Order No. 684, dated 19 December 2019 the approval of the regulation On veterinary medical and breeding conditions that apply to the movement and import of ungulates

URDHËR Nr. 684, datë 19.12.2019 PËR MIRATIMIN E RREGULLORES “MBI KUSHTET MJEKËSORE VETERINARE DHE TË MBARËSHTIMIT QË ZBATOHEN NË LËVIZJEN DHE IMPORTIN E NJËTHUNDRAKËVE” Në mbështetje të nenit 102, pika 4, të Kushtetutës, të nenit 51, pika 2, nenit 129, germa “c”, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar, URDHËROJ: 1. Miratimin e rregullores “Mbi kushtet mjekësore veterinare dhe të mbarështimit që zbatohen në lëvizjen dhe importin e njëthundrakëve”, sipas tekstit bashkëlidhur. 2. Për zbatimin e këtij urdhri ngarkohen Drejtoria e Përgjithshme e Përputhshmërisë në Bujqësi, Ushqim dhe Zhvillim Rural, agjencitë rajonale të shërbimit veterinar dhe mbrojtjes së bimëve, Autoriteti Kombëtar i Ushqimit dhe Instituti i Sigurisë Ushqimore dhe Veterinarisë. 3. Ky urdhër hyn në fuqi pas botimit në Fletoren Zyrtare. MINISTËR I BUJQËSISË DHE ZHVILLIMIT RURAL Bledar Çuçi RREGULLORE MBI KUSHTET MJEKËSORE VETERINARE DHE TË MBARËSHTIMIT QË ZBATOHEN NË LËVIZJEN DHE IMPORTIN E NJËTHUNDRAKËVE KAPITULLI I Neni 1 Kjo rregullore përcakton kushtet mjekësore veterinare dhe të mbarështimit të kafshëve të gjalla, të llojit njëthundrakë, për lëvizjen dhe importimin e tyre nga vendet e tjera. Neni 2 Në këtë rregullore termat e mëposhtme kanë këto kuptime: a) “Stabiliment” është një stabiliment bujqësor ose stërvitor, në të cilin mbahen ose mbarështohen zakonisht kafshët njëthundrakë, për çdo përdorim; b) “Njëthundrakë” janë kafshë të egra ose të domestikuara të llojit “kuaj” (përfshirë edhe zebrat), specie gomari ose pasardhës që vijnë nga kryqëzimi i këtyre specieve; c) “Njëthundrakë të regjistruar” nënkupton çdo kafshë njëthundrakë të regjistruar, siç është e përcaktuar në nenin 11, pika 1, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar, dhe rregullores nr. 221, datë 14.4.2016 “Mbi metodat e identifikimit dhe regjistrimit të kafshëve njëthundrakë”; d) “Njëthundrakë për therje” nënkupton njëthundrakë që synohen të transportohen drejtpërdrejt ose me tranzit, në thertore për therje; e) “Njëthundrakë për mbarështim ose riprodhim” nënkupton njëthundrakë përveç atyre të përmendura në gërmat “b” dhe “d”; f) “Vend i pastër nga sëmundja afrikane e kuajve” është një vend në të cilën nuk janë shfaqur shenja klinike, nuk ka evidencë serologjike (në njëthundrakët e pavaksinuar) dhe epidemiologjike për sëmundjen afrikane të kuajve në atë vend, për dy vitet e fundit, dhe në të cilën nuk janë kryer vaksinime kundër sëmundjes gjatë 12 muajve të fundit; g) “Sëmundje të detyrueshme për deklarim”, janë sëmundjet e cituara në aneksin I, në të cilën janë listuar nga autoriteti kompetent veterinar dhe miratuar nga ministri, për të cilat sapo zbulohen ose dyshohet, për to njoftohet shërbimi veterinar; h) “Pranim i përkohshëm” ështe pranimi i përkohshëm i njëthundrakëve të regjistruar, nga vendi i origjinës, në varësi nga gjendja shëndetësore e tyre, në vendin në të cilën ato do të transportohen, për një periudhë kohore jo më pak se 90 ditë. KAPITULLI II RREGULLAT E LËVIZJES SË NJËTHUNDRAKËVE Neni 3 Autorizimi i lëvizjes së njëthundrakëve në Republikën e Shqipërisë bëhet vetëm nëse ato përmbushin kushtet e hartuara në nenet 4 dhe 5 të kësaj rregulloreje dhe nenin 72, pika 1, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar. Përbëjnë përjashtim të përgjithshëm ose të kufizuar lëvizja e njëthundrakëve të cilët: a) ngrihen ose mbahen, për qëllime sportive apo rekreative; b) marrin pjesë në ngjarje kulturore ose aktivitete të organizuara nga organet e autorizuara lokale; c) janë të destinuara vetëm për kullotje të përkohshme ose për punë. Në të gjitha rastet e mësipërme duhet të njoftohet ARSHVMB , sipas nenit 52, pika 1, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar. Neni 4 1. Kafshët njëthundrakë kur importohen në territorin e Republikës së Shqipërisë nuk duhet të shfaqin shenja klinike të sëmundjeve infektive gjatë inspektimit. Inspektimi duhet të kryhet 48 orë para kalimit të ngarkesës në vendin e dërgimit. 2. Veterineri zyrtar duhet që në momentin e inspektimit të jetë i bindur, në bazë edhe të deklarimeve nga pronari ose rritësi i kafshës, të konstatojë se njëthundrakët kanë qenë ose jo në kontakt me njëthundrakë të tjerë, që vuajnë nga sëmundje infektive ose ngjitëse gjatë 15 ditëve të fundit, menjëherë përpara inspektimit. 