Orden de 28 de diciembre de 1999 - Modifica el anexo del Real Decreto Nº 2.257/1994, que se aprueban los métodos oficiales de análisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias

ORDEN de 28 de diciembre de 1999 por la que se modifica el anexo del Real Decreto 2257/1994, de 25 de noviembre, por el que se aprueban los m�todos oficiales de an�lisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias. Las Directivas 92/89/CEE de 3 de noviembre; 92/95/CEE de 9 de noviembre; 94/14/CE de 29 de marzo; 93/70/CEE de 28 de julio; 93/117/CEE de 17 de diciembre, y 93/28/CEE de 4 de junio, todas de la Comisi�n, por la que se establecen diversos m�todos de an�lisis, fueron incorporadas al ordenamiento jur�dico interno mediante Real Decreto 2257/1994, de 25 de noviembre, por el que se aprueban los m�todos oficiales de an�lisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias. La disposici�n final primera del Real Decreto 2257/1994, modificada por el Real Decreto 609/1999, de 16 de abril, habilita a los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y de Sanidad y Consumo para modificar, en el �mbito de sus respectivas competencias, el anexo de dicho Real Decreto, cuando ello sea consecuencia de la normativa comunitaria. Aprobada la Directiva 1999/27/CE de la Comisi�n, de 20 de abril de 1999, por la que se fijan m�todos de an�lisis comunitarios para la determinaci�n de amprolio, diclazurilo y carbadox en los alimentos para animales y se modifican las Directivas 71/250/CEE, 73/46/CEE y se deroga la Directiva 74/203/CEE, por la que se establecen diversos m�todos de an�lisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales, es preciso proceder a su incorporaci�n, modificando en lo que es preciso los m�todos actualmente vigentes como oficiales. La presente Orden, que incorpora la citada Directiva 1999/27/CE, se dicta al amparo de lo dispuesto en el art�culo 149.1.13.� y 16.� de la Constituci�n que atribuye al Estado la competencia exclusiva en materia de bases y coordinaci�n general de la sanidad. En su elaboraci�n han sido consultadas las Comunidades Aut�nomas y los sectores afectados, asimismo, ha sido informada favorablemente por la Comisi�n Interministerial para la Ordenaci�n Alimentaria. En su virtud, a propuesta de los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y de Sanidad y Consumo, dispongo: Art�culo �nico. Modificaci�n del anexo del Real Decreto 2257/1994. Se modifica el anexo del Real Decreto 2257/1994, de 25 de noviembre, por el que se aprueban diversos m�todos oficiales de an�lisis de piensos o alimentos para Animales y sus primeras materias, de la siguiente forma: 1. Se a�aden los m�todos para la determinaci�n de amprolio, diclazurilo y carbadox que figuran en el anexo de la presente Orden. 2. Quedan derogados los m�todos n�meros: 24. Esencia de mostaza, 34(b). Almid�n (m�todo de la pancreatina), 37. Teobromina, 38. Retinol (vitamina A), 41. Menadiona (vitamina K3), 51. Amprolio, 52. Etopabato, 53. Dinitolmida y 54. Nicarbacina, que figuraban en el anexo del mencionado Real Decreto 2257/1994. Disposici�n final �nica. Entrada en vigor. La presente Orden entrar� en vigor el d�a siguiente al de su publicaci�n en el "Bolet�n Oficial del Estado". Madrid, 28 de diciembre de 1999. �LVAREZ-CASCOS FERN�NDEZ Ilmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y de Sanidad y Consumo. "ANEXO 51. Determinaci�n de amprolio Clorhidrato del cloruro de 1-[(4-amino2-propil-5-pirimidinil)-2 picolinio] 1. Finalidad y campo de aplicaci�n. El presente m�todo permite la determinaci�n del amprolio en los alimentos para animales y premezclas. El l�mite de detecci�n es de 1mg/kg ; el de determinaci�n, de 25 mg/kg. 2. Principio. La muestra se somete a extracci�n con una mezcla de agua y metanol. Tras disoluci�n con la fase m�vil y filtraci�n por membrana, se determina el contenido de amprolio por cromatograf�a de l�quidos de alta resoluci�n (CLAR) de intercambio cati�nico con detecci�n UV. 3. Reactivos. 3.1 Metanol. 3.2 Acetonitrilo de calidad CLAR. 3.3 Agua de calidad CLAR. 3.4 Soluci�n de ortofosfato monos�dico, c = 0,1 mol/l. Disolver en agua (3.3) 13,80 g de ortofosfato monos�dico monohidratado en un matraz aforado de 1.000 ml, enrasar con agua (3.3) y mezclar. 3.5 Soluci�n de perclorato s�dico c = 1,6 mol/l. Disolver en agua (3.3) 224,74 g de perclorato s�dico monohidratado en un matraz aforado de 1.000 ml, enrasar con agua (3.3) y mezclar. 3.6 Fase m�vil para la CLAR (v�ase la observaci�n 9.1). Mezcla de acetonitrilo (3.2), soluci�n de ortofosfato monos�dico (3.4) y soluci�n de perclorato s�dico (3.5), 450 + 450 + 100 (V + V + V). Antes de utilizar la soluci�n, filtrarla por un filtro de membrana de 0,22 mm (4.3) y desgasificarla [por ejemplo, en ba�o de ultrasonidos (4.4) durante al menos quince minutos]. 3.7 Sustancia patr�n: Amprolio puro, clohidrato de cloruro de 1-[(4 amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metil-piridina, E 750 (v�ase el punto 9.2). 3.7.1 Soluci�n madre de patr�n de amprolio, 500 mg/ml. Pasar, con precisi�n de 0,1 mg, 50 mg de amprolio (3.7) en un matraz aforado de 100 ml, disolver en 80 ml de metanol (3.1) y colocar el matraz durante diez minutos en un ba�o de ultrasonidos (4.4). Despu�s del tratamiento de ultrasonidos, llevar la soluci�n a temperatura ambiente, enrasar con agua y mezclar. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.7.2 Soluci�n intermedia de patr�n de amprolio, 50 mg/ml. Pasar con pipeta 5,0 ml de la soluci�n madre de patr�n (3.7.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con el disolvente de extracci�n (3.8) y mezclar. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.7.3 Soluciones de calibraci�n. Pesar 0,5, 1,0 y 2,0 ml de la soluci�n intermedia de patr�n (3.7.2) a una serie de matraces aforados de 50 ml. Enrasar con la fase m�vil (3.6) y mezclar. Estas soluciones corresponden respectivamente a 0,5, 1,0 y 2,0 mg de amprolio por ml y deben prepararse justo antes de su utilizaci�n. 3.8 Disolvente de extracci�n. Mezcla de metanol (3.1) y agua 2 + 1 (V + V). 4. Material. 4.1 Equipo para CLAR con sistema de inyecci�n, adecuado para vol�menes de inyecci�n de 100 ml. 4.1.1 Columna de cromatograf�a de l�quidos de 125 mm x 4 mm, de intercambio cati�nico, con empaquetamiento de nucleosil 10 SA de 10 mm, o equivalente. 4.1.2 Detector de UV con ajuste de longitud de onda variable o detector de red de diodos. 4.2 Filtro de membrana, material de tefl�n, 0,45 mm. 4.3 Filtro de membrana, 0,22 mm. 4.4 Ba�o de ultrasonidos. 4.5 Agitador mec�nico o magn�tico. 5. Procedimiento. 5.1 Consideraciones generales. 5.1.1 Prueba en blanco. Para la prueba de recuperaci�n (5.1.2), debe analizarse un pienso en blanco a fin de comprobar la ausencia de amprolio y de sustancias interferentes. El pienso en blanco debe ser de tipo similar a la muestra y en �l no debe detectarse amprolio ni sustancias que interfieran. 5.1.2 Prueba de recuperaci�n. Debe realizarse una prueba de recuperaci�n analizando el pienso en blanco que se habr� enriquecido por adici�n de una cantidad de amprolio similar a la presente en la muestra. Para a�adir una concentraci�n del 100 mg/kg, transferir 10,0 ml de la soluci�n madre de patr�n (3.7.1) a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y concentrar la soluci�n por evaporaci�n hasta llegar a unos 0,5 ml. A�adir 50 g del pienso en blanco mezlar cuidadosamente ; dejar en reposo durante diez minutos, volviendo a mezclar varias veces, y pasar a la fase de extracci�n (5.2). Si no se dispone de un pienso en blanco de tipo similar al de la muestra (v�ase el punto 5.1.1), otra posibilidad consiste en realizar una prueba de recuperaci�n mediante el m�todo de adici�n de patr�n. En este caso, la muestra que deben analizarse se enriquece con una cantidad de amprolio similar a la que ya est� presente en la misma. Esta muestra se analiza junto con la muestra sin enriquecer, y la recuperaci�n se calcula por sustracci�n. 5.2 Extracci�n. 5.2.1 Premezclas (contenido < 1 por 100 de amprolio) y alimentos para animales. Pesar, con precisi�n de 0,01 g, 5-40 g de la muestra, seg�n el contenido en amprolio, en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y a�adir 200 ml de disolvente de extracci�n (3.8). Poner el matraz durante quince minutos en el ba�o de ultrasonidos (4.4). Retirar el matraz del ba�o de ultrasonidos y agitarlo durante una hora con agitaci�n mec�nica (4.5). Diluir una al�cuota del extracto con la fase m�vil (3.6) hasta conseguir un contenido de amprolio de 0,5-2 mg/ml y mezclar (v�ase la observaci�n 9.3). Filtrar 5-10 ml de esta soluci�n diluida a trav�s de un filtro de membrana (4.2). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.3). 5.2.2 Premezclas (contenido >/- 1 por 100 de amprolio). Pesar, con precisi�n de 0,001 g, 1-4 g de la premezcla, seg�n el contenido en amprolio, en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y a�adir 200 ml de disolvente de extracci�n (3.8). Poner el matraz durante quince minutos en el ba�o de ultrasonidos (4.4). Retirar el matraz del ba�o de ultrasonidos y agitarlo durante una hora con agitaci�n mec�nica o magn�tica (4.5). Diluir una al�cuota del extracto con la fase m�vil (3.6) hasta conseguir un contenido de amprolio de 0,5-2 mg/ml y mezclar. Filtrar 5-10 ml de esta soluci�n diluida a trav�s de un filtro de membrana (4.2). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.3). 5.3 Determinaci�n mediante CLAR. 5.3.1 Par�metros. Las siguientes condiciones se proponen con car�cter indicativo, por lo que podr�n aplicarse otras si ofrecen resultados equivalentes. Columna de cromatograf�a de l�quidos (4.1.1): 125 mm x 4 mm, de intercambio cati�nico, con empaquetamiento de nucleosil 10 SA de 10 mm, o equivalente. Fase m�vil (3.6): Mezcla de acetonitrilo (3.2), soluci�n de ortofosfato monos�dico (3.4) y soluci�n de perclorato s�dico (3.5), 450 + 450 + 100 (V + V + V). Flujo: 0,7-1 ml/min. Longitud de onda de detecci�n: 264 nm. Volumen de inyecci�n: 100 ml. Comprobar la estabilidad del sistema cromatogr�fico inyectando varias veces la soluci�n de calibraci�n (3.7.3) con 1,0 mg/ml, hasta obtener alturas de pico y tiempos de retenci�n constantes. 5.3.2 Curva de calibraci�n. Inyectar cada soluci�n de calibraci�n (3.7.3) varias veces y determinar las alturas (�reas) medias de los picos correspondientes a cada concentraci�n. Trazar una curva de calibraci�n poniendo las alturas (�reas) media de los picos de las soluciones de calibraci�n en ordenadas y las concentraciones correspondientes en mg/ml en abscisas. 5.3.3 Soluci�n de la muestra. Inyectar varias veces el extracto de la muestra (5.2) utilizando el mismo volumen que el empleado para las soluciones de calibraci�n y determinar la altura (�rea) media de los picos de amprolio. 6. C�lculo de los resultados. A partir de la altura (�rea) media de los picos de amprolio de la soluci�n de la muestra, determinar la concentraci�n de la soluci�n de la muestra en mg/ml mediante la curva de calibraci�n (5.3.2). El contenido w de amprolio de la muestra, expresado en mg/kg, se obtiene mediante la siguiente f�rmula: (VER IMAGEN P�GINA 261) w = V - B - f / m [mg/kg] donde: V = volumen del disolvente de extracci�n (3.8) en ml de acuerdo con 5.2 (es decir ; 200 ml). B = concentraci�n de amprolio en el extracto de la muestra (5.2) en mg/ml. f = factor de diluci�n de acuerdo con 5.2. m = masa de la porci�n de muestra en g. 7. Validaci�n de los resultados. 7.1 Identidad. La identidad del analito puede confirmarse por cocromatograf�a o mediante un detector de red de diodos que permita comparar los espectros del extracto de la muestra (5.2) y de la soluci�n de calibraci�n (3.7.3) con 2,0 mg/ml. 7.1.1 Cocromatograf�a. Se enriquece un extracto de la muestra (5.2) mediante adici�n de una cantidad adecuada de la soluci�n de calibraci�n (3.7.3). La cantidad de amprolio a�adida debe ser similar a la cantidad de amprolio que se encuentre en el extracto de la muestra. Solamente debe aumentar la altura del pico de amprolio, teniendo en cuenta la cantidad a�adida y la diluci�n del extracto. La anchura del pico a la mitad de su altura debe estar dentro del margen del +/- 10 por 100 de la anchura inicial del pico de amprolio del extracto de la muestra antes de ser enriquecido. 7.1.2 Detecci�n por red de diodos. Los resultados deben evaluarse de acuerdo con los siguientes criterios: a) La longitud de onda de absorci�n m�xima de los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, debe ser la misma dentro de un margen determinado por el poder de resoluci�n del sistema de detecci�n. En el caso de la detecci�n por red de diodos se sit�a generalmente en +/- 2 nm. b) Entre 210 y 320 nm, los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, no deben ser diferentes en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los dos espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del analito patr�n. c) Entre 210 y 320 nm, los espectros de la pendiente ascendente, del v�rtice y de la pendiente descendiente del pico producido por el extracto de la muestra no deben ser diferentes entre s� en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del espectro del v�rtice del pico. La presencia del analito s�lo se considera confirmada cuando se cumplen todos estos criterios. 7.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe superar: El 15 por 100 del resultado superior en caso de contenido de amprolio entre 25 y 500 mg/kg. Los 75 mg/kg en caso de contenido de amprolio entre 500 y 1.000 mg/kg. El 7,5 por 100 del resultado superior en caso de contenido de amprolio mayor de 1.000 mg/kg. 7.3 Recuperaci�n. En el caso de una muestra enriquecida (virgen), la recuperaci�n debe ser como m�nimo del 90 por 100. 8. Resultados de un estudio colaborativo. Se organiz� un estudio en colaborativo en el que se analizaron tres piensos para aves de corral (muestras 1-3), un pienso mineral (muestra 4) y una premezcla (muestra 5). Los resultados se recogen en el siguiente cuadro: (VER IMAGEN P�GINA 262) Muestra 1 (pienso en blanco) Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 L . ... .. ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. .. 14 14 14 14 15 n . ... .. ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. .. 56 56 56 56 60 Media (mg/kg) .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. ... .. - 45,5 188 5.129 25.140 Sr (mg/kg) . ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. . 2,26 3,57 178 550 CVr (Porcentaje) . ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. - 4,95 1,90 3,46 2,20 SR (mg/kg) ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. ... .. ... .. . - 2,95 11,8 266 760 CVR (Porcentaje) . .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. - 6,47 6,27 5,19 3,00 Contenido nominal (mg/kg) .. .. ... .. ... .. ... ... - 50 200 5.000 25.000 L: n�mero de laboratorios. n: n�mero de valores individuales. Sr: desviaci�n t�pica de la repetibilidad. CVr: coeficiente de variaci�n de la repetibilidad. SR: desviaci�n t�pica de la reproducibilidad. CVR: coeficiente de variaci�n de la reproducibilidad. 9. Observaciones. 9.1 Si la muestra contiene tiamina, el pico de �sta aparece en el cromatograma precediendo de cerca al pico de amprolio. Seg�n este m�todo, el amprolio y la tiamina deben separarse. Si la columna (4.1.1) utilizada en este m�todo no separa el amprolio de la tiamina, sustituir hasta el 50 por 100 del acetonitrilo de la fase m�vil (3.6) por metanol. 9.2 De acuerdo con la British Pharmacopoeia, el espectro de una soluci�n de amprolio (c = 0,02 mol/l) de �cido clorh�drico (c = 0,1 mol/l) presenta m�ximos a 246 nm y 262 nm. La absorbancia es de 0,84 a 246 nm y de 0,80 a 262 nm. 9.3 El extracto debe estar siempre diluido con la fase m�vil ; en caso contrario, el tiempo de retenci�n del pico de amprolio puede variar significativamente debido a cambios en la fuerza i�nica. 64. Determinaci�n de diclazurilo 2, 6 dicloro-a-(4-clorofenil)-4-[4, 5-dihidro-3,5-dioxo-1,2, 4-triacina 2(3H)-il]benceno-acetonitrilo 1. Finalidad y campo de aplicaci�n. El presente m�todo permite la determinaci�n del diclazurilo en los alimentos para animales y premezclas. El l�mite de detecci�n es de 0,1 mg/kg ; el de determinaci�n, de 0,5 mg/kg. 2. Principio. Tras la adici�n de un patr�n interno, la muestra se somete a extracci�n con metanol acidificado. En caso de alimentos para animales, se purifica una al�cuota del extracto en un cartucho de extracci�n en fase s�lida de C18. El diclazurilo se eluye de un cartucho de una mezcla de metanol acidificado y agua. Previa evaporaci�n, el residuo se disuelve en DMF/agua. En caso de premezclas, el extracto se evapora y el residuo se disuelve en DMF/agua. El contenido de diclazurilo se determina mediante cromatograf�a de l�quidos de alta resoluci�n (CLAR) de fase inversa y gradiente ternario con detecci�n de UV. 3. Reactivos. 3.1 Agua de calidad CLAR. 3.2 Acetato de amonio. 3.3 Sulfato de hidr�geno y tetrabutilamonio (SHTB). 3.4 Acetonitrilo de calidad CLAR. 3.5 Metanol de calidad CLAR. 3.6 N,N-dimetilformamida (DMF). 3.7 �cido clorh�drico, R20 = 1,19 g/ml. 3.8 Sustancia patr�n diclazurilo II-24: 2,6 dicloro-a-(4-clorofenil)-4 [4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2, 4-triacina-2(3H)-il]benceno-acetonitrilo, de pureza garantizada, E 771. 3.8.1 Soluci�n madre de patr�n de diclazurilo, 500 mg/ml. Pesar, con precisi�n de 0,1 mg, 25 mg de sustancia patr�n de diclazurilo (3.8) en un matraz aforado de 50 ml, disolver y enrasar con DMF (3.6) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.8.2 Soluci�n de patr�n de diclazurilo, 50 mg/ml. Pasar 5,00 ml de la soluci�n madre de patr�n (3.8.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con DMF (3.6) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.9 Sustancia patr�n interno: 2,6 dicloro-a-(4-clorofenil)-4-[4,5 dihidro-3,5-dioxo-1,2, 4-triacina-2(3H)-il]-a-metilbenceno-acetonitrilo. 3.9.1 Soluci�n madre de patr�n interno, 500 mg/ml. Pesar, con precisi�n de 0,1 mg, 25 mg de sustancia patr�n interno (3.9) en un matraz aforado de 50 ml, disolver y enrasar con DMF (3.6) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.9.2 Soluci�n de patr�n interno, 50 mg/ml. Pasar 5,00 ml de la soluci�n madre de patr�n interno (3.9.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con DMF (3.6) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.9.3 Soluci�n de patr�n interno, para premezclas, p/1.000 mg/ml (p = contenido nominal de diclazurilo en la premezcla, expresado en mg/kg). Pesar, con precisi�n de 0,1 mg, p/10 mg de sustancia patr�n interno en un matraz aforado de 100 ml, disolver en DMF (3.6) en un ba�o de ultrasonidos (4.6) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.10 Soluciones de calibraci�n, 2 mg/ml. Pasar con pipeta 2,00 ml de la soluci�n de patr�n de diclazurilo (3.8.2) y 2,00 ml de la soluci�n de patr�n interno (3.9.2) a un matraz aforado de 50 ml. A�adir 16 ml de DMF (3.6), enrasar y mezclar. Esta soluci�n debe prepararse justo antes de su utilizaci�n. 3.11 Cartucho de extracci�n en fase s�lida C18 ; por ejemplo, Bond Elut, tama�o 1 cc, masa de sorbente: 100 mg. 3.12 Disolvente de extracci�n: Metanol acidificado. Poner con pipeta 5,0 ml de �cido clorh�drico (3.7) en 1.000 ml de metanol (3.5) y mezclar. 3.13 Fase m�vil para la CLAR. Eluyente A: Soluci�n de acetato de amonio y sulfato de hidr�geno y tetrabutilamonio. 3.13.1 Disolver 5 g de acetato de amonio (3.2) y 3,4 g de SHTB (3.3) en 1.000 ml de agua (3.1) y mezclar. 3.13.2 Eluyente B: Acetonitrilo (3.4). 3.13.3 Eluyente C: Metanol (3.5). 4. Material. 4.1 Agitador mec�nico. 4.2 Equipo para CLAR con capacidad de gradientes ternarios. 4.2.1 Columna de cromatograf�a de l�quidos, con relleno de hypersil ODS de 3 mm, de 100 mm x 4,6 mm o equivalente. 4.2.2 Detector de UV con ajuste de longitud de onda variable o detector de red de diodos. 4.3 Evaporador rotatorio de vac�o. 4.4 Filtro de membrana, 0,45 mm. 4.5 Colector de vac�o. 4.6 Ba�o de ultrasonidos. 5. Procedimiento. 5.1 Consideraciones generales. 5.1.1 Prueba en blanco. Debe analizarse un pienso en blanco a fin de comprobar la ausencia de diclazurilo y de sustancias que interfieran. El pienso en blanco debe ser de tipo similar a la muestra y en su an�lisis no debe detectarse diclazurilo ni sustancias que interfieran. 5.1.2 Prueba de recuperaci�n. Debe realizarse una prueba de recuperaci�n analizando el pienso en blanco que se habr� enriquecido por adici�n de una cantidad de diclazurilo similar a la presente en la muestra. Para a�adir una concentraci�n del 1 mg/kg, transferir 0,1 ml de la soluci�n madre del patr�n (3.8.1) con 50 g del pienso en blanco y mezclar cuidadosamente ; dejar en reposo durante diez minutos, volviendo a mezclar varias veces, y pasar a la fase de extracci�n (5.2). Si no se dispone de un pienso en blanco de tipo similar al de la muestra (v�ase el punto 5.1.1), otra posibilidad consiste en realizar una prueba de recuperaci�n mediante el m�todo de adici�n de patr�n. En este caso, la muestra que debe analizarse se enriquece con una cantidad de diclazurilo similar a la que ya est� presente en la misma. Esta muestra se analiza junto con la muestra sin enriquecer, y la recuperaci�n se calcula por sustracci�n. 5.2 Extracci�n. 5.2.1 Alimentos para animales. Pesar, con precisi�n de 0,01 g, unos 50 g de la muestra. Pasar a un matraz Erlenmeyer de 500 ml, a�adir 1,00 ml de la soluci�n de patr�n interno (3.9.2), 200 ml de disolvente de extracci�n (3.12) y tapar el matraz. Agitar la mezcla en el agitador (4.1) hasta el d�a siguiente. Dejar reposar durante diez minutos. Pasar una al�cuota de 20 ml del sobrenadante a un recipiente adecuado de vidrio y diluir con 20 ml de agua. Pasar esta soluci�n a un cartucho de extracci�n (3.11) y hacer que lo atraviese aplicando vac�o (4.5). Lavar el cartucho con 25 ml de una mezcla de disolvente de extracci�n (3.12) y agua, 65 + 35 (V + V). Desechar las fracciones recogidas y eluir los compuestos con 25 ml de una mezcla de disolvente de extracci�n (3.12) y agua 80 + 20 (V + V). Evaporar esta fracci�n hasta llegar justo a la sequedad mediante el evaporador rotatorio (4.3) a 60 �C. Disolver el residuo en 1,0 ml de DMF (3.6), a�adir 1,5 ml de agua (3.1) y mezclar. Filtrar a trav�s de un filtro de membrana (4.4). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.3). 5.2.2 Premezclas. Pesar, con precisi�n de 0,001 g, aproximadamente, 1 g de la muestra. Pasar a un matraz Erlenmeyer de 500 ml, a�adir 1,00 ml de la soluci�n de patr�n interno (3.9.3), 200 ml de disolvente de extracci�n (3.12) y tapar el matraz. Agitar la mezcla en el agitador (4.1) hasta el d�a siguiente. Dejar reposar durante diez minutos. Transferir una al�cuota de 10.000 p/ml (p = contenido nominal de diclazurilo en la premezcla, expresado en mg/kg) del sobrenadante a un matraz redondo de tama�o adecuado. Evaporar hasta llegar justo a la sequedad a presi�n reducida, a 60 �C, mediante el evaporador rotatorio (4.3). Volver a disolver el residuo en 10,0 ml de DMF (3.6), a�adir 15,0 ml de agua (3.1) y mezclar. Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.3). 5.3 Determinaci�n mediante CLAR. 5.3.1 Par�metros. Las siguientes condiciones se proponen con car�cter indicativo, por lo que podr�n aplicarse otras si ofrecen resultados equivalentes. Columna de cromatograf�a de l�quidos (4.2.1): 100 mm x 4,6 mm, con relleno de hypersil ODS de 3 mm, o equivalente Fase m�vil: Eluyente A (3.13.1): Soluci�n acuosa de acetato de amonio y sulfato de hidr�geno y tetrabutilamonio. Eluyente B (3.13.2): Acetonitrilo. Eluyente C (3.13.3): Metanol. Modo de eluci�n: Gradiente lineal. Condiciones iniciales A + B + C =60 + 20 + 20 (V + V + V). Tras diez minutos eluci�n en gradiente durante treinta minutos hasta: A + B + C =45 + 20 + 35 (V + V + V). Lavar con B durante diez minutos. Flujo: 1,5-2 ml/min. Volumen de inyecci�n: 20 ml. Longitud de onda del detector: 280 mm. Comprobar la estabilidad del sistema cromatogr�fico inyectando varias veces la soluci�n de calibraci�n (3.10) con 2 mg/ml, hasta obtener alturas de pico y tiempos de retenci�n constantes. 5.3.2 Curva de calibraci�n. Inyectar 20 ml de la soluci�n de calibraci�n (3.10) varias veces y determinar las alturas (�reas) medias de los picos correspondientes al diclazurilo y al patr�n interno. 5.3.3 Soluci�n de la muestra. Inyectar 20 ml de la soluci�n de la muestra (5.2.1 � 5.2.2) varias veces y determinar las alturas (�reas) medias de los picos correspondientes al diclazurilo y al patr�n interno. 6. C�lculo de los resultados. 6.1 Piensos. El contenido w de diclazurilo de la muestra, expresado en mg/kg, se obtiene mediante la siguiente f�rmula: (VER IMAGEN P�GINA 264) W = hd,s x hi,c / hi,s x hd,c x Bd,c . 10v / m mg/kg] donde: hd,s = altura (�rea) del pico de diclazurilo en la soluci�n de la muestra (5.2.1). hi,s = altura (�rea) del pico del patr�n interno en la soluci�n de la muestra (5.2.1). hd,c = altura (�rea) del pico de diclazurilo en la soluci�n de calibraci�n (3.10). hi,c = altura (�rea) del pico del patr�n interno en la soluci�n de calibraci�n (3.10). Bd,c = concentraci�n de diclazurilo en la soluci�n de calibraci�n en mg/ml (3.10). m = masa de la porci�n de muestra en g. V = volumen del extracto seg�n 5.2.1 (es decir, 2,5 ml). 6.2 Premezclas. El contenido w de diclazurilo de la muestra, expresado en mg/kg, se obtiene mediante la siguiente f�rmula: (VER IMAGEN P�GINA 264) W = hd,s x hi,c / hi,s x hd,c x Bd,c x 0,02v . p / m [mg/kg] donde: hd,c = altura (�rea) del pico de diclazurilo en la soluci�n de calibraci�n (3.10). hi,c = altura (�rea) del pico del patr�n interno en la soluci�n de calibraci�n (3.10). hd,s = altura (�rea) del pico de diclazurilo en la soluci�n de la muestra (5.2.2). hi,s = altura (�rea) del pico del patr�n interno en la soluci�n de la muestra (5.2.2). Bd,c = concentraci�n de diclazurilo en la soluci�n de calibraci�n (3.10). m = masa de la porci�n de muestra en g. V = volumen del extracto seg�n 5.2.2 (es decir, 25 ml). p = contenido nominal de diclazurilo en la premezcla, expresado en mg/kg. 7. Validaci�n de los resultados. 7.1 Identidad. La identidad del analito puede confirmarse por cocromatograf�a o mediante un detector de red de diodos que permita comparar los espectros del extracto de la muestra (5.2.1 � 5.2.2) y de la soluci�n de calibraci�n (3.10). 7.1.1 Cocromatograf�a. Se enriquece un extracto de la muestra (5.2.1 � 5.2.2) mediante adici�n de una cantidad adecuada de la soluci�n de calibraci�n (3.10). La cantidad de diclazurilo a�adida debe ser similar a la cantidad de diclazurilo que se encuentre en el extracto de la muestra. Solamente debe aumentar la altura de los picos de diclazurilo y de patr�n interno, teniendo en cuenta la cantidad a�adida y la diluci�n del extracto. La anchura del pico a la mitad de su altura debe estar dentro del margen del +/- 10 por 100 de la anchura inicial del pico de diclazurilo o de patr�n interno del extracto de la muestra antes de ser enriquecido. 7.1.2 Detecci�n por red de diodos. Los resultados deben evaluarse de acuerdo con los siguientes criterios: a) La longitud de onda de absorci�n m�xima de los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, debe ser la misma dentro de un margen determinado por el poder de resoluci�n del sistema de detecci�n. En el caso de la detecci�n por red de diodos se sit�a generalmente en +/- 2 nm. b) Entre 230 y 320 nm, los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, no deben ser diferentes en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los dos espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del analito patr�n. c) Entre 230 y 320 nm, los espectros de la pendiente ascendente del v�rtice y de la pendiente descendente del pico producido por el extracto de la muestra no deben ser diferentes entre s� en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del espectro del v�rtice del pico. La presencia del analito s�lo se considera confirmada cuando se cumplen todos estos criterios. 7.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe superar: El 30 por 100 del resultado superior en caso de contenido de diclazurilo entre 0,5 y 2,5 mg/kg. Los 0,75 mg/kg en caso de contenido de diclazurilo entre 2,5 y 5 mg/kg. El 15 por 100 del resultado superior en caso de contenido de diclazurilo mayor de 5 mg/kg. 7.3 Recuperaci�n. En el caso de una muestra enriquecida (virgen), la recuperaci�n debe ser como m�nimo del 80 por 100. 8. Resultados de un estudio colaborativo. Se organiz� un estudio colaborativo en el que 11 laboratorios analizaron cinco muestras. De estas muestras, dos eran premezclas: Una mezclada con una matriz org�nica (O 100) y la otra con una matriz inorg�nica (A 100). El contenido te�rico era de 100 mg de diclazurilo por kg. Las otras tras muestras eran piensos compuestos para aves de corral, elaborados por tres productores diferentes (NL) (L1/Z1/K1). El contenido te�rico era de 1 mg de diclazurilo por kg. Se dieron instrucciones a los laboratorios para que analizaran cada muestra una vez o por duplicado. (Puede encontrarse informaci�n m�s detallada de este estudio, en el "Journal of the AOAC International", volumen 77, n�mero 6, 1994, pp. 1359-1361.) Los resultados se recogen en el siguiente cuadro: (VER IMAGEN P�GINA 265) Muestra 1 A 100 Muestra 2 O 100 Muestra 3 L 1 Muestra 4 Z 1 Muestra 5 K 1 L . ... .. ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. .. 11 11 11 11 6 n . ... .. ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. .. 19 18 19 19 12 Media (mg/kg) .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. ... .. 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89 Sr (mg/kg) . ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. . 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 CVr (Porcentaje) . ... ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34 SR (mg/kg) ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. ... .. ... .. . 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 CVR (Porcentaje) . .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65 Contenido nominal (mg/kg) .. .. ... .. ... .. ... ... 100 100 1 1 1 L: n�mero de laboratorios. n: n�mero de valores individuales. Sr: desviaci�n t�pica de la repetibilidad. CVr: coeficiente de variaci�n de la repetibilidad. SR: desviaci�n t�pica de la reproducibilidad. CVR: coeficiente de variaci�n de la reproducibilidad. 9. Observaciones. Debe demostrarse previamente que la respuesta del diclazurilo es lineal a lo largo de la gama de concentraciones que se midan. 65. Determinaci�n de carbadox Metil 3-(2-quinoxalinilmetileno)carbazato N1, N4-di�xido 1. Finalidad y campo de aplicaci�n. El presente m�todo permite la determinaci�n del carbadox en los alimentos para animales, premezclas y formulaciones. El l�mite de detecci�n es de 1 mg/kg ; el de determinaci�n, de 10 mg/kg. 2. Principio. La muestra se equilibra con agua y se somete a extracci�n con metanol acetonitrilo. En caso de alimentos para animales, una parte al�cuota del extracto filtrado se purifica en una columna de �xido de aluminio. En caso de premezclas y formulaciones, una porci�n al�cuota del extracto filtrado se diluye con agua, metanol y acetonitrilo hasta una concentraci�n adecuada. El contenido de carbadox se determina mediante cromatograf�a de l�quidos de alta resoluci�n (CLAR) de fase inversa con detecci�n de UV. 3. Reactivos. 3.1 Metanol. 3.2 Acetonitrilo de calidad CLAR. 3.3 �cido ac�tico, W = 100 por 100. 3.4 �xido de aluminio neutro, de grado I de actividad. 3.5 Metanol-acetonitrilo 1 + 1 (V + V). Mezclar 500 ml de metanol (3.1) con 500 ml de acetonitrilo (3.2). 3.6 �cido ac�tico, r = 10 por 100. Diluir 10 ml de �cido ac�tico (3.3) con agua hasta llegar a 100 ml. 3.7 Acetato de sodio, CH3COONa. 3.8 Agua de calidad CLAR. 3.9 Soluci�n amortiguadora de acetato, c = = 0,01 mol/1, pH = 6,0. Disolver 0,82 g de acetato de sodio (3.7) en 700 ml de agua (3.8) y ajustar el pH a 6,0 con �cido ac�tico (3.6). Pasar a un matraz aforado de 1.000 ml, enrasar con agua (3.8) y mezclar. 3.10 Fase m�vil para la CLAR. Mezclar 825 ml de soluci�n amortiguadora de acetato (3.9) con 175 ml de acetonitrilo (3.2). Filtrar por filtro de 0,22 mm (4.5) y desgasificar la soluci�n (por ejemplo, poni�ndola en ba�o de ultrasonidos durante diez minutos). 3.11 Sustancia patr�n. Carbadox puro: Metil-3-2(2-quinoxalinilmetileno) carbazato N1, N4 di�xido, E 850. 3.11.1 Soluci�n madre de patr�n de carbadox, 100 mg/ml (v�ase el punto 5. Procedimiento). Pesar, con precisi�n de 0,1 mg, 25 mg de sustancia patr�n de carbadox (3.11) en un matraz aforado de 250 ml. Disolver con metanol-acetonitrilo (3.5) en ba�o de ultrasonidos (4.7). A continuaci�n, llevar la soluci�n a temperatura ambiente, enrasar con metanol-acetonitrilo (3.5) y mezclar. Envolver el matraz en papel de aluminio o utilizar un matraz de color �mbar y guardar en frigor�fico. A una temperatura de </- 4 �C, la soluci�n es estable durante un mes. 3.11.2 Soluciones de calibraci�n. Pasar 2,0, 5,0, 10,0 y 20,0 ml de la soluci�n de madre de patr�n (3.11.1) a una serie de matraces aforados de 100 ml. A�adir 30 ml de agua, enrasar con metanol-acetonitrilo (3.5) y mezclar. Envolver los matraces en papel de aluminio. Estas soluciones corresponden respectivamente a 2,0, 5,0, 10,0 y 20,0 mg/m de carbadox por ml y deben prepararse justo antes de su utilizaci�n. Nota: Para la determinaci�n de carbadox en alimentos para animales que contengan menos de 10 mg/kg, deben prepararse soluciones de calibraci�n con una concentraci�n inferior a 2,0 mg/ml. 3.12 Mezcla agua-[metanol-acetonitrilo] (3.5), 300 + 700 (V + V). Mezclar 300 ml de agua con 700 ml de la mezcla metanol-acetonitrilo (3.5). 4. Material. 4.1 Agitador mec�nico o magn�tico de laboratorio. 4.2 Papel de filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/A o equivalente). 4.3 Columna de vidrio (300 a 400 mm de longitud, 10 mm aproximadamente de di�metro interior)con fritado de vidrio sinterizado y llave de extracci�n. Nota: Tambi�n puede utilizarse una columna de vidrio provista de una llave de cierre o una columna de vidrio con un extremo c�nico, en esta caso, se introduce un tap�n de fibra de vidrio hasta el extremo inferior y se comprime con una varilla de vidrio. 4.4 Equipo para CLAR con sistema de inyecci�n que permita unos vol�menes de inyecci�n de 20 ml. 4.4.1 Columna de cromatograf�a de l�quidos de 300 mm x 4 mm, C18, con relleno de 10 mm, o equivalente. 4.4.2 Detector de UV con ajuste de longitud de onda variable o detector por red de diodos que funcione en la gama de 225 a 400 nm. 4.5 Filtro de membrana, 0,22 mm. 4.6 Filtro de membrana, 0,45 mm. 4.7 Ba�o de ultrasonidos. 5. Procedimiento. Nota: El carbadox es sensible a la luz. Todas las operaciones deben realizarse con luz tenue, o utilizando material de vidrio de color �mbar o envuelto en papel de aluminio. 5.1 Consideraciones generales. 5.1.1 Prueba en blanco. Para la realizaci�n de la prueba de recuperaci�n (5.1.2) debe analizarse un pienso en blanco a fin de comprobar la ausencia de carbadox y de sustancias que interfieran. El pienso en blanco debe ser de tipo similar a la muestra y en su an�lisis no debe detectarse carbadox ni sustancias que interfieran. 5.1.2 Prueba de recuperaci�n. Debe realizarse una prueba de recuperaci�n analizando el pienso en blanco (5.1.1) que se habr� enriquecido por adici�n de una cantidad de carbadox similar a la presente en la muestra. Para a�adir una concentraci�n de 50 mg/kg, poner 5,0 ml de la soluci�n madre de patr�n (3.11.1) en un matraz Erlenmeyer de 200 ml. Evaporar la soluci�n en corriente de nitr�geno hasta que queden unos 0,5 ml. A�adir 10 g del pienso en blanco, mezclar y esperar diez minutos antes de pasar a la fase de extracci�n (5.2). Si no se dispone de un pienso en blanco de tipo similar al de la muestra (v�ase el punto 5.1.1), otra posibilidad consiste en realizar una prueba de recuperaci�n mediante el m�todo de adici�n de patr�n. En este caso, la muestra se enriquece con una cantidad de carbadox similar a la que ya est� presente en la misma. Esta muestra se analiza junto con la muestra sin enriquecer, y la recuperaci�n se calcula por sustracci�n. 5.2 Extracci�n. 5.2.1 Alimentos para animales. Pesar, con precisi�n de 0,01 g, unos 10 g de la muestra. Pasar a un matraz Erlenmeyer de 200 ml, a�adir 15,0 ml de agua, mezclar y equilibrar durante cinco minutos. A�adir 35,0 ml de metanol-acetonitrilo (3.5), tapar y agitar durante treinta minutos con el agitador mec�nico o magn�tico (4.1). Filtrar la soluci�n a trav�s de un papel de filtro de fibra de vidrio (4.2). Conservar esta soluci�n para la fase de purificaci�n (5.3). 5.2.2 Premezclas (0,1-2,0 por 100). Pesar, con precisi�n de 0,001 g, aproximadamente 1 g de la muestra. Pasar a un matraz Erlenmeyer de 200 ml, a�adir 15,0 ml de agua, mezclar y equilibrar durante cinco minutos. A�adir 35,0 ml de metanol acetonitrilo (3.5), tapar y agitar durante treinta minutos con el agitador mec�nico o magn�tico (4.1). Filtrar la soluci�n a trav�s de un papel de filtro de fibra de vidrio (4.2). Pasar con pipeta una al�cuota del filtrado a un matraz aforado de 50 ml. A�adir 15,0 ml de agua, enrasar con metanol-acetonitrilo (3.5) y mezclar. La concentraci�n de carbadox en la soluci�n final debe ser de unos 10 mg/ml. Se filtra una al�cuota a trav�s del filtro de 0,45 mm (4.6). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.4). 5.2.3 Formulaciones (>2 por 100). Pesar, con precisi�n de 0,001 g, aproximadamente 0,2 g de la muestra sin triturar. Pasar a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, a�adir 45,0 ml de agua, mezclar y equilibrar durante cinco minutos. A�adir 105,0 ml de metanol-acetonitrilo (3.5), tapar y homogeneizar. Poner en el ba�o de ultrasonidos (4.7) durante quince minutos y agitar a continuaci�n durante quince minutos con el agitador mec�nico o magn�tico (4.1). Filtrar la soluci�n a trav�s de un papel de filtro de fibra de vidrio (4.2). Diluir una al�cuota del filtrado con la mezcla agua-metanol acetonitrilo (3.12) hasta conseguir una concentraci�n final de carbadox de 10-15 xg/ml (en caso de preparado al 10 por 100, el factor de diluci�n es 10). Se filtra una al�cuota a trav�s del filtro de 0,45 mm (4.6). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.4). 5.3 Purificaci�n. 5.3.1 Preparaci�n de la columna de �xido de aluminio. Pesar 4 g de �xido de aluminio (3.4) y pasarlo a la columna de vidrio (4.3). 5.3.2 Purificaci�n de la muestra. Pasar 15 ml del extracto filtrado (5.2.1) a la columna de �xido de aluminio y desechar los 2 primeros ml de elu�do. Recoger los siguientes 5 ml y filtrar una al�cuota a trav�s del filtro de 0,45 mm (4.6). Proceder a la determinaci�n mediante CLAR (5.4). 5.4 Determinaci�n mediante CLAR. 5.4.1 Par�metros. Las siguientes condiciones se proponen con car�cter indicativo, por lo que podr�n aplicarse otras si ofrecen resultados equivalentes. Columna de cromatograf�a de l�quidos (4.1.1): 300 mm x 4 mm, C18, con relleno de 10 mm, o equivalente. Fase m�vil (3.1): Mezcla de soluci�n amortiguadora de acetato (3.9) y acetonitrilo (3.2), 825 + + 175 (V + V). Flujo: 1,5-2 ml/min. Longitud de onda de detecci�n: 365 nm. Volumen de inyecci�n: 20 ml. Comprobar la estabilidad del sistema cromatogr�fico inyectando varias veces la soluci�n de calibraci�n (3.11.2) con 5,0 mg/ml, hasta obtener alturas (�reas) de pico y tiempos de retenci�n constantes. 5.4.2 Curva de calibraci�n. Inyectar cada soluci�n de calibraci�n (3.11.2) varias veces y determinar las alturas (�reas)medias de los picos correspondientes a cada concentraci�n. Trazar una curva de calibraci�n poniendo las alturas o las �reas medias de los picos de la soluciones de calibraci�n en ordenadas y las concentraciones correspondientes en mg/ml de abscisas. 5.4.3 Soluci�n de la muestra. Inyectar varias veces el extracto de la muestra [(5.3.2) en caso de alimentos para animales (5.2.2), en caso de premezclas y (5.2.3) en caso de formulaciones] y determinar las alturas (�reas) medias de los picos correspondientes al carbadox. 6. C�lculo de los resultados. A partir de la altura (�rea) media de los picos de carbadox de la soluci�n de la muestra, determinar la concentraci�n de la soluci�n de la muestra en mg/ml mediante la curva de calibraci�n (5.4.2). 6.1 Alimentos para animales. El contenido w de carbadox de la muestra, expresado en mg/kg, se obtiene mediante la siguiente f�rmula: (VER IMAGEN P�GINA 267) W = B x V1 / m [mg/kg] Donde: B = concentraci�n de carbadox en el extracto de la muestra (5.3.2) en xg/ml. V1 = volumen de extracci�n en ml (es decir, 50 ml). m = masa de la porci�n de muestra en g. 6.2 Premezclas y formulaciones. El contenido w de carbadox de la muestra, expresado en mg/kg, se obtiene mediante la siguiente f�rmula: (VER IMAGEN P�GINA 267) W = B x V2 x f / m [mg/kg] Donde: B = concentraci�n de carbadox en el extracto de la muestra (5.2.2 � 5.2.3) en mg/ml. V2 = volumen de extracci�n en ml (es decir, 50 ml en caso de premezclas y 150 ml en caso de preparados). f = factor de diluci�n seg�n 5.2.2 (premezclas) o 5.2.3 (preparados). m = masa de la porci�n de muestra en g. 7. Validaci�n de los resultados. 7.1 Identidad. La identidad del analito puede confirmarse por cocromatograf�a o mediante un detector de red de diodos que permita comparar los espectros del extracto de la muestra y de la soluci�n de calibraci�n (3.11.2) con 10 mg/ml. 7.1.1 Cocromatograf�a. Se enriquece un extracto de la muestra mediante adici�n de una cantidad adecuada de la soluci�n de calibraci�n (3.11.2). La cantidad de carbadox a�adida debe ser similar a la cantidad calculada de carbadox que se encuentre en el extracto de la muestra. Solamente debe aumentar la altura del pico de carbadox teniendo en cuenta la cantidad a�adida y la diluci�n del extracto. La anchura del pico a la mitad de su altura m�xima debe estar dentro del margen del +/- 10 por 100 de la anchura inicial. 7.1.2 Detecci�n por red de diodos. Los resultados deben evaluarse de acuerdo con los siguientes criterios: a) La longitud de onda de absorci�n m�xima de los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, debe ser la misma dentro de un margen determinado por el poder de resoluci�n del sistema de detecci�n. En el caso de la detecci�n por red de diodos se sit�a generalmente en +/- 2 nm. b) Entre 225 y 400 nm, los espectros de la muestra y del patr�n, registrados en el v�rtice del pico del cromatograma, no deben ser diferentes en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los dos espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del analito patr�n. c) Entre 225 y 400 nm, los espectros de la pendiente ascendente del v�rtice y de la pendiente descendiente del pico producido por el extracto de la muestra no deben ser diferentes entre s� en las partes del espectro situadas entre el 10 por 100 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando est�n presentes los mismos m�ximos y la desviaci�n entre los espectros no supera en ning�n punto observado el 15 por 100 de la absorbancia del espector del v�rtice del pico. La presencia del analito s�lo se considera confirmada cuando se cumplen todos estos criterios. 7.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe superar el 15 por 100 del resultado superior en caso de contenido superior o igual a 10 mg/kg. 7.3 Recuperaci�n. En el caso de una muestra (en blanco) enriquecida, la recuperaci�n debe ser como m�nimo del 90 por 100. 8. Resultados de un estudio colaborativo. Se organiz� un estudio en colaborativo en el que ocho laboratorios analizaron alimentos para animales, cuatro premezclas y tres preparados. De cada muestra se hicieron an�lisis por duplicado. (Puede encontrarse informaci�n m�s detallada de este estudio en el "Journal of the AOAC International", volumen 71, 1998, pp. 484-490.) Los resultados (salvo los valores aberrantes) se recogen en los siguientes cuadros: Cuadro 1. Resultados del estudio colaborativo respecto a los alimentos para animales (VER IMAGEN P�GINA 268) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 L ... .. ... .. ... .. ... .. ... ... .. ... .. .. 8 8 8 8 8 8 n .. .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. ... .. 15 14 15 15 15 15 Media (mg/kg) .. ... ... .. ... .. ... 50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7 Sr (mg/kg) . ... .. ... .. ... ... .. ... . 2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12 CVr (Porcentaje) .. .. ... .. ... .. ... 5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3 SR (mg/kg) .. .. ... .. ... .. ... .. ... . 3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44 CVR (Porcentaje) . .. ... .. ... .. ... 7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9 Contenido nominal (mg/kg). 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 Cuadro 2. Resultados del estudio colaborativo respecto a las premezclas y formulaciones (VER IMAGEN P�GINA 268) Premezclas Preparados A B C D A B C L ... .. ... .. ... .. ... ... .. .. 7 7 7 7 8 8 8 n ... .. ... .. ... .. ... ... .. .. 14 14 14 14 16 16 16 Media (mg/kg) . ... .. ... 8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104 Sr (mg/kg) ... .. ... .. ... . 0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7 CVr (Porcentaje) ... .. ... 4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4 SR (mg/kg) .. .. ... .. ... . 0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7 CVR (Porcentaje) .. ... .. 4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4 Contenido nominal (mg/kg) . ... .. ... 100 100 100 100 100 100 100 L: n�mero de laboratorios. n: n�mero de valores individuales. Sr: desviaci�n t�pica de la repetibilidad. CVr: coeficiente de variaci�n de la repetibilidad. SR: desviaci�n t�pica de la reproducibilidad. CVR: coeficiente de variaci�n de la reproducibilidad."