Turkish Food Codex Notification No. 2014/53 on methods of sampling and analysis of olive oil and olive-residue oil

20 Kasım 2014 PERŞEMBE Resmî Gazete Sayı : 29181 TEBLİĞ Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığından: TÜRK GIDA KODEKSĠ ZEYTĠNYAĞI VE PĠRĠNA YAĞI ANALĠZ METOTLARI TEBLĠĞĠ (TEBLĠĞ NO: 2014/53) Amaç MADDE 1 – (1) Bu Tebliğin amacı, zeytinyağı ve pirina yağının resmi kontrolleri için analiz metotlarını belirlemektir. Kapsam MADDE 2 – (1) Bu Tebliğ, zeytinyağı ve pirina yağının analiz metotlarını kapsar. Dayanak MADDE 3 – (1) Bu Tebliğ, 29/12/2011 tarihli ve 28157 3 üncü mükerrer sayılı Resmî Gazete‘de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine dayanılarak hazırlanmıĢtır. Tanımlar MADDE 4 – (1) Bu Tebliğde geçen; a) Bakanlık: Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığını, b) Karar ağacı: Bu Tebliğ kapsamında yer alan ürünlerin özelliklerini tespit etmek için kullanılabilen sistematik iĢlemler dizinini, c) UZK: Uluslararası Zeytin Konseyi‘ni (IOC), ifade eder. Karar ağaçları MADDE 5 – (1) Bu Tebliğ kapsamındaki ürünlerin değerlendirilmesinde Ek-1‘de yer alan karar ağaçları kullanılabilir. (2) Karar ağacının kullanılmadığı durumlarda analizler 7/8/2010 tarihli ve 27665 sayılı Resmî Gazete‘de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliğinde yer alan kriterler dikkate alınarak uygun bir sıralamada gerçekleĢtirilebilir. Analiz metotları MADDE 6 – (1) Bu Tebliğ kapsamında yer alan ürünlerin resmi kontrolü için analiz metotları aĢağıdaki eklerde yer almaktadır. a) Ek-2: Serbest Yağ Asitliği Tayini b) Ek-3: Peroksit Değeri Tayini c) Ek-4: Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Mumsu Maddelerin Tayini ç) Ek-5: Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Sterol ve Eritrodiol+Uvaol (Triterpenik dialkoller) BileĢiminin ve Miktarının Tayini d) Ek-6: Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Mumsu Maddelerin, Yağ Asitleri Metil Esterleri ve Yağ Asitleri Etil Esterlerinin Tayini e) Ek-7: 2- Gliseril Monopalmitat Yüzde Miktarının Tayini f) Ek-8: Ultraviyole IĢığında Özgül Soğurma Tayini g) Ek-9A: Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Gaz Kromatografisi ile Tayini ğ) Ek-9B: Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Hazırlanması h) Ek-10: Uçucu Halojenli Çözücülerin Tayini ı) Ek-11: Natürel Zeytinyağlarına Ait Duyusal Özelliklerin Tespiti i) Ek-12: Pirinada Yağ Miktarı Tayini j) Ek-13: Stigmastadienlerin Tayini k) Ek-14: Gerçek ve Teorik ECN 42 Trigliserid Ġçeriği Arasındaki Maksimum Farkın Tayini l) Ek-15: Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Alifatik Alkol Miktarının Tayini m) Ek-16: Zeytinyağında Yabancı Yağın Tespiti Avrupa Birliği mevzuatına uyum MADDE 7 – (1) Bu Tebliğin hazırlanmasında, 11/7/1991 tarihli ve 2568/91 EEC sayılı Zeytinyağı ve Pirina Yağının Karakteristiklerini ve Ġlgili Analiz Metotlarını Belirleyen Komisyon Tüzüğü dikkate alınmıĢtır. Yürürlükten kaldırılan tebliğ MADDE 8 – (1) 7/8/2010 tarihli ve 27665 sayılı Resmî Gazete‘de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Zeytinyağı ve Pirina Yağı Numune Alma ve Analiz Metotları Tebliği (Tebliğ No: 2010/36) yürürlükten kaldırılmıĢtır. GeçiĢ hükümleri GEÇĠCĠ MADDE 1 – (1) Bu Tebliğin yayımı tarihinden önce resmi kontroller için analiz yapan kurum ve kuruluĢlar 30/6/2015 tarihine kadar bu Tebliğ hükümlerine uyarlar. (2) Bu Tebliğin yayımı tarihinden önce resmi kontroller için analiz yapan kurum ve kuruluĢlar bu Tebliğ hükümlerine uyum sağlayana kadar 8 inci madde ile yürürlükten kaldırılan Tebliğ hükümlerine uyarlar. Yürürlük MADDE 9 – (1) Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme MADDE 10 – (1) Bu Tebliğ hükümlerini Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanı yürütür. EK-1 Karar Ağacı a) Türk Gıda Kodeksi-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nin Ek-1‘inde belirtilen kriterlere uyum gösterildiğinin teyit edilmesi amacıyla uygulanır. b) Karar ağacında belirtilen analizler, karar ağacında yer alan kararlardan birine