3. Njëthundrakët nuk duhet të jenë të destinuar për therje, nën një program kombëtar të çrrënjosjes së sëmundjeve ngjitëse. 4. Njëthundrakët duhet të identifikohen me dokumentin e tyre të identifikimit: a) Siç është e përcaktuar në nenin 11, pika 1, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar, dhe rregullores nr. 221, datë 14.4.2016 “Mbi metodat e identifikimit dhe regjistrimit të kafshëve njëthundrakë”. Veterineri zyrtar duhet të pezullojë vlefshmërinë e dokumentit të identifikimit në rast se gjen raste në kundërshtim me germën “a” të këtij neni ose në nenin 5 të kësaj rregulloreje. Dokumenti i identifikimit, pas therjes së njëthundrakut të regjistruar, duhet t’i kthehet autoritetit që e ka lëshuar atë. 5. Njëthundraket nuk duhet të vijnë nga stabilimente: a) Ku kafshët e pranishme në fermë që janë të ekspozuar ndaj një sëmundjeje dhe nuk janë therur, periudha e ndalimit për mbajtjen e tyre në fermë duhet të jetë të paktën: i. 6 muaj në rastin e njëthundrakëve të dyshuar për prekje nga sëmundja e butrit, duke u nisur nga data e ekspozimit apo kontaktit të mundshëm me kafshë të sëmura të butrit, duke filluar nga data e kontaktit të fundit aktual ose të mundshëm me një kafshë të sëmurë. Në rastin e një mashkulli, ndalimi i tyre do të zbatohet derisa kafsha të kastrohet; ii. 6 muaj në rastet e sëmundjes së morves ose të encefalomieliteve të kuajve, duke filluar nga dita në të cilën theren njëthundrakët të cilët vuajnë nga sëmundja në fjalë; iii. në rastin e sëmundjes së anemisë infektive të kuajve, deri në datën në të cilën kafshët e prekura janë therur, kafshët e mbetura kanë shfaqur një reaksion negativ në dy testet Coggins të kryera brenda tre muajve; iv. 6 muaj nga raportimi i rastit të fundit të sëmundjes së stomatitit vezikular; v. 1 muaj nga raportimi i fundit të rastit të sëmundjes së rabies; vi. 15 ditë nga raportimi i fundit të rastit të sëmundjes së antraksit. b) Nëse të gjitha llojet e kafshëve të prekshme ndaj sëmundjeve që kanë qenë në fermë, janë therur dhe mjediset janë dezinfektuar, periudha e ndalimit do të jetë 30 ditë, duke filluar nga dita në të cilën kafshët janë therur dhe mjediset janë dezinfektuar, përveç rastit të sëmundjes së antraksit, ku periudha e ndalimit është 15 ditë. Shërbimi veterinar rajonal bën përjashtim të këtyre urdhrave, në rastin e hipodromeve dhe garave. 6. Në rastin ku autoriteti kompetent harton një program vullnetar ose të detyrueshëm për sëmundjet të caktuara, nga e cila njëthundrakët janë të prekshëm, ky program duhet të ketë informacion, për: a) përhapjen e sëmundjes brenda territorit; b) arsyet e hartimit të këtij programi, duke marrë në konsideratë rëndësinë e sëmundjes, kostot dhe benefitet; c) zonën gjeografike në të cilën implementohet programi; d) statusin e kategorive që do të zbatohen në stabilimente, standardet që do të arrihen për secilën specie dhe testet që do të përdoren ku do të aplikohen vendosmëritë e marra, standardet që duhen arritur për çdo specie dhe testet që duhet të përdoren; e) procedurat e programit të monitorimit; f) masat që merren në rastin kur stabilimenti humbet statusin shëndetësor; g) masat që duhen marrë, në rastet kur rezultatet e testeve të kryera në përputhje me parashikimet e programit janë pozitive. Neni 5 1. Mund të lëvizin kafshë njëthundrakë nga ajo pjesë e territorit, e cila nuk është e pastër nga sëmundja afrikane e kuajve, brenda territorit të Republikës së Shqipërisë sipas kushteve të përcaktuara në pikat e mëposhtme të këtij neni. 2. Një pjesë e një territori duhet të konsiderohet e infektuar nga sëmundja afrikane e kuajve nëse: a) ka evidencë klinike, seriologjike dhe epidemiologjike për praninë e sëmundjes afrikane të kuajve në dy vitet e fundit; b) vaksinimi kundër sëmundjes afrikane të kuajve është kryer në 12 muajt e fundit. Pjesa e territorit që konsiderohet e infektuar nga sëmundja afrikane e kuajve duhet të përfshijë një minimum: a) të një zone mbrojtëse me rreze të paktën 100 km përreth çdo qendre ku ka ndodhur infeksioni; b) të një zone të survejancës të paktën 50 km, përtej zonës mbrojtëse, në të cilën nuk është kryer vaksinimi për 12 muajt e fundit. 3. Të gjithë njëthundrakët e vaksinuar, të ndodhur në zonën e mbrojtjes, duhet të jenë të regjistruar. 4. Certifikata e shëndetit duhet të vërtetojë vaksinimin e njëthundrakëve. 5. Kafshët njëthundrakë mund të dërgohen jashtë territorit të Republikës së Shqipërisë nëse plotësojnë kërkesat e mëposhtme: a) ata duhet të dërgohen vetëm gjatë periudhave të caktuara të vitit, duke marrë parasysh aktivitetin e vektorëve; b) ata nuk duhet të shfaqin shenja klinike të sëmundjes afrikane të kuajve në ditën e inspektimit sipas nenit 4, pika 1; c) ato duhet t’i nënshtrohen testit, për sëmundjen afrikane të kuajve dy herë, me një interval kohor të ndërmjetëm 21 dhe 30 ditë midis dy testeve, ku testimi i dytë duhet të kryhet 10 ditë para dërgimit të tyre: i. të kenë rezultuar negative kur është kryer testi për sëmundjen afrikane të kuajve, nëse ato nuk janë vaksinuar kundër sëmundjes afrikane të kuajve; ii. nëse nuk kanë pasur një rritje të numrit të antitrupave edhe pa ju nënshtruar vaksinimit përgjatë dy muajve të fundit. d) Ata duhet të mbahen në stacionin e karantinës për një minimum periudhe kohore prej 40 ditësh para dërgimit të tyre; e) Ata duhet të jenë mbrojtur nga vektorët si insektet, përgjatë periudhës së karantinës dhe gjatë transportimit nga stacioni i karantinës në vendin e destinacionit. Neni 6 1. Njëthundrakët duhet të transportohen, sa më shpejt të jetë e mundur nga vendi i origjinës ose direkt përmes qendrës së grumbullimit, tek vendi i destinacionit me automjete ose kontejnerë të cilat janë të pastra dhe të dezinfektuara në përputhje me nenin 72, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar. Automjetet duhet të dizejnohen në atë mënyrë që feçet e njëthundrakëve, mbeturinat ose ushqimi, të mos dalin jashtë automjetit gjatë transportit. Transporti duhet të kryhet në mënyrë të tillë ku shëndeti dhe mirëqenia e njëthundrakëve të mund të mbrohet në mënyrë efektive sipas nenit 72, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar. 2. Vendi i destinacionit të njëthundrakëve mund të bëjë përjashtime në vija të përgjithshme ose të kufizuara nga kërkesat e përmendura në nenin 4, pika 5, për kafshë të cilat janë të indikuar për therje, vetëm kur certifikata shëndetësore është në përputhje me aneksin II të kësaj rregulloreje. Kur ky rregull plotësohet, njëthundrakët që janë të destinuar për therje duhet të transportohen direkt në thertoren e përcaktuar dhe të theren brenda 5 ditëve nga mbërritja në thertore. 3. Veterineri zyrtar duhet të regjistrojë numrin e identifikimit ose numrin e dokumentit të identifikimit për kafshët e therura, të vendit të dërgimit dhe t’i dërgojë autoritetit kompetent të vendit të dërgimit, një vërtetim që kafsha është therur. Neni 7 1. Në rastin e eksportit të sigurohet që: a) njëthundrakët të jenë të regjistruar dhe të shoqëruar me dokumentin e identifikimit e cilësuar në nenin 59 pika 2, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar dhe certifikata shëndetësore nëse ata janë të destinuar për tregti sipas aneksit II; b) njëthundrakët që janë për mbarshtim, prodhim ose therje, gjatë transportit të duhet të shoqërohen nga certifikata e shëndetit, në përputhje me aneksin II. 2. Certifikata shëndetësore, në rastin e njëthundrakëve të regjistruar, sipas nenit 42, pika 1, dhe neni 55, të ligjit nr. 10465, datë 29.9.2011 “Për shërbimin veterinar në Republikën e Shqipërisë”, i ndryshuar, duhet të përpilohet 48 orë para hyrjes së tyre në vendin e destinacionit ose ndryshe jo më vonë se dita e fundit para dërgimit të tyre, në një nga gjuhët zyrtare të vendit të dërgimit ose destinacionit. Kohëzgjatja e vlefshmërisë së certifikatës shëndetësore ose vërtetimit shëndetësor është 10 ditë. 3. Certifikata shëndetësore ose vërtetimi shëndetësor duhet të përbëhet nga një fletë e vetme. KAPITULLI III RREGULLAT E IMPORTIT TË NJËTHUNDRAKËVE NË REPUBLIKËN E SHQIPËRISË Neni 8 Njëthundrakët e importuar duhet të përmbushin kushtet e cituara në nenet 9 dhe 13. Neni 9 1. Importimi i njëthundrakëve duhet të autorizohet duke marrë parasysh situatën shëndetësore dhe garancinë e dhënë nga vendi për njëthundrakët të cilët duhet të shoqërohen me një autorizim të parashikuar sipas legjislacionit në fuqi, për tu zbatuar në të gjithë territorin e vendit ose vetëm për një pjesë të territorit të tij. 2. Kur importohen kafshë njëthundrakë në territorin e Republikës së Shqipërisë, të merret parasysh: a) statusi shëndetësor i njëthundrakëve, statusi i kafshëve të tjera shtëpiake dhe të egra, me një vëmendje të veçantë mbi sëmundjet e kafshëve ekzotike si dhe aspekteve të përgjithshme të kushteve të shëndetit dhe mjedisit të vendit nga i cili importohen kafshët njëthundrakë; b) legjislacioni i vendit importues, në lidhje me shëndetin dhe mirëqenien e kafshëve; c) organizimi i Autoritetit kompetent veterinar, shërbimit inspektues dhe zbatueshmëria e shërbimeve të tij inspektuese, mbikëqyrja e aktivitetit të tyre dhe mjeteve të vëna në dispozicion