôåñá üôáí ï ÷ñüíïò êáôåñãáóßáò/äåéãìáôïëçøßáò åßíáé ìåãáëýôåñïò áðü ôï 1,5 ôçò äéÜñêåéáò ôïõ êýêëïõ. Ôá áñíçôéêÜ áðïôå ëÝóìáôá ìå ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç ðñÝðåé íá åðéâå âáéþíïíôáé ðåñßðôùóç ðñïò ðåñßðôùóç. Óôéò ðåñéðôþ óåéò üðïõ äåí êñßíåôáé áíáãêáßá ç åðéâåâáßùóç ôùí áñ íçôéêþí áðïôåëåóìÜôùí, áõôü èá ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. 1.4.3.4 Ðñïåôïéìáóßá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí ÊõôôáñéêÝò êáëëéÝñãåéåò õðïâÜëëïíôáé óå êáôåñãáóßá ìå Colcemid® Þ êïë÷éêßíç ãéá ìßá Ýùò ôñåéò þñåò óõíÞ èùò ðñéí áðü ôç óõëëïãÞ. ÊÜèå êõôôáñéêÞ êáëëéÝñãåéá óõëëÝãåôáé êáé õðïâÜëëåôáé óå ÷ùñéóôÞ åðåîåñãáóßá ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí. Ç ðñïåôïéìáóßá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí ðåñéëáìâÜíåé êáôåñãáóßá ôùí êõô ôÜñùí ìå õðüôïíï äéÜëõìá, óôåñÝùóç êáé ÷ñþóç. 1.4.3.5 ÁíÜëõóç ¼ëåò ïé áíôéêåéìåíïöüñïé, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé åêåßíùí ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí, èá ðñÝðåé íá ðáßñíïõí Ýíá îå÷ùñéóôü êùäéêü ðñéí áðü ôçí åîÝôáóç óôï ìéêñïóêüðéï. ÅðåéäÞ ïé äéáäéêáóßåò óôåñÝùóçò áðïëÞãïõí óõ÷íÜ óôç ñÞîç åíüò ìÝñïõò ôùí ìåôáöáóéêþí êõôôÜñùí ìå áðþëåéá ÷ñùìïóùìÜôùí, ôá êáôáìåôñïýìåíá êýôôáñá èá ðñÝðåé óõíåðþò íá ðåñéÝ÷ïõí áñéèìü êåíôñïìåñéäßùí ßóï ìå ôïí õðïèåôéêü áñéèìü ± 2 ãéá üëá ôá åßäç êõôôÜñùí. Èá ðñÝðåé íá êáôáìåôñïýíôáé ôïõëÜ÷éóôïí 200 êáëþò áíå ðôõãìÝíåò ìåôáöÜóåéò áíÜ óõãêÝíôñùóç êáé ìÜñôõñá, ìïéñáóìÝíåò åî ßóïõ ìåôáîý ôùí åéò äéðëïýí êáëëéåñãåéþí, åöüóïí ãßíåôáé, Ï áñéèìüò áõôüò ìðïñåß íá ìåéùèåß üôáí ðáñáôçñåßôáé õøçëüò áñéèìüò åêôñïðþí. Áí êáé óêïðüò ôçò äïêéìÞò åßíáé íá áíé÷íåõèïýí ÷ñùìï óùìéêÝò äïìéêÝò åêôñïðÝò, åßíáé óçìáíôéêü ôï íá êáôá ãñáöïýí ôõ÷üí öáéíüìåíá ðïëõðëïåéäßáò êáé åíäïáíáäé ðëáóéáóìïý, åöüóïõí ðáñáôçñçèïýí. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Ç ðåéñáìáôéêÞ ìïíÜäá åßíáé ôï êýôôáñï, åðïìÝíùò èá ðñÝðåé íá õðïëïãßæåôáé ôï ðïóïóôü ôùí êõôôÜñùí ìå äï ìéêÞ Þ äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ïé äéÜöïñïé ôý ðïé äïìéêþí ÷ñùìïóùìéêþí ìåôáâïëþí èá ðñÝðåé íá êá ôáãñÜöïíôáé ìå ôïí áñéèìü êáé ôç óõ÷íüôçôÜ ðïõ åìöáíß æïíôáé óôéò ðåéñáìáôéêÝò êáé óôéò êáëëéÝñãåéåò ôïõ ìÜñôõñá. Ôá ÷Üóìáôá êáôáãñÜöïíôáé îå÷ùñéóôÜ êáé ðå ñéëáìâÜíïíôáé óôçí Ýêèåóç, ãåíéêÜ üìùò äåí ðåñéëáìâÜ íïíôáé óôç óõíïëéêÞ óõ÷íüôçôá åêôñïðþí. Èá ðñÝðåé åðßóçò íá êáôáãñÜöïíôáé êáé ïé ðáñÜëëçëåò ìåôñÞóåéò êõôôáñïôïîéêüôçôáò ãéá üëåò ôéò õðïâëçèåß óåò óå êáôåñãáóßá êáèþò êáé ôéò áñíçôéêÝò êáëëéÝñãåéåò ìÜñôõñá óôá êýñéá ðåéñÜìáôá åêôñïðÞò. Èá ðñÝðåé íá äßíïíôáé óôïé÷åßá ãéá êÜèå êáëëéÝñãåéá ÷ùñéóôÜ. ÅðéðëÝïí, üëá ôá óôïé÷åßá èá ðñÝðåé íá óõíïøß æïíôáé ìå ôç ìïñöÞ ðßíáêá. Äåí áðáéôåßôáé åðáëÞèåõóç ôùí óáöþí èåôéêþí áðïêñß óåùí. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá áðïóáöçíßæïíôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò ôñïðïðïéþíôáò êáôÜ ðñïôßìçóç ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Ç áíÜãêç åðéâåâáßùóçò ôùí áñíçôéêþí áðïôåëåóìÜôùí Ý÷åé óõæç ôçèåß óôï óçìåßï 1.4.3.3. Óôá åðáíáëçðôéêÜ ðåéñÜìáôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ôñïðïðïßçóç ôùí ðáñáìÝôñùí ôçò äïêéìÞò þóôå íá êáëýðôïõí üëç ôçí Ýêôáóç ôùí åêôé ìïýìåíùí óõíèçêþí. Óôéò ðáñáìÝôñïõò ðïõ ìðïñïýí íá ôñïðïðïéçèïýí ðåñéëáìâÜíåôáé ôï åýñïò ôùí óõãêå íôñþóåùí êáé ïé óõíèÞêåò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß Ýíá áðïôÝëåóìá ùò èåôéêü õðÜñ÷ïõí äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôçí óõãêÝíôñù óç áýîçóç Þ ç áíáðáñáãþãéìç áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ðñþôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí áðïôåëåóìÜ ôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé óôáôéóôé êÝò ìÝèïäïé (3)(13). Óå ìßá èåôéêÞ áðüêñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäéêüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôéóôéêÞ óçìáíôéêüôçôá. Ôõ÷üí áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí ðïëõðëïåéäþí êõôôÜ ñùí ìðïñåß íá óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ìðïñåß íá áíáóôÝëëåé ôéò ìéôùôéêÝò äéåñãáóßåò êáé íá åðÜãåé áñéè ìçôéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ôõ÷üí áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå åíäïáíáäéðëáóéáóìÝíá ÷ñùìï óþìáôá ìðïñåß íá óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ìðïñåß íá åìðïäßæåé ôçí ðñüïäï ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ (17)(18). Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîïãüíïò óôï óýóôçìá áõôü. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôçí åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôçí in vitro äïêéìÞ ÷ñùìï óùìéêþí åêôñïðþí äåß÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åðÜ ãåé äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óå êáëëéåñãçìÝíá óùìáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åðÜãåé ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óå êáëëéåñãç ìÝíá óùìáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí. 3. ÁÍÁÖÏÑÁ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõèá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, Êýôôáñá: � ôýðï êáé ðçãÞ ôùí êõôôÜñùí, � ÷áñáêôçñéóôéêÜ êáñõïôýðïõ êáé êáôáëëçëüôçôá ôïõ ÷ñçóéìïðïéçèÝíôïò ôýðïõ êõôôÜñùí, � áðïõóßá ìõêïðëÜóìáôïò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñß ðôùóç, � ðëçñïöïñßåò ãéá ôç äéÜñêåéá ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ, � öýëï ôùí äùñçôþí áßìáôïò, ðëÞñåò áßìá Þ äéá÷ùñé óìÝíá ëåìöïêýôôáñá, ÷ñçóéìïðïéçèÝí ìéôùãüíï, � áñéèìü äéåëåýóåùí, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ìåèüäïõò óõíôÞñçóçò ôçò êõôôáñéêÞò êáëëéÝñãåéáò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � õðïèåôéêü áñéèìü ÷ñùìïóùìÜôùí. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � ôáõôüôçôá ôçò ïõóßáò áíáóôïëÞò ôçò ìåôÜöáóçò, óõãêÝíôñùóç áõôÞò êáé äéÜñêåéá Ýêèåóçò ôùí êõôôÜñùí, � áéôéïëïãßá ãéá ôçí åðéëïãÞ ôùí óõãêåíôñþóåùí êáé ôïõ áñéèìïý ôùí êáëëéåñãåéþí óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí, ð.÷. óôïé÷åßùí êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé ðåñéïñéóìþí áðü ðëåõñÜò äéáëõôüôçôáò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáëëéÝñãåéáò êáé óõãêÝíôñùóç CO2, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � óõãêÝíôñùóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � üãêï ôïõ öïñÝá êáé ôçò ðñïóôåèåßóáò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, � èåñìïêñáóßá åðùÜóåùò, � ÷ñüíï åðùÜóåùò, � äéÜñêåéá ôçò êáôåñãáóßáò, � ðõêíüôçôá ôùí êõôôÜñùí óôçí áíáêáëëéÝñãåéá, åöü óïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ôýðï êáé óýóôáóç ôïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé êñéôçñßùí áðïäï÷Þò, � èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò, � ìåèüäïõò ðñïåôïéìáóßáò ôùí áíôéêåéìåíïöüñùí, � êñéôÞñéá êáôáìÝôñçóçò ôùí åêôñïðþí, � áñéèìü ôùí áíáëõèåéóþí ìåôáöÜóåùí, � ìåèüäïõò ãéá ôéò ìåôñÞóåéò ôïîéêüôçôáò, � êñéôÞñéá êáôÜôáîçò ôçò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôé êÞò Þ äéöïñïýìåíçò. 1854 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, ð.÷. âáèìüò óõññïÞò, óôïé÷åßá êõôôáñéêïý êýêëïõ, áñéèìüò êõôôÜñùí, ìéôùôéêüò äåß êôçò, � óçìÜäéá êáèßæçóçò, � óôïé÷åßá ãéá ôï pH êáé ôçí ïóìùìïñéáêüôçôá ôïõ ìÝ óïõ êáôåñãáóßáò, åöüóïí ðñïóäéïñßóôçêáí, � ïñéóìü ôùí åêôñïðþí, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí ÷áóìÜôùí, � áñéèìü êõôôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò êáé ôý ðï ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí îå÷ùñéóôÜ ãéá êÜèå êáôåñ ãáóèåßóá êáëëéÝñãåéá êáé êáëëéÝñãåéá-ìÜñôõñá � áëëáãÝò óôçí ðëïåéäßá, åöüóïí ðáñáôçñÞèçêáí, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, � éóôïñéêÜ óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëýôçò/öï ñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõ ðéêÝò áðïêëßóåéò. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ÓõìðåñÜóìáôá 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. 2. Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chro mosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, 427-432. 3. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Col man, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. En virons. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), 1-175. 4. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, 147-204. 5. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mam malian Cells. Mutation Res., 268, 297-305. 6. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364. 7. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215. 8. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Muta gen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sis ter Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90. 9. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Com bined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, 277-290. 10. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gate house, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177. 11. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. 12. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, 241-261. 13. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. 14. Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aber ration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, 139-149. 15. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vo latile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. 16. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mu tagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801. 17. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chi nese hamster cells during alpha-radiation induced G2 ar rest. Mutation Res., 119, 403-413. 18. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin - induced endoreduplication in Chinese ham ster cells. Cancer Res., 43, 1362-1364. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1855 ÐáñÜñôçìá 2B B.11. ÌÅÔÁËËÁÎÉÃÅÍÅÓÇ - IN VIVO ÄÏÊÉÌÇ ×ÑÙÌÏÓÙÌÉÊÙÍ ÅÊÔÑÏÐÙÍ ÌÕÅËÏÕ ÔÙÍ ÏÓÔÙÍ ÓÅ ÈÇËÁÓÔÉÊÁ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Ç in vivo äïêéìÞ ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí óå èçëáóôéêÜ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôçí áíß÷íåõóç äïìéêþí ÷ñùìïóùìé êþí åêôñïðþí ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ôçí õðü äïêéìÞ ïõ óßá óôá êýôôáñá ôïõ ìõåëïý ôùí ïóôþí æþùí, óõíÞèùò ôñùêôéêþí (1)(2)(3)(4). Ïé äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñï ðÝò ìðïñåß íá åßíáé äýï ôýðùí, ÷ñùìïóùìéêÝò Þ ÷ñùìáôé äéêÝò. Ôõ÷üí áýîçóç óôçí ðïëõðëïåéäßá ìðïñåß íá óçìáß íåé üôé ìßá ÷çìéêÞ ïõóßá Ý÷åé ôç äõíáôüôçôá íá åðÜãåé áñéè ìçôéêÝò åêôñïðÝò. Ôá ðåñéóóüôåñá ÷çìéêÜ ìåôáëëáîéãüíá ðñïêáëïýí åêôñïðÝò ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ, áðáíôþíôáé üìùò êáé åêôñïðÝò ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ. Ïé ÷ñùìïóùìé êÝò ìåôáëëÜîåéò êáé ôá óõíáöÞ óõìâÜíôá áðïôåëïýí áßôéï ðïëëþí ãåíåôéêþí áóèåíåéþí ôïõ áíèñþðïõ êáé õðÜñ÷ïõí ïõóéáóôéêÝò åíäåßîåéò üôé ïé ÷ñùìïóùìéêÝò ìåôáëëÜîåéò êáé ôá óõíáöÞ óõìâÜíôá ðïõ ðñïêáëïýí áëëïéþóåéò óå ïãêïãïíßäéá êáé ïãêïãåíÞ áðïêáôáóôáôéêÜ ãïíßäéá óùìá ôéêþí êõôôÜñùí óõíäÝïíôáé ìå ôçí åìöÜíéóç êáñêßíïõ óå áíèñþðïõò êáé óå ðåéñáìáôéêÜ óõóôÞìáôá. Óôçí ðáñïýóá äïêéìÞ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò ôñù êôéêÜ. Óôç äïêéìÞ áõôÞ, éóôüò-óôü÷ïò åßíáé ï ìõåëüò ôùí ïóôþí åðåéäÞ ðáñïõóéÜæåé Ýíôïíç áããåßùóç êáé ðåñéëáì âÜíåé êýôôáñá ìå ôá÷ý êõôôáñéêü êýêëï ðïõ ìðïñïýí åý êïëá íá áðïìïíùèïýí êáé íá õðïâëçèïýí óå êáôåñãáóßá. Ôá õðüëïéðá åßäç êáé éóôïß-óôü÷ïé äåí åìðßðôïõí óôï èÝ ìá ôçò ðáñïýóáò ìåèüäïõ. Ç ðáñïýóá äïêéìÞ ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí Ý÷åé Üìå óç ó÷Ýóç ìå ôçí åêôßìçóç ôïõ êéíäýíïõ ìåôáëëáîéãÝíå óçò äåäïìÝíïõ üôé åðéôñÝðåé ôçí åîÝôáóç ðáñáãüíôùí in vivo ìåôáâïëéóìïý, öáñìáêïêéíçôéêÞò êáé äéåñãáóéþí åðéäéüñèùóçò DNA áí êáé ïé ðáñÜãïíôåò áõôïß ìðïñåß íá äéáöÝñïõí ìåôáîý åéäþí êáé ìåôáîý éóôþí. Ç in vivo äïêé ìÞ åßíáé åðßóçò ÷ñÞóéìç ãéá ðåñáéôÝñù äéåñåýíçóç ôõ÷üí ìåôáëëáîéãüíïõ äñÜóçò ðïõ åíôïðßæåôáé óå in vitro äïêé ìÞ. ÅÜí õðÜñ÷ïõí åíäåßîåéò üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá, Þ ïé åíåñãïß ìåôáâïëßôåò ôçò, äåí öèÜíåé óôïí éóôü-óôü÷ï, äåí ðñïóöÝñåôáé ç ÷ñÞóç ôçò ðáñïýóáò äïêéìÞò. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ, ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ÅêôñïðÞ ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç ìåìïíùìÝíùí ÷ñùìáôé äþí Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç ìåôáîý ÷ñùìáôéäþí. ÅêôñïðÞ ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç, Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç, êáé ôùí äýï ÷ñùìáôéäþí óôçí ßäéá èÝóç. Åíäïáíáäéðëáóéáóìüò: äéåñãáóßá êáôÜ ôçí ïðïßá Ýðåé ôá áðü ìßá S öÜóç áíôéãñáöÞò DNA, ï ðõñÞíáò äåí õöß óôáôáé ìßôùóç áëëÜ îåêéíÜ ìßá íÝá S öÜóç. Ôï áðïôÝëå óìá åßíáé ÷ñùìïóþìáôá ìå 4, 8, 16, ... ÷ñùìáôßäåò. ×Üóìá: á÷ñùìáôéêÞ âëÜâç ìéêñüôåñç áðü ôï ðëÜôïò ìéáò ÷ñùìáôßäçò êáé ìå åëÜ÷éóôç áðåõèõãñÜììéóç ôçò Þ ôùí ÷ñùìáôéäþí. ÁñéèìçôéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôïõ áñéèìïý ôùí ÷ñù ìïóùìÜôùí áðü ôïí êáíïíéêü ÷áñáêôçñéóôéêü áñéèìü ôùí ÷ñçóéìïðïéïõìÝíùí êõôôÜñùí. Ðïëõðëïåéäßá: ðïëëáðëÜóéï ôïõ áðëïåéäïýò ÷ñùìï óùìéêïý áñéèìïý (n) ðÝñáí ôïõ äéðëïåéäïýò áñéèìïý (äçë. 3n, 4n ê.ï.ê). ÄïìéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôçò äïìÞò ôùí ÷ñùìïóù ìÜôùí ðïõ åíôïðßæåôáé ìå ðáñáôÞñçóç óôï ìéêñïóêüðéï ôïõ óôáäßïõ ôçò ìåôáöÜóåùò ôçò äéáßñåóçò ôùí êõôôÜ ñùí êáé ãßíåôáé áíôéëçðôÞ ìå ôç ìïñöÞ áðáëåßøåùí êáé èñáõóìÜôùí, åíäïáíôáëëáãþí Þ áíôáëëáãþí. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ Ôá æþá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá áðü ìßá êá ôÜëëçëç ïäü åêèÝóåùò êáé èõóéÜæïíôáé óå êáôÜëëçëåò ÷ñïíéêÝò óôéãìÝò ìåôÜ ôçí áãùãÞ. Ðñéí áðü ôç èõóßá, ôá æþá õðïâÜëëïíôáé óå áãùãÞ ìå Ýíá ðáñÜãïíôá áíáóôï ëÞò ìåôáöÜóåùò (ð.÷. êïë÷éêßíç Þ Colcemid®). Óôç óõíÝ ÷åéá, áðü ôá êýôôáñá ôïõ ìõåëïý ôùí ïóôþí, ðáñáóêåõÜ æïíôáé ÷ñùìïóùìéêÜ ðáñáóêåõÜóìáôá ôá ïðïßá ÷ñùìá ôßæïíôáé êáé ôá ìåôáöáóéêÜ êýôôáñá åîåôÜæïíôáé ðñïò åíôïðéóìü ôõ÷üí ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 ÅðéëïãÞ æùúêþí åéäþí ÓõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýíôáé åðßìõåò, ðïíôéêïß êáé êéíÝ æéêïé êñéêçôïß, áí êáé ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß êáé ïðïéï äÞðïôå Üëëï êáôÜëëçëï åßäïò èçëáóôéêïý. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò åñãá óôçñéáêÝò öõëÝò íåáñþí õãéþí åíÞëéêùí æþùí. Óôçí áñ ÷Þ ôçò äïêéìÞò, ïé äéáöïñÝò óôá âÜñç ôùí æþùí èá ðñÝ ðåé íá åßíáé åëÜ÷éóôåò êáé íá ìçí õðåñâáßíïõí ôï ± 20% ôïõ ìÝóïõ âÜñïõò êÜèå öýëïõ. 1.4.1.2 ÓõíèÞêåò óôÝãáóçò êáé äéáôñïöÞò Åöáñìüæïíôáé ïé ãåíéêÝò óõíèÞêåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôç ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ôïõ ÌÝñïõò Â, áí êáé ï óôü÷ïò ãéá ôçí õãñáóßá èá ðñÝðåé íá åßíáé 50-60%. 1.4.1.3 Ðñïåôïéìáóßá ôùí æþùí ÕãéÞ íåáñÜ åíÞëéêá æþá ÷ùñßæïíôáé ôõ÷áßá óå ïìÜäåò ìáñôõñßáò êáé áãùãÞò. Ôá êëïõâéÜ èá ðñÝðåé íá äéáôÜó óïíôáé ìå ôÝôïéï ôñüðï þóôå íá åëá÷éóôïðïéïýíôáé ôõ÷üí ðéèáíÝò åðéäñÜóåéò áðü ôç èÝóç ôùí êëïõâéþí. ÊÜèå æþï ðáßñíåé îå÷ùñéóôÞ ôáõôüôçôá. Ôá æþá åãêëéìáôßæïíôáé óôéò åñãáóôçñéáêÝò óõíèÞêåò ãéá ðÝíôå ôïõëÜ÷éóôïí çìÝñåò. 1.4.1.4 Ðñïåôïéìáóßá ôùí äüóåùí ÓôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé, åöüóïí ÷ñåéÜæå ôáé, ðñéí íá ÷ïñçãçèïýí óôá æþá. Oé õãñÝò õðü äïêéìÞ ïõ óßåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé áðåõèåßáò ùò Ý÷ïõí Þ áñáéùìÝíåò. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìáôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá óôïé÷åßá ôá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôáèåñüôçôá ôçò ïõóßáò åðé ôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïéìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí. 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Ï äéáëýôçò/öïñÝáò äåí èá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé ôïîéêÞ äñÜóç óôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá åðßðåäá äüóåùí áëëÜ ïý ôå êáé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñá óÞ ôïõ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá. . Åöüóïí ï ÷ñçóéìïðïé ïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åßíáé áðü ôïõò ãíùóôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé 1856 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÷åßùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. ÓõíéóôÜ ôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá áí ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß õäáôéêüò äéáëýôçò/öïñÝáò. 1.4.2.2 ÌÜñôõñåò Óå êÜèå äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ðáñÜë ëçëá èåôéêïß êáé áñíçôéêïß (äéáëýôçò Þ öïñÝáò) ìÜñôõñåò ãéá êÜèå öýëï. Ìå åîáßñåóç ôçí áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ôá æþá óôéò ïìÜäåò ìáñôõñßáò èá ðñÝðåé íá áíôé ìåôùðßæïíôáé ìå ôïí ßäéï áêñéâþò ôñüðï ìå åêåßíï ôùí æþ ùí óôéò õðïâáëëüìåíåò óå áãùãÞ ïìÜäåò. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá ðñïêáëïýí äïìéêÝò åêôñïðÝò in vivo óå åðßðåäá Ýêèåóçò ðïõ áíáìÝíåôáé íá äþóïõí áíé÷íåýóéìç áýîçóç ðÜíù áðü ôï âáóéêü üñéï. Ïé äüóåéò ôùí èåôéêþí ìáñôýñùí èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé Ýôóé þóôå ôá áðïôåëÝóìáôá íá åßíáé óáöÞ áëëÜ íá ìçí áðïêáëýðôïõí áìÝóùò ôçí ôáõôüôçôá ôùí êùäéêïðïéç ìÝíùí áíôéêåéìåíïöüñùí óôïí ðáñáôçñçôÞ. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé êáé áðü ïäü äéáöï ñåôéêÞ áðü åêåßíç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò êáé íá äåéãìáôß æïíôáé ìüíï ìßá öïñÜ. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, ìðïñåß íá åîå ôÜæåôáé ç ÷ñÞóç èåôéêþí ìáñôýñùí ðáñüìïéáò ÷çìéêÞò ôÜîçò. Ðáñáäåßãìáôá ïõóéþí-èåôéêþí ìáñôýñùí åßíáé: Óå êÜèå äåéãìáôïëçøßá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò, õðïâëçèÝíôåò óå áãùãÞ ìüíï ìå äéáëýôç Þ öïñÝá áëëÜ ìå ôïí ßäéï êáôÜ ôá Üëëá ôñüðï ìå åêåßíï ôùí ïìÜäùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, åêôüò êé áí áðü ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò ìÜñôõñåò ðñïêý ðôïõí áðïäåêôÝò äéáöïñïðïéÞóåéò êáé óõ÷íüôçôåò êõô ôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. ÅÜí ãéá ôïõò áñíçôé êïýò ìÜñôõñåò ãßíåôáé ìßá ìüíï äåéãìáôïëçøßá, ï êáôáë ëçëüôåñïò ÷ñüíïò åßíáé ï ÷ñüíïò ôçò ðñþôçò äåéãìáôïëçøßáò. ÅðéðëÝïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé êáé ìç õðïâëçèÝíôåò óå áãùãÞ ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí éóôïñéêÜ Þ äçìïóéåõìÝíá óôïé÷åßá ðïõ áðïäåé êíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åðéöÝñåé åðé âëáâÞ Þ ìåôáëëáîïãüíá áðïôåëÝóìáôá. 1.5 ÄÉÁÄÉÊÁÓÉÁ 1.5.1 Áñéèìüò êáé öýëï ôùí æþùí ÊÜèå õðïâáëëüìåíç óå áãùãÞ ïìÜäá êáé ïìÜäá-ìÜñ ôõñáò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé 5 ôïõëÜ÷éóôïí ðñïò åîÝ ôáóç æþá áíÜ öýëï. ÅÜí êáôÜ ôï ÷ñüíï ôçò äïêéìÞò õðÜñ ÷ïõí äéáèÝóéìá äåäïìÝíá áðü ìåëÝôåò óôï ßäéï åßäïò æþ ïõ ìå ôç ßäéá ïäü Ýêèåóçò ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé äåí õðÜñ÷ïõí ïõóéáóôéêÝò äéáöïñÝò óôçí ôïîéêüôçôá ìåôáîý öýëùí, áñêåß ôüôå ç äéåîáãùãÞ äïêéìÞò óå Ýíá ìüíï öý ëï. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ ç Ýêèåóç ôùí áíèñþðùí óôéò ÷çìéêÝò ïõóßåò åîáñôÜôáé áðü ôï öýëï, üðùò ð.÷. ìðïñåß íá óõìâåß óôçí ðåñßðôùóç ïñéóìÝíùí öáñìáêåõôéêþí ðáñáãüíôùí, ç äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá åêôåëåßôáé ìå æþá ôïõ áíôßóôïé÷ïõ öýëïõ. 1.5.2 ×ñïíïäéÜãñáììá áãùãÞò Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ÷ïñçãïýíôáé êáôÜ ðñïôßìçóç ìå åöÜðáî áãùãÞ. Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ìðïñïýí åðßóçò íá ÷ïñçãçèïýí êáé äéáêåêïììÝíá, äçë. äýï áãùãÝò ôçí ßäéá çìÝñá ðïõ íá ìçí áðÝ÷ïõí ÷ñïíéêÜ ðåñéóóüôåñï áðü ìå ñéêÝò þñåò, ãéá íá äéåõêïëõíèåß ç ÷ïñÞãçóç ìåãÜëçò ðï óüôçôáò ïõóßáò. 'Áëëïé ôõ÷üí ÷ñçóéìïðïéïýìåíïé ôñüðïé áãùãÞò èá ðñÝðåé íá áéôéïëïãïýíôáé åðéóôçìïíéêþò. Ôá äåßãìáôá èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé óå äýï äéáöï ñåôéêÝò ÷ñïíéêÝò óôéãìÝò ìåôÜ ôçí áãùãÞ ôçò ìßáò çìÝ ñáò. Ãéá ôá ôñùêôéêÜ, ç ðñþôç äåéãìáôïëçøßá ãßíåôáé óå ÷ñüíï ðïõ áíôéóôïé÷åß óôï 1,5 ôçò êáíïíéêÞò äéÜñêåéáò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ (ï ôåëåõôáßïò åßíáé êáíïíéêÜ 12-18 þñåò) ìåôÜ ôçí áãùãÞ. ÅðåéäÞ ï áðáéôïýìåíïò ÷ñüíïò ãéá ôçí ðñüóëçøç êáé ôï ìåôáâïëéóìü ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò êáèþò åðßóçò êáé ç åðßäñáóÞ ôçò óôçí êéíçôéêÞ ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ìðïñåß íá åðçñåÜóåé ôïí Üñéóôï åí äåéêíõüìåíï ÷ñüíï ãéá ôçí áíß÷íåõóç ÷ñùìïóùìéêÞò åêôñïðÞò, óõíéóôÜôáé íá ãßíåôáé ìßá äåýôåñç äåéãìáôïëç øßá 24 þñåò ìåôÜ ôçí ðñþôç. Åöüóïí ç ÷ïñÞãçóç ôçò ïõ óßáò ãßíåôáé óå ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ðïõ õðåñâáßíåé ôçí ìßá çìÝñá, ç äåéãìáôïëçøßá èá ðñÝðåé íá ãßíåôáé Ýðåéôá áðü ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ðïõ íá áíôéóôïé÷åß óôï 1,5 ôçò êáíïíé êÞò äéÜñêåéáò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ìåôñïýìåíï áðü ôçí ôåëéêÞ áãùãÞ. Ðñéí áðü ôç èõóßá, óôá æþá åã÷ýåôáé åíäïðåñéôïíáúêþò êáôÜëëçëç äüóç ðáñÜãïíôá áíáóôïëÞò ìåôÜöáóçò (ð.÷. Colcemid® Þ êïë÷éêßíç). Óå êáôÜëëçëç ìåôáãåíÝóôåñç ÷ñïíéêÞ óôéãìÞ ðñáãìáôïðïéåßôáé óôá æþá äåéãìáôïëç øßá. Ãéá ôïõò ðïíôéêïýò, ç êáôáëëçëüôåñç óôéãìÞ åßíáé ðå ñßðïõ 3-5 þñåò, åíþ ãéá ôïõò êéíÝæéêïõò êñéêçôïýò ôï äéÜ óôçìá áõôü áíôéóôïé÷åß ðåñßðïõ óå 4-5 þñåò. ÓõëëÝãï íôáé êýôôáñá áðü ôï ìõåëü ôùí ïóôþí êáé åîåôÜæïíôáé áðü ðëåõñÜò ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí. 1.5.3 Åðßðåäá äüóåùí ÅÜí åêôåëåóôåß äïêéìÞ áíåýñåóçò åýñïõò åðåéäÞ äåí õðÜñ÷ïõí êáôÜëëçëá äéáèÝóéìá äåäïìÝíá, áõôÞ èá ðñÝ ðåé íá åêôåëåßôáé óôï ßäéï åñãáóôÞñéï, ìå ôï ßäéï åßäïò, öõ ëÞ, öýëï êáé ôñüðï áãùãÞò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óôçí êý ñéá äïêéìÞ (5). Åöüóïí õðÜñ÷åé ôïîéêüôçôá, ãéá ôçí ðñþ ôç äåéãìáôïëçøßá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôñßá åðßðåäá äüóåùí. Ôá åðßðåäá áõôÜ äüóåùí èá ðñÝðåé íá êáëý ðôïõí ìßá ðåñéï÷Þ áðü ôç ìÝãéóôç ìÝ÷ñé ôç ÷áìçëÞ Þ ìç äåíéêÞ ôïîéêüôçôá. Ãéá ôç ìåôáãåíÝóôåñç äåéãìáôïëçøßá, ÷ñåéÜæåôáé íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ìüíï ç ìÝãéóôç äüóç. Ç ìÝ ãéóôç äüóç ïñßæåôáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé óçìåßá ôïîé êüôçôáò ôÝôïéá þóôå ôõ÷üí õøçëüôåñá åðßðåäá äüóçò, ìå âÜóç ôïí ßäéï ôñüðï ÷ïñÞãçóçò, íá áíáìÝíåôáé öõóéïëï ãéêÜ íá ïäçãÞóïõí óå öáéíüìåíá èíçóéìüôçôáò. Ïõóßåò ìå åéäéêÝò âéïëïãéêÝò äñÜóåéò óå ÷áìçëÝò ìç ôïîéêÝò äü óåéò (üðùò ïñìüíåò êáé ìéôùãüíá) ìðïñåß íá áðïôåëïýí åîáéñÝóåéò óôá êñéôÞñéá ñýèìéóçò ôùí äüóåùí êáé èá ðñÝðåé íá áîéïëïãïýíôáé êáôÜ ðåñßðôùóç. Ç ìÝãéóôç äü óç ìðïñåß åðßóçò íá ïñéóôåß êáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé ïñéóìÝíåò åíäåßîåéò ôïîéêüôçôáò óôï ìõåëü ôùí ïóôþí (ð.÷. ìåãáëýôåñç áðü 50% ìåßùóç óôï ìéôùôéêü äåßêôç). 1.5.4 ÄïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò ÅÜí ìßá äïêéìÞ ìå Ýíá åðßðåäï äüóçò ôïõëÜ÷éóôïí 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò óôçí ïðïßá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìßá ìüíç áãùãÞ, Þ äýï áãùãÝò ôçí ßäéá ìÝñá, äåí äþóåé ïñá ôÜ ôïîéêÜ áðïôåëÝóìáôá, êáé åöüóïí äåí áíáìÝíåôáé ç åì öÜíéóç ãïíïôïîéêüôçôáò ìå âÜóç óôïé÷åßá áðü ïõóßåò ó÷åôéêÞò äïìÞò, ôüôå ìðïñåß íá êñéèåß ùò ìç áíáãêáßá ç åêôÝëåóç ðëÞñïõò ìåëÝôçò ìå ôñßá åðßðåäá äüóçò. Óå äïêéìÝò ìåãáëýôåñçò äéÜñêåéáò, ç ïñéáêÞ äüóç åßíáé ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1857 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá ãéá áãùãÞ ìÝ÷ñé 14 çìÝñåò êáé 1000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá ãéá áãù ãÞ ìåãáëýôåñç áðü 14 çìÝñåò. Ç áíáìåíüìåíç áíèñþðé íç Ýêèåóç ìðïñåß íá áðïôåëÝóåé Ýíäåéîç üôé ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéçèåß õøçëüôåñï åðßðåäï äüóçò óôç äïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò. 1.5.5 ×ïñÞãçóç ôùí äüóåùí Ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ÷ïñçãåßôáé óõíÞèùò ìå äéáóùëÞ íùóç ÷ñçóéìïðïéþíôáò óôïìá÷éêü óùëÞíá Þ êáôÜëëçëï óùëÞíá äéáóùëÞíùóçò Þ ìå åíäïðåñéôïíáúêÞ Ýã÷õóç. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ïäïß Ýêèåóçò åöüóïí ìðïñïýí íá áéôéïëïãçèïýí. Ï ìÝãéóôïò üãêïò õãñïý ðïõ ìðïñåß íá ÷ïñçãçèåß ìå äéáóùëÞíùóç Þ Ýã÷õ óç åöÜðáî åîáñôÜôáé áðü ôï ìÝãåèïò ôïõ ðåéñáìáôüæù ïõ. Ï üãêïò äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôá 2 ml/100g âÜ ñïõò óþìáôïò. Áí ÷ñçóéìïðïéçèïýí ìåãáëýôåñïé üãêïé, áõôü ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. Ìå åîáßñåóç ôéò åñåèéóôéêÝò Þ äéáâñùôéêÝò ïõóßåò ïé ïðïßåò êáíïíéêÜ åìöáíßæïõí åíôïíüôåñá áðïôåëÝóìáôá óå õøçëüôåñåò óõãêåíôñþ óåéò, ïé äéáöïñïðïéÞóåéò óôïí üãêï èá ðñÝðåé íá åëá÷é óôïðïéïýíôáé ðñïóáñìüæïíôáò ôç óõãêÝíôñùóç þóôå íá äéáóöáëßæåôáé óôáèåñüò üãêïò óå üëá ôá åðßðåäá äüóå ùí. 1.5.6 Ðñïåôïéìáóßá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí ÁìÝóùò ìåôÜ ôç èõóßá ëáìâÜíåôáé ìõåëüò ôùí ïóôþí, åêôßèåôáé óå õðüôïíï äéÜëõìá êáé óôåñåþíåôáé. Ôá êýôôá ñá êáôüðéí áðëþíïíôáé óå áíôéêåéìåíïöüñïõò ðëÜêåò êáé ÷ñùìáôßæïíôáé. 1.5.7 AíÜëõóç Èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ï ìéôùôéêüò äåßêôçò ùò ìÝôñï ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò óå 1000 ôïõëÜ÷éóôïí êýô ôáñá áíÜ æþï ãéá üëá ôá õðïâëçèÝíôá óå áãùãÞ æþá (óõ ìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé ôùí èåôéêþí ìáñôýñùí) êáé ôá ìç õðïâëçèÝíôá óå áãùãÞ æþá-áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò. Ãéá êÜèå æþï èá ðñÝðåé íá åîåôÜæïíôáé ôïõëÜ÷éóôïí 100 êýôôáñá. Ï áñéèìüò áõôüò ìðïñåß íá ìåéùèåß üôáí ðáñá ôçñåßôáé õøçëüò áñéèìüò åêôñïðþí. 'Ïëåò ïé áíôéêåéìå íïöüñïé, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé åêåßíùí ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí, èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïõí Ýíáí áíåîÜñôçôï êùäéêü ðñßí áðü ôçí åîÝôáóç óôï ìéêñïóêü ðéï. ÅðåéäÞ ïé äéáäéêáóßåò ðñïåôïéìáóßáò ôùí áíôéêåéìå íïöüñùí áðïëÞãïõí óõ÷íÜ óôç ñÞîç åíüò ðïóïóôïý ìå ôáöÜóåùí ìå áðþëåéá ÷ñùìïóùìÜôùí, ôá êáôáìåôñïý ìåíá êýôôáñá èá ðñÝðåé óõíåðþò íá ðåñéÝ÷ïõí Ýíáí áñéèìü êåíôñïìåñéäßùí ßóï ìå ôïí áñéèìü 2n ± 2. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Èá ðñÝðåé íá ðáñïõóéÜæïíôáé ìå ìïñöÞ ðßíáêá åðéìÝ ñïõò óôïé÷åßá ãéá ôá æþá. Ç ðåéñáìáôéêÞ ìïíÜäá åßíáé ôï æþï. Ãéá êÜèå æþï èá ðñÝðåé íá åêôéìÜôáé ï áñéèìüò ôùí êáôáìåôñçèÝíôùí êõôôÜñùí, ï áñéèìüò ôùí åêôñïðþí áíÜ êýôôáñï êáé ôï ðïóïóôü ôùí êõôôÜñùí ìå äïìéêÞ Þ äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ïé äéÜöïñïé ôýðïé äï ìéêþí ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí èá ðñÝðåé íá êáôáãñÜ öïíôáé ìå ôïí áñéèìü êáé ôç óõ÷íüôçôÜ ôïõò óôéò õðïâëç èåßóåò óå áãùãÞ ïìÜäåò êáé ôéò ïìÜäåò-ìÜñôõñåò. Ôá ÷Ü óìáôá êáôáãñÜöïíôáé îå÷ùñéóôÜ êáé ðåñéëáìâÜíïíôáé óôçí Ýêèåóç, ãåíéêÜ üìùò äåí ðåñéëáìâÜíïíôáé óôç óõ íïëéêÞ óõ÷íüôçôá åêôñïðþí. Åöüóïí äåí õðÜñ÷ïõí åí äåßîåéò äéáöïñÜò áðïêñßóåùò áíÜëïãá ìå ôï öýëï, ôá äå äïìÝíá áðü ôá äýï öýëá ìðïñïýí íá óõíäõÜæïíôáé ãéá óôáôéóôéêÞ áíÜëõóç. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß Ýíá áðïôÝëåóìá ùò èåôéêü õðÜñ÷ïõí äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôç äüóç áýîç óç óôï ó÷åôéêü áñéèìü êõôôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò Þ ç óáöÞò áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå åêôñïðÝò óå ïìÜäá ìßáò ìüíçò äüóçò óå ìßá ìüíç äåéã ìáôïëçøßá. Ðñþôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí áðïôåëåóìÜôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéï ëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèïäïé (6). Óå ìßá èå ôéêÞ áðüêñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäéêüò áðïöáóéóôé êüò ðáñÜãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôéóôéêÞ óçìáíôéêü ôçôá. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá äéáóáöçíßæïíôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò, ôñïðïðïéþíôáò, êáôÜ ðñïôßìçóç, ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Ôõ÷üí áýîçóç óôçí ðïëõðëïåéäßá ìðïñåß íá óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ìðïñåß íá åðÜãåé áñéèìçôéêÝò ÷ñù ìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ôõ÷üí áýîçóç óôïí åíäïáíáäéðëá óéáóìü ìðïñåß íá óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ìðïñåß íá ðáñåìðïäßæåé ôçí ðñüïäï ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ (7) (8). Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîéãüíïò óôç äïêéìÞ áõôÞ. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôçí in vivo äïêéìÞ ÷ñùìï óùìéêþí åêôñïðþí äåß÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åðÜ ãåé ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óôï ìõåëü ôùí ïóôþí ôùí åîåôáóèÝíôùí åéäþí. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åðÜãåé ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óôï ìõåëü ôùí ïóôþí ôùí åîåôáóèÝíôùí åéäþí. Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ðéèáíüôçôá ðñüóâáóçò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò Þ ôùí ìåôáâïëéôþí ôçò óôç ãåíéêÞ êõ êëïöïñßá Þ åéäéêüôåñá óôïí éóôü óôü÷ï (ð.÷. óõóôåìéêÞ ôïîéêüôçôá). 3. ÁÍÁÖÏÑÁ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõ èá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝò, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, ÅîåôáóèÝíôá æþá: � ÷ñçóéìïðïéçèÝí åßäïò/öõëÞ, � áñéèìü, çëéêßá êáé öýëï ôùí æþùí, � ðçãÞ, óõíèÞêåò óôÝãáóçò, äßáéôá, êëð, � âÜñïò ôùí ìåìïíùìÝíùí æþùí óôçí Ýíáñîç ôçò äïêé ìÞò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíïõ ôïõ åýñïõò ôùí âáñþí óþ ìáôïò, ôçò ìÝóçò ôéìÞò êáé ôçò ôõðéêÞò áðüêëéóçò ãéá êÜ èå ïìÜäá. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò (öïñÝáò/äéáëýôçò) ìÜñôõ ñåò, � óôïé÷åßá áðü ôç ìåëÝôç ôïõ åýñïõò, åöüóïí Ýãéíå, 1858 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) � áéôéïëïãßá ôçò åðéëïãÞò ôïõ åðéðÝäïõ äüóåùò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôç ÷ïñÞãçóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, � áéôéïëïãßá ôçò ÷ñçóéìïðïéçèåßóáò ïäïý ÷ïñÞãçóçò, � ìåèüäïõò åðáëÞèåõóçò ôïõ üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá Ýöèáóå óôç ãåíéêÞ êõêëïöïñßá Þ óôïí éóôü óôü÷ï, åöü óïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ìåôáôñïðÞ ôçò óõãêÝíôñùóçò (ppm) ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôç äßáéôá/ðüóéìï íåñü óôçí ðñáãìáôéêÞ äüóç (mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá), åöüóïí ÷ñåéÜæåôáé, � óôïé÷åßá ãéá ôçí ðïéüôçôá ôçò ôñïöÞò êáé ôïõ íåñïý, � ëåðôïìåñÞ ðåñéãñáöÞ ôùí ó÷çìÜôùí áãùãÞò êáé äåéãìáôïëçøßáò, � ìåèüäïõò ãéá ôéò ìåôñÞóåéò ôçò ôïîéêüôçôáò, � ôáõôüôçôá ôçò ïõóßáò áíáóôïëÞò ôçò ìåôÜöáóçò, óõãêÝíôñùóç áõôÞò êáé äéÜñêåéá ôçò áãùãÞò, � ìåèüäïõò ðñïåôïéìáóßáò áíôéêåéìåíïöüñùí, � êñéôÞñéá êáôáìÝôñçóçò ôùí åêôñïðþí, � áñéèìü åîåôáóèÝíôùí êõôôÜñùí áíÜ æþï, � êñéôÞñéá êáôÜôáîçò ôçò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôé êÞò Þ äéöïñïýìåíçò. ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � ìéôùôéêü äåßêôç, � ôýðï êáé áñéèìü åêôñïðþí îå÷ùñéóôÜ ãéá êÜèå æþï, � ïëéêü áñéèìü åêôñïðþí áíÜ ïìÜäá ìå ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò, � áñéèìü êõôôÜñùí ìå åêôñïðÝò áíÜ ïìÜäá ìå ìÝóåò ôé ìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò, � áëëáãÝò óôçí ðëïåéäßá, åöüóïí ðáñáôçñÞèçêáí, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � ôá ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) ìÜñôõñåò, � éóôïñéêÜ óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëýôçò/öï ñÝáò) ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðï êëßóåéò, � ôá ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò èåôéêïýò ìÜñôõñåò. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. REFERENCES 1. Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306. 2. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aber rations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, 157-165. 3. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenet ic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Com mittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 4. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Work ing Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chro mosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, 305-312. 5. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Re port of British Toxicology Society/UK Environmental Muta gen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Muta genicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319. 6. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guide lines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. pp. 184-232. 7. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chi nese hamster cells during alpha-radiation induced G2 ar rest. Mutation Res. 119, 403-413. 8. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin - induced endoreduplication in Chinese ham ster cells. Cancer Res., 43, 1362-1364. ÐáñÜñôçìá 2à B. 12. METAËËÁÎÉÃÅÍÅÓÇ - IN VIVO ÄÏÊÉÌÇ ÌÉÊÑÏÐÕÑÇÍÙÍ ÅÑÕÈÑÏÊÕÔÔÁÑÙÍ ÈÇËÁÓÔÉÊÙÍ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Ç in vivo äïêéìÞ ìéêñïðõñÞíùí óå èçëáóôéêÜ ÷ñçóéìï ðïéåßôáé ãéá ôçí áíß÷íåõóç âëÜâçò ðñïêáëïýìåíçò áðü ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá óôá ÷ñùìïóþìáôá Þ ôç ìéôùôéêÞ óõ óêåõÞ åñõèñïâëáóôþí ìå åîÝôáóç åñõèñïêõôôÜñùí ëáìâáíïìÝíùí áðü ôï ìõåëü ôùí ïóôþí êáé/Þ ðåñéöåñéêÜ áéìïêýôôáñá æþùí, óõíÞèùò ôñùêôéêþí. Óêïðüò ôçò äïêéìÞò ìéêñïðõñÞíùí åßíáé ç áíáãíþñéóç ïõóéþí ðïõ ðñïêáëïýí êõôôáñïãåíåôéêÞ âëÜâç ðïõ áðï ëÞãåé óôï ó÷çìáôéóìü ìéêñïðõñÞíùí ðïõ ðåñéÝ÷ïõí ëáí èÜíïíôá ÷ñùìïóùìéêÜ èñáýóìáôá Þ ïëüêëçñá ÷ñùìï óþìáôá. ¼ôáí Ýíáò åñõèñïâëÜóôçò ìõåëïý ôùí ïóôþí áíáðôõ ÷èåß óå ðïëõ÷ñùìéêü åñõèñïêýôôáñï, ï êýñéïò ðõñÞíáò åêâÜëëåôáé êáé ïé ìéêñïðõñÞíåò ðïõ Ý÷ïõí ó÷çìáôéóôåß ìðïñåß íá ðáñáìåßíïõí ðßóù óôï Üëëùò áðýñçíï êõôôá ñüðëáóìá. Ç ðáñáôÞñçóç ôùí ìéêñïðõñÞíùí äéåõêïëý íåôáé óôá êýôôáñá áõôÜ åðåéäÞ äåí Ý÷ïõí êýñéï ðõñÞíá. Ôõ÷üí áýîçóç óôç óõ÷íüôçôá ôùí ðåñéå÷üíôùí ìéêñïðõ ñÞíåò ðïëõ÷ñùìéêþí åñõèñïêõôôÜñùí óôá æþá ðïõ Ý÷ïõí õðïâëçèåß óå áãùãÞ áðïôåëåß Ýíäåéîç ðñïêëçèåß óáò ÷ñùìïóùìéêÞò âëÜâçò. Óôç äïêéìÞ áõôÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞèùò ìõåëüò ôùí ïóôþí ôñùêôéêþí åðåéäÞ óôïí éóôü áõôü ðáñÜãïíôáé ðï ëõ÷ñùìéêÜ åñõèñïêýôôáñá. Åî ßóïõ áðïäåêôÞ åßíáé êáé ç ìÝôñçóç öåñüíôùí ìéêñïðõñÞíåò Üùñùí (ðïëõ÷ñùìé êþí) åñõèñïêõôôÜñùí óôï ðåñéöåñéêü áßìá óå ïðïéïäÞ ðïôå åßäïò óôï ïðïßï Ý÷åé êáôáäåé÷èåß üôé ï óðëÞíáò äåí ìðïñåß íá áðïìáêñýíåé åñõèñïêýôôáñá ðïõ öÝñïõí ìé êñïðõñÞíåò Þ ôï ïðïßï åìöáíßæåé éêáíÞ åõáéóèçóßá óôçí áíß÷íåõóç ðáñáãüíôùí ðïõ ðñïêáëïýí äïìéêÝò Þ áñéè ìçôéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ïé ìéêñïðõñÞíåò ìðï ñïýí íá äéáêñéèïýí ìå âÜóç ïñéóìÝíá êñéôÞñéá. Óôá êñé ôÞñéá áõôÜ ðåñéëáìâÜíåôáé ï åíôïðéóìüò ôçò ðáñïõóßáò Þ áðïõóßáò DNA êéíçôï÷þñïõ Þ êåíôñïìåñéäßïõ óôïõò ìé ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1859 êñïðõñÞíåò. Âáóéêü ôåëéêü óçìåßï åßíáé ç åýñåóç ôçò óõ ÷íüôçôáò ôùí öåñüíôùí ìéêñïðõñÞíåò Üùñùí (ðïëõ ÷ñùìéêþí) åñõèñïêõôôÜñùí. Ùò âáóéêü ôåëéêü óçìåßï ôçò äïêéìÞò ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß êáé ç åýñåóç ôïõ áñéèìïý ôùí þñéìùí (ïñèï÷ñùìéêþí) åñõèñïêõôôÜñùí óôï ðåñéöåñéêü áßìá ðïõ ðåñéÝ÷ïõí ìéêñïðõñÞíåò ìåôá îý åíüò äåäïìÝíïõ áñéèìïý þñéìùí åñõèñïêõôôÜñùí üôáí ôá æþá õðïâÜëëïíôáé óå áãùãÞ óõíå÷þò åðß 4 åâäï ìÜäåò Þ êáé ðåñéóóüôåñï. ÁõôÞ ç in vivo äïêéìÞ ìéêñïðõñÞíùí óôá èçëáóôéêÜ Ý÷åé Üìåóç ó÷Ýóç ìå ôçí åêôßìçóç ôïõ êéíäýíïõ ìåôáëëáîéãÝ íåóçò äåäïìÝíïõ üôé åðéôñÝðåé ôçí åîÝôáóç ðáñáãüíôùí ôïõ in vivo ìåôáâïëéóìïý, ôçò öáñìáêïêéíçôéêÞò êáé ôùí äéåñãáóéþí åðéäéüñèùóçò DNA áí êáé áõôïß ìðïñåß íá ðïéêßëëïõí áíÜëïãá ìå ôï åßäïò, áíÜëïãá ìå ôïí éóôü êáé áíÜëïãá ìå ôá ãåíåôéêÜ ôåëéêÜ óçìåßá. Ïé in vivo äïêéìÝò åßíáé åðßóçò ÷ñÞóéìåò ãéá ôçí ðåñáéôÝñù äéåñåýíçóç ôçò ìåôáëëáîéãåíïýò äñÜóçò ðïõ áíé÷íåýåôáé áðü Ýíá in vitro óýóôçìá. ÅÜí õðÜñ÷ïõí åíäåßîåéò üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá, Þ ï åíåñãüò ìåôáâïëßôçò ôçò, äåí èá öèÜóåé óôïí éóôü óôü÷ï, äåí ðñïóöÝñåôáé ç ÷ñÞóç ôçò ðáñïýóáò äïêéìÞò. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ Êåíôñïìåñßäéï (Kéíçôï÷þñïò): Ðåñéï÷Þ Þ ðåñéï÷Ýò åíüò ÷ñùìïóþìáôïò ìå ôéò ïðïßåò ôá éíßäéá ôçò áôñÜêôïõ åíþíïíôáé êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò äéáßñåóçò ôïõ êõôôÜñïõ äßíïíôáò ôç äõíáôüôçôá ìåèïäåõìÝíçò êßíçóçò ôùí èõ ãáôñéêþí ÷ñùìïóùìÜôùí ðñïò ôïõò ðüëïõò ôùí èõãá ôñéêþí êõôôÜñùí. ÌéêñïðõñÞíåò: Ìéêñïß ðõñÞíåò, äéÜêñéôïé êáé åðéðëÝïí ôùí êýñéùí ðõñÞíùí ôùí êõôôÜñùí, ðïõ ðáñÜãïíôáé êá ôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò ôåëüöáóçò ôçò ìßôùóçò (ìåßùóç) áðü ëáíèÜíïíôá ÷ñùìïóùìéêÜ èñáýóìáôá Þ ïëüêëçñá ÷ñù ìïóþìáôá. Ïñèï÷ñùìéêü åñõèñïêýôôáñï: 'Ùñéìï åñõèñïêýôôá ñï ÷ùñßò ñéâïóþìáôá ðïõ äéáêñßíåôáé áðü ôá Üùñá, ðï ëõ÷ñùìéêÜ åñõèñïêýôôáñá ìÝóù åðéëåêôéêþí ãéá ôá ñé âïóþìáôá ÷ñþóåùí. Ðïëõ÷ñùìéêü åñõèñïêýôôáñï: ́Áùñï åñõèñïêýôôáñï, óå åíäéÜìåóï óôÜäéï áíÜðôõîçò, ðïõ ðåñéÝ÷åé áêüìç ñé âïóþìáôá êáé óõíåðþò ìðïñåß íá äéáêñéèåß áðü ôá þñé ìá, ïñèï÷ñùìéêÜ åñõèñïêýôôáñá ìå ÷ñþóåéò åéäéêÝò ãéá ôá ñéâïóþìáôá. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ Ôá æþá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ìÝóù êáôÜë ëçëçò ïäïý ÷ïñÞãçóçò. Åöüóïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìõåëüò ôùí ïóôþí, ôá æþá èõóéÜæïíôáé óå êáôÜëëçëåò ÷ñïíéêÝò óôéãìÝò ìåôÜ ôçí áãùãÞ, åîÜãåôáé ï ìõåëüò ôùí ïóôþí êáé óôç óõíÝ÷åéá ôá ëáìâáíüìåíá ðáñáóêåõÜóìáôá ÷ñùìáôß æïíôáé (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). ¼ôáí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ðåñéöå ñéêü áßìá, ôï áßìá óõëëÝãåôáé óå êáôÜëëçëåò ÷ñïíéêÝò óôéãìÝò ìåôÜ ôçí áãùãÞ êáé ôá ëáìâáíüìåíá ðáñáóêåõÜ óìáôá åðßóôñùóçò ÷ñùìáôßæïíôáé (4)(8)(9)(10). Óôéò äïêé ìÝò ìå ðåñéöåñéêü áßìá èá ðñÝðåé íá ìåóïëáâåß üóï ôï äõ íáôü ëéãüôåñïò ÷ñüíïò ìåôáîý ôçò ôåëåõôáßáò Ýêèåóçò êáé ôçò óõëëïãÞò ôùí êõôôÜñùí. Ôá ðáñáóêåõÜóìáôá åîåôÜ æïíôáé ãéá íá äéáðéóôùèåß ç ðáñïõóßá Þ ìç ìéêñïðõñÞíùí. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 ÅðéëïãÞ æùúêþí åéäþí Åöüóïí ãéá ôç äïêéìÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìõåëüò ôùí ïóôþí, óõíéóôÜôáé ç ÷ñÞóç ðïíôéêþí Þ åðßìõùí áí êáé ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ïðïéïäÞðïôå êáôÜëëçëï åßäïò èçëáóôéêïý. ¼ôáí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ðåñéöåñéêü áßìá, óõ íéóôÜôáé ç ÷ñÞóç ðïíôéêþí. Åíôïýôïéò, ìðïñåß íá ÷ñçóé ìïðïéçèåß ïðïéïäÞðïôå êáôÜëëçëï åßäïò èçëáóôéêïý õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé åßíáé åßäïò óôï ïðïßï ï óðëÞíáò äåí áðïìáêñýíåé ôá öÝñïíôá ìéêñïðõñÞíåò åñõèñïêýôôáñá Þ åßäïò ðïõ åìöáíßæåé éêáíÞ åõáéóèçóßá óôçí áíß÷íåõóç ðáñáãüíôùí ðïõ ðñïêáëïýí äïìéêÝò Þ áñéèìçôéêÝò ÷ñù ìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí óõ íÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò åñãáóôçñéáêÝò öõëÝò íåá ñþí õãéþí æþùí. Óôçí áñ÷Þ ôçò äïêéìÞò, ç äéáöïñïðïßç óç óôá âÜñç ôùí æþùí èá ðñÝðåé íá åßíáé åëÜ÷éóôç êáé íá ìçí õðåñâáßíåé ôï ±20% ôïõ ìÝóïõ âÜñïõò êÜèå öýëïõ. 1.4.1.2 ÓõíèÞêåò óôÝãáóçò êáé äéáôñïöÞò Åöáñìüæïíôáé ïé ãåíéêÝò óõíèÞêåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôç ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ôïõ ÌÝñïõò Â, áí êáé ï óôü÷ïò ãéá ôçí õãñáóßá èá ðñÝðåé íá åßíáé 50-60%. 1.4.1.3 Ðñïåôïéìáóßá ôùí æþùí ÕãéÞ íåáñÜ åíÞëéêá æþá ÷ùñßæïíôáé ôõ÷áßá óå ïìÜäåò ìÜñôõñåò êáé áãùãÞò. Óå êÜèå æþï äßíåôáé ìßá îå÷ùñéóôÞ ôáõôüôçôá. Ôá æþá åãêëéìáôßæïíôáé óôéò åñãáóôçñéáêÝò óõíèÞêåò ãéá ðÝíôå ôïõëÜ÷éóôïí çìÝñåò Ôá êëïõâéÜ èá ðñÝðåé íá äéáôÜóóïíôáé ìå ôÝôïéï ôñüðï þóôå íá åëá÷é óôïðïéïýíôáé ôõ÷üí ðéèáíÝò åðéäñÜóåéò áðü ôç èÝóç ôùí êëïõâéþí. 1.4.1.4 Ðñïåôïéìáóßá ôùí äüóåùí ÓôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé, åöüóïí ÷ñåéÜæå ôáé, ðñéí íá ÷ïñçãçèïýí óôá æþá. Oé õãñÝò õðü äïêéìÞ ïõ óßåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé áðåõèåßáò ùò Ý÷ïõí Þ áñáéùìÝíåò ðñéí áðü ôç ÷ïñÞãçóç. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóé ìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìáôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí óôïé÷åßá ðïõ õðÜñ÷ïõí ó÷åôéêÜ ìå ôç óôáèåñüôçôá ôçò ïõóßáò åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïéìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí. 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Ï äéáëýôçò/öïñÝáò äåí èá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé ôïîéêÞ äñÜóç óôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá åðßðåäá äüóåùí áëëÜ ïý ôå êáé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñá óÞ ôïõ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá. Åöüóïí ï ÷ñçóéìïðïé ïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åßíáé áðü ôïõò ãíùóôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé ÷åßùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. ÓõíéóôÜ ôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá áí ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß õäáôéêüò äéáëýôçò/öïñÝáò. 1.4.2.2 ÌÜñôõñåò Óå êÜèå äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ðáñÜë ëçëá èåôéêïß êáé áñíçôéêïß (öïñÝáò/äéáëýôçò) ìÜñôõñåò ãéá êÜèå öýëï. Ìå åîáßñåóç ôçí áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ôá æþá óôéò ïìÜäåò-ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá áíôé ìåôùðßæïíôáé ìå ôïí ßäéï áêñéâþò ôñüðï ìå åêåßíï ôùí æþ ùí ðïõ áíÞêïõí óôéò ïìÜäåò áãùãÞò. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá ðáñÜãïõí ìéêñïðõ ñÞíåò in vivo óå åðßðåäá Ýêèåóçò ðïõ áíáìÝíåôáé íá äþ óïõí áíé÷íåýóéìç áýîçóç ðÜíù áðü ôï âáóéêü üñéï. Ïé äüóåéò ôùí èåôéêþí ìáñôýñùí èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé Ýôóé þóôå ôá áðïôåëÝóìáôá íá åßíáé óáöÞ áëëÜ íá ìçí áðïêáëýðôïõí áìÝóùò ôçí ôáõôüôçôá ôùí êùäéêïðïéç ìÝíùí áíôéêåéìåíïöüñùí óôïí ðáñáôçñçôÞ. Ïé èåôéêïß 1860 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé êáé áðü ïäü äéáöï ñåôéêÞ áðü åêåßíç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò êáé íá äåéãìáôß æïíôáé ìüíï ìßá öïñÜ. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, ìðïñåß íá åîå ôáóèåß ç ÷ñÞóç èåôéêþí ìáñôýñùí ðáñüìïéáò ÷çìéêÞò ôÜ îçò. Ðáñáäåßãìáôá ïõóéþí-èåôéêþí ìáñôýñùí åßíáé: Ãéá êÜèå äåéãìáôïëçøßá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò, ìüíï ìå äéáëýôç Þ öïñÝá, áëëÜ õðïâëçèÝíôåò óôçí ßäéá êáôÜ ôá Üëëá áãùãÞ ìå åêåßíç ôùí ïìÜäùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, åêôüò êé áí áðü ðñï ûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò ìÜñôõñåò ðñïêýðôïõí áðï äåêôÝò äéáöïñïðïéÞóåéò êáé óõ÷íüôçôåò êõôôÜñùí ìå ìé êñïðõñÞíåò ìåôáîý ôùí æþùí. ÅÜí ãéá ôïõò áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò ãßíåôáé ìßá ìüíï äåéãìáôïëçøßá, ï êáôáëëçëü ôåñïò ÷ñüíïò åßíáé ï ÷ñüíïò ôçò ðñþôçò äåéãìáôïëç øßáò. ÅðéðëÝïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé ìç õðïâëçèÝíôåò óå áãùãÞ ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí éóôïñéêÜ Þ äçìïóéåõìÝíá óôïé÷åßá ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åðéöÝñåé åðéâëáâÞ Þ ìå ôáëëáîéãüíá áðïôåëÝóìáôá. Åöüóïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ðåñéöåñéêü áßìá, ìðïñåß åðß óçò íá ãßíåé áðïäåêôü ùò ðáñÜëëçëïò áñíçôéêüò ìÜñôõ ñáò êáé Ýíá äåßãìá ðñï-áãùãÞò, áëëÜ ìüíï óôéò âñá÷õ ÷ñüíéåò äïêéìÝò ìå ðåñéöåñéêü áßìá (ð.÷., 1-3 áãùãÝò) üôáí ôá ðñïêýðôïíôá óôïé÷åßá åõñßóêïíôáé óôçí áíáìå íüìåíç âÜóåé éóôïñéêïý ðåñéï÷Þ ãéá ôï ìÜñôõñá. 1.5 ÄÉÁÄÉÊÁÓÉÁ 1.5.1 Áñéèìüò êáé öýëï ôùí æþùí ÊÜèå õðïâáëëüìåíç óå áãùãÞ ïìÜäá êáé ïìÜäá-ìÜñôõ ñáò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé 5 ôïõëÜ÷éóôïí æþá áíÜ öýëï (11). ÅÜí êáôÜ ôï ÷ñüíï ôçò äïêéìÞò õðÜñ÷ïõí äéáèÝóéìá äåäïìÝíá áðü ìåëÝôåò óôï ßäéï åßäïò æþïõ ìå ôçí ßäéá ïäü Ýêèåóçò ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé äåí õðÜñ÷ïõí ïõóéáóôéêÝò äéáöïñÝò óôçí ôïîéêüôçôá ìåôáîý öýëùí, áñêåß ôüôå ç äéå îáãùãÞ äïêéìÞò óå Ýíá ìüíï öýëï. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ ç Ýêèåóç ôùí áíèñþðùí óôéò ÷çìéêÝò ïõóßåò åîáñôÜôáé áðü ôï öýëï, üðùò ð.÷. ìðïñåß íá óõìâåß óôçí ðåñßðôùóç ïñéóìÝíùí öáñìáêåõôéêþí ðáñáãüíôùí, ç äïêéìÞ èá ðñÝ ðåé íá åêôåëåßôáé óå æþá ôïõ áíôßóôïé÷ïõ öýëïõ. 1.5.2 ×ñïíïäéÜãñáììá áãùãÞò Äåí ìðïñåß íá ðñïôáèåß êáíÝíá ôõðïðïéçìÝíï ÷ñïíï äéÜãñáììá áãùãÞò (äçë. 1, 2 Þ ðåñéóóüôåñåò áãùãÝò óå äéáóôÞìáôá 24 h). Ôá äåßãìáôá áðü ðáñáôåôáìÝíåò äï óïëïãéêÝò áãùãÝò åßíáé áðïäåêôÜ åöüóïí õðÜñ÷åé áðï äåäåéãìÝíï èåôéêü áðïôÝëåóìá óôç äïêéìÞ áõôÞ Þ, óôçí ðåñßðôùóç áñíçôéêÞò äïêéìÞò, åöüóïí Ý÷åé áðïäåé÷èåß ç ýðáñîç ôïîéêüôçôáò Þ Ý÷åé ÷ñçóéìïðïéçèåß ç ïñéáêÞ äüóç êáé ç ÷ïñÞãçóç óõíå÷ßóôçêå ìÝ÷ñé ôç óôéãìÞ ôçò äåéãìá ôïëçøßáò. Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ìðïñïýí åðßóçò íá ÷ï ñçãçèïýí êáé óå äéáêåêïììÝíç äïóïëïãßá, äçë. äýï áãù ãÝò ôçí ßäéá çìÝñá ðïõ íá ìçí áðÝ÷ïõí ÷ñïíéêÜ ðåñéóóü ôåñï áðü ëßãåò þñåò, ãéá íá äéåõêïëõíèåß ç ÷ïñÞãçóç ìåãÜëçò ðïóüôçôáò ïõóßáò. Ç äïêéìÞ ìðïñåß íá åêôåëåóôåß ìå äýï ôñüðïõò: (á) Ôá æþá õðïâÜëëïíôáé óå åöÜðáî áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá. Óôçí ðåñßðôùóç ôïõ ìõåëïý ôùí ïóôþí ëáì âÜíïíôáé äåßãìáôá ôïõëÜ÷éóôïí äýï öïñÝò, îåêéíþíôáò ôï íùñßôåñï 24 þñåò ìåôÜ ôçí áãùãÞ, áëëÜ ìçí õðåñâáßíï íôáò ôéò 48 þñåò áðü ôçí áãùãÞ ìå êáôÜëëçëá äéáóôÞìáôá ìåôáîý ôùí äåéãìÜôùí. Ôõ÷üí ëÞøç äåßãìáôïò ðñéí áðü ôçí ðáñÝëåõóç 24 ùñþí ìåôÜ ôçí áãùãÞ èá ðñÝðåé íá áéôéïëï ãåßôáé. Óôçí ðåñßðôùóç ôïõ ðåñéöåñéêïý áßìáôïò ëáìâÜíï íôáé äåßãìáôá ôïõëÜ÷éóôïí äýï öïñÝò, îåêéíþíôáò ôï íù ñßôåñï 36 þñåò ìåôÜ ôçí áãùãÞ êáé áöÞíïíôáò íá ðåñÜóåé êáôÜëëçëï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá áðü ôçí ðñþôç äåéãìáôïëç øßá ãéá ôç ëÞøç ôùí åðïìÝíùí áëëÜ ü÷é áñãüôåñá áðü ôéò 72 þñåò. Åöüóïí óå ìßá äåéãìáôïëçøßá åíôïðéóôåß èåôéêÞ áðüêñéóç, äåí áðáéôåßôáé ç ëÞøç Üëëïõ äåßãìáôïò. (â) Åöüóïí ãßíïõí 2 Þ ðåñéóóüôåñåò çìåñÞóéåò áãùãÝò (ð.÷. äýï Þ ðåñéóóüôåñåò áãùãÝò óå äéÜóôçìá 24 ùñþí), èá ðñÝðåé íá ãßíåé ìßá ìüíï äåéãìáôïëçøßá óôï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ìåôáîý 18 êáé 24 ùñþí ìåôÜ ôçí ôåëéêÞ áãùãÞ ãéá ôï ìõåëü ôùí ïóôþí êáé ìßá ðÜëé äåéãìáôïëçøßá óôï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ìåôáîý 36 êáé 48 ùñþí áðü ôçí ôåëéêÞ áãùãÞ ãéá ôï ðåñéöåñéêü áßìá (12). Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí åðéðñïóèÝôùò êáé Üëëïé ÷ñüíïé äåéãìáôïëçøßáò, üôáí ÷ñåéÜæåôáé. 1.5.3 Åðßðåäá äüóåùí ÅÜí åêôåëåóôåß äïêéìÞ áíåýñåóçò åýñïõò åðåéäÞ äåí õðÜñ÷ïõí êáôÜëëçëá äéáèÝóéìá äåäïìÝíá, áõôÞ èá ðñÝ ðåé íá åêôåëåßôáé óôï ßäéï åñãáóôÞñéï, ìå ôï ßäéï åßäïò, öõ ëÞ, öýëï êáé ôñüðï áãùãÞò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óôçí êý ñéá äïêéìÞ (13). Åöüóïí õðÜñ÷åé ôïîéêüôçôá, ãéá ôçí ðñþ ôç äåéãìáôïëçøßá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôñßá åðßðåäá äüóåùí. Ôá åðßðåäá áõôÜ äüóåùí èá ðñÝðåé íá êáëý ðôïõí ìßá ðåñéï÷Þ áðü ôç ìÝãéóôç ìÝ÷ñé ÷áìçëÞ Þ ìçäåíé êÞ ôïîéêüôçôá. Óôç ìåôáãåíÝóôåñç äåéãìáôïëçøßá, ÷ñåéÜ æåôáé íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ìüíï ç ìÝãéóôç äüóç. Ç ìÝãéóôç äüóç ïñßæåôáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé óçìåßá ôïîéêüôçôáò ôÝôïéá þóôå ôõ÷üí õøçëüôåñá åðßðåäá äüóçò, ìå âÜóç ôï ßäéï äïóïëïãéêü êáèåóôþò, íá áíáìÝíåôáé öõóéïëïãéêÜ íá ïäçãÞóïõí óå öáéíüìåíá èíçóéìüôçôáò. Ïõóßåò ìå åé äéêÝò âéïëïãéêÝò äñÜóåéò óå ÷áìçëÝò ìç ôïîéêÝò äüóåéò (üðùò ïñìüíåò êáé ìéôùãüíá) ìðïñåß íá áðïôåëïýí åîáé ñÝóåéò óôá êñéôÞñéá ñýèìéóçò ôùí äüóåùí êáé èá ðñÝðåé íá áîéïëïãïýíôáé êáôÜ ðåñßðôùóç.Ç ìÝãéóôç äüóç ìðï ñåß åðßóçò íá ïñéóôåß êáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé åíäåßîåéò ôïîéêüôçôáò óôï ìõåëü ôùí ïóôþí (ð.÷. ìåßùóç óôï ðïóï óôü Üùñùí åñõèñïêõôôÜñùí ìåôáîý ðëÞñùí åñõèñïêõô ôÜñùí óôï ìõåëü ôùí ïóôþí Þ ôï ðåñéöåñéêü áßìá). 1.5.4 ÄïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò ÅÜí ìßá äïêéìÞ ìå Ýíá åðßðåäï äüóçò ôïõëÜ÷éóôïí 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò óôçí ïðïßá åöáñìüæåôáé ìßá ìü íç áãùãÞ, Þ äýï áãùãÝò ôçí ßäéá ìÝñá, äåí äþóåé ïñáôÜ ôïîéêÜ áðïôåëÝóìáôá, êáé åöüóïí äåí áíáìÝíåôáé ç åì öÜíéóç ãïíïôïîéêüôçôáò ìå âÜóç óôïé÷åßá áðü ïõóßåò ó÷åôéêÞò äïìÞò, ôüôå ìðïñåß íá èåùñçèåß ùò ìç áíáãêáßá ç åêôÝëåóç ðëÞñïõò ìåëÝôçò ìå ôñßá åðßðåäá äüóçò. Óå ìåëÝôåò ìåãáëýôåñçò äéÜñêåéáò, ç ïñéáêÞ äüóç åßíáé 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá ãéá áãùãÞ ìÝ÷ñé 14 çìÝñåò êáé 1000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/day ãéá áãùãÞ ìåãáëýôåñç áðü 14 çìÝñåò. Ç áíáìåíüìåíç áíèñþðéíç Ýêèåóç ìðïñåß íá áðïôåëÝóåé Ýíäåéîç üôé ðñÝðåé íá ÷ñç óéìïðïéçèåß õøçëüôåñï åðßðåäï äüóçò óôç äïêéìÞ ïñéá êÞò äüóçò. ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1861 1.5.5 ×ïñÞãçóç äüóåùí Ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ÷ïñçãåßôáé óõíÞèùò ìå äéáóùëÞ íùóç ÷ñçóéìïðïéþíôáò óôïìá÷éêü óùëÞíá Þ êáôÜëëçëï óùëÞíá äéáóùëÞíùóçò Þ ìå åíäïðåñéôïíáúêÞ Ýã÷õóç. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ïäïß Ýêèåóçò åöüóïí ìðïñïýí íá áéôéïëïãçèïýí. Ï ìÝãéóôïò üãêïò õãñïý ðïõ ìðïñåß íá ÷ïñçãçèåß ìå äéáóùëÞíùóç Þ ìå Ýã ÷õóç åöÜðáî åîáñôÜôáé áðü ôï ìÝãåèïò ôïõ ðåéñáìáôü æùïõ. Ï üãêïò äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôá 2 ml/100g âÜñïõò óþìáôïò. Áí ÷ñçóéìïðïéçèïýí ìåãáëýôåñïé üãêïé, áõôü ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. Ìå åîáßñåóç ôéò åñå èéóôéêÝò Þ äéáâñùôéêÝò ïõóßåò ïé ïðïßåò êáíïíéêÜ åìöáíß æïõí åíôïíüôåñá áðïôåëÝóìáôá ìå õøçëüôåñåò óõãêå íôñþóåéò, ïé äéáöïñïðïéÞóåéò óôïí üãêï èá ðñÝðåé íá åëá÷éóôïðïéïýíôáé ðñïóáñìüæïíôáò ôç óõãêÝíôñùóç þóôå íá äéáóöáëßæåôáé óôáèåñüò üãêïò óå üëá ôá åðßðå äá äüóçò. 1.5.6 Ðñïåôïéìáóßá ôïõ ìõåëïý/áßìáôïò Ôá êýôôáñá ôïõ ìõåëïý ôùí ïóôþí ëáìâÜíïíôáé óõíÞ èùò áðü ôá ìçñéáßá ïóôÜ Þ ôá ïóôÜ ôùí êíçìþí áìÝóùò ìåôÜ ôç èõóßá. ÓõíÞèùò, ôá êýôôáñá áðïìáêñýíïíôáé áðü ôá åí ëüãù ïóôÜ, ìïñöþíïíôáé óå ðáñáóêåõÜóìáôá êáé ÷ñùìáôßæïíôáé ÷ñçóéìïðïéþíôáò êáèéåñùìÝíåò ìåèü äïõò. Ôï ðåñéöåñéêü áßìá ëáìâÜíåôáé áðü ôçí ïõñáßá öëÝâá Þ Üëëï êáôÜëëçëï áéìïöüñï áããåßï. Ôá áéìïêýô ôáñá ÷ñùìáôßæïíôáé áìÝóùò õðåñæùúêþò (8)(9)(10) Þ ëáìâÜíïíôáé åðéóôñùìÝíá ðáñáóêåõÜóìáôá êáé êáôüðéí ÷ñùìáôßæïíôáé. ×ñçóéìïðïéþíôáò ìßá åéäéêÞ ãéá ôï DNA ÷ñùóôéêÞ [ð.÷. ðïñôïêáëü÷ñïõí áêñéäßíçò (14) Þ Hoech st 33258 plus pyronin-Y (15)] ìðïñïýí íá åîáëåéöèïýí ïñéóìÝíá áðü ôá ôå÷íéêÜ óöÜëìáôá ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ôç ÷ñÞóç ìç åéäéêÞò ãéá ôï DNA ÷ñùóôéêÞò. Ôï ðëåï íÝêôçìá áõôü äåí áðïêëåßåé ôç ÷ñÞóç óõìâáôéêþí ÷ñù óôéêþí (ð.÷. Giemsa). Ìðïñïýí åðßóçò íá ÷ñçóéìïðïéç èïýí êáé ðñüóèåôá óõóôÞìáôá [ð.÷. óôÞëåò êõôôáñßíçò ãéá ôçí áðïìÜêñõíóç åìðýñçíùí êõôôÜñùí (16)] õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé ôá óõóôÞìáôá áõôÜ Ý÷ïõí áðïäåé÷èåß êá ôÜëëçëá ãéá ôçí ðáñáóêåõÞ ìéêñïðõñÞíùí óôï åñãáóôÞ ñéï. 1.5.7 ÁíÜëõóç Ç áíáëïãßá ôùí Üùñùí óôï óýíïëï (Üùñá + þñéìá) ôùí åñõèñïêõôôÜñùí ðñïóäéïñßæåôáé ãéá êÜèå æþï ìå ôñþíôáò Ýíá óýíïëï ôïõëÜ÷éóôïí 200 åñõèñïêõôôÜñùí ãéá ôï ìõåëü ôùí ïóôþí êáé 1000 åñõèñïêõôôÜñùí ãéá ôï ðåñéöåñéêü áßìá (17). ́Ïëåò ïé áíôéêåéìåíïöüñïé, óõìðå ñéëáìâáíïìÝíùí êáé åêåßíùí ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí, èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïõí Ýíá äéáöïñåôéêü êù äéêü ðñéí áðü ôçí åîÝôáóç óôï ìéêñïóêüðéï. Ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò óõ÷íüôçôáò åìöÜíéóçò Üùñùí åñõ èñïêõôôÜñùí ìå ìéêñïðõñÞíá êáôáìåôñïýíôáé ôïõëÜ÷é óôïí 2000 Üùñá åñõèñïêýôôáñá áíÜ æþï. Ìðïñïýí íá ëçöèïýí êáé Üëëåò ðëçñïöïñßåò êáôáìåôñþíôáò þñéìá åñõèñïêýôôáñá ãéá ìéêñïðõñÞíåò. ÊáôÜ ôçí åîÝôáóç ôùí áíôéêåéìåíïöüñùí, ç áíáëïãßá ôùí Üùñùí óôï óý íïëï ôùí åñõèñïêõôôÜñùí äåí èá ðñÝðåé íá åßíáé ìéêñü ôåñç áðü ôï 20% ôçò ôéìÞò ôïõ ìÜñôõñá. ¼ôáí ôá æþá õðïâÜëëïíôáé óå áãùãÞ óõíå÷þò ãéá 4 Þ êáé ðåñéóóüôå ñåò åâäïìÜäåò, ãéá ôç óõ÷íüôçôá åìöÜíéóçò ìéêñïðõ ñÞíùí ìðïñïýí íá êáôáìåôñçèïýí åðßóçò ôïõëÜ÷éóôïí 2000 þñéìá åñõèñïêýôôáñá áíÜ æþï. Ùò åíáëëáêôéêüò ôñüðïò åêôßìçóçò áíôß åêåßíïõ ìå ôá ÷Ýñéá, ìðïñïýí íá ãßíïõí äåêôÜ êáé óõóôÞìáôá áõôüìáôçò áíÜëõóçò (áíÜ ëõóç åéêüíáò êáé êõôôáñïìåôñßá ñïÞò êõôôáñéêþí åíáéù ñçìÜôùí), åöüóïí õðÜñ÷åé êáôÜëëçëç áéôéïëüãçóç êáé åðéêýñùóç. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Èá ðñÝðåé íá ðáñïõóéÜæïíôáé ìå ìïñöÞ ðßíáêá åðéìÝ ñïõò óôïé÷åßá ãéá êÜèå æþï. Ç ðåéñáìáôéêÞ ìïíÜäá åßíáé ôï æþï. Ãéá êÜèå åîåôáæüìåíï æþï èá ðñÝðåé íá êáôáãñÜ öåôáé ÷ùñéóôÜ ï áñéèìüò ôùí êáôáìåôñçèÝíôùí Üùñùí åñõèñïêõôôÜñùí, ï áñéèìüò ôùí öåñüíôùí ìéêñïðõñÞ íåò Üùñùí åñõèñïêõôôÜñùí êáé ï áñéèìüò ôùí Üùñùí óôï óýíïëï ôùí åñõèñïêõôôÜñùí. ¼ôáí ôá æþá õðïâÜë ëïíôáé óå áãùãÞ óõíå÷þò ãéá 4 Þ ðåñéóóüôåñåò åâäïìÜ äåò, èá ðñÝðåé åðßóçò íá äßíïíôáé êáé ôá óôïé÷åßá ãéá ôá þñéìá åñõèñïêýôôáñá, åöüóïí åëÞöèçóáí. Ãéá êÜèå æþï äßíåôáé ç áíáëïãßá ôùí Üùñùí óôï óýíïëï ôùí åñõèñï êõôôÜñùí êáé, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, ôï ðïóïóôü ôùí öåñüíôùí ìéêñïðõñÞíåò åñõèñïêõôôÜñùí. Åöüóïí äåí õðÜñ÷ïõí åíäåßîåéò äéáöïñÜò áðïêñßóåùò áíÜëïãá ìå ôï öýëï, ôá äåäïìÝíá áðü ôá äýï öýëá ìðïñïýí íá óõíäõÜæïíôáé ãéá óôáôéóôéêÞ áíÜëõóç. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß ùò èåôéêü Ýíá áðïôÝëåóìá õðÜñ÷ïõí äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôç äüóç áýîç óç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå ìéêñïðõñÞíåò Þ ç óá öÞò áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå ìéêñïðõñÞíåò óå ïìÜäá ìßáò ìüíçò äüóçò óå ìßá ìüíç äåéãìáôïëçøßá. Ðñþôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí áðïôåëåóìÜôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèïäïé (18)(19). Óå ìßá èåôéêÞ áðü êñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäéêüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜ ãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôéóôéêÞ óçìáíôéêüôçôá. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá äéáóáöçíßæï íôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò êáé ôñïðïðïéþíôáò, êáôÜ ðñï ôßìçóç, ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîéãüíïò óôç äïêéìÞ áõôÞ. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá óôç äïêéìÞ ìéêñïðõñÞíùí äåß ÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ðñïêáëåß ôçí ðáñáãùãÞ ìé êñïðõñÞíùí ðïõ åßíáé áðïôÝëåóìá ÷ñùìïóùìéêÞò âëÜ âçò Þ âëÜâçò óôç ìéôùôéêÞ óõóêåõÞ óôïõò åñõèñïâëÜ óôåò ôïõ åîåôáóèÝíôïò åßäïõò. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðáñÜãåé ìéêñïðõñÞíåò óôá Üùñá åñõèñïêýô ôáñá ôïõ åîåôáóèÝíôïò åßäïõò. Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé áí ç õðü äïêéìÞ ïõóßá Þ ïé ìå ôáâïëßôåò ôçò Ý÷ïõí ôç äõíáôüôçôá ðñüóâáóçò óôç ãåíé êÞ êõêëïöïñßá Þ åéäéêüôåñá óôïí éóôü óôü÷ï (ð.÷. óõóôå ìéêÞ ôïîéêüôçôá). 1862 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 3. ÁÍÁÖÏÑÁ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêü ëïõèá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, ÅîåôáóèÝíôá æþá: � ÷ñçóéìïðïéçèÝí åßäïò/öõëÞ, � áñéèìü, çëéêßá êáé öýëï ôùí æþùí, � ðçãÞ, óõíèÞêåò óôÝãáóçò, äßáéôá, êëð, � âÜñïò ôùí ìåìïíùìÝíùí æþùí óôçí Ýíáñîç ôçò äïêé ìÞò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíïõ ôïõ åýñïõò ôùí âáñþí óþ ìáôïò, ôçò ìÝóçò ôéìÞò êáé ôçò ôõðéêÞò áðüêëéóçò ãéá êÜ èå ïìÜäá. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò (öïñÝáò/äéáëýôçò) ìÜñôõñåò, � óôïé÷åßá áðü ôç ìåëÝôç åýñåóçò ôïõ åýñïõò, åöüóïí Ýãéíå, � áéôéïëïãßá ôçò åðéëïãÞò ôïõ åðéðÝäïõ äüóåùò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôç ÷ïñÞãçóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, � áéôéïëïãßá ôçò ÷ñçóéìïðïéçèåßóáò ïäïý ÷ïñÞãçóçò, � ìåèüäïõò åðáëÞèåõóçò ôïõ üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá Ýöèáóå óôç ãåíéêÞ êõêëïöïñßá Þ óôïí éóôü óôü÷ï, åöü óïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ìåôáôñïðÞ ôçò óõãêÝíôñùóçò (ppm) ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôç äßáéôá/ðüóéìï íåñü óôçí ðñáãìáôéêÞ äüóç (mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá), åöüóïí ÷ñåéÜæåôáé, � óôïé÷åßá ãéá ôçí ðïéüôçôá ôçò ôñïöÞò êáé ôïõ íåñïý, � ëåðôïìåñÞ ðåñéãñáöÞ ôùí ó÷çìÜôùí áãùãÞò êáé äåéãìáôïëçøßáò, � ìåèüäïõò åôïéìáóßáò áíôéêåéìåíïöüñùí, � ìåèüäïõò ãéá ôéò ìåôñÞóåéò ôçò ôïîéêüôçôáò, � êñéôÞñéá ãéá ôçí êáôáìÝôñçóçò ôùí öåñüíôùí ìéêñï ðõñÞíåò Üùñùí åñõèñïêõôôÜñùí, � áñéèìü åîåôáóèÝíôùí êõôôÜñùí áíÜ æþï, � êñéôÞñéá êáôÜôáîçò ôçò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôé êÞò Þ äéöïñïýìåíçò. ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � áíáëïãßá Üùñùí óôï óýíïëï ôùí åñõèñïêõôôÜñùí, � áñéèìü öåñüíôùí ìéêñïðõñÞíåò Üùñùí åñõèñïêõô ôÜñùí, ÷ùñéóôÜ ãéá êÜèå æþï, � ìÝóç ôéìÞ ± ôõðéêÞ áðüêëéóç ôùí öåñüíôùí ìéêñïðõ ñÞíåò åñõèñïêõôôÜñùí áíÜ ïìÜäá, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò êáé åöáñìïóèåßóåò ìÝèïäïé, � ðáñÜëëçëá êáé ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñ íçôéêïýò (äéáëýôçò/öïñÝáò) ìÜñôõñåò, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò èåôéêïýò ìÜñôõñåò. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chro mosomal Damage, Mutation Res., 18, 187-190. 2. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 9-15. 3. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123: 61-118. 4. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salam one, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronu cleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agen cy Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, 29-80. 5. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: "Developments in Science and Practice of Toxicology", Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, 555-558. 6. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103-112. 7. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shel by, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14: 513-522. 8. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Or ange-Coated Slides. Mutation Res., 245, 245-249. 9. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Stain ing: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, 83-98. 10. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagene sis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 153-159. 11. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pac chierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Van nier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, 293-304. 12. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutage nesis, 10, 313-319. 13. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319. 14. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, 241-247. 15 .MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Mi cronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, 269-275. 16. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The auto mated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, 91-104. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1863 17. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromat ic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, 97-99. 18. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cyto genetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Re port, Part I, revised. Cambridge University Press, Cam bridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 19. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Com mittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232. ÐáñÜñôçìá 2Ä B. 13/14. ÌÅÔÁËËÁÎÉÃÅÍÅÓÇ: ÄÏÊÉÌÇ ÁÍÁÓÔÑÏÖÇÓ ÌÅÔÁËËÁÎÇÓ ÌÅ ×ÑÇÓÇ ÂÁÊÔÇÑÉÙÍ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 471 Bacterial Reverse Mutation Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Óôç äïêéìÞ âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò ÷ñç óéìïðïéïýíôáé áðáéôïýíôá áìéíïîÝá óôåëÝ÷ç Salmonella typhimurium êáé Escherichia coli ãéá ôïí åíôïðéóìü óçìåé áêþí ìåôáëëÜîåùí, ðïõ ðåñéëáìâÜíïõí õðïêáôÜóôáóç, ðñïóèÞêç Þ áðÜëåéøç åíüò Þ ìåñéêþí æåõãþí âÜóåùí DNA (1)(2)(3). Ç áñ÷Þ ôçò äïêéìÞò áõôÞò ôçò âáêôçñéá êÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò óõíßóôáôáé óôï üôé áíé÷íåý åé ìåôáëëÜîåéò ðïõ áíáóôñÝöïõí ìåôáëëÜîåéò ðïõ õðÜñ ÷ïõí óôá õðü äïêéìÞ óôåëÝ÷ç êáé áðïêáèéóôïýí ôç ëåé ôïõñãéêÞ éêáíüôçôá ôùí âáêôçñßùí ãéá óýíèåóç åíüò âáóéêïý áìéíïîÝïò. Ôá áíáóôñáöÝíôá âáêôÞñéá áíé÷íåý ïíôáé áðü ôçí éêáíüôçôÜ ôïõò íá áíáðôýóóïíôáé áðïõóßá ôïõ áìéíïîÝïò ðïõ áðáéôåßôáé áðü ôï ãïíéêü õðü äïêéìÞ óôÝëå÷ïò. Ïé óçìåéáêÝò ìåôáëëÜîåéò åßíáé ôï áßôéï ðïëëþí ãåíåôé êþí áóèåíåéþí óôïõò áíèñþðïõò êáé õðÜñ÷ïõí ïõóéá óôéêÝò åíäåßîåéò üôé ïé óçìåéáêÝò ìåôáëëÜîåéò óôá ïãêï ãïíßäéá êáé óôá ïãêïãåíÞ áðïêáôáóôáôéêÜ ãïíßäéá óùìá ôéêþí êõôôÜñùí åìðëÝêïíôáé óôç äçìéïõñãßá üãêùí óôïõò áíèñþðïõò êáé óå ðåéñáìáôüæùá. Ç äïêéìÞ âáêôç ñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò åßíáé ôá÷åßá, öèçíÞ êáé ó÷åôéêþò åýêïëç íá ãßíåé. ÐïëëÜ áðü ôá õðü äïêéìÞ óôå ëÝ÷ç ðáñïõóéÜæïõí ïñéóìÝíá ÷áñáêôçñéóôéêÜ ðïõ ôá êá èéóôïýí ðéï åõáßóèçôá ãéá ôçí áíß÷íåõóç ìåôáëëÜîåùí êáé óôá ïðïßá ðåñéëáìâÜíïíôáé áðïêñéíüìåíåò áêïëïõ èßåò DNA óôéò èÝóåéò áíáóôñïöÞò, áõîçìÝíç êõôôáñéêÞ äéáðåñáôüôçôá óôá ìåãÜëá ìüñéá êáé åîÜëåéøç ôùí óõ óôçìÜôùí åðéäéüñèùóçò DNA Þ åíßó÷õóç ôùí åðéññåðþí óå óöÜëìáôá äéåñãáóéþí åðéäéüñèùóçò DNA. Ç åîåéäß êåõóç ôùí õðü äïêéìÞ óôåëå÷þí ìðïñåß íá ðáñÜó÷åé ïñé óìÝíåò ÷ñÞóéìåò ðëçñïöïñßåò ãéá ôïõò ôýðïõò ìåôáëëÜ îåùí ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ãïíïôïîéêïýò ðáñÜãïíôåò. Ãéá ôéò äïêéìÝò âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò õðÜñ÷åé äéáèÝóéìç ìßá ðïëý ìåãÜëç âÜóç äåäïìÝíùí ìå áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá ìåãÜëç ðïéêéëßá äïìþí åíþ Ý÷ïõí áíáðôõ÷èåß áñêåôÝò êáèéåñùìÝíåò ðëÝïí ìåèïäïëïãßåò ãéá ôïí Ýëåã÷ï ÷çìéêþí ïõóéþí ìå äéáöïñåôéêÝò öõóéêï ÷çìéêÝò éäéüôçôåò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé ðôçôéêþí åíþóåùí. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ Ç äïêéìÞ áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò óôç Salmonella typhimurium Þ óôá Escherichia coli áíé÷íåýåé ìåôÜëëáîç óå áðáéôïýí áìéíïîý óôÝëå÷ïò (éóôéäßíç Þ èñõðôïöÜíç, áíôßóôïé÷á) ãéá ôçí ðáñáãùãÞ óôåëÝ÷ïõò ðïõ äåí åîáñ ôÜôáé áðü ôçí Ýîùèåí ðáñï÷Þ áìéíïîÝïò. Ìåôáëëáîïãüíá õðïêáôÜóôáóçò æåõãþí âÜóåùí åßíáé ðáñÜãïíôåò ðïõ ðñïêáëïýí áëëáãÞ âÜóåùí óôï DNA. Óôç äïêéìÞ áíáóôñïöÞò ç áëëáãÞ áõôÞ ìðïñåß íá óõìâåß óôç èÝóç ôçò áñ÷éêÞò ìåôÜëëáîçò Þ óå ìßá Üëëç èÝóç ôïõ âáêôçñéáêïý ãïíéäéþìáôïò. Ìåôáëëáîïãüíá áëëáãÞò ðëáéóßïõ åßíáé ðáñÜãïíôåò ðïõ ðñïêáëïýí ôçí ðñïóèÞêç Þ áðÜëåéøç åíüò Þ ðåñéó óïôÝñùí æåõãþí âÜóåùí óôï DNA, ìåôáâÜëëïíôáò Ýôóé ôï áíáãíùóôéêü ðëáßóéï óôï RNA. 1.3 ÁÑ×ÉÊÅÓ ÈÅÙÑÇÓÅÉÓ Óôç äïêéìÞ âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò ÷ñç óéìïðïéïýíôáé ðñïêáñõùôéêÜ êýôôáñá ôá ïðïßá äéáöÝ ñïõí áðü ôá êýôôáñá ôùí èçëáóôéêþí óå ïñéóìÝíá óçìåßá üðùò ç ðñüóëçøç, ï ìåôáâïëéóìüò, ç ÷ñùìïóùìéêÞ äï ìÞ êáé ïé äéåñãáóßåò åðéäéüñèùóçò DNA. Ïé äïêéìÝò ðïõ ðñáãìáôïðïéïýíôáé in vitro áðáéôïýí åí ãÝíåé ôç ÷ñÞóç åîùãåíïýò ðçãÞò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôá in vitro óõóôÞìáôá ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò äåí ìðïñïýí íá ìéìçèïýí ðëÞñùò ôéò in vivo óõíèÞêåò óôá èçëáóôéêÜ. Óõ íåðþò, ç äïêéìÞ äåí ðáñÝ÷åé Üìåóåò ðëçñïöïñßåò ãéá ôç ìåôáëëáîéãüíï êáé êáñêéíïãüíï äõíáôüôçôá ìéáò ïõóßáò óôá èçëáóôéêÜ. Ç äïêéìÞ âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò ÷ñçóé ìïðïéåßôáé óõíÞèùò ùò ìßá áñ÷éêÞ äïêéìÞ ðñïóáíáôïëé óìïý ãéá ôç ãïíïôïîéêÞ äñáóôéêüôçôá êáé, éäéáßôåñá, ôçí åðÜãïõóá óçìåéáêÝò ìåôáëëÜîåéò. Áðü ðïëõÜñéèìá óõë ëåãìÝíá óôïé÷åßá êáôáäåéêíýåôáé üôé ðïëëÜ ÷çìéêÜ ðïõ åß íáé èåôéêÜ óôç äïêéìÞ áõôÞ åìöáíßæïõí ìåôáëëáîéãüíï äñÜóç êáé óå Üëëåò äïêéìÝò. ÕðÜñ÷ïõí ðáñáäåßãìáôá ìå ôáëëáîéãüíùí ðáñáãüíôùí ðïõ äåí áíé÷íåýïíôáé ìå ôç äïêéìÞ áõôÞ. Ïé áôÝëåéåò áõôÝò ìðïñïýí íá áðïäïèïýí óôçí åéäéêÞ öýóç ôïõ áíé÷íåõüìåíïõ ôåëéêïý óçìåßïõ, óôéò äéáöïñÝò óôç ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç Þ óôéò äéá öïñÝò óôç âéïäéáèåóéìüôçôá. Áðü ôçí Üëëç ìåñéÜ, ðáñÜ ãïíôåò ðïõ åíéó÷ýïõí ôçí åõáéóèçóßá ôçò äïêéìÞò âáêôç ñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò ìðïñïýí íá ïäçãÞóïõí óå õðåñåêôßìçóç ôçò ìåôáëëáîéãüíïõ äñáóôéêüôçôáò. Ç äïêéìÞ âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò ìðïñåß íá ìç ðñïóöÝñåôáé ãéá ôçí áîéïëüãçóç ïñéóìÝíùí ôÜîå ùí ÷çìéêþí ïõóéþí üðùò, ð.÷., ãéá éó÷õñÜ âáêôçñéïêôü íåò åíþóåéò (ð.÷. ïñéóìÝíá áíôéâéùôéêÜ) êáé åíþóåéò ðïõ èåùñåßôáé (Þ åßíáé ãíùóôü) üôé ðáñåìâáßíïõí åéäéêÜ óôï óýóôçìá êõôôáñéêÞò áíôéãñáöÞò ôùí èçëáóôéêþí (ð.÷. ïñéóìÝíïé áíáóôïëåßò ôçò ôïðïúóïìåñÜóçò êáé ïñéóìÝíá íïõêëåïóéäéêÜ áíÜëïãá). Ãéá ôéò ðåñéðôþóåéò áõôÝò, ìðï ñåß íá ðñïóöÝñïíôáé ðåñéóóüôåñï ïé äïêéìÝò ìåôÜëëá îçò óôá èçëáóôéêÜ. Áí êáé ðïëëÝò åíþóåéò ðïõ åßíáé èåôéêÝò óôç äïêéìÞ áõ ôÞ åßíáé êáñêéíïãüíåò óôá èçëáóôéêÜ, ï óõó÷åôéóìüò áõ 1864 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ôüò äåí åßíáé áðüëõôïò. ÅîáñôÜôáé áðü ôçí ôÜîç ôçò ÷çìé êÞò Ýíùóçò êáé õðÜñ÷ïõí êáñêéíïãüíá ðïõ äåí áíé÷íåý ïíôáé ìå ôç äïêéìÞ áõôÞ åðåéäÞ äñïõí ìÝóù Üëëùí, ìç ãï íïôïîéêþí, ìç÷áíéóìþí Þ ìç÷áíéóìþí ðïõ äåí õößóôáíôáé óôá âáêôçñéáêÜ êýôôáñá. 1.4 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ ÅíáéùñÞìáôá âáêôçñéáêþí êõôôÜñùí åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ðáñïõóßá êáé áðïõóßá åîùãåíïýò óõ óôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Óôç ìÝèïäï ðñï óèÞêçò óå ôñõâëßï, ôá åíáéùñÞìáôá áõôÜ áíáìåéãíýïíôáé ìå Üãáñ åðéêÜëõøçò êáé åðéóôñþíïíôáé áìÝóùò óå åëÜ÷é óôç ðïóüôçôá èñåðôéêïý ìÝóïõ. Óôç ìÝèïäï ðñïåðùÜ óåùò, ôï ìßãìá êáôåñãáóßáò åðùÜæåôáé êáé êáôüðéí áíá ìåéãíýåôáé ìå Üãáñ åðéóôñþóåùò ðñéí åðéóôñùèåß óå åëÜ ÷éóôç ðïóüôçôá ìÝóïõ. Êáé óôéò äýï ôå÷íéêÝò, Ýðåéôá áðü äýï Þ ôñåéò çìÝñåò åðùÜóåùò, ìåôñþíôáé ïé áíÜóôñïöåò áðïéêßåò êáé ï áñéèìüò ôïõò óõãêñßíåôáé ìå ôïí áñéèìü ôùí áõèüñìçôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí óå ôñõâëßá-ìÜñ ôõñåò ìå äéáëýôç. 'Å÷ïõí ðåñéãñáöåß äéÜöïñåò äéáäéêáóßåò ãéá ôçí åêôÝ ëåóç ôçò äïêéìÞò âáêôçñéáêÞò áíÜóôñïöçò ìåôÜëëáîçò. Ìåôáîý åêåßíùí ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò åßíáé ç ìÝèïäïò ðñïóèÞêçò óå ôñõâëßï (1)(2)(3)(4), ç ìÝèïäïò ðñïåðùÜóåùò (2)(3)(5)(6)(7)(8), ç ìÝèïäïò äéáêýìáíóçò (9)(10) êáé ç ìÝèïäïò åíáéùñÞìáôïò (11). 'Å÷ïõí ðåñé ãñáöåß åðßóçò êáé ôñïðïðïéÞóåéò ãéá ôç äïêéìáóßá áå ñßùí Þ áôìþí (12). Ïé äéáäéêáóßåò ðïõ ðåñéãñÜöïíôáé óôç ìÝèïäï ó÷åôß æïíôáé êõñßùò ìå ôéò ìåèüäïõò ðñïóèÞêçò óå ôñõâëßï êáé ðñïåðùÜóåùò. Êáé ïé äýï åßíáé áðïäåêôÝò ãéá ôçí ðñáã ìáôïðïßçóç ðåéñáìÜôùí êáé ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç. ÏñéóìÝíåò ïõóßåò ìðïñïýí íá áíé÷íåõ èïýí áðïôåëåóìáôéêüôåñá ìå ôç ìÝèïäï ðñïåðùÜóåùò. Ïé ïõóßåò áõôÝò áíÞêïõí óå ìßá óåéñÜ ÷çìéêþí ôÜîåùí óôçí ïðïßá ðåñéëáìâÜíïíôáé ïé áëåéöáôéêÝò íéôñïæáìßíåò ìå âñá÷åßá áëõóßäá, ôá äéóèåíÞ ìÝôáëëá, áëäåûäåò, áæù ÷ñþìáôá êáé äéáæùåíþóåéò, ðõñïëëéæéäéíéêÜ áëêáëïåéäÞ, áëëõëïåíþóåéò êáé íéôñïåíþóåéò (3). Áíáãíùñßæåôáé åðß óçò üôé ïñéóìÝíåò ôÜîåéò ìåôáëëáîéãüíùí äåí áíé÷íåýï íôáé ðÜíôïôå ìå ôéò ôõðïðïéçìÝíåò äéáäéêáóßåò üðùò ìå ôç ìÝèïäï ðñïóèÞêçò óå ôñõâëßï Þ ìå ôç ìÝèïäï ðñïå ðùÜóåùò. ÁõôÝò èá ðñÝðåé íá èåùñïýíôáé ùò "åéäéêÝò ðå ñéðôþóåéò" êáé óõíéóôÜôáé éäéáßôåñá íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ãéá ôçí áíß÷íåõóÞ ôïõò åíáëëáêôéêÝò äéáäéêáóßåò. Ùò "åé äéêÝò ðåñéðôþóåéò" ìðïñïýí íá áíáöåñèïýí ïé áêüëïõ èåò (ìáæß ìå ðáñáäåßãìáôá äéáäéêáóéþí ðïõ ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ãéá ôçí áíß÷íåõóÞ ôïõò):áæù÷ñþìáôá êáé äéáæùåíþóåéò (3)(5)(6)(13), áÝñéá êáé ðôçôéêÝò ïõóßåò (12)(14)(15)(16) êáé ãëõêïæßôåò (17)(18). Ôõ÷üí ðáñÝêëéóç áðü ôçí ôõðïðïéçìÝíç äéáäéêáóßá ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé åðéóôçìïíéêþò. 1.5 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.5.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.5.1.1 ÂáêôÞñéá Ðñüóöáôåò êáëëéÝñãåéåò âáêôçñßùí èá ðñÝðåé íá áöÞ íïíôáé íá áíáðôõ÷èïýí ìÝ÷ñé ôï ôåëåõôáßï óôÜäéï ôçò åê èåôéêÞò Þ ôï ðñþúìï óôÜäéï ôçò óôáôéêÞò öÜóçò áíáðôý îåùò (ðåñßðïõ 109 êýôôáñá áíÜ ml). Äåí èá ðñÝðåé íá ÷ñç óéìïðïéïýíôáé êáëëéÝñãåéåò ðïõ âñßóêïíôáé óôï ôåëåõôáßï óôÜäéï ôçò óôáôéêÞò öÜóçò. Ðáßæåé óçìáíôéêü ñüëï ïé ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò êáëëéÝñãåéåò íá åìöáíßæïõí õøçëü ôßôëï âéþóéìùí âáêôçñßùí. Ï ôßôëïò ìðïñåß íá âñå èåß åßôå áðü ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôéò êáìðýëåò áý îçóçò, åßôå óå êÜèå äïêéìÞ ìå ôïí ðñïóäéïñéóìü ôïõ áñéè ìïý ôùí âéþóéìùí êõôôÜñùí ìå äïêéìÞ óå ôñõâëßï. Ç óõíéóôþìåíç èåñìïêñáóßá åðùÜóåùò åßíáé 37°C. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ðÝíôå ôïõëÜ÷éóôïí óôå ëÝ÷ç âáêôçñßùí. Óå áõôÜ èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ôÝóóåñá óôåëÝ÷ç S. typhimurium (TA 1535, TA 1537 Þ TA97a Þ TA97, TA98 êáé TA100) ðïõ Ý÷åé áðïäåé÷èåß üôé åß íáé áîéüðéóôá êáé ðáñÝ÷ïõí áíáðáñáãþãéìåò áðïêñßóåéò ìåôáîý åñãáóôçñßùí. Ôá ôÝóóåñá áõôÜ óôåëÝ÷ç S. typhimurium Ý÷ïõí GC æåýãç âÜóåùí óôçí ðñùôáñ÷éêÞ èÝóç áíáóôñïöÞò êáé åßíáé ãíùóôü üôé äåí ìðïñïýí íá åíôïðßóïõí ïñéóìÝíá ïîåéäùôéêÜ ìåôáëëáîéãüíá., ðáñÜ ãïíôåò óôáõñïåéäïýò óýíäåóçò êáé õäñáæßíåò. Ïé ïõóßåò áõôÝò ìðïñïýí íá áíé÷íåõèïýí ìå óôåëÝ÷ç E. coli WP2 Þ S. typhimurium TA102 (19) ðïõ Ý÷ïõí Ýíá æåýãïò âÜóåùí AT óôçí ðñùôáñ÷éêÞ èÝóç áíáóôñïöÞò. Óõíåðþò, ï óõíé óôþìåíïò óõíäõáóìüò óôåëå÷þí åßíáé: � S. typhimurium TA1535 êáé � S. typhimurium TA1537 Þ TA97Þ TA97a êáé � S. typhimurium TA98 êáé � S. typhimurium TA100 êáé � E. coli WP2 uvrA Þ E. coli WP2 uvrA (pKM101) ÞS. typhimurium TA102. Ãéá íá áíé÷íåõèïýí ìåôáëëáîéãüíá óôáõñïåéäïýò óýí äåóçò ìðïñåß íá åßíáé óêüðéìï íá ðåñéëçöèåß TA102 Þ íá ðñïóôåèåß Ýíá åéäéêü ãéá ôçí åðéäéüñèùóç DNA óôÝëå÷ïò E. coli [ð.÷. E. coli WP2 Þ E. coli WP2 (pKM101)]. Ãéá ôçí ðáñáóêåõÞ Ýôïéìùí êáëëéåñãåéþí, ôçí åðáëÞ èåõóç é÷íçèåôþí êáé ôçí áðïèÞêåõóç èá ðñÝðåé íá ÷ñç óéìïðïéïýíôáé êáèéåñùìÝíåò äéáäéêáóßåò. Ãéá êÜèå êáôå øõãìÝíï ðáñáóêåýáóìá Ýôïéìçò êáëëéÝñãåéáò èá ðñÝðåé íá êáôáäåéêíýåôáé üôé áðáéôåß áìéíïîý ãéá íá áíáðôõ÷èåß (éóôéäßíç ãéá óôåëÝ÷çS. typhimurium êáé èñõðôïöÜíç ãéá óôåëÝ÷ç E. coli ). Èá ðñÝðåé ïìïßùò íá åëÝã÷ïíôáé ðñïò åðéâåâáßùóç êáé Üëëá öáéíïôõðéêÜ ÷áñáêôçñéóôéêÜ, óõ ãêåêñéìÝíá: ç ðáñïõóßá Þ áðïõóßá ðëáóìéäßùí R-ðáñÜ ãïíôá üðïõ ÷ñåéÜæåôáé [äçë. áíôßóôáóç áìðéêéëëßíçò óå óôåëÝ÷ç TA98, TA100 êáé TA97a Þ TA97, WP2 uvrA êáé WP2 uvrA (pKM101), êáé áíôßóôáóç áìðéêéëëßíçò + ôåôñá êõêëßíçò óå óôÝëå÷ïò TA102], ç ðáñïõóßá ÷áñáêôçñéóôé êþí ìåôáëëÜîåùí (äçë. rfa ìåôÜëëáîç óå S. typhimurium ìÝóù ôçò åõáéóèçóßáò óå êñõóôáëëéêü éþäåò êáé uvrA ìå ôÜëëáîç óå E. coli Þ uvrB ìåôÜëëáîç óå S. typhimurium ìÝ óù ôçò åõáéóèçóßáò óå õðåñéþäåò öùò) (2)(3). Ôá óôåëÝ ÷ç èá ðñÝðåé åðßóçò íá äßíïõí Ýíáí áñéèìü áõèüñìçôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí óå ôñõâëßï ðïõ íá ðÝöôåé ìÝóá óôéò ðåñéï÷Ýò óõ÷íïôÞôùí ðïõ áíáìÝíïíôáé áðü ôá ðñï ûðÜñ÷ïíôá åñãáóôçñéáêÜ äåäïìÝíá êáé, êáôÜ ðñïôßìç óç, ìÝóá óôçí ðåñéï÷Þ ðïõ áíáöÝñåôáé óôç âéâëéïãñá ößá. 1.5.1.2 Èñåðôéêü ìÝóï ×ñçóéìïðïéåßôáé êáôÜëëçëï åëÜ÷éóôï Üãáñ (ð.÷. Üãáñ ðïõ ðåñéÝ÷åé åëÜ÷éóôï ìÝóï E Vogel-Bonner êáé ãëõêüæç) êáé Üãáñ åðßóôñùóçò ðïõ ðåñéÝ÷åé éóôéäßíç êáé âéïôßíç Þ èñõðôïöÜíç ãéá íá ìðïñïýí íá ãßíïõí ìåñéêÝò êõôôáñé êÝò äéáéñÝóåéò (1)(2)(9). 1.5.1.3 MåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç Ôá âáêôÞñéá èá ðñÝðåé íá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ðáñïõóßá êáé áðïõóßá êáôÜëëçëïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôï óõíçèÝóôåñá ÷ñçóéìï ðïéïýìåíï óýóôçìá åßíáé Ýíá ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜóìá åìðëïõôéóìÝíï ìå óõìðáñÜãïíôá (S9) ðïõ ðáñáóêåõÜ ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1865 æåôáé áðü ôï Þðáñ ôñùêôéêþí ðïõ Ý÷åé õðïâëçèåß óå êá ôåñãáóßá ìå åíæõìïåðáãùãéêïýò ðáñÜãïíôåò üðùò ôï Aroclor 1254 (1)(2) Þ ìßãìá öáéíïâáñâéôüíçò êáé â-íá öèïöëáâüíçò (18)(20)(21). Ôï ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜ óìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞèùò óå óõãêåíôñþóåéò ôçò ôÜ îåùò ôïõ 5 Ýùò 30% v/v óôï S9-ìßãìá. Ç åðéëïãÞ êáé êá ôÜóôáóç åíüò óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò ìðïñåß íá åîáñôÜôáé áðü ôçí ôÜîç ôçò õðü äïêéìÞ ÷çìéêÞò ïõóßáò. Óå ïñéóìÝíåò ðåñéðôþóåéò ìðïñåß íá ÷ñåéÜæåôáé íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ðåñéóóüôåñåò áðü ìßá óõãêåíôñþ óåéò ìåôáìéôï÷ïíäñéáêïý êëÜóìáôïò. Óôçí ðåñßðôùóç ôùí áæù÷ñùìÜôùí êáé ôùí áæùåíþóåùí, ìðïñåß íá åßíáé êáëýôåñá íá ÷ñçóéìïðïéçèåß áíáãùãéêü óýóôçìá ìåôá âïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò (6)(13). 1.5.1.4 Õðü äïêéìÞ ïõóßá/ðñïåôïéìáóßá Ïé óôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé åöüóïí áðáéôåßôáé ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá ôùí âáêôçñßùí. Ïé õãñÝò ïõóßåò ìðïñïýí íá ðñïóôßèåíôáé áðåõèåßáò óôá óõóôÞìáôá äï êéìÞò êáé/Þ íá áñáéþíïíôáé ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá. ÐñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìá ôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôá èåñüôçôá ôçò ïõóßáò óôïé÷åßá åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïé ìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí. Äåí ðñÝðåé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñáóç ôïõ äéáëýôç/öïñÝá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá åíþ èá ðñÝðåé íá åßíáé óõìâáôüò ìå ôçí åðéâßùóç ôùí âá êôçñßùí êáé ôç äñáóôéêüôçôá S9 (22). Åöüóïí ï ÷ñçóéìï ðïéïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí áíÞêåé óôïõò ãíù óôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé÷åßùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. Óõíé óôÜôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá ç ÷ñÞ óç åíüò õäáôéêïý äéáëýôç/öïñÝá. ¼ôáí åîåôÜæïíôáé ïõ óßåò ðïõ äåí åßíáé óôáèåñÝò óôï íåñü, ïé ÷ñçóéìïðïéïý ìåíïé ïñãáíéêïß äéáëýôåò èá ðñÝðåé íá åßíáé áðáëëáãìÝíïé ýäáôïò. 1.5.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.5.2.1 Õðü äïêéìÞ óôåëÝ÷ç (âë. 1.5.1.1) 1.5.2.2 ÓõãêÝíôñùóç åêèÝóåùò Ìåôáîý ôùí êñéôçñßùí ðïõ ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðü øç ãéá ôïí êáèïñéóìü ôçò ìÝãéóôçò ãéá ÷ñÞóç ðïóüôçôáò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åßíáé ç êõôôáñïôïîéêüôçôá êáé ç äéá ëõôüôçôá óôï ôåëéêü ìßãìá êáôåñãáóßáò. Ìðïñåß íá åßíáé óêüðéìï íá ðñïóäéïñéóôåß ç ôïîéêüôç ôá êáé ç äõóäéáëõôüôçôá ìå ìßá ðñïêáôáñêôéêÞ äïêéìÞ. Ç êõôôáñïôïîéêüôçôá ìðïñåß íá âñåèåß áðü ôç ìåßùóç ôïõ áñéèìïý ôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí, ôï ìçäåíéóìü Þ ôçí åëÜôôùóç ôïõ õðïóôñþìáôïò Þ ôï âáèìü åðéâßùóçò ôùí åîåôáæïìÝíùí êáëëéåñãåéþí. Ç êõôôáñïôïîéêüôçôá ìéáò ïõóßáò ìðïñåß íá ìåôáâëçèåß ðáñïõóßá óõóôçìÜôùí ìå ôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ç äõóäéáëõôüôçôá èá ðñÝðåé íá åêôéìÜôáé ìå âÜóç ôçí ðôþóç éæÞìáôïò óôï ôåëéêü ìßã ìá õðü ôéò ðñáãìáôéêÝò óõíèÞêåò äïêéìÞò ðïõ åßíáé åì öáíÞò ìå ãõìíü ïöèáëìü. Ç óõíéóôþìåíç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç äïêéìÞò ãéá äéá ëõôÝò ìç êõôôáñïôïîéêÝò ïõóßåò åßíáé 5 mg/ôñõâëßï Þ 5 µl/ôñõâëßï. Ãéá ìç êõôôáñïôïîéêÝò ïõóßåò ðïõ äåí åßíáé äéáëõôÝò óå åðßðåäá óõãêåíôñþóåùò 5 mg/ôñõâëßï Þ 5 µl/ôñõâëßï, ìßá Þ ðåñéóóüôåñåò áðü ôéò ÷ñçóéìïðïéïýìå íåò óôç äïêéìÞ óõãêåíôñþóåéò èá ðñÝðåé íá êáèéóôïýí ôçí ïõóßá áäéÜëõôç óôï ôåëéêü ìßãìá êáôåñãáóßáò. Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ðïõ åßíáé êõôôáñïôïîéêÝò Þäç áðü åðßðåäá óõãêåíôñþóåùò êÜôù ôùí 5 mg/ôñõâëßï Þ 5 µl/ôñõâëßï èá ðñÝðåé íá õðïâÜëëïíôáé óôç äïêéìÞ ìÝ÷ñé ôïõ åðéðÝäïõ ôçò êõôôáñïôïîéêÞò óõãêÝíôñùóçò. Ôï ßæçìá äåí èá ðñÝ ðåé íá ðáñåìâáßíåé óôçí åêôßìçóç. Óôá áñ÷éêÜ ðåéñÜìáôá èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôïõëÜ÷éóôïí ðÝíôå äéáöïñåôéêÝò áíáëýóéìåò óõãêåíôñþ óåéò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ìå çìéëïãáñéèìéêÜ ðåñßðïõ äéáóôÞìáôá (äçë. √10) ìåôáîý ôùí óçìåßùí äïêéìÞò. ¼ôáí äéåñåõíÜôáé ç ó÷Ýóç óõãêÝíôñùóçò/áðüêñéóçò, ìðïñåß íá åßíáé óêüðéìï íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ìéêñüôåñá äéáóôÞ ìáôá. ¼ôáí áîéïëïãïýíôáé ïõóßåò ðïõ ðåñéÝ÷ïõí óçìá íôéêÝò ðïóüôçôåò äõíçôéêÜ ìåôáëëáîéãüíùí ðñïóìåßîå ùí, ìðïñåß íá åîåôáóôåß êáé ç äéåíÝñãåéá äïêéìÞò óå óõ ãêåíôñþóåéò ìåãáëýôåñåò áðü ôá 5 mg/ôñõâëßï Þ 5 µl/ôñõâëßï. 1.5.2.3 Áñíçôéêïß êáé èåôéêïß ìÜñôõñåò Óå êÜèå äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ðáñÜë ëçëá êáé êáëëéÝñãåéåò ìå åîåéäéêåõìÝíïõò ãéá ôï óôÝëå ÷ïò èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò (äéáëýôçò Þ öïñÝáò) ìÜñôõ ñåò. Èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé óõãêåíôñþóåéò èåôéêþí ìáñôýñùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôçí áðïôåëåóìáôéêüôçôá êÜèå äïêéìÞò. Óå äïêéìÝò óôéò ïðïßåò ÷ñçóéìïðïéåßôáé óýóôçìá ìåôá âïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò, ï Þ ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò áíáöï ñÜò èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé ìå âÜóç ôï åßäïò ôùí ÷ñç óéìïðïéïõìÝíùí âáêôçñéáêþí óôåëå÷þí. Ðáñáäåßãìáôá êáôÜëëçëùí èåôéêþí ìáñôýñùí ãéá äï êéìÝò ìå ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç áðïôåëïýí ïé ðáñá êÜôù ïõóßåò: 1866 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) Ç ðáñáêÜôù ïõóßá åßíáé Ýíáò êáôÜëëçëïò èåôéêüò ìÜñ ôõñáò ãéá ôç ìÝèïäï áíáãùãéêÞò ìåôáâïëéêÞò åíåñãï ðïßçóçò: Ôï 2-áìéíïáíèñáêÝíéï äåí èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ùò áðïêëåéóôéêüò äåßêôçò ôçò áðïôåëåóìáôéêüôçôáò ôïõ S9-ìßãìáôïò. ÅÜí ÷ñçóéìïðïéçèåß 2-áìéíïáíèñáêÝíéï, êÜèå ðáñôßäá S9 èá ðñÝðåé íá ÷áñáêôçñßæåôáé êáé ìå Ýíá ìåôáëëáîéãüíï ðïõ áðáéôåß ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç áðü ìéêñïóùìéêÜ Ýíæõìá, ð.÷. âåíæï[á]ðõñÝíéï, äéìåèõ ëïâåíæáíèñáêÝíéï. Ïé ïõóßåò ðïõ áêïëïõèïýí áðïôåëïýí ðáñáäåßãìáôá åîåéäéêåõìÝíùí êáôÜ óôÝëå÷ïò èåôéêþí ìáñôýñùí ãéá äï êéìÝò ðïõ åêôåëïýíôáé ÷ùñßò åîùãåíÝò óýóôçìá ìåôáâï ëéêÞò åíåñãïðïßçóçò: ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1867 Ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò êáôÜëëçëåò ïõóßåò áíáöïñÜò. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç äõíáôüôçôá ÷ñÞóçò ùò èåôéêþí ìáñôýñùí ïõóéþí ó÷åôéêÞò ÷çìéêÞò ôÜîçò. Èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò, áðïôåëïýìåíïé áðü ìüíï ôïí äéáëýôç Þ öïñÝá óôï ìÝóï, ÷ùñßò ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, êáé õðïâáëëüìåíïé óôçí ßäéá êáôåñãáóßá ìå åêåßíç ôùí õðü äïêéìÞ êáëëéåñãåéþí, Åðé ðëÝïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé ìç õðïâëçèÝ íôåò óå êáôåñãáóßá ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí ðñüôå ñá óôïé÷åßá ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéáëýôçò äåí åðéöÝñåé åðéâëáâÞ Þ ìåôáëëáîéãüíá áðïôåëÝóìáôá. 1.5.3 Äéáäéêáóßá Óôç ìÝèïäï ôçò ðñïóèÞêçò óå ôñõâëßï (1)(2)(3)(4), ÷ù ñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç, áíáìåéãíýïíôáé óõíÞèùò 0.05 ml Þ 0.1 ml ôùí äéáëõìÜôùí äïêéìÞò, 0.1 ml ðñüóöá ôçò âáêôçñéáêÞò êáëëéÝñãåéáò (ðïõ ðåñéÝ÷åé ðåñßðïõ 108 âéþóéìá êýôôáñá) êáé 0.5 ml óôåßñïõ ñõèìéóôéêïý äéáëý ìáôïò ìå 2.0 ml Üãáñ åðéóôñþóåùò. Óôç äïêéìÞ ìå ìåôá âïëéêÞ åíåñãïðïßçóç, áíáìåéãíýïíôáé óõíÞèùò 0.5 ml ìßã ìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò ðïõ ðåñéÝ÷åé êáôÜëëç ëç ðïóüôçôá ìåôáìéôï÷ïíäñéáêïý êëÜóìáôïò (ôçò ôÜîåùò ôïõ 5 Ýùò 30% v/v óôï ìßãìá ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò) ìå ôï Üãáñ åðéóôñþóåùò (2.0 ml), ìáæß ìå ôá âáêôÞñéá êáé ôçí ïõóßá äïêéìÞò/äéÜëõìá äïêéìÞò. Ôï ðåñéå÷üìåíï êÜèå óùëÞíá áíáêáôåýåôáé êáé öÝñåôáé óôçí åðéöÜíåéá ôñõâëß ïõ ìå åëÜ÷éóôï Üãáñ. Ôï Üãáñ åðéóôñþóåùò áöÞíåôáé íá óôåñåïðïéçèåß ðñéí áðü ôçí åðþáóç. Óôç ìÝèïäï ôçò ðñïåðùÜóåùò (2)(3)(5)(6), ç ïõóßá äï êéìÞò/äéÜëõìá äïêéìÞò ðñïåðùÜæåôáé ìå ôï õðü äïêéìÞ óôÝëå÷ïò (ðïõ ðåñéÝ÷åé ðåñßðïõ 108 âéþóéìá êýôôáñá) êáé óôåßñï ñõèìéóôéêü äéÜëõìá Þ ôï óýóôçìá ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò (0.5 ml) óõíÞèùò ãéá 20 min. Þ êáé ðåñéó óüôåñï óôïõò 30-37°C ðñéí íá áíáìåé÷èåß ìå ôï Üãáñ åðé óôñþóåùò êáé íá åðéóôñùèåß óôçí åðéöÜíåéá ôñõâëßïõ ìå åëÜ÷éóôï Üãáñ. ÓõíÞèùò, 0.05 Þ 0.1 ml ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò/äéáëýìáôïò äïêéìÞò, 0.1 ml âáêôçñßùí êáé 0.5 ml S9 ìßãìáôïò Þ óôåßñïõ ñõèìéóôéêïý áíáìåéãíýïíôáé ìå 2,0 ml Üãáñ åðéóôñþóåùò. Ïé óùëÞíåò, êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò ðñùåðþáóçò, èá ðñÝðåé íá áåñßæïíôáé ìå ôç ÷ñÞóç áíá ôáñÜêôç. Ãéá ôç óùóôÞ åêôßìçóç ôçò äéáêýìáíóçò, óå êÜèå åðß ðåäï äüóåùò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ôñéðëÞ åðß óôñùóç. Åöüóïí áéôéïëïãåßôáé åðéóôçìïíéêþò, ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß êáé äéðëÞ åðßóôñùóç. Ôõ÷áßá áðþ ëåéá ôñõâëßïõ äåí êáèéóôÜ êáô' áíÜãêç Üêõñç ôç äïêé ìÞ. ÁÝñéåò Þ ðôçôéêÝò ïõóßåò èá ðñÝðåé íá õðïâÜëëïíôáé óå äïêéìÞ ìå êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò, üðùò ð.÷. óå óöñáãé óìÝíá äï÷åßá (12)(14)(15)(16). 1.5.4 Åðþáóç ¼ëá ôá ôñõâëßá óå ìßá äåäïìÝíç äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá åðùÜæïíôáé óôïõò 37°C ãéá 48-72 þñåò. ÌåôÜ ôçí ðåñßï äï åðþáóçò, ìåôñÜôáé ï áñéèìüò ôùí áíÜóôñïöùí áðïé êéþí áíÜ ôñõâëßï. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 Åðåîåñãáóßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí Ôá äåäïìÝíá èá ðñÝðåé íá ðáñïõóéÜæïíôáé ùò ï áñéè ìüò ôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí áíÜ ôñõâëßï. Èá ðñÝðåé åðßóçò íá äßíåôáé êáé ï áñéèìüò ôùí áíÜóôñïöùí áðïé êéþí óôá ôñõâëßá ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêáí ùò áñíçôéêüò (äéáëýôçò-ìÜñôõñáò êáé ìç õðïâëçèåßò óå êáôåñãáóßá ìÜñôõñáò, åöüóïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé) êáé èåôéêüò ìÜñôõ ñáò.Ãéá ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá êáèþò êáé ãéá ôïí èåôéêü êáé áñíçôéêü (ìç êáôåñãáóèåßò êáé/Þ äéáëýôçò) ìÜñôõñá èá ðñÝðåé íá äßíïíôáé óôïé÷åßá ìå ôïõò åðéìÝñïõò êáôÜ ôñõ âëßï áñéèìïýò, ôï ìÝóï áñéèìü ôùí áíÜóôñïöùí áðïé êéþí áíÜ ôñõâëßï êáé ôçí ôõðéêÞ áðüêëéóç. Äåí áðáéôåßôáé åðáëÞèåõóç ôùí óáöþí èåôéêþí áðï êñßóåùí. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá áðïóáöçíßæïíôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò ôñïðïðïéþ íôáò êáôÜ ðñïôßìçóç ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Ôá áñ íçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá ðñÝðåé íá åðéâåâáéþíïíôáé êáôÜ ðå ñßðôùóç . Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ äåí èåùñåßôáé áíáãêáßá ç åðéâåâáßùóç ôùí áñíçôéêþí áðïôåëåóìÜôùí, èá ðñÝðåé íá ðáñÝ÷åôáé ó÷åôéêÞ áéôéïëüãçóç. Óôá åðáíáëçðôéêÜ ðåé ñÜìáôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ôñïðïðïßçóç ôùí ðá ñáìÝôñùí ôçò äïêéìÞò þóôå íá êáëýðôïõí üëç ôçí Ýêôá óç ôùí åêôéìïýìåíùí óõíèçêþí. Óôéò ðáñáìÝôñïõò ðïõ ìðïñïýí íá ôñïðïðïéçèïýí ðåñéëáìâÜíåôáé ôï åýñïò ôçò óõãêÝíôñùóçò, ç ìÝèïäïò êáôåñãáóßáò (ðñïóèÞêç óå ôñõâëßï Þ ðñïåðþáóç óå õãñü ðåñéâÜëëïí) êáé ïé óõí èÞêåò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß Ýíá áðïôÝëåóìá ùò èåôéêü åöáñìüæï íôáé äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôçí óõãêÝ íôñùóç áýîçóç óôçí ðåñéï÷Þ äïêéìÞò êáé/Þ ìßá áíáðá ñáãþãéìç áýîçóç õðü ìßá Þ ðåñéóóüôåñåò óõãêåíôñþ óåéò óôïí áñéèìü ôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí áíÜ ôñõâëßï óå Ýíá ôïõëÜ÷éóôïí óôÝëå÷ïò ìå Þ ÷ùñßò óýóôçìá ìåôá âïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò (23). Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ðñþôá ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí áðïôåëåóìÜôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêé ìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèï äïé [24]. Åíôïýôïéò, óå ìßá èåôéêÞ áðüêñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäéêüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôéóôéêÞ óçìáíôéêüôçôá. Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîéãüíïò óôï óýóôçìá áõôü. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôç äïêéìÞ âáêôçñéáêÞò áíÜ óôñïöçò ìåôÜëëáîçò äåß÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åðÜãåé óçìåéáêÝò ìåôáëëÜîåéò ìå õðïêáôáóôÜóåéò âÜóå ùí Þ áëëáãÝò ðëáéóßïõ óôï ãïíéäßùìá ôçò Salmonella typhimurium êáé/Þ Escherichia coli . ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝ óìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åßíáé ìåôáëëáîéãüíïò óôï åîåôáæüìåíï åßäïò. 3. ÅÊÈÅÓÇ ÁÍÁÖÏÑÁÓ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõ èá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ äéáëýôç/öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, ÓôåëÝ÷ç: � ÷ñçóéìïðïéçèÝíôá óôåëÝ÷ç, � áñéèìü êõôôÜñùí áíÜ êáëëéÝñãåéá, � ÷áñáêôçñéóôéêÜ ôùí óôåëå÷þí. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � ðïóüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò áíÜ ôñõâëßï (mg/ôñõâëßï Þ ìl/ôñõâëßï) ìå áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôçò äüóåùò êáé ôïõ áñéèìïý ôùí ôñõâëßùí áíÜ óõãêÝ íôñùóç, � ÷ñçóéìïðïéçèÝí èñåðôéêü ìÝóï, � ôýðï êáé óýóôáóç ôïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñ ãïðïßçóçò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé ôùí êñéôçñßùí áðïäï÷Þò, � äéáäéêáóßåò êáôåñãáóßáò. ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � óçìÜäéá êáèßæçóçò, � åðéìÝñïõò êáôÜ ôñõâëßï áðïôåëÝóìáôá ìåôñÞóåùí, � ôï ìÝóï áñéèìü ôùí áíÜóôñïöùí áðïéêéþí áíÜ ôñõ âëßï êáé ôçí ôõðéêÞ áðüêëéóç, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò. � ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364. 2. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215. 3. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Ki er, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, 217-233. 4. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, 69-240. 5. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Muta genicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 91-96. 6. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems 1868 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285. 7. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. 8. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 167-177. 9. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, 33-42. 10. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., El sevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. 11. Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Exam ination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagen esis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmen tal Mutagenesis, 3, 453-465. 12. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mu tation Res., 307, 335-344. 13. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, 33-47. 14. Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Env iron. Mol. Mutagen., 19, 2-141. 15. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. 16. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, 421-441. 17. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawa mura, M., and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, 3780-3782. 18. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glyco sides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4961-4965. 19. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, 285-291. 20 .Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: "In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing" Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. 21. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gate house, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177. 22 .Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88 343-350. 23. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, 83-91. 24. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analy sis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirk land, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65. ÐáñÜñôçìá 2E B. 17. ÌÅÔÁËËÁÎÉÃÅÍÅÓÇ- IN VITRO ÄÏÊÉÌÇ ÊÕÔÔÁÑÉÊÇÓ ÃÏÍÉÄÉÁÊÇÓ ÌÅÔÁËËÁÎÇÓ ÓÅ ÈÇËÁÓÔÉÊÁ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Ç in vitro äïêéìÞ êõôôáñéêÞò ãïíéäéáêÞò ìåôÜëëáîçò óôá èçëáóôéêÜ ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ãéá ôçí áíß÷íåõ óç ãïíéäéáêþí ìåôáëëÜîåùí ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ÷çìé êÝò ïõóßåò. Óôéò êáôÜëëçëåò êõôôáñéêÝò óåéñÝò ðåñéëáì âáíïíôáé L5178Y ëåìöùìáôéêÜ êýôôáñá ðïíôéêïý, ïé CHO, CHO-AS52 êáé V79 óåéñÝò êõôôÜñùí êéíÝæéêïõ êñé êçôïý êáé TK6 áíèñþðéíá ëåìöïâëáóôïåéäÞ êýôôáñá (1). Óôéò êõôôáñéêÝò áõôÝò óåéñÝò ôá óõíçèÝóôåñá ÷ñçóéìï ðïéïýìåíá ãåíåôéêÜ ôåëéêÜ óçìåßá ìåôñïýí ìåôÜëëáîç óå èõìéäéíï êéíÜóç (ÔÊ) êáé öùóöïñéâïæõëï ôñáíóöåñÜóç õðïîáíèßíçò-ãïõáíßíçò (HPRT) êáèþò êáé Ýíá äéáãïíßäéï öùóöïñéâïæõëï ôñáíóöåñÜóçò îáíèßíçò-ãïõáíßíçò (XPRT). Ïé äïêéìÝò ìåôÜëëáîçò TK, HPRT êáé XPRT áíé ÷íåýïõí äéÜöïñá öÜóìáôá ãåíåôéêþí óõìâÜíôùí. Ôï ãå ãïíüò üôé ïé TK êáé XPRT âñßóêïíôáé óå áõôïóþìáôá ìðï ñåß íá åðéôñÝøåé ôçí áíß÷íåõóç ãåíåôéêþí óõìâÜíôùí (ð.÷. ìåãÜëåò áðáëåßøåéò) ðïõ äåí áíé÷íåýïíôáé óôï ãåíåôéêü ôüðï HPRT óå X-÷ñùìïóþìáôá (2)(3)(4)(5)(6). Óôçí in vitro äïêéìÞ êõôôáñéêÞò ãïíéäéáêÞò ìåôÜëëáîçò óå èçëáóôéêÜ, ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáëëéÝñãåé åò êáèéåñùìÝíùí êõôôáñéêþí óåéñþí Þ êõôôáñéêþí óôå ëå÷þí. Ôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá êýôôáñá åðéëÝãïíôáé ìå âÜ óç ôçí éêáíüôçôá áíÜðôõîÞò ôïõò óå êáëëéÝñãåéá êáé ôç óôáèåñüôçôá ôçò óõ÷íüôçôáò áõèüñìçôçò ìåôÜëëáîçò. Óôéò äïêéìÝò ðïõ äéåîÜãïíôáé in vitro áðáéôåßôáé åí ãÝíåé ç ÷ñÞóç åîùãåíïýò ðçãÞò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôï óýóôçìá áõôü ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò äåí ìðï ñåß íá ìéìçèåß åî ïëïêëÞñïõ ôéò in vivo óõíèÞêåò ôùí èç ëáóôéêþí. ÐñÝðåé íá ëáìâÜíåôáé ðñüíïéá þóôå íá áðï öåýãïíôáé óõíèÞêåò ðïõ ìðïñåß íá ïäçãÞóïõí óôç ëÞøç áðïôåëåóìÜôùí ôá ïðïßá äåí áíôéðñïóùðåýïõí åããåíÞ ìåôáëëáîéãÝíåóç. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá ðïõ äåí áíôéêá ôïðôñßæïõí åããåíÞ ìåôáëëáîéãÝíåóç ìðïñåß íá ðñïÝñ÷ï íôáé áðü áëëáãÝò óôï pH, ôçí ïóìùìïñéáêüôçôá Þ õøçëÜ åðßðåäá êõôôáñïôïîéêüôçôáò (7). Ç ðáñïýóá äïêéìÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí åíôïðéóìü ðéèáíþí ìåôáëëáîéãüíùí êáé êáñêéíïãüíùí óôá èçëáóôé ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1869 êÜ. ÐïëëÝò åíþóåéò ðïõ åìöáíßæïíôáé èåôéêÝò óôçí ðá ñïýóá äïêéìÞ åßíáé êáñêéíïãüíåò ãéá ôá èçëáóôéêÜ. Åíôïýôïéò, äåí õðÜñ÷åé áðüëõôç óõó÷Ýôéóç ìåôáîý áõôÞò ôçò äïêéìÞò êáé ôïõ öáéíïìÝíïõ ôçò êáñêéíïãÝíåóçò. Ç óõó÷Ýôéóç åîáñôÜôáé áðü ôç ÷çìéêÞ ôÜîç êáé õðÜñ÷ïõí áýîïõóåò åíäåßîåéò üôé õðÜñ÷ïõí êáñêéíïãüíá ðïõ äåí áíé÷íåýïíôáé áðü ôç äïêéìÞ áõôÞ ãéáôß äñïõí ìÝóù Üë ëùí, ìç ãïíïôïîéêþí ìç÷áíéóìþí Þ ìç÷áíéóìþí ðïõ áðïõóéÜæïõí óôá âáêôçñéáêÜ êýôôáñá (6). Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ åéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ÅîåëéêôéêÞ ìåôÜëëáîç: ãïíéäéáêÞ ìåôÜëëáîç áðü ôï ãï íéêü ôýðï ðñïò ôï ðñïúüí ìåôÜëëáîçò ðïõ ðñïêáëåß áë ëïßùóç Þ áðþëåéá ôçò åíæõìáôéêÞò äñáóôéêüôçôáò ôçò ëåéôïõñãßáò ôçò êùäéêïðïéçìÝíçò ðñùôåÀíçò. Ìåôáëëáîéãüíá õðïêáôÜóôáóçò æåõãþí âÜóåùí: ïõ óßåò ðïõ ðñïêáëïýí õðïêáôÜóôáóç åíüò Þ ðåñéóóïôÝ ñùí æåõãþí âÜóåùí óôï DNA. Ìåôáëëáîéãüíá áëëáãÞò ðëáéóßïõ: Ïõóßåò ðïõ ðñïêá ëïýí ðñïóèÞêç Þ áðÜëåéøç åíüò Þ ðïëëþí æåõãþí âÜóå ùí óôï ìüñéï DNA. ×ñüíïò öáéíïôõðéêÞò Ýêöñáóçò: ðåñßïäïò êáôÜ ôçí ïðïßá ìç áëëïéùìÝíá ãïíéäéáêÜ ðñïúüíôá õößóôáíôáé ìåß ùóç áðü íåùóôß ìåôáëëáãìÝíá êýôôáñá. Óõ÷íüôçôá ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò: ï áñéèìüò ôùí ðá ñáôçñïõìÝíùí ìåôáëëáãìÝíùí êõôôÜñùí äéá ôïõ áñéè ìïý âéþóéìùí êõôôÜñùí. Ó÷åôéêÞ óõíïëéêÞ áíÜðôõîç: áýîçóç ôïõ áñéèìïý ôùí êõôôÜñùí ìå ôï ÷ñüíï óå óýãêñéóç ìå Ýíá êõôôáñéêü ðëç èõóìü-ìÜñôõñá. Õðïëïãßæåôáé ùò ôï ãéíüìåíï ôçò áíÜ ðôõîçò åíáéùñÞìáôïò óå ó÷Ýóç ìå ôïí áñíçôéêü ìÜñôõñá åðß ôçí áðïôåëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò óå ó÷Ýóç ìå ôïí áñíçôéêü ìÜñôõñá. Ó÷åôéêÞ áíÜðôõîç åíáéùñÞìáôïò: áýîçóç ôïõ áñéèìïý ôùí êõôôÜñùí êáôÜ ôçí ðåñßïäï Ýêöñáóçò óå ó÷Ýóç ìå ôïí áñíçôéêü ìÜñôõñá. Âéùóéìüôçôá: ç áðïôåëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò ôùí êáôåñãáóìÝíùí êõôôÜñùí óôï ÷ñüíï ôçò åðßóôñù óçò óå ôñõâëßï õðü åðéëåêôéêÝò óõíèÞêåò ìåôÜ ôçí ðå ñßïäï Ýêöñáóçò. Åðéâßùóç: ç áðïôåëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò ôùí êáôåñãáóìÝíùí êõôôÜñùí üôáí åðéóôñþíïíôáé óå ôñõ âëßï óôï ôÝëïò ôçò ðåñéüäïõ êáôåñãáóßáò. Ç åðéâßùóç åê öñÜæåôáé óõíÞèùò óå ó÷Ýóç ìå ôçí åðéâßùóç ôïõ êõôôá ñéêïý ðëçèõóìïý-ìÜñôõñá. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ Ôá êýôôáñá ðïõ ðáñïõóéÜæïõí Ýëëåéøç èõìéäéíï êéíÜ óçò (TK) ëüãù ôçò ìåôÜëëáîçò TK+/- -> TK-/- ðáñïõóéÜæïõí áíôßóôáóç óôçí êõôôáñïôïîéêÞ åðßäñáóç ôïõ ðõñéìéäéíé êïý áíáëüãïõ ôñéöèïñïèõìéäßíç (TFT). Ôá êýôôáñá ìå èõìéäéíï êéíÜóç åßíáé åõáßóèçôá óôçí TFT, ðñÜãìá ôï ïðïßï åìðïäßæåé ôïí êõôôáñéêü ìåôáâïëéóìü êáé óôáìáôÜ åé ôçí ðåñáéôÝñù êõôôáñéêÞ äéáßñåóç. 'Åôóé, ôá ìåôáëëáã ìÝíá êýôôáñá ìðïñïýí íá ðïëëáðëáóéÜæïíôáé ðáñïõóßá TFT, åíþ ôá êáíïíéêÜ êýôôáñá, ôá ïðïßá ðåñéÝ÷ïõí èõìé äéíïêéíÜóç, äåí ìðïñïýí. Ïìïßùò, êýôôáñá ôá ïðïßá ðá ñïõóéÜæïõí Ýëëåéøç óå HPRT Þ XPRT åðéëÝãïíôáé åðåéäÞ ðáñïõóéÜæïõí áíôßóôáóç óôçí 6-èåéïãïõáíßíç (TG) Þ 8 áæáãïõáíßíç (AG). ÅÜí óå êÜðïéá áðü ôéò äïêéìÝò êõôôá ñéêÞò ãïíéäéáêÞò ìåôÜëëáîçò óå èçëáóôéêÜ õðïâÜëëåôáé óå äïêéìÞ áíÜëïãç âÜóç Þ Ýíùóç ó÷åôéêÞ ìå ôïí ðáñÜãï íôá åðéëïãÞò, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæïíôáé ðñïóåêôéêÜ ïé éäéüôçôåò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ãéá ðáñÜäåéãìá, èá ðñÝðåé íá äéåñåõíÜôáé ïðïéáäÞðïôå ôõ÷üí õðüíïéá åðéëå êôéêÞò ôïîéêüôçôáò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò Ýíáíôé ôùí ìå ôáëëáãìÝíùí êáé ìç êõôôÜñùí. ÊáôÜ ôçí õðïâïëÞ ëïéðüí óå äïêéìÞ ÷çìéêþí ïõóéþí ðïõ Ý÷ïõí ó÷Ýóç áðü ðëåõñÜò äïìÞò ìå ôïí ðáñÜãïíôá åðéëïãÞò, èá ðñÝðåé íá åðéâå âáéþíåôáé ç áðüäïóç ôïõ óõóôÞìáôïò åðéëïãÞò/ðáñÜãï íôá (8). Ôá õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò Þ ìïíïóôñùìáôéêÞò êáë ëéÝñãåéáò êýôôáñá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç, ãéá êáôÜëëçëï ÷ñï íéêü äéÜóôçìá êáé êáôüðéí öÝñïíôáé óå õðïêáëëéÝñãåéåò ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé ãéá íá åðéôñáðåß ç öáéíïôõðéêÞ Ýêöñáóç ðñéí áðü ôçí åðéëïãÞ ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò (9)(10)(11)(12)(13). Ç êõôôá ñïôïîéêüôçôá ðñïóäéïñßæåôáé óõíÞèùò ìåôñþíôáò ôç ó÷åôéêÞ áðïôåëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò (åðéâßùóç) Þ ôç ó÷åôéêÞ óõíïëéêÞ áíÜðôõîç ôùí êáëëéåñãåéþí ìåôÜ ôçí ðåñßïäï êáôåñãáóßáò. Ïé êáôåñãáæüìåíåò êáëëéÝñãåéåò äéáôçñïýíôáé óå èñåðôéêü ìÝóï ãéá éêáíü ÷ñïíéêü äéÜóôç ìá ðïõ åßíáé ÷áñáêôçñéóôéêü ãéá êÜèå åðéëåãüìåíï ãåíå ôéêü ôüðï êáé êõôôáñéêü ôýðï, þóôå íá ìðïñÝóåé íá åðé ôåõ÷èåß ç Üñéóôç äõíáôÞ öáéíïôõðéêÞ Ýêöñáóç ôùí ðñï êëçèåéóþí ìåôáëëÜîåùí. Ç óõ÷íüôçôá ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò ðñïóäéïñßæåôáé áíáêáëëéåñãþíôáò ãíù óôïýò áñéèìïýò êõôôÜñùí óå èñåðôéêü ìÝóï ðïõ ðåñéÝ÷åé ôïí ðáñÜãïíôá åðéëïãÞò ãéá ôçí áíß÷íåõóç ìåôáëëáãìÝ íùí êõôôÜñùí êáé óå èñåðôéêü ìÝóï ÷ùñßò ðáñÜãïíôá åðé ëïãÞò ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò áðïôåëåóìáôéêüôçôáò êëùíïðïßçóçò (âéùóéìüôçôá). 'Åðåéôá áðü êáôÜëëçëï ÷ñüíï åðùÜóåùò, ìåôñþíôáé ïé áðïéêßåò. Ç óõ÷íüôçôá ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò åîÜãåôáé áðü ôïí áñéèìü ôùí ìåôáëëáãìÝíùí áðïéêéþí óôï ìÝóï åðéëïãÞò êáé ôïí áñéè ìü ôùí áðïéêéþí óå ìç åðéëåêôéêü ìÝóï. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 Êýôôáñá ÕðÜñ÷ïõí äéÜöïñïé êõôôáñéêïß ôýðïé ðïõ ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí óôç äïêéìÞ áõôÞ, óôïõò ïðïßïõò ðåñé ëáìâÜíïíôáé õðïêëþíïé ôùí L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 Þ TK6 êõôôÜñùí. Ïé êõôôáñéêïß ôýðïé ðïõ ÷ñçóéìï ðïéïýíôáé óôç äïêéìÞ áõôÞ èá ðñÝðåé íá Ý÷ïõí áðïäå äåéãìÝíç åõáéóèçóßá óå ÷çìéêÜ ìåôáëëáîéãüíá, õøçëÞ áðïôåëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò êáé óôáèåñÞ áõ èüñìçôç óõ÷íüôçôá ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò. Ôá êýôôáñá èá ðñåðåé íá åëÝã÷ïíôáé ãéá ôõ÷üí ðáñïõóßá ìõêïðëÜ óìáôïò êáé åöüóïí åßíáé ìïëõóìÝíá íá ìç ÷ñçóéìïðïé ïýíôáé. Ç äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ó÷åäéÜæåôáé Ýôóé þóôå íá Ý÷åé ðñïêáèïñéóìÝíç åõáéóèçóßá êáé éó÷ý. Ï áñéèìüò ôùí êõô ôÜñùí, ïé êáëëéÝñãåéåò êáé ïé óõãêåíôñþóåéò ôçò õðü äï êéìÞ ïõóßáò èá ðñÝðåé íá áíôéêáôïðôñßæïõí áõôÝò ôéò êá èïñéóìÝíåò ðáñáìÝôñïõò (14). Ï åëÜ÷éóôïò áñéèìüò âéþ óéìùí êõôôÜñùí ðïõ åðéæïýí ôçò êáôåñãáóßáò êáé ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óå êÜèå óôÜäéï ôçò äïêéìÞò èá ðñÝðåé íá âáóßæåôáé óôç óõ÷íüôçôá áõèüñìçôçò ìåôÜëëáîçò. ´Åíáò ãåíéêüò êáíüíáò åßíáé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé áñéèìüò êõôôÜñùí ðïõ íá åßíáé ôïõëÜ÷éóôïí äåêáðëÜóéïò ôïõ áíôéóôñüöïõ ôçò óõ÷íüôçôáò áõèüñìçôçò ìåôÜëëáîçò. ÓõíéóôÜôáé ðÜíôùò íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôïõëÜ÷éóôïí 106 êýôôáñá. Èá ðñÝðåé íá õðÜñ÷åé éóôïñéêü êáôÜëëçëùí óôïé÷åßùí ãéá ôï ÷ñçóéìïðïéïýìåíï êõôôáñéêü óýóôçìá ðïõ íá áðïäåéêíýåé ôç óõíåðÞ áðïäïôéêüôçôá ôçò äïêé ìÞò. 1870 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1.4.1.2 ÈñåðôéêÜ ìÝóá êáé óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáôÜëëçëá ìÝóá êáë ëéÝñãåéáò êáé óõíèÞêåò åðùÜóåùò (äï÷åßá êáëëéÝñãåéáò, èåñìïêñáóßá, óõãêÝíôñùóç CO2 êáé õãñáóßá). Ôá èñå ðôéêÜ ìÝóá èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé áíÜëïãá ìå ôá óõ óôÞìáôá åðéëïãÞò êáé ôïí êõôôáñéêü ôýðï ðïõ ÷ñçóéìï ðïéïýíôáé óôç äïêéìÞ. Ðáßæåé óçìáíôéêü ñüëï ïé óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò íá åðéëÝãïíôáé Ýôóé þóôå íá äéáóöáëßæåôáé ç Üñéóôç áíÜðôõîç ôùí êõôôÜñùí êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò ðåñéüäïõ åêöñÜóåùò êáé ç éêáíüôçôá ó÷çìáôéóìïý áðïé êéþí ìåôáëëáãìÝíùí êáé ìç êõôôÜñùí. 1.4.1.3 Ðñïåôïéìáóßá ôùí êáëëéåñãåéþí Ôá êýôôáñá ðïëëáðëáóéÜæïíôáé áðü Ýôïéìåò êáëëéÝñ ãåéåò, áíáêáëëéåñãïýíôáé óå èñåðôéêü ìÝóï êáé åðùÜæï íôáé óôïõò 37°C. Ðñéí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí óôç äïêéìÞ áõôÞ, ïé êáëëéÝñãåéåò åíäÝ÷åôáé íá ÷ñåéÜæåôáé íá êáèáñé óôïýí áðü ðñïûðÜñ÷ïíôá ìåôáëëáãìÝíá êýôôáñá. 1.4.1.4 ÌåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç Ôá êýôôáñá èá ðñÝðåé íá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ðáñïõóßá êáé áðïõóßá êáôÜëëçëïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. Ôï óõíçèÝóôåñá ÷ñçóéìï ðïéïýìåíï óýóôçìá åßíáé Ýíá ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜóìá åìðëïõôéóìÝíï ìå óõìðáñÜãïíôá (S9) ðïõ ðáñáóêåõÜ æåôáé áðü Þðáñ ôñùêôéêþí ðïõ Ý÷åé õðïâëçèåß óå êáôåñ ãáóßá ìå åíæõìïåðáãùãéêïýò ðáñÜãïíôåò üðùò : Aroclor 1254 (15)(16)(17)(18) Þ ìßãìá öáéíïâáñâéôüíçò êáé â-íá öèïöëáâüíçò (19)(20). Ôï ìåôáìéôï÷ïíäñéáêü êëÜóìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞ èùò óå óõãêåíôñþóåéò ôçò ôÜîåùò ôïõ 1-10% v/v óôï ôå ëéêü ìÝóï äïêéìÞò. Ç åðéëïãÞ êáé êáôÜóôáóç åíüò óõóôÞ ìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò ìðïñåß íá åîáñôÜôáé áðü ôçí ôÜîç ôçò õðü äïêéìÞ ÷çìéêÞò ïõóßáò. Óå ïñéóìÝ íåò ðåñéðôþóåéò ìðïñåß íá ÷ñåéÜæåôáé íá ÷ñçóéìïðïéç èïýí ðåñéóóüôåñåò áðü ìßá óõãêåíôñþóåéò ìåôáìéôï÷ïí äñéáêïý êëÜóìáôïò. Ìå ïñéóìÝíåò áëëáãÝò, óôéò ïðïßåò ðåñéëáìâÜíåôáé êáé ç ðáñáóêåõÞ åðåîåñãáóìÝíùí ìå ìåèüäïõò ãåíåôéêÞò ìç÷áíéêÞò êõôôáñéêþí óåéñþí ðïõ åêöñÜæïõí åéäéêÜ åíåñãïðïéçôéêÜ Ýíæõìá, åíäÝ÷åôáé íá ìðïñåß íá ãßíåé êáé åíäïãåíÞò åíåñãïðïßçóç. Ç åðéëïãÞ ôùí ÷ñçóéìïðïéïõ ìÝíùí êõôôáñéêþí óåéñþí ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé åðéóôç ìïíéêþò (ð.÷. áðü ôç ó÷Ýóç ôïõ êõôï÷ñùìéêïý P450 éóï åíæýìïõ óôï ìåôáâïëéóìü ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò). 1.4.1.5 Õðü äïêéìÞ ïõóßá/Ðñïåôïéìáóßá Ïé óôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé åöüóïí áðáéôåßôáé ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá ôùí êõôôÜñùí. Ïé õãñÝò ïõóßåò ìðïñïýí íá ðñïóôßèåíôáé áðåõèåßáò óôá óõóôÞìáôá äï êéìÞò êáé/Þ íá áñáéþíïíôáé ðñéí áðü ôçí êáôåñãáóßá. ÐñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìá ôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôá èåñüôçôá ôçò ïõóßáò óôïé÷åßá åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïé ìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí. 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Äåí ðñÝðåé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñáóç ôïõ äéáëýôç/öïñÝá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá åíþ èá ðñÝðåé íá åßíáé óõìâáôüò ìå ôçí åðéâßùóç ôùí êõô ôÜñùí êáé ôç äñáóôéêüôçôá S9. Åöüóïí ï ÷ñçóéìïðïéïý ìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí áíÞêåé óôïõò ãíùóôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé÷åß ùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. ÓõíéóôÜôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá ç ÷ñÞóç åíüò õäáôéêïý äéáëýôç/öïñÝá. ¼ôáí åîåôÜæïíôáé ïõóßåò ðïõ äåí åßíáé óôáèåñÝò óôï íåñü, ïé ÷ñçóéìïðïéïýìåíïé ïñ ãáíéêïß äéáëýôåò èá ðñÝðåé íá åßíáé áðáëëáãìÝíïé ýäá ôïò. Ôï íåñü ìðïñåß íá áöáéñåèåß ìå ôçí ðñïóèÞêç ìï ñéáêïý êïóêßíïõ. 1.4.2.2 Óõãêåíôñþóåéò åêèÝóåùò Ìåôáîý ôùí êñéôçñßùí ðïõ ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðü øç üôáí êáèïñßæåôáé ç ìÝãéóôç ðñïò ÷ñÞóç óõãêÝíôñùóç åßíáé ç êõôôáñïôïîéêüôçôá, ç äéáëõôüôçôá óôï óýóôçìá äïêéìÞò êáé ïé ìåôáâïëÝò óôï pH Þ ôçí ïóìùìïìïñéáêü ôçôá. Ç êõôôáñïôïîéêüôçôá èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç óôï êýñéï ðåßñáìá ÷ñçóéìïðïéþíôáò ìßá êáôÜëëçëç Ýíäåéîç ôçò áêåñáéüôç ôáò êáé áíÜðôõîçò ôùí êõôôÜñùí üðùò ç ó÷åôéêÞ áðïôå ëåóìáôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò (åðéâßùóç) Þ ç ó÷åôéêÞ óõ íïëéêÞ áíÜðôõîç. ×ñÞóéìï ìðïñåß íá åßíáé ï ðñïóäéïñé óìüò ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé äéáëõôüôçôáò íá ãßíåé óå Ýíá ðñïêáôáñêôéêü ðåßñáìá. Ãéá ôçí áíÜëõóç èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôÝó óåñéò ôïõëÜ÷éóôïí óõãêåíôñþóåéò. Åöüóïí åìöáíßæïíôáé öáéíüìåíá êõôôáñïôïîéêüôçôáò, ïé óõãêåíôñþóåéò áõôÝò èá ðñÝðåé íá êáëýðôïõí ìßá ðåñéï÷Þ áðü ôç ìÝãéóôç ìÝ÷ñé ìéêñÞ Þ êáé ìçäåíéêÞ ôïîéêüôçôá. Áõôü óçìáßíåé óõíÞèùò üôé ïé óõãêåíôñþóåéò äåí èá ðñÝðåé íá äéáöÝñïõí ðåñéó óüôåñï áðü Ýíá óõíôåëåóôÞ ìåôáîý 2 êáé √10. Åöüóïí ç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç âáóßæåôáé óôçí êõôôáñïôïîéêüôç ôá, èá ðñÝðåé íá Ý÷åé ùò áðïôÝëåóìá Ýíá ðïóïóôü 10 20% (ü÷é üìùò ëéãüôåñï áðü 10%) ó÷åôéêÞò åðéâßùóçò (ó÷åôéêÞò áðïôåëåóìáôéêüôçôáò êëùíïðïßçóçò) Þ ó÷åôé êÞò óõíïëéêÞò áíÜðôõîçò. Ãéá ó÷åôéêþò ìç êõôôáñïôïîé êÝò ïõóßåò, ç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç äïêéìÞò èá ðñÝðåé íá åßíáé 5 µl/ml, 5 mg/ml Þ 0.01 M, üðïéá áðü ôéò ôñåéò åßíáé ÷áìçëüôåñç. Ó÷åôéêÜ áäéÜëõôåò ïõóßåò èá ðñÝðåé íá õðïâÜëëïíôáé óå äïêéìÞ ìÝ÷ñé Þ êáé ðÝñáí ôïõ ïñßïõ äéáëõôüôçôÜò ôïõò õðü ôéò óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò. Ôá ó÷åôéêÜ ìå ôç äõóäéá ëõôüôçôá óôïé÷åßá èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæïíôáé óôï ôå ëéêü ìÝóï êáôåñãáóßáò óôï ïðïßï åêôßèåíôáé ôá êýôôáñá. Ìðïñåß íá åßíáé ÷ñÞóéìï íá õðïëïãéóôåß ç äéáëõôüôçôá óôçí áñ÷Þ êáé ôï ðÝñáò ôçò êáôåñãáóßáò êáèþò ç äéáëõ ôüôçôá ìðïñåß íá áëëÜæåé êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò Ýêèåóçò óôï óýóôçìá äïêéìÞò ëüãù ôçò ðáñïõóßáò êõôôÜñùí, S9, ïñïý, êëð. Ç ìÝãéóôç äéáëõôüôçôá ìðïñåß íá áíé÷íåõèåß ìå ãõìíü ïöèáëìü. Ôï ßæçìá äåí ðñÝðåé íá ðáñåìâáßíåé óôá áðïôåëÝóìáôá ôçò åêôßìçóçò. 1.4.2.3 ÌÜñôõñåò Óå êÜèå ðåßñáìá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé êáë ëéÝñãåéåò ìå èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò (äéáëý ôçò Þ öïñÝáò), ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç. ¼ôáí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç, ùò èå ôéêüò ìÜñôõñáò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ïõóßá ðïõ áðáéôåß åíåñãïðïßçóç ãéá ôçí ðáñï÷Þ ìåôáëëáîéãüíïõ áðüêñéóçò. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1871 Ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò áíáöïñÜò ìðïñïýí íá ÷ñçóéìï ðïéçèïýí êáé Üëëåò ïõóßåò, ð.÷. åÜí Ýíá åñãáóôÞñéï Ý÷åé Ýíá éóôïñéêü ìå óôïé÷åßá ãéá ôçí 5-Âñùìï-2´-äåïîõïõñéäß íç [áñéèì CAS 59-14-3, áñéèì. EINECS 200-415-9], ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß êáé áõôÞ ç ïõóßá áíáöïñÜò. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ÷ñÞóç ùò èåôéêþí ìáñôýñùí ïõóéþí ó÷åôéêÞò ÷çìéêÞò ôÜîçò. Èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò, áðïôåëïýìåíïé áðü ìüíï ôïí äéáëýôç Þ ôï öïñÝá óôï ìÝ óï êáôåñãáóßáò, êáé êáôåñãáóìÝíïé ìå ôïí ßäéï ôñüðï ìå åêåßíï ôùí êáëëéåñãåéþí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, ÅðéðëÝ ïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé ìç õðïóôÜíôåò åðåîåñãáóßá ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí ðñüôåñá óôïé÷åßá ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéáëýôçò äåí åðéöÝñåé åðéâëáâÞ Þ ìåôáëëáîéãüíá áðïôåëÝóìáôá. 1.4.3 Äéáäéêáóßá 1.4.3.1 Êáôåñãáóßá ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ÐïëëáðëáóéáóèÝíôá êýôôáñá èá ðñÝðåé íá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá ìå êáé ÷ùñßò ìåôáâïëéêÞ åíåñãï ðïßçóç. Ç Ýêèåóç èá ðñÝðåé íá äéáñêåß ãéá êáôÜëëçëï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá (óõíÞèùò ôñåéò Ýùò Ýîé þñåò åßíáé áñ êåôü). Ï ÷ñüíïò Ýêèåóçò ìðïñåß íá áíôéóôïé÷åß óå Ýíá Þ ðåñéóóüôåñïõò êõôôáñéêïýò êýêëïõò. Ãéá êÜèå óõãêÝíôñùóç, ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí áðëÝò Þ äéðëÝò êáëëéÝñãåéåò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. ¼ôáí ÷ñçóéìïðïéïýíôáé áðëÝò êáëëéÝñãåéåò, ï áñéèìüò ôùí óõãêåíôñþóåùí èá ðñÝðåé íá áõîÜíåôáé þóôå íá åîá óöáëßæåôáé ï êáôÜëëçëïò áñéèìüò êáëëéåñãåéþí ãéá áíÜ ëõóç (ð.÷. ôïõëÜ÷éóôïí 8 ðñïò áíÜëõóç óõãêåíôñþóåéò). Ïé êáëëéÝñãåéåò ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ãéá áñíçôéêïß ìÜñ ôõñåò (äéáëýôçò), èá ðñÝðåé íá åßíáé åéò äéðëïýí. Ïé áÝñéåò Þ ðôçôéêÝò ïõóßåò èá ðñÝðåé íá åîåôÜæïíôáé ìå êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò, üðùò ð.÷. óå óöñáãéóìÝíá äï ÷åßá êáëëéÝñãåéáò (21) (22). 1.4.3.2 ÌÝôñçóç åðéâßùóçò, âéùóéìüôçôáò êáé óõ÷íü ôçôáò ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò Óôï ôÝëïò ôçò ðåñéüäïõ Ýêèåóçò, ôá êýôôáñá ðëÝíïíôáé êáé êáëëéåñãïýíôáé ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò åðéâßùóçò êáé ãéá íá ìðïñÝóåé íá åðéôåõ÷èåß ç Ýêöñáóç ôïõ öáéíï ôýðïõ ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò. Ç ìÝôñçóç ôçò êõôôá ñïôïîéêüôçôáò ìå ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò ó÷åôéêÞò áðïôå ëåóìáôéêüôçôáò êëùíïðïßçóçò (åðéâßùóçò) Þ ôçò ó÷åôé êÞò óõíïëéêÞò áíÜðôõîçò ôùí êáëëéåñãåéþí ãßíåôáé óõíÞèùò ìåôÜ ôçí ðåñßïäï êáôåñãáóßáò. ÊÜèå ãåíåôéêüò ôüðïò Ý÷åé êáèïñéóìÝíåò ÷ñïíéêÝò áðáéôÞóåéò ãéá íá ðñáãìáôïðïéçèåß ç êáô' ïõóßá Üñéóôç öáéíïôõðéêÞ Ýêöñáóç ðñïóöÜôùò ðáñá÷èÝíôùí ðñïúü íôùí ìåôÜëëáîçò (ïé HPRT êáé XPRT áðáéôïýí ôïõëÜ÷é óôïí 6-8 çìÝñåò êáé ç TK ôïõëÜ÷éóôïí 2 çìÝñåò). Ôá êýô ôáñá áõîÜíïíôáé óå èñåðôéêü ìÝóï ìå êáé ÷ùñßò ðáñÜãï íôá Þ ðáñÜãïíôåò åðéëïãÞò ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôïõ áñéèìïý ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò êáé ôçò áðïôåëåóìá ôéêüôçôáò êëùíïðïßçóçò, áíôßóôïé÷á. Ç ìÝôñçóç ôçò âéù óéìüôçôáò (ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí õðïëïãéóìü ôçò óõ÷íüôçôáò ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò) îåêéíÜ óôï ôÝëïò ôïõ ÷ñüíïõ Ýêöñáóçò ìå åðßóôñùóç óå ìç åðéëåêôéêü ìÝóï. ÅÜí ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åßíáé èåôéêÞ óôç äïêéìÞ L5178Y TK+/- , èá ðñÝðåé íá ðñáãìáôïðïéåßôáé ìÝôñçóç ìåãÝèïõò ôùí áðïéêéþí óå ìßá ôïõëÜ÷éóôïí áðü ôéò êáëëéÝñãåéåò ôçò äïêéìÞò (ìå ôçí õøçëüôåñç èåôéêÞ óõãêÝíôñùóç) êáèþò êáé óôïí áñíçôéêü êáé èåôéêü ìÜñôõñá. ÅÜí ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åßíáé áñíçôéêÞ óôç äïêéìÞ L5178Y TK+/-, èá ðñÝðåé 1872 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) Ðáñáäåßãìáôá ïõóéþí-èåôéêþí ìáñôýñùí åßíáé: íá ðñáãìáôïðïéåßôáé ìÝôñçóç ìåãÝèïõò áðïéêéþí óôïí áñíçôéêü êáé èåôéêü ìÜñôõñá. Óå äïêéìÝò óôéò ïðïßåò ÷ñç óéìïðïéåßôáé TK6TK+/-, ìðïñåß åðßóçò íá ãßíåé ìÝôñçóç ìå ãÝèïõò áðïéêéþí. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Óôá ëáìâáíüìåíá óôïé÷åßá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíå ôáé ðñïóäéïñéóìüò ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé âéùóéìü ôçôáò, ï áñéèìüò ôùí áðïéêéþí êáé ç óõ÷íüôçôá ôùí ðñïú üíôùí ìåôÜëëáîçò êáé ãéá ôéò õðü äïêéìÞ êáëëéÝñãåéåò êáé ãéá ôïõò ìÜñôõñåò. Óå ðåñßðôùóç èåôéêÞò áðïêñßóåùò óôç äïêéìÞ L5178Y TK+/-, ïé áðïéêßåò êáôáìåôñïýíôáé ìå âÜóç ôá êñéôÞñéá ãéá ôéò ìéêñÝò êáé ìåãÜëåò áðïéêßåò ãéá ìßá ôïõëÜ÷éóôïí óõãêÝíôñùóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò (ìÝãéóôç èåôéêÞ óõãêÝíôñùóç) êáé óôïí áñíçôéêü êáé ôïí èåôéêü ìÜñôõñá. Ç ìïñéáêÞ êáé êõôôáñïãåíåôéêÞ öýóç êáé ôùí ìéêñþí êáé ôùí ìåãÜëùí áðïéêéþí ðñïúüíôùí ìåôÜë ëáîçò Ý÷åé ìåëåôçèåß ëåðôïìåñþò (23) (24). Óôçí äïêéìÞ TK+/-, ïé áðïéêßåò êáôáìåôñïýíôáé ìå âÜóç ôá êñéôÞñéá ãéá ôéò áðïéêßåò êáíïíéêÞò áíÜðôõîçò (ìåãÜëåò) êáé âñáäåßáò áíÜðôõîçò (ìéêñÝò) (25). Ôá ìåôáëëáãìÝíá êýôôáñá ðïõ Ý÷ïõí õðïóôåß ôéò ðëÝïí åêôåôáìÝíåò ãåíåôéêÝò âëÜâåò Ý÷ïõí ðáñáôåôáìÝíï ÷ñüíï äéðëáóéáóìïý êáé Ýôóé ó÷ç ìáôßæïõí ìéêñÝò áðïéêßåò. Ïé âëÜâåò áõôÝò ìðïñïýí íá êõìáßíïíôáé áðü áðþëåéá ïëüêëçñïõ ôïõ ãïíéäßïõ ìÝ÷ñé êáñõïôõðéêþò ïñáôÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò. Ç åìöÜ íéóç ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò óå ìéêñÝò áðïéêßåò óõíäÝåôáé ìå ÷çìéêÝò ïõóßåò ðïõ ðñïêáëïýí óïâáñÝò ÷ñùìïóùìé êÝò åêôñïðÝò (26). Ôá ìåôáëëáãìÝíá êýôôáñá ðïõ Ý÷ïõí ðëçãåß ëéãüôåñï óïâáñÜ, áíáðôýóóïíôáé ìå ñõèìïýò ðá ñüìïéïõò ìå åêåßíïõò ôùí ãïíéêþí êõôôÜñùí êáé ó÷çìáôß æïõí ìåãÜëåò áðïéêßåò. Èá ðñÝðåé íá äßíåôáé ç åðéâßùóç (ó÷åôéêÞ áðïôåëåóìá ôéêüôçôá êëùíïðïßçóçò) Þ ç ó÷åôéêÞ óõíïëéêÞ áíÜðôõîç. Ç óõ÷íüôçôá ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò èá ðñÝðåé íá åê öñÜæåôáé ùò ï áñéèìüò ôùí ìåôáëëáãìÝíùí êõôôÜñùí ðñïò ôïí áñéèìü ôùí åðéâéùóÜíôùí êõôôÜñùí. Èá ðñÝðåé íá äßíïíôáé óôïé÷åßá ãéá êÜèå ìåìïíùìÝíç êáëëéÝñãåéá. ÅðéðëÝïí, üëá ôá äåäïìÝíá èá ðñÝðåé íá äß íïíôáé ìå ôç ìïñöÞ ðßíáêá. Äåí áðáéôåßôáé åðáëÞèåõóç ôùí óáöþí èåôéêþí áðï êñßóåùí. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá áðïóáöçíßæïíôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò ôñïðïðïéþ íôáò êáôÜ ðñïôßìçóç ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Ôá áñ íçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá ðñÝðåé íá åðéâåâáéþíïíôáé êáôÜ ðå ñßðôùóç. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ äåí êñßíåôáé áíáãêáßá ç åðéâåâáßùóç ôùí áñíçôéêþí áðïôåëåóìáôùí, èá ðñÝðåé íá ðáñÝ÷åôáé ó÷åôéêÞ áéôéïëüãçóç. Óôá åðéâåâáéùôéêÜ ðåéñÜìáôá, ôüóï ãéá ôá äéöïñïýìåíá üóï êáé ãéá ôá áñ íçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ôñïðï ðïßçóç ôùí ðáñáìÝôñùí ôçò ìåëÝôçò þóôå íá êáëýðôïõí üëç ôçí Ýêôáóç ôùí åêôéìïýìåíùí óõíèçêþí. Óôéò ðáñá ìÝôñïõò ðïõ ìðïñïýí íá ôñïðïðïéçèïýí ðåñéëáìâÜíå ôáé ôï åýñïò ôùí óõãêåíôñþóåùí êáé ïé óõíèÞêåò ìåôá âïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß Ýíá áðïôÝëåóìá ùò èåôéêü åöáñìüæï íôáé äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôçí óõãêÝ íôñùóç áýîçóç Þ ç áíáðáñáãþãéìç áýîçóç óôç óõ÷íü ôçôá ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò. Ðñþôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí áðïôåëåóìÜôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèïäïé. Óå ìßá èåôéêÞ áðüêñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíá äéêüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôé óôéêÞ óçìáíôéêüôçôá. Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîéãüíïò óôï óýóôçìá áõôü. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôçí in vitro äïêéìÞ êõôôáñé êÞò ãïíéäéáêÞò ìåôÜëëáîçò óå èçëáóôéêÜ äåß÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åðÜãåé ãïíéäéáêÝò ìåôáëëÜîåéò óôá ÷ñçóéìïðïéçèÝíôá êáëëéåñãçèÝíôá êýôôáñá èçëáóôé êïý. Ç ðåñßðôùóç ìå ôç ìåãáëýôåñç óçìáíôéêüôçôá åßíáé åêåßíç üðïõ õðÜñ÷åé èåôéêÞ êáé áíáðáñáãþãéìç óõíÜñ ôçóç áðüêñéóçò ìå óõãêÝíôñùóç. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝ óìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åðÜãåé ãïíéäéáêÝò ìåôáëëÜîåéò óôá ÷ñçóéìïðïéçèÝíôá êáëëéåñãçèÝíôá êýôôáñá èçëáóôé êïý. 3. ÅÊÈÅÓÇ ÁÍÁÖÏÑÁÓ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõ èá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá/äéáëýôç, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, Êýôôáñá: � ôýðï êáé ðçãÞ ôùí êõôôÜñùí, � áñéèìü ôùí êõôôáñéêþí êáëëéåñãåéþí, � áñéèìü êõôôáñéêþí äéåëåýóåùí, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ìåèüäïõò óõíôÞñçóçò ôçò êõôôáñéêÞò êáëëéÝñãåéáò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � áðïõóßá ìõêïðëÜóìáôïò. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � áéôéïëïãßá ãéá ôçí åðéëïãÞ ôùí óõãêåíôñþóåùí êáé ôïõ áñéèìïý ôùí êáëëéåñãåéþí óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí, ð.÷. óôïé÷åßùí êõôôáñïôïîéêüôçôáò êáé ðåñéïñéóìþí áðü ðëåõñÜò äéáëõôüôçôáò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáëëéÝñãåéáò , óõãêÝíôñùóç CO2, � óõãêÝíôñùóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � üãêï ôïõ öïñÝá êáé ôçò ðñïóôéèÝìåíçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � èåñìïêñáóßá åðùÜóåùò, � ÷ñüíï åðùÜóåùò, � äéÜñêåéá ôçò êáôåñãáóßáò, � ðõêíüôçôá ôùí êõôôÜñùí êáôÜ ôçí êáôåñãáóßá, � ôýðï êáé óýóôáóç ôïõ óõóôÞìáôïò ìåôáâïëéêÞò åíåñ ãïðïßçóçò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé êñéôçñßùí áðïäï ÷Þò, � èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò, � äéÜñêåéá ôçò ðåñéüäïõ Ýêöñáóçò (óõìðåñéëáìâáíï ìÝíïõ ôïõ áñéèìïý ôùí áíáêáëëéåñãçèÝíôùí êõôôÜñùí ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1873 êáé ôùí õðïêáëëéåñãåéþí êáé äéáãñáììÜôùí äéáôñïöÞò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ðáñÜãïíôåò åðéëïãÞò, � êñéôÞñéá ãéá ôçí êáôÜôáîçò ìéáò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôéêÞò Þ äéöïñïýìåíçò, � ìåèüäïõò ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêáí ãéá ôçí êáôáãñáöÞ ôïõ áñéèìïý ôùí âéþóéìùí êáé ôùí ìåôáëëáãìÝíùí êõô ôÜñùí, � ïñéóìü ôùí áðïéêéþí ó÷åôéêÜ ìå ôï ìÝãåèïò êáé ôïí ôý ðï ôïõò (óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí êñéôçñßùí êáôÜôá îçò óå "ìéêñÝò" êáé "ìåãÜëåò" áðïéêßåò, åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç). ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � óçìÜäéá êáèßæçóçò, � óôïé÷åßá ãéá ôï pH êáé ôçí ïóìùìïñéáêüôçôá êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò Ýêèåóçò óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, åöüóïí ðñïóäéïñßóôçêáí, � ìÝãåèïò ôùí áðïéêéþí, åöüóïí êáôáãñÜöçêå, ôïõëÜ ÷éóôïí ãéá ôïõò èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò, � åðÜñêåéá ôïõ åñãáóôçñßïõ óôçí áíß÷íåõóç ìéêñïá ðïéêéáêþí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò ìå ôï óýóôçìá L5178Y TK+/-, üðïõ óõíôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, � ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò, � óõ÷íüôçôá ôùí ðñïúüíôùí ìåôÜëëáîçò. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tin dall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 2. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mu tations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312. 3. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lym phoblasts. Mutation Res., 94, 467-485. 4. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutage nesis, 4, 394-403. 5. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Compar ison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evalu ation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128. 6. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mu tation Res., 312, 235-239. 7. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204. 8. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225-251. 9. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, 17-36. 10. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Gua nine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141. 11. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autoso mal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17. 12. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-In duced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147. 13. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Pro cedures for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Hand book of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. 14. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mam malian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony For mation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. 15. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6 Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylni trosamine. Mutation Res., 46, 365-373. 16. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364. 17. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Character ization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108. 18. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Meth ods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215. 19. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gate house, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177. 20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. 21. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vo latile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. 1874 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. 22. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mu tagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801. 23. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51-55. 24. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161-174. 25. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, 89-102. 26. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- -3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609-614. ÐáñÜñôçìá 2ÓÔ B.23. ÄÏÊÉÌÇ ÓÐÅÑÌÏÃÏÍÉÁÊÇÓ ×ÑÙÌÏÓÙÌÉÊÇÓ ÅÊÔÑÏÐÇÓ ÓÅ ÈÇËÁÓÔÉÊÁ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôéãñáöÞ ôçò OECD TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aber ration Test (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Óêïðüò ôçò in vivo äïêéìÞò óðåñìïãïíéáêÞò ÷ñùìïóù ìéêÞò åêôñïðÞò åßíáé ï åíôïðéóìüò ôùí ïõóéþí åêåßíùí ðïõ ðñïêáëïýí äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óå óðåñìïãïíéáêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí (1)(2)(3)(4)(5). Ïé äïìéêÝò åêôñïðÝò ìðïñåß íá åßíáé äýï ôýðùí, ÷ñùìïóù ìéêÝò Þ ÷ñùìáôéäéêÝò. Ôá ðåñéóóüôåñá ÷çìéêÜ ìåôáëëáîé ãüíá ðñïêáëïýí åêôñïðÝò ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ, áðáíôþ íôáé üìùò êáé åêôñïðÝò ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ. Ç ðáñïý óá ìÝèïäïò äåí Ý÷åé ó÷åäéáóôåß ãéá ôç ìÝôñçóç áñéèìçôéêþí åêôñïðþí êáé äåí ÷ñçóéìïðïéåßôáé óõíÞèùò ãéá ôï óêïðü áõôü. Ïé ÷ñùìïóùìéêÝò ìåôáëëÜîåéò êáé ôá óõíáöÞ óõìâÜíôá áðïôåëïýí ôï áßôéï ðïëëþí ãåíåôéêþí áóèåíåéþí óôïí Üíèñùðï. Ìå ôçí ðáñïýóá äïêéìÞ ìåôñïýíôáé ÷ñùìïóùìéêÜ óõì âÜíôá óå óðåñìïãïíéáêÜ ãåííçôéêÜ êýôôáñá êáé, óõíå ðþò, ðéóôåýåôáé üôé ìðïñåß ìå áõôÞí íá ðñïâëåöèåß ç åðá ãùãÞ êëçñïíïìéêþí ìåôáëëÜîåùí óôá ãåííçôéêÜ êýôôáñá. Óôç äïêéìÞ áõôÞ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò ôñùêôéêÜ. AõôÞ ç in vivo êõôôáñïãåíåôéêÞ äïêéìÞ áíé÷íåýåé ÷ñùìïóù ìéêÝò åêôñïðÝò óå óðåñìïãïíéáêÝò ìéôþóåéò. 'Áëëá êýôôá ñá-óôü÷ïé äåí áðïôåëïýí áíôéêåßìåíï ôçò ìåèüäïõ áõôÞò. Ãéá ôçí áíß÷íåõóç åêôñïðþí ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ óå óðåñìïãïíéáêÜ êýôôáñá, èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ðñþ ôç ìéôùôéêÞ êõôôáñéêÞ äéáßñåóç ìåôÜ ôçí êáôåñãáóßá ðñéí ïé áëëïéþóåéò áõôÝò áðùëåóèïýí óôéò åðüìåíåò êõôôáñé êÝò äéáéñÝóåéò. Ðñüóèåôåò ðëçñïöïñßåò áðü ôá õðïâëç èÝíôá óå êáôåñãáóßá óðåñìïãïíéáêÜ âëáóôïêýôôáñá ìðïñïýí íá ëçöèïýí áðü ìåéùôéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ áíÜëõ óç ãéá ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ åêôñïðÝò óôï óôÜäéï ôçò äéáêßíçóçò-ìåôÜöáóçò É üôáí ôá õðü êáôåñãáóßá êýôôá ñá ãßíïõí óðåñìáôïêýôôáñá. ÁõôÞ ç in vivo äïêéìÞ Ý÷åé ó÷åäéáóôåß ãéá íá äéåñåõíÜôáé áí ìåôáëëáîéãüíá óùìáôéêþí êõôôÜñùí åßíáé äñáóôéêÜ êáé óå ãåííçôéêÜ êýôôáñá. ÅðéðëÝïí, ç óðåñìïãïíéáêÞ äï êéìÞ ó÷åôßæåôáé ìå ôçí åêôßìçóç ôïõ êéíäýíïõ ìåôáëëáîï ãÝíåóçò äåäïìÝíïõ üôé ìå áõôÞ ìðïñïýí íá åîåôáóôïýí ðáñÜãïíôåò ôïõ in vivo ìåôáâïëéóìïý, ôçò öáñìáêïêéíç ôéêÞò êáé ôùí äéåñãáóéþí åðéäéüñèùóçò DNA. Óôïõò üñ÷åéò õðÜñ÷ïõí äéÜöïñåò ãåíåÝò óðåñìïãï íßùí ìå Ýíá ïñéóìÝíï öÜóìá âáèìïý åõáéóèçóßáò óôéò ÷çìéêÝò ïõóßåò. 'Åôóé, ïé åíôïðéæüìåíåò åêôñïðÝò áíôé ðñïóùðåýïõí ôç óõíïëéêÞ áðüêñéóç ôùí õðü êáôåñãá óßá óðåñìïãïíéáêþí êõôôáñéêþí ðëçèõóìþí, üðïõ äå óðüæïõóá èÝóç êáôáëáìâÜíïõí ôá ðïëõáñéèìüôåñá äéá öïñïðïéçìÝíá óðåñìïãïíéáêÜ êýôôáñá. ÁíÜëïãá ìå ôç èÝóç ôïõò óôïõò üñ÷åéò, ïé äéÜöïñåò ãåíåÝò óðåñìïãï íßùí ìðïñïýí íá åêôåèïýí Þ ü÷é óôç ãåíéêÞ êõêëïöïñßá ëüãù ôïõ öõóéêïý êáé öõóéïëïãéêïý öñáãìïý ôùí Óåñ ôïëéåßùí êõôôÜñùí êáé ôïõ öñáãìïý áßìáôïò-üñ÷åùí. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí åíäåßîåéò üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá, Þ ïé ìåôáâïëßôåò ôçò, äåí ðñüêåéôáé íá öèÜóïõí óôïí éóôü óôü÷ï, äåí åßíáé óêüðéìï íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ç äïêéìÞ áõÞ. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ÅêôñïðÞ ÷ñùìáôéäéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç ìåìïíùìÝíùí ÷ñùìáôé äþí Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç ìåôáîý ÷ñùìáôéäþí. ÅêôñïðÞ ÷ñùìïóùìéêïý ôýðïõ: äïìéêÞ ÷ñùìïóùìéêÞ âëÜâç ðïõ åìöáíßæåôáé ùò ñÞîç, Þ ñÞîç êáé åðáíÝíùóç, êáé ôùí äýï ÷ñùìáôéäþí óôçí ßäéá èÝóç. ×Üóìá: á÷ñùìáôéêÞ âëÜâç ìéêñüôåñç áðü ôï ðëÜôïò ìéáò ÷ñùìáôßäçò êáé ìå åëÜ÷éóôç áðåõèõãñÜììéóç ôùí ÷ñùìáôéäþí. ÁñéèìçôéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôïõ áñéèìïý ôùí ÷ñù ìïóùìÜôùí áðü ôïí êáíïíéêü ÷áñáêôçñéóôéêü áñéèìü ôùí ÷ñçóéìïðïéïõìÝíùí æþùí. Ðïëõðëïåéäßá: ðïëëáðëÜóéï ôïõ áðëïåéäïýò ÷ñùìï óùìéêïý áñéèìïý (n) ðÝñáí ôïõ äéðëïåéäïýò áñéèìïý (äçë. 3n, 4n ê.ï.ê). ÄïìéêÞ åêôñïðÞ: ìåôáâïëÞ ôçò äïìÞò ôùí ÷ñùìïóù ìÜôùí ðïõ áíé÷íåýåôáé ìå ðáñáôÞñçóç ìå ìéêñïóêüðéï ôïõ óôáäßïõ ôçò ìåôáöÜóåùò ôçò äéáßñåóçò ôùí êõôôÜ ñùí êáé ãßíåôáé áíôéëçðôÞ ìå ôç ìïñöÞ áðáëåßøåùí, åí äïáíôáëëáãþí Þ áíôáëëáãþí. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ Ôá æþá åêôßèåíôáé óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá áðü ìßá êáôÜë ëçëç ïäü åêèÝóåùò êáé èõóéÜæïíôáé óå êáôÜëëçëåò ÷ñïíé êÝò óôéãìÝò ìåôÜ ôçí áãùãÞ. Ðñéí áðü ôç èõóßá, ôá æþá õðïâÜëëïíôáé óå áãùãÞ ìå Ýíá ðáñÜãïíôá áíáóôïëÞò ìå ôáöÜóåùò (ð.÷. êïë÷éêßíç Þ Colcemid®). Óôç óõíÝ÷åéá, ðá ñáóêåõÜæïíôáé ðáñáóêåõÜóìáôá áðü ãåííçôéêÜ êýôôáñá, ÷ñùìáôßæïíôáé êáé ôá ìåôáöáóéêÜ êýôôáñá åîåôÜæïíôáé ðñïò åíôïðéóìü ôõ÷üí ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 ÅðéëïãÞ æùúêþí åéäþí ÓõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýíôáé áñóåíéêïß êéíÝæéêïé êñéêç ôïß êáé ðïíôéêïß. Åíôïýôïéò, ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé áñóåíéêÜ áðü Üëëá êáôÜëëçëá åßäç èçëáóôéêþí. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýìå íåò åñãáóôçñéáêÝò öõëÝò íåáñþí õãéþí åíÞëéêùí æþùí. Óôçí áñ÷Þ ôçò äïêéìÞò, ïé äéáöïñÝò óôá âÜñç ôùí æþùí èá ðñÝðåé íá åßíáé åëÜ÷éóôåò êáé íá ìçí õðåñâáßíïõí ôï ± 20% ôïõ ìÝóïõ âÜñïõò. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1875 1.4.1.2 ÓõíèÞêåò óôÝãáóçò êáé äéáôñïöÞò Åöáñìüæïíôáé ïé ãåíéêÝò óõíèÞêåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôç ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ôïõ ÌÝñïõò Â, áí êáé ï óôü÷ïò ãéá ôçí õãñáóßá èá ðñÝðåé íá åßíáé 50-60%. 1.4.1.3 Ðñïåôïéìáóßá ôùí æþùí ÕãéÞ íåáñÜ åíÞëéêá áñóåíéêÜ ÷ùñßæïíôáé ôõ÷áßá óå ïìÜ äåò ìáñôõñßáò êáé áãùãÞò. Ôá êëïõâéÜ èá ðñÝðåé íá äéá ôÜóóïíôáé ìå ôÝôïéï ôñüðï þóôå íá åëá÷éóôïðïéïýíôáé ôõ ÷üí ðéèáíÝò åðéäñÜóåéò áðü ôç èÝóç ôùí êëïõâéþí. Ôá æþá ëáìâÜíïõí ìßá áðïêëåéóôéêÞ ãéá ôï êáèÝíá ôáõôüôçôá. Ôá æþá åãêëéìáôßæïíôáé óôéò åñãáóôçñéáêÝò óõíèÞêåò ãéá ðÝ íôå ôïõëÜ÷éóôïí çìÝñåò ðñéí áðü ôçí Ýíáñîç ôçò äïêéìÞò. 1.4.1.4 Ðñïåôïéìáóßá ôùí äüóåùí ÓôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëý ôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé, åöüóïí ÷ñåéÜæåôáé, ðñéí íá ÷ïñçãçèïýí óôá æþá. Oé õãñÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò ìðï ñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé áðåõèåßáò ùò Ý÷ïõí Þ íá áñáéþíï íôáé ðñéí áðü ôç ÷ïñÞãçóç. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìáôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá óôïé÷åßá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôáèåñüôçôá ôçò ïõ óßáò åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïéìùí ðáñáóêåõáóìÜôùí . 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Ï äéáëýôçò/öïñÝáò äåí èá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé ôïîéêÞ äñÜóç óôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá åðßðåäá äüóåùí áëëÜ ïý ôå êáé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñá óÞ ôïõ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá. Åöüóïí ï ÷ñçóéìïðïé ïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí áíÞêåé óôïõò ãíùóôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé÷åß ùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. ÓõíéóôÜôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá ç ÷ñÞóç åíüò õäáôéêïý äéáëýôç/öïñÝá. 1.4.2.2 ÌÜñôõñåò Óå êÜèå äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ðáñÜë ëçëá èåôéêïß êáé áñíçôéêïß (äéáëýôçò Þ öïñÝáò) ìÜñôõ ñåò. Ìå åîáßñåóç ôçí áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ôá æþá óôéò ïìÜäåò ìáñôõñßáò èá ðñÝðåé íá áíôéìåôùðßæï íôáé ìå ôïí ßäéï áêñéâþò ôñüðï ìå åêåßíï ôùí æþùí óôéò õðïâáëëüìåíåò óå áãùãÞ ïìÜäåò. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá ðñïêáëïýí äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò in vivo óå óðåñìïãïíéáêÜ êýô ôáñá óå åðßðåäá Ýêèåóçò ðïõ áíáìÝíåôáé íá äþóïõí áíé ÷íåýóéìç áýîçóç ðÜíù áðü ôï âáóéêü üñéï. Ïé äüóåéò ôùí èåôéêþí ìáñôýñùí èá ðñÝðåé íá åðéëÝãï íôáé Ýôóé þóôå ïé åðéäñÜóåéò íá åßíáé óáöåßò áëëÜ íá ìçí áðïêáëýðôïõí áìÝóùò ôçí ôáõôüôçôá ôùí êùäéêïðïéç ìÝíùí áíôéêåéìåíïöüñùí óôïí ðáñáôçñçôÞ. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé êáé áðü ïäü äéáöï ñåôéêÞ áðü åêåßíç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò êáé íá äåéãìáôß æïíôáé ìüíï ìßá öïñÜ. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí, ìðïñåß íá åîå ôÜæåôáé ç ÷ñÞóç èåôéêþí ìáñôýñùí ðáñüìïéáò ÷çìéêÞò ôÜîçò. Ðáñáäåßãìáôá ïõóéþí-èåôéêþí ìáñôýñùí åßíáé: Ãéá êÜèå äåéãìáôïëçøßá èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò, õðïâëçèÝíôåò óå áãùãÞ ìüíï ìå äéáëýôç Þ öïñÝá áëëÜ ìå ôïí ßäéï êáôÜ ôá Üëëá ôñüðï ìå åêåßíï ôùí ïìÜäùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, åêôüò êé áí áðü ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò ìÜñôõñåò ðñïêý ðôïõí áðïäåêôÝò äéáöïñïðïéÞóåéò êáé óõ÷íüôçôåò êõô ôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò ìåôáîý ôùí æþùí. Åðé ðëÝïí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé ìç õðïâëçèÝ íôåò óå áãùãÞ ìÜñôõñåò åêôüò áí õðÜñ÷ïõí éóôïñéêÜ Þ äçìïóéåõìÝíá óôïé÷åßá ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé ï åðéëåãåßò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí åðéöÝñåé åðéâëáâÞ Þ ìåôáëëáîéãü íá áðïôåëÝóìáôá 1.5 ÄÉÁÄÉÊÁÓÉÁ 1.5.1 Áñéèìüò æþùí ÊÜèå õðïâáëëüìåíç óå áãùãÞ ïìÜäá êáé ïìÜäá-ìÜñ ôõñáò ðñÝðåé íá áðïôåëåßôáé áðü 5 ôïõëÜ÷éóôïí ðñïò åîÝ ôáóç áñóåíéêÜ. 1.5.2 ×ñïíïäéÜãñáììá áãùãÞò Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ÷ïñçãïýíôáé êáôÜ ðñïôßìçóç ìßá Þ äýï öïñÝò (äçë. ùò ìßá Þ äýï áãùãÝò). Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ìðïñïýí åðßóçò íá ÷ïñçãçèïýí êáé äéáêåêïììÝ íá, äçë. äýï áãùãÝò ôçí ßäéá çìÝñá ðïõ íá ìçí áðÝ÷ïõí ÷ñïíéêÜ ðåñéóóüôåñï áðü ìåñéêÝò þñåò, ãéá íá äéåõêïëý íåôáé ç ÷ïñÞãçóç ìåãÜëçò ðïóüôçôáò ïõóßáò. 'Áëëïé ôõ ÷üí ÷ñçóéìïðïéïýìåíïé ôñüðïé áãùãÞò èá ðñÝðåé íá áé ôéïëïãïýíôáé åðéóôçìïíéêþò. Óôçí ïìÜäá óôçí ïðïßá äßíåôáé ç ìåãáëýôåñç äüóç, ãß íïíôáé äýï äåéãìáôïëçøßåò ìåôÜ ôçí áãùãÞ. ÅðåéäÞ ç êé íçôéêÞ ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ìðïñåß íá åðçñåáóôåß áðü ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ðñáãìáôïðïéïýíôáé ìßá ðñþôç äåéãìáôïëçøßá êáé ìßá äåýôåñç äåéãìáôïëçøßá áñãüôå ñá, 24 êáé 48 þñåò ðåñßðïõ áíôßóôïé÷á ìåôÜ ôçí áãùãÞ. Ãéá ôéò õðüëïéðåò äüóåéò, èá ðñÝðåé íá ãßíåôáé ìßá äåéã ìáôïëçøßá óôéò 24 þñåò Þ óå ÷ñüíï ðïõ áíôéóôïé÷åß óôï 1,5 ôçò ÷ñïíéêÞò äéÜñêåéáò ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ ìåôÜ ôçí áãùãÞ, åêôüò êé áí åßíáé ãíùóôü üôé ãéá ôçí áíß÷íåõóç ôùí åðéäñÜóåùí åßíáé êáôáëëçëüôåñïò êÜðïéïò Üëëïò ÷ñüíïò äåéãìáôïëçøßáò (6). ÅðéðëÝïí, ìðïñïýí íá ðñáãìáôïðïéçèïýí äåéãìáôïëç øßåò êáé óå Üëëåò ÷ñïíéêÝò óôéãìÝò. Ãéá ðáñÜäåéãìá, óôçí ðåñßðôùóç ïõóéþí ðïõ ìðïñåß íá åðáãÜãïõí ÷ñùìïóù ìéêÞ õóôÝñçóç, Þ ìðïñåß íá áóêÞóïõí S-áíåîÜñôçôåò åðé äñÜóåéò, ìðïñåß íá åßíáé êáëü íá ãßíåé íùñßôåñá ç äåéãìá ôïëçøßá (1). Ôï áí ðñÝðåé íá õðÜñîåé Þ ü÷é ÷ñïíïäéÜãñáììá åðáíåé ëçììÝíçò áãùãÞò, áõôü ÷ñåéÜæåôáé íá åîåôÜæåôáé êáôÜ ðåñßðôùóç. Óôçí ðåñßðôùóç åðáíåéëçììÝíçò áãùãÞò, ôá æþá èá ðñÝðåé íá èõóéÜæïíôáé 24 þñåò (1,5 êõôôáñéêü êý êëï) ìåôÜ ôçí ôåëåõôáßá áãùãÞ. 'Ïðïõ ÷ñåéÜæåôáé, ìðï ñïýí íá õðÜñîïõí ðñüóèåôåò äåéãìáôïëçøßåò óå Üëëïõò ÷ñüíïõò. Ðñéí áðü ôç èõóßá, óôá æþá åã÷ýåôáé åíäïðåñéôïíáúêþò êáôÜëëçëç äüóç ðáñÜãïíôá áíáóôïëÞò ìåôÜöáóçò (ð.÷. Colcemid® Þ êïë÷éêßíç). Óå êáôÜëëçëç ÷ñïíéêÞ óôéãìÞ ðñáãìáôïðïéåßôáé äåéãìáôïëçøßá óôá æþá. Ãéá ôïõò ðï íôéêïýò, ç êáôáëëçëüôåñç óôéãìÞ åßíáé ðåñßðïõ 3-5 þñåò, åíþ ãéá ôïõò êéíÝæéêïõò êñéêçôïýò ôï äéÜóôçìá áõôü áíôé óôïé÷åß ðåñßðïõ óå 4-5 þñåò. 1.5.3 Åðßðåäá äüóåùí ÅÜí åêôåëåóôåß äïêéìÞ áíåýñåóçò åýñïõò åðåéäÞ äåí õðÜñ÷ïõí êáôÜëëçëá äéáèÝóéìá äåäïìÝíá, áõôÞ èá ðñÝ ðåé íá åêôåëåßôáé óôï ßäéï åñãáóôÞñéï, ìå ôï ßäéï åßäïò, öõ ëÞ êáé ôñüðï áãùãÞò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óôçí êýñéá äï 1876 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) êéìÞ (7). Åöüóïí õðÜñ÷åé ôïîéêüôçôá, óôçí ðñþôç äåéã ìáôïëçøßá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôñßá åðßðåäá äüóåùí. Ôá åðßðåäá áõôÜ äüóåùí èá ðñÝðåé íá êáëýðôïõí ìßá ðåñéï ÷Þ áðü ôç ìÝãéóôç ìÝ÷ñé ôç ÷áìçëÞ Þ ìçäåíéêÞ ôïîéêüôç ôá. Ãéá ôç äåýôåñç äåéãìáôïëçøßá, áñêåß íá ÷ñçóéìïðïé åßôáé ìüíï ç ìÝãéóôç äüóç. Ç ìÝãéóôç äüóç ïñßæåôáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé óçìåßá ôïîéêüôçôáò ôÝôïéá þóôå ôõ÷üí õøçëüôåñá åðßðåäá äüóçò, ìå âÜóç ôïí ßäéï ôñüðï ÷ïñÞ ãçóçò, íá áíáìÝíåôáé öõóéïëïãéêÜ íá ïäçãÞóïõí óå öáé íüìåíá èíçóéìüôçôáò. Ïõóßåò ìå åéäéêÝò âéïëïãéêÝò äñÜóåéò óå ÷áìçëÝò ìç ôïîéêÝò äüóåéò (üðùò ïñìüíåò êáé ìéôùãüíá) ìðïñåß íá áðïôåëïýí åîáéñÝóåéò óôá êñéôÞñéá ñýèìéóçò ôùí äüóå ùí êáé èá ðñÝðåé íá áîéïëïãïýíôáé êáôÜ ðåñßðôùóç.Ç ìÝ ãéóôç äüóç ìðïñåß åðßóçò íá ïñéóôåß êáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé åíäåßîåéò ôïîéêüôçôáò óôá óðåñìïãïíéáêÜ êýô ôáñá (ð.÷. åëÜôôùóç ôïõ ëüãïõ ôùí óðåñìïãïíéáêþí ìé ôþóåùí ðñïò ôçí ðñþôç êáé äåýôåñç ìåéùôéêÞ ìåôÜöáóç. Ç åëÜôôùóç áõôÞ äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôï 50%). 1.5.4 ÄïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò ÅÜí ìßá äïêéìÞ ìå Ýíá åðßðåäï äüóçò ôïõëÜ÷éóôïí 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá óôçí ïðïßá ÷ñçóéìïðïéåß ôáé ìßá ìüíç áãùãÞ, Þ äýï áãùãÝò ôçí ßäéá ìÝñá, äåí äþ óåé ïñáôÜ ôïîéêÜ áðïôåëÝóìáôá, êáé åöüóïí äåí áíáìÝ íåôáé ç åìöÜíéóç ãïíïôïîéêüôçôáò ìå âÜóç óôïé÷åßá áðü ïõóßåò ó÷åôéêÞò äïìÞò, ôüôå ìðïñåß íá èåùñçèåß ùò ìç áíáãêáßá ç åêôÝëåóç ðëÞñïõò ìåëÝôçò ìå ôñßá åðßðåäá äüóçò. Ç áíáìåíüìåíç áíèñþðéíç Ýêèåóç ìðïñåß íá äþ óåé ìßá Ýíäåéîç ôçò áíÜãêçò ãéá ÷ñçóéìïðïßçóç õøçëüôå ñïõ åðßðåäïõ äüóçò óôç äïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò. 1.5.5 ×ïñÞãçóç äüóåùí Ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ÷ïñçãåßôáé óõíÞèùò ìå äéáóùëÞ íùóç ÷ñçóéìïðïéþíôáò óôïìá÷éêü óùëÞíá Þ êáôÜëëçëï óùëÞíá äéáóùëÞíùóçò Þ ìå åíäïðåñéôïíáúêÞ Ýã÷õóç. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ïäïß Ýêèåóçò åöüóïí ìðïñïýí íá áéôéïëïãçèïýí. Ï ìÝãéóôïò üãêïò õãñïý ðïõ ìðïñåß íá ÷ïñçãçèåß ìå äéáóùëÞíùóç Þ Ýã÷õ óç åöÜðáî åîáñôÜôáé áðü ôï ìÝãåèïò ôïõ ðåéñáìáôüæù ïõ. Ï üãêïò äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôá 2 ml/100g âÜ ñïõò óþìáôïò. Áí ÷ñçóéìïðïéçèïýí ìåãáëýôåñïé üãêïé, áõôü ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. Ìå åîáßñåóç ôéò åñåèéóôéêÝò Þ äéáâñùôéêÝò ïõóßåò ïé ïðïßåò êáíïíéêÜ åìöáíßæïõí åíôïíüôåñá áðïôåëÝóìáôá óå õøçëüôåñåò óõãêåíôñþ óåéò, ïé äéáöïñïðïéÞóåéò óôïí üãêï èá ðñÝðåé íá åëá÷é óôïðïéïýíôáé ðñïóáñìüæïíôáò ôç óõãêÝíôñùóç þóôå íá äéáóöáëßæåôáé óôáèåñüò üãêïò óå üëá ôá åðßðåäá äüóçò. 1.5.6 Ðñïåôïéìáóßá ôùí ÷ñùìïóùìÜôùí ÁìÝóùò ìåôÜ ôç èõóßá, ëáìâÜíïíôáé áðü ôïí Ýíá Þ êáé ôïõò äýï üñ÷åéò, åíáéùñÞìáôá êõôôÜñùí ðïõ åêôßèåíôáé óå õðïôïíéêü äéÜëõìá êáé óôåñåþíïíôáé. Ôá êýôôáñá êá ôüðéí åðéóôñþíïíôáé óå áíôéêåéìåíïöüñïõò ðëÜêåò êáé ÷ñùìáôßæïíôáé. 1.5.7 AíÜëõóç Ãéá êÜèå æþï èá ðñÝðåé íá åîåôÜæïíôáé ôïõëÜ÷éóôïí 100 êáëþò áíáðôõãìÝíåò ìåôáöÜóåéò (äçë. 500 êáô' åëÜ÷éóôï ìåôáöÜóåéò áíÜ ïìÜäá). Ï áñéèìüò áõôüò ìðïñåß íá ìåé ùèåß üôáí ðáñáôçñåßôáé õøçëüò áñéèìüò åêôñïðþí. ´Ïëåò ïé áíôéêåéìåíïöüñïé, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí êáé åêåßíùí ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí, èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïõí Ýíáí áíåîÜñôçôï êùäéêü ðñßí áðü ôçí åîÝ ôáóç óôï ìéêñïóêüðéï. ÅðåéäÞ ïé äéáäéêáóßåò óôåñÝùóçò áðïëÞãïõí óõ÷íÜ óôç ñÞîç åíüò ðïóïóôïý ìåôáöÜóåùí ìå áðþëåéá ÷ñùìïóùìÜôùí, ôá êáôáìåôñïýìåíá êýôôá ñá èá ðñÝðåé íá ðåñéÝ÷ïõí áñéèìü êåíôñïìåñéäßùí ßóï ìå ôïí áñéèìü 2n ± 2. 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Ôá óôïé÷åßá ãéá ôá åðéìÝñïõò æþá èá ðñÝðåé íá ðáñïõ óéÜæïíôáé ìå ìïñöÞ ðßíáêá. Ç ðåéñáìáôéêÞ ìïíÜäá åßíáé ôï æþï. Ãéá êÜèå æþï èá ðñÝðåé íá åêôéìÜôáé ï áñéèìüò ôùí êõôôÜñùí ìå äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò êáé ï áñéè ìüò ôùí åêôñïðþí áíÜ êýôôáñï. Ïé äéÜöïñïé ôýðïé äïìé êþí ÷ñùìïóùìéêþí åêôñïðþí èá ðñÝðåé íá êáôáãñÜöï íôáé ìå ôïí áñéèìü êáé ôç óõ÷íüôçôÜ ôïõò óôéò õðïâëçèåß óåò óå áãùãÞ ïìÜäåò êáé óôéò ïìÜäåò-ìÜñôõñåò. Ôá ÷Üóìáôá êáôáãñÜöïíôáé îå÷ùñéóôÜ êáé ðåñéëáìâÜíïíôáé óôçí Ýêèåóç, ãåíéêÜ üìùò äåí ðåñéëáìâÜíïíôáé óôç óõ íïëéêÞ óõ÷íüôçôá åêôñïðþí. Åöüóïí ðáñáôçñçèåß ìßôùóç êáèþò åðßóçò êáé ìåßù óç, èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ï ëüãïò ôùí ìéôþóåùí óðåñìïãïíßùí ðñïò ôçí ðñþôç êáé äåýôåñç ìåéùôéêÞ ìå ôÜöáóç ùò ìÝôñï ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò ãéá üëá ôá õðïâëçèÝíôá óå áãùãÞ æþá êáé ôïõò áñíçôéêïýò ìÜñôõ ñåò óå óõíïëéêü äåßãìá 100 äéáéñåìÝíùí êõôôÜñùí áíÜ æþï ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò äõíáôÞò êõôôáñïôïîéêÞò åðßäñáóçò. Åöüóïí ðáñáôçñåßôáé ìüíï ìßôùóç, èá ðñÝ ðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ï äåßêôçò ìéôþóåùò óå 1000 ôïõ ëÜ÷éóôïí êýôôáñá ãéá êÜèå æþï. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ãéá íá èåùñçèåß Ýíá áðïôÝëåóìá ùò èåôéêü åöáñìüæï íôáé äéÜöïñá êñéôÞñéá üðùò ç ó÷åôéæüìåíç ìå ôç äüóç áý îçóç óôï ó÷åôéêü áñéèìü êõôôÜñùí ìå ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò Þ ç óáöÞò áýîçóç óôïí áñéèìü ôùí êõôôÜñùí ìå åêôñïðÝò óå ìßá ìüíç äüóç óå ìßá ìüíç äåéãìáôïëç øßá. Ðñþôá èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêü ôçôá ôùí áðïôåëåóìÜôùí. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìï ðïéïýíôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèïäïé (8). Óå ìßá èåôéêÞ áðü êñéóç äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäéêüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜ ãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôéóôéêÞ óçìáíôéêüôçôá. Ôõ÷üí äéöïñïýìåíá áðïôåëÝóìáôá èá ðñÝðåé íá äéáóáöçíßæï íôáé ìå ðåñáéôÝñù äïêéìÝò ôñïðïðïéþíôáò, êáôÜ ðñïôß ìçóç, ôéò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ãéá ìßá õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðëçñïýí ôá áíùôÝñù êñéôÞñéá, ç ïõóßá áõôÞ èåùñåßôáé ùò ìç ìåôáëëáîéãüíïò óôç äïêéìÞ áõôÞ. Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôçí in vivo äïêéìÞ óðåñìï ãïíéáêÞò ÷ñùìïóùìéêÞò åêôñïðÞò äåß÷íïõí üôé ç õðü äï êéìÞ ïõóßá åðÜãåé äïìéêÝò ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñïðÝò óôá ãåííçôéêÜ êýôôáñá ôùí åîåôáóèÝíôùí åéäþí. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêé ìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åðÜãåé ÷ñùìïóùìéêÝò åêôñï ðÝò óôá ãåííçôéêÜ êýôôáñá ôùí åîåôáóèÝíôùí åéäþí. Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ðéèáíüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò Þ ôùí ìåôáâïëéôþí ôçò íá öèÜíåé óôïí éóôü óôü÷ï. 3. ÅÊÈÅÓÇ ÁÍÁÖÏÑÁÓ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõ ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1877 èá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, ÅîåôáóèÝíôá æþá: � ÷ñçóéìïðïéçèÝí åßäïò/öõëÞ, � áñéèìü êáé çëéêßá ôùí æþùí, � ðçãÞ, óõíèÞêåò óôÝãáóçò, äßáéôá, êëð, � âÜñïò ôùí ìåìïíùìÝíùí æþùí óôçí Ýíáñîç ôçò äïêé ìÞò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíïõ ôïõ åýñïõò ôùí âáñþí óþ ìáôïò, ôçò ìÝóçò ôéìÞò êáé ôçò ôõðéêÞò áðüêëéóçò ãéá êÜ èå ïìÜäá. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � óôïé÷åßá áðü ôç ìåëÝôç ôïõ åýñïõò, åöüóïí Ýãéíå, � áéôéïëïãßá ôçò åðéëïãÞò ôïõ åðéðÝäïõ äüóåùò, � áéôéïëïãßá ôçò ÷ñçóéìïðïéçèåßóáò ïäïý ÷ïñÞãçóçò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôç ÷ïñÞãçóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, � áéôéïëïãßá ôïõ ÷ñïíéêïý óçìåßïõ ôçò èõóßáò, � ìåôáôñïðÞ ôçò óõãêÝíôñùóçò (ppm) ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôç äßáéôá/ðüóéìï íåñü óôçí ðñáãìáôéêÞ äüóç (mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá), åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðå ñßðôùóç, � óôïé÷åßá ãéá ôçí ðïéüôçôá ôçò ôñïöÞò êáé ôïõ íåñïý, � ëåðôïìåñÞ ðåñéãñáöÞ ôùí ó÷çìÜôùí áãùãÞò êáé äåéãìáôïëçøßáò, � ìåèüäïõò ãéá ôéò ìåôñÞóåéò ôçò ôïîéêüôçôáò, � ôáõôüôçôá ôçò ïõóßáò áíáóôïëÞò ôçò ìåôÜöáóçò, óõãêÝíôñùóç áõôÞò êáé äéÜñêåéá ôçò áãùãÞò, � ìåèüäïõò åôïéìáóßáò áíôéêåéìåíïöüñùí, � êñéôÞñéá ãéá ôç ìÝôñçóç ôùí åêôñïðþí, � áñéèìü åîåôáóèÝíôùí êõôôÜñùí áíÜ æþï, � êñéôÞñéá êáôÜôáîçò ôçò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôé êÞò Þ äéöïñïýìåíçò. ÁðïôåëÝóìáôá: � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � ìéôùôéêü äåßêôç, � ëüãï óðåñìïãïíéáêþí ìéôþóåùí ðñïò ðñþôç êáé äåý ôåñç ìåéùôéêÝò ìåôáöÜóåéò, � ôýðï êáé áñéèìü åêôñïðþí îå÷ùñéóôÜ ãéá êÜèå æþï, � ïëéêü áñéèìü åêôñïðþí áíÜ ïìÜäá, � áñéèìü êõôôÜñùí ìå åêôñïðÝò áíÜ ïìÜäá, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò áíáëýóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò, � ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò. � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò èåôéêïýò ìÜñôõñåò, � áëëáãÝò óôçí ðëïåéäßá, åöüóïí ðáñáôçñÞèçêáí. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of En vironmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Ap plied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Mag nusson, J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484. 2. Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306. 3. Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294. 4. Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Rec ommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 5. Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chro mosomes. Mutation Res., 52, 207-209. 6. Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Gen eroso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318. 7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Re port of British Toxicology Society/UK Environmental Muta gen Society Working group: Dose setting in In Vivo Muta genicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319. 8. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evalu ation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232. ÐáñÜñôçìá 2Æ B.39. ÄÏÊÉÌÇ ÌÇ ÐÑÏÃÑÁÌÌÁÔÉÓÌÅÍÇÓ ÓÕÍ ÈÅÓÇÓ DNA (UDS) ÌÅ ÇÐÁÔÉÊÁ ÊÕÔÔÁÑÁ ÈÇËÁÓÔÉÊÙÍ IN VIVO 1. MEÈÏÄÏÓ Ç ðáñïýóá ìÝèïäïò áðïôåëåß áíôßãñáöï ôçò OECD TG 486, Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mam malian Liver Cells In Vivo (1997). 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Óêïðüò ôçò äïêéìÞò ìç ðñïãñáììáôéóìÝíçò óýíèåóçò DNA (UDS) ìå çðáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí in vivo åßíáé ç áíáãíþñéóç ïõóéþí ðïõ åðÜãïõí åðéäéüñèùóç ôïõ DNA óôá çðáôéêÜ êýôôáñá õðïâëçèÝíôùí óå áãùãÞ æþùí (âë. 1,2,3,4). ÁõôÞ ç in vivo äïêéìÞ ðáñÝ÷åé ìÝèïäï ãéá ôç äéåñåýíç óç ôùí ãïíïôïîéêþí åðéäñÜóåùí ÷çìéêþí ïõóéþí óôï Þðáñ. Ôï ìåôñïýìåíï ôåëéêü óçìåßï åßíáé åíäåéêôéêü ôçò âëÜâçò ôïõ DNA êáé ôçò åðáêüëïõèçò åðéäéüñèùóçò óôá çðáôéêÜ êýôôáñá. Ôï Þðáñ åßíáé óõíÞèùò ï êõñéüôåñïò ôüðïò ìåôáâïëéóìïý ôùí áðïññïöïõìÝíùí åíþóåùí. Áðïôåëåß óõíåðþò ðñüóöïñï ôüðï ãéá ôç ìÝôñçóç ôçò âëÜâçò ôïõ DNA in vivo. Eöüóïí õðÜñ÷ïõí åíäåßîåéò üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí èá öèÜóåé óôïí éóôü-óôü÷ï, äåí åíäåßêíõôáé íá ÷ñçóéìï ðïéåßôáé ç äïêéìÞ áõôÞ. Ôï ôåëéêü óçìåßï ôçò ìç ðñïãñáììáôéóìÝíçò óýíèåóçò DNA (UDS) ìåôñéÝôáé ðñïóäéïñßæïíôáò ôçí ðñüóëçøç 1878 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) åðéóçìáóìÝíùí íïõêëåïóéäßùí óå êýôôáñá ðïõ äåí õðü êåéíôáé óå ðñïãñáììáôéóìÝíç (S-öÜóç) óýíèåóç DNA. H åõñýôåñá ÷ñçóéìïðïéïýìåíç ôå÷íéêÞ åßíáé ï ðñïóäéïñé óìüò ôçò ðñüóëçøçò åðéóçìáóìÝíçò ìå ôñßôéï èõìéäßíçò (3Ç-ÔdR) ìå áõôïáêôéíïãñÜöçóç. Ãéá ôéò in vivo äïêéìÝò UDS ÷ñçóéìïðïéåßôáé êáôÜ ðñïôßìçóç Þðáñ áðü åðßìõåò. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëïé éóôïß áíôß ãéá Þðáñ, áõôü üìùò äåí áðïôåëåß áíôéêåßìåíï ôçò ðáñïýóáò ìåèüäïõ. Ç áíß÷íåõóç áðïêñßóåùò UDS åîáñôÜôáé áðü ôïí áñéè ìü ôùí âÜóåùí DNA ðïõ áðïêüðçêáí êáé áíôéêáôáóôÜèç êáí óôï óçìåßï ôçò âëÜâçò. Óõíåðþò, ç äïêéìÞ UDS Ý÷åé éäéáßôåñç áîßá ãéá ôçí áíß÷íåõóç åêôåôáìÝíùí åðéäéïñèþ óåùí (20-30 âÜóåéò) ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ïõóßåò. Áíôé èÝôùò, ïé ðåñéïñéóìÝíåò åðéäéïñèþóåéò (1-3 âÜóåéò) áíé ÷íåýïíôáé ìå ðïëý ìéêñüôåñç åõáéóèçóßá. ÐåñáéôÝñù, ìå ôáëëáîéãüíá óõìâÜíôá ìðïñåß íá ðñïêýøïõí ëüãù ìç åðéäéüñèùóçò, êáêÞò åðéäéüñèùóçò Þ êáêÞò áíôéãñáöÞò áëëïéþóåùí DNA. H Ýêôáóç ôçò áðüêñéóçò UDS äåí áðï ôåëåß Ýíäåéîç ãéá ôçí ðéóôüôçôá ôçò äéåñãáóßáò åðéäéüñ èùóçò. ÅðéðëÝïí, ìðïñåß Ýíá ìåôáëëáîïãüíï íá áíôéäñÜ ìå ôï DNA áëëÜ ç âëÜâç ôïõ DNA íá ìçí åðéäéïñèþíåôáé ìå ôç äéåñãáóßá ôçò åðéäéüñèùóçò áðïêïðÞò. Ç Ýëëåéøç åîåéäéêåõìÝíùí ðëçñïöïñéþí ãéá ôç ìåôáëëáîéãüíï äñá óôéêüôçôá áðü ôç äïêéìÞ UDS áíôéóôáèìßæåôáé áðü ôçí åí äõíÜìåé åõáéóèçóßá áõôïý ôïõ ôåëéêïý óçìåßïõ åðåéäÞ ìåôñéÝôáé óå ïëüêëçñï ôï ãïíéäßùìá. Âë. åðßóçò ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ÌÝñïò B. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ Êýôôáñá óå åðéäéüñèùóç: êáèáñüò ðõñçíéêü êüêêïò (NNG) ìåãáëýôåñïò áðü ìßá ðñïêáèïñéóìÝíç ôéìÞ ðïõ ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé áðü ôï åñãáóôÞñéï ðïõ äéåîÜãåé ôç äïêéìÞ. Êáèáñïß ðõñçíéêïß êüêêïé (NNG): ðïóïôéêü ìÝôñï ôçò UDS äñáóôéêüôçôáò êõôôÜñùí óå áõôïáêôéíïãñáöéêÝò äïêéìÝò UDS ðïõ õðïëïãßæåôáé áöáéñþíôáò ôï ìÝóï áñéè ìü êõôôáñïðëáóìáôéêþí êüêêùí óå ðõñçíïúóïäýíáìåò êõôôáñïðëáóìáôéêÝò ðåñéï÷Ýò (CG) áðü ôïí áñéèìü ôùí ðõñçíéêþí êüêêùí (NG): NNG = NG - CG. Ï áñéèìüò ôùí NNG õðïëïãßæåôáé ãéá ôá ìåìïíùìÝíá êýôôáñá êáé êáôü ðéí áèñïßæïíôáé ãéá ôá êýôôáñá ìéáò êáëëéÝñãåéáò, ðá ñÜëëçëùí êáëëéåñãåéþí, êëð. Ìç ðñïãñáììáôéóìÝíç óýíèåóç DNA (UDS): Åðéäéïñ èùôéêÞ óýíèåóç DNA ìåôÜ ôçí áðïêïðÞ êáé áðïìÜêñõí óç ôìÞìáôïò DNA ðïõ ðåñéëáìâÜíåé ðåñéï÷Þ ðïõ Ý÷åé õðïóôåß âëÜâç ðñïêëçèåßóá áðü ÷çìéêÝò ïõóßåò Þ öõóé êïýò ðáñÜãïíôåò. 