varılana kadar uygulanmak suretiyle gösterilen sırayla gerçekleĢtirilmelidir. c) Türk Gıda Kodeksi-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nde değiĢiklik olması durumunda karar ağacında söz konusu Tebliğdeki değerler kullanılmalıdır. ç) Karar ağaçları aĢağıdaki tablolarda yer almaktadır. Zeytinyağı ve pirina yağının kategorilerinin doğrulanması amacıyla alınan numuneler, aĢağıda verilen karar ağaçlarına göre veya TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliğinde yer alan kriterler dikkate alınarak uygun bir sıralamada analiz edilir. Tüm analiz sonuçları beyan edilen yağ kategorisinin özelliklerine uygun ise, yağın beyana uygun olduğu rapor edilir. Tek bir analiz sonucu beyan edilen yağ kategorisine uygun değilse, yağın beyana uygun olmadığı rapor edilir. Notlar: 1. Analiz sonuçları Türk Gıda Kodeksi Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliğinde belirtilen kalite ve saflık kriterleri ile aynı ondalıkla ifade edilir. 2. Analiz sonuçları ifade edilirken virgülden sonraki rakam 4‘ten büyükse değer 1 artırılır. Tablo 1 * TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliğindeki değerler dikkate alınır. Natürel Sızma Zeytinyağı (Kalite kriterleri) ≤ 0,8 > 0,8 ≤20 > 20 Peroksit değeri, (meq aktif oksijen/kg yağ ) E270≤0,22 E270>0,22 Delta E ≤0,01 Ultraviyole ışığında özgül soğurma Meyvemsilik medyanı (Mf) > 0 ve Kusur medyanı (Md) = 0 Meyvemsilik medyanı Mf = 0 Duyusal analiz Meyvemsilik medyanı (Mf) > 0 ve kusur medyanı (Md) >0 Yağ kategorisi kalite kriterleri açısından beyan edilen şekildedir. Tablo 3’e gidiniz (saflık kriterleri) Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Ultraviyole ışığında özgül soğurma E232≤2,50 E232>2,50 Serbest asitlik, (oleik asit cinsinden %) Yağ asidi etil esterleri* (FAEE) (mg/kg) Hayır Evet Ultraviyole ışığında özgül soğurma Delta E >0,01 Tablo 2 Natürel Birinci Zeytinyağı (Kalite kriterleri) ≤ 2,0 ≤ 20 > 20 Peroksit değeri (meq aktif oksijen/kg yağ ) E270≤0,25 E270>0,25 Ultraviyole ışığında özgül soğurma Delta E ≤0,01 Delta E >0,01 Ultraviyole ışığında özgül soğurma Meyvemsilik medyanı (Mf) > 0 ve Kusur medyanı (Md) ≤ 3,5 Meyvemsilik medyanı (Mf)=0 veya Meyvemsilik medyanı (Mf) > 0 ve Kusur medyanı (Md) > 3,5 Duyusal analiz Yağ kategorisi kalite kriterleri açısından beyan edilen şekildedir. Tablo 3’e gidiniz (saflık kriterleri) Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Yukarıdaki parametrelerin değerleri natürel sızma zeytinyağı kalite kriterlerini karşılıyor mu? (Tablo 1) Hayır Evet Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Ultraviyole ışığında özgül soğurma E232≤2,60 E232>2,60 > 2,0 Serbest asitlik (oleik asit cinsinden %) Tablo 3 * C42+C44+C46 (a) Rafine yağın mevcudiyeti (rafine zeytinyağı veya diğer tohum yağları) (b) Pirina yağının mevcudiyeti Natürel Sızma ve Natürel Birinci Zeytinyağları (Saflık kriterleri) Uygun Uygun Değil Kalite kriterleri (Tablo 1 ve 2) ≤ 0,05 > 0,05 3,5-Stigmastadienler (mg/kg) tC18:1 ≤ 0,05 t(C18:2+C18:3) ≤ 0,05 tC18:1 > 0,05 t(C18:2+C18:3) > 0,05 Trans yağ asitleri izomerleri (%) Uygun Uygun Değil Yağ asitleri kompozisyonu % ≤ |0,2| > |0,2| ΔECN 42 Uygun Uygun Değil Sterol kompozisyonu ve toplam sterol içeriği Eritrodiol+uvaol içeriği (toplam steroller içinde) (%) ≤ 150 > 150 Mumsu maddeler* ( mg/kg) ≤ 2,0 2,0 < E+U ≤4,5 > 4,5 Yağ kategorisi kalite ve saflık kriterleri açısından beyan edilen şekildedir. Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. (a) Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. Yağ türü beyan edilen kategoriye uygun değildir. (b) Tablo 4 Karar Ağacında Yer Alan Analizler Ġle Eklerde Yer Alan Analizler Arasındaki EĢleĢtirme Tablosu Serbest Asitlik Ek – 2 Serbest Yağ Asitliği Tayini Peroksit değeri Ek – 3 Peroksit Değeri Tayini UV spektrofotometrisi Ek – 8 Ultraviyole Işığında Özgül Soğurma Tayini Duyusal değerlendirme Ek – 11 Natürel Zeytinyağlarına Ait Duyusal Özelliklerin Tespiti Yağ asidi etil esterleri Ek - 6 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Mumsu