të tyre, duke përfshirë punonjësit dhe kapacitetet laboratorike me qëllim zbatimin efektiv në nivel kombëtar të legjislacionit në fuqi; d) garancia që autoritetet kompetente veterinare të vendit importues mund të japin në lidhje me pajtueshmërinë e kushteve përkatëse të shëndetit të kafshëve. e) nëse vendi importues është anëtar i Organizatës Botërore të Shëndetit të Kafshëve (OIE), rregulloret dhe shpejtësia e informacionit të dhënë nga vendi importues në lidhje me ekzistencën e sëmundjeve infektive ose ngjitëse të njëthundrakëve në territorin e tyre, veçanërisht në lidhje me sëmundjet e listuara në faqen zyrtare të Organizatës Botërore të Shëndetit të Kafshëve (OIE ) dhe në aneksin I të kësaj rregulloreje; f) vendi ynë informon menjëherë vendin importues: i. kur konfirmohet shfaqja e sëmundjeve infektive të njëthundrakeve, të listuar në aneksin I dhe çdo ndryshim që bëhet në programet e vaksinimit në lidhje me këto sëmundje brenda 24 orëve; ii. çdo ndryshim të propozuar mbi rregullat shëndetësore kombëtare në lidhje me njëthundrakët, veçanërisht në lidhje me importimin e tyre; iii. statusin shëndetësor veçanërisht për njëthundrakët, në intervale të rregullta, për territorin e tij; g) ndonjë eksperiencë nga importimet e mëparshme të njëthundrakëve të gjallë nga vendet e tjera dhe rezultatet që janë marrë nga kontrolli gjatë importit; h) rezultatet që janë marrë nga inspektimi dhe auditimet e marra nga vendet e tjera, dhe në veçanti rezultatet e vlerësimit nga autoritetet kompetente dhe raportet e paraqitura nga autoriteti kompetent për inspektimet e kryera; i) rregullat në fuqi të një vendi importues mbi parandalimin dhe kontrollin e sëmundjeve infektive, zbatueshmërinë e tyre, përfshirë këtu rregullat e importit të njëthundrakeve nga ky vend. 3. Kushtet specifike të importit do të vendosen duke pasur parasysh situatën shëndetësore të kafshëve në Republikën e Shqipërisë, specifikisht të njëthundrakëve. Neni 10 Njëthundrakët që vijnë në territorin e Republikës së Shqipërisë duhet: a) të jenë të lirë nga sëmundja afrikane e kuajve; b) të jenë të lirë nga encefalomieliti venezuelian i njëthundrakëve; c) të jenë të pastër për 6 muajt e fundit nga sëmundja e morves dhe e butrit. Neni 11 Përpara ditës së transportit për në Republikën e Shqipërisë, njëthundrakët duhet të kenë qëndruar pa ndërprerje në territor ose në një pjesë të atij territori, për një periudhë kohore sipas përcaktimve të nenit 10. Njëthundrakët duhet të vijnë nga një fermë e cila ka qenë nën mbikëqyrje veterinare. Neni 12 Importi i njëthundrakëve në territorin e Republikës së Shqipërisë duhet të autorizohet vetëm nëse njëthundrakët përmbushin kërkesat: a) e shëndetit të kafshëve, në bazë të species dhe kategorive të njëthundrakëve, sipas procedurave të importit të vendit nga vijnë; b) në rastin kur vendi nuk ka qenë i lirë nga sëmundja e stomatitit vezikular ose arteriti viral për 6 muajt e fundit, njëthundrakët duhet të plotësojnë kërkesat e mëposhtme: i. Duhet të vijnë nga një fermë e cila ka qenë e lirë nga stomatiti vezikular për të paktën gjashtë muajt e fundit ku duhet të kenë reaguar negativisht ndaj testeve serologjike para dërgimit; ii. në rastin e arteritit viral, meshkujt njëthundrakë duhet që të kenë reaguar negativisht ndaj testeve serologjike ose testeve të izolimit të virusit ose kundrejt ndonjë prove tjetër të njohur, e cila do të garantonte pastërtinë nga virusi. Neni 13 1. Njëthundrakët duhet të idendifikohen në përputhje me nenin 4 pika 4 dhe të jenë të shoqëruar nga certifikata shëndetësore e plotësuar nga veterineri zyrtar. Kjo certifikate duhet: a) të lëshohet në ditën e ngarkimit të kafshëve për dërgim në Republikën e Shqipërisë ose në rastin e kuajve të regjistruar, në ditën e fundit para se të hyjnë në vendin e shtetit tjetër; b) të përpilohet në gjuhën Shqipe dhe gjuhën e vendit nga vjen; c) të shoqërojë kafshën që nga origjina e saj; d) të vërtetojë që kafshët plotësojnë kërkesat e kësaj rregulloreje dhe ato të përcaktuara në përputhje me këtë rregullore në lidhje me importin; e) të konsistojë në një fletë të vetme; f) të lëshohet për një dërgesë të vetme ose në rastin e kafshëve për therje, të jetë në përputhje me numrin e identifikimit dhe regjistrimit të këtyre kafshëve. 2. Certifikata e shëndetit duhet të hartohet në përputhje me modelin e miratuar nga ministri . Neni14 1. Sapo të mbërrijnë në Republikën e Shqipërisë, njëthundrakët që janë për therje duhet të dërgohen në thertore, direkt ose pas transitit përmes aprovimit të qendrës së grumbullimit në përputhje me nenin 6 dhe në përputhje me kërkesat e shëndetit të kafshëve, duhet të theren brenda një periudhe kohore të specifikuar në nenin 12. 2. Në rastin e kushteve të veçanta të aprovuara, autoriteti kompetent që për shkaqe shëndetësore të kafshëve, cakton thertoren në të cilën duhet të dërgohen këto njëthundrakë. Neni 15 a) Autoriteti kompetent mund të përcaktojë importin nga një vend apo pjesë të një territori sipas specieve dhe kategorive të njëthundrakëve; b) Duhet të vendosen kushtet specifike për hyrjen e përkohshme në territorin e vendit tonë të njëthundrakeve të regjistruar, të njëthundrakeve të destinuar për përdorime të veçanta ose ri-futja e tyre në territorin e vendeve të destinacionit, pas eksportimit të përkohshëm; c) Duhet të përcaktohen kushtet për konvertimin e hyrjes së përkohshme në hyrje të përhershme bazuar ne kushtet shëndetësore të njëthundrakëve; d) Sëmundjet e listuara në aneksin I, ekzaminohen në Institutin e Sigurisë Ushqimore dhe Veterinarisë (ISUV). Neni 16 Diagnoza e sëmundjes afrikane të kuajve, testet serologjike Metodat serologjike të përshkruara më poshtë janë enzima të lidhura me testin imunosorbent (ELISA), të bazuara në pikën 2 të Seksionit B në kapitullin 2.5.1 të manualit të testeve diagnostike dhe vaksinave në kafshët e tokës, edicioni i 2016 i adaptuar nga Asambleja Botërore e Delegatëve të OIE në maj të 2012. Proteina virale VP7, është një antigen imunodominant i virusit të sëmundjes afrikane të kuajve (AHSV) dhe ruhet nëpërmjet 9 serotipave të AHSV. Proteinat AHSV-VP7 rekombinante kanë treguar që janë të qëndrueshme, të padëmshme dhe të përshtatëshme për tu përdorur si antigen në testin ELISA, për gjetjen e antitrupave e AHSV, me një shkallë të lartë sensitiviteti dhe specifiteti (Laviada et al., 1992b (1); ); Maree and Paweska, 2005). Testi indirect ELISA dhe ELISA bllokuese janë dy AHS-VP7 teste ELISA të përshtatëshme për diagnostikimin serologjik të sëmundjes afrikane të kuajve (AHS). 1. Testi indirect ELISA për gjetjen e antitrupave të virusit të sëmundjes Afrikane të Kuajve (AHSV) Konjugati i përdorur në këtë metodë është një peroksidaze antihorse gamma-globuline që vepron me serumin e kuajve, mushkave dhe gomarëve. Metoda e përshkruar nga Maree & Paweska (2005) (2) përdor proteinën G si konjugat i cili vepron edhe me serumin e zebrave. Antigjeni mund të sigurohet nga Qendra e Investigimit e Shëndetit të Kafshëve (CISA) Spanjë, brenda 4-6 muaj nga kërkesa e bërë. 1.1 PROCEDURA E TESTIT 1.1.1 Faza solide 1.1.1.1 Shtresat e pllakave të testit ELISA me rekombinantët AHSV-4 VP7 hollohen në një buffer karbonati/bikarbonati me pH 9,6. Pllakat inkubohen brenda natës në temperaturë 4°C. 1.1.1.2 Lani pllakat 5 herë me ujë të distiluar 0.01% (v/v) dhe 20 herë me solucion larës. Pastroni pllakat me një material absorbent (thithës) për të hequr çdo mbetje nga larja. 1.1.1.3 Bllokoni pllakat me një kripë fosfati buferik (pbs) me ph 7.2 + 5% (w/v) qumësht i skremuar (Nestlé Dry Skim Milk TM), 200 μl , për 1 orë në temperaturën 37°C. 1.1.1.4 Hiqni solucionin bllokues dhe pastroni pllakat me material absorbues. 1.1.2 Mostrat e testit 1.1.2.1 Mostrat e serumit që do të testohen dhe serumet e kontrollit pozitiv dhe negativ hollohen 1 në 25 PBS + 5% (w/v) qumësht i skremuar + 0,05% (v / v) Tween 20, 100 μl për pus. Inkuboji për 1 orë në 37°C. Për titrimin, bëni një seri 2-herëshe hollimi nga 1 në 25 (100 μl / well), një serum për kolonën e pllakës, dhe bëni të njëjtën gjë me kontrollet pozitive dhe negative. Inkuboji për 1 orë në temperaturën 37°C. 1.1.2.2 Lani pllakat pesë herë me ujë të distiluar 0,01% (v / v), 20 herë (solucion larës). Pastroni pllakat me material absorbues për të hequr çdo mbetje nga larja e bërë. 1.1.3 Konjugati 1.1.3.1 Hidhni 100 μl/ pusetë e horseradish - peroxidase (HRP)- e konjuguar me anti – horse gamma - globulinë e holluar në PBS + 5 % qumësht + 0.05 % tween 20, pH 7.2. Inkubojeni për 1 orë në temperaturën 37 °C. 1.1.3 Lajini pllakat 5 herë me ujë të vazhdueshëm të distiluar që përmban 1.01 % (v/v) Tween 20 herë (solucion larës) Prekini pllakat butësisht në një material absorbent për të hequr mbetjet e larjes. 1.1.4 Kromogjen/substrati 1.1.4.1 Shto 200 μl / pusetë kromogjeni / solucion s ubstrati (10 ml e 80.6 Mm DMAB (dimetilaminobenzaldehyde) + 10 ml e 1.56 mM MVTH ( 3-methyl- 2 benzo- tiazolinë hidrazone hidrochlorid ) + 5 5 μl H2O2 ). Zhvillimi i ngjyrimit stopohet duke shtuar 50 μl 3NH2SO4 pas 5-10 minuta ( para kontrollit negativ që fillon të ngjyroset) Mund të përdoren gjithashtu kromogjenët e tjerë si ABTS (2.2’ – Azino-bis-( 3 etilbenzotiazolinë- 6 acid sulfurik), TMB ( tetrametil benzidinë), ose OPD (ortho- phenyldiamine). 1.1.4.2 Lexo pllakat me 600 nm ( ose 620 nm). 1.2 INTERPRETIMI I REZULTATEVE 1.2.1. Llogarisni vlerën e prerjes duke shtuar 0,06 vlerës së kontrollit negativ (0,06 është devijimi standard që derivon nga një grup prej 30 serume negative). 1.2.2. Testet e mostrave që japin vlerat e absorbimit më të ulëta se ndarja janë konsideruar si negative. 1.2.3. Mostrat e testit që japin vlerat e absorbimit më të mëdha se cut-off + 0,15 konsiderohen si pozitive. 1.2.4. Mostrat e testit që japin vlera të absorbimit të ndërmjetëm konsiderohen si jokonkluzive. Në këtë rast duhet të përdoret një teknikë e dytë për të konfirmuar rezultatin. 2. Testi bllokues Elisa për gjetjen e antitrupave të virusit të sëmundjes afrikane të kuajve (AHSV) Testi ELISA bllokuese është dizenjuar për të gjetur antitrupat specifik të virusit të sëmundjes afrikane të kuajve, nga kafshë të çdo specieje njëthundrake, si p.sh. kujt, zebra dhe kryqëzimet e tyre, duke parandaluar kështu problemin e specifitetit të ekperimentuar rastësisht, duke përdorur testin e ELISA indirekte. Principi i testit është të bllokojë reagimin midis proteinës rekombinante VP7 e absorbuar (e thithur) nga pllaka e ELISA dhe konjuguesit AHS-VP7 antitrup specifik monoclonal ( Mab). Antitrupi në këtë test do të bllokojë reagimin midis antigjenit dhe “Mab” duke dhënë një reduktim të ngjyrosjes, sepse “Mab” drejtohet kundër VP7. Shqyrtimi do të japë një nivel të lartë sensitiviteti dhe specifiteti. ELISA bllokuese competitive është e pranishme në treg. 2.1 Procedura e testit 2.1.1Faza solide 2.1.1.1 Parafilmi i pllakave ELISA me 50-100 ng rekombinant AHSV-4 VP7 të holluar në buffer me karbonat / bikarbonat me pH 9,6, inkubojini natën në 4°C. 2.1.1.2Lajini pjatat 3 herë me kripë buferike me fosfat (pbs) 1.1 x që përmban 1.135 M NaCl dhe 0.05 % (v/v) TWEEN 20 (PBST). Pastroni pllakat me një material thithës për të larguar mbetjet e mundshme që mbesin nga larja. 2.1.2 Mostrat e testit dhe kontrolli 2.1.2.1 Mostrat e serumit që do të testohen dhe serume të kontrollit pozitiv dhe negativ, hollohen 1 në 5 në një diluent që përmban 0.35 M NaCl,0.05 % (v/v) Tween 20 dhe 0.1 Kathon, 100 μl për pus. Inkubojini për 1 orë në temperaturën 37 °C. 2.1.2.2 Lajini pllakat 5 herë në buffer me kripë fostati (PBS) 0,1 X me përmbajtje 0,135 M NaCl dhe 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Thajini pllakat me një material absorbent për të larguar çdo mbetje të mundshme nga larja. 2.1.3 Konjuguesi 2.1.3.1 Merrni 100 μl/pusetë of horseradish peroxidase- të konjuguar me Mab anti-VP7. Më parë Mab ka qenë e holluar 1/5 000 - 1/15 000 në 1/1 e një solucion e StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) në ujë të distiluar. Inkubojeni në 30 minuta në temperaturën 37 °C. 2.1.4 Lajini pllakat 5 herë më kripë buferike me fosfat (PBS) x që përmban containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Thajini pllakat me një material absorbent për të larguar çdo mbetje të mundshme nga larja. 2.1.5 Kromogjeni/ Substrati Shtoni 100 μl/pusetë kromogen/substrate solucion, i.e. 1 ml ABTS (ABTS (2,2′- Azino- bis-[ acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic]) 5 mg/ml + 9 ml substrat buferi ( 0,1 M Fosfat Citrat buffer me ph 4 që përmban 0,03 % H 2 O 2 ) dhe inkubojeni për 10 minuta në temperaturë dhome. Zhvillimi i ngjyrimit stopohet duke shtuar 100 μl/well e 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate). 2.1.6 Leximi Lexo në 405 nm në lexues ELISA. 2.2 INTERPRETIMI I REZULTATEVE 2.1.7 Përcaktoni përqindjen e bllokimit (PB) të çdo mostre duke aplikuar formulën e mëposhtme, ku ‘Abs’ qëndron për antitrupat: Abs(control-) – Abs(sample) BP= x 100 Abs(control-) – Abs(control+) 2.1.8 Mostrat që tregojnë një vlerë BP më të lartë se 50% duhet të konsiderohen si pozitive për antitrupat e sëmundjes afrikane të kuajve AHSV. 2.1.9 Mostrat që tregojnë një vlerë BP më të ulët se 45% duhet të konsiderohen si negative për antitrupat e sëmundjes afrikane të kuajve AHSV. 2.2.4. Mostrat që tregojnë një vlerë të PB midis 45% dhe 50% duhet të konsiderohen si jokonkluzive dhe duhet të rishikohen. Nëse rezultati është përsëri jokonkluziv, kafshët duhet të rishqyrtohen në mostrat e marra jo më shpejt se dy javë pas marrjes së mostrës, që konsiderohej si jokonkluzive. Neni 17 Identifikimi i agjentit Reaksioni në kohë reale i zinxhirit të transkriptimit të (rRT-PCR) Testet e identifikimit të agjentit që bazohen në metodën e zbulimit të acidit nukleik zbulojnë llojet e referencës nga nëntë serotipat e virusit të AHSV. Metoda e përshkruar në pikën 2.1 bazohet në pikën 1.2 të seksionit B në kapitullin 2.5.1 të Manualit të Testimeve Diagnostike dhe Vaksinave për Kafshët Tokësore, botimi 2016 i miratuar nga Asambleja Botërore e Delegatëve të OIE në maj 2012. Çdo metodë zbulimi RT-PCR e përdorur për testimin e mostrave, gjak ose shpretkë, në kontekstin e Direktivës 2009/156 / EC duhet të kryejë barazinë ose tejkalimin e ndjeshmërisë së metodologjive të përshkruara në pikën 2. Virusi i inaktivizuar i serotipave 1–9 të zinxhirit të referencës mund të merren nga Laboratori Referues i Bashkimit Evropian ose Laboratori Referues i OIE për sëmundjen e kuajve afrikane, Algete, Spanjë. 1. Ekstraktimi i ARN- së së virusit Për të siguruar një reagim të mirë është e nevojshme të nxjerrim nga mostra një ARN të AHSV me cilësi të lartë. Nxjerrja e acideve nukleike nga mostrat klinike mund të kryhet nga një sërë metodash të pranishme në shtëpi ose në treg. Kitet komerciale përdorin qasje të ndryshme për izolimin e ARN. Shumica janë të bazuara në njërën nga procedurat e mëposhtme: nxjerrja e acideve nukleike nga fenoli-kloroform; absorbimi i acideve nukleike në sistemin e filtrimit; absorbimi i acideve nukleike me sistemin e rruazave magnetike. Një shembull i nxjerrjes së ARN jepet më poshtë: i. g e mostrës indore homogjenizohet në 1 ml të solucionit të denatyruar (4 M guanidium thiocianate, 25 mM citrat natriumi, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5% sarkozil). 1.2 Pas centrifugimit, supernatantit i shtohet 1 μg ARN maja, 0,1 ml acetat natriumi 2 M Ph4, 1ml fenol dhe 0,2 ml kloroform / izoamil alkool përzierje (49/1). 1.3. Suspensioni shkundet fort dhe ftohet në akull për 15 minuta. 1.4. Pas centrifugimit, ARN e pranishme në fazën ujore është fenol i ekstraktuar, etanoli precipituar dhe ujë steril i risuspensuar. 2. Procedura RT-PCR në kohë reale 2.1. RT-PCR në kohë reale specifike për grupin nga Agüero et al., 2008 (1) Kjo RT-PCR në kohë reale specifike për grupin ka target VP7 të AHSV që është në gjendje të zbulojë të gjitha serotipat dhe shtamet e njohura të AHSV që qarkullojnë aktualisht. Ajo ka qenë e praktikuar me rezultate shumë të mira nga laboratorët kombëtarë referentë të Shteteve Anëtare të Bashkimit Evropian në testet e zotësisë të organizuara çdo vit nga Laboratori Referues i Bashkimit Evropian për periudhën 2009-2015. Për më tepër, në një proces gjyqësor ndërkombëtar të organizuar në vitin 2015 në kuadër të rrjetit të laboratorëve referentë të OIE, ky protokoll u rendit i lartë mes të tjerash. Sekuenca primare dhe probe për zbulimin e specieve të virusit AHSV: Primer primar 5’-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3 ‘ Primer i kundërt 5’-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3 ‘ Probe MGB-TaqMan 5’-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3 ‘ 2.1.1 Përqendrimi i stokut primar hollohet në një përqendrim prej 8 μM (‘stoku i punës primer 8 μM’), ndërsa është e holluar në një përqendrim prej 50 μM (‘sonda e punës 50 μM’). Testi i pllakave provë duhet të dizenjohet dhe të jetë e ngarkuar në softuerin e makinës PCR në kohë reale. Duke përdorur paraqitjen si një udhërrëfyes, 2.5 μl e çdo primeri srezerve, i shtohet 8 μM çdo pus që përmban mostrat e ARN, të kontrollit pozitiv dhe /ose negativ (përqendrimi përfundimtar i primerit do të jetë 1 μM në 20 μl RT -PCR përzierje). Pjata mbahet në akull. 2.1.2 2 μl e ARN të izoluar (mostrat e testit dhe kontrollit pozitiv), ose 2 μl të ARN-së të lirë në ujë kontrollet në reksion negativ, përzier me primer të kundërt. Kjo përzierje denatyrohet me ngrohje në 95°C për 5 minuta, e ndjekur nga ftohja e shpejtë në akull për të paktën 5 minuta. 2.1.3 Një vëllim i duhur i RT-PCR master mix në kohë reale, për numrin e mostrave për t’u testuar përgatitet sipas udhëzimeve të prodhuesit. 0.1 μl të aksioneve së hetuesit 50 μM shtohet në çdo pus që përmban mostra të ARN (përqendrimi përfundimtar do të jetë 0.25 μM në çdo pus që përmban mostra të ARN). 13 μl e RT-PCR në kohë reale dhe master mix shpërndahet në çdo pus në pllakën PCR që përmbajnë primer të denaturuar dhe ARN. 2.1.4 Pllaka vendoset në një cikler termik në kohë reale, e programuar për transkriptimin e kundërt, për dedektimin e amplifikimit cDNA/fluoreshente. Kushtet e amplifikimit konsistojnë në një hap të parë të transkriptimit në 48°C për 25 minuta, i ndjekur nga 10 minuta në 95°C (‘fillimi i nxehtë’) dhe 40 cikle për 15 sekonda në 95°C, 35 sekonda në 55°C ,30 sekonda në 72°C (ose 40 cikle në 97°C për 2 sekonda dhe 55°C për 30 sekonda nëse përdoren reagjentët dhe termociklet që japin reagime të shpejta). Të dhënat e fluoreshencës që merren në fund të hapit është 55°C. 2.1.5 Analiza konsiderohet e pavlefshme nëse vërehen valë amplifikimi atipik, në këtë rast analiza duhet të përsëritet. Mostrat konsiderohen pozitive, nëse vlera Ct (numri i ciklit në të cilin ndriçimi fluoreshent i gjeneruar brenda një reaksioni kalon pragun e ndriçimit fluoreshent) është më i ulët ose i barabartë me pragun e përcaktuar Ct (35) brenda 40 cikleve PCR (Ct ≤ 35). Mostrat konsiderohen jobindëse, nëse vlera Ct është më e lartë se pragu i përcaktuar Ct (35) brenda 40 cikleve PCR (Ct> 35). Mostrat konsiderohen negative, nëse merret një kurbë horizontale amplifikimi e cila nuk kalon vijën e pragut brenda 40 cikleve të PCR. 2.2 Grupi specifik në kohë reale e RT-PCR nga Guthrie et al, 2013 (1) RT-PCR në kohë reale, duke përdorur sondat e transferimit të energjisë me rezonancë fluorescente, përdoret (FRET) për të zbuluar acidin nukleik të AHSV. Analiza e AHSV RT-PCR e përshkruar, është dizenjuar duke përdorur sekuenca nga një shumëllojshmëri e gjerë e shtameve aktualisht në qarkullim të AHSV (Quan et al., 2010 (2)). Ai përfshin gjithashtu një test të kontrollit të jashtëm sintetik për të verifikuar funksionimin e duhur të komponentëve të analizës. Kitet për PCR me një hap në kohë reale janë në dispozicion edhe në treg. Më poshtë janë disa hapa themelore të përshkruara nga Guthrie et al. (2013), të cilat mund të modifikohen në varësi të kërkesave lokale / rasteve specifike, mjeteve të përdorura dhe pajisjeve në dispozicion. Sekuenca primare dhe probe për zbulimin e viruseve të specieve AHSV: Primeri primar 5’-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA- GCC-T-3 ‘ Primer i kundërt 5’-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA- TGA-3 ‘ Sonda MGB-TaqMan 5’-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3 ‘ 2.2.1. Solucioni primar dhe probe e përzierjeve stok , janë bërë në një përqendrim 25 × në 5 μΜ për primeret e primar, të kundërt dhe 3 μΜ për probe. Një test i shtresës së pllakave duhet të dizejnohet dhe të ngarkohet në softuerin e makinës PCR në kohë reale. Duke përdorur shtresën si një udhëzues, 5 μl e mostrave të ARN, duke përfshirë mostrat e testit dhe kontrollet pozitive dhe negative, vendosen në puset e përshtatshme të pllakës. 2.2.2. ARN denatyrohet me ngrohje në 95°C për 5 minuta, e ndjekur nga ftohja e shpejtë në akull për të paktën 3 minuta. 2.2.3. Përgatitet një vëllim i përshtatshëm i master mix RT-PCR në kohë reale për numrin e mostrave që do të testohen, duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. 1 μl e 25 × e primerit të përzierjes (nga pika 2.2.1 më sipër) që përfshihet në përzierjen master për të dhënë një përqendrim final në çdo pus prej 200 nM për secilën primer dhe 120 nM të sondës. 20 μl të përzierjes master shpërndahet në çdo pus në pllakën PCR që përmban ARN të denaturuar. 2.2.4. Pllaka vendoset në një cikël termik në kohë reale e programuar për transkriptimin e kundërt dhe amplifikimin cADN/zbulimin fluoreshent siç sugjerohet nga prodhuesit. Amplifikimi kushteve përbëhet, për shembull, nga një hap i parë i transkriptimit në 48°C për 10 minuta, i ndjekur nga 10 minuta në 95°C dhe 40 cikle 15 sekonda në 95°C dhe 45 sekonda në 60°C. 2.2.5. Mostrat konsiderohen pozitive, nëse fluorescenca e normalizuar për analizën AHSV RT PCR tejkalon një prag 0,1 brenda 36 cikleve të PCR në të gjitha replikimet e një mostre. Mostrat konsiderohen të papërfunduara, nëse ndriçimi i normalizuar për testin AHSV RT-PCR tejkalon një prag 0,1 midis 36 dhe 40 cikleve të PCR-së në çdo replikim të një mostre. Mostrat janë konsideruar negative, nëse ndriçimi i normalizuar për testin AHSV RT-PCR nuk tejkalon pragun 0,1 brenda 40 cikleve të PCR në të gjitha replikimet e një mostre dhe nëse fluorescenca e normalizuar për kontrollin e jashtëm sintetik tejkalon një 0, 1 prag brenda 33 cikleve PCR. ANEKS I SËMUNDJET E DETYRUESHME PËR DEKLARIM Sëmundjet e mëposhtme për kafshët njëthundrakë janë të detyrueshme për deklarim: 1. Butri (Dourina) 2. Morva 3. Encefalomieliti i njëthundrakëve 4. Anemia infektive 5. Rabies 6. Antraksi 7. Sëmundja afrikane e kuajve 8. Stomatiti vezikular ANEKS II MODEL I CERTIFIKATËS TË SHËNDETIT PËR KAFSHËT NJËTHUNDRAKË