1.3 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ Ç äïêéìÞ UDS ìå çðáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí in vivo äåß÷íåé åðéäéïñèùôéêÞ óýíèåóç DNA ìåôÜ ôçí áðïêïðÞ êáé áðïìÜêñõíóç ôìÞìáôïò DNA ðïõ ðåñéëáìâÜíåé ðå ñéï÷Þ ðïõ Ý÷åé õðïóôåß âëÜâç áðü ÷çìéêÝò ïõóßåò Þ öõóé êïýò ðáñÜãïíôåò. Ç äïêéìÞ óôçñßæåôáé óõíÞèùò óôçí ðñïóèÞêç 3H-TdR óôï DNA çðáôéêþí êõôôÜñùí ðïõ åì öáíßæïõí ÷áìçëÞ óõ÷íüôçôá êõôôÜñùí óôçí S-öÜóç ôïõ êõôôáñéêïý êýêëïõ. Ç ðñüóëçøç 3H-TdR ðñïóäéïñßæåôáé óõíÞèùò ìå áõôïáêôéíïãñÜöçóç åðåéäÞ ç ôå÷íéêÞ áõôÞ äåí åßíáé ôüóï åðéäåêôéêÞ óå ðáñåìâïëÝò áðü êýôôáñá S öÜóçò üðùò, ð.÷., ç õãñÞ óðéíèçñïãñáößá. 1.4 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ 1.4.1 Ðñïåôïéìáóßåò 1.4.1.1 ÅðéëïãÞ æùúêþí åéäþí ÓõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïýíôáé åðßìõåò, áí êáé ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëá êáôÜëëçëá åßäç èçëáóôéêþí. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óõíÞèùò ÷ñçóéìïðïéïý ìåíåò åñãáóôçñéáêÝò öõëÝò íåáñþí õãéþí åíÞëéêùí æþ ùí. Óôçí áñ÷Þ ôçò äïêéìÞò, ïé äéáöïñÝò óôá âÜñç ôùí æþ ùí èá ðñÝðåé íá åßíáé åëÜ÷éóôåò êáé íá ìçí õðåñâáßíïõí ôï ± 20% ôïõ ìÝóïõ âÜñïõò ãéá êÜèå öýëï. 1.4.1.2 ÓõíèÞêåò óôÝãáóçò êáé äéáôñïöÞò Åöáñìüæïíôáé ïé ãåíéêÝò óõíèÞêåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôç ÃåíéêÞ ÅéóáãùãÞ ôïõ ÌÝñïõò Â, áí êáé ï óôü÷ïò ãéá ôçí õãñáóßá èá ðñÝðåé íá åßíáé 50-60%. 1.4.1.3 Ðñïåôïéìáóßá ôùí æþùí ÕãéÞ íåáñÜ åíÞëéêá æþá ÷ùñßæïíôáé ôõ÷áßá óå ïìÜäåò ìáñôõñßáò êáé áãùãÞò. Ôá êëïõâéÜ èá ðñÝðåé íá äéáôÜó óïíôáé ìå ôÝôïéï ôñüðï þóôå íá åëá÷éóôïðïéïýíôáé ôõ÷üí ðéèáíÝò åðéäñÜóåéò áðü ôç èÝóç ôùí êëïõâéþí. Ôá æþá ëáìâÜíïõí ìßá êáé ìïíáäéêÞ ôáõôüôçôá êáé ðáñáìÝíïõí óôá êëïõâéÜ ôïõò ôïõëÜ÷éóôïí ðÝíôå çìÝñåò ðñéí áðü ôçí Ýíáñîç ôçò äïêéìÞò ãéá íá ìðïñÝóïõí íá åãêëéìáôéóôïýí óôéò åñãáóôçñéáêÝò óõíèÞêåò. 1.4.1.4 Õðü äïêéìÞ ïõóßá/ðñïåôïéìáóßá ÓôåñåÝò õðü äïêéìÞ ïõóßåò èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé Þ íá ôßèåíôáé õðü ìïñöÞ åíáéùñÞìáôïò óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò Þ öïñåßò êáé íá áñáéþíïíôáé, åöüóïí ÷ñåéÜæå ôáé, ðñéí íá ÷ïñçãçèïýí óôá æþá. Oé õãñÝò õðü äïêéìÞ ïõ óßåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé áðåõèåßáò ùò Ý÷ïõí Þ íá áñáéþíïíôáé ðñéí áðü ôç ÷ïñÞãçóç. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóé ìïðïéïýíôáé ðñüóöáôá ðáñáóêåõÜóìáôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò åêôüò êé áí ôá óôïé÷åßá ó÷åôéêÜ ìå ôç óôáèåñüôç ôá ôçò ïõóßáò åðéôñÝðïõí ôç ÷ñÞóç Ýôïéìùí ðáñáóêåõá óìÜôùí . 1.4.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò 1.4.2.1 Äéáëýôçò/öïñÝáò Ï äéáëýôçò/öïñÝáò äåí èá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé ôïîéêÞ äñÜóç óôá ÷ñçóéìïðïéïýìåíá åðßðåäá äüóåùí áëëÜ ïý ôå êáé íá õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðéèáíÞ ÷çìéêÞ áíôßäñá óÞ ôïõ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá. Åöüóïí ï ÷ñçóéìïðïé ïýìåíïò äéáëýôçò/öïñÝáò äåí áíÞêåé óôïõò ãíùóôïýò, ç ÷ñÞóç ôïõ èá ðñÝðåé íá óôçñßæåôáé óôçí ýðáñîç óôïé÷åß ùí ðïõ áðïäåéêíýïõí ôç óõìâáôüôçôÜ ôïõ. ÓõíéóôÜôáé, åöüóïí åßíáé äõíáôü, íá åîåôÜæåôáé ðñþôá ç ÷ñÞóç åíüò õäáôéêïý äéáëýôç/öïñÝá. 1.4.2.2 ÌÜñôõñåò Óå êÜèå áíåîáñôÞôùò åêôåëïýìåíï ìÝñïò ôçò äïêéìÞò, èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïíôáé ôáõôü÷ñïíá èåôéêïß êáé áñ íçôéêïß (äéáëýôçò Þ öïñÝáò) ìÜñôõñåò. Ìå åîáßñåóç ôçí áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ôá æþá óôéò ïìÜäåò ìáñ ôõñßáò èá ðñÝðåé íá áíôéìåôùðßæïíôáé ìå ôïí ßäéï áêñéâþò ôñüðï ìå åêåßíï ôùí æþùí óôéò õðïâáëëüìåíåò óå áãùãÞ ïìÜäåò. Ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá åßíáé ïõóßåò ðïõ åßíáé ãíùóôü üôé åìöáíßæïõí ôï öáéíüìåíï ôçò UDS üôáí ÷ïñç ãïýíôáé óå äüóåéò åêèÝóåùò ðïõ áíáìÝíåôáé íá äþóïõí áíé÷íåýóéìç áýîçóç ðÜíù áðü ôï âáóéêü üñéï. Èåôéêïß ìÜñôõñåò ðïõ ÷ñåéÜæïíôáé ìåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé óå äüóåéò ðïõ ðáñÝ÷ïõí ìÝ ôñéá áðüêñéóç (4) Ïé äüóåéò ìðïñïýí íá åðéëÝãïíôáé Ýôóé þóôå ôá áðïôåëÝóìáôá íá åßíáé óáöÞ áëëÜ íá ìçí áðïêá ëýðôïõí áìÝóùò ôçí ôáõôüôçôá ôùí êùäéêïðïéçìÝíùí áíôéêåéìåíïöüñùí óôïí ðáñáôçñçôÞ. Ðáñáäåßãìáôá ïõ óéþí ðïõ ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ùò èåôéêïß ìÜñ ôõñåò åßíáé ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1879 Ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò êáôÜëëçëåò ïõóßåò. Åðßóçò, ïé èåôéêïß ìÜñôõñåò ìðïñïýí íá ÷ïñçãïýíôáé êáé áðü ïäü äéáöïñåôéêÞ áðü åêåßíç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. 1.5 ÄÉÁÄÉÊÁÓÉÁ 1.5.1 Áñéèìüò êáé öýëï ôùí æþùí Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé êáôÜëëçëïò áñéèìüò æþ ùí þóôå íá ëáìâÜíåôáé õðüøç ç öõóéêÞ âéïëïãéêÞ ðïéêé ëßá óôçí áðüêñéóç. ÊÜèå ïìÜäá èá ðñÝðåé íá áðïôåëåßôáé áðü 3 ôïõëÜ÷éóôïí æþá ãéá åîÝôáóç . Åöüóïí õðÜñ÷ïõí óçìáíôéêÜ ðñüôåñá óôïé÷åßá, ãéá ôéò ïìÜäåò ìÜñôõñåò, èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò, áðáéôïýíôáé ìüíïí 1 Þ 2 æþá. ÅÜí êáôÜ ôï ÷ñüíï ôçò Ýñåõíáò õðÜñ÷ïõí äéáèÝóéìá óôïé÷åßá áðü ìåëÝôåò óôï ßäéï åßäïò êáé ìå ôçí ßäéá ïäü Ýê èåóçò ðïõ áðïäåéêíýïõí üôé äåí õðÜñ÷ïõí ïõóéáóôéêÝò äéáöïñÝò óôçí ôïîéêüôçôá ìåôáîý ôùí öýëùí, ôüôå áñêåß ç äïêéìÞ íá ãßíåé óå æþá åíüò öýëïõ, êáôÜ ðñïôßìçóç áñ óåíéêÜ. Åöüóïí ç Ýêèåóç óå ìéá ÷çìéêÞ ïõóßá áöïñÜ ìü íï ôï Ýíá öýëï, üðùò ð.÷. óôçí ðåñßðôùóç öáñìáêåõôé êþí ïõóéþí, ç äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá ðñáãìáôïðïéåßôáé ìå æþá ôïõ áíôßóôïé÷ïõ öýëïõ. 1.5.2 ×ñïíïäéÜãñáììá áãùãÞò Ïé åîåôáæüìåíåò ïõóßåò ÷ïñçãïýíôáé åí ãÝíåé ìå ìßá ìü íç áãùãÞ. 1.5.3 Åðßðåäá äüóåùí ÊáíïíéêÜ, ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôïõëÜ÷éóôïí äýï åðßðåäá äüóåùí. Ç ìÝãéóôç äüóç ïñßæåôáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò ôÝôïéá þóôå ôõ÷üí õøçëüôåñá åðß ðåäá äüóçò, ìå âÜóç ôï ßäéï äïóïëïãéêü êáèåóôþò, íá áíáìÝíåôáé öõóéïëïãéêÜ íá ïäçãÞóïõí óå öáéíüìåíá èíçóéìüôçôáò. ÃåíéêÜ, ç ÷áìçëüôåñç äüóç áíôéóôïé÷åß óôï 50% Ýùò 25% ôçò õøçëÞò äüóçò. Ïõóßåò ìå åéäéêÝò âéïëïãéêÝò äñÜóåéò óå ÷áìçëÝò ìç ôïîéêÝò äüóåéò (üðùò ïñìüíåò êáé ìéôùãüíá) ìðïñåß íá áðïôåëïýí åîáéñÝóåéò óôá êñéôÞñéá ñýèìéóçò ôùí äüóå ùí êáé èá ðñÝðåé íá áîéïëïãïýíôáé êáôÜ ðåñßðôùóç. ÅÜí ðñáãìáôïðïéçèåß ìåëÝôç äéáðßóôùóçò ôïõ åýñïõò åðåé äÞ äåí õðÜñ÷ïõí êáôÜëëçëá äéáèÝóéìá äåäïìÝíá, ç ìå ëÝôç áõôÞ èá ðñÝðåé íá ðñáãìáôïðïéåßôáé óôï ßäéï åñãá óôÞñéï, ìå ôï ßäéï åßäïò, öõëÞ, öýëï êáé áãùãÞ ðïõ ÷ñç óéìïðïéïýíôáé êáé óôçí êýñéá ìåëÝôç. Ç ìÝãéóôç äüóç ìðïñåß åðßóçò íá ïñéóôåß êáé ùò ç äüóç ðïõ ðáñÝ÷åé åíäåßîåéò ôïîéêüôçôáò óôï Þðáñ (ð.÷. ðõêíù ôéêïýò ðõñÞíåò). 1.5.4 ÄïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò ÅÜí ìßá äïêéìÞ ìå Ýíá åðßðåäï äüóçò ôïõëÜ÷éóôïí 2000 mg/kg âÜñïõò óþìáôïò óôçí ïðïßá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìßá ìüíç áãùãÞ, Þ äýï áãùãÝò ôçí ßäéá ìÝñá, äåí äþóåé ïñá ôÜ ôïîéêÜ áðïôåëÝóìáôá, êáé åöüóïí äåí áíáìÝíåôáé ç åì öÜíéóç ãïíïôïîéêüôçôáò ìå âÜóç óôïé÷åßá áðü ïõóßåò ó÷åôéêÞò äïìÞò, ôüôå ìðïñåß íá ìçí åßíáé áíáãêáßá ç ðñáãìáôïðïßçóç ðëÞñïõò ìåëÝôçò. Ç áíáìåíüìåíç áí èñþðéíç Ýêèåóç ìðïñåß íá äþóåé ìßá Ýíäåéîç ãéá ôï áí ÷ñåéÜæåôáé íá ÷ñçóéìïðïéçèåß õøçëüôåñï åðßðåäï äüóçò óôç äïêéìÞ ïñéáêÞò äüóçò. 1.5.5 ×ïñÞãçóç äüóåùí Ç õðü äïêéìÞ ïõóßá ÷ïñçãåßôáé óõíÞèùò ìå äéáóùëÞ íùóç ÷ñçóéìïðïéþíôáò óôïìá÷éêü óùëÞíá Þ êáôÜëëçëï óùëÞíá äéáóùëÞíùóçò. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ïäïß Ýêèåóçò åöüóïí ìðïñïýí íá áéôéïëïãç èïýí. Äåí óõíéóôÜôáé ðÜíôùò ç åíäïðåñéôïíáúêÞ ïäüò åðåéäÞ ìå ôïí ôñüðï áõôü ôï Þðáñ ìðïñåß íá åêôåèåß áðåõèåßáò óôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá áíôß ìÝóù ôïõ êõêëï öïñéáêïý óõóôÞìáôïò. Ï ìÝãéóôïò üãêïò õãñïý ðïõ ìðïñåß íá ÷ïñçãçèåß ìå äéáóùëÞíùóç Þ Ýã÷õóç åöÜðáî åîáñôÜôáé áðü ôï ìÝãåèïò ôïõ ðåéñáìáôüæùïõ. Ï üãêïò äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôá 2 ml/100g âÜñïõò óþìá ôïò. Áí ÷ñçóéìïðïéçèïýí ìåãáëýôåñïé üãêïé, áõôü ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. Ìå åîáßñåóç ôéò åñåèéóôéêÝò Þ äéáâñùôé êÝò ïõóßåò ïé ïðïßåò êáíïíéêÜ åìöáíßæïõí åíôïíüôåñá áðïôåëÝóìáôá óå õøçëüôåñåò óõãêåíôñþóåéò, ïé äéáöï ñïðïéÞóåéò óôïí üãêï èá ðñÝðåé íá åëá÷éóôïðïéïýíôáé ðñïóáñìüæïíôáò ôç óõãêÝíôñùóç þóôå íá äéáóöáëßæå ôáé óôáèåñüò üãêïò óå üëá ôá åðßðåäá äüóçò. 1.5.6 Ðñïåôïéìáóßá ôùí çðáôéêþí êõôôÜñùí Ôá çðáôéêÜ êýôôáñá ëáìâÜíïíôáé áðü õðïâëçèÝíôá óå áãùãÞ æþá êáíïíéêÜ 12-16 þñåò ìåôÜ ôç ÷ïñÞãçóç. ×ñåé Üæåôáé åí ãÝíåé ìßá ðñüóèåôç ðñþúìç äåéãìáôïëçøßá (êá íïíéêÜ 2-4 þñåò ìåôÜ ôçí áãùãÞ) åêôüò êé áí õðÜñ÷åé óá öÞò èåôéêÞ áðüêñéóç óôéò 12-16 þñåò. Åíôïýôïéò, ìðï ñïýí íá ãßíïõí äåéãìáôïëçøßåò óå åíáëëáêôéêÜ ÷ñïíéêÜ äéáóôÞìáôá åöüóïí ôïýôï áéôéïëïãåßôáé ìå âÜóç ôïîéêï êéíçôéêÜ äåäïìÝíá. Âñá÷õðñüèåóìåò êáëëéÝñãåéåò çðáôéêþí êõôôÜñùí èçëáóôéêþí ðáñáóêåõÜæïíôáé óõíÞèùò åã÷ýïíôáò åðéôï ðßùò óôï Þðáñ êïëëáãåíÜóç êáé áöÞíïíôáò ôá ðñïóöÜ ôùò äéáóôáèÝíôá çðáôéêÜ êýôôáñá íá ðñïóêïëëçèïýí óå êÜôÜëëçëç åðéöÜíåéá. Ôá çðáôéêÜ êýôôáñá áðü áñíçôé êïýò ìÜñôõñåò èá ðñÝðåé íá åìöáíßæïõí âéùóéìüôçôá (5) ôïõëÜ÷éóôïí 50%. 1.5.7 Ðñïóäéïñéóìüò ôçò UDS ÐñïóöÜôùò áðïìïíùèÝíôá çðáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôé êþí åðùÜæïíôáé óõíÞèùò óå ìÝóï ðïõ ðåñéÝ÷åé 3H-TdR ãéá êáôÜëëçëï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá, ð.÷. 3-8 þñåò. Óôï ôÝëïò ôçò ðåñéüäïõ åðùÜóåùò, ôï ìÝóï ðñÝðåé íá áðïìáêñý íåôáé áðü ôá êýôôáñá ôá ïðïßá ìðïñïýí êáôüðéí íá åðù áóôïýí óå ìÝóï ðïõ ðåñéÝ÷åé ðåñßóóåéá ìç åðéóçìáóìÝ íçò èõìéäßíçò ãéá íá ìåéùèåß ç ìç åíóùìáôùìÝíç ñáäéÝ íåñãåéá ("cold chase"). Ôá êýôôáñá êáôüðéí åêðëÝíïíôáé, óôåñåþíïíôáé êáé îçñáßíïíôáé. Ãéá ìåãáëýôåñïõò ÷ñü íïõò åðùÜóåùò, ìðïñåß íá ìç ÷ñåéÜæåôáé ç öÜóç ôçò "cold chase". Ïé áíôéêåéìåöüñïé ðëÜêåò âõèßæïíôáé óå áõ 1880 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ôïáêôéíïãñáöéêü ãáëÜêôùìá, åêôßèåíôáé óôï óêüôïò (ð.÷. øý÷ïíôáé ãéá 7-14 çìÝñåò), áíáðôýóóïíôáé, ÷ñùìáôßæï íôáé êáé ìåôñïýíôáé ïé åêôåèåéìÝíïé êüêêïé áñãýñïõ. Ãéá êÜèå æþï åôïéìÜæïíôáé äýï Ýùò ôñåéò áíôéêåéìåíïöüñïé ðëÜêåò. 1.5.8 AíÜëõóç Ôá áíôéêåéìåíïöüñá ðáñáóêåõÜóìáôá èá ðñÝðåé íá ðå ñéÝ÷ïõí éêáíü áñéèìü êõôôÜñùí êáíïíéêÞò ìïñöïëïãßáò ãéá íá ìðïñåß íá ãßíåé óçìáíôéêÞ åêôßìçóç ôçò UDS. Ôá ðá ñáóêåõÜóìáôá åîåôÜæïíôáé ìå ìéêñïóêüðéï ãéá íá äéáðé óôùèåß áí õðÜñ÷ïõí óçìÜäéá Ýêäçëçò êõôôáñïôïîéêüôç ôáò. (ð.÷. ðýêíùóç, ìåéùìÝíá åðßðåäá ñáäéïåðéóÞìáí óçò). Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïõí Ýíá êùäé êü ðñéí áðü ôçí êáôáìÝôñçóç ôùí êüêêùí. ÊáíïíéêÜ ìå ôñïýíôáé 100 êýôôáñá áðü êÜèå æþï áðü äýï ôïõëÜ÷éóôïí áíôéêåéìåíïöüñïõò ðëÜêåò. Ôõ÷üí êáôáìÝôñçóç ëéãüôå ñùí ôùí 100 êõôôÜñùí/æþï èá ðñÝðåé íá áéôéïëïãåßôáé. Ãéá ôïõò ðõñÞíåò S-öÜóåùò äåí ìåôñéÝôáé ï áñéèìüò êüê êùí, ìðïñåß üìùò íá êáôáãñáöåß ç áíáëïãßá ôùí êõôôÜ ñùí S-öÜóåùò. Ç ðïóüôçôá ôçò åíóùìáôùìÝíçò 3H-TdR óôïõò ðõñÞ íåò êáé ôï êõôôáñüðëáóìá ìïñöïëïãéêþò êáíïíéêþí êõô ôÜñùí, üðùò äåéêíýåôáé áðü ôçí åíáðüèåóç êüêêùí áñ ãýñïõ, èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ìå êáôÜëëçëåò ìå èüäïõò. Ðñïóäéïñßæåôáé ï áñéèìüò êüêêùí óôïõò ðõñÞíåò (ðõ ñçíéêïß êüêêïé, NG) êáé óôéò ðõñçíïúóïäýíáìåò ðåñéï÷Ýò óôï êõôôáñüðëáóìá (êõôôáñïðëáóìáôéêïß êüêêïé, CG). Ïé CG ìåôñéþíôáé åßôå áðü ôçí éó÷õñüôåñá åðéóçìáóìÝíç ðåñéï÷Þ ôïõ êõôôáñïðëÜóìáôïò, åßôå áðü ôï ìÝóï üñï äýï Þ ôñéþí ôõ÷áßùí áñéèìþí êõôôáñïðëáóìáôéêþí êüê êùí êïíôÜ óôïí ðõñÞíá. Ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ìÝèïäïé êáôáìÝôñçóçò (ð.÷. êáôáìÝôñçóç óå ïëüêëçñï ôï êýôôáñï) åöüóïí õðÜñ÷åé êáôÜëëçëç áéôéï ëüãçóç (6). 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Èá ðñÝðåé íá äßíïíôáé åðéìÝñïõò áðïôåëÝóìáôá ãéá êÜ èå áíôéêåéìåíïöüñï êáé êÜèå æþï. ÅðéðëÝïí, üëá ôá äå äïìÝíá èá ðñÝðåé íá óõíïøßæïíôáé ìå ôç ìïñöÞ ðßíáêá. Ï áñéèìüò ôùí êáèáñþí ðõñçíéêþí êüêêùí (NNG) èá ðñÝ ðåé íá õðïëïãßæåôáé ãéá êÜèå êýôôáñï, ãéá êÜèå æþï êáé ãéá êÜèå äüóç êáé ÷ñïíéêÞ óôéìÞ áöáéñþíôáò ôïí áñéèìü ôùí CG áðü ôïí áñéèìü ôùí NG. Åöüóïí ìåôñçèïýí ôá "êýô ôáñá óå åðéäéüñèùóç", èá ðñÝðåé ôá êñéôÞñéá ãéá ôïí ïñé óìü ôùí "êõôôÜñùí óå åðéäéüñèùóç" íá áéôéïëïãïýíôáé êáé íá óôçñßæïíôáé óå ðñïûðÜñ÷ïíôá Þ ðáñÜëëçëá óôïé ÷åßá áñíçôéêþí ìáñôýñùí. ÁñéèìçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá ìðïñïýí íá åîá÷èïýí ìå óôáôéóôéêÝò ìåèüäïõò. Åöüóïí ÷ñçóéìïðïéïýíôáé, ïé óôáôéóôéêÝò äïêéìÝò èá ðñÝðåé íá åðéëÝãïíôáé êáé íá áéôéïëïãïýíôáé ðñéí áðü ôç äéåîáãùãÞ ôçò Ýñåõíáò.. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ Ðáñáäåßãìáôá êñéôçñßùí ãéá áðïêñßóåéò èåôéêÝò/áñíç ôéêÝò åßíáé ôá áêüëïõèá: èåôéêÝò (i) ôéìÝò NNG ìåãáëýôåñåò åíüò ðñïêáèïñé óìÝíïõ êáôþôåñïõ ïñßïõ ðïõ áéôéïëïãåßôáé ìå âÜóç åñ ãáóôçñéáêÜ ðñïûðÜñ÷ïíôá äåäïìÝíá, Þ (ii) ôéìÝò NNG óçìáíôéêÜ ìåãáëýôåñåò áðü ôïõ ðá ñÜëëçëïõ ìÜñôõñá, áñíçôéêÝò (i) ôéìÝò NNG ìÝóá Þ êÜôù áðü ôá ðñïûðÜñ ÷ïíôá äåäïìÝíá ãéá ôï êáôþôåñï üñéï ìÜñôõñá, Þ (ii) ôéìÝò NNG ìç óçìáíôéêÜ ìåãáëýôåñåò áðü ôïí ðá ñÜëëçëï ìÜñôõñá. Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç âéïëïãéêÞ ó÷åôéêüôçôá ôùí äåäïìÝíùí, äçë. èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðüøç ðáñÜ ìåôñïé üðùò ç ìåôáîý ôùí æþùí äéáêýìáíóç, ç ó÷Ýóç äü óçò-áðüêñéóçò êáé ç êõôôáñïôïîéêüôçôá. Ùò âïÞèçìá óôçí áîéïëüãçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí äïêéìþí ìðï ñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáé óôáôéóôéêÝò ìÝèïäïé. ÐÜ íôùò, óå ìßá èåôéêÞ áðüêñéóç, äåí èá ðñÝðåé ùò ìïíáäé êüò áðïöáóéóôéêüò ðáñÜãïíôáò íá ëáìâÜíåôáé ç óôáôé óôéêÞ óçìáíôéêüôçôá Áí êáé ôá ðåñéóóüôåñá ðåéñÜìáôá èá äßíïõí óáöþò èå ôéêÜ Þ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, óå óðÜíéåò ðåñéðôþóåéò ôá äåäïìÝíá åíäÝ÷åôáé íá ìçí åðéôñÝðïõí ôç åîáãùãÞ ïñéóôéêïý óõìðåñÜóìáôïò ó÷åôéêÜ ìå ôç äñáóôéêüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá áðïôåëÝóìáôá ìðïñåß íá ðá ñáìÝíïõí äéöïñïýìåíá Þ áìöéóâçôÞóéìá Üó÷åôá ìå ôï ðüóåò öïñÝò èá åðáíáëçöèåß ôï ðåßñáìá. ÈåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá áðü ôç äïêéìÞ UDS ìå çðáôéêÜ êýôôáñá èçëáóôéêþí in vivo äåß÷íïõí üôé ç õðü äïêéìÞ ïõ óßá ðñïêáëåß âëÜâç óôï DNA óå çðáôéêÜ êýôôáñá èçëá óôéêþí in vivo ðïõ ìðïñåß íá åðéäéïñèùèåß ìå ìç ðñï ãñáììáôéóìÝíç óýíèåóç DNA in vitro.. ÁñíçôéêÜ áðïôåëÝ óìáôá äåß÷íïõí üôé, õðü ôéò óõíèÞêåò ôçò äïêéìÞò, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí ðñïêáëåß âëÜâç óôï DNA ðïõ íá ìðïñåß íá áíé÷íåõèåß ìå ôç äïêéìÞ áõôÞ. Èá ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé ç ðéèáíüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò íá öèÜóåé óôç ãåíéêÞ êõêëïöïñßá Þ åéäéêÜ óôïí éóôü óôü÷ï (ð.÷. óõóôåìéêÞ ôïîéêüôçôá). 3. ÁÍÁÖÏÑÁ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõ èá óôïé÷åßá: Äéáëýôçò/ÖïñÝáò � áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ öïñÝá, � äéáëõôüôçôá êáé óôáèåñüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôï äéáëýôç/öïñÝá, åöüóïí åßíáé ãíùóôÝò, ÅîåôáóèÝíôá æþá: � ÷ñçóéìïðïéçèÝí åßäïò/öõëÞ, � áñéèìü, çëéêßá êáé öýëï ôùí æþùí, � ðçãÞ, óõíèÞêåò óôÝãáóçò, äßáéôá, êëð, � âÜñïò ôùí ìåìïíùìÝíùí æþùí óôçí Ýíáñîç ôçò äïêé ìÞò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíïõ ôïõ åýñïõò ôùí âáñþí óþ ìáôïò, ôçò ìÝóçò ôéìÞò êáé ôçò ôõðéêÞò áðüêëéóçò ãéá êÜ èå ïìÜäá. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: � èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò (öïñÝá/äéáëýôç) ìÜñôõñåò, � óôïé÷åßá áðü ôç ìåëÝôç åýñåóçò ôïõ åýñïõò, åöüóïí Ýãéíå, � áéôéïëïãßá åðéëïãÞò ôïõ åðéðÝäïõ äüóåùò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôç ÷ïñÞãçóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, � áéôéïëïãßá ôçò åðéëåãåßóáò ïäïý ÷ïñÞãçóçò, � ìåèüäïõò åðáëÞèåõóçò üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá Ýöèá óå óôç ãåíéêÞ êõêëïöïñßá Þ óôïí éóôü-óôü÷ï, åöüóïí óõ íôñÝ÷åé ðåñßðôùóç, � ìåôáôñïðÞ ôçò óõãêÝíôñùóçò (ppm) ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôç äßáéôá/ðüóéìï íåñü óôçí ðñáãìáôéêÞ äüóç (mg/kg âÜñïõò óþìáôïò/çìÝñá), åöüóïí óõíôñÝ÷åé ðå ñßðôùóç, ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1881 � ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðïéüôçôá ôçò ôñïöÞò êáé ôïõ íå ñïý, � ëåðôïìåñÞ ðåñéãñáöÞ ôùí ó÷çìÜôùí áãùãÞò êáé äåéãìáôïëçøßáò, � ìåèüäïõò ãéá ôéò ìåôñÞóåéò ôçò ôïîéêüôçôáò, � ìåèüäïõò ðñïåôïéìáóßáò êáé êáëëéÝñãåéáò ôùí çðá ôéêþí êõôôÜñùí, � ÷ñçóéìïðïéçèåßóá áõôïáêôéíïãñáöéêÞ ôå÷íéêÞ, � áñéèìü áíôéêåéìåíïöüñùí ðëáêþí êáé áñéèìïýò êá ôáìåôñçèÝíôùí êõôôôÜñùí, � êñéôÞñéá áîéïëüãçóçò, � êñéôÞñéá êáôÜôáîçò ôçò äïêéìÞò ùò èåôéêÞò, áñíçôé êÞò Þ äéöïñïýìåíçò. ÁðïôåëÝóìáôá: � ìÝóåò ôéìÝò êáôÜ áíôéêåéìåíïöüñï, æþï êáé ïìÜäá ãéá ôïõò ðõñçíéêïýò êüêêïõò, êõôôáñïðëáóìáôéêïýò êüê êïõò êáé êáèáñïýò ðõñçíéêïýò êüêêïõò, � ó÷Ýóç äüóçò-áðüêñéóçò, üðïõ åßíáé äõíáôü, � óôáôéóôéêÝò åêôéìÞóåéò, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, � óçìÜäéá ôïîéêüôçôáò, � ðáñÜëëçëá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, � ðñïûðÜñ÷ïíôá óôïé÷åßá ãéá ôïõò áñíçôéêïýò (äéáëý ôçò/öïñÝáò) êáé èåôéêïýò ìÜñôõñåò, ìå åýñç, ìÝóåò ôéìÝò êáé ôõðéêÝò áðïêëßóåéò, � áñéèìü "êõôôÜñùí óå åðéäéüñèùóç", åöüóïí ðñïó äéïñßóôçêå, � áñéèìü êõôôÜñùí "S-öÜóåùò", åöüóïí ðñïóäéïñß óôçêå, � âéùóéìüôçôá ôùí êõôôÜñùí. ÅîÝôáóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí. ÓõìðåñÜóìáôá. 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. (1985). An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay. Mutation Res., 156, 1-18. 2. Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Proto col and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res. 189, 123-133. 3. Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Bur linson, B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77. 4. Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Bur linson, B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., Mc Queen, C.A. and Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo. Mutation Res., 312, 263-285. 5. Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberg er-Freudl, C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, 21-27. 6. Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mu tagen, 4, 553-562. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ 2Ç B.40. ÄÉÁÂÑÙÓÇ ÔÏÕ ÄÅÑÌÁÔÏÓ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Ôï ÅõñùðáÀêü ÊÝíôñï Åðéêýñùóçò Åíáëëáêôéêþí Ìå èüäùí (ÅÊÅÅÌ, Êïéíü ÊÝíôñï Åñåõíþí, ÅõñùðáúêÞ Åðé ôñïðÞ) Ý÷åé åãêñßíåé ùò åðéóôçìïíéêÜ Ýãêõñåò äýï in vitro äïêéìÝò äåñìáôéêÞò äéáâñùôéêüôçôáò, ôç äïêéìáóßá äéá äåñìéêÞò çëåêôñéêÞò áíôßóôáóçò (TER - transcutaneous electrical resistance) äÝñìáôïò åðßìõïò êáé äïêéìÞ ðïõ ÷ñçóéìïðïéåß ïìïßùìá áíèñùðßíïõ äÝñìáôïò (1)(2)(3). Ç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ôïõ ÅÊÅÅÌ êáôÝäåéîå üôé êáé ïé äýï äïêéìÝò åßíáé óå èÝóç íá äéáêñßíïõí ìå áîéüðéóôï ôñüðï ãíùóôÝò äéáâñùôéêÝò áðü ìç äéáâñùôéêÝò ïõóßåò ôïõ äÝñìáôïò. ÐÝñáí ôïýôïõ, ôï ðñùôüêïëëï ôçò äïêéìÞò ìå ïìïßùìá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò, åðÝôñåøå ïñèÞ äéÜêñé óç ìåôáîý ôùí äéáöüñùí âáèìþí äéáâñùôéêþí åðéäñÜóå ùí (ãíùóôÜ éó÷õñÜ äéáâñùôéêÜ ôïõ äÝñìáôïò, R35, êáé Üëëá äéáâñùôéêÜ ôïõ äÝñìáôïò R34) (2). Ç ðåñéãñáöÞ ôùí äýï ìåèüäùí êáé ç äéáäéêáóßá ôçò äïêéìÞò ðáñÝ÷ï íôáé êáôùôÝñù. Ç åðéëïãÞ ôçò ìåèüäïõ ãßíåôáé ìå âÜóç ôéò åéäéêÝò áðáéôÞóåéò êáé ôéò ðñïôéìÞóåéò ôïõ ÷ñÞóôç. Âë. åðßóçò ãåíéêÞ åéóáãùãÞ ìÝñïò Â. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ÄéÜâñùóç ôïõ äÝñìáôïò: åßíáé ç ðñüêëçóç ìç áíôé óôñåðôÞò âëÜâçò óôï äåñìáôéêü éóôü ìåôÜ ôçí åöáñìïãÞ åëåã÷üìåíçò ïõóßáò. 1.3 ÏÕÓÉÅÓ ÁÍÁÖÏÑÁÓ Ïõäåìßá, áëëÜ âë. óçìåßá 1.5.3.4 êáé 1.7.2.3. 1.4 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ - ÄÏÊÉÌÁÓÉÁ ÄÉÁÄÅÑÌÉÊÇÓ ÇËÅÊÔÑÉÊÇÓ ÁÍÔÉÓÔÁÓÇÓ (ÔÅR) ÄÅÑÌÁÔÏÓ ÅÐÉÌÕÏÓ Ôï åëåã÷üìåíï õëéêü åöáñìüæåôáé åðß 24 þñåò êáô' áíþôá ôï üñéï óôéò åðéäåñìéêÝò åðéöÜíåéåò äßóêùí äÝñìáôïò ðïõ Ý÷ïõí ëçöèåß áðü ôéò äïñÝò íåáñþí åðéìõþí ïé ïðïßïé Ý÷ïõí èáíáôùèåß ìå ìç âÜíáõóï ôñüðï. Ôá äéáâñùôéêÜ õëéêÜ ðñïó äéïñßæïíôáé âÜóåé ôçò éêáíüôçôÜò ôïõò íá ðñïêáëïýí áðþëåéá ôçò áêåñáéüôçôáò ôçò êåñáôßíçò óôéâÜäáò êáé ôçò öñáêôéêÞò ëåéôïõñãßáò, ç ïðïßá ìåôñÜôáé ùò ìåßùóç ôçò åããåíïýò äéá äåñìéêÞò çëåêôñéêÞò áíôßóôáóçò (TER) óå åðßðåäá ÷áìçëüôå ñá åíüò êáôþôáôïõ ïñßïõ (5kÙ) (4)(5). ÅñåèéóôéêÜ êáé ìç åñå èéóôéêÜ õëéêÜ äåí ðñïêáëïýí ìåßùóç ôçò TER óå åðßðåäá ÷á ìçëüôåñá ôïõ êáôùôÜôïõ ïñßïõ. Óôç äéáäéêáóßá ôçò äïêéìÞò ìðïñåß íá åíóùìáôùèåß Ýíá óôÜäéï äÝóìåõóçò ÷ñùóôéêÞò ãéá ôéò ôáóéåíåñãÝò ïõóßåò êáé ôéò ïõäÝôåñåò ïñãáíéêÝò åíþóåéò (ãéá ôïõò ïñéóìïýò âë. õðïóçìåßùóç (6)) þóôå íá ìåéùèåß ï áñéèìüò ôùí øåõäïèåôéêþí áðïôåëåóìÜôùí ðïõ ëáìâÜíï íôáé ìå ÷çìéêÝò ïõóßåò áõôïý ôïõ ôýðïõ óõãêåêñéìÝíá (2) (7). 1.5 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ - ÄÏÊÉ ÌÁÓÉÁ TER ÄÅÑÌÁÔÏÓ ÅÐÉÌÕÏÓ 1.5.1 Ðåéñáìáôüæùá Ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôùí äßóêùí äÝñìáôïò áðáéôïýíôáé íåáñïß (20-23 çìåñþí) åðßìõåò (óôÝëå÷ïò Wistar Þ ðáñü ìïéï). Áöáéñåßôáé åðéìåëþò ôï ôñß÷ùìá áðü ôçí ðåñéï÷Þ ôçò ñÜ÷çò êáé ôùí ðëåõñþí ìå ìéêñÞ îõñéóôéêÞ ìç÷áíÞ ãéá æþá. Ôá ðåéñáìáôüæùá åêðëýíïíôáé êáé óöïõããßæïíôáé åðéìåëþò åíþ ç ðåñéï÷Þ åìâáðôßæåôáé óå áíôéâéïôéêü äéÜ ëõìá (ðïõ ðåñéÝ÷åé, åðß ðáñáäåßãìáôé, óôñåðôïìõêßíç, ðå íéêéëßíç, ÷ëùñáìöáéíéêüëç Þ áìöïôåñéêßíç, óå êáôÜëëçëåò óõãêåíôñþóåéò ãéá ôçí áíáóôïëÞ ôçò âáêôçñéáêÞò áíÜ ðôõîçò). Ôá ðåéñáìáôüæùá åêðëýíïíôáé åê íÝïõ ìå áíôé âéïôéêÜ ôçí ôñßôç Þ ôÝôáñôç çìÝñá ìå ôçí ðñþôç Ýêðëõóç 1882 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) êáé ÷ñçóéìïðïéïýíôáé åíôüò ôñéþí çìåñþí (ç çëéêßá ôùí ðåéñáìáôüæùùí äåí ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôéò 31 çìÝñåò ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôçò äïñÜò). 1.5.2 Ðñïåôïéìáóßá ôùí äßóêùí äÝñìáôïò Ôá ðåéñáìáôüæùá èáíáôþíïíôáé ìå ìç âÜíáõóï ôñüðï. Áöáéñåßôáé ôï äÝñìá áðü ôç ñÜ÷ç êÜèå æþïõ êáé áðáë ëÜóóåôáé áðü ôçí ðåñßóóåéá ëßðïõò ìå ðñïóåêôéêÞ áðï ìÜêñõíóÞ ôïõ áðü ôï äÝñìá. Ç äïñÜ ôïðïèåôåßôáé åðÜíù áðü ôï Üêñï óùëÞíá ðïëõôåôñáöèùñïáéèõëåíßïõ (PTFE) ìå ôñüðï þóôå ç åðéöÜíåéá ôçò åðéäåñìßäáò íá âñßóêåôáé óå åðáöÞ ìå ôï óùëÞíá. Ôï äÝñìá óõãêñáôåßôáé óôç èÝóç ôïõ ìå ôç âïÞèåéá åëáóôéêïý äáêôõëßïõ Ï ï ïðïßïò óôå ñåþíåôáé ìå ðßåóç óôï Üêñï ôïõ óùëÞíá, åíþ ç ðåñßóóåéá éóôþí áðïêüðôåôáé. Ïé äéáóôÜóåéò ôïõ óùëÞíá êáé ôïõ äá êôõëßïõ ðáñÝ÷ïíôáé óôï ó÷Þìá 1. Óôç óõíÝ÷åéá, ç Ýíùóç ôïõ åëáóôéêïý äáêôõëßïõ Ï ìå ôï Üêñï ôïõ óùëÞíá PTFE óôåãáíïðïéåßôáé ìå ôç âïÞèåéá âáæåëßíçò. Ï óùëÞíáò óôçñßæåôáé ìå åëáôçñéùôü óöéãêôÞñá åíüò õðïäï÷Ýá ðïõ ðåñéÝ÷åé äéÜëõìá èåééêïý ìáãíçóßïõ (154mM) (ó÷Þìá 2). 1.5.3 Äéáäéêáóßá äïêéìÞò 1.5.3.1 ÅöáñìïãÞ ôïõ åëåã÷üìåíïõ õëéêïý Ïé õãñÝò åëåã÷üìåíåò ïõóßåò (150ml) åöáñìüæïíôáé óôçí åðéäåñìéêÞ åðéöÜíåéá ðïõ âñßóêåôáé óôï åóùôåñéêü ôïõ óùëÞíá (ó÷Þìá 2). Ïôáí åîåôÜæïíôáé óôåñåÜ õëéêÜ, åöáñìüæåôáé åðáñêÞò ðïóüôçôá óôåñåïý õëéêïý óôï äß óêï þóôå íá êáëýðôåôáé ôï óýíïëï ôçò åðéöÜíåéáò ôçò åðéäåñìßäáò. Óôç óõíÝ÷åéá, 150ml áðéïíéóìÝíïõ íåñïý ðñïóôßèåíôáé óôï óôåñåü õëéêü êáé ïé óùëÞíåò áíáäåýï íôáé Þðéá. Ïé åëåã÷üìåíåò ïõóßåò ðñÝðåé íá åßíáé óå ìÝãé óôç äõíáôÞ åðáöÞ ìå ôï äÝñìá. Ãéá ïñéóìÝíá óôåñåÜ áõ ôü ìðïñåß íá åðéôåõ÷èåß ìå èÝñìáíóç óôïõò 30°C êáô' áíþôáôï üñéï êáé ôÞîç ôçò åëåã÷üìåíçò ïõóßáò Þ ìå Üëå óìá þóôå íá ëçöèåß êïêêïðïéçìÝíï õëéêü Þ óêüíç. Ãéá êÜèå åëåã÷üìåíç ïõóßá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôñåéò äßóêïé äÝñìáôïò. Ïé åëåã÷üìåíåò ïõóßåò äéáôçñïýíôáé óå åðáöÞ ìå ôï äÝñìá åðß 24 þñåò (âë. åðßóçò 1.5.3.4). Óôç óõíÝ÷åéá åêðëýíïíôáé ìå åêôüîåõóç ôñå÷ïýìåíïõ íåñïý èåñìïêñá óßáò Ýùò 30°C Ýùò üôïõ áðïìáêñõíèïýí ðëÞñùò. Ç áðï ìÜêñõíóç åëåã÷üìåíùí ïõóéþí ðïõ Ý÷ïõí óôåñåïðïéçèåß óôï åóùôåñéêü ôïõ óùëÞíá åßíáé äõíáôüí íá äéåõêïëõíèåß ìå åêôüîåõóç èåñìïý íåñïý èåñìïêñáóßáò 30°C ðåñßðïõ. 1.5.3.2 ÌåôñÞóåéò TER Ç TER ìåôñÜôáé ìå ôç âïÞèåéá ãÝöõñáò äåäïìÝíùí (databridge) ðïõ ëåéôïõñãåß ìå åíáëëáóóüìåíï ñåýìá êáé ÷áìçëÞ ôÜóç (ð.÷. AIM 401 Þ 6401, Þ áíôßóôïé÷ç). Ðñéí áðü ôç ìÝôñçóç ôçò çëåêôñéêÞò áíôßóôáóçò, åëáôôþíåôáé ç åðéöáíåéáêÞ ôÜóç ôïõ äÝñìáôïò ìå ôçí ðñïóèÞêç áéèá íüëçò 70% óôçí ðïóüôçôá ðïõ áðáéôåßôáé ãéá íá êáëõöèåß ç åðéäåñìßäá. Ëßãá ëåðôÜ áñãüôåñá, ï óùëÞíáò áíôéóôñÝ öåôáé ãéá íá áðïìáêñõíèåß ç áéèáíüëç êáé ï éóôüò åíõäá ôþíåôáé ìå ôçí ðñïóèÞêç 3ml äéáëýìáôïò èåééêïý ìáãíç óßïõ (154mM). Ôá çëåêôñüäéá ôçò ãÝöõñáò äåäïìÝíùí ôïðïèåôïýíôáé óå ìéá áðü ôéò äýï ðëåõñÝò ôïõ äßóêïõ äÝñìáôïò ãéá ôç ìÝôñçóç ôçò áíôßóôáóçò óå kÙ/äßóêï äÝñìáôïò (ó÷Þìá 2). Ïé äéáóôÜóåéò ôùí çëåêôñïäßùí êáé ôï ìÞêïò ôïõ çëåêôñïäßïõ ðïõ âñßóêåôáé êÜôù áðü ôïõò óöéãêôÞñåò ôýðïõ êñïäïäåßëïõ ðáñÝ÷ïíôáé óôï ó÷Þìá 1. Ï óöéãêôÞñáò ôïõ åóùôåñéêïý (÷ïíäñïý) çëåêôñïäßïõ ôïðïèåôåßôáé óôçí êïñõöÞ ôïõ óùëÞíá PTFE êáôÜ ôç ìÝ ôñçóç ôçò áíôßóôáóçò þóôå íá åîáóöáëßæåôáé ç åìâÜðôé óç óôáèåñïý ôìÞìáôïò ôïõ çëåêôñïäßïõ óôï äéÜëõìá èåé éêïý ìáãíçóßïõ. Ôï åîùôåñéêü (ëåðôü) çëåêôñüäéï ôïðï èåôåßôáé åíôüò ôïõ õðïäï÷Ýá ìå ôñüðï þóôå íá áêïõìðÜåé óôïí ðõèìÝíá ôïõ. Ç áðüóôáóç ìåôáîý âÜóçò ôïõ åëáôçñéùôïý óöéãêôÞñá êáé ôçò âÜóçò ôïõ óùëÞíá PTFE äéáôçñåßôáé óôáèåñÞ (ó÷Þìá1 ) äåäïìÝíïõ üôé åðç ñåÜæåé ôç ëáìâáíüìåíç ôéìÞ ôçò áíôßóôáóçò. Óçìåéþíåôáé üôé áí ç ìåôñïýìåíç ôéìÞ ôçò áíôßóôáóçò õðåñâáßíåé ôá 20 kÙ, áõôü ìðïñåß íá ïöåßëåôáé óôçí åëåã ÷üìåíç ïõóßá ðïõ åðéêáëýðôåé ôçí åðéäåñìéêÞ åðéöÜíåéá ôïõ äßóêïõ äÝñìáôïò. Ìðïñåß íá åðé÷åéñçèåß áðïìÜêñõí óç ôçò ïõóßáò áõôÞò ìå áíÜäåõóç ôïõ óùëÞíá PTFE åðß 10 äåõôåñüëåðôá ðåñßðïõ áöïý êáëõöèåß ôï óôüìéü ôïõ ìå ôïí ðñïóôáôåõüìåíï ìå ãÜíôé áíôß÷åéñá. Ôï äéÜëõìá èåééêïý ìáãíçóßïõ áðï÷ýíåôáé êáé åðáíáëáìâÜíåôáé ç ìÝ ôñçóç ôçò áíôßóôáóçò ìå íÝï äéÜëõìá èåééêïý ìáãíçóßïõ. Ïé ìÝóåò ìåôñïýìåíåò ôéìÝò TER ãßíïíôáé áðïäåêôÝò åöüóïí ïé óýã÷ñïíÝò ôïõò èåôéêÝò êáé áñíçôéêÝò ôéìÝò ðïõ Ý÷ïõí ðñïêýøåé ãéá ôçí ïõóßá ìÜñôõñá ðåñéêëåßïíôáé óôéò áðïäåêôÝò ãéá ôç ìÝèïäï ðåñéï÷Ýò ôéìþí. Ïé õðïäåé êíõüìåíåò ïõóßåò ìÜñôõñåò êáé ïé áíôßóôïé÷åò áðïäåêôÝò ðåñéï÷Ýò ôéìþí çëåêôñéêÞò áíôßóôáóçò ãéá ôçí ðåñéãñá öüìåíç ìåèïäïëïãßá êáé óõóêåõÞ Ý÷ïõí ùò åîÞò: 1.5.3.3 ÔñïðïðïéçìÝíç äéáäéêáóßá ãéá ôáóéåíåñãÝò ïõ óßåò êáé ïõäÝôåñåò ïñãáíéêÝò åíþóåéò ÅÜí ïé ôéìÝò TER åëåã÷üìåíùí ïõóéþí ðïõ åìðßðôïõí óôçí êáôçãïñßá ôùí ôáóéåíåñãþí ïõóéþí Þ ôùí ïõäÝôåñùí ïñãáíéêþí åíþóåùí åßíáé ìéêñüôåñåò áðü Þ ßóåò ìå 5 kÙ, ìðïñåß íá ðñáãìáôïðïéçèåß åêôßìçóç ôçò äéåßóäõóçò ÷ñù óôéêÞò óôïõò éóôïýò. Ìå ôç äéáäéêáóßá áõôÞ èá ðñïóäéïñé óôåß êáôÜ ðüóï ôá áðïôåëÝóìáôá åßíáé øåõäïèåôéêÜ (2). 1.5.3.3.1 ÅöáñìïãÞ êáé áðïìÜêñõíóç ôçò ÷ñùóôéêÞò ïõóßáò óïõëöïñïäáìßíçò  ÌåôÜ ôçí áñ÷éêÞ êáôåñãáóßá ìå ôçí åëåã÷üìåíç ïõóßá åöáñìüæïíôáé óôçí åðéäåñìéêÞ åðéöÜíåéá êÜèå äßóêïõ äÝñìáôïò ãéá äýï þñåò, 150 µl äéáëýìáôïò óïõëöïñïäá ìßíçò  óå áðåóôáãìÝíï íåñü 10% (w/v). Óôç óõíÝ÷åéá, ïé äßóêïé äÝñìáôïò åêðëýíïíôáé ìå åêôüîåõóç ôñå÷ïýìåíïõ íåñïý èåñìïêñáóßáò äùìáôßïõ åðß 10 äåõôåñüëåðôá ðåñß ðïõ þóôå íá áðïìáêñõíèåß ôõ÷üí ðåñßóóåéá Þ áäÝóìåõôç ÷ñùóôéêÞ. Åêáóôïò ôùí äßóêùí äÝñìáôïò áöáéñåßôáé áðü ôïí óùëÞíá PTFE êáé ôïðïèåôåßôáé ìå öéáëßäéï (ð.÷. ãõÜëé íï öéáëßäéï óðéíèçñéóìïý ôùí 20 ml) ðïõ ðåñéÝ÷åé áðéïíé óìÝíï íåñü (8 ml). Ôá öéáëßäéá áíáäåýïíôáé Þðéá åðß 5 ëå ðôÜ þóôå íá áðïìáêñõíèåß ôõ÷üí åðéðëÝïí ðåñßóóåéá Þ áäÝóìåõôç ÷ñùóôéêÞ. ÅðáíáëáìâÜíåôáé ç Ýêðëõóç ìå ôñå ÷ïýìåíï íåñü êáé, óôç óõíÝ÷åéá, ïé äßóêïé äÝñìáôïò áöáé ñïýíôáé êáé ôïðïèåôïýíôáé óå öéáëßäéá ðïõ ðåñéÝ÷ïõí 5 ml äéáëýìáôïò äùäåêõëïóïõëöïíéêïý íáôñßïõ (SDS) óå áðï óôáãìÝíï íåñü 30% (w/v). Ôá öéáëßäéá áöÞíïíôáé ðñïò åðþáóç óôïõò 60°C åðß ìéá íý÷ôá. ÌåôÜ ôçí åðþáóç, ïé äß óêïé äÝñìáôïò áöáéñïýíôáé áðü ôá öéáëßäéá êáé áðïññß ðôïíôáé åíþ ôï åíáðïìÝíïí äéÜëõìá öõãïêåíôñåßôáé åðß 8 ëåðôÜ óôïõò 21 °C (ó÷åôéêÞ öõãüêåíôñïò äýíáìç �175). Áðü ôçí õðåñêåßìåíç óôéâÜäá ëáìâÜíåôáé 1 ml êáé áñáéþ íåôáé óå áíáëïãßá 1 ðñïò 5 (v/v) [äçë. 1 ml + 4 ml] ìå äéÜ ëõìá 30% (w/v) SDS óå áðåóôáãìÝíï íåñü. Ç ïðôéêÞ ðõ êíüôçôá ôïõ äéáëýìáôïò ìåôñÜôáé óôá 565 nm ðåñßðïõ. 1.5.3.3.2 Õðïëïãéóìüò ôçò ðåñéåêôéêüôçôáò óå ÷ñùóôéêÞ Ç ðåñéåêôéêüôçôá êÜèå äßóêïõ óå óïõëöïñïäáìßíç  õðïëïãßæåôáé ìå âÜóç ôéò ôéìÝò ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò (óõíôå ëåóôÞò ìïñéáêÞò áðüóâåóçò ôçò óïõëöïñïäáìßíçò  óôá ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1883 565 nm = 8.7 x 104� ìïñéáêü âÜñïò = 580). Ðñïóäéïñßæåôáé ç ðåñéåêôéêüôçôá åêÜóôïõ äßóêïõ äÝñìáôïò óå óïõëöïñï äáìßíç  êáé êáôüðéí õðïëïãßæåôáé ç ìÝóç ðåñéåêôéêüôçôá óå ÷ñùóôéêÞ ãéá ôéò åðáíáëÞøåéò. Ïé ìÝóåò ôéìÝò äÝóìåõóçò ÷ñùóôéêÞò ãßíïíôáé áðïäåêôÝò åöüóïí ïé óýã÷ñïíåò ôéìÝò ðïõ Ý÷ïõí ðñïêýøåé ãéá ôçí ïõóßá ìÜñôõñá ðåñéêëåßïíôáé óôéò áðïäåêôÝò ãéá ôç ìÝèïäï ðåñéï÷Ýò ôéìþí. Ïé õðïäåé êíõüìåíåò áðïäåêôÝò ðåñéï÷Ýò ôéìþí ðåñéåêôéêïôÞôùí óå ÷ñùóôéêÞ ãéá ôéò ïõóßåò ìÜñôõñåò, ãéá ôç ìåèïäïëïãßá êáé ãéá ôç óõóêåõáóßá ðïõ ðåñéãñÜöïíôáé Ý÷ïõí ùò åîÞò: 1.5.3.4 Ðñüóèåôåò ðëçñïöïñßåò Ïé åëåã÷üìåíåò ïõóßåò ìðïñïýí íá åöáñìüæïíôáé óôïõò äßóêïõò äÝñìáôïò ãéá âñá÷ýôåñá ÷ñïíéêÜ äéáóôÞ ìáôá (ð.÷. 2 þñåò) ðñïêåéìÝíïõ íá åíôïðßæïíôáé õëéêÜ ðïõ ðñïêáëïýí éó÷õñÞ äéÜâñùóç. Ç ìåëÝôç åðéêýñùóçò, ùóôüóï, êáôÝäåéîå üôé ç äïêéìáóßá TER ïäÞãçóå óå õðå ñåêôßìçóç ôïõ äéáâñùôéêïý äõíáìéêïý äéáöüñùí åëåã ÷üìåíùí ÷çìéêþí ïõóéþí ìåôÜ ôç äéáôÞñçóÞ ôïõò óå åðá öÞ ìå ôïõò äßóêïõò äÝñìáôïò åðß äýï þñåò (2), åíþ ìå ôçí åéêïóéôåôñÜùñç äéáäéêáóßá åðÝôñåøå ôïí ïñèü ðñïóäéï ñéóìü ôùí äéáâñùôéêþí êáé ìç äéáâñùôéêþí ïõóéþí. Ôá ÷áñáêôçñéóôéêÜ êáé ïé äéáóôÜóåéò ôçò ÷ñçóéìïðïé ïýìåíçò óõóêåõÞò êáèþò êáé ç áêïëïõèïýìåíç ðåéñá ìáôéêÞ äéáäéêáóßá ìðïñïýí íá åðçñåÜóïõí ôéò ëáìâáíü ìåíåò ôéìÝò TER. Ôï êáôþôáôï üñéï äéÜâñùóçò ôùí 5 kÙ õðïëïãßóôçêå ìå âÜóç ôá äåäïìÝíá ðïõ åëÞöèçóáí ìå ôç óõãêåêñéìÝíç óõóêåõÞ êáé äéáäéêáóßá ðïõ ðåñéãñÜöï íôáé óôçí ðáñïýóá ìÝèïäï. Óå ðåñßðôùóç óçìáíôéêÞò ìå ôáâïëÞò ôùí óõíèçêþí ôçò äïêéìÞò åßíáé äõíáôüí íá éó÷ýïõí äéáöïñåôéêÜ üñéá êáé ôéìÝò ãéá ôïõò ìÜñôõñåò. Ùò åê ôïýôïõ, óõíéóôÜôáé äéáêñßâùóç ôçò ìåèïäïëïãßáò êáé ôïõ êáôùôÜôïõ ïñßïõ áíôßóôáóçò ìÝóù ôçò äéåîáãù ãÞò äïêéìþí ìå óåéñÜ ðñïôýðùí äéáëõìÜôùí áíáöïñÜò ôá ïðïßá èá åðéëåãïýí ìåôáîý ôùí ÷çìéêþí ïõóéþí ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêáí óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò (3). 1.6 ÁÑ×Ç ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ - ÄÏÊÉÌÁÓÉÁ ÌÅ ÏÌÏÉÙÌÁ ÁÍÈÑÙÐÉÍÏÕ ÄÅÑÌÁÔÏÓ Ôï åëåã÷üìåíï õëéêü åöáñìüæåôáé ôïðéêÜ åðß 4 þñåò êáô' áíþôáôï üñéï, óôï ôñéóäéÜóôáôï ïìïßùìá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò ôï ïðïßï ðåñéëáìâÜíåé áíáðëáóèåßóá åðéäåñìß äá ìå ëåéôïõñãéêÞ êåñáôßíç óôéâÜäá. Ôá äéáâñùôéêÜ õëéêÜ ôáõôïðïéïýíôáé ìå âÜóç ôçí éêáíüôçôÜ ôïõò íá ðñïêá ëïýí ìåßùóç ôçò êõôôáñéêÞò âéùóéìüôçôáò (üðùò ðñïó äéïñßæåôáé ð.÷. ìå ôç äïêéìáóßá áíáãùãÞò ôïõ ÌÔÔ) óå åðß ðåäá ÷áìçëüôåñá ôùí êáèïñéóèÝíôùí êáôùôÜôùí ïñßùí óå óõãêåêñéìÝíåò ðåñéüäïõò Ýêèåóçò. Ç áñ÷Þ ôçò äïêé ìáóßáò óôçñßæåôáé óôï óêåðôéêü üôé äéáâñùôéêÝò ÷çìéêÝò ïõóßåò åßíáé åêåßíåò ðïõ ìðïñïýí íá äéåéóäýóïõí óôçí êå ñáôßíç óôïéâÜäá (ìå äéÜ÷õóç Þ äéÜâñùóç) êáé åßíáé áñ êïýíôùò êõôôáñïôïîéêÝò þóôå íá ðñïêáëïýí ôï èÜíáôï ôùí êõôôÜñùí óôéò õðïêåßìåíåò êõôôáñéêÝò óôïéâÜäåò. 1.7 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ÔÇÓ ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ - ÄÏÊÉ ÌÁÓÉÁ ÌÅ ÏÌÏÉÙÌÁ ÁÍÈÑÙÐÉÍÏÕ ÄÅÑÌÁÔÏÓ 1.7.1 Ïìïéþìáôá áíèñùðßíïõ äÝñìáôïò Ôá ïìïéþìáôá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò åßíáé äõíáôüí íá ðñïÝñ÷ïíôáé áðü äéÜöïñåò ðçãÝò, áëëÜ ðñÝðåé íá éêáíï ðïéïýí ïñéóìÝíá êñéôÞñéá. Ôï ïìïßùìá ðñÝðåé íá Ý÷åé ìéá ëåéôïõñãéêÞ êåñáôßíç óôïéâÜäá ìå õðüóôñùìá æþíôùí êõôôÜñùí. Ç öñáêôéêÞ ëåéôïõñãßá ôçò êåñáôßíçò óôïéâÜ äáò ðñÝðåé íá åßíáé åðáñêÞò. Áõôü ìðïñåß íá áðïäåé÷èåß êáôáäåéêíýïíôáò ôçí áíôï÷Þ ôïõ ïìïéþìáôïò óôçí êõô ôáñïôïîéêüôçôá ìåôÜ ôçí åöáñìïãÞ ïõóéþí ïé ïðïßåò åß íáé ãíùóôÝò ùò êõôôáñïôïîéêÝò áëëÜ äåí äéáðåñíïýí ôçí êåñáôßíç óôïéâÜäá. ÐñÝðåé åðßóçò íá êáôáäåéêíýåôáé üôé ìå ôï ïìïßùìá áõôü ëáìâÜíïíôáé áíáðáñáãþãéìá áðïôå ëÝóìáôá õðü êáèïñéóìÝíåò ðåéñáìáôéêÝò óõíèÞêåò. Ç âéùóéìüôçôá ôùí æþíôùí êõôôÜñùí ôïõ ïìïéþìáôïò ðñÝðåé íá åßíáé áñêåôÜ õøçëÞ þóôå íá ãßíåôáé óáöÞò äéÜ êñéóç ìåôáîý ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí. Ç êõô ôáñéêÞ âéùóéìüôçôá (üðùò ðñïêýðôåé, åðß ðáñáäåßãìáôé, áðü ôç ìÝôñçóç ôùí åðéðÝäùí ôïõ áíá÷èÝíôïò MTT, äçëá äÞ óå ôéìÞ ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò) ìåôÜ ôçí Ýêèåóç óå áñíç ôéêü ìÜñôõñá ðñÝðåé íá åìðßðôåé óôá áðïäåêôÜ üñéá ãéá ôï óõãêåêñéìÝíï ïìïßùìá. Ïìïßùò, ïé ôéìÝò êõôôáñéêÞò âéùóé ìüôçôáò ðïõ ëáìâÜíïíôáé ìå èåôéêü ìÜñôõñá (Ýíáíôé ôùí áíôßóôïé÷ùí ðïõ ëáìâÜíïíôáé ìå áñíçôéêü ìÜñôõñá) ðñÝ ðåé íá âñßóêïíôáé åíôüò êáèïñéóìÝíùí ïñßùí. Ôï ÷ñçóéìï ðïéïýìåíï ðñïãíùóôéêü ìïíôÝëï ðñÝðåé íá áíôáðïêñßíå ôáé áðáñáéôÞôùò óôá äéåèíÞ ðñüôõðá åðéêýñùóçò (2). 1.7.2 Äéáäéêáóßá äïêéìÞò 1.7.2.1 ÅöáñìïãÞ ôïõ åëåã÷üìåíïõ õëéêïý ÐñïêåéìÝíïõ ãéá õãñÜ õëéêÜ, ÷ñçóéìïðïéåßôáé åðáñêÞò ðïóüôçôá åëåã÷üìåíçò ïõóßáò þóôå íá êáëýðôåé ôçí åðé öÜíåéá ôïõ äÝñìáôïò (ôïõëÜ÷éóôïí 25 µl/cm²). ÐñïêåéìÝ íïõ ãéá óôåñåÜ õëéêÜ, ÷ñçóéìïðïéåßôáé åðáñêÞò ðïóüôçôá åëåã÷üìåíçò ïõóßáò þóôå íá êáëýðôåé ôï äÝñìá êáé óôç óõíÝ÷åéá ç óôåñåÜ ïõóßá õãñáßíåôáé ãéá íá åîáóöáëéóôåß êáëÞ åðáöÞ ìå ôï äÝñìá. Åöüóïí áðáéôåßôáé, ôá óôåñåÜ êï íéïðïéïýíôáé ðñéí áðü ôçí ÷ñçóéìïðïßçóÞ ôïõò. Ç ìÝèïäïò åöáñìïãÞò ðñÝðåé íá åßíáé êáôÜëëçëç ãéá Ýíá åõñý öÜóìá ÷çìéêþí ïõóéþí (âë. õðïóçìåßùóç 2). Óôï ôÝëïò ôçò ðåñéü äïõ Ýêèåóçò ôï åëåã÷üìåíï õëéêü åêðëýíåôáé åðéìåëþò áðü ôçí åðéöÜíåéá ôïõ äÝñìáôïò ìå áëáôïý÷ï äéÜëõìá. 1.7.2.2 ÌåôñÞóåéò ôçò êõôôáñéêÞò âéùóéìüôçôáò Ãéá ôç ìÝôñçóç ôçò êõôôáñéêÞò âéùóéìüôçôáò ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ïéáäÞðïôå åðéêõñùìÝíç ðïóïôéêÞ ìÝèïäïò. Ç ðëÝïí ÷ñçóéìïðïéïýìåíç äïêéìáóßá åßíáé ç áíáãùãÞ ÌÔÔ ç ïðïßá ðáñåß÷å áêñéâÞ êáé áíáðáñáãþãéìá áðïôåëÝóìáôá óå äéÜöïñá åñãáóôÞñéá (2). Ï äßóêïò äÝñìáôïò åìâáðôßæå ôáé óå äéÜëõìá ÌÔÔ óõãêåíôñþóåùò 0,3 mg/ml óôïõò 20 28°C åðß 3 þñåò. Ôï ðñïêýðôïí êõáíïýí ßæçìá formazan åê ÷õëßæåôáé (åê÷ýëéóç ìå äéáëýôç) êáé ç óõãêÝíôñùóç ôçò for mazan õðïëïãßæåôáé ìå ìÝôñçóç ôçò ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò óå ðåñéï÷Þ ìÞêïõò êýìáôïò ìåôáîý 545 êáé 595 nm. 1.7.2.3 Ðñüóèåôåò ðëçñïöïñßåò Ôï åßäïò ôïõ ÷ñçóéìïðïéçèÝíôïò ïìïéþìáôïò äÝñìá ôïò êáé ôï áêñéâÝò ðñùôüêïëëï ôïõ ÷ñüíïõ Ýêèåóçò êáé ôùí äéáäéêáóéþí Ýêðëõóçò ê.ëð. åðçñåÜæïõí óå ìåãÜëï âáèìü ôá ó÷åôéêÜ ìå ôçí êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá áðïôåëÝ óìáôá. ÓõíéóôÜôáé äéáêñßâùóç ôçò ìåèïäïëïãßáò êáé ôïõ ðñïãíùóôéêïý ìïíôÝëïõ ìÝóù ôçò äéåîáãùãÞò äïêéìþí ìå óåéñÜ ðñïôýðùí äéáëõìÜôùí áíáöïñÜò ôá ïðïßá åðé ëÝãïíôáé ìåôáîý ôùí ÷çìéêþí ïõóéþí ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞ èçêáí óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ôïõ ÅÊÅÅÌ (3). Ç ÷ñçóé ìïðïéçèåßóá ìÝèïäïò åßíáé áðáñáßôçôï íá Ý÷åé áðïäåé ÷èåß áíáðáñáãþãéìç åíôüò êáé ìåôáîý ôùí äéáöüñùí åñãáóôçñßùí ãéá Ýíá åõñý öÜóìá ÷çìéêþí ïõóéþí, óýì öùíá ìå ôá äéåèíÞ ðñüôõðá. Ç ìÝèïäïò ðñÝðåé íá áíôá ðïêñßíåôáé ôïõëÜ÷éóôïí óôá êñéôÞñéá åðéóôçìïíéêÞò åðé êýñùóçò ðïõ êáèïñßæïíôáé ðñïçãïõìÝíùò (2) êáé ôá áðï ôåëÝóìáôá ôçò ìåëÝôçò åðéêýñùóçò íá äçìïóéåýïíôáé óå Ýãêõñï åðéóôçìïíéêü ðåñéïäéêü ôïõ ïðïßïõ ôá Üñèñá åãêñßíïíôáé áðü ïìüôéìïõò áîéïëïãçôÝò. 1884 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1885 2. ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ 2.1.1 Äïêéìáóßá TER äÝñìáôïò åðßìõïò Ïé ôéìÝò çëåêôñéêÞò áíôßóôáóçò óå kÙ ôïõ åëåã÷üìåíïõ õëéêïý, ôùí èåôéêþí êáé áñíçôéêþí ìáñôýñùí êáé ôõ÷üí ðñïôýðùí ÷çìéêþí ïõóéþí áíáöïñÜò ðñÝðåé íá ðáñïõ óéÜæïíôáé õðü ìïñöÞ ðßíáêá, üðïõ èá ðåñéëáìâÜíïíôáé åðßóçò äåäïìÝíá ãéá ôá åðáíáëçðôéêÜ ðåéñÜìáôá, ìÝóåò ôéìÝò êáé ç ðñïêýðôïõóá ôáîéíüìçóç. 2.1.2 Äïêéìáóßá ìå ïìïßùìá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò Ïé ôéìÝò ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò êáé ôá õðïëïãéóèÝíôá äå äïìÝíá åêáôïóôéáßáò êõôôáñéêÞò âéùóéìüôçôáò ãéá ôï åëåã÷üìåíï õëéêü, ôïõò èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõ ñåò êáé ôõ÷üí ðñüôõðåò ÷çìéêÝò ïõóßåò áíáöïñÜò ðñÝðåé íá ðáñïõóéÜæïíôáé õðü ìïñöÞ ðßíáêá, üðïõ ðåñéëáìâÜ íïíôáé åðßóçò äåäïìÝíá ãéá ôá åðáíáëçðôéêÜ ðåéñÜìáôá, ìÝóåò ôéìÝò êáé ç ðñïêýðôïõóá ôáîéíüìçóç. 2.2 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÊÁÉ ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁ ÔÙÍ 2.2.1 Äïêéìáóßá TER äÝñìáôïò åðßìõïò ¼ôáí ç ìÝóç ôéìÞ TER ðïõ ëáìâÜíåôáé ãéá ôçí åëåã÷ü ìåíç ïõóßá õðåñâáßíåé ôá 5 kÙ ôüôå ç óõãêåêñéìÝíç ïõóßá äåí èåùñåßôáé äéáâñùôéêÞ. ÅÜí ç ôéìÞ TER åßíáé ìéêñüôåñç Þ ßóç ôùí 5 kÙ, ç åëåã÷üìåíç ïõóßá èåùñåßôáé äéáâñùôéêÞ åöüóïí äåí ðñüêåéôáé ãéá ôáóéåíåñãü ïõóßá Þ ïõäÝôåñç ïñãáíéêÞ Ýíùóç. Ãéá ôáóéåíåñãÝò ïõóßåò Þ ïõäÝôåñåò ïñãáíéêÝò åíþ óåéò ãéá ôéò ïðïßåò ëáìâÜíïíôáé ôéìÝò TER ìéêñüôåñåò Þ ßóåò ôùí 5 kÙ, åßíáé äõíáôüí íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ç ìÝèï äïò ôçò äéåßóäõóçò ÷ñùóôéêÞò. ÅÜí ç ìÝóç ðåñéåêôéêü ôçôá ôïõ äßóêïõ óå ÷ñùóôéêÞ õðåñâáßíåé Þ éóïýôáé ìå ôçí áíôßóôïé÷ç ìÝóç ðåñéåêôéêüôçôá óå ÷ñùóôéêÞ ðïõ ðñï êýðôåé ôáõôü÷ñïíá ãéá ôï èåôéêü ìÜñôõñá 36% õäñï ÷ëþñéï, ôüôå ôï ëáìâáíüìåíï áðïôÝëåóìá ãéá ôçí åëåã ÷üìåíç ïõóßá åßíáé ðñáãìáôéêÜ èåôéêü êáé ç ïõóßá èåù ñåßôáé åðïìÝíùò äéáâñùôéêÞ. ÅÜí ç ìÝóç ðåñéåêôéêüôçôá ôïõ äßóêïõ óå ÷ñùóôéêÞ åßíáé ìéêñüôåñç áðü ôçí áíôß óôïé÷ç ìÝóç ðåñéåêôéêüôçôá óå ÷ñùóôéêÞ ðïõ ðñïêýðôåé ôáõôü÷ñïíá ãéá ôï èåôéêü ìÜñôõñá 36% õäñï÷ëþñéï, ôü ôå ôï ëáìâáíüìåíï áðïôÝëåóìá ãéá ôçí åëåã÷üìåíç ïõ óßá åßíáé øåõäïèåôéêü êáé ç ïõóßá äåí åßíáé åðïìÝíùò äéáâñùôéêÞ. 2.2.2 Äïêéìáóßá ìå ïìïßùìá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò Ç ôéìÞ ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò ôïõ áñíçôéêïý ìÜñôõñá áíôéðñïóùðåýåé êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá 100%. Ùò åê ôïý ôïõ ïé ëáìâáíüìåíåò ãéá ôï åëåã÷üìåíï äåßãìá ôéìÝò ïðôé êÞò ðõêíüôçôáò ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ãéá ôïí õðïëïãéóìü ôçò åêáôïóôéáßáò âéùóéìüôçôáò óå ó÷Ýóç ìå ôïí áñíçôéêü ìÜñôõñá. Ç äéá÷ùñéóôéêÞ ôéìÞ åêáôïóôéáßáò êõôôáñéêÞò âéùóéìüôçôáò âÜóåé ôçò ïðïßáò ãßíåôáé äéÜ êñéóç ìåôáîý äéáâñùôéêþí êáé ìç äéáâñùôéêþí åëåã÷üìå íùí õëéêþí (Þ ìåôáîý ôùí äéáöüñùí âáèìþí äéÜâñùóçò) ðñÝðåé íá êáèïñßæåôáé óáöþò óôï ðñïãíùóôéêü ìïíôÝëï ðñéí áðü ôçí åðéêýñùóç ôçò ìåèüäïõ, êáé ç ðñáãìáôï ðïéïýìåíç óôç óõíÝ÷åéá ìåëÝôç åðéêýñùóçò ðñÝðåé íá êáôáäåéêíýåé ôçí êáôáëëçëüôçôá ôçò äéá÷ùñéóôéêÞò áõ ôÞò ôéìÞò (ð.÷. âë. õðïóçìåßùóç 2). 3. ÅÊÈÅÓÅÉÓ ÅÊÈÅÓÇ ÔÇÓ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç ôçò äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôïõëÜ÷é óôïí ôéò áêüëïõèåò ðëçñïöïñßåò Åëåã÷üìåíç ïõóßá: ôáõôïðïßçóç, öõóéêÞ êáôÜóôáóç êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, öõóéêï÷çìéêÝò éäéüôçôåò. ÁíÜëïãåò ðëçñïöïñßåò ðñÝðåé íá ðáñÝ÷ïíôáé ãéá ôéò ôõ÷üí ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò ïõóßåò áíáöïñÜò. ÓõíèÞêåò äïêéìÞò: ëåðôïìåñÞò ðåñéãñáöÞ ôçò äéáäéêáóßáò äïêéìÞò ðïõ áêïëïõèÞèçêå· ðåñéãñáöÞ êáé áéôéïëüãçóç ôõ÷üí ôñïðïðïéÞóåùí. ÁðïôåëÝóìáôá: ðáñïõóßáóç óå ðßíáêá ôùí ôéìþí çëåêôñéêÞò áíôßóôá óçò (äïêéìáóßá TER) Þ ôùí ôéìþí åêáôïóôéáßáò êõôôáñé êÞò âéùóéìüôçôáò (äïêéìáóßá ìå ïìïßùìá áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò) ðïõ åëÞöèçóáí ãéá ôï åëåã÷üìåíï õëéêü, ôïõò èåôéêïýò êáé áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò êáé ôõ÷üí ðñüôõðåò ÷çìéêÝò ïõóßåò áíáöïñÜò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí äåäïìÝíùí ðïõ ðñïÝêõøáí áðü ôá åðáíáëçðôéêÜ ðåéñÜ ìáôá êáé ôùí ìÝóùí ôéìþí, ðåñéãñáöÞ ôõ÷üí Üëëùí åðéðôþóåùí ðïõ ðáñáôçñÞ èçêáí. Ó÷ïëéáóìüò ôùí áðïôåëåóìÜôùí ÓõìðåñÜóìáôá 4. ÂÉÂËÉÏÃÑÁÖÉÁ 1. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275 280. 2. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. & Lieb sch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524. 3. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. & Worth, A.P. (1998). The ECVAM internation al validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Se lection and distribution of the test chemicals. Toxicology in Vitro 12, 471-482. 4. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. & Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test - modifications and vali dation. Food & Chemical Toxicology 24, 507-512. 5. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Bas ketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. & Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxicology in Vitro 6, 191-194. 6. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Cur ren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. & Liebsch, M. (1998). An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. 7. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hilde brand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Os borne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. & Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6. ATLA 23, 219-255. 1886 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1887 1888 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ 2È B. 41. ÖÙÔÏÔÏÎÉÊÏÔÇÔÁ - IN VITRO 3T3 NRU ÄÏÊÉÌÇ ÖÙÔÏÔÏÎÉÊÏÔÇÔÁÓ 1. ÌÅÈÏÄÏÓ 1.1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ Ùò öùôïôïîéêüôçôá ïñßæåôáé ç ôïîéêÞ áðüêñéóç ðïõ åì öáíßæåôáé ìåôÜ ôçí ðñþôç Ýêèåóç ôïõ äÝñìáôïò óå ïñé óìÝíåò ÷çìéêÝò ïõóßåò êáé ôçí åí óõíå÷åßá Ýêèåóç óôï öùò Þ ðïõ åðÜãåôáé ïìïßùò áðü áêôéíïâüëçóç ôïõ äÝñ ìáôïò Ýðåéôá áðü óõóôåìéêÞ ÷ïñÞãçóç ìéáò ÷çìéêÞò ïõ óßáò. Ôá óôïé÷åßá ðïõ ëáìâÜíïíôáé áðü ôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò ÷ñçóéìåýïõí ãéá ôïí ðñïóäéï ñéóìü ôçò öùôïôïîéêÞò äõíáôüôçôáò ìéáò õðü äïêéìÞ ïõ óßáò, äçë. ôçò ýðáñîçò Þ áðïõóßáò ðéèáíþí êéíäýíùí ðïõ ìðïñåß íá åìöáíéóôïýí áðü ìéá õðü äïêéìÞ ïõóßá óå óõí äõáóìü ìå Ýêèåóç óôï õðåñéþäåò êáé ôï ïñáôü öùò. ÄåäïìÝíïõ üôé ôï ôïîéêïëïãéêü ôåëéêü áðïôÝëåóìá ôçò in vitro äïêéìÞò åßíáé ï ðñïóäéïñéóìüò ôçò öùôïêõôôáñï ôïîéêüôçôáò, ðïõ ðñïêáëåßôáé áðü ôç óõíäõáóìÝíç äñÜ óç ÷çìéêÞò ïõóßáò êáé öùôüò, åíþóåéò ðïõ åßíáé öùôïôï îéêÝò in vivo Ýðåéôá áðü óõóôåìéêÞ åöáñìïãÞ êáé êáôáíï ìÞ óôï äÝñìá, êáèþò åðßóçò êáé åíþóåéò ðïõ äñïõí ùò öùôïåñåèéóôéêÜ Ýðåéôá áðü ôïðéêÞ åöáñìïãÞ óôï äÝñìá, ìðïñïýí íá ôáõôïðïéçèïýí ìå ôç äïêéìÞ. Ç in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò áíáðôý ÷èçêå êáé åðéêõñþèçêå óå êïéíü ðñüãñáììá ÅÅ/COLIPA áðü ôï 1992-1997 (1)(2)(3) ðïõ áðÝâëåðå óôçí êáèéÝñù óç ìéáò Ýãêõñçò in vitro åíáëëáêôéêÞò ëýóçò áíôß ôùí äéá öüñùí in vivo ÷ñçóéìïðïéïýìåíùí äïêéìþí. Ôï 1996 óå óõíÜíôçóç åñãáóßáò ôïõ ÏÏÓÁ ðñïôÜèçêå ìéá in vitro ðñïóÝããéóç äéáäï÷éêþí óôáäßùí åëÝã÷ïõ ãéá ôçí åêôßìç óç ôçò öùôïôïîéêüôçôáò (4). Ôá áðïôåëÝóìáôá ôçò in vitro 3T3 NRU äïêéìÞò öùôï ôïîéêüôçôáò óõãêñßèçêáí ìå ôéò in vivo ïîåßåò öùôïôïîé êÝò/öùôïåñåèéóôéêÝò åðéäñÜóåéò óå æþá êáé áíèñþðïõò, êáé ç äïêéìÞ áðïäåß÷èçêå üôé ðáñåß÷å åîáéñåôéêÝò ðñï âëÝøåéò ùò ðñïò ôéò åðéäñÜóåéò áõôÝò. Ç äïêéìÞ äåí Ý÷åé ó÷åäéáóôåß ãéá ôçí ðñüâëåøç Üëëùí äõóìåíþí åðéäñÜóå ùí ðïõ ìðïñåß íá ðñïêýøïõí áðü ôç óõíäõáóìÝíç äñÜ óç ÷çìéêÞò ïõóßáò êáé ôïõ öùôüò, ð.÷. öùôïãïíéäéïôïîé êüôçôáò, öùôïáëëåñãßáò êáé öùôïêáñêéíïãÝíåóçò, áí êáé ðïëëÝò ïõóßåò ðïõ ðáñïõóéÜæïõí ôá åéäéêÜ áõôÜ ÷á ñáêôçñéóôéêÜ áíôéäñïýí èåôéêÜ óôçí in vitro 3T3 NRU äï êéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò. ÅðéðëÝïí, ç äïêéìÞ äåí Ý÷åé ó÷å äéáóôåß êáôÜ ôñüðï ðïõ íá ìðïñåß íá ãßíåôáé åêôßìçóç ôçò öùôïôïîéêÞò éó÷ýïò. Óôï ðñïóÜñôçìá äßíåôáé ìéá ðñïóÝããéóç äéáäï÷éêþí óôáäßùí åëÝã÷ïõ ôçò öùôïôïîéêüôçôáò ÷çìéêþí ïõóéþí. 1.2 ÏÑÉÓÌÏÉ ¸íôáóç áêôéíïâïëßáò: ç Ýíôáóç ôïõ ðñïóðßðôïíôïò óå ìéá åðéöÜíåéá õðåñéþäïõò (UV) Þ ïñáôïý öùôüò, ìå ôñïýìåíç óå W/m² Þ mW/cm². Äüóç öùôüò: ç ðïóüôçôá (= Ýíôáóç x ÷ñüíïò) õðåñéþ äïõò (UV) Þ ïñáôÞò áêôéíïâïëßáò ðñïóðßðôïõóáò óå åðé öÜíåéá, åêöñáæüìåíç óå Joules (= W x s) áíÜ ìïíÜäá åðéöáíåßáò, ð.÷. J/m² Þ J/cm². Æþíåò UV öùôüò: Ïé ÷áñáêôçñéóìïß ðïõ ðñïôåßíïíôáé áðü ôçí CIE (Commission Internationale de L'Eclairage) åßíáé: UVA (315-400nm), UVB (280-315nm) êáé UVC (100 280nm). ×ñçóéìïðïéïýíôáé åðßóçò êáé ïñéóìÝíïé Üëëïé ÷áñáêôçñéóìïß: ôï äéá÷ùñéóôéêü óçìåßï ìåôáîý UVB êáé UVA ôïðïèåôåßôáé óõ÷íÜ óôá 320nm, åíþ ç UVA ìðïñåß íá ÷ùñßæåôáé óå UV-A1 êáé UV-A2 ìå ôçí õðïäéáßñåóç óôá 340nm ðåñßðïõ. ÊõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá: ðáñÜìåôñïò ðïõ ìåôñÜåé ôç óõíïëéêÞ äñáóôéêüôçôá åíüò êõôôáñéêïý ðëçèõóìïý (ð.÷. ðñüóëçøç ôçò æùôéêÞò ÷ñùóôéêÞò Neutral Red óå êõôôáñéêÜ ëõóïóþìáôá) ç ïðïßá, áíÜëïãá ìå ôï ìåôñïý ìåíï ôåëéêü áðïôÝëåóìá êáé ôïí ÷ñçóéìïðïéïýìåíï ó÷å äéáóìü ôçò äïêéìÞò, óõó÷åôßæåôáé ìå ôï óõíïëéêü áñéèìü êáé/Þ æùôéêüôçôá ôùí êõôôÜñùí. Ó÷åôéêÞ êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá: ç êõôôáñéêÞ âéùóéìüôç ôá åêöñáæüìåíç óå ó÷Ýóç ìå áñíçôéêïýò (äéáëýôåò) ìÜñ ôõñåò ðïõ Ý÷ïõí ðåñÜóåé áðü üëç ôç äéáäéêáóßáò äïêéìÞò (åßôå +UV, åßôå -UV), áëëÜ äåí Ý÷ïõí õðïâëçèåß óå åðå îåñãáóßá ìå õðü äïêéìÞ ïõóßá. ÌïíôÝëï ðñüâëåøçò: áëãüñéèìïò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôç ìåôáôñïðÞ ôùí áðïôåëåóìÜôùí ìéáò äïêéìÞò ôïîé êüôçôáò óå ðñüâëåøç ôçò ôïîéêÞò äõíáôüôçôáò. Óôá ðëáßóéá ôùí êáôåõèõíôçñßùí ãñáììþí ôçò ðáñïýóáò äï êéìÞò, ãéá ôç ìåôáôñïðÞ ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò in vitro 3T3 NRU äïêéìÞò öùôïôïîéêüôçôáò óå ðñüâëåøç ôùí öùôïôïîéêþí äõíáôïôÞôùí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéç èïýí ïé PIF êáé MPE. PIF (Photo Irritation Factor - ÓõíôåëåóôÞò öùôïåñåèé óìïý): óõíôåëåóôÞò ðïõ ëáìâÜíåôáé óõãêñßíïíôáò äýï åîßóïõ áðïôåëåóìáôéêÝò êõôôáñïôïîéêÝò óõãêåíôñþóåéò (EC50) ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò áðïõóßá (-UV) êáé ðáñïõóßá (+UV) ìç êõôôáñïôïîéêÞò áêôéíïâüëçóçò ìå UVA/ïñáôü öùò. MPE (Mean Photo Effect - ÌÝóç öùôïåðßäñáóç): íÝï ìÝ ôñï ðïõ ðñïÝñ÷åôáé áðü ìáèçìáôéêÞ áíÜëõóç ôïõ ðëÞ ñïõò ó÷Þìáôïò äýï êáìðõëþí óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò áðïõóßá (-UV) êáé ðáñïõóßá (+UV) ìç êõôôáñïôïîéêÞò áêôéíïâüëçóçò ìå UVA/ïñ.öùò. Öùôïôïîéêüôçôá: ïîåßá ôïîéêÞ áðüêñéóç ðïõ åìöáíßæå ôáé ìåôÜ ôçí ðñþôç Ýêèåóç ôïõ äÝñìáôïò óå ïñéóìÝíåò ÷çìéêÝò ïõóßåò êáé ôçí åí óõíå÷åßá Ýêèåóç óôï öùò, Þ ç ïðïßá åðÜãåôáé ïìïßùò áðü áêôéíïâüëçóç ôïõ äÝñìáôïò Ýðåéôá áðü óõóôåìéêÞ ÷ïñÞãçóç ìéáò ÷çìéêÞò ïõóßáò. Öùôïåñåèéóìüò: õðïäéáßñåóç ôïõ üñïõ �öùôïôïîéêü ôçôá�, ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá íá ðåñéãñÜøåé ìüíïí ôéò öùôïôïîéêÝò åêåßíåò áíôéäñÜóåéò ðïõ ðñïêáëïýíôáé óôï äÝñìá Ýðåéôá áðü Ýêèåóç óå ÷çìéêÝò ïõóßåò (ôïðéêÜ Þ áðü ôï óôüìá). Ïé öùôïôïîéêÝò áõôÝò áíôéäñÜóåéò Ý÷ïõí ðÜ íôïôå ùò áðïôÝëåóìá ôç ìç åîåéäéêåõìÝíç êáôáóôñïöÞ êõôôÜñùí (áíôéäñÜóåéò üðùò ôá çëéáêÜ åãêáýìáôá). Öùôïáëëåñãßá: åðßêôçôç áíïóïëïãéêÞ áíôßäñáóç, ðïõ äåí åìöáíßæåôáé óôçí ðñþôç åðáöÞ ìå ÷çìéêÞ ïõóßá êáé öùò, êáé ÷ñåéÜæåôáé åðáãùãéêü ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ìéáò Þ äýï åâäïìÜäùí ðñéí íá åìöáíéóôåß äåñìáôéêÞ áíôßäñáóç. Öùôïãïíéäéïôïîéêüôçôá: ðáñáôçñïýìåíç ãïíéäéïôïîé êÞ áðüêñéóç ìå ãåíåôéêü ôåëéêü áðïôÝëåóìá, ðïõ åìöáíß æåôáé ìåôÜ ôçí Ýêèåóç êõôôÜñùí óå ìç ãïíéäéïôïîéêÞ äü óç UV/ïñáôïý öùôüò êáé ìç ãïíéäéïôïîéêÞ ÷çìéêÞ ïõóßá. ÖùôïêáñêéíïãÝíåóç: êáñêéíïãÝíåóç ðñïêáëïýìåíç áðü åðáíåéëçììÝíç ÷ñÞóç öùôüò êáé ÷çìéêÞò ïõóßáò. Åöüóïí ôõ÷üí áðü UV ðñïêáëïýìåíç ïãêïãÝíåóç åíé ó÷ýåôáé áðü ÷çìéêÞ ïõóßá, ôüôå ÷ñçóéìïðïéåßôáé ï üñïò 'öùôïóõãêáñêéíïãÝíåóç'. 1.3 ÏÕÓÉÅÓ ÁÍÁÖÏÑÁÓ Åêôüò áðü ôïí èåôéêü ÷çìéêü ìÜñôõñá ÷ëùñïðñïìáæß íç, ðïõ èá ðñÝðåé íá äïêéìÜæåôáé ôáõôü÷ñïíá óå êÜèå äï êéìÞ, óå ðåñéðôþóåéò ðñþôçò åöáñìïãÞò ôçò äïêéìÞò öùôïôïîéêüôçôáò 3T3 NRU óõíéóôÜôáé íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé ùò ïõóßåò áíáöïñÜò êáé ïñéóìÝíåò áðü ôéò ïõóßåò ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêáí óå äéåñãáóôçñéáêÝò äïêéìÝò ìå ôçí ðáñïýóá äïêéìÞ (1)(3)(13). 1.4 ÁÑ×ÉÊÅÓ ÈÅÙÑÇÓÅÉÓ ÕðÜñ÷ïõí äéÜöïñïé ôýðïé ÷çìéêþí ïõóéþí ðïõ Ý÷ïõí áíáöåñèåß ùò öùôïôïîéêÝò (5)(6)(7)(8). Ôï ìüíï êïéíü ÷á ñáêôçñéóôéêü ôïõò åßíáé ç éêáíüôçôÜ ôïõò íá áðïññïöïýí öùôåéíÞ åíÝñãåéá óôçí ðåñéï÷Þ ôïõ çëéáêïý öùôüò. Óýì öùíá ìå ôïí ðñþôï íüìï ôçò öùôï÷çìåßáò (Grotthaus Draper's Law) ç öùôïáíôßäñáóç áðáéôåß åðáñêÞ áðïññü öçóç êâÜíôùí öùôüò. ¸ôóé, ðñéí áðü ôï âéïëïãéêü Ýëåã ÷ï óýìöùíá ìå ôéò êáôåõèõíôÞñéåò ãñáììÝò ôçò ðáñïýóáò äïêéìÞò, èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæåôáé ôï öÜ óìá áðïññüöçóçò UV/ïñáôïý ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò (ð.÷. óýìöùíá ìå ôçí OECD Test Guideline 101). ÅÜí ï óõ íôåëåóôÞò ìïñéáêÞò áðüóâåóçò / áðïññüöçóçò åßíáé ìé êñüôåñïò áðü 10 ëßôñá x mol-1 x cm-1, ç ÷çìéêÞ ïõóßá äåí Ý÷åé öùôïáíôéäñáóôéêÝò äõíáôüôçôåò êáé äåí ÷ñåéÜæåôáé íá åëåã÷èåß ìå ôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôç ôáò Þ ïðïéáäÞðïôå Üëëç âéïëïãéêÞ äïêéìÞ ãéá äõóìåíåßò öùôï÷çìéêÝò åðéäñÜóåéò (ÐñïóÜñôçìá). 1.5 ÁÑ×Ç ôçò ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ ¸÷ïõí åíôïðéóôåß ôÝóóåñéò ìç÷áíéóìïß ìå ôïõò ïðïßïõò ç áðïññüöçóç öùôüò áðü ìéá ÷ñùìïöüñï ÷çìéêÞ Ýíùóç ìðïñåß íá ïäçãÞóåé óå öùôïôïîéêÞ áðüêñéóç (7). ¼ëïé áðïëÞãïõí óå êáôáóôñïöÞ ôùí êõôôÜñùí. Óõíåðþò, ç in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò âáóßæåôáé óå óý ãêñéóç ôçò êõôôáñïôïîéêüôçôáò ìéáò ÷çìéêÞò ïõóßáò üôáí õðïâÜëëåôáé óå äïêéìÞ ìå êáé ÷ùñßò Ýêèåóç óå ìç êõôôáñïôïîéêÞ äüóç UVA/ïñáôïý öùôüò. Ç êõôôáñïôïîé êüôçôá óå áõôÞ ôç äïêéìÞ åêöñÜæåôáé ìå ôç ìïñöÞ åîáñ ôþìåíçò áðü ôç óõãêÝíôñùóç ìåßùóçò ôçò ðñüóëçøçò ôçò æùôéêÞò ÷ñùóôéêÞò, Neutral Red (NR), ( 9) 24 þñåò ìå ôÜ ôçí áãùãÞ ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá êáé áêôéíïâüëçóç. Êýôôáñá Balb/c 3T3 äéáôçñïýíôáé óå êáëëéÝñãåéá ãéá 24 þñåò ãéá ôï ó÷çìáôéóìü ìïíïóôéâÜäùí. Óôç óõíÝ÷åéá, äýï ôñõâëßá ìå 96 êïéëüôçôåò áíÜ äïêéìáæüìåíç ïõóßá ðñïåðùÜæïíôáé ìå ïêôþ äéáöïñåôéêÝò óõãêåíôñþóåéò ôçò ïõóßáò ãéá 1 h. Óôç óõíÝ÷åéá, Ýíá áðü ôá äýï ôñõâëßá åêôßèåôáé óå ìç êõôôáñïôïîéêÞ äüóç UVA/ïñ.öùôüò 5 J/cm² UVA (ðåßñáìá +UV), åíþ ôï Üëëï ôñõâëßï äéáôçñåß ôáé óôï óêoôÜäé (ðåßñáìá -UV). Êáé óôá äýï ôñõâëßá, ôï ìÝ óïí áãùãÞò áíôéêáèßóôáôáé êáôüðéí áðü ìÝóïí êáëëéÝñ ãåéáò êáé Ýðåéôá áðü 24 áêüìç þñåò åðþáóçò, ðñïóäéï ñßæåôáé ç êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá ìå Neutral Red Uptake (NRU) ãéá 3 h. Ç ó÷åôéêÞ êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá, åêöñá æüìåíç ùò ðïóïóôü ìç õðïâëçèÝíôùí óå áãùãÞ áñíçôé êþí ìáñôýñùí, õðïëïãßæåôáé ãéá êÜèå ìßá áðü ôéò ïêôþ óõãêåíôñþóåéò äïêéìÞò. Ãéá ôçí ðñüâëåøç ôçò öùôïôïîé êÞò äõíáôüôçôáò, ïé êáôÜ óõãêÝíôñùóç áðïêñßóåéò ðïõ ëáìâÜíïíôáé ìå (+UV) êáé ÷ùñßò (-UV) áêôéíïâüëçóç óõ ãêñßíïíôáé, óõíÞèùò óôá åðßðåäá EC50 , äçë. óôç óõãêÝ íôñùóç ðïõ áíáóôÝëåé ôçí êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá êáôÜ 50% óå óýãêñéóç ìå ôïõò ìç õðïâëçèÝíôåò óå áãùãÞ ìÜñôõñåò. 1.6 ÐÏÉÏÔÉÊÁ ÊÑÉÔÇÑÉÁ ÊõôôáñéêÞ åõáéóèçóßá óå UVA, éóôïñéêÜ óôïé÷åßá: Ôá êýôôáñá èá ðñÝðåé êáíïíéêÜ íá åëÝã÷ïíôáé ùò ðñïò ôçí åõáéóèçóßá ôïõò óå UVA. Êýôôáñá äéáóðåßñïíôáé õðü ðõ êíüôçôá ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé êáé óôçí in vitro 3T3 NRU äï êéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò, ôçí åðüìåíç çìÝñá áêôéíïâïëïý íôáé ìå äüóåéò UVA áðü 1-9 J/cm², êáé ç êõôôáñéêÞ âéùóé ìüôçôá ðñïóäéïñßæåôáé ìéá çìÝñá áñãüôåñá ÷ñçóéìïðïé þíôáò ôç äïêéìÞ NRU. Ôá êýôôáñá ðëçñïýí ôá êñéôÞñéá ðïéüôçôáò, åÜí ç âéùóéìüôçôÜ ôïõò ìåôÜ ôçí áêôéíïâüëç óç ìå 5 J/cm2 UVA äåí åßíáé ìéêñüôåñç áðü ôï 80% ôçò âéùóéìüôçôáò ôùí äéáôçñçèÝíôùí óôï óêïôÜäé ìáñôý ñùí. Óôç ìÝãéóôç äüóç UVA ôùí 9 J/cm2, ç âéùóéìüôçôá äåí èá ðñÝðåé íá åßíáé ìéêñüôåñç áðü ôï 50% åêåßíçò ôùí äéáôçñçèÝíôùí óôï óêüôïò ìáñôýñùí. Ï Ýëåã÷ïò áõôüò èá ðñÝðåé íá åðáíáëáìâÜíåôáé Ýðåéôá áðü êÜèå 10 ðåñß ðïõ äéåëåýóåéò ôùí êõôôÜñùí. Åõáéóèçóßá óôï UVA ôùí áñíçôéêþí êõôôáñéêþí ìáñôý ñùí, ôñÝ÷ïõóá äïêéìÞ: Ç äïêéìÞ ðëçñïß ôá ðïéïôéêÜ êñéôÞ ñéá åÜí ïé áñíçôéêïß ìÜñôõñåò (êýôôáñá óå Earl's Balanced Salt Solution (EBSS) ìå Þ ÷ùñßò 1% äéìåèõëïóïõëöïîåßäéï (DMSO) Þ 1% áéèáíüëç (EtOH)) óôï +UVA ðåßñáìá åìöá íßæïõí âéùóéìüôçôá ü÷é ìéêñüôåñç áðü ôï 80% åêåßíçò ìç áêôéíïâïëçìÝíùí êõôôÜñùí óôïí ßäéï äéáëýôç ôïõ óõìðá ñïìáñôïýíôïò ðåéñÜìáôïò óôï óêïôÜäé (UVA). Âéùóéìüôçôá áñíçôéêþí ìáñôýñùí: Ç áðüëõôç ïðôéêÞ ðõ êíüôçôá (OD540 NRU) ìåôñïýìåíç óôï åê÷ýëéóìá NR ôùí áñ íçôéêþí ìáñôýñùí äåß÷íåé áí ôá 1 x 104 êýôôáñá áíÜ êïéëü ôçôá áíáðôý÷èçêáí ìå êáíïíéêü ÷ñüíï äéðëáóéáóìïý êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôùí äýï çìåñþí ôçò äïêéìÞò. Ìéá äïêéìÞ ðëç ñïß ôá êñéôÞñéá áðïäï÷Þò åÜí ç ìÝóç OD540 NRU ôùí ìç õðï âëçèÝíôùí óå áãùãÞ ìáñôýñùí åßíáé ≥ 0.2 Èåôéêüò ìÜñôõñáò: Óå êÜèå in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öù ôïôïîéêüôçôáò ðñÝðåé íá åîåôÜæåôáé óõã÷ñüíùò êáé ìéá ãíùóôÞ öùôïôïîéêÞ ÷çìéêÞ ïõóßá. Óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ôùí EE/COLIPÁ ùò èåôéêüò ìÜñôõñáò ÷ñçóéìïðïéÞèçêå ÷ëùñïðñïìáæßíç (CPZ) ç ïðïßá êáé åðïìÝíùò ðñïôåßíå ôáé. Óôçí ðåñßðôùóç CPZ ðïõ åîåôÜæåôáé ìå ôï ôõðéêü ðñù ôüêïëëï óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò, ïñßóôçêáí ôá áêüëïõèá êñéôÞñéá áðïäï÷Þò äïêéìÞò: CPZ áêôéíïâïëçìÝíç (+UVA): EC50= 0.1 Ýùò 2.0 µg/ml, CPZ ìç áêôéíïâïëçìÝíç (-UVA): EC50 = 7.0 Ýùò 90.0 µg/ml. Ï óõ íôåëåóôÞò öùôïåñåèéóìïý (PIF), äçë. ç ìåôáâïëÞ ôçò EC50 èá ðñÝðåé íá åßíáé ôïõëÜ÷éóôïí 6. Ùò óõìðáñïìáñôïýíôåò èåôéêïß ìÜñôõñåò, áíôß ôçò CPZ, ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí êáé Üëëåò ãíùóôÝò öùôïôïîéêÝò ÷çìéêÝò ïõóßåò, êáôÜëëçëåò ãéá ôç ÷çìéêÞ ôÜîç Þ ôá ÷áñáêôçñéóôéêÜ äéáëõôüôçôáò ôçò áîéïëïãïý ìåíçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Óôçí ðåñßðôùóç áõôÞ, ìå âÜóç éóôïñéêÜ äåäïìÝíá, èá ðñÝðåé íá ïñéóôïýí êáôÜëëçëá ïé ðåñéï÷Ýò ôùí ôéìþí EC50 êáé ï PIF Þ ç MPE (Mean Photo Ef fect) ùò êñéôÞñéá áðïäï÷Þò ãéá ôç äïêéìÞ. 1.7 ÐÅÑÉÃÑÁÖÇ ôçò ÌÅÈÏÄÏÕ ÄÏÊÉÌÇÓ 1.7.1 ÐáñáóêåõÜóìáôá 1.7.1.1 Êýôôáñá Óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ÷ñçóéìïðïéÞèçêå ìüíéìç êõô ôáñéêÞ óåéñÜ éíïâëáóôþí ðïíôéêïý - Balb/c 3T3, êëþíïò 31 - åßôå áðü ôçí ATCC åßôå áðü ôçí ECACC, ç ïðïßá åðï ìÝíùò êáé ðñïôåßíåôáé. Óôï ßäéï ðñùôüêïëëï äïêéìÞò ìðï ñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí åîßóïõ åðéôõ÷þò êáé Üëëá êýô ôáñá Þ êõôôáñéêÝò óåéñÝò, åöüóïí ïé óõíèÞêåò êáëëéÝñ ãåéáò åßíáé ðñïóáñìïóìÝíåò óôéò åéäéêÝò áíÜãêåò ôùí êõôôÜñùí, ðñÝðåé üìùò íá êáôáäåéêíýåôáé ç éóïäõíáìßá. Ôá êýôôáñá èá ðñÝðåé êáíïíéêÜ íá åëÝã÷ïíôáé ìÞðùò åß íáé ìïëõóìÝíá áðü ìõêüðëáóìá êáé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1889 ìüíïí åöüóïí ôá áðïôåëÝóìáôá ôïõ åëÝã÷ïõ áõôïý åßíáé éêáíïðïéçôéêÜ. ÅðåéäÞ ç åõáéóèçóßá ôùí êõôôÜñùí óå UVA ìðïñåß íá áõîÜíåôáé ìå ôïí áñéèìü ôùí äéåëåýóåùí, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êýôôáñá Balb/c 3T3 ìå ôïí ÷áìçëüôåñï äõíáôüí áñéèìü äéåëåýóåùí, êáôÜ ðñïôßìçóç êÜôù ôùí 100. ¸÷åé éäéáßôåñç óçìáóßá, ç åõáéóèçóßá óå UVA ôùí êõôôÜñùí Balb/c 3T3 íá åëÝã÷åôáé ôáêôéêÜ óýìöùíá ìå ôç äéáäéêáóßá ðïéïôéêïý åëÝã÷ïõ ðïõ ðåñéãñÜöåôáé óôéò ðá ñïýóåò êáôåõèõíôÞñéåò ãñáììÝò. 1.7.1.2 ÌÝóá êáé óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò Ãéá ôç óõíÞèç äéÝëåõóç êõôôÜñùí êáé êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò äéáäéêáóßáò äïêéìÞò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé êáôÜëëçëá ìÝóá êáëëéÝñãåéáò êáé óõíèÞêåò åðùÜóåùò. Ãéá êýôôáñá Balb/c 3T3, ôá ìÝóá áõôÜ åßíáé DMEM ìå ðñï óèÞêç 10% ïñïý íåïãÝííçôïõ ìïó÷áñéïý, 4 mM ãëïõôá ìßíç, ðåíéêéëëßíç êáé óôñåðôïìõêßíç, êáé åðþáóç ìå õãñá óßá óôïõò 37°C / 7.5% CO2. Åßíáé éäéáßôåñá óçìáíôéêü, ïé óõíèÞêåò ôçò êõôôáñéêÞò êáëëéÝñãåéáò íá äéáóöáëßæïõí ÷ñüíï êõôôáñéêïý êýêëïõ óôá êáíïíéêÜ éóôïñéêÜ ðëáßóéá ôùí ÷ñçóéìïðïéïýìåíùí êõôôÜñùí Þ êõôôáñéêþí óåéñþí. 1.7.1.3 Åôïéìáóßá ôùí êáëëéåñãåéþí Êýôôáñá áðü êáôåøõãìÝíåò áñ÷éêÝò êáëëéÝñãåéåò åì âïëéÜæïíôáé óå ìÝóïí êáëëéÝñãåéáò óôçí êáôÜëëçëç ðõ êíüôçôá êáé ÷ùñßæïíôáé óå õðïêáëëéÝñãåéåò ôïõëÜ÷éóôïí ìéá öïñÜ ðñéí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò. Ãéá ôç äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò, ôá êýôôáñá åìâïëéÜæï íôáé óå ìÝóïí êáëëéÝñãåéáò óå ðõêíüôçôá ôÝôïéá þóôå ïé êáëëéÝñãåéåò íá ìç öèÜíïõí óå êáôÜóôáóç óõññïÞò ìÝ ÷ñé ôï ôÝëïò ôçò äïêéìÞò, äçë. üôáí ç êõôôáñéêÞ âéùóéìü ôçôá ðñïóäéïñßæåôáé 48 þñåò ìåôÜ ôç äéáóðïñÜ ôùí êõô ôÜñùí. Óôçí ðåñßðôùóç êõôôÜñùí Balb/c 3T3 êáëëéåñ ãïýìåíùí óå ôñõâëßá 96 êïéëïôÞôùí, ç óõíéóôþìåíç êõôôáñéêÞ ðõêíüôçôá åßíáé 1x104 êýôôáñá áíÜ êïéëüôçôá. Ãéá êÜèå äïêéìáæüìåíç ÷çìéêÞ ïõóßá, ôá êýôôáñá åìâï ëéÜæïíôáé ìå ôïí ßäéï ôñüðï óå äýï ÷ùñéóôÜ ôñõâëßá ôùí 96 êïéëïôÞôùí, ôá ïðïßá ðåñíïýí óôç óõíÝ÷åéá ôáõôü ÷ñïíá áðü üëç ôç äéáäéêáóßá äïêéìÞò õðü ôáõôüóçìåò óõíèÞêåò êáëëéÝñãåéáò, åêôüò áðü ôç ÷ñïíéêÞ ðåñßïäï üðïõ Ýíá áðü ôá ôñõâëßá áêôéíïâïëåßôáé (+UVA/ïñ.) êáé ôï Üëëï äéáôçñåßôáé óôï óêïôÜäé (-UVA/ïñ.). 1.7.1.4 ÌåôáâïëéêÞ åíåñãïðïßçóç Áí êáé ç ÷ñÞóç ìåôáâïëéêþí óõóôçìÜôùí áðïôåëåß ãå íéêÞ áðáßôçóç ãéá üëåò ôéò in vitro äïêéìÝò ãéá ôçí ðñü âëåøç ãïíéäéïôïîéêþí êáé êáñêéíïãüíùí äõíáôïôÞôùí, ìÝ÷ñé óÞìåñá, óôçí ðåñßðôùóç ôçò öùôïôïîéêïëïãßáò, äåí õðÜñ÷åé êáììéÜ ãíùóôÞ ÷çìéêÞ ïõóßá ãéá ôçí ïðïßá íá ÷ñåéÜæåôáé ìåôáâïëéêüò ìåôáó÷çìáôéóìüò ðñïêåéìÝíïõ ç ïõóßá íá äñÜóåé ùò öùôïôïîßíç in vivo Þ in vitro. ̧ ôóé, ïý ôå èåùñåßôáé áíáãêáßï ïýôå äéêáéïëïãåßôáé åðéóôçìïíéêÜ ç åêôÝëåóç ôçò ðáñïýóáò äïêéìÞò ìå êÜðïéï óýóôçìá ìå ôáâïëéêÞò åíåñãïðïßçóçò. 