Maddelerin, Yağ Asitleri Metil Esterleri ve Yağ Asitleri Etil Esterlerinin Tayini Stigmastadienler Ek – 13 Stigmastadienlerin Tayini Yağ asitlerinin trans izomerleri Ek – 9A Ek – 9B Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Gaz Kromatografisi ile Tayini Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Hazırlanması Yağ asidi kompozisyonu Ek – 9A Ek – 9B Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Gaz Kromatografisi ile Tayini Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Hazırlanması ΔECN42 Ek – 14 Gerçek ve Teorik ECN 42 Trigliserid İçeriği Arasındaki Maksimum Farkın Tayini Sterol kompozisyonu ve toplam steroller ile Eritrodiol+Uvaol Ek – 5 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi İle Sterol ve Eritrodiol+Uvaol (Triterpenik dialkoller) Bileşiminin ve Miktarının Tayini Alifatik alkoller Ek – 15 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Alifatik Alkol Miktarının Tayini Mumsu maddeler Ek – 4 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Mumsu Maddelerin Tayini 2-gliseril monopalmitat Ek – 7 2-Gliseril Monopalmitat Yüzde Miktarının Tayini EK-2 Serbest Yağ Asitliği Tayini 1. Kapsam Bu metot zeytinyağı ve prina yağındaki serbest yağ asitleri miktarının belirlenmesi için kullanılan yöntemi tanımlar. Serbest yağ asitlerinin miktarı, genel olarak hesaplanan serbest asitlik (oleik asit cinsinden, %) Ģeklinde ifade edilir. 2. Prensip Çözücü karıĢımı içinde numunenin çözündürülmesi ile çözücü ortamına geçen serbest yağ asitlerinin etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile titre edilmesidir. 3. Kimyasallar Tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve saf su kullanılmalıdır. 3.1. Çözücü karıĢımı: Dietil eter ve % 95 lik (v/v) etanolün 1:1 (v/v) oranında karıĢımı Her 100 mL‘lik etanol-dietil eter karıĢımı (v/v), kullanımdan hemen önce 0,3 mL fenolftalein indikatörü eĢliğinde etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile nötralize edilmelidir. Dietil eter yüksek derecede yanıcı olup ve patlayıcı peroksitler oluĢturabildiğinden dikkatli kullanılmalıdır. Dietil eter kullanımı mümkün değilse bunun yerine etanol ve toluen içeren bir karĢım kullanılabilir, gerektiğinde etanolün yerine ise propan-2-ol kullanılabilir. 3.2. 0,1 Molar (M) etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: (gerekirse yaklaĢık 0,5 M ): Etanollü potasyum hidroksit çözeltisinin deriĢimi, mutlaka kesin olarak bilinmeli ve kullanımdan hemen önce kontrol edilmelidir. Kullanımdan en az beĢ gün önce hazırlanmıĢ ve lastik tıpalı kahverengi cam bir ĢiĢeye konulmuĢ çözelti kullanılmalıdır. Çözelti, renksiz veya saman rengi olmalıdır. Potasyum hidroksitin kararlı renksiz çözeltisi Ģu Ģekilde hazırlanır: 1000 mL etanol, 8 g potasyum hidroksit ve 0,5 g alüminyum talaĢı ile birlikte geri soğutucu altında bir saat boyunca kaynatılır ve hemen damıtılır. Gerekli miktarda potasyum hidroksit damıtılmıĢ etanol içinde çözülür. Potasyum karbonat çökeltisinin üzerindeki berrak sıvının ayrılması için çözelti birkaç gün dinlendirildikten sonra filtre edilir. Çözelti damıtılmaksızın Ģu Ģekilde hazırlanabilir: 1000 mL etanole 4 mL alüminyum butilat eklenir ve karıĢım birkaç gün beklemeye bırakılır. Üstteki faz filtre edilir ve elde edilen distilat içinde gerekli miktarda potasyum hidroksit çözülür. Titrasyonda kullanılan etanollü potasyum hidroksit çözeltisinin yerine suyun faz ayrımına sebep olmaması Ģartıyla potasyum veya sodyum hidroksitin sulu çözeltisi de kullanılabilir. 3.3. Fenolftalein ( %1‘lik (m/v)) veya alkalin mavisi (%2‘lik (m/v)) çözeltisi: Çözeltiler % 95-96‘lık (v/v) etanol ile hazırlanmalıdır. Alkalin mavisi çözeltisi çok koyu renkli yağlar için kullanılmalıdır. 4. Cihaz ve malzemeler AĢağıdakileri içeren genel laboratuvar malzemeleri: 4.1. Analitik terazi, 4.2. Erlen: 250 mL‘lik, 4.3. Büret:10 mL‘lik (0,05 mL taksimatlı) 5 Prosedür 5.1. Analiz için numunenin hazırlanması Nem ve safsızlıklar toplamı % 1‘den az ise numunede herhangi bir iĢlem yapılmaz. Fazla ise numune filtre edilmelidir. