Regulation on detection, prevention of spread and control of the harmful organism Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al causing brown rot of potato tubers and bacterial wilting of potatoes and tomatoes

6 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. 2) Милосав Кљакић, 3) Милојка Сетенчић. 2. Ово рјешење ступа на снагу наредног дана од дана објављивања у “Службеном гласнику Републике Српске”. Број: 04/1-012-2-2090/17 Предсједница 17. августа 2017. године Владе, Бања Лука Жељка Цвијановић, с.р. На основу члана 43. став 6. Закона о Влади Републи ке Српске (“Службени гласник Републике Српске”, број 118/08) и члана 53. став 1. тачка a) Закона о државним слу жбеницима (“Службени гласник Републике Српске”, бр. 118/08 и 117/11), Влада Републике Српске, на 138. сједни ци, одржаној 17.8.2017. године, д о н o с и Р Ј ЕШЕЊЕ О РАЗРЈЕШЕЊУ ВРШИОЦА ДУЖНОСТИ ПОМОЋНИКА МИНИСТРА ЗА РЕСОР ЗА БУЏЕТ И ЈАВНЕ ФИНАНСИЈЕ У МИНИСТАРСТВУ ФИНАНСИЈА РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ 1. Светлана Радовановић, дипломирани економиста, разрјешава се вршиоца дужности помоћника министра за Ресор за буџет и јавне финансије у Министарству финан сијa због истека времена на које је постављена. 2. Ово рјешење ступа на снагу наредног дана од дана објављивања у “Службеном гласнику Републике Српске”. Број: 04/1-012-2-2066/17 Предсједница 17. августа 2017. године Владе, Бањалука Жељка Цвијановић, с.р. На основу члана 15. став 1. тачка з) и члана 43. став 6. Закона о Влади Републике Српске (“Службени гласник Републике Српске”, број 118/08) и чл. 25. и 42. Закона о државним службеницима (“Службени гласник Републике Српске”, бр. 118/08 и 117/11), Влада Републике Српске, на 138. сједници, одржаној 17.8.2017. године, д о н o с и Р Ј ЕШЕЊЕ О ПОСТАВЉЕЊУ ВРШИОЦА ДУЖНОСТИ ПОМОЋНИКА МИНИСТРА ЗА РЕСОР ЗА БУЏЕТ И ЈАВНЕ ФИНАНСИЈЕ У МИНИСТАРСТВУ ФИНАНСИЈА РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ 1. Светлана Радовановић, дипломирани економиста, поставља се за вршиоца дужности помоћника министра за Ресор за буџет и јавне финансије у Министарству финан сија Републике Српске на период до 90 дана. 2. Ово рјешење ступа на снагу наредног дана од дана објављивања у “Службеном гласнику Републике Српске”. Број: 04/1-012-2-2065/17 Предсједница 17. августа 2017. године Владе, Бањалука Жељка Цвијановић, с.р. 1482 На основу члана 36, а у вези са чланом 43. Закона о заштити здравља биља у Републици Српској (“Службени гласник Републике Српске”, број 25/09), и члана 82. став 2. Закона о републичкој управи (“Службени гласник Репу блике Српске”, бр. 118/08, 11/09, 74/10, 86/10, 24/12, 121/12, 15/16 и 57/16), министар пољопривреде, шумарства и во допривредe д о н о с и ПРАВИЛНИК О ОТКРИВАЊУ, СПРЕЧАВАЊУ ШИРЕЊА И СУЗБИЈАЊА ШТЕТНОГ ОРГАНИЗМА Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., ПРОУЗРОКОВАЧА СМЕЂЕ ТРУЛЕЖИ КРТОЛА КРОМПИРА И БАКТЕРИЈСКОГ УВЕНУЋА КРОМПИРА И ПАРАДАЈЗА Члан 1. Овим правилником прописују се мјере откривања, спре чавања ширења и сузбијања штетног организма Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., проузроковача смеђе трулежи кртола кромпира и бактеријског увенућа кромпира и парадајза, начин одређивања граница зараженог и угро женог подручја и подручја без штетног организма, услови за окончање наложених мјера, као и начин обавјештавања о предузетим мјерама и престанак мјера. Члан 2. (1) Ради откривања појаве штетног организма Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., проузроковача смеђе трулежи кртола кромпира и бактеријског увенућа кромпира и парадајза (у даљем тексту: штетни организам) спроводе се прегледи биљака и кртола кромпира (Solanum tuberosum L.) и прегледи биљака парадајза (Lycopersicon esculentum Mill.), осим сјемена и плодова парадајза (у даљем тексту: главне биљке домаћини), као и прегледи прописаних обје ката. (2) Ради откривања других могућих извора заразе који могу угрозити производњу главних биљака домаћина, врши се процјена опасности од ширења штетног организма. Ако се анализом ризика утврди опасност од ширења штетног организма у производним подручјима главних биљака до маћина спроводе се мјере откривања штетног организма, и то прегледом: 1) на другим биљкама домаћинима, укључујући само никле биљке из фамилије Solаnaceae, 2) површинских вода које се користе за наводњавање или прскање главних биљака домаћина, 3) течног отпада који настаје у индустријској преради или у погонима за паковање главних биљака домаћина и користи се за наводњавање или прскање главних биљака домаћина, 4) супстрата који се користи за раст биљака, земљишта и чврстих отпадака који настају у индустријској преради или у погонима за паковање главних биљака домаћина. Члан 3. (1) При визуелном прегледу биљака кромпира у пољу, у одговарајућем периоду у току вегетације, врши се преглед на присуство штетног организма, узимају се узорци биљака кромпира и достављају овлашћеној фитосанитарној лабо раторији (у даљем тексту: лабораторија), ради лаборато ријског испитивања. (2) При визуелном прегледу кртола кромпира из лото ва у складиштима и дистрибутивним центрима, врши се преглед кртола сјеменског кромпира и кромпира који није намијењен садњи (у даљем тексту: меркантилни кромпир), као и визуелни преглед кртола које су сјечене, а чији узор ци се достављају лабораторији ради лабораторијског испи тивања. Сјеменски кромпир мора да потиче од материјала који испуњава услове здравствене исправности и за који је лабораторијским испитивањем утврђено да није заражен штетним организмом. (3) При визуелном прегледу парадајза у одговарајућем периоду током вегетације врши се преглед расада на при суство штетног организма који је намијењен тржишној производњи. (4) Када се прегледи врше на другим биљкама домаћи нима, у површинским водама, укључујући течни отпад и у осталом материјалу, посебно супстратима, земљишту и чврстим отпацима индустријских постројења за прераду и паковање, узимају се узорци и достављају лабораторији ради лабораторијског испитивања. (5) Лабораторијско испитивање из ст. 1, 2. и 4. овог члана спроводи се на начин описан у Прилогу - Шема те стирања за дијагностику, детекцију и идентификацију про узроковача смеђе трулежи кртола кромпира и бактеријског увенућа кромпира и парадајза, који чини саставни дио овог правилника. Члан 4. (1) Сумња на појаву штетног организма постоји ако су визуелним прегледом уочени типични симптоми болести 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 7 или је резултат једног од брзих тестова провјере (screening test) позитиван. (2) Да би се потврдила или отклонила сумња на појаву штетног организма, спроводе се даља лабораторијска испи тивања на начин описан у Прилогу. (3) При лабораторијском испитивању, на одговарајући начин, чувају се узорковане кртоле и када је то могуће узор коване биљке, преостали екстракт и додатно припремљен материјал за брзе тестове провjере (screening test), нпр. ста калца за имунофлуоресценцију и пратећа документација. (4) Сачувани узорак кртоле обезбјеђује тестирање сорт ности, када је то потребно. (5) Ако је лабораторијским испитивањем потврђено присуство штетног организма, на одговарајући начин, чу вају се материјал из става 3. овог члана, узорак вјештачки заражених тест биљака парадајза и патлиџана, као и изо лована култура штетног организма најмање мјесец дана од дана потврђене заразе. Члан 5. (1) У случају сумње на појаву штетног организма, по ред мјера из чл. 2. и 3. овог правилника, спроводе се сље деће мјере: 1) забрана премјештања биљака парадајза, као и биљака и кртола кромпира из свих усјева, лотова или пошиљака из којих су узети узорци, 2) предузимање потребних радњи ради откривања изво ра заразе штетним организмом, 3) додатне превентивне мјере ради спречавања ширења штетног организма, у зависности од процијењеног степена ризика. (2) Мјере из става 1. тачка 3) овог члана примјењују се нарочито у случају производње главних биљака домаћина и премјештања свих осталих кртола или биљака повезаних са сумњивом појавом, унутар и ван објеката, ограничавање употребе потенцијално контаминираних машина и опреме. Члан 6. У случају сумње на заразу штетним организмом, када постоји опасност од преношења заразе са главних биљака домаћина или површинским водама у другу државу, Ми нистарство пољопривреде, шумарства и водопривреде о томе обавјештава надлежне органе. Члан 7. Када се на основу резултата лабораторијских испитива ња, спроведених на начин описан у Прилогу, потврди при суство штетног организма, границе зараженог и угроженог подручја или подручја без штетног организма одређују се тако што се: 1) утврђује обим једног или више примарних извора заразе, 2) означавају као заражене главне биљке домаћини, по шиљке или лотови из којих је узет узорак, машине, опрема, превозна средства, складишта или њихови дијелови и сви други објекти и предмети, укључујући материјал за пако вање, који су били у контакту са главним биљкама домаћи нима који су означени као заражени, мјеста производње, поља, заштићене просторе намијењене производњи биља, било да је узорак узет у току вегетације или након вађења или бербе главних биљака домаћина, 3) одређује обим могуће заразе на основу података о свим контактима у производном процесу са извором заразе (прије и послије вађења или скупљања биљака), 4) разграничава заражено, угрожено и подручје без штетног организма, и то на основу означене и потврђене заразе, обима могуће заразе, као и могућег ширења штет ног организма. Члан 8. (1) Обим примарних извора заразе главних биљака до маћина из члана 7. тачка 1) овог правилника утврђује се у зависности од: 1) мјеста производње, на којем се: 1. производи или је био произведен кромпир, који је клонски сродан са кромпиром на којем је потврђена зараза штетним организмом, 2. производи или је био произведен парадајз, који по тиче из истог извора као и парадајз на коме је потврђена зараза штетним организмом, 3. производе или су били произведени кромпир или па радајз, који су под надзором фитосанитарног инспектора због сумње на заразу штетним организмом, 4. производи или је био произведен кромпир који је клонски сродан с кромпиром произведеним на мјесту про изводње гдје је потврђена зараза штетним организмом, 5. производе кромпир или парадајз, а који се налазе у близини заражених мјеста производње, укључујући и она мјеста производње на којима се користе иста опрема за производњу и објекти, 6. користе површинске воде за наводњавање или пр скање из извора за који се сумња на заразу или је потврђена да је заражен штетним организмом, 7. користе површинске воде за наводњавање или пр скање из истог извора који се користи и на мјестима про изводње на којима је потврђена зараза или постоји сумња на заразу штетним организмом, 8. производе главне биљке домаћини, а које су попла вљене или су биле поплављенe површинским водама у којима је потврђена зараза или постоји сумња на заразу штетним организмом; 2) површинских вода које се користе за наводњавање, прскање или су поплавиле поља или мјеста производње на којима је потврђена зараза штетним организмом. (2) При утврђивању обима примарних извора зара зе главних биљака домаћина спроводи се лабораторијско испитивање свих партија сјеменског кромпира који је клон ски сродан са зараженим кромпиром, на начин описан у Прилогу. Члан 9. Обим могуће заразе из члана 7. тачка 3) овог правилни ка одређује на основу података о: 1) главним биљкама домаћинима гајеним на мјесту про изводње које је означено као заражено, 2) другим мјестима производње која су у било каквој вези са производњом главних биљака домаћина које су означене као заражене, као и заједнички коришћене опреме и објеката, 3) главним биљкама домаћинима произведеним на мје стима производње из тачке 2) овог члана или су се нала зиле на тим мјестима производње истовремено са главним биљкама домаћинима које су означене као заражене или су се налазиле на мјестима производње која су означена као заражена, 4) простору и објектима на којима се налазе или до рађују главне биљке домаћини које потичу са мјеста про изводње из т. 1, 2. и 3. овог члана, 5) машинама, превозним средствима, складиштима или њиховим дијеловима и другим прописаним објектима или предметима, укључујући и материјал за паковање, који су могли да дођу у контакт са главним биљкама домаћинима које су означене као заражене, 6) главним биљкама домаћинима које су биле ускла диштене или у додиру са неким од прописаних објека та или предметима из тачке 5) овог члана прије њиховог чишћења и дезинфекције, 7) биљкама парадајза које потичу из истих извора као и парадајз који је означен као заражен, односно кртола или биљака кромпира које су клонски повезане са кртолама, односно биљкама кромпира које су означене као зараже не и који се, и ако су резултати лабораторијских испити вања негативни, сматрају могуће зараженим због клонске сродности са кромпиром означеним као зараженим. Када 8 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. је потребно, може да се спроведе и тест сортности да би се провјерио идентитет заражених и клонски сродних кртола или биљака кромпира, 8) мјестима производње главних биљака домаћина на ведених у тачки 7) овог члана, 9) мјестима производње главних биљака домаћина на којима се за наводњавање или прскање употребљава вода која је означена као заражена, 10) главним биљкама домаћинима произведеним на пољима која су била поплављена површинском водом за коју је утврђено да је заражена штетним организмом. Члан 10. Обим могућег ширења штетног организма из члана 7. тачка 4) овог правилника одређује се на основу података о: 1) близини других мјеста производње главних биљака домаћина, 2) заједничкој производњи и заједничкој употреби зали ха сјеменског кромпира, 3) мјесту производње на којем се употребљава повр шинска вода за наводњавање или прскање главних биљака домаћина, на којима постоји или је постојала могућност површинског дотицања воде са мјеста производње која су означена као заражена или могућност поплављивања водом са мјеста производње која су означена као заражена. Члан 11. Када се на основу резултата лабораторијских испити вања, спроведених на начин описан у Прилогу, потврди присуство штетног организма у усјеву других биљака до маћина у подручјима гдје је угрожена производња главних биљака домаћина одређују се границе зараженог и угроже ног подручја и подручја без штетног организма, тако што се: 1) утврђује обим примарних извора заразе главних биљака домаћина, у складу са чланом 8. овог правилника, 2) означавају као заражене биљке домаћини из којих је узет узорак, 3) одређује обим могуће заразе и разграничава зараже но и угрожено подручје у складу са чл. 9. и 10. овог пра вилника. Члан 12. (1) Када се на основу резултата лабораторијских испи тивања, спроведених на начин описан у Прилогу, потврди присуство штетног организма у површинској води (укљу чујући и течни отпад који настаје у индустријској преради главних биљака домаћина или у погонима за њихово пако вање) или у самониклим биљкама из фамилије Solanaceae које у њој расту, а производња главних биљака домаћина је угрожена због коришћења те воде за наводњавање, пр скање или због поплављивања, одређују се границе зара женог, угроженог и подручја без штетног организма, тако што се: 1) означава као заражена површинска вода из које је узет узорак и 2) одређује обим могуће заразе и разграничава посебно регулисано подручје на основу означене заразе и могуће ширење штетног организма. (2) Обим могућег ширења штетног организма у повр шинској води из става 1. тачка 2) овог члана одређује се на основу података о: 1) близини мјеста производње главних биљака домаћи на која су угрожена плављењем или се граниче са површин ском водом која је означена као заражена, 2) сваком засебном подручју наводњавања које је у вези с површинском водом која је означена као заражена и 3) воденим токовима повезаним са површинском водом која је означена као заражена, узимајући у обзир смјер и брзину тока воде означене као заражене и присутност само никлих биљака домаћина из фамилије Solanaceae. Члан 13. (1) Главне биљке домаћини које су означене као зараже не не користе се за садњу. (2) Када су главне биљке домаћини из става 1. овог чла на означене као заражене, спроводе се сљедеће мјере: 1) уништавање, односно спаљивање или 2) одлагање на службено одобрено мјесто за одлагање отпада, за које је утврђено да не постоји опасност од ши рења штетног организма или 3) употребљавање тих биљака као хране за живо тиње након одговарајуће топлотне обраде, која не оста вља никакву могућност преживљавања штетног органи зма или 4) коришћење тих биљака за индустријску прераду, под условом да се директно допреме до мјеста прераде које има опрему за одлагање отпада, чиме је отклоњена опасност од ширења штетног организма и ако је обезбијеђено чишћење и дезинфекција превозних средстава која напуштају мјесто прераде или 5) друге мјере, под условом да нема опасности од ши рења штетног организма. Члан 14. (1) Главне биљке домаћини које се сматрају могуће зараженим штетним организмом, главне биљке домаћини гајене на мјестима производње која се сматрају могуће за раженима, као и кртоле или биљке кромпира које су клон ски повезане са онима које су означене као заражене без обзира на резултате лабораторијских испитивања не смију се користити за садњу. (2) Кртоле кромпира из става 1. овог члана могу се: 1) употријебити као меркантилни кромпир намијењен за исхрану, који се мора паковати на мјестима са одгова рајућом опремом за одлагање отпада, и који је спреман за непосредну доставу и употребу без накнадног препаки вања, а са сјеменским кромпиром дозвољено је да се рукује на тим истим мјестима само ако се ради одвојено или након чишћења и дезинфекције, 2) употријебити као меркантилни кромпир намијењен индустријској преради, под условом да се директно допре ме до мјеста прераде које има опрему за одлагање отпада, чиме је отклоњена опасност од ширења штетног органи зма, и ако је обезбијеђено чишћење и дезинфекција прево зних средстава која напуштају мјесто прераде и 3) употријебити или одложити на други одобрени на чин, под условом да нема опасности од ширења штетног организма. (3) Остали дијелови главних биљака домаћина, укљу чујући и остатке стабљика и лишћа, могу се уништити или употријебити или одложити на други одобрени на чин, под условом да нема опасности од ширења штетног организма. Члан 15. (1) Ради спречавања ширења штетног организма отпа дом који је настао као резултат спровођења мјера из чл. 13. и 14. овог правилника и отпада који настаје током руко вања, одстрањивања и прераде заражених партија, спрово де се сљедеће мјере: 1) отпаци кромпира и парадајза (укључујући одбачени кромпир, кору и парадајз) и сви други чврсти отпаци који су у вези са кромпиром и парадајзом (укључујући земљу, камење и друге остатке) морају да се: 1. одлажу на службено одобреном мјесту, на којем не постоји опасност од неконтролисаног ширења штетног организма у околину (нпр. испирањем кроз поре земље до пољопривредног земљишта или дотицајем са водом која би могла да се употријеби за наводњавање пољопривредног земљишта). Отпаци се превозе директно до одређеног мје ста, у затвореном превозном средству, тако да не постоји опасност од губитка отпада, 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 9 2. спаљују, 3. одстране примјеном других мјера за које је утврђено да не постоји опасност од ширења штетног организма; 2) течни отпад настао у преради који садржи чврсте честице, прије уклањања се филтрира или обрађује по ступком седиментације ради одстрањивања чврстих чес тица, које се након тога уклањају на начин из тачке 1) овог става. (2) Течни дио отпада из става 1. тачка 2) овог члана тре тира се на сљедећи начин: 1) прије одстрањивања загријава се на температури од најмање 60 °C у трајању најмање 30 минута или 2) одстрањује се на начин који онемогућава да отпа ци дођу на било који начин у додир са пољопривредним земљиштем или водом која се може употријебити за на водњавање пољопривредног земљишта. Члан 16. (1) Машине, превозна средства, складишта и њихови дијелови, други објекти и предмети, укључујући и мате ријал за паковање, који су означени као заражени или се сматрају могуће зараженим, морају да се очисте и дезин фикују примјеном одговарајућих поступака за чишћење и дезинфекцију којима се отклања опасност од ширења штет ног организма. (2) У случају када материјал за паковање из става 1. овог члана није могуће очистити и дезинфиковати тако да се отклони опасност од ширења штетног организма, нала же се његово уништавање. Члан 17. (1) На пољу намијењеном за производњу главних биљака домаћина, које је означено као заражено за врије ме од најмање четири вегетационе године послије године у којој је утврђена зараза, налаже се спровођење сљедећих мјера: 1) уклањање самониклих биљака кромпира и парадајза, као и других самониклих биљака домаћина штетног орга низма, укључујући корове из породице Solanaceae, и 2) забрана садње кртола или биљака кромпира, као и сјетве сјемена кромпира у ботаничком смислу, садње биља ка парадајза и сјетве сјемена парадајза, садње или сјетве других биљака домаћина, садње или сјетве биљних врста из рода Brassica за које је утврђено да омогућавају прежи вљавање штетног организма и садње или сјетве биљака за које је утврђено да омогућавају ширење штетног органи зма. (2) У првој сезони производње кромпира или парадај за која слиједи послије периода из става 1. овог члана, под условом да на пољу најмање двије посљедње вегетационе године током спровођења прегледа нису пронађене самони кле биљке кромпира и парадајза, као и друге биљке домаћи ни, укључујући корове из породице Solanaceae, у случају производње кромпира, допушта се производња искључиво меркантилног кромпира и спроводи лабораторијско испи тивање кртола приликом вађења. (3) У сезони производње кромпира или парадајза која слиједи послије сезоне из става 2. овог члана дозволиће се, уз одговарајући плодоред, који мора бити најмање двого дишњи за производњу сјеменског кромпира, производња сјеменског или меркантилног кромпира, као и биљака па радајза, уз спровођење прегледа. (4) У току пет вегетационих година послије године у којој је зараза утврђена, спроводе се сљедеће мјере: 1) уклањање самониклих биљака кромпира и парадајза, као и других биљака домаћина штетног организма, укљу чујући корове из фамилије Solanaceae, и 2) у прве три године, одржавање поља на угару или као трајни пашњак са интензивном испашом или честом ниском косидбом или се сију житарице или се користи за производњу сјеменских трава. У сљедеће двије узастопне године допуштена је производња биљака које нису домаћи ни штетног организма и за које је познато да не омогућавају преживљавање или ширење штетног организма. (5) Послије спровођења мјера из става 1. тачка 2) овог члана, у сљедећој вегетационој години дозволиће се про изводња сјеменског или меркантилног кромпира или пара дајза, уз лабораторијско испитивање извађених биљака и кртола, ако на пољу које је означено као заражено у току спровођења прегледа нису пронађене самоникле биљ ке кромпира и парадајза, као и других биљака домаћина, укључујући корове из фамилије Solanaceae, најмање двије узастопне вегетационе године. Члан 18. (1) На осталим пољима унутар мјеста производње које је означено као заражено у вегетационој години која слиједи послије године у којој је утврђена зараза, под условом да је утврђено да је отклоњена опасност од самониклих биљака кромпира и парадајза, као и других биљака домаћина штет ног организма, укључујући корове из фамилије Solanaceae, не дозвољава се садња кртола и биљака кромпира, сjетва сjемена кромпира у ботаничком смислу, као и сjетва и садња других биљака домаћина штетног организма. (2) Ако је прије садње утврђено да је отклоњена опа сност од самониклих биљака домаћина штетног организма, може се дозволити садња сертификованог сјеменског кром пира намијењеног искључиво производњи меркантилног кромпира, односно садња биљака парадајза произведених из сјемена које испуњава услове здравствене исправности. Током вегетације мора се спроводити надзор, као и лабо раторијско испитивање извађених биљака и кртола на при суство штетног организма на начин описан у Прилогу. (3) У другој и трећој вегетационој години која слиједи послије године у којој је зараза утврђена, послије спро вођења мјера из ст. 1. и 2. овог члана, дозвољава се садња искључиво сертификованог сјеменског кромпира за сје менску или меркантилну производњу, односно садња само оних биљака парадајза које су произведене из сјемена које испуњава услове здравствене исправности, или из биљака добијених вегетативним размножавањем биљака парадајза произведених из таквог сјемена и произведених под струч ним надзором на мјестима производње која нису означена као заражена, за производњу расада или плодова. (4) Поред мјера из ст. 1, 2. и 3. овог члана, на осталим пољима унутар мјеста производње које је означено као заражено најмање три вегетационе године спроводи се уклањање самониклих биљака главног домаћина и других биљака домаћина штетног организма и преглед усјева то ком производње, у одговарајућим временским периодима, свих поља на којима се гаји кромпир, као и лабораторијско испитивање извађених биљака и кртола са сваког поља. Члан 19. (1) На мјестима производње која су означена као за ражена послије утврђивања заразе штетним организмом произвођач мора очистити и дезинфиковати све машине, опрему и складишне просторе који су коришћени за про изводњу кромпира или парадајза, како у првој години када је дозвољена производња кромпира и парадајза тако и у свакој наредној производној години. (2) Када је то потребно ради спречавања ширења штет ног организма на мјестима производње која су означена као заражена није дозвољено наводњавање и прскање. Члан 20. (1) У заштићеном простору који је означен као заражен, а намијењен је за производњу биља, није дозвољена садња кртола или биљака кромпира и сјетва сјемена кромпира у ботаничком смислу, као ни сјетва и садња других биљака домаћина штетног организма, укључујући и биљке и сјеме парадајза, све док се у том заштићеном простору не спро веду мјере уништавања штетног организма и не уклоне све биљке домаћини и њихови дијелови, при чему се, као минимална мјера, обавезно спроводи потпуна замјена суп страта за гајење, као и чишћење и дезинфекција тог зашти ћеног простора и цјелокупне опреме. 10 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. (2) Послије спровођења мјера из става 1. овог члана може се одобрити производња кромпира и парадајза, и то: 1) производња кромпира из сертификованог сјеменског кромпира произведеног под стручним надзором или мини кртола или микро-биљака добијених из културе биљног ткива које потичу из тестираних извора и 2) производња парадајза из сјемена које испуњава усло ве здравствене исправности или из биљака добијених веге тативним размножавањем биљака парадајза произведених из таквог сјемена под стручним надзором. (3) Када је то потребно ради спречавања ширења штет ног организма на мјестима производње која су означена као заражена, није дозвољено наводњавање и прскање. Члан 21. (1) Ради праћења здравственог стања главних биља ка домаћина, биљних производа и прописаних објеката у посебно регулисаном подручју и обезбјеђивања услова за престанак наложених мјера у току најмање три вегетационе године које слиједе послије оне у којој је зараза утврђена: 1) врши се надзор мјеста на којима се производе, скла диште, налазе или дорађују кртоле кромпира или биљке па радајза, укључујући и парцеле (површине) са којих потичу и на којима су се користили исти уређаји, 2) врши се садња унутар зараженог и угроженог подру чја искључиво сертификованог сјеменског кромпира и оба везно испитивање послије вађења сјеменског кромпира који је произведен на могуће зараженим мјестима производње и 3) на свим производним површинама унутар зараженог и угроженог подручја са произведеним сјеменским кром пиром поступа се одвојено од меркантилног кромпира или се врши чишћење и дезинфекција између поступања са сје менским и меркантилним кромпиром, 4) врши се садња само оних биљака парадајза произве дених из сјемена које испуњава услове здравствене исправ ности или из биљака добијених вегетативним размножа вањем биљака парадајза произведених из таквог сјемена и гајених под стручним надзором, у свим усјевима парадајза унутар зараженог и угроженог подручја, 5) обављају се прегледи из чл. 2. и 3. овог правилника. (2) Ради праћења површинских вода које су биле озна чене као заражене у зараженом и угроженом подручју и обезбеђивања услова за престанак наложених мјера у току најмање три вегетационе године које слиједе послије годи не у којој је зараза утврђена: 1) обављају се прегледи у одговарајућем временском пе риоду и узимају узорци површинске воде, а када је то потреб но, узорци биљака домаћина штетног организма из фамилије Solanaceae из те воде, ради лабораторијског испитивања, 2) врши се надзор при спровођењу наводњавања и пр скања главних биљака домаћина. (3) Ако је на основу резултата лабораторијског испи тивања узорака утврђено да вода која је била означена као заражена више није заражена, може се дозволити њена упо треба за наводњавање и прскање. Члан 22. Подаци и информације о потврђеној зарази, као и пода ци и информације о престанку мjера Министарство пољо привреде, шумарства и водопривреде доставља надлежним органима. Члан 23. Овај правилник ступа на снагу осмог дана од дана обја вљивања у “Службеном гласнику Републике Српске”. Број: 12.03.3-330-3269/17 25. августа 2017. године Министар, Бања Лука Др Стево Мирјанић, с.р. ПРИЛОГ Шема тестирања за дијагностику, детекцију и идентификацију проузроковача смеђе трулежи кртола кромпира и бактеријског уве нућа кромпира и парадајза Поглавље I - Област примјене шеме тестирања Приказана шема тестирања описује различите поступке укљу чене у: 1) дијагнозу проузроковача смеђе трулежи кромпира и бак теријског увенућа кромпира, парадајза и других биљака домаћи на, 2) детекцију Ralstonia solanacearum у узорцима кртола кром пира, биљака кромпира, парадајза и других биљака домаћина, у води и у земљишту, 3) идентификацију Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). Поглавље II - Општа начела У поглављима од IX до XVI овог прилога налазе се стандардни протоколи за поједине методе, потврђени и одобрени реагенси и појединости у вези са припремом материјала за тестирање и рефе рентног материјала. У Поглављу IX овог прилога налази се спи сак лабораторија укључених у процес оптимизације и валидације протокола. С обзиром на то да протоколи укључују методе детекције карантинског организма, што подразумијева и употребу живих референтних култура R. solanacearum, процедура се мора изво дити у прописаним карантинским условима са одговарајућим објектима за одлагање, чување и уништавање отпада у складу са условима које прописује институција одговорна за карантинске прописе. Параметри тестирања морају обезбиједити уједначене и поно вљиве нивое детекције R. solanacearum према прописаним праго вима осјетљивости појединих метода. Обавезна је прецизна припрема позитивних контрола. Тестирање у складу са захтијеваним прагом осјетљивости подразумијева правилно постављање, одржавање и калибрирање опреме, пажљиво руковање и чување реагенаса, као и предузи мање мјера за спречавање контаминације између узорака, нпр. ра здвајање позитивних контрола од узорака за тестирање. Да би се избјегле административне или друге грешке, морају се примјењи вати стандарди контроле квалитета, посебно при означавању узо рака и вођењу документације. Сумња на присуство патогена у узорку подразумијева позити ван резултат теста провјере узорка као што је приказано у дијагра мима тока. Позитиван резултат добијен у првом извршеном тесту провjе ре (IF тест, PCR/FISH, селективна изолација) мора се потврдити и другим тестом провјере који се базира на другом биолошком на челу. Ако је резултат првог теста провjере (IF или PCR/FISH) пози тиван, тада се сумња на присуство R. solanacearum и потребно је примијенити и други тест провјере. Ако је резултат и другог теста позитиван, тада је сумња потврђена и тестирање се наставља пре ма описаној шеми. Ако је резултат другог теста негативан, тада се сматра да R. solanacearum није присутна у узорку. Позитиван резултат IF теста се дефинише као позитивно очитавање IF теста потврђено и другим тестом провјере (PCR/FISH). Потврђено присуство патогена подразумијева изолацију и идентификацију чисте културе R. solanacearum и потврду патоге ности. Поглавље III 1. Приказ дијаграма тока 1.1. Шема утврђивања присуства проузроковача смеђе тру лежи кртола и бактеријског увенућа (Ralstonia solanacearum) у кртолама и биљкама кромпира, парадајза или другим биљкама домаћинима са симптомима смеђе трулежи или бактеријског уве нућа (Шема 1) Поступак тестирања примјењује се за кртоле и биљке кром пира, парадајза или друге биљке домаћине са типичним симпто мима или симптомима који упућују на присуство проузроковача смеђе трулежи. Поступак укључује тест провјере, изолацију па тогена из зараженог спроводног ткива на храњиву подлогу и у случају позитивног резултата идентификацију чисте културе R. solanacearum. 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 11 Шема 1. (1) Опис симптома наведен је у Поглављу IV овог прилога. (2) Брзи дијагностички тестови олакшавају постављање дијаг нозе, али нису неопходни. Негативан резултат не гарантује увијек одсутност патогена. (3) Тестирање присуства патогена у бактеријском ексудату из спроводног ткива стабљике описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.1. овог прилога. (4) Тест за откривање гранула poli-β-hidroksibutirata у бакте ријским ћелијама описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.2. овог прилога. (5) Серолошки тестови аглутинације на бактеријском ексудату или екстракту из ткива са симптомима описани су у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (6) IF тест на суспензији бактеријског ексудата у води или на екстракту из ткива са симптомима описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога. (7) FISH тест на суспензији бактеријског ексудата у води или на екстракту из ткива са симптомима описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога. (8) ELISA тест на суспензији бактеријског ексудата у води или на екстракту из ткива са симптомима описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.8. овог прилога. (9) PCR тест на суспензији бактеријског ексудата у води или на екстракту из ткива са симптомима описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога. (10) Патоген се обично може лако изоловати из биљног мате ријала са симптомима методом разрјеђења и изолације на хранљи ву подлогу (Поглавље IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога). (11) Опис типичне морфологије колоније наведен је у Погла вљу IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (12) Гајење бактеријске културе може бити неуспјешно у по одмаклом стадијуму инфекције због компетиције или претјераног размножавања сапрофитних бактерија. Ако су симптоми болести типични, а тест изолације негативан, тест изолације се мора поно вити, најбоље на селективној хранљивој подлози. (13) Поуздана идентификација чистих култура изолата бакте рије R. solanacearum постиже се извођењем тестова описаних у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. (14) Тест патогености описан је у Поглављу VIII тачка 3. овог прилога. 1.2. Шема за утврђивање присуства и идентификацију R. solanacearum у узорцима кртола кромпира без видљивих симпто ма (Шема 2) Начело Поступак тестирања намијењен је за откривање присуства скривене заразе у кртолама кромпира. Позитиван резултат најмање два теста провјере, који се бази рају на различитим биолошким начелима, допуњава се изолацијом патогена, послије чега, у случају изолације типичних колонија, слиједи потврда чисте културе R. solanacearum. Позитиван резултат само једног од тестова провјере није до вољан да би се узорак сматрао вјероватно зараженим. Тестови провјере и изолација морају омогућити ниво осјетљи вости детекције 103 ћелије/ml до 104 ћелије/ml ресуспендованог талога, укљученог као позитивна контрола у свакој серији тестова. Шема 2. (1) Стандардна величина узорка је 200 кртола; ако на распо лагању нема 200 кртола, поступак се може спровести и на мањим узорцима. (2) Методе екстракције и концентровања патогена описане су у Поглављу V тачка 1. овог прилога. (3) Ако су резултати најмање два теста који се заснивају на различитим биолошким начелима позитивни, потребно је извр шити изолацију и потврдити присуство патогена. Извршити бар један тест провјере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други тест или више тестова провјере који се заснивају на различитим биолошким начелима да би се потвр дио позитиван резултат. Ако су резултати осталих тестова нега тивни, сматра се да је тај узорак негативан. Даље тестирање није потребно. Тест имунофлуоресценције (IF) описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога. (4) Селективна изолација је описана у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога. (5) PCR тест је описан у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога. (6) FISH тест је описан у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога. (7) ELISA тестови су описани у Поглављу VIII тачка 1. подтач ка 1.8. овог прилога. (8) Биолошки тест је описан у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог прилога. (10) Типична морфологија колоније описана је у Поглављу IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (11) Гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспјешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бак теријама. Ако се у тестовима провjере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање 12 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. спроводног ткива на мјесту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке. (12) Поуздана идентификација чистих култура R. solanacearum постиже се извођењем тестова описаних у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. (13) Тест патогености описан је у Поглављу VIII тачка 3. овог прилога. 1.3. Шема за утврђивање присуства и идентификацију R. solanacearum у узорцима биљака кромпира, парадајза или других биљака домаћина без симптома (Шема 3) Шема 3. (1) За препоручене величине узорака видјети Поглавље V тач ка 2. подтачка 2.1. овог прилога. (2) Екстракција патогена и методе концентровања описане су у Поглављу V тачка 2. подтачка 2.1. овог прилога. (3) Ако су резултати најмање два теста који се заснивају на ра зличитим биолошким начелима позитивни, потребно је извршити изолацију и потврду присуства патогена. Извршити бар један тест провjере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други тест или више тестова провјере, који се засни вају на различитим биолошким начелима да би се потврдио пози тиван резултат. Ако су резултати осталих тестова негативни, сматра се да је тај узорак негативан. Даље тестирање није потребно. (4) Селективна изолација описана је Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога. (5) IF тест описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога. (6) PCR тестови описани су у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога. (7) FISH тест описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога. (8) ELISA тест описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.8. овог прилога. (9) Биолошки тест описан је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог прилога. (10) Типична морфологија колоније описана је у Поглављу IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (11) Гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспјешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бак теријама. Ако се у тестовима провјере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање спроводног ткива на мјесту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке. (12) Поуздана идентификација чистих култура R. solanacearum постиже се извођењем тестова описаних у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. (13) Тест патогености описан је у Поглављу VIII тачка 3. овог прилога. Поглавље IV - Детекција бактерије R. solanacearum у кртолама и биљкама кромпира, парадајза и другим биљкама домаћинима 1. Детаљне методе за детекцију R. solanacearum у кртолама и биљкама кромпира, парадајза или другим биљкама домаћинима са симптомима смеђе трулежи и бактеријског увенућа 1.1. Симптоми 1.1.1. Симптоми на кромпиру Биљка кромпира. Почетна фаза инфекције у пољу препознаје се по увенућу лишћа при врху биљке на високим температурама током дана, али које се опорављају током ноћи. У раним фазама увенућа лишће остаје зелено, али касније почиње да жути и ра звија се смеђа некроза. Такође, долази и до појаве епинастије. Убр зо долази до неповратног увенућа изданка или цијеле биљке што резултира пропадањем и одумирањем биљке. Попречни пресјек спроводног ткива увенуле стабљике обично је смеђе боје, а из пресјеченог мјеста се лако може исциједити млијечни бактеријски ексудат. Кад се пресјечено мјесто стабљике стави усправно у воду, из спроводних судова истиче бактеријски ексудат. Кртола кромпира. Кртоле кромпира треба пререзати попречно или уздужно у близини пупка кртола. Почетна фаза инфекције пре познаје се по промјени боје спроводног прстена од стакластожуте до свијетлосмеђе из којег се спонтано, након неколико минута, појављује блиједи кремасти бактеријски ексудат. Касније, спро водно ткиво постаје изразито смеђе и некроза се може проширити на паренхимско ткиво. У узнапредовалим фазама инфекције бакте ријски ексудат може цурити и из пупчаног дијела и из окаца и на њу се лијепе честице земље. На покожици кртоле могу се појавити црвенкастосмеђа улегнућа због пропадања спроводног ткива изну тра. У узнапредовалим фазама болести уобичајен је и секундарни развој меке трулежи коју проузрокују гљиве и бактерије. 1.1.2. Симптоми на парадајзу Биљка парадајза. Први видљиви симптом је увелост најмлађих листова. У условима који су повољни за патогена (температура зе мљишта око 25 °C; засићеност влагом) у року од неколико дана долази до епинастије и увенућа само једне стране или цијеле биљ ке што доводи до потпуног пропадања биљке. У мање повољним условима (температура земљишта мања од 21 °C) увенуће се рјеђе појављује, али се на стабљици може развити велики број адвенти вног коријења. Могуће је уочити пруге које изгледају као натопље не водом и протежу се дуж стабљике, од њене базе, а доказ су не кротирања спроводног ткива. Ако се стабљика пресијече унакрсно, из спроводног ткива чија је боја промијењена у смеђу, цури бијели или жућкасти бактеријски ексудат. 1.1.3. Симптоми на другим биљкама домаћинима Биљке Solanum dulcamara и S. nigrum. Код ових биљака до маћина се у природним условима ријетко уочавају симптоми уве нућа, осим ако температура земљишта прелази 25 °C или ако је ниво инокулума изузетно висок (нпр. S. nigrum који расте близу обољеле биљке кромпира или парадајза). Ако дође до увенућа, симптоми су исти као и код парадајза. Биљке Solanum dulcamara расту са стабљикама и коријењем у води и на њима није видљиво увенуће, али је на попречном пресијеку основе стабљике или дије ловима стабљике који су под водом видљива свијетлосмеђа обоје ност спроводног ткива. Уколико пресјечену стабљику усправно ставимо у воду, из спроводног ткива на мјесту пресјека може цури ти бактеријски ексудат, чак и ако нема симптома увенућа. 1.2. Брзи тестови провјере Брзи тестови провjере олакшавају, али нису пресудни у поста вљању почетне дијагнозе. Примијенити један или више сљедећих одобрених тестова: 1.2.1. Тест бактеријског ексудата из стабљике (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.1. овог прилога). 1.2.2. Детекција гранула poli-β-hidroksibutirata (PHB): Карактеристичне грануле PHB-a у ћелијама R. solanacearum постају видљиве при бојењу термички фиксираним размазом бак теријског ексудата из зараженог ткива на микроскопској плочици нилском плавом бојом А и суданском црном бојом Б (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.2. овог прилога). 1.2.3. Серолошки тестови аглутинације (Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога). Остали тестови. У остале одговарајуће брзе тестове провјере спадају IF тест, FISH тест, ELISA тест и PCR тест. 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 13 1.3. Поступак изолације У мањој количини стерилне дестиловане воде или 50 ml фо сфатног пуфера направити суспензију бактеријског ексудата или дијелова ткива промијењене боје из спроводног прстена кртола кромпира или из спроводних судова стабљика кромпира, парадајза или других биљака домаћина са симптомима увенућа и оставити 5 до 10 минута. Припремити низ децималних разрјеђења суспензије. Преније ти 50 μl до 100 μl суспензије и разрјеђења на општу храњиву по длогу (NA, YPGA или SPA; и/или на Келманову тетразолиум-под логу и/или на одобрену селективну подлогу (нпр. SMSA; видјети Поглавље X овог прилога). Суспензију и/или разрјеђење размазати по подлози, примјењујући одговарајућу технику наношења разрје ђења на подлогу. Уколико је потребно, наношењем разрјеђења су спензије колонија на одвојеним подлогама припремити позитивну контролу R. solanacearum биовар 2. Инкубирати подлоге од два до шест дана на 28 °C. На општој храњивој подлози вирулентни изолати бактерије R. solanacearum стварају пљоснате, неправилне и течне колоније би серне кремастобијеле боје, често са карактеристичним спиралама у средини. Невирулентни облици бактерије R. solanacearum ства рају мале, округле, нефлуидне колоније, путерасте конзистенције и кремастобијеле боје. На Келмановој тетразолиум-подлози и на SMSA подлози спи рале су крвавоцрвене боје. Невирулентни облици бактерије R. solanacearum стварају мале, округле, нефлуидне колоније, путе расте конзистенције које су цијеле и тамноцрвене боје. 1.4. Тестови за идентификацију бактерија R. solanacearum Тестови за потврду идентитета изолата за које се сматра да су изолати R. solanacearum наведени су у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. Поглавље V - Методе за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у узорцима кртола кромпира без симптома 1. Детаљне методе за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у узорцима кртола кромпира без симптома 1.1. Припрема узорка Стандардна величина узорка је 200 кртола по тесту. Интензивније узорковање захтијева извођење већег броја те стова на узорцима те величине. Већи број кртола у узорку довешће до инхибиције или ће отежати тумачење резултата. Међутим, по ступак се може примијенити и за узорке са мање од 200 кртола, када је на располагању мање кртола. Валидација свих метода за утврђивање присуства патогена, које су описане у даљем тексту, базира се на тестирању узорака од 200 кртола. Екстракт кромпира који је описан у даљем тексту може се користити и за утврђивање присуства проузроковача прстенасте трулежи кромпира, бактерије Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Процедура која претходи припреми узорка (опциона): Инкубирати узорак на од 25 °C до 30 °C у периоду до двије недјеље прије извођења тестова, да би се изазвало умножавање по пулација бактерија R. solanacearum. Опрати кртоле. Употријебити одговарајућа дезинфекциона средства (при коришћењу PCR теста употријебити једињења хлора ради уклањања евентуално присутне ДНК патогена) и детерџенте између сваког узорка. Осушити кртоле на ваздуху. Поступак прања је посебно користан (али не обавезан) за случајеве обраде узорака са већом количином земље, при извођењу PCR теста или процеду ре директне изолације. Чистим и дезинфикованим скалпелом или ножем за поврће ук лонити покожицу са пупчаног дијела кртоле тако да се виде спро водни судови. Пажљиво изрезати мали конусни дио спроводног ткива на пупчаном дијелу захватајући што мање околног, неспро водног ткива. Све кртоле са потенцијално сумњивим симптомима смеђе тру лежи одвојити посебно и тестирати. Ако се приликом вађења конуса из пупчаног дијела уоче по тенцијални симптоми смеђе трулежи, кртоле треба визуелно пре гледати. Сваку пресјечену кртолу са оваквим симптомима треба оставити два дана на собној температури, а потом чувати у каран тинским условима (на 4 °C до 10 °C) до спровођења тестирања. Све кртоле у узорку (укључујући и оне са сумњивим симптомима) треба чувати у складу с одговарајућим одредбама Правилника. Извађене конусе из пупчаног дијела кртоле који садрже дије лове спроводног ткива ставити у стерилне посуде које се могу запечатити и/или херметички затворити (ако су посуде већ упо требљаване, морају се темељно очистити и дезинфиковати упо требом средстава на бази једињења хлора). Узорке је пожељно одмах обрадити. Ако то није могуће, чувати их у посуди без до датка пуфера, најдуже 72 сата у фрижидеру или најдуже 24 сата на собној температури. Током чувања долази до сушења и субери зације сржног дијела конуса, као и до раста и развоја сапрофита, што може ометати утврђивање присуства бактерије проузроковача прстенасте трулежи. Извађене конусе из пупчаног дијела кртоле обрадити ко ришћењем једног од сљедећих поступака: извађене конусе прекрити довољном количином (око 40 ml) екстракционог пуфера и ултрацентрифугирати на 50 обртаја/мин. до 100 обртаја/мин., четири сата на температури испод 24 °C или 16 до 24 сата уз хлађење или извађене конусе хомогенизовати са довољном количином (око 40 ml) екстракционог пуфера било у мјешалици (нпр. Waring или Ultra Thurax) било дробљењем у затвореној кеси за мацера цију за једнократну употребу (нпр. кесе Stomacher или Bioreba од чврстог политена 150 mm ∙ 250 mm, стерилизоване зрачењем), користећи гумени чекић или одговарајући апарат за мацерирање (нпр. Homex). Ако се узорци хомогенизују у блендеру, постоји велика опа сност од њихове унакрсне контаминације. Предузети мјере опре за у циљу спречавања настајања аеросола или просипања током екстракције. За сваки узорак употријебити стерилизоване ножиће и посуде. Током процедуре PCR-а, спријечити пренос ДНК на кон тејнере или апаратуру за мацерирање. За PCR тест препоручује се мацерирање узорака у кесицама за једнократну употребу и даље коришћење епрувета и туба за једнократну употребу. Одлити супернатант. Ако је превише мутан, разбистрити га ултрацентрифугирањем на мањем броју обртаја (највише 180 g/10 минута на температури од 4 °C до 10 °C) или вакуумском фил трацијом (40 μm до 100 μm) током које се филтер додатно испира екстракционим пуфером (око 10 ml). Извршити концентрисање фракције бактерије центрифуги рањем на 7.000 g/15 минута (или 10.000 g/10 минута) на темпера тури од 4 °C до 10 °C, послије чега се пажљиво, без мијешања са талогом одлива супернатант. Ресуспендовати талог у 1,5 ml пелет пуфера (пуфера за раства рање талога). Од ове количине користити 500 μl за тестирање на присуство R. solanacearum, 500 μl за тестирање на присуство Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus и 500 μl као референт ни материјал за чување. У посљедњи, референтни дио од 500 μl додати стерилни глицерол у коначној концентрацији од 10% до 25% (v/v), промијешати и чувати на температури од -16 °C до -24 °C (недјељама) или на -68 °C до -86 °C (мјесецима). Дијелове од војене за утврђивање присуства бактерија током тестирања чувати на температури од 4 °C до 10 °C. Не препоручује се вишеструко замрзавање и одмрзавање. У случају потребе за транспортом узо рака, доставити га у преносивом фрижидеру у року од 24 сата до 48 сати. Важно је да се све позитивне контроле R. solanacearum и узор ци држе одвојено да би се избјегла контаминација. Ово се односи и на IF плочице и друге тестове. 1.2. Тестирање Видјети дијаграм и опис тестова и оптимизоване протоколе у одговарајућим додацима: Селективна изолација (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога). IF тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога). PCR тестови (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог при лога). FISH тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога). ELISA тестови (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.8. овог при лога). Биолошки тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог при лога). 2. Методе за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у узорцима биљака кромпира, парадајза или других биљака домаћина без симптома 2.1. Припрема узорка За откривање латентних популација R. solanacearum препо ручује се тестирање збирних узорака. Поступак се може погодно примијенити на збирне узорке са највише 200 дијелова стабљике (узимање узорака током спровођења надзора мора се базирати на статистички репрезентативном узорку испитиване биљне попула ције). Чистим дезинфикованим ножем или маказама за резање одре зати 1 cm до 2 cm доњег дијела сваке стабљике, одмах изнад по вршине земљишта. Дијелове стабљике дезинфиковати кратким потапањем у 70% етанол и одмах осушити упијајућим папиром. 14 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. Ставити дијелове стабљике у затворену стерилну посуду. Расад парадајза из расадника: чистим дезинфикованим ножем одсјећи дио величине 1 cm од доњег дијела стабљике, непосредно изнад површине земље. Биљке парадајза из поља или стакленика чистим, дезинфико ваним ножем одсјећи најнижи бочни изданак на свакој биљци, и то непосредно изнад споја са стабљиком. Са сваког бочног изданка одсјећи доњи део величине 1 cm. Са осталих биљака домаћина чистим, дезинфикованим ножем или баштенским маказама одсјећи део величине 1 cm са доњег дијела стабљике, непосредно изнад нивоа земље. Ако се узоркује S. dulcamara или друге биљке домаћини које расту у води, одсије ците дио величине од 1 cm до 2 cm са подводног дијела стабљике или столона са воденим коријењем. При узорковању на одређеној локацији, препоручује се те стирање статистички репрезентативног узорка од најмање десет биљака по мјесту узорковања за сваку врсту самониклог биља која је потенцијални домаћин. Детекција патогена најпоузданија је крајем прољећа и током љета и јесени, иако се природне ин фекције могу открити током цијеле године код вишегодишње биљке Solanum dulcamara, која расте у водотоковима. Позна ти домаћини су самоникле биљке кромпира (кртоле остале у земљишту), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium и други врсте породице Solanaceae. Остале биљке домаћини су Pelargonium spp. и Portulaca oleracea. Европске врсте само никлог биља које у специфичним условима средине могу бити потенцијални домаћини популација R. solanacearum биовар 2 / раса 3 у коријењу и/или ризосфери су Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parvifl ora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra и Urtica dioica. У овој се фази може обавити визуелни преглед биљака (обојеност спроводног система или појава бактеријског ексуда та). Одвојити све дијелове стабљика са симптомима и тестирати их посебно. Кратко дезинфикујте дијелове стабљика 70% етанолом и од мах осушите упијајућим папиром. Дијелове стабљика затим обра дите једним од сљедећих поступака: дијелове стабљике прекрити довољном количином (при ближно 40 ml) екстракционог пуфера и ултрацентрифугирати на 50 обртаја/мин. до 100 обртаја/мин. четири сата на температури испод 24 °C или 16 до 24 сата уз хлађење, или дијелове стабљике измацерирати у чврстој кеси за мацера цију (нпр. Stomacher или Bioreba) са одговарајућом количином екстракционог пуфера, користећи гумени чекић или одговарајућу опрему за мацерирање (нпр. Homex). Ако то није могуће, дијелове стабљике чувати у фрижидеру најдуже 72 сата или на собној тем ператури најдуже 24 сата. Послије 15 минута таложења, одлити супернатант. Даље избистравање екстракта или концентровање фракције бактерија обично није потребно, али се може постићи филтри рањем и/или центрифугирањем како је описано у тачки 1. овог поглавља. Подијелити чисти или концентровани екстракт узорка на два једнака дела. Једну половину чувати на температури од 4 °C до 10 °C током тестирања, а другу половину оставити за случај употребе у додатним тестирањима: у екстракт се додаје 10% до 25% (v/v) стерилног глицерола и чува се на температури од -16 °C до -24° С (недјељама) или на -68 °C до -86 °C (мјесецима). 2.2. Тестирање Видјети дијаграм и опис тестова и оптимизоване протоколе у одговарајућим додацима: Селективна изолација (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога). IF тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога). PCR тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога). FISH тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога). ELISA тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.8. овог прило га). Биолошки тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог при лога). Поглавље VI - Детекција и идентификација у води 1. Шема за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у води Шема 4. (1) За препоручене поступке узорковања видјети тачку 2. подтачка 2.1. овог поглавља. (2) Методе концентрисања патогена описане су у тачки 2. подтачка 2.1. овог поглавља. Овај поступак се препоручује само ако неће довести до инхибиције изолације, јер се концентрисањем повећавају популације и патогена и конкурентних сапрофитних бактерија. (3) Селективна изолација описана је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога. (4) Биолошко тестирање је описано у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог прилога. (5) Методе обогаћивања за PCR тест описане су у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. и Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога (6) Методе обогаћивања за ELISA тест описане су у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. и Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.8. овог прилога. (7) Типична морфологија колоније описана је у Поглављу IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (8) Гајење бактеријске културе може бити неуспјешно због компетиције или инхибиције сапрофитним бактеријама. Ако се сумња да ће велике популације сапрофитних бактерија утицати на поузданост изолације, поновити изолацију послије разрјеђивања узорка у стерилној води. (9) Поуздана идентификација чистих култура R. solanacearum постиже се извођењем тестова описаних у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. (10) Тест патогености описан је Поглављу VIII тачка 3. овог прилога. Идентификациона шема описана у овом поглављу може се примијенити за детекцију патогена у узорцима површинске (те куће воде), као и у узорцима индустријских (отпадних) вода. Ипак, важно је нагласити да ће очекивана осјетљивост детекције вари рати у зависности од супстрата. На осјетљивост теста изолације утичу популације конкурентских сапрофитних бактерија, чија је бројност најчешће много већа у случају индустријских (отпадних) вода, него у случају површинских (текућих) вода. Иако се пошто вањем и реализовањем поменуте идентификационе шеме очекује детекција популације бактерије концетрације 103 ћ/литру повр шинске (текуће) воде, очекује се да је осјетљивост детекције много нижа код индустријске (отпадне) воде. Из овог разлога се препо ручује да се популација ове бактерије утврђује у узорку отпадне воде тек послије процеса прочишћавања (нпр. седиментација или филтрација), током којег се редукује број бактерија сапрофитне популације. Ово ограничавање осјетљивости метода треба узети у обзир када се процјењује поузданост било ког добијеног нега тивног резултата анализе. Иако се ова шема веома успјешно при 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 15 мјењује код утврђивања присуства ове бактерије у текућим водама, њена ограничења треба узети у обзир приликом сличних надзора индустријских (отпадних) вода. 2. Методе за детекцију и идентификацију R. solanacearum у води 2.1. Припрема узорака 4. детекција R. solanacearum у текућим водама је најпоузда нија током касног прољећа, љета и јесени, када је температура воде изнад 15 °C; 5. поновљено узимање узорака на одабраним мјестима неколи ко пута током наведеног периода ће повећати поузданост детекције умањивањем климатских варијација; 6. узети у обзир утицај јаких падавина и географске параме тре водотокова у циљу избјегавања ефекта разрјеђења који могу умањити могућност детекције патогена; 7. узорке узимати у текућим водама у близини биљака домаћи на, уколико постоје. На одабраним мјестима узорковати воду захватањем одређене количине воде у рециклабилне стерилне епрувете или боце, и то са дубине испод 30 cm и у оквиру 2 m од обале; индустријску и отпад ну воду узорковати на мјесту испуштања; препоручује се величина узорка од 500 ml по мјесту узорковања. Уколико је потребно да узорци буду мањи, препоручује се да буду узети са три различи те тачке по одабраном мјесту узорковања и да се сваки састоји од два подузорка од најмање 30 ml. У условима интензивног надзора, изабрати најмање три мјеста узорковања на свака 3 km водотока; у узорковање укључити и мјеста уливања других водотокова. Узорак транспортовати у тамним и хладним контејнерима (4 °C до 10 °C) и тестирати у периоду од 24 сата од узорковања. Уколико је потребно, бактеријска фракција се може концен тровати коришћењем једне од сљедећих метода: 8. центрифугирати 30 ml до 50 ml подузорака на 10.000 g у трајању од 10 минута (или 7.000 g у трајању од 15 минута), најпо жељније на температури од 4 °C до 10 °C; одлити супернатант и ресуспендовати пелет у 1 ml пуфера; 9. извршити мембранску филтрацију (минимална величина поре 0.45 μm), а потом и испирање филтера са 5 ml до 10 ml пуфе ра и сакупљање онога што се испере; овај метод је погодан за веће запремине воде које садрже мању концентрацију сапрофита. Концентрисање раствора се не препоручује за узорке инду стријске (отпадне) воде, јер би повећана популација сапрофитних бактерија инхибирала развој R. solanacearum. 2.2. Тестирање у лабораторији се изводи према одговарајућој идентификационој шеми у складу са овим прилогом. Поглавље VII - Детекција и идентификација у земљишту 1. Шема за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у земљишту Шема 5. (1) За препоручене поступке узорковања видјети у Поглављу VI тачка 2. подтачка 2.1. овог прилога. (2) Селективна изолација описана је у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. овог прилога. (3) Методе обогаћивања за PCR тест описане су у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.4. и 1.6. овог прилога. (4) Биолошки тест је описан у Поглављу VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог прилога. (5) Типична морфологија колоније описана је у Поглављу IV тачка 1. подтачка 1.3. овог прилога. (6) Гајење бактерије може бити неуспјешно због компетиције или инхибиције сапрофитних бактерија. Ако се сумња да ће велике популације сапрофитних бактерија утицати на поузданост изола ције, поновити изолацију послије додатног разрјеђивања узорка. (7) Поуздана идентификација чистих култура R. solanacearum постиже се примјеном тестова описаних у Поглављу VIII тачка 2. овог прилога. (8) Тест патогености описан је у Поглављу VIII тачка 3. овог прилога. 2. Методе за детекцију и идентификацију бактерије R. solanacearum у земљишту Начела Валидан поступак описан у овом дијелу се може примијенити за детекцију патогена у узорцима земљишта, као и за испитивање узорака чврстог индустријског отпада насталог при преради кром пира или узорака канализацијског муља. Међутим, важно је напо менути да ове методе нису довољно осјетљиве да би гарантовале детекцију мањих и/или неравномерно распоређених популација бактерије R. solanacearum, које могу бити природно присутне у узорцима тих супстрата. Треба узети у обзир ограничења у осјетљивости овог поступ ка тестирања при оцјењивању поузданости добијених негативних резултата, као и при примјени поступка у истраживањима чији је циљ утврдити присуство или одсуство патогена у земљишту или муљу. Најпоузданији начин утврђивања присуства патогена у земљишту на пољу је сјетва/садња осјетљивих биљака домаћина и праћење појаве инфекције, али се ни коришћењем ове методе неће открити ниски нивои контаминације. 2.1. Припрема узорка Узорковање земљишта у пољу треба обављати у складу с основним начелима која се примјењују код узорковања за испити вање нематода. Са 60 мјеста на сваких 0,3 ha узети 0,5 до 1 kg зе мљишта по узорку, с дубине од 10 cm до 20 cm (или на мрежи од 7 m ∙ 7 m). Ако се сумња на присуство патогена, повећати број мјеста узорковања на 120 (на сваких 0,3 ha). Прије тестирања узорке чу вати на температури од 12 °C до 15 °C. Узорковање чврстог инду стријског отпада насталог при преради кромпира или узорковање канализацијског муља извршити узимањем укупно 1 kg на мјести ма која представљају укупну количину муља коју треба тестирати. Сваки узорак добро промијешати прије тестирања. Подузорке од 10 g до 25 g земљишта или муља измијешати у 60 ml до 150 ml екстракционог пуфера на ротационој мјешалици (250 обртаја/мин.), у трајању од максимално 2 сата. Мијешању, по потреби, може помоћи додавање 0,02% стерилног Tween – 20 и 10 g до 20 g стерилног пијеска. Суспензију одржавати на температури од 4 °C током тестира ња. Тестирање се изводи према одговарајућој идентификационој шеми у складу са овим прилогом. Поглавље VIII - Оптимизовани протоколи за детекцију и иден тификацију R. solanacearum 1. Дијагностички тестови и тестови за идентификацију 1.1. Тестирање бактеријског ексудата из стабљике Присуство R. solanacearum у стабљикама увелих биљака кромпира, парадајза или других биљака домаћина може се утврди ти сљедећим једноставним тестом: сасјећи стабљику непосредно изнад површине земљишта и тај крај ставити у епрувету са чистом водом. Послије неколико минута, из пресјечених спроводних судо ва пратити појаву карактеристичног бактеријског ексудата. 1.2. Детекција гранула поли-п-хидроксибутирата (PHB) На микроскопској плочици припремити размаз бактеријског ексудата из зараженог ткива или из 48-часовне културе са храњиве подлоге YPGA или SPA (Поглавље X овог прилога). За позитивну контролу припремити размазе биовара 2, бакте рије R. solanacearum, а за негативну контролу размаз бактеријске врсте за коју је познато да је негативна на PHB, уколико се овај поступак сматра потребним. 16 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. Размазе оставити да се осуше на ваздуху и потом их фиксирати на пламену. Обојити препарат или нилском плавом или суданском црном бојом и посматрати под микроскопом сљедеће. 1.2.1. Тест са нилском плавом бојом: Прелити сваку плочицу с 1% воденим раствором нилскоплаве боје А и инкубирати 10 минута на 55 °C. Оциједити раствор боје. Испрати кратко под благим млазом воде из славине. Вишак воде уклонити упијајућим папиром. Прелити размаз 8% воденим раствором сирћетне киселине и инкубирати један минут на собној температури. Испрати кратко под благим млазом воде из славине. Вишак воде уклонити упијајућим папиром. Поново навлажити капљицом воде и покрити покровним ста калцем. Прегледати обојени размаз епифлуоресцентним микроскопом на 450 nm, имерзијским објективом повећања од 600 до 1.000 пута (уљна или водена имерзија). Прегледати да ли је присутна светлонаранџаста флуоресцен ција гранула PHB-а. Такође, прегледати плочицу и под нормалним светлом да би се потврдило присуство гранула PHB у ћелијама и да је ћелијска морфологија типична за R. solanacearum. 1.2.2. Тест са бојом суданскоцрно Прелити сваку плочицу 0,3% воденим раствором боје судан скоцрно Б у 70% етанолу и инкубирати 10 минута на собној тем ператури. Оциједити раствор боје, кратко испрати под млазом воде из славине и вишак воде уклонити упијајућим папиром. Плочице накратко умочити у ксилол и осушити их на упијајућем папиру. Ксилол је опасан за здравље, предузети потреб не сигурносне мјере и радити у дигестору. Прелити плочице 0,5% (w/в) воденим раствором шафранина и оставити 10 секунди на собној температури. Шафранин је опа сан за здравље, предузети потребне сигурносне мјере и радити у дигестору. Испрати под благим млазом воде из славине, осушити на упијајућем папиру и покрити покровним стакалцем. Прегледати обојене размазе под микроскопом који користи пролазно свјетло, уљним имерзијским објективом повећања од 1.000 пута. Прегледати да ли се уочавају плаво-црно обојене грануле PHB а у ћелијама R. solanacearum с ћелијским зидовима обојеним ру жичасто. 1.3. Серолошки тест аглутинације Аглутинација ћелија R. solanacearum у бактеријском ексу дату или екстрактима ткива са симптомима, најбоље се уочава коришћењем потврђених и одобрених антитијела обиљеже них одговарајућим обојеним ознакама као што су црвене ће лије Stanhulococcus aureus или обојене честице латекса. Ако се користи комплет који је доступан на тржишту, слиједити упутства произвођача. У супротном, примијенити сљедећи по ступак: помијешати капљице суспензије обиљеженог антитијела и бактеријског ексудата (око 5 μl сваког) на предметним плочицама са више бунарчића, припремити позитивне и негативне контроле користећи су спензије R. solanacearum биовар 2 и хетерологног соја, уочити да ли долази до аглутинације у позитивним узорцима послије 15 секунди лаганог мијешања. 1.4. Изолација R. solanacearum 1.4.1. Изолација на селективној подлози Напомена Прије примјене ове методе, обавити претходне тестове да би се осигурала поновљива детекција 103 до 104 јединица које ства рају колоније (CFU) бактерије R. solanacearum по ml, а које су до дате екстрактима узорака који су у претходним тестирањима дока зани као негативни. Користити потврђену и одобрену селективну храњиву подлогу као што је SMSA (прилагођену према Elphinstone и сар., 1996; − Поглавље X овог прилога). Приликом прегледа засејане хранљиве подлоге, обратити пажњу на разликовање R. solanacearum од других бактерија чије колоније могу расти на тој хранљивој подлози, јер колоније R. solanacearum могу бити нетипичне морфологије ако је интензиван пораст разних бактерија на подлози или ако су присутне антаго нистичке бактерије. Уколико се посумња да је дошло до негати вног утицаја компетиције или антагонизма, узорак треба поново тестирати другим тестом. Највећа осјетљивост детекције овом методом може се очеки вати ако се користе свјеже припремљени екстракти узорака. Међу тим, ова се метода може примјењивати и на екстрактима чуваним с глицеролом на температури од -68 °C до -86 °C. Позитивна контрола: припремити децимална разрјеђења су спензије 106 cfu по ml вирулентног соја биовара 2 R. solanacearum (нпр. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Позитивне контроле припремити потпуно одвојено од узорака који се тестирају да би се избјегла могућност контаминирања узорака. Прије употребе за рутинско тестирање узорака, провјерити по годност сваке серије селективне храњиве подлоге за раст и развој патогена. Контролни материјал подвргнути истим принципима те стирања, као и узорак или узорке. Примијенити одговарајућу технику наношења разрјеђења да би се осигурала довољна разријеђеност популација сапрофитних бактерија. Нанијети од 50 μl до 100 μl екстракта узорка по подлози и по сваком разрјеђењу. Инкубирати подлоге на 28 °C и очитати их послије 48 сати, а послије тога сваки дан у периоду од шест дана. Типичне колоније R. solanacearum на храњивој подлози SMSA А су млијечнобије ле боје, пљоснате, неправилног облика и воденасте, а послије три дана инкубације средина им постаје ружичаста до крвавоцрвена с унутрашњим пругама или спиралама. Напомена На овој храњивој подлози понекад расту и нетипичне колоније R. solanacearum, које могу бити мале, округле, потпуно црвене боје и неводенасте или само дјелимично воденасте, због чега их је те шко разликовати од колонија сапрофитних бактерија. Колоније за које се сматра да су колоније R. solanacearum тре ба пренијети на уобичајену храњиву подлогу и пречистити да би се добиле појединачне издвојене колоније. Културе се кратко вријеме могу чувати у стерилној води (pH 6 до 8, без хлора) на собној температури у тами или дуже вријеме на температури од -68 °C до -86 °C или лиофилизоване. Изолате идентификовати (Поглавље VIII тачка 2. овог прило га) и провјерити патогеност (Поглавље VIII тачка 3. овог прилога). Тумачење резултата селективне изолације Селективна изолација је негативна ако се послије шест дана не уочавају никакве бактеријске колоније или ако се не пронађу сумњиве колоније типичне за R. solanacearum , под условом да се не сумња на инхибицију због конкуренције или антагонизма дру гих бактерија и да су типичне колоније R. solanacearum пронађене у позитивним контролама Селективна изолација је позитивна ако се издвоје сумњиве ко лоније R. solanacearum. 1.4.2. Поступак обогаћивања За обогаћивање употријебити потврђену и одобрену подлогу што је модификована Wilbrink течна подлога (Поглавље X овог прилога). Овај поступак се може примијенити за селективно повећање популације R. solanacearum у екстрактима узорака, усљед чега се повећава и осјетљивост детекције. На овај начин се такође значај но разрјеђују инхибитори PCR реакције (1 : 100). Међутим, треба напоменути да обогаћивање R. solanacearum може бити неуспjеш но због компетиције или антагонизма сапрофитних организама који се често истовремено обогаћују. Због тога може бити тешко издвојити R. solanacearum из култура обогаћених у течној подло зи. Поред тога, у случају употребе ELISA теста, с обзиром на то да се популације серолошки сродних сапрофита могу повећати, препоручује се употреба специфичних моноклоналних антитијела умјесто поликлоналних антитиjела. За обогаћивање за PCR тест пренесите 100 μl екстракта узорка у 10 ml течне подлоге за обогаћивање који је претходно подијељен у аликвоте у епрувете или бочице без ДНК. За обогаћивање за ELISA тест могу се користити већи дијелови екстракта узорка у те кућој подлози (нпр. 100 μl у 1,0 ml текуће подлоге за обогаћивање). Инкубирати 72 сата на температури од 27 °C до 30 °C са протресањем или без протресања, с чепом који није до краја затег нут да би се омогућило провјетравање. Добро промијешати прије коришћења у ELISA или PCR тесто вима. С обогаћеном текућом подлогом поступати исто као и с узор цима у претходно описаним тестовима. Напомена Уколико се очекује да ће обогаћивање R. solanacearum бити онемогућено због великих популација одређених конкурентних 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 17 сапрофитних бактерија, бољи резултати се могу добити обогаћи вањем екстракта узорака прије центрифугирања или других посту пака концентрисања. 1.5. IF тест Начело Употреба IF теста као главног теста провјере препоручује се због његове доказане уједначености у постизању захтиjеваних пра гова осјетљивости методе. Када се IF тест користи као главни тест провjере и ако је IF очитавање позитивно, додатно се као други тест користи PCR или FISH тест. Када се IF тест користи као други тест провјере и IF очитавање је позитивно, даља тестирања у циљу комплетирања анализа се изводе према дијаграму тока. Напомена Користити потврђена и одобрена антитијела R. solanacearum. Препоручује се одређивање титра за сваку нову серију анти тијела. Титар се дефинише као највеће разрјеђење у коме долази до оптималне реакције при тестирању суспензије која садржи 105 до 106 ћелија по ml одговарајућег соја R. solanacearum уз ко ришћење флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC) коњугата у складу с препорукама произвођача. Сви потврђени и одобрени поликло нални антисеруми имали су IF титар најмање 1 : 2.000. Током тестирања користити радна разрјеђења антитијела, која су близу или једнака титру. Тестирање треба извршити на свјеже припремљеним екстрактима узорака, а по потреби, тестирање се може успјешно извршити и на екстрактима који су били чувани на температури од -68 °C до -86 °C с додатком глицерола. Глицерол уклонити додавањем 1 ml пелет пуфера (пуфера за растварање талога), (Поглавље XII овог прилога), поновним центрифугирањем на 7.000 g у трајању од 15 минута и ресуспендовањем талога у јед накој запремини пелет пуфера. Овај дио процедуре често није потребан, нарочито ако су узорци фиксирани на микроскопска IF стакла пламеном. На одвојеним микроскопским стаклима припремити пози тивну контролу, и то хомологни или неки други референтни изолат R. solanacearum, растворен у екстракту кромпира и по избору у пуферу. На истој IF плочици треба, гдје год је то могуће, користити и позитивну контролу коју чини природно заражено ткиво (лиофи лизовано или замрзнуто на -16 °C до -24 °C). Негативну контролу могу представљати и дијелови екстра кта узорака који су у ранијем тестирању показали негативан резултат. У Поглављу XI овог прилога наведени су стандардизовани позитивни и негативни контролни материјали који се могу упо требљавати у овом тесту. Користити микроскопске плочице са више бунарчића, по мо гућности с 10 отвора пречника најмање 6 mm. Примијенити идентичан поступак тестирања на узорке и на позитивне и негативне контроле. 1.5.1. Припремити IF плочице за тестирање једним од сље дећих поступака 1.5.1.1. За талоге с релативно малом количином наталоженог скроба У први бунарчић пипетом одмјерити стандардну запремину разрјеђења од 1/100 ресуспендованог талога кромпира (15 μl је довољно за бунарчиће пречника 6 mm – повећати запремину за веће бунарчиће). Потом у остале бунарчиће у истом реду пипетом одмјерити сличну запремину неразријеђене суспензије (1/1) тало га. Други ред се може користити као дупликат првог или за други узорак како је приказано у Шеми 6. 1.5.1.2. За остале суспензије талога Припремити децимална разрјеђења (1/10 и 1/100) ресуспен дованог талога у пуферу за талог. У један ред бунарчића пипе том одмјерити стандардну запремину ресуспендованог талога и сваког разрјеђења (15 μl је довољно за бунарчиће пречника 6 mm – повећати запремину за веће). Други ред се може користити као дупликат првог или за други узорак као што је приказано у Шеми 7. 1.5.2. Оставити да се капљице осуше на собној температури или их загријевати до температуре од 40 °C до 45 °C. Ћелије бак терија фиксирати на IF плочицу загријавањем (15 минута на 60 °C), провлачењем кроз пламен, 95% етанолом или према посебним упутствима произвођача антитијела. Уколико је то неопходно, фиксиране плочице се могу чувати замрзнуте у десикатору у краћем временском интервалу (највише до три мjесеца). 1.5.3. IF поступак 1.5.3.1. У складу са поступком за припрему плочица за тести рање како је описано у 1.5.1.1 Припремити двоструки низ разрјеђења антитијела у IF пуферу. Први бунарчић мора имати 1/2 титра (Т/2), а остали 1/4 титра (Т/4), 1/2 титра (Т/2), титар (Т) и двоструки титар (2Т). 1.5.3.2. У складу с поступком за припрему плочица за тестира ње како је описано у 1.5.1.2. Припремити радно разрјеђење антитијела у IF пуферу. Радно разрјеђење утиче на специфичност. Шема 7. Припрема плочица у складу са 1.5.1.2. и 1.5.3.2. Поредати плочице на навлажени упијајући папир. Сваки бу нарчић потпуно испунити разрјеђењем антитијела. Запремина ан титијела мора бити једнака запремини нанесеног екстракта. Уколико не постоје посебна упутства произвођача антитијела, слиједити сљедећу процедуру: Инкубирати прекривене плочице на влажном папиру 30 мину та на собној температури (18 °C до 25 °C). Капљице са сваке плочице отрести и плочице пажљиво испра ти IF пуфером. Потопити плочице у IF пуфер-Тwееn па у IF пуфер, у трајању од по 5 минута. Спријечити стварање аеросола или пре нос капљица јер би могло доћи до унакрсне контаминације узора ка. Плочице пажљиво осушити упијајућим папиром. Поредати плочице на навлажени упијајући папир. Бунарчиће попунити разријеђеним FITC конјугатом који се користи за одре ђивање титра. Запремина конјугата нанесеног на бунарчић мора бити једнака запремини нанесеног антитијела. Инкубирати покривене плочице на влажном папиру, 30 минута на собној температури (18 °C до 25 °C). Отрести капљице конјугата са плочица. Испрати и опрати пло чице како је претходно описано. Плочице пажљиво осушити. На сваки бунарчић пипетом нанијети од 5 μl до 10 μl 0,1М гли церола с фосфатним пуфером или комерцијално доступно сред ство против избљеђивања и ставити покровно стакло. 1.5.4. Очитавање IF теста Прегледати припремљене плочице под епифлуоресцентним микроскопом с одговарајућим филтерима за ексцитацију FITC-а, под уљном или воденом имерзијом и увећањем од 500 до 1.000 пута. Прегледати сваки бунарчић уздуж и попријеко, под правим углом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. Прво треба прегледати плочицу с позитивном контролом. Ће лије морају бити изразито флуоресцентне и потпуно обојене на утврђеном титру антитијела или радног разрјеђења. У случају да код обојености дође до одступања, IF тест се мора поновити (По главље VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога). Утврдити да ли јасно флуоресцентне ћелије које се уоча вају у бунарчићима имају морфологију карактеристичну за R. solanacearum. Интензитет флуоресценције мора бити једнак или бољи од оног који даје позитивни контролни изолат, при једнаком разрjе ђењу антитијела. Занемарити непотпуно обојене или слабо флуо ресцентне ћелије. Уколико се посумња на контаминацију, тест се мора поновити [нпр. ако због контаминације пуфера све плочице у серији показују 18 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. позитивне ћелије или ако су позитивне ћелије пронађене (изван бунарчића) на површини плочице]. Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу теста имунофлуоресценције. У концентрованом екстракту издвојених конуса пупчаних делова кртоле или делова стабљике увијек се очекује и присуство популација флуоресцентних ћелија са нети пичном морфологијом или унакрсна реакција са сапрофитним бак теријама сличне величине и грађе као R. solanacearum. Приликом очитавања у обзир се узимају само флуоресцентне ћелије типичне величине и морфологије у титру или радном ра зрјеђењу антитијела. Тумачење очитавања IF теста Уколико се утврди присуство јасно флуоресцентних ћелија карактеристичне морфологије, одредити просјечан број типичних ћелија по микроскопском видном пољу и израчунати број типич них ћелија по ml ресуспендованог талога (Поглавље XIII овог при лога). Очитавање IF теста је позитивно за узорке који имају најмање 5 ∙ 103 типичних ћелија по ml ресуспендованог талога. Овакав узо рак се сматра потенцијално контаминираним и потребно је извр шити даље тестирање. Очитавање IF теста је негативно за узорке који имају мање од 5 ∙ 103 ћелија по ml ресуспендованог талога и узорак се сматра не гативним. Није потребно даље тестирање. 1.6. PCR тест Начела Када се употребом PCR теста као првог теста провjере добије позитиван резултат, IF тест или изолација на подлогу се користе као други обавезни тест провjере. Ако се коришћењем PCR теста као другог теста провjере добије позитиван резултат, за поста вљање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање према дијаграму тока. Коришћење ове методе као главног теста провjере препоручује се само уколико је доступна специјализована експертиза. Напомена Прелиминарна тестирања примјеном ове методе треба да омогуће поновљиву детекцију најмање 103 до 104 ћелија R. solanacearum по ml, које су додате екстракту узорка претходно до казаног као негативног. За постизање највећег степена осјетљивости и специфичности у свим лабораторијима потребно је извођење огледа за стандар дизацију (оптимизацију) методе. Користити потврђене и одобрене реагенсе и протоколе за PCR (Поглавље XIV овог прилога). По жељно је одабрати метод са интерном контролом. Предузети од говарајуће мјере опреза да би се избјегла контаминација узорка циљном ДНК. PCR тест треба да обављају искусни стручњаци, у специјализованим лабораторијима за молекуларну биологију. Негативне контроле (за екстракцију ДНК и PCR поступак) тре ба увијек у поступку обрадити посљедње да би се утврдило да ли је евентуално дошло до било каквог преношења ДНК. У PCR тест укључити сљедеће негативне контроле: екстракт узорка у коме претходно током тестирања није дока зано присуство R. solanacearum, пуфер коришћен за екстракцију бактерије и ДНК из узорка, PCR реакциони микс. У PCR тест укључити сљедеће позитивне контроле: 10. аликвоте ресуспендованих талога у које је додата бактерија R. solanacearum (за припрему видјети Поглавље XI тачка 2. овог прилога), 11. суспензију од 106 ћелија по ml вирулентног изолата R. solanacearum у води (нпр. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; видjети 12. ако је могуће, у PCR тесту користити и ДНК екстраховану из позитивних контролних узорака. Да би се избjегла могућа контаминација, позитивне контроле припремити просторно одвојено од узорака за тестирање. С обзиром на то да примјена PCR протокола захтијева ко ришћење екстракта узорака са што мање земље, прије почетка про цедуре извођења теста, узорке кромпира је пожељно добро опрати. У поглављу XI овог прилога наведени су стандардизовани по зитивни и негативни контролни материјали који се могу користити у овим тестовима. 1.6.1. Методе пречишћавања ДНК Позитивну и негативну контролу користити како је претходно описано (видјети у Поглављу XI овог прилога). Контролни мате ријал припремити на исти начин као и узорке. Доступне су различите методе пречишћавања циљане ДНК из комплексних супстрата узорка у циљу уклањања инхибитора PCR реакције и других ензимских реакција и методе концентровања циљане ДНК у екстракту узорка. Метода која слиједи је стандардизована за коришћење са по тврђеном и одобреном PCR методом у Поглављу XIV овог прилога. 1.6.1.1. Метода према Pastriku (2000) Пипетом одмjерити 220 μl лизис пуфера (100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl [пХ 8], 1 mM EDTA [pH 8]) у Eppendorf тубу од 1,5 ml. Додати 100 μl екстракта узорка и ставити у термоблок или во дено купатило на 95 °C 10 минута. Ставити тубу на лед у трајању од пет минута. Додати 80 μl основног шток раствора Lysozyme (50 mg лизози ма по ml у 10 mm Тris HCl, pH 8) и инкубирати 30 минута на 37 °C. Додати 220 μl раствора Easy DNA® А (Invitrogen), добро измиjешати на вортексу и инкубирати 30 минута на 65 °C. Додати 100 μl раствора EasyDNA® Б (Invitrogen) и снажно измиjешати на вортексу до постизања униформног вискозитета узорка. Додати 500 μl хлороформа, измијешати на вортексу док се ви скозитет не умањи и смјеса постане хомогена. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 °C да се подијеле фазе и створи међуфаза. Пренети горњу фазу у нову Eppendorf тубу. Додати 1 ml 100% етанола (-20 °C), кратко промијешати на вортексу и инкубирати на леду 10 минута. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 °C и уклонити етанол од талога. Додати 500 μl 80% етанола (-20 °C) и промијешати окретањем тубе. Центрифугирати на 15.000 g 10 минута на 4 °C сачувати талог, а уклонити етанол. Оставити талог да се суши на ваздуху или у вакуумској цен трифуги (DNA speed vac). Ресуспендовати талог у 100 μl стерилне ултрачисте воде и оставити на собној температури најмање 20 минута. Чувати на -20 °C до извођења PCR-а. Било који бијели талог издвојити центрифугирањем и за PCR употријебити 5 μl супернатанта који садржи ДНК. 1.6.1.2. Друге методе За екстракцију ДНК могу се примијенити и друге методе (нпр. Qiаgеn DNеаsy Plant Kit), уколико је доказана еквивалентност у прочишћавању ДНК из контролних узорака који садрже 103 до 104 патогених ћелија по ml. 1.6.2. PCR Припремити узорке за тестирање и контролне узорке за PCR према одобреним протоколима (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.6. овог прилога). Припремити разрјеђење екстракта ДНК из узор ка 1 : 10 у ултрачистој води. У неконтаминираном простору припремити одговарајући ре акциони микс за PCR према објављеним протоколима (Поглавље XIV овог прилога). Одобрени PCR протокол је мултиплекс реак ција која такође укључује унутрашњу PCR контролу. Према протоколу за PCR, додати 5 μl екстракта ДНК на 25 μl реакционог микса у стерилне епрувете за PCR. Укључити и негативну контролу која садржи само PCR реак циони микс, а умјесто узорка додати исти извор ултрачисте воде који је коришћен за припрему PCR реакционог микса. Ставити епрувете у уређај за PCR (thermal cycler) и покренути стандардизовани PCR програм. 1.6.3. Анализа PCR продуката Умножене PCR продукте раздвојити електрофорезом у агаро зном гелу. У сваки бунарчић 2% (v/v) агарозног гела у трис-ацетат EDTA пуферу (ТАЕ), (Поглавље XIV овог прилога) нанијети нај мање 12 μl ампликона ДНК из сваког узорка, помијешане с 3 μl боје и пропустити уз напон од 5 до 8 В по cm. Употријебити одго варајући ДНК маркер, нпр. 100 bp marker (100 bp ladder). Обојити електрофоретске траке ДНК у гелу потапањем гела у етидиум бромид (0,5 mg/l) у трајању од 30 до 60 минута. Предузети одговарајуће мјере опреза при раду са овим мутагеном. Обојени гел прегледати на краткоталасном УВ трансилумина тору (нпр. λ = 302 nm) и потражити умножене фрагменте очекива не дужине и документовати их. Приликом сваког новог налаза/случаја провјерити аутентич ност умноженог PCR продукта извођењем анализе уз помоћ ре 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 19 стрикционих ензима на узорку преостале умножене ДНК, и то инкубацијом при оптималној температури и у оптималном вре мену с одговарајућим ензимом и пуфером. Настале фрагменте раздвојити електрофорезом у агарозном гелу како је претходно наведено и послије бојења етидиум бромидом на УВ трансилу минатору посматрати карактеристичну матрицу (образац) рестри кционих фрагмената и упоредити је с позитивном контролом прије и послије раздвајања. Тумачење резултата PCR теста PCR тест је негативан ако у тестираном узорку није видљив PCR продукт очекиване дужине који је специфичан за R. solanacearum, али је видљив у свим позитивним контролним узор цима (код мултиплекс PCR-а с прајмерима за унутрашњу контролу који су специфични за биљку домаћина: у тестираном узорку се мора умножити други продукт PCR-а очекиване величине). PCR тест је позитиван ако је видљив PCR продукт који је спе цифичан за R. solanacearum и који је очекиване дужине и рестри кционог обрасца, под условом да није умножен ни у једном узорку која представља негативну контролу. Поуздана потврда позити вног резултата представља и успјешно понављање теста с другим паром PCR прајмера (Поглавље XIV овог прилога). Напомена Уколико се очекивани фрагмент (позитивна реакција) добије у узорку позитивне контроле која садржи R. solanacearum у води, а негативни резултат добије у узорку позитивне контроле која садр жи R. solanacearum у екстракту кромпира, претпоставља се да је дошло до инхибиције PCR реакције. У мултиплекс PCR протоко лима који се изводе употребом унутрашњих PCR контрола, сматра се да је дошло до инхибиције реакције ако није добијен ниједан од два продукта. Такође, ако се из једне или више негативних контрола добије очекивани продукт, може се сумњати да је дошло до контамина ције. 1.7. FISH тест Начело Када се FISH тест као први тест провjере и ако се њиме до бије позитиван резултат, мора се спровести IF тест или изолација као други обавезни тест провjере. Ако се FISH тест користи као други тест провјере и ако се њиме добије позитиван резултат, за постављање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање пре ма дијаграму тока. Напомена Користити потврђене и одобрене олиго-пробе специфичне за бактерију R. solanacearum (Поглавље XV овог прилога). Прели минарна тестирања примјеном ове методе треба да омогуће поно вљиву детекцију најмање 103 до 104 ћелија R. solanacearum по ml додатих екстракту узорка претходно доказаног као негативног. Поступак треба извршити на свеже припремљеним екстракти ма узорака, али се успјешно може примијенити и на екстракт узор ка који је био чуван са глицеролом на температури од -16 °C до -24 °C или од -68 °C до -86 °C. За негативну контролу употријебити дијелове екстракта узо рака који су у ранијем тестирању на R. solanacearum доказани као негативни. За позитивну контролу припремити суспензије које садр же 105 до 106 ћелија/ml 0,01 М фосфатног пуфера (ПБ) бакте рије R. solanacearum биовар 2 (нпр. сој NCPPB4156 = PD 2762 = CFBP3857; видјети Додатак 3) из културе старе од три до пет дана. Припремити одвојене плочице за позитивну контролу са хо мологим или неким другим референтним изолатом бактерије R. solanacearum, раствореним у екстракту кромпира, као што је наве дено у Поглављу XI тачка 2. овог прилога. Коришћење еубактеријске олиго-пробе обиљежене FITC-om омогућава контролу процеса хибридизације јер ће се обојити све еубактерије присутне у узорку. У Поглављу XI тачка 1. овог прилога наведени су стандарди зирани позитивни и негативни контролни материјали који се могу употребљавати у овом тесту. Контролни материјал тестирати примjеном исте процедуре као и узорке. 1.7.1. Фиксирање екстракта кромпира Сљедећи протокол се заснива на процедури Wullingsi сар., (1998): Припремити раствор за фиксирање (Поглавље XV овог при лога). Пипетом одмерити 100 μl екстракта сваког узорка у Eppendorf епрувету па центрифугирати 7 минута на 7.000 g. Уклонити супернатант и растворити талог у 200 μl фиксатива припремљеног највише 24 сата раније, промијешати и инкубирати један сат у фрижидеру. Алтернативни фиксатив је 96% етанол. При томе је потребно растворити талог из корака 5.1.2 у 50 μl 0,01 М ПБ и 50 μl 96% етанола, промијешати и инкубирати на 4 °C, 30 до 60 минута. Центрифугирати 7 минута на 7.000 g, уклонити супернатант и ресуспендовати талог у 75 μl 0,01 М ПБ. У бунарчиће чистих плочица нанијети 16 μl фиксираних су спензија како је приказано у Шеми 8. На сваку плочицу нанијети два различита, неразријеђена узорка и употријебити 10 μl за при премање разрјеђења 1 : 100 (у 0,01 М ПБ). Преостали фиксирани раствор узорка (49 μl) чувати на -20 °C Послије додавања једнаке запремине 96% етанола. Ако FISH тест треба поновити, центри фугирањем уклонити етанол и додати једнаку запремину 0,01 ПБ (уз мешање). Шема 8. Приказ плочице за FISH тест Плочице осушити на ваздуху (или у сушници на 37 °C) па их фиксирати провлачењем кроз пламен. На овом кораку се може пре кинути поступак и наставити сљедећи дан. Плочице треба чувати на собној температури у сувом простору без прашине. 1.7.2. Хибридизација Дехидратацију ћелија извршити узастопним потапањем пло чица у 50%, 80% и 90% етанол, у трајању од по једног минута. Плочице поставити на држач и осушити на ваздуху. Припремити влажну комору за инкубацију тако што се дно херметички затворене кутије прекрива упијајућим или филтер папиром потопљеним у 1 h xubmix (Поглавље XV овог прилога). Кутију претходно инкубирати у апарату за хибридизацију нукле инских киселина на 45°C најмање 10 минута. Нанесите по 10 μl хибридизованог раствора у осам бунарчића (бунарчићи 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10; видети Шему 7) сваке плочице, а два средња бунарчића (3 и 8) оставити празне. Прва и задња четири бунарчића покрити покровним стакалцем (24 mm ∙ 24 mm), пазећи притоме да у бунарчићима не остане ва здух. Ставити плочицу у претходно загријану влажну комору и хи бридизовати пет сати у апарату за хибридизацију на 45 °C, у тами. Припремити три посуде са 1 l ултрачисте воде, 1 L 1 ∙ hubmix (334 ml 3 ∙ hubmix и 666 ml ултрачисте воде) и 1 L 1/8 ∙ hubmix (42 ml 3 ∙ hubmix и 958 ml ултрачисте воде). Сваку посуду претходно инкубирати у воденом купатилу на 45 °C. Скинути покровна стакалца, а предметне плочице ставити на држач. Вишак пробе уклонити инкубирањем у трајању од 15 минута на 45 °C у посуди с 1 ∙ hubmix. Пренијети држач плочица у раствор за прање (1/8 ∙ hubmix) и инкубирати још 15 минута. Плочице накратко уронити у ултрачисту воду и ставити на филтер-папир. Вишак влаге уклонити филтер-папиром. У сваки бунарчић пипетом наниjети 5 μl до 10 μl заштитног раствора про тив изблеђивања (нпр. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, УСА или еквивалентна) па цијелу предметну плочицу покрити великим по кровним стаклом (24 mm ∙ 60 mm). 1.7.3. Очитавање FISH теста Плочице прегледати под епифлуоресцентним микроскопом, коришћењем уљане имерзије, с увећањем 630 или 1.000 puta. Са филтером прикладним за флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC), еубактеријске ћелије (укључујући већину грам-негативних ћелија) се у узорку виде као флуоресцентно зелене. Употребом филтера за тетраметилродамин-5-изотиоцијанат, ћелије R. solanacearum, обојене са Cu3, виде се као флуоресцентно црвене. Упоредити морфологију ћелија узорка с морфологијом ћелија позитивних контрола. Ћелије морају бити јасно флоуресцентне и у потпуности обојене. Ако дође до одступања у обојености, FISH тест (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога) мора се поновити. Пре гледати сваки бунарчић уздуж и попријеко под нормалним углом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. 20 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. Уочити да ли су видљиве јасно флуоресцентне ћелије у бунар чићима морфологије карактеристичне за R. solanacearum. Интензитет флуоресценције мора бити једнак или јачи него код позитивне контроле. Ћелије које нису у потпуности обојене или су слабе флуоресценције не узимају се у обзир. Уколико постоји сумња да је дошло до контаминације, тест се мора поновити (нпр. све плочице у серији због контаминације пу фера показују позитивне ћелије или су позитивне ћелије пронађене изван бунарчића, на површини плочице). Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу FISH теста. У концентрованом екстракту издвојених конуса пупчаних дијелова кртоле или стабљике увијек се очекује и присуство попу лација флуоресцентних ћелија са нетипичном морфологијом или унакрсна реакција са сапрофитним бактеријама сличне величине и грађе као R. solanacearum, мада знатно рјеђе него код IF теста. У обзир се узимају само флуоресцентне ћелије типичне вели чине и морфологије. Тумачење резултата FISH теста Резултати FISH теста сматрају се важећим ако се у свим пози тивним и ни у једној негативној контроли примјеном FISH филтра уочава присуство јасно зелених флуоресцентних ћелија чија је ве личина и морфологија типична за R. solanacearum и ако се при мјеном филтера за родамин уочавају јасне црвене флуоресцентне ћелије. Ако се уоче јасне ћелије карактеристичне морфологије, одредити просјечни број типичних флуоресцентних ћелија по ми кроскопском видном пољу и израчунати број типичних ћелија по милилитру ресуспендованог талога. Потенцијално позитивним се сматрају узорци са најмање 5 ∙ 103 типичних ћелија по ml ре суспендованог талога и потребна су им даља тестирања. Негатив ним се сматрају узорци с мање од 5 ∙ 103 типичних ћелија по ml ресуспендованог талога. FISH тест је негативан ако се примјеном филтера за родамин не уоче снажно флуоресцентне црвене ћелије чија је величина и морфологија типична за R. solanacearum, под условом да се при мјеном филтера за родамин уоче типичне изразито флуоресцентне црвене ћелије у препаратима позитивне контроле. 1.8. ELISA тестови Начело Због релативно ниске осјетљивости, ELISA се може примије нити само као необавезни додатни тест поред IF, PCR или FISH тестова. Ако се примјењује DAS ELISA, обавезно је претходно обогаћивање екстракта и употреба моноклоналних антитијела. Обогаћивање узорака прије примјене ELISA теста може бити корисно јер се на тај начин повећава осјетљивост теста, али може бити и неуспјешно због компетиције осталих организама у узорку. Напомена Користити потврђени и одобрени извор антитијела за R. solanacearum. Препоручљиво је да се титар одреди за сваку нову серију анти тијела. Титар се дефинише као највеће разрјеђење код којег долази до оптималне реакције при тестирању суспензије која садржи 105 до 106 ћелија/ml хомологног соја бактерије R. solanacearum уз ко ришћење одговарајућих конјугата секундарних антитијела према препорукама произвођача. Током тестирања, треба користити ан титијела у радним разрјеђењима која су близу или једнака титру формулације доступне на тржишту. Одредити титар антитијела на суспензији од 105 до 106 ћелија по ml хомологног соја бактерије R. solanacearum. За негативну контролу користити екстракт узорка који је у ра нијем тестирању на R. solanacearum био негативан и суспензију бактерије, с којом не долази до унакрсне реакције, у фосфатном пуферу с додатком соли (PBS). За позитивну контролу користити аликвоте екстракта узорка који је у ранијем тестирању био негативан, помијешане са 103 до 104 ћелија/ml бактерије R. solanacearum биовар 2 (нпр. сој NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). За упоређивање резултата на свакој микротитарској плочи користити стандардну суспензију од 105 до 106 ћелија/ml бактерије R. solanacearum у PBS-u. Побрините се да позитивне контроле на микротитарској плочи буду добро одвојене од узорака који се тестирају. У Поглављу XI тачка 1. овог прилога наведени су стандарди зовани позитивни и негативни контролни материјали који се могу употребљавати у овом тесту. Контролни материјал тестирати на исти начин као и узорке. Извршена је валидација два протокола за ELISA тест. 1.8.1. Индиректна ELISA (Robinson Smith и сар., 1995) Употријебити аликвоте од 100 μl до 200 μl екстракта узорка (у неким случајевима се загријавањем четири минута на 100 °C у воденом купатилу или блоку за загријавање могу смањити неспе цифични резултати). Додати једнаку запремину пуфера за облагање двоструке јачи не и промијешати на вортексу. Нанијети аликвоте од 100 μl у најмање два бунарчића на ми кротитарске плоче (нпр. Nunc-Polusort или еквивалентна) и инку бирати један сат на 37 °C или преко ноћи на 4 °C. Уклонити екстракт из бунарчића. Испрати бунарчиће три пута раствором PBS-Tween, а посљедњи раствор за испирање оставити у бунарчићима најмање пет минута. Припремити одговарајуће разрјеђење антитијела за R. solanacearum у пуферу за блокирање. За потврђена и одобрена антитијела која су доступна на тржишту користити препоручена разрјеђења (обично двострука концентрација титра). Додати 100 μl у сваки бунарчић и инкубирати један сат на 37 °C. Уклонити раствор антитијела из бунарчића и испрати бунар чиће, три пута раствором PBS-Tween, а посљедњи раствор за испи рање оставити у бунарчићима најмање пет минута. Припремити одговарајуће разрјеђење секундарних антитијела – конјугата алкалне фосфатазе у пуферу за блокирање. Додати 100 μl у сваки бунарчић и инкубирати један сат на 37 °C. Уклонити конјугат антитијела из бунарчића и опрати бунар чиће, као што је претходно описано. У сваки бунарчић додати 100 μl раствора супстрата алкалне фосфатазе, инкубирати у тами на собној температури и очитати апсорпцију при 405 nm у интервалу од 90 минута. 1.8.2. DASI ELISA Припремити одговарајуће разрјеђење поликлоналних иму ноглобулина за бактерију R. solanacearum у пуферу за облагање pH 9,6 (Поглавље XII овог прилога). Нанијети 200 μl у сваки бу нарчић. Инкубирати четири до пет сати на 37 °C или 16 сати на 4 °C. Бунарчиће испрати три пута раствором PBS-Tween. У најмање два бунарчића нанијети 190 μl екстракта узорка. На свакој плочи додати позитивну и негативну контролу, и то сваку у по два бунарчића. Инкубирати 16 сати на 4 °C. Бунарчиће испрати три пута раствором PBS-Tween. Припремити одговарајуће разрјеђење моноклоналних анти тијела специфичних за бактерију R. solanacearum у PBS-u, који садржи и 0,5% говеђег серумског албумина (BCA), и нанијети 190 μl у сваки бунарчић. Инкубирати два сата на 37 °C. Бунарчиће испрати три пута раствором PBS-Tween. Припремити одговарајуће разрјеђење антимишијих имуногло булина конјугираних са алкалном фосфатазом у PBS- u. Нанијети 190 μl у сваки бунарчић. Инкубирати два сата на 37 °C. Бунарчиће испрати три пута раствором PBS-Tween. Припремити раствор супстрата алкалне фосфатазе која садр жи 1 mg п-нитрофенил фосфата по ml пуфера супстрата. Нанијети 200 μl у сваки бунарчић. Инкубирати у тами на собној температури и очитати апсорпцију при 405 nm у периоду од 90 минута. Тумачење резултата ELISA тестова ELISA тест је негативан ако је просјечна оптичка густина (ОD) у бунарчићима с дупликатом узорка < 2x ОD у бунарчићу с негативном контролом екстракта узорка, под условом да су све вриједности ОD позитивних контрола изнад 1 (након 90 минута инкубације са супстратом) и да су веће од двоструке вриједности ОD добијених за негативне екстракте узорка. ELISA тест је позитиван ако је просјечна оптичка густина (ОD) у бунарчићима с дупликатом узорка > 2x ОD у бунарчићу с негативном контролом екстракта узорка, под условом да су вријед ности ОD за све бунарчиће с негативном контролом < 2x ОD у бу нарчићима с позитивном контролом. Ако се у ELISA тесту очитају негативни резултати у бунар чићима са позитивном контролом, то указује да тест није правилно изведен или да је дошло до инхибиције. Ако се у ELISA тесту очи тају позитивни резултати у бунарчићима с негативном контролом, то указује да је дошло до унакрсне контаминације или до неспеци фичног везања антитијела. 1.9. Биолошки тест Напомена Прелиминарно тестирање овом методом треба да омогући поновљиво откривање присуства 103 до 104 CFU бактерије R. solanacearum по ml, додатих екстрактима узорака који су у ранијем тестирању били негативни (Поглавље XI овог прилога). 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 21 Највећа осјетљивост детекције може се очекивати ако се кори сте свјеже припремљени екстракти узорака и оптимални услови за раст и развој патогена. Међутим, ова метода може успjешно да се примиjени и употребом екстраката који су чувани са глицеролом на температури од -68 °C до -86 °C. Сљедећи протокол се заснива на Janse (1988) За сваки узорак користити 10 биљака осјетљиве сорте па радајза у фази трећег правог листа (нпр. Moneumaker или друге сорте за коју је утврђено у лабораторијским условима да је једна ке осjетљивости). Детаљи о гајењу биљака се налазе у Поглављу XVI овог прилога. За ову сврху може се употријебити и плави патлиџан (нпр. сорта Blalck Beaty или сорте једнаке осjетљиво сти), али само биљке у фази 2-3 листа до потпуног развоја трећег правог листа. Симптоми на плавом патлиџану су слабији и спо рије се развијају, па се препоручује коришћење младих биљака парадајза. Распоредити 100 μl екстракта узорка на биљке за тестирање. Инокулација инјекцијом Стабљике инокулисати непосредно изнад котиледона инјек цијом с танком иглом (не мањом од 23G). Узорак подијелити на биљке, тако да свака биљка добије одговарајућу количину. Инокулација зарезивањем Држећи биљку међу прстима, пипетом нанијети капљицу (око 5 μl do 10 μl) ресуспендованог талога на стабљику, и то између котиледона и првог листа. Стерилним скалпелом направити дија гонални рез, дуг око 1 cm и дубок око 2/3 дебљине стабљике, поче вши од нанесене капљице ресуспендованог талога. Чврсто затво рити рез стерилним вазелином из шприца. Позитивна контрола: користећи исту методу инокулисати 5 биљака суспензијом од 105 до 106 ћелија по ml воде познате култу ре R. solanacearum, вирулентног соја биовара 2. Негативна контрола: инокулисати 5 биљака, користећи стерил ни пелет пуфер (пуфер за растварање талога). Биљке за позитивне и негативне контроле одвојити од осталих биљака. Биљке гајити у карантинским просторијама до четири седми це на 25 °C до 30 °C, уз довољну количину свјетла и високу вла жност и адекватно заливати да би се спријечило накупљање воде или увенуће због недостатка воде. У циљу спречавања унакрсне контаминације, биљке позитивне и негативне контроле гајити на јасно одвојеним столовима у стакленику или полицама у комори за раст или, у случају да је простор ограничен, побринути се да су биљке јасно одвојене између појединих поступака у току изво ђења процедуре. Ако се биљке за различите узорке морају гајити близу једна другој, раздвојите их погодним платном. Пазити да не дође до унакрсне контаминације приликом прихрањивања, зали вања, прегледања и сваког другог поступка с биљкама. Од кључ не важности је да у стакленицима и коморама за гајење не буде никаквих инсеката јер они могу пренијети бактерију с узорка на узорак. Пратити појаву симптома увенућа, епинастије, хлорозе и/ или заостајање у порасту. Из заражених биљака изоловати (Поглавље IV тачка 1. подтач ка 1.3. овог прилога) и идентификовати пречишћене културе R. solanacearum (Поглавље VIII тачка 2. овог прилога). Ако се послије три недјеље не појаве симптоми, обавити IF/ PCR/изолацију на узорку дијелова стабљика дужине 1 cm са сваке биљке за тестирање. Ако тест буде позитиван, примијенити метод засејавања разрјеђења на хранљиву подлогу. Идентификовати све пречишћене културе R. solanacearum. Тумачење резултата биолошког теста Валидни резултати биолошког теста се добијају ако биљке у позитивној контроли показују типичне симптоме, ако се из тих биљака може поново издвојити бактерија и ако на биљкама нега тивне контроле не дође до појаве симптома. Биолошки тест је негативан ако тестиране биљке нису зара жене R. solanacearum, а под условом да је утврђено присуство R. solanacearum у позитивним контролама. Биолошки тест је позитиван ако су тестиране биљке заражене R. solanacearum. 