1.7.1.5 Õðü äïêéìÞ ïõóßá / ÐáñáóêåõÞ Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò ðñÝðåé íá åßíáé ðñüóöáôá ðáñá óêåõáóìÝíåò ëßãï ðñéí áðü ôç ÷ñÞóç ôïõò, åêôüò êé áí ôá õöéóôÜìåíá óôïé÷åßá óôáèåñüôçôáò åðéôñÝðïõí ôçí áðï èÞêåõóç. Óôçí ðåñßðôùóç ðïõ õðÜñ÷åé ðéèáíüôçôá ôá÷åß áò öùôïáðïéêïäüìçóçò, ìðïñåß íá áðáéôåßôáé ðáñá óêåõÞ ìå åñõèñü öùò. Ïé õðü äïêéìÞ ïõóßåò èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé óå ñõè ìéóôéêÜ áëáôïý÷á äéáëýìáôá, ð.÷. Earl's Balanced Salt So lution, (EBSS) Þ Phosphate Buffered Saline (PBS), ôá ïðïßá, ãéá ëüãïõò áðïöõãÞò ðáñåìâáôéêþí öáéíïìÝíùí êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò áêôéíïâüëçóçò, ðñÝðåé íá åßíáé áðçëëáãìÝíá ðñùôåúíéêþí óõóôáôéêþí êáé ÷ñùóôéêþí äåéêôþí pH ðïõ áðïññïöïýí ôï öùò. Ïõóßåò ìå ðåñéïñéóìÝíç õäáôïäéáëõôüôçôá èá ðñÝðåé íá äéáëýïíôáé óå êáôÜëëçëïõò äéáëýôåò óôï åêáôïíôá ðëÜóéï ôçò åðéèõìçôÞò ôåëéêÞò óõãêÝíôñùóçò êáé êáôü ðéí íá áñáéþíïíôáé 1:100 ìå ôï ñõèìéóôéêü áëáôïý÷ï äéÜ ëõìá. Åöüóïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé äéáëýôçò, áõôüò ðñÝðåé íá õðÜñ÷åé óå óôáèåñü üãêï 1% (v/v) óå üëåò ôéò êáëëéÝñãåé åò, äçë. ôüóï óôïõò áñíçôéêïýò ìÜñôõñåò üóï êáé óå üëåò ôéò óõãêåíôñþóåéò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ùò äéáëýôåò óõíéóôþíôáé ôï äéìåèõëïóïõëöïîåßäéï (DMSO) êáé ç áéèáíüëç (EtOH). ÊáôÜëëçëïé ìðïñåß íá åß íáé êáé Üëëïé äéáëýôåò ìå ÷áìçëÞ êõôôáñïôïîéêüôçôá (ð.÷. áêåôüíç), ðñÝðåé üìùò íá åëÝã÷ïíôáé ðñïóåêôéêÜ ìÞðùò ôõ÷üí åìöáíßæïõí êÜðïéåò åéäéêÝò éäéüôçôåò, ð.÷. áíôé äñïýí ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá, ðáãþíïõí ôçí öùôïôïîé êÞ åðßäñáóç, åíþíïíôáé ìå ñßæåò, êëð. Ðñïò õðïâïÞèçóç ôçò äéáëõôïðïßçóçò, ìðïñåß íá ÷ñç óéìïðïéçèåß, åöüóïí áðáéôåßôáé, áíÜìåéîç ìå vortex êáé/Þ åðßäñáóç õðåñÞ÷ùí êáé/Þ èÝñìáíóç óôïõò 37°C. 1.7.1.6 Áêôéíïâïëßá UV / Ðñïåôïéìáóßá ÖùôåéíÞ ðçãÞ: ï êñéóéìüôåñïò ðáñÜãïíôáò óôç äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò åßíáé ç åðéëïãÞ êáôÜëëçëçò öùôåéíÞò ðçãÞò êáé êáôÜëëçëïõ ößëôñïõ. Ç æþíç UVA êáé ïé ïñáôÝò ðåñéï÷Ýò ó÷åôßæïíôáé óõíÞèùò ìå öáéíüìåíá öùôïåõáé óèçôïðïßçóçò (7)(10), åíþ ç UVB ó÷åôßæåôáé ëéãüôåñï êáé åßíáé áðåõèåßáò ëßáí êõôôáñïôïîéêÞ, ç äå êõôôáñïôïîéêü ôçôÜ ôçò áõîÜíåôáé ìÝ÷ñé ôï ÷éëéáðëÜóéï óôçí ðåñéï÷Þ áðü 313 Ýùò 280 nm (11). Óôá êñéôÞñéá ãéá ôçí åðéëïãÞ êá ôÜëëçëçò öùôåéíÞò ðçãÞò èá ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåôáé ùò âáóéêÞ áðáßôçóç, ôá êýìáôá ðïõ åêðÝìðïíôáé áðü ôç öùôåéíÞ ðçãÞ íá Ý÷ïõí ìÞêïò êýìáôïò áðïññïöïýìåíï áðü ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá åíþ ç öùôåéíÞ äüóç (ðïõ ðñÝ ðåé íá åðéôõã÷Üíåôáé ìÝóá óå ëïãéêü ÷ñïíéêü äéÜóôçìá) èá ðñÝðåé íá åßíáé åðáñêÞò ãéá ôçí áíß÷íåõóç ãíùóôþí öùôïåõáéóèçôïðïéçôéêþí ïõóéþí. ÐåñáéôÝñù, ôá ÷ñçóé ìïðïéïýìåíá ìÞêç êýìáôïò êáé ïé äüóåéò äåí èá ðñÝðåé íá Ý÷ïõí áíåðßôñåðôåò åðéäñÜóåéò óôï óýóôçìá äïêéìÞò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíçò êáé ôçò åêðïìðÞò èåñìüôçôáò (ðåñéï÷Þ õðåñýèñïõ). Ùò Üñéóôç öùôåéíÞ ðçãÞ èåùñåßôáé ç ðñïóïìïßùóç ôïõ çëéáêïý öùôüò ìå çëéáêïýò ðñïóïìïéùôÝò. Óôïõò çëéá êïýò ðñïóïìïéùôÝò ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ôüóïí ôüîá Xenon üóï êáé (åðé÷ñéóìÝíá) ôüîá õäñáñãýñïõ-ìåôáëëïáëïãï íéäßùí. Ôá ôåëåõôáßá Ý÷ïõí ôï ðëåïíÝêôçìá üôé åêðÝ ìðïõí ëéãüôåñç èåñìüôçôá êáé åßíáé öèçíüôåñá, äåí ôáé ñéÜæïõí üìùò áðüëõôá ìå ôï çëéáêü öùò. ÅðåéäÞ üëïé ïé çëéáêïß ðñïóïìïéùôÝò åêðÝìðïõí óçìáíôéêÝò ðïóüôçôåò UVB, èá ðñÝðåé íá öéëôñÜñïíôáé êáôÜëëçëá þóôå íá åîá óèåíåß ç õøçëÞò êõôôáñïôïîéêüôçôáò áêôéíïâïëßá UVB. Ãéá ôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé öÜóìá áêôéíïâïëßáò áðçëëáã ìÝíï ðñáêôéêÜ áðü UVB (UVA:UVB ~ 1:20). ¸÷åé äçìïóé åõôåß ðáñÜäåéãìá ôçò êáôáíïìÞò ôçò öáóìáôéêÞò áêôéíï âïëßáò ôïõ öéëôñáñéóìÝíïõ çëéáêïý ðñïóïìïéùôÞ ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêå óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ôçò in vitro 3T3 NRU äïêéìÞò öùôïôïîéêüôçôáò (3). Äïóéìåôñßá: Ç Ýíôáóç ôïõ öùôüò (Ýíôáóç áêôéíïâï ëßáò) èá ðñÝðåé íá åëÝã÷åôáé êáíïíéêÜ ðñéí áðü êÜèå äï êéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò, ÷ñçóéìïðïéþíôáò êáôÜëëçëï åõ 1890 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ñýæùíï õðåñéùäéüìåôñï. Ôï UV-ìåôñï ðñÝðåé íá äéáêñé âþíåôáé ùò ðñïò ôçí ðçãÞ. Ç ëåéôïõñãßá ôïõ UV-ìÝôñïõ èá ðñÝðåé íá åëÝã÷åôáé, êáé ãéá ôï óêïðü áõôü, óõíéóôÜôáé ç ÷ñÞóç åíüò äåýôåñïõ UV-ìÝôñïõ áíáöïñÜò ôïõ ßäéïõ ôýðïõ êáé ìå ôáõôüóçìç äéáêñßâùóç. ÈåùñçôéêÜ, êáôÜ ìåãÜëá äéáóôÞìáôá, èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé öá óìáôïáêôéíüìåôñï ãéá íá ìåôñéÝôáé ç öáóìáôéêÞ áêôéíï âïëßá ôçò öéëôñáñéóìÝíçò öùôåéíÞò ðçãÞò êáé íá åëÝã÷å ôáé ç âáèìïíüìçóç ôïõ åõñýæùíïõ UV-ìÝôñïõ, ôá üñãá íá áõôÜ üìùò áðáéôïýí ÷åéñéóìü ìüíïí áðü êáôÜëëçëá åêðáéäåõìÝíá Üôïìá. Óôç ìåëÝôç åðéêýñùóçò ðñïóäéïñßóôçêå üôé äüóç 5 J/cm² (UVA) äåí ðáñïõóéÜæåé êõôôáñïôïîéêüôçôá ãéá ôá êýôôáñá Balb/c 3T3, åßíáé üìùò åðáñêÞò ãéá ôç äéÝãåñóç Ýóôù êáé áóèåíþí öùôïôïîéêþí ÷çìéêþí ïõóéþí. Ãéá ôçí åðßôåõîç 5 J/cm² åíôüò ÷ñïíéêïý äéáóôÞìáôïò 50 min, ç Ýíôáóç ôçò áêôéíïâïëßáò ðñÝðåé íá ðñïóáñìüæåôáé óôá 1.666 mW/cm². Åöüóïí ÷ñçóéìïðïéçèåß Üëëç êõôôáñéêÞ óåéñÜ Þ äéáöïñå ôéêÞ öùôåéíÞ ðçãÞ, ç äüóç UVA ìðïñåß íá ðñÝðåé íá ðñï óáñìïóôåß åëáöñþò, ìå âÜóç ôá êñéôÞñéá ôçò ìç äõóìå íïýò åðßäñáóçò óôá êýôôáñá êáé ôçò åðÜñêåéáò ãéá ôçí áíß ÷íåõóç óõíÞèùí öùôïôïîéíþí. Ï ÷ñüíïò ôçò öùôåéíÞò Ýêèåóçò õðïëïãßæåôáé ìå ôïí áêüëïõèï ôñüðï: 1.7.2 ÓõíèÞêåò äïêéìÞò Ç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç ìéáò õðü äïêéìÞ ïõóßáò äåí èá ðñÝðåé íá õðåñâáßíåé ôá 100 µg/ml, áöïý üëåò ïé öùôïôï îéêÝò ïõóßåò áíé÷íåýèçêáí óå ÷áìçëüôåñåò óõãêåíôñþ óåéò, åíþ óå õøçëüôåñåò óõãêåíôñþóåéò áõîÜíåé ç ðéèá íüôçôá åìöÜíéóçò åóöáëìÝíùí èåôéêþí áðïôåëåóìÜôùí (õðåñâïëéêþí ðñïâëÝøåùí) (13). Ôï pH ôçò õøçëüôåñçò óõãêÝíôñùóçò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò èá ðñÝðåé íá åßíáé éêáíïðïéçôéêü (ðåñéï÷Þ pH: 6.5 - 7.8). Ïé ðåñéï÷Ýò óõãêåíôñþóåùí ìéáò ÷çìéêÞò ïõóßáò ðïõ õðïâÜëëåôáé óå äïêéìÞ ðáñïõóßá (+UVA) êáé áðïõóßá (UVA) öùôüò èá ðñÝðåé íá ðñïóäéïñßæïíôáé êáôÜëëçëá ìå ðñïçãïýìåíá ðåéñÜìáôá ãéá åýñåóç ôçò ðåñéï÷Þò. Ôï åý ñïò êáé ôï äéÜóôçìá ìéáò óåéñÜò óõãêåíôñþóåùí ðñÝðåé íá ðñïóáñìüæïíôáé Ýôóé þóôå ïé êáìðýëåò óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò íá õðïóôçñßæïíôáé áðü åðáñêÞ ðåéñáìáôéêÜ äå äïìÝíá. Èá ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãåùìåôñéêÞ óåéñÜ óõãêåíôñþóåùí (ìå óôáèåñü óõíôåëåóôÞ áñáßùóçò). 1.7.3 Äéáäéêáóßá äïêéìÞò1 1.7.3.1 1ç çìÝñá ÐáñáóêåõÜæåôáé åíáéþñçìá êõôôÜñùí ìå 1x105 êýôôá ñá/ml óå ìÝóïí êáëëéÝñãåéáò êáé ðñïóôßèåíôáé 100 µL ìÝ óïõ êáëëéÝñãåéáò óôéò ðåñéöåñåéáêÝò ìüíïí êïéëüôçôåò åíüò ìéêñïôéôëïäïôéêïý ôñõâëßïõ ìå 96 êïéëüôçôåò (= ëåõ êÜ). Óôéò åíáðïìÝíïõóåò êïéëüôçôåò, ðñïóôßèåíôáé 100 µL êõôôáñéêïý åíáéùñÞìáôïò ìå 1x105 êýôôáñá/ml (= 1x104 êýôôáñá/êïéëüôçôá). Ãéá êÜèå äïêéìáæüìåíç ïõóßá, åôïé ìÜæïíôáé äýï ôñõâëßá: Ýíá ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò êõô ôáñïôïîéêüôçôáò (-UVA), êáé ôï Üëëï ãéá ôïí ðñïóäéïñé óìü ôçò öùôïêõôôáñïôïîéêüôçôáò (+UVA). Ôá êýôôáñá åðùÜæïíôáé ãéá 24 h (7.5% CO2, 370C) Ýùò üôïõ ó÷çìáôßæïõí ìïíïóôéâÜäá óå åðßðåäá çìéóõññïÞò. Ç ðåñßïäïò áõôÞ åðþáóçò åðéôñÝðåé ôçí åðáíáöïñÜ óå êáíïíéêÞ êáôÜóôáóç êáé ðñüóöõóç ôùí êõôôÜñùí êáé ôçí åêèåôéêÞ ôïõò áýîçóç. 1.7.3.2 2ç çìÝñá ÌåôÜ ôçí åðþáóç, ôï ìÝóïí êáëëéÝñãåéáò áðïìáêñýíå ôáé áðü ôá êýôôáñá êáé áêïëïõèåß äéðëÞ Ýêðëõóç ìå 150 µL EBSS/PBS áíÜ êïéëüôçôá. Ðñïóôßèåíôáé 100 µL EB SS/PBS ìå ôçí êáôÜëëçëç óõãêÝíôñùóç ïõóßáò Þ áðëþò äéáëýôç (áñíçôéêüò ìÜñôõñáò). ×ñçóéìïðïéïýíôáé 8 äéá öïñåôéêÝò óõãêåíôñþóåéò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ôá êýô ôáñá åðùÜæïíôáé ìå ôçí õðü äïêéìÞ ïõóßá óôï óêïôÜäé ãéá 60 ëåðôÜ (7.5% CO2, 370C). Ãéá ôçí åêôÝëåóç ôïõ (+UVA) ôìÞìáôïò ôçò äïêéìÞò, ôá êýôôáñá áêôéíïâïëïýíôáé ìÝóá áðü ôï êáðÜêé ôïõ ôñõ âëßïõ ìå 96 êïéëüôçôåò ìå 1.7 mW/cm² UVA (= 5 J/cm²). Ãéá ôçí áðïöõãÞ óõìðýêíùóçò õäñáôìþí êÜôù áðü ôï êáðÜêé ÷ñçóéìïðïéåßôáé Ýíáò áíåìéóôÞñáò. ÄéðëÜ ôñõâëßá (-UVA) äéáôçñïýíôáé óå èåñìïêñáóßá äùìáôßïõ ìÝóá óå Ýíá óêïôåéíü êïõôß ãéá 50 min (= ÷ñüíïò Ýêèåóçò UVA). Ôï õðü äïêéìÞ äéÜëõìá ìåôáããßæåôáé êáé áêïëïõèåß Ýê ðëõóç äýï öïñÝò ìå 150 µL EBSS/PBS. Ôï EBSS/PBS áíôéêáèßóôáôáé ìå ìÝóïí êáëëéÝñãåéáò êáé áêïëïõèåß åðþáóç (7.5% CO2, 37 °C) üëç ôç íýêôá (18-22 h). 1.7.3.3 3ç çìÝñá ÌéêñïóêïðéêÞ áîéïëüãçóç Ôá êýôôáñá åîåôÜæïíôáé óå ìéêñïóêüðéï áíôßèåóçò öÜ óåùí. ÊáôáãñÜöïíôáé ïé ìïñöïëïãéêÝò áëëáãÝò ôùí êõô ôÜñùí ðïõ ïöåßëïíôáé óôçí êõôôáñïôïîéêÞ åðßäñáóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Ï Ýëåã÷ïò áõôüò óõíéóôÜôáé ãéá ôçí áðïöõãÞ ðåéñáìáôéêþí ëáèþí, ôá óôïé÷åßá üìùò áõôÜ äåí ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ãéá ôçí åêôßìçóç ôçò êõôôáñïôïîé êüôçôáò Þ ôçò öùôïôïîéêüôçôáò. ÄïêéìÞ Neutral Red Uptake Ôá êýôôáñá åêðëýíïíôáé ìå 150 µL ðñïèåñìáóìÝíï EB SS/PBS. Ôï äéÜëõìá åêðëýóåùò áðïìáêñýíåôáé ìå Þðéá Üíôëçóç. Ðñïóôßèåíôáé 100 µl ìÝóïõ NR êáé áêïëïõèåß åðþáóç óôïõò 37 °C, óå Ýíõãñç áôìüóöáéñá ìå 7.5% CO2, ãéá 3 h. ÌåôÜ ôçí åðþáóç, ôï ìÝóïí NR áðïìáêñýíåôáé êáé ôá êýôôáñá åêðëÝíïíôáé ìå 150 µL EBSS/PBS. Áêïëïõèåß ïëïêëçñùôéêÞ ìåôÜããéóç êáé óôýðùóç ôïõ EBSS/PBS. (Ðñïáéñåôéêþò: áíÜóôñïöç öõãïêÝíôñçóç). Ðñïóôßèåíôáé áêñéâþò 150 µL äéÜëõìá åêñüöçóçò NR (ðñïóöÜôùò ðáñáóêåõáóèÝí äéÜëõìá áéèáíüëçò/ïîéêïý ïîÝïò). Ôï ìéêñïôéôëïäïôéêü ôñõâëßï áíáêéíåßôáé ìå ôá÷ýôçôá ìå ôç âïÞèåéá áíáôáñÜêôç (óÝúêåñ) ìéêñïôéôëïäïôéêþí ôñõâëßùí åðß 10 min, ìÝ÷ñéò üôïõ åê÷õëéóôåß ôï NR áðü ôá êýôôáñá êáé ó÷çìáôéóôåß ïìïéïãåíÝò äéÜëõìá. ÌåôñéÝôáé ç ïðôéêÞ ðõêíüôçôá ôïõ åê÷õëßóìáôïò NR óôá 540 nm ìå öáóìáôïöùôüìåôñï, ÷ñçóéìïðïéþíôáò ôá ëåõ êÜ ùò óçìåßá áíáöïñÜò. Ôá äåäïìÝíá óþæïíôáé óå êá ôÜëëçëç ìïñöÞ (ð.÷. ASCII) ãéá ìåôáãåíÝóôåñç áíÜëõóç. 2 ÄÅÄÏÌÅÍÁ 2.1 ÐÏÉÏÔÇÔÁ ÊÁÉ ÐÏÓÏÔÇÔÁ ÄÅÄÏÌÅÍÙÍ Ôá äåäïìÝíá èá ðñÝðåé íá åßíáé ôÝôïéá þóôå íá ìðïñåß íá ãßíåé ïõóéáóôéêÞ áíÜëõóç ôçò ó÷Ýóçò óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò ðáñïõóßá êáé áðïõóßá UVA/ïñ. áêôéíïâïëßáò. Åöüóïí äéáðéóôùèåß êõôôáñïôïîéêüôçôá, ôüóï ôï åýñïò ôùí óõãêåíôñþóåùí üóï êáé ôï ìåôáîý ôùí åðéìÝñïõò óõ ãêåíôñþóåùí äéÜóôçìá èá ðñÝðåé íá ñõèìßæïíôáé Ýôóé þóôå íá ìðïñåß íá ÷áñá÷èåß êáìðýëç óýìöùíá ìå ôá ðåé ñáìáôéêÜ äåäïìÝíá. Ëüãù ôïõ üôé ìéá õðü äïêéìÞ ïõóßá ìðïñåß íá ìçí åßíáé êõôôáñïôïîéêÞ ìÝ÷ñé ôçí êáèïñéóìÝ ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1891 1 Ðñüóèåôåò ëåðôïìÝñåéåò ìðïñïýí íá âñåèïýí óôçí ðáñáìðïìðÞ (12) íç ïñéáêÞ óõãêÝíôñùóç ôùí 100 µg/ml óôï óêïôåéíü ðåß ñáìá (-UVA), áëëÜ ëßáí ôïîéêÞ üôáí áêôéíïâïëåßôáé (+UVA), ôá ðñïò Ýëåã÷ï åýñç ôùí óõãêåíôñþóåùí êáé óôá äýï ìÝñç ôïõ ðåéñÜìáôïò ìðïñåß íá ÷ñåéÜæåôáé íá äéáöÝñïõí êáôÜ ôÜîåéò ìåãÝèïõò þóôå íá ðëçñïýôáé ç áðáßôçóç ôçò êáôÜëëçëçò ðïéüôçôáò ôùí äåäïìÝíùí. Åöüóïí äåí äéáðéóôùèåß êõôôáñïôïîéêüôçôá êáé óôá äýï ìÝñç ôïõ ðåéñÜìáôïò (-UVA and +UVA), áñêåß Ýëåã÷ïò ìå ìåãÜëç áðüóôáóç ìåôáîý ìåìïíùìÝíùí äüóåùí ìÝ÷ñé ôçí õøçëüôåñç óõãêÝíôñùóç. Äåí ÷ñåéÜæåôáé ïðïéáäÞðïôå åðáëÞèåõóç ìå åðáíáëç ðôéêü ðåßñáìá óôçí ðåñßðôùóç óáöïýò èåôéêïý áðïôåëÝ óìáôïò. ÅðéðëÝïí, äåí ÷ñåéÜæåôáé íá åðáëçèåýïíôáé ïýôå ôá óáöÞ áñíçôéêÜ áðïôåëÝóìáôá, õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åîåôÜóôçêå óå åðáñêþò õøçëÝò óõãêåíôñþóåéò. Óôéò ðåñéðôþóåéò áõôÝò, áñêåß Ýíá êýñéï ðåßñáìá, åðéêïõñïýìåíï áðü Ýíá Þ ðåñéóóüôåñá ðñïêá ôáñêôéêÜ ðåéñÜìáôá áíåýñåóçò åýñïõò óõãêåíôñþóåùí. ÄïêéìÝò ìå ïñéáêÜ áðïôåëÝóìáôá êïíôÜ óôç ãñáììÞ ôïìÞò ôïõ ìïíôÝëïõ ðñüâëåøçò èá ðñÝðåé íá åðáíáëáì âÜíïíôáé ãéá åðáëÞèåõóç. Åöüóïí èåùñçèåß áíáãêáßá ç åðáíÜëçøç ôçò äïêéìÞò ôüôå, ãéá ôç ëÞøç óáöïýò áðïôåëÝóìáôïò, ìðïñåß íá ðáß æåé óçìáíôéêü ñüëï ç äéáêýìáíóç ôùí ðåéñáìáôéêþí óõí èçêþí. Ìéá âáóéêÞ ìåôáâëçôÞ óôç äïêéìÞ áõôÞ åßíáé ç ðá ñáóêåõÞ ôùí äéáëõìÜôùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò. Óõíå ðþò, ç äéáêýìáíóç áõôþí ôùí óõíèçêþí (óõíäéáëýôçò, ëåéïôñßâçóç, åöáñìïãÞ õðåñÞ÷ùí) ìðïñåß íá Ý÷åé ïõóéá óôéêÞ óçìáóßá óôçí åðáíÜëçøç ôçò äïêéìÞò. Åíáëëáêôé êþò, ìðïñåß íá åîåôáóôåß êáé ç äéáêýìáíóç ôïõ ðñï ôçò áêôéíïâïëÞóåùò ÷ñüíïõ åðùÜóåùò. Ç âñÜ÷õíóç ôïõ ÷ñüíïõ ìðïñåß íá Ý÷åé éäéáßôåñç óçìáóßá óôçí ðåñßðôùóç õäáôïáóôáèþí ÷çìéêþí ïõóéþí. 2.2 ÅÐÅÎÅÑÃÁÓÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ ¼ðïõ åßíáé äõíáôüí, ðñïóäéïñßæåôáé ç óõãêÝíôñùóç ìéáò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ðïõ ðáñïõóéÜæåé 50% áíáóôïëÞ ôçò êõôôáñéêÞò NRU (EC50). Áõôü ìðïñåß íá ãßíåé åöáñìü æïíôáò ïðïéáäÞðïôå êáôÜëëçëç äéáäéêáóßá ìç ãñáììéêÞò áíáãùãÞò (êáôÜ ðñïôßìçóç Hill Þ ëïãéóôéêÞ áíáãùãÞ) óôá äåäïìÝíá óõãêÝíôñùóçò-áðüêñéóçò, Þ ÷ñçóéìïðïéþ íôáò Üëëåò äéáäéêáóßåò ðñïóáñìïãÞò (14). Ðñéí ÷ñçóé ìïðïéçèåß êÜðïéá ôéìÞ EC50 ãéá ðåñáéôÝñù õðïëïãéóìïýò, èá ðñÝðåé íá åëÝã÷åôáé êáôÜëëçëá ç ðïéüôçôá ôçò ðñï óáñìïãÞò. Åíáëëáêôéêþò, ãéá ôïí õðïëïãéóìü ôçò EC50 ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ãñáöéêÝò ìÝèïäïé ðñï óáñìïãÞò. Óôçí ðåñßðôùóç áõôÞ, óõíéóôÜôáé ç ÷ñÞóç ÷Üñôïõ ðéèáíïôÞôùí (x-êëßìáêá: log, y-êëßìáêá: probit), êáèþò óå ðïëëÝò ðåñéðôþóåéò ç óõíÜñôçóç óõãêÝíôñù óçò-áðüêñéóçò êáèßóôáôáé ó÷åäüí ãñáììéêÞ ìåôÜ ôï ìå ôáó÷çìáôéóìü áõôü.. 2.3 ÁÎÉÏËÏÃÇÓÇ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ (ÌÏÍÔÅËÁ ÐÑÏÂËÅØÇÓ) 2.3.1 ÌïíôÝëï ðñüâëåøçò Ýêäïóç 1: ÓõíôåëåóôÞò öù ôïåñåèéóìïý (PIF) ÅÜí ôüóï ðáñïõóßá (+UVA) üóï êáé áðïõóßá (-UVA) öùôüò, ëáìâÜíïíôáé ðëÞñåéò êáìðýëåò óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò, ï óõíôåëåóôÞò öùôïåñåèéóìïý (PIF) õðïëï ãßæåôáé ìå ôïí áêüëïõèï ôýðï: ÔéìÞ PIF < 5, óçìáßíåé ìç öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá, ôéìÞ PIF ≥ 5 óçìáßíåé öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá. ÅÜí ìéá ÷çìéêÞ ïõóßá åßíáé êõôôáñïôïîéêÞ ìüíï õðü óõí èÞêåò +UVA êáé ìç êõôôáñïôïîéêÞ üôáí äïêéìÜæåôáé õðü óõíèÞêåò -UVA, ï PIF äåí ìðïñåß íá õðïëïãéóôåß, áí êáé áõôü åßíáé Ýíá áðïôÝëåóìá ðïõ äåß÷íåé öùôïôïôïîéêÞ äõ íáôüôçôá. Óôéò ðåñéðôþóåéò áõôÝò, ìðïñåß íá õðïëïãéóôåß ìéá ôéìÞ "> PIF" åÜí ç äïêéìÞ êõôôáñïôïîéêüôçôáò (-UV) åêôåëåóôåß ìÝ÷ñé ôçí áíþôáôç óõãêÝíôñùóç äïêéìÞò (Cmax) ïðüôå áõôÞ ç ôéìÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí õðïëï ãéóìü ôçò "> PIF": ÅÜí ìðïñåß íá ëçöèåß ìüíïí ôéìÞ "> PIF", ôüôå êÜèå ôé ìÞ >1 ðñïëÝãåé öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá. ÅÜí äåí ìðïñïýí íá õðïëïãéóôïýí ïýôå ç EC50 (-UV) ïý ôå ç EC50 (+UV) ëüãù ôïõ üôé ç ÷çìéêÞ ïõóßá äåí äåß÷íåé êáììßá êõôôáñïôïîéêüôçôá ìÝ÷ñé ôç ìÝãéóôç óõãêÝíôñù óç äïêéìÞ, áõôü äåß÷íåé ôçí ìç ýðáñîç öùôïôïîéêÞò äõ íáôüôçôáò. Óôéò ðåñéðôþóåéò áõôÝò, ãéá ôïí ÷áñáêôçñé óìü ôïõ áðïôåëÝóìáôïò ÷ñçóéìïðïéåßôáé Ýíá ôõðéêü "PIF = *1" ÅÜí ìðïñåß íá ëçöèåß ìüíï ìéá ôéìÞ "PIF = *1", áõôü óç ìáßíåé ôç ìç ýðáñîç öùôïôïîéêÞò äõíáôüôçôáò. Óôéò ðåñéðôþóåéò (b) êáé (c), èá ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé óïâáñÜ õðüøç ïé óõãêåíôñþóåéò ðïõ ëáìâÜíïíôáé óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò ðñïêåéìÝíïõ íá ðñïâëåöèåß ç öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá 2.3.2 ÌïíôÝëï ðñüâëåøçò Ýêäïóç 2: ÌÝóç öùôïåðß äñáóç (MPE) Åíáëëáôéêþò, ìðïñåß íá åöáñìïóôåß êáé ìéá íÝá Ýêäïóç ôïõ ìïíôÝëïõ ãéá ôçí ðñüâëåøç ôçò öùôïôïîéêÞò äõíá ôüôçôáò, ðïõ Ý÷åé áíáðôõ÷èåß ÷ñçóéìïðïéþíôáò äåäïìÝ íá ôçò ìåëÝôçò åðéêýñùóçò ôùí ÅÅ/COLIPA (15) êáé äïêé ìáóôåß õðü ôõöëÝò óõíèÞêåò óå ìåôáãåíÝóôåñç ìåëÝôç ãéá ôçí in vitro öùôïôïîéêüôçôá ÷çìéêþí ößëôñùí UV (13). Ôï ìïíôÝëï áõôü õðåñðçäÜ ôïí ðåñéïñéóìü ôïõ ìïíôÝëïõ PIF óôéò ðåñéðôþóåéò ðïõ äåí ìðïñåß íá ëçöèåß ôéìÞ EC50. Ôï ìïíôÝëï ÷ñçóéìïðïéåß ôç "ìÝóç öùôïåðßäñáóç" (MPE), ìÝôñï ôï ïðïßï âáóßæåôáé óå óýãêñéóç ôùí ðëÞñùí êáìðõëþí óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò. Ãéá ôçí åöáñìïãÞ ôïõ ìïíôÝëïõ MPE, áíáðôý÷èçêå óôï Humboldt Univer sity (Berlin, D) Ýíá åéäéêü ëïãéóìéêü ðïõ ìðïñåß íá ðáñá ëçöèåß äùñåÜí. 2.4 ÅÑÌÇÍÅÉÁ ÔÙÍ ÁÐÏÔÅËÅÓÌÁÔÙÍ Èåôéêü áðïôÝëåóìá óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôï ôïîéêüôçôáò (PIF ≥ 5 Þ MPE ≥ 0.1) óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá Ý÷åé öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá. ÅÜí ôï áðïôÝëåóìá áõôü ëáìâÜíåôáé óå óõãêåíôñþóåéò êÜôù ôùí 10 µg/ml, ç õðü äïêéìÞ ïõóßá åßíáé åðßóçò ðéèáíüí íá äñá êáé ùò öù ôïôïîßíç êáé õðü ðïéêßëåò óõíèÞêåò Ýêèåóçò in vivo. ÅÜí ëçöèåß èåôéêü áðïôÝëåóìá ìüíï óôç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç äïêéìÞ ôùí 100 µg/mL, ãéá ôçí åêôßìçóç ôùí êéíäýíùí Þ ôçò öùôïôïîéêÞò éó÷ýïò ìðïñåß íá áðáéôåßôáé íá ëçöèïýí õð� üøéí êáé Üëëá óôïé÷åßá. Óå áõôÜ ìðïñåß íá ðåñéëáìâÜíïíôáé óôïé÷åßá ãéá ôç äéåßóäõóç, ôçí áðïññüöçóç êáé ðéèáíÞ óõóóþñåõóç ôçò ïõóßáò óôï äÝñìá, Þ Ýëåã÷ïò ôçò ïõóßáò óå åðéâåâáéùôéêÞ åíáëëáêôéêÞ äïêéìÞ, ð.÷. ÷ñçóéìïðïéþ íôáò ìïíôÝëï áíèñþðéíïõ äÝñìáôïò in vitro. 1892 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) Áñíçôéêü áðïôÝëåóìá áðü ôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öù ôïôïîéêüôçôáò (PIF < 5 Þ MPE < 0.1) óçìáßíåé üôé ç õðü äïêé ìÞ ïõóßá äåí åßíáé öùôïôïîéêÞ óôá êáëëéåñãçìÝíá êýôôáñá èçëáóôéêþí õðü ôéò ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò óõíèÞêåò. Óôéò ðåñé ðôþóåéò üðïõ ç ïõóßá ìðüñåóå íá äïêéìáóôåß ìÝ÷ñé ôç ìÝãé óôç óõãêÝíôñùóç ôùí 100 µg/ml, ôõ÷üí áñíçôéêü áðïôÝëå óìá óçìáßíåé üôé ç ïõóßá äåí Ý÷åé öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá, ç äå öùôïôïîéêüôçôá in vivo ìðïñåß íá èåùñçèåß ùò áðßèáíç. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ åëÞöèçóáí ôáõôüóçìåò áðïêñßóåéò óõãêÝíôñùóçò-ôïîéêüôçôáò (EC50+UV êáé EC50-UV) óå ÷áìç ëüôåñåò óõãêåíôñþóåéò, ç åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ìðïñåß íá åßíáé ç ßäéá. ÁíôéèÝôùò, áí äåí êáôáäåß÷èçêå ôïîé êüôçôá (+UV êáé -UV) áëëÜ ëüãù ìåéùìÝíçò õäáôïäéáëõôü ôçôáò ôçò ïõóßáò ïé óõãêåíôñþóåéò ðåñéïñßóôçêáí óå ôéìÝò ÷áìçëüôåñåò ôùí 100 µg/ml, ôüôå ìðïñåß íá ôåèåß åí áìöéâï ëßá ç óõìâáôüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ìå ôç äïêéìÞ êáé èá ðñÝðåé íá åîåôáóôåß ôï åíäå÷üìåíï äéåîáãùãÞò åðéâåâáéùôé êÞò äïêéìáóßáò (ð.÷., ÷ñçóéìïðïéþíôáò ìïíôÝëï äÝñìáôïò in vitro, Þ ìïíôÝëï äÝñìáôïò ex vivo or äïêéìÞ in vivo). 3 ÁÍÁÖÏÑÁ ÅÊÈÅÓÇ ÄÏÊÉÌÇÓ Ç Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõèá óôïé÷åßá: Õðü äïêéìÞ ïõóßá: óôïé÷åßá ôáõôïðïßçóçò êáé áñéè. CAS, åÜí åßíáé ãíù óôÜ öõóéêÞ ìïñöÞ êáé êáèáñüôçôá öõóéêï÷çìéêÝò éäéüôçôåò ó÷åôéêÝò ìå ôç äéåîáãùãÞ ôçò ìåëÝôçò óôáèåñüôçôá êáé öùôïóôáèåñüôçôá, åÜí åßíáé ãíù óôÝò Äéáëýôçò: áéôéïëüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ äéáëýôç äéáëõôüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôïí äéáëýôç ðïóïóôü äéáëýôç åõñéóêüìåíï óôï ìÝóï êáôåñãáóßáò (EBSS Þ PBS) Êýôôáñá: ôýðïò êáé ðçãÞ êõôôÜñùí áðïõóßá ìõêïðëÜóìáôïò áñéèìüò êõôôáñéêþí äéåëåýóåùí, áí åßíáé ãíùóôÝò åõáéóèçóßá ôùí êõôôÜñùí óå UVA, ðñïóäéïñéæüìåíç ìå ôïí åîïðëéóìü áêôéíïâüëçóçò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (a). åðþáóç ðñéí êáé ìåôÜ ôçí êáôåñ ãáóßá: ôýðïò êáé óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáëëéÝñãåéáò óõíèÞêåò åðþáóçò (óõãêÝíôñùóç CO2, èåñìïêñáóßá, õãñáóßá) äéÜñêåéá ôçò åðþáóçò (ðñïêáôåñãáóßá, ìåôáêáôåñãá óßá) ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (b). êáôåñãáóßá ìå ôçí ÷çìéêÞ ïõóßá: óêåðôéêü ôçò åðéëïãÞò ôùí óõãêåíôñþóåùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ìå êáé ÷ùñßò áêôé íïâüëçóç UV/ïñ. óå ðåñßðôùóç ðåñéïñéóìÝíçò äéáëõôüôçôáò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò êáé áðïõóßáò êõôôáñïôïîéêüôçôáò, óêåðôé êü ôçò ÷ñçóéìïðïéçèåßóáò õøçëüôåñçò óõãêÝíôñùóçò ôýðïò êáé óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáôåñãáóßáò (ñõèìéóôé êü áëáôïý÷ï äéÜëõìá) äéÜñêåéá ôçò ÷çìéêÞò êáôåñãáóßáò ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (c). áêôéíïâüëçóç: óêåðôéêü åðéëïãÞò ôçò ÷ñçóéìïðïéïýìåíçò öùôåéíÞò ðçãÞò ÷áñáêôçñéóôéêÜ öáóìáôéêÞò áíôéíïâïëßáò ôçò öùôåé íÞò ðçãÞò ÷áñáêôçñéóôéêÜ äéáöÜíåéáò / áðïññüöçóçò ôïõ Þ ôùí ÷ñçóéìïðïéïýìåíùí ößëôñùí ÷áñáêôçñéóôéêÜ ôïõ áêôéíïìÝôñïõ êáé ëåðôïìÝñåéåò äéáêñßâùóÞò ôïõ áðüóôáóç ôçò öùôåéíÞò ðçãÞò áðü ôï óýóôçìá äïêéìÞò Ýíôáóç áêôéíïâïëßáò UVA óôçí áðüóôáóç áõôÞ, åê öñáæüìåíç óå mW/cm² äéÜñêåéá Ýêèåóçò óå UV/ïñ. öùò äüóç UVA (Ýíôáóç áêôéíïâïëßáò ´ ÷ñüíïò), åêöñáæü ìåíç óå J/cm² èåñìïêñáóßá ÷ñçóéìïðïéïýìåíç óôéò êõôôáñéêÝò êáë ëéÝñãåéåò êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò áêôéíïâüëçóçò êáé óôéò ôáõôï÷ñüíùò äéáôçñïýìåíåò óôï óêïôÜäé êõôôáñéêÝò êáëëéÝñãåéåò ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (d). äïêéìÞ NRU óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ NR äéÜñêåéá åðþáóçò NR óõíèÞêåò åðþáóçò (óõãêÝíôñùóç CO2, èåñìïêñáóßá, õãñáóßá) óõíèÞêåò åê÷ýëéóçò NR (åê÷õëéóôéêü, äéÜñêåéá) ìÞêïò êýìáôïò ÷ñçóéìïðïéïýìåíï ãéá ôçí öáóìáôï öùôïìåôñéêÞ áíÜãíùóç ôçò ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò NR äåýôåñï ìÞêïò êýìáôïò (áíáöïñÜò), åöüóï ÷ñçóéìï ðïéåßôáé ðåñéå÷üìåíï ëåõêïý ôïõ öáóìáôïöùôïìÝôñïõ, åöü óïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ÁðïôåëÝóìáôá êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá ëáìâáíüìåíç óå êÜèå óõãêÝ íôñùóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, åêöñáæüìåíç óå ðïóï óôéáßá ìÝóç âéùóéìüôçôá ôùí ìáñôýñùí êáìðýëåò óõãêÝíôñùóçò - áðüêñéóçò (óõãêÝíôñùóç õðü äïêéìÞ ïõóßáò óå óõíÜñôçóç ìå ôç ó÷åôéêÞ êõôôáñé êÞ âéùóéìüôçôá), ëáìâáíüìåíåò óå ôáõôü÷ñïíá ðåéñÜìá ôá +UVA êáé -UVA áíÜëõóç äåäïìÝíùí ôùí êáìðõëþí óõãêÝíôñùóçò áðüêñéóçò: åöüóïí åßíáé äõíáôüí, åêôßìçóç / õðïëïãé óìüò ôùí EC50 (+UVA) êáé EC50 (-UVA) óýãêñéóç ôùí äýï êáìðõëþí óõãêÝíôñùóçò - áðüêñé óçò ðïõ ëáìâÜíïíôáé ìå êáé ÷ùñßò áêôéíïâüëçóç UVA/ïñ., åßôå ìå õðïëïãéóìü ôïõ óõíôåëåóôÞ öùôïåñåèé óìïý (PIF), åßôå ìå õðïëïãéóìü ôçò ìÝóçò öùôïåðßäñá óçò (MPE) ôáîéíüìçóç ôçò öùôïôïîéêÞò äõíáôüôçôáò êñéôÞñéá áðïäï÷Þò äïêéìÞò (a), ôáõôü÷ñïíôïò áñíçôé êüò ìÜñôõñáò: áðüëõôç âéùóéìüôçôá (ïðôéêÞ ðõêíüôçôá åê÷õëßóìá ôïò NR) áêôéíïâïëçìÝíùí êáé ìç êõôôÜñùí éóôïñéêÜ óôïé÷åßá áñíçôéêïý ìÜñôõñá, ìÝóç ôéìÞ êáé ôõðéêÞ áðüêëéóç êñéôÞñéá áðïäï÷Þò äïêéìÞò (b), ôáõôü÷ñïíïò èåôéêüò ìÜñôõñáò: EC50(+UVA) êáé EC50(-UVA) êáé PIF èåôéêïý ìÜñôõñá éóôïñéêÜ óôïé÷åßá èåôéêïý ìÜñôõñá: EC50(+UVA) êáé EC50(-UVA) êáé PIF, ìÝóç ôéìÞ êáé ôõðéêÞ áðüêëéóç ÓõæÞôçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùí ÓõìðåñÜóìáôá 4 ÐÁÑÁÐÏÌÐÅÓ 1. Spielmann, H., Balls, M., Doring, B., Holzhutter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., ÖÅÊ 170 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1893 Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steil ing, W. and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxicology in Vitro 8, 793-796. 2. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), Euro pean Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, 7-8. 3. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pe chovitch, G., De Silva, O., Holzhutter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Mau rer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Slad owski, D., Steiling, W and Brantom, P. (1998) EU/COLIPA "In vitro phototoxicity" validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxicol ogy in Vitro 12, 305-327. 4. OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/ TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmon isation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods - OECD Publications Office, Paris, 1996. 5. Lovell W. W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxicology in Vitro 7, 95-102. 6. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photo dynamic substances. In "Research progress in organic, bi ological and medicinal chemistry" Vol. 3 part 1. North Hol land Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV. 7. Spielmann, H., Lovell, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The re port and recommendations of ECVAM workshop 2. ATLA 22, 314-348. 8. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In "The sci ence of photobiology"; edited by KC Smith. Plenum Press, New York; 2nd edition, pp. 79-110. 9. Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985). Toxicity de termination in vitro by morphological alterations and neu tral red absorption. Toxicology Letters 24, 119-124. 10. Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996). Animal models for phototoxicity testing. In "Dermatotoxi cology"; edited by FN Marzulli and HI Maibach. Published by Taylor & Francis, Washington DC; 5th Edition, pp. 515 530. 11. Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987). Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Research 47, 1825-1829. 12. ZEBET / ECVAM / COLIPA - Standard Operating Pro cedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test. Drafted 23 De cember 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project "In Vitro Photoirritation". 13. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhutter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998). A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test. ATLA 26, 679-708. 14. Holzhótter, H.G. and Quedenau, J. (1995) Mathe matical modelling of cellular responses to external signals. Journal of Biological Systems 3, 127-138. 15. Holzhótter, H.G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chem icals. ATLA 25, 445-462. 1894 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) 1895 ÐáñÜñôçìá 3 ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ IX ÌÅÑÏÓ A ÄéáôÜîåéò ó÷åôéêÜ ìå óõóôÞìáôá áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ Åêôüò ôùí äéáôÜîåùí ôïõ Üñèñïõ 22 ðáñÜãñáöïò (1) óôïé÷åßï (å) ôçò ðáñïýóáò Ïäçãßáò, äï÷åßá êÜèå ÷ùñçôé êüôçôáò ðïõ ðåñéÝ÷ïõí ïõóßåò ðáñïõóéÜæïõóåò êéíäý íïõò åéóðíïÞò (Xn; R65) êáé ôáîéíïìçìÝíåò êáé åðéóçìá óìÝíåò óýìöùíá ìå ôçí ðáñÜãñáöï 3.2.3 ôïõ ÐáñáñôÞ ìáôïò VI ôçò ðáñïýóáò Ïäçãßáò, ìå åîáßñåóç ôéò ïõóßåò ðïõ äéáôßèåíôáé óôçí áãïñÜ õðü ìïñöÞ áåñïæüë Þ óå äï ÷åßá åöïäéáóìÝíá ìå óöñáãéóìÝíï óýíäåóìï øåêáóìïý (spray), èá ðñÝðåé íá åßíáé åöïäéáóìÝíá ìå óýóôçìáôá áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ. 1. Åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò Ôá óõóôÞìáôá áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ ðïõ ÷ñçóéìïðïé ïýíôáé óå åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò èá óõììïñöïý íôáé ìå ôçí ðñïäéáãñáöÞ ISO 8317 (Ýêäïóç 1 Éïõëßïõ 1989 ) ó÷åôéêÜ ìå "Óõóêåõáóßåò áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ ÁðáéôÞóåéò êáé ìÝèïäïé äïêéìáóßáò ãéá åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò" ðïõ èåóðßóôçêå áðü ôï ÄéåèíÞ Ïñãáíéóìü Ðñïôýðùí [International Standard Organization (ISO)]. 2. Ìç åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò ÓõóôÞìáôá áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ ðïõ ÷ñçóéìïðïéïý íôáé óå ìç åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò ðñÝðåé íá óõì ìïñöïýíôáé ìå ôçí ðñïäéáãñáöÞ CEN EN 862 (Ýêäïóç ÌÜñôéïò 1997) ó÷åôéêÜ ìå "Óõóêåõáóßåò -Óõóêåõáóßåò áóöáëåßáò ãéá ðáéäéÜ- ÁðáéôÞóåéò êáé ìÝèïäïé äïêéìá óßáò ãéá ìç åðáíáêëåéüìåíåò óõóêåõáóßåò, ãéá ìç öáñ ìáêåõôéêÜ ðñïúüíôá" ðïõ èåóðßóôçêå áðü ôçí ÅõñùðáúêÞ ÅðéôñïðÞ Ôõðïðïßçóçò (CEN). 3. ÐáñáôçñÞóåéò 1. Ç ðéóôïðïßçóç ðåñß óõììüñöùóçò ìå ôéò ðñïáíáöå ñüìåíåò ðñïäéáãñáöÝò ðñáãìáôïðïéåßôáé ìüíï áðü åñ ãáóôÞñéá ôá ïðïßá åßíáé óýìöùíá ìå ôç European Stan dards Series EN 45 000. 2. ÅéäéêÝò ðåñéðôþóåéò Áí åßíáé ðñïöáíÝò üôé ç óõóêåõáóßá åßíáé áñêåôÜ áóöá ëÞò ãéá ðáéäéÜ åöüóïí áõôÜ äåí ìðïñïýí íá öôÜóïõí óôï ðåñéå÷üìåíï ÷ùñßò ôç âïÞèåéá åñãáëåßïõ, ôüôå äåí ÷ñåé Üæåôáé åêôÝëåóç äïêéìáóßáò. Óå üëåò ôéò Üëëåò ðåñéðôþóåéò êáé üôáí õðÜñ÷ïõí áñ êåôÝò åíäåßîåéò ðåñß áìöéâüëïõ áóöáëåßáò ôïõ êëåéóßìá ôïò ãéá ðáéäéÜ, ç åèíéêÞ áñ÷Þ ìðïñåß íá æçôÞóåé áðü ôï õðåýèõíï ðñüóùðï, ðïõ äéáèÝôåé óôçí áãïñÜ ôï ðñïúüí, íá ôçò ðñïóêïìßóåé ðéóôïðïéçôéêü åñãáóôçñßïõ üðùò ðå ñéãñÜöåôáé óôï óçìåßï 3.1 óôï ïðïßï âåâáéïýôáé üôé ôï ðñïúüí åßôå: öÝñåé ôýðï êëåéóßìáôïò ðïõ äåí áðáéôåß Ýëåã÷ï ìå âÜ óç ôéò ðñïäéáãñáöÝò ISO êáé CEN ðïõ áíáöÝñïíôáé ðá ñáðÜíù, Þ öÝñåé ôýðï êëåéóßìáôïò ðïõ Ý÷åé Þäç äïêéìáóôåß êáé åõñåèåß üôé åßíáé óýìöùíï ìå ôéò ðñïáíáöåñüìåíåò ðñï äéáãñáöÝò. ÌÅÑÏÓ B ÄéáôÜîåéò ó÷åôéêÜ ìå áíÜãëõöåò ðñïåéäïðïéçôéêÝò åíäåßîåéò Ïé ôå÷íéêÝò ðñïäéáãñáöÝò ãéá áíÜãëõöåò ðñïåéäïðïé çôéêÝò åíäåßîåéò ðñÝðåé íá óõììïñöïýíôáé ìå ôçí ðñï äéáãñáöÞ EN ISO 11683 ( Ýêäïóç 1997) ó÷åôéêÜ ìå " Óõ óêåõáóßåò - ÁíÜãëõöåò åíäåßîåéò êéíäýíïõ - ÁðáéôÞóåéò ". Ï ÐÑÏÅÄÑÏÓ Ç ÃÑÁÌÌÁÔÅÁÓ ÍÉÊ. ×ÁÔÆÇ×ÑÇÓÔÉÄÇÓ ÅË. ÐÁËËÁÑÇ ÔÁ ÌÅËÇ: Í. Êáôóßìðáò, Ä. Ìðüóêïõ, Á. Åðéöáíåßïõ, Ä. ÌáíôÝëçò, Ê. ÊáøÜëçò, É. Ãáãëßáò. Ç éó÷ýò ôçò ðáñïýóáò áðüöáóçò áñ÷ßæåé áðü ôç äçìï óßåõóÞ ôçò óôçí Åöçìåñßäá ôçò ÊõâåñíÞóåùò. Ç áðüöáóç áõôÞ íá äçìïóéåõèåß óôçí Åöçìåñßäá ôçò ÊõâåñíÞóåùò. ÁèÞíá, 31 Éáíïõáñßïõ 2002 ÏÉ ÕÐÏÕÑÃÏÉ ÅÈÍÉÊÇÓ ÏÉÊÏÍÏÌÉÁÓ ÕÖÕÐÏÕÑÃÏÓ ÏÉÊÏÍÏÌÉÊÙÍ ÍÉÊÏËÁÏÓ ×ÑÉÓÔÏÄÏÕËÁÊÇÓ ÁÐÏÓÔÏËÏÓ ÖÙÔÉÁÄÇÓ 1896 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÄÅÕÔÅÑÏ) ÁÐÏ ÔÏ ÅÈÍÉÊÏ ÔÕÐÏÃÑÁÖÅÉÏ