2. Идентификациони тестови Идентификација чисте културе добијених изолата R. solanacearum врши се коришћењем најмање два од наведених те стова који се заснивају на различитим биолошким принципима. Према потреби, укључити познате референтне изолате за сваки тест (Поглавље XI овог прилога). 2.1. Одгајивачки и ензимски тестови за идентификацију Фенотипска својства универзално присутна или одсутна код бактерије R. solanacearum утврдити према методама Lelluomm и Stead (1987), Klement и сар. (1990), Schaad и сар. (2001). Тестови Очекивани резултати Стварање флуоресцентног пигмента Грануле поли-(3-хидроксибутирата + Оксидацијски/ферментацијски (О/F) тест 0+/F Активност каталазе + Тест оксидазе по Ковацу + Редукција нитрата + Коришћење цитрата + Раст на 40 °C Раст у 1% NaCI + Раст у 2% NaCl Активност аргинин-дихидролазе Разлагање желатина Хидролиза скроба Хидролиза ескулина Стварање левана 2.2. IF тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у IF пуферу. Припремити двострука разрјеђења раствора погодног антисе рума. Примијенити IF поступак (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.5. овог прилога). IF тест је позитиван ако је IF титар културе једнак титру пози тивне контроле. 2.3. ELISA тест Напомена При примјени само два теста идентификације, не примjењива ти други серолошки тест уз овај. Припремите суспензију од око 108 ћелија по ml у 1 ∙ PBS. Спровести одговарајући поступак ELISA са моноклоналним антитијелима специфичним за бактерију R. solanacearum. ELISA тест је позитиван ако је ELISA вриједност очитања кул туре једнака најмање половини вриједности позитивне контроле. 2.4. PCR тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у ул трачистој води. Загријати 100 μl суспензије ћелија бактерије у затвореним епруветама у термоблоку или у врелом воденом купатилу четири минута на 100 °C. До употребе узорци се могу чувати на -16 °C до -4 °C. Употријебити одговарајуће PCR процедуре за умножавање специфичних фрагмената R. solanacearum [нпр. Sea и сар. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik и сар. (2002), Boudazin и сар. (1999), Opina и сар. (1997), Weller и сар. (1999)]. Идентификација R. solanacearum је позитивна ако су PCR про дукти исте величине и имају исти полиморфизам дужине рестри кционих фрагмената као и позитивни контролни изолат. 2.5. FISH тест Припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml ултра чисте воде. Примијенити FISH поступак (Поглавље VIII тачка 1. подтачка 1.7. овог прилога) са најмање двије олиго-пробе специфичне за R. solanacearum (Поглавље XV овог прилога). FISH тест је позитиван ако су постигнуте реакције културе и позитивне контроле једнаке. 2.6. Профилирање масних киселина (FAP) Културу гајити на триптиказа-соја-агару (Oxoid) 48 сати на 28 °C. Примијенити одговарајући FAP поступак (Janse, 1991; Stead, 1992). FAP тест је позитиван ако је профил тестиране културе иден тичан профилу позитивне контроле. Присуство карактеристичних масних киселина: 14:0 3ОХ, 16:0 2ОХ, 16:1 2ОХ и 18:1 2ОХ, и од суство 16:0 3ОХ у великој мјери указују на Ralstonia sp. 2.7. Методе карактеризације соја Код сваког новог случаја изолације R. solanacearum, препору чује се обављање карактеризација соја, примјеном једне од сље дећих метода. 22 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. Према потреби, у сваки коришћени тест укључити познате ре ферентне сојеве. 2.7.1. Одређивање биовара R. solanacearum се дијели на биоваре на основу способности коришћења и/или оксидације три дисахарида и три хексозна алко хола (Hayward, 1964. и Hayward и сар., 1990). Хранљиве подлоге за одређивање биовара описане су у Поглављу X овог прилога. Тест се може успјешно обавити инокулисањем подлоге чистим културама изолата R. solanacearum и инкубирањем на 28 °C. Ако се подлога распореди у 96 стерилних бунарчића на одговарајућој плочи (200 μl по бунарчићу), у року од 72 сата може се уочити промјена боје од маслинастозелене до жуте, што означава позити ван резултат теста. Биовар 1 2 3 4 5 Коришћење: Малтоза - + + - + Лактоза - + + - + Д (+) целобиоза - + + - + Манитол - - + + + Сорбитол - - + + Дулцитол - - + + Биовар 2 се дијели на подфенотипове помоћу додатних тесто ва. Биовар 2А (проширен у целом свету) Биовар 2А (нађен у Чилеу и Колумбији) Биовар 2Т (нађен у тро пским подру чјима) Коришћење трехалозе - + + Коришћење мезо-инози тола + - + Коришћење Д-рибозе - - + Пектолитичка активност (1) слаба слаба висока 1 Видјети Lelliot и Stead (1987). 2.7.2. Геномски отисак прста Молекуларна диференцијација сојева у комплексу R. solanacearum може се постићи примјеном неколико метода, укљу чујући сљедеће: Анализа полиморфизма дужине рестрикционих фрагмената (RFLP), (Cook и сар., 1989). PCR понављајућих низова, коришћењем прајмера REP, BOX и ERIC (Louws и сар., 1995, Smith и сар., 1995). Анализа полиморфизма дужине умножених фрагмената (AFLP), (Van der Wolf и сар., 1998). 2.7.3. PCR методе Специфични PCR прајмери (Pastrik и сар., 2002; видети Погла вље XIV овог прилога) могу се употријебити за диференцијацију сојева који припадају групи 1 (биовари 3, 4 и 5) и групи 2 (биова ри 1, 2А и 2Т) бактерије R. solanacearum, како је првобитно било утврђено методом RFLP (Cook и сар., 1989) и секвенционирањем 16С рДНК (Taghavi и сар., 1996). 3. Тест потврде Тест провjере патогености се користи за коначно потврђивање присуства R. solanacearum и за процјену вирулентности култура идентификованих као R. solanacearum. Припремити инокулум од приближно 106 ћелија по ml из култура изолата који се тестира, старости 24 до 48 сати и одгова рајућег изолата позитивне контроле R. solanacearum (нпр. НЦППБ 4156 = ПД 2762 = ЦФБП 3857; Поглавље XI овог прилога). Инокулисати стабљике 5 до 10 младих сијанаца осјетљивих сорти парадајза или плавог патлиџана у фази 3 прва листа (Погла вље VIII тачка 1. подтачка 1.9. овог прилога). Инокулисане сејанце инкубирати до две недјеље на 25 °C до 28 °C уз високу релативну влажност и адекватно заливати да би се избјегло накупљање воде или стрес од суше. Код инокулације чистим културама, типично увенуће се поја вљује у року од 14 дана. Ако послије овог периода симптоми нису присутни, добијена култура се не може потврдити као патогени изолат R. solanacearum. Појаву симптома увенућа и/или епинастије, хлорозе и зао стајања у порасту. Изолацију из биљака са симптомима извршити одстрањи вањем дијела стабљике дужине 2 cm изнад мјеста инокулације који се затим уситни и раствори у малој количини стерилне дес тиловане воде или 50 mm фосфатном пуферу (Поглавље XII овог прилога). Изолација патогена се потом врши размазом добијеног мацерата на одговарајућу селективну подлогу (Поглавље X овог прилога), која се инкубира 48 до 72 сата на 28 °C. Послије чега се прати раст колонија типичних за бактерију R. solanacearum. Поглавље IX - Лабораторије укључене у оптимизацију и вали дацију протокола Лабораторија Мјесто Држава Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit Беч и Линц Аустрија Departement Gewasbescherming Merelbeke Белгија Plantedirektoratet Lyngby Данска Central Science Laboratory York Енглеска Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Шкотска Laboratoire national de la protection des vegetaux, unite de Angers Француска Laboratoire national de la protection des vegetaux, Station de quarantaine de la pomme de terre Le Rheu Француска Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Њемачка Pfl anzenschutzamt Hannover Hannover Њемачка State Laboratory Dublin Ирска Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali Bologna Италија Regione Veneto Unit – Periferica per i Servizi Fitosanitari Verona Италија Nederlandse Algemene Keuringsdienst Emmeloord Холандија Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Холандија Direccao-Geral de Proteccao das Culturas Lisabon Португал Centro Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Шпанија Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Instituto Шпанија Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala Шведска Поглавље X - Храњиве подлоге за изолацију и гајење бакте рије R. solanacearum 1. Опште хранљиве подлоге 1.1. Хранљиви агар (NА) Хранљиви агар (Difco) 23 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 1.2. Агар са квасцем, пептоном и глукозом (YPGA) Екстракт квасца (Difco) 5 g Bacto pepton (Difco) 5 g Д(+) глукоза (монохидрат) 10 g Agar Bacto (Difco) 15 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 1.3. Агар са сахарозом и пептоном (СПА) Сахароза 20 g Bacto pepton (Difco) 5 g К2ХПО4 0,5 g МгСО4 7Х2О 0,25 g Agar Bacto (Difco) 15 g Дестилована вода 1 l pH 7,2-7,4 Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 23 1.4. Келманова тетразолиум-подлога Kасамино киселине (Difco) 1 g Bacto pepton (Difco) 10 g Декстроза 5 g Agar Bacto (Difco) 15 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Охладити на 50 °C и додати раствор 2,3,5-трифенил-тетразо лиум-хлорида (Сигма), стерилисаног филтрирањем, како би се до била коначна концентрација од 50 mg/l. 2. Потврђене и одобрене селективне хранљиве подлоге SMSA подлога (Englebrecht, 1994, измjене према Elphinstone и сар., 1996) Основна подлога Цасамино киселине (Difco) 1 g Bacto pepton (Difco) 10 g Глицерол 5 ml Agar Bacto (Difco), (види напомену 2) 15 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Охладите на 50 °C и додајте основни водени раствор сљедећих састојака, стерилисан филтрирањем, да бисте добили предвиђене коначне концентрације: Кристал виолет (Сигма) 5 mg на l Полимиксин-Б-сулфат (Сигма П-1004) 600 000 У (око 100 mg) на l Бацитрацин (Сигма Б-0125) 1 250 У (око 25 mg) на L Хлорамфеникол (Сигма Ц-3175) 5 mg на L Пеницилин-Г (Сигма П-3032) 825 У (око 0,5 mg) на L 2,3,5-трифенил-тетразолиум-хлорид (Сигма) 50 mg на L Напомена Други реагенси у односу на горенаведене могу утицати на раст бактерије R. solanacearum. Умјесто Agara Bacto (Difco) може се користити Agar Oxoid бр. 1. Раст R. solanacearum је у том случају спорији, али се може умањити и раст конкурентних сапрофита. За формирање типичних колонија бактерије R. solanacearum можда ће требати 1 до 2 дана више, а црвено обојење може бити свјетлије и дифузније, него на Agaru Bacto. Повећањем концентрације бацитрацина на 2500 У/l умањује се пораст популације конкурентних бактерија, без утицаја на раст бактерије R. solanacearum. Храњиву подлогу и основни раствор антибиотика чувати на 4 °C на тамном мјесту и употријебити у року од мјесец дана. Прије употребе, са подлога се уклања површинска конденза ција. Подлоге се не смију претјерано осушити. Након припремања сваке нове серије хранљиве подлоге, тре ба обавити контролу квалитета подлоге засијавањем суспензије референтне културе R. solanacearum (Поглавље XI овог прилога) и праћењем стварања типичних колонија послије два до пет дана инкубације на 28 °C. 3. Потврђене и одобрене хранљиве подлоге за обогаћивање SMSA течна подлога (Elphinstone и сар., 1996) Припремити као за селективну подлогу SMSA, али изоставити Agar Bacto и 2,3,5-трифенил-тетразол-хлорид. Модификована Wilbrink течна подлога (Caruso и сар., 2002) Сахароза 10 g Протеоза пептон 5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,25 g NaNO3 0,25 g Дестилована вода 1 l Стерилизовати у аутоклаву на 121 °C 15 минута и охладити на 50 °C. Додати основни раствор антибиотика као за SMSA течну по длогу. Поглавље XI - Стандардизовани контролни материјали 1. Стандардизовани контролни материјали доступни на тржи шту Бактеријски изолати Препоручује се коришћење сљедећих бактеријских изолата као стандардног референтног материјала било за позитивне кон троле (Табела 1) или током оптимизације тестова у циљу избје гавања унакрсних реакција (Табела 2). Сви су сојеви доступни на тржишту и могу се набавити код: 1) National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory,York, UK, 2) Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Holandija, Collection francaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA – Station de 3) phytobacteriologie, Angers, Francuska. Табела 1. SMT попис референтних изолата бактерије R. solanacearum Ознака NCPPB Број. SMT Остале ознаке Држава по ријекла Био вар NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Египат 2 NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Турска 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Енглеска 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Кипар 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Шведска 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Белгија 2 NCPPB 4156* 71 * PD 2762, CFBP 3857 Холандија 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Француска 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS55 Португал 2 NCPPB 4160 69 IVIA –1632-2 Шпанија 2 NCPPB 4161 76 B3B Њемачка 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 САД 1 NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Костарика 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Колумбија 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Перу 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Бразил 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Перу 3 NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a Аустралија 3 NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Шри Ланка 4 NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Филипини 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Кина 5 * Употребљавати као стандардни референтни сој бактерије R. solanacearum биовар 2 (раса 3). Напомена Аутентичност горенаведених сојева може се гарантовати само ако су набављени из аутентичне збирке култура. 24 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. Табела 2. SMT попис референтних серолошки или генетски сродних бактерија за употребу при оптимизацији тестова детек ције Ознака NCPPB Број SMT Остале ознаке Идентификација NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa (1) NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis (1) NCPPB 4164 – CFBP 2227 Burkholderia cepacia (2) NCPPB 4165 – CFBP 2459 Ralstonia pickettii (2) NCPPB 4166 58 CFBP 3567 CSL Pr1150 Ralstonia pickettii (1) NCPPB 4167 60 CFBP 4618 PD 2778 Ralstonia sp. (1) NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis (1) NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli (1) NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1) NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1) NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1) NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) NCPPB 4168 61 CFBP 4619 IPO S339 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4170 63 CFBP 4621 IPO S306 Ochrobactrum anthropi (1) (2) NCPPB 4171 64 CFBP 4622 IPO 1693 Curtobacterium sp. (1) (2) NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp. (1) NCPPB 4173 – PD 2318 Aureobacterium sp. (2) NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. (1) (2) 1 Сој који у серолошким тестовима (IF и/или ELISA) може унакрсно реаговати са поликлоналним серумима. (2) Сој од кога се у неким лабораторијима може умножити PCR продукт дужине сличне дужини која се очекује при употреби специфичних прајмера OLI -1 и Y-2 (Поглавље XIV овог прилога). (3) У већини тестова би могао дати унакрсну реакцију, али је познато да се јавља само на бананама у Индонезији. Дољенаведени стандардни контролни материјал може се доби ти из збирке култура NCPPB. Лиофилизоване грануле екстракта кромпира из 200 здравих кртола кромпира као негативна контрола за све тестове. Лиофилизоване грануле екстракта кромпира из 200 здравих кртола кромпира са 103 до 104 и 104 до 106 ћелија R. solanacearum биовар 2 (сој NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) као позитивна контрола за серолошке и PCR тестове. С обзиром да лиофилиза ција утиче на виталност ћелија, оне нису прикладне као стандард на контрола за изолацију или биолошке тестове. Формалином фиксиране суспензије бактерије R. solanacearum биовар 2 (сој NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) са 106 ћелија/ml као позитивна контрола за серолошке тестове. 2. Припрема позитивних и негативних контрола за основне те стове провjере (PCR/IF и FISH ) Направити суспензију културе вирулентног соја R. solanacearum раса 3 / биовар 2 (нпр. сој NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) гајене 48 сати на SMSA основној подлози у 10 mm фосфатном пуферу концентрације приближно 2 ∙ 108 cfu/ml. То је обично слабо мутна суспензија оптичке густине 0,15 на 600 nm. Извадити конус пупчаног дијела из 200 кртола бијеле сор те кромпира за које је познато да нису заражене бактеријом R. solanacearum. Обрадити конусе уобичајеном методом и ресуспендовати та лог у 10 ml. Припремити 10 стерилних микроепрувета од 1,5 ml са 900 μl ресуспендованог талога. У прву микроепрувету додати 100 μl суспензије R. solanacearum и измијешати на вортексу. У сљедећих пет микроепрувета припре мити децимална разрјеђења бактеријске суспензије. Ових шест микроепрувета са зараженим екстрактом користи ти за позитивну, а четири микроепрувете са незараженим екстрак том користити за негативну контролу. У складу с тим, означити микроепрувете. У микроепруветама од 1,5 ml припремити аликвоте од 100 μl тако да се добије девет копија сваког контролног узорка. До упо требе чувати на -16 °C до -24 °C. Присуство и количину присутне R. solanacearum у контролним узорцима прво потврдити IF тестом. За PCR тест извршити екстракцију ДНК у позитивним и нега тивним контролним узорцима за сваку серију узорака за тестирање. За IF и FISH тестове извршити тестирање позитивних и нега тивних контролних узорака за сваку серију узорака за тестирање. Код IF, FISH и PCR тестова потребно је утврдити присуство R. solanacearum у концентрацији од најмање 103 и 104 ћелија/ ml код позитивних контрола и ни у једној негативној контроли. Поглавље XII - Пуфери за тест процедуре Стерилисани пуфери који нису отварани могу се чувати до го дину дана. 1. Пуфери за екстракцију 1.1. Екстракциони пуфер (50 mm фо сфатни пуфер, pH 7) Овај пуфер се користи за екстракцију бактерије из биљног тки ва хомогенизацијом или тресењем. Na2HPO4 (анхидровани) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Сљедећи састојци могу бити корисни: Напомена Количина по литру Pahuljice Lubrol Дефлокулант (*) 0,5 g DC силикон против пјењења Средство против пјењења (*) 1 ml Tetranatrijev pirofosfat Антиоскиданс 1 g Polivinilpirolidon 40000 (PVP-40) Везање PCR инхиби тора 50 g * За употребу код методе екстракције хомогенизацијом. 1.2. Пелет пуфер (пуфер за растварање талога – 10 mm фосфат ни пуфер, pH 7,2) Овај пуфер се користи за ресуспендовање и разрјеђивање екс тракта конуса извађених из пупчаних дијелова кртола кромпира, послије концентровања талога центрифугирањем. Na2HPO4 ∙ 12H2O 2,7 g NaH2PO4 ∙ 2H2O 0,4 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 12ГС 15 минута. 2. Пуфери за IF тест 2.1. IF пуфер [10 mm фосфатни пуфер с додатком соли (PBS), pH 7,2] Овај пуфер се користи за разрјеђивање антитијела. Na2HPO4 ∙ 12H2O 2,7 g NaH2PO4 ∙ 2H2O 0,4 g NaCl 8 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 ˚С 15 минута. 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 25 2.2. IF пуфер – Tween Овај пуфер се користи за испирање IF плочица. IF пуферу додати 0,1% Tween 20. 2.3. Фосфатни пуфер с глицеролом pH 7,6 Овај пуфер се користи као раствор за прекривање бунарчића у IF тесту да би се појачала флуоресценција. Na2HPO4 ∙ 12H2O 3,2 g NaH2PO4 ∙ 2H2O 0,15 g Glicerol 50 ml Дестилована вода 100 ml Комерцијални раствори нпр. VectashieldR (Vector Laboratories) или Citifl uopR (Leica). 3. Пуфери за индиректни ELISA тест. 3.1. Пуфер за облагање двоструке јачине, pH 9,6 Na2CO3 6,36 g NaHCO3 11,72 g Дестилована вода 1 l Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121 ˚С 15 минута. Као антиоксиданс може се додати натријум сулфит (0,2%). 3.2. 10X фосфатни пуфер са додатком соли (PBS), pH 7,4 NaCl 80 g KH2PO4 2 g Na2HPO4.12H2O 29 g KCl 2 g Дестилована вода 1 l 3.3. PBS-Tween 10X PBS 100 ml 10% Tween 20 5 ml Дестилована вода 895 ml 3.4. Пуфер за блокирање антитијела (мора бити свеже при премљен) 10X PBS 10 ml Поливинилпиролидон-44000 (PVP - 44) 2 g 10% Tween 20 0,5 ml Млијеко у праху 0,5 g Дестилована вода Допуните до 100 ml 3.5. Раствор супстрата алкалне фосфатазе, pH 9,8 Диетаноламин 97 ml Дестилована вода 800 ml Помијешати и подесити pH на 9,8 концентрованом HCl. Допу нити дестилованом водом до 1 литра. Додајте 0,2 g MgCl2 Растворите две таблете супстрата фосфатазе од 5 mg (Сигма) на 15 ml раствора. 4. Пуфери за DASI ELISA тест 4.1. Пуфер за облагање, pH 9,6 Na2CO3 1,59 g Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g NaHCO3 2,93 g Дестилована вода 1000 ml Растворити састојке и подесити pH на 9,6. 4.2. 10X фосфатни пуфер са додатком соли (PBS), pH 7,2 до 7,4 NaCl 80 g NaCl 80 g NaH2PO4.2H2O 4 g NaH2PO4.2H2O 4 g Na2HPO4.12H2O 27 g Na2HPO4.12H2O 27 g Дестилована вода 1.000 ml 4.3. PBS-Tween 10X PBS 50 ml 10% Tween 205 ml Дестилована вода 950 ml 4.4. Пуфер супстрата, pH 9,8 Диетаноламин 100 ml Дестилована вода 900 ml Помијешати и подесити pH на 9,8 концентрованом HCl. Поглавље XIII - Одређивање нивоа контаминације у IF и FISH тестовима 1. Избројати просечан број типичних флуоресцентних ћелија по видном пољу (ц) с = πи2/4Г2К2 гдjе је и = коефицијент поља (варира од 8 до 24 зависно од типа оку лара) К = коефицијент тубе (цијеви) (1 или 1,25) Г = повећање објектива (100x, 40x, итд.). 2. Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по бунар чићу микроскопске плочице (C) C = c ∙ С/с гдје је С = површина бунарчића IF плочице са више бунарчића и с = површина поља објектива. 3. Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по ml ре суспендованог талога (N) N = C ∙ 1.000/y ∙ F гдjе је y = запремина ресуспендованог талога у сваком бунарчићу и Ф = фактор разрјеђења ресуспендованог талога. Поглавље XIV - Потврђени и одобрени протоколи и реагенси за PCR Напомена Прелиминарна тестирања треба да омогуће поновљиву детек цију од најмање 103 до 104 ћелија R. solanacearum по ml екстракта узорка. Током прелиминарних тестирања не смиjе доћи до појаве ла жно позитивних резултата код одабраних бактеријских изолата. (Поглавље XI овог прилога) 1. Протокол за мултиплекс PCR са унутрашњом PCR контро лом (Seal и сар., 1993) 1.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер OLI-1 5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’ Низводни прајмер Y-2 5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’ Очекивана дужина умноженог производа из ДНК бактерије R. solanacearum = 288 bp (пар прајмера PSA). 1.2. PCR реакциони микс Реагенс Количина по реакцији Коначна концентрација Стерилна ултрачиста вода 17,65 μl 10 ∙ PCR pufer1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 ∙ (1,5 mM MgCl2) Смjеса d-NTP (20 mM) 0,25 μl 0,2 mm Прајмер OLI-1 (20 μM) 1,25 μl 1 μM Прајмер Y-2 (20 μM) 1,25 μl 1 μM Taq polimeraza (5 U/ μl)1 0,1 μl 0,5 U Запремина узорка 2 μl Укупна запремина 25 μl 1 Валидација методе извршена је уз коришћење Taq polimeraze Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL. 1.3. Услови PCR реакције Извести сљедећи програм: 1 циклус: 2 минута на 96 °C (денатурација ланца ДНК) 35 циклуса: 20 секунди на 94 °C (денатурација ланца ДНК) 20 секунди на 68 °C (везивање прајмера) 30 секунди на 72 °C (хибридизација) 26 СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 1.9.2017. 1 циклус: 10 минута на 72 °C (коначно продужавање) држати на 4 °C Напомена Оптимални услови коришћења овог програма су дефинисани за коришћење на PCR Perkin Elmer 9600 thermal cycler. Модифи кација трајања корака циклуса 35 је вјероватно потребна у случају употребе других модела thermal cycler. 1.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК R. solanacearum испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагме ната са ензимом Ава II послије инкубације на 37 °C. 2. Протокол за PCR према Pastrik и Maiss (2000) 2.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер Ps-1 5’- agt cga acg gca gcg ggg g-3’ Низводни прајмер Ps-2 5’- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3’ Очекивана дужина умноженог производа из ланца ДНК бакте рије R. solanacearum = 553 bp. 2.2. PCR реакциони микс Реагенс Количина по реакцији Коначна концентрација Стерилна ултрачиста вода 16,025 μl 10 ∙ PCR пуфер1 (15 mm MgCl2) 2,5 μl 1 ∙ (1,5 mm MgCl2) БСА (фракција В) (10%) 0,25 μl 0,1% Смjеса д-НТП (20 mm) 0,125 μl 0,1 mM Прајмер Пс-1 (10 mm) 0,5 μl 0,2 μM Прајмер Пс-2 (10|јМ) 0,5 μl 0,2 μM Таq полимераза (5 У/|ЈИ)<1> 0,1 μl 0,5 U Запремина узорка 5 μl Укупна запремина 25 μl 1 Валидација методе извршена је уз коришћење polimeraze Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) и Gibco BRL. Напомена Оптимални услови коришћења овог програма дефинисани су за коришћење на PCR MJ Research PTC 200 thermal cycleru sa Gibco Taq полимеразом. При истим концентрацијама може се ко ристити и Perkin Elmer AmpliTaq и пуфер. 2.3. Услови PCR реакције Извести сљедећи програм: 1 циклус: 5 минута на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 30 секунди на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 35 циклуса: 30 секунди на 68 °C (везивање прајмера) 45 секунди на 72 °C (продужавање копије) 1 циклус: 5 минута на 72 °C (коначно продужавање) др жати на 4 °C Напомена Оптимални услови коришћења овог програма дефинисани су за коришћење на PCR MJ Research PTC 200 thermal cycler. Моди фикација трајања корака циклуса 35 је можда потребна у случају употребе других модела thermal cycler. 2.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК R. solanacearum испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагме ната са ензимом Таq I послије инкубације на 65 °C 30 минута. Рестрикциони фрагменти добијени из специфичног фрагмента R. solanacearum су величине 457 bp и 96 bp. 3. Протокол за мултиплекс PCR са унутрашњом PCR контро лом (Pastrik и сар., 2000) 3.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер RS-1-F 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’ Низводни прајмер RS-1-R 5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’ Узводни прајмер NS-5-F 5’-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3’ Низводни прајмер NS-6-R 5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3’ Очекивана дужина умноженог производа из ДНК R. solanacearum = 718 bp (пар прајмера РС). Очекивана дужина умноженог производа из 18С рРНК унутра шње контроле = 310 bp (пар прајмера НС). 3.2. PCR реакциони микс Реагенс Количина по реакцији Коначна концентрација Стерилна ултрачиста вода 12,625 μl 10 ∙ PCR пуфер1 (15 mM MgCl) 2,5 μl 1 ∙ (1,5 mM MgCl2) BSA (фракција В) (10%) 0,25 μl 0,1% Смjеса d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Прајмер RS-1-F (10 μM) 2 μl 0,8 μl Прајмер RS-1-F (10 μM) 2,0 μl 0,8 μl Прајмер NS-5-F (10 μM) (2) 0,15 μl 0,06 μl Прајмер NS-6-R (10 μM) (2) 0,15 μl 0,06 μl Таq полимераза (5 U/μl) (1) 0,2 μl 1 U Запремина узорка 5 μl Укупна запремина 25 μl 1 Метода је потврђена Таq полимеразом Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL. 2 Концентрације прајмера NS-5-F и NS-6-R су оптимизоване за екстракцију конуса пупчаних дијелова кртола кромпира мето дом хомогенизације и пречишћавањем ДНК према Pastriku (2000). Ако се екстракција обавља тресењем или ако се примјењују друге методе издвајања ДНК, потребно је поново оптимизовати кон центрације реагенаса. 3.3. Услови PCR реакције Извести сљедећи програм: 1 циклус: 5 минута на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 30 секунди на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 35 циклуса: 30 секунди на 58 °C (везивање прајмера) 45 секунди на 72 °C (хибридизација) 1 циклус: 5 минута на 72 °C (коначно продужавање) др жати на 4 °C Напомена Оптимални услови коришћења овог програма дефинисани су за коришћење на PCR MJ Research PTC 200 thermal cycler. Моди фикација трајања корака циклуса 35 је можда потребна у случају употребе других модела thermal cycler. 3.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК R. solanacearum испоља вају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом Bsm I или изосхизомером (нпр. Mva 1269 I) послије инкубације на 65 °C у трајању од 30 минута. 4. Протокол за специфичан PCR биовара (Pastrik и сар. 2001) 4.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер Rs-1-F 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’ Низводни прајмер Rs-1-R 5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’ Низводни прајмер Rs-3-R 5’-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3’ Очекивана дужина умноженог производа из ДНК R. solanacearum: са Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp са Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp 4.2. PCR реакциони микс Специфични PCR за биовар 1/2 Реагенс Количина по реакцији Коначна концентрација Стерилна ултрачиста вода 12,925 μl 10 ∙ PCR pufer1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 ∙ (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смjеша d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Prajmer Rs-1-F (10 μM) 2 μl 0,8 μM 1.9.2017. СЛУЖБЕНИ ГЛАСНИК РЕПУБЛИКЕ СРПСКЕ - Број 81 27 Prajmer Rs-1-R (10 μM) 2 μl 0,8 μM Taq polimeraza (5 U/μl) (1) 0,2 μl 1 U Запремина узорка 5 μl Укупна запремина 25 μl ¹ Методе су потврђене Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL. Специфични PCR за биовар 3/4/5 Реагенс Количина по реакцији Коначна концентрација Стерилна ултрачиста вода 14,925 μl 10 ∙ PCR pufer1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 ∙ (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смјеса d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Prajmer Rs-1-F (10 μM) 1 μl 0,4 μM Prajmer Rs-3-R (10 μM) 1 μl 0,4 μM Taq polimeraza (5 U/μl) (1) 0,2 μl 1,0 U Запремина узорка 5,0 μl Укупна запремина 25,0 μl (1) Методе су потврђене Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL.Л. 4.3. Услови PCR реакције Извести сљедећи програм за специфичне реакције за биовар 1/2 и биовар 3/4/5: 1 циклус: 5 минута на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 30 секунди на 95 °C (денатурација ланца ДНК) 35 циклуса: 30 секунди на 58 °C (везивање прајмера) 45 секунди на 72 °C (хибридизација) 1 циклус: 5 минута на 72 °C (коначно продужавање) др жати на 4 °C Напомена Оптимални услови коришћења овог програма су дефинисани за коришћење на PCR MJ Research PTC 200 thermal cycleru. Моди фикација трајања корака циклуса 35 је можда потребна у случају употребе других модела thermal cyclerа. 4.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК R. solanacearum са прајме рима Rs-1-F i Rs-1-R испољавају карактеристичне полиморфиз ме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом Bsm I или изосхизомером (нпр. Mva 1269 I) послије инкубације на 65 °C у трајању од 30 минута. PCR производи умножени из ДНК бакте рије R. solanacearum са прајмерима Rs-1-F i Rs-3-R немају мјеста рестрикције. 5. Припрема боје за електрофорезу 5.1. Бромфенол плаво (10% концентровани раствор) Бромфенол плаво 5 g Дестилована вода (бидестилована) 50 ml 5.2. Пуфер за бојење Глицерол (86%) 3,5 ml Бромфенол плаво (5.1) 300 μl Дестилована вода (бидестилована) 6,2 ml 5.3. 10x Tris acetatni и EDTA pufer (TAE), pH 8,0 Tris pufer 48 g Глацијална сирћетна киселина 11,42 ml EDTA (динатријумова со) 3,72 g Дестилована вода 1 l Разриједите једном прије употребе. Доступан је и на тржишту (нпр. инвитроген или замјена). Поглавље XV - Потврђени и одобрени реагенси за Fish тест 1. Олиго пробе Специфична проба за R. solanacearum OLI-1-CY3: 5’-ggc agg tag caa gct acc ccc-3’ Неспецифична еубактеријска проба EUB-338-FITC: 5’-gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Раствор за фиксирање Раствор за фиксирање садржи параформалдехид који је ток сичан. Носити рукавице и не удисати га. Препоручује се рад у ди гестору. 2.1. Загријати 9 ml воде за употребу у процедурама молекулар не биологије (нпр. ултрачисте воде) на око 60 °C и додати 0,4 g па раформалдехида. Параформалдехид се раствара послије додавања 5 капи 1N NaOH и мијешања на магнетској мјешалици. 2.2. Подесити pH на 7 додајући 1 ml 0,1 М фосфатног пуфера (PB; pH 7,0) и 5 капи 1N HCl. Вриједност pH провјерити и помоћу индикатор трака и ако је потребно подесите pH помоћу HCl или NaOH. У растворима с параформалдехидом не употребљавати pH-ме тар. 2.3. Профилтрирати раствор кроз мембрански филтер од 0,22 μm и до даље употребе чувати на 4°C и заштитити од прашине. 3. 3X Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (стерилизована филтрирањем и у аутоклаву) 15 mM Разриједите до једанпут према потреби. 4. Раствор за хибридизацију 1X Hybmix Натријум додецил сулфат (SDS) 0,01% Formamid 30% Проба EUB 338 5 ng/μl Проба OLI-1 ili OLI-2 5 ng/μl Припремити количине раствора за хибридизацију према про рачунима у Табели 1. За сваку плочицу (са 2 различита узорка у дупликату) треба 90 μl раствора за хибридизацију. Важно: форма мид је веома токсичан и зато носити рукавице и предузети потреб не мјере опреза! Табела 1. Предложене количине за припремање смјесе за хи бридизацију Број стакалаца 1 4 6 8 10 Стерилна ултрачиста вода 23,1 92,4 138,6 184,8 231 3 ∙ Hybmix 30 120 180 240 300 1% SDS 0,9 3,6 5,4 7,2 9 Формамид 27 108 162 216 270 Проба EUB 338 5 ng/μl 4,5 18 27 36 45 Проба OLI-1 ili OLI-2 5 ng/μl 4,5 18 27 36 45 Укупна запремина (|јл) 90 360 540 720 900 Напомена Све растворе који садрже олиго-пробе осјетљиве на свјетлост чувати у мраку на -20 °C. Током употребе заштитите их од директне сунчеве свјетлости или електричног свјетла. 5. 0,1 М фосфатни пуфер, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Дестилована вода 1 l Растворите састојке, проверите pH и стерилишите у аутоклаву на 121 °C 15 минута. Поглавље XVI - Услови гајења плавог патлиџана и парадајза Посијати сјеме парадајза (Lycopersicon esculentum) и плавог патлиџана (Solanum melongena) у пастеризовани компост за сjеме. Пресадити сијанце са потпуно развијеним котиледонима (од десет до 14 дана) у пастеризован компост у саксијама. Прије инокулације, парадајз и плави патлиџан би требало да се гаје у стакленику под сљедећим условима: Дужина дана: 14 сати или природна дужина дана, ако је дужа од 14 сати Температура: дневна: од 21 °C до 24 °C ноћна: од 14 °C до 18 °C Осјетљива сорта парадајза: Moneymaker Осјетљива сорта плавог патлиџана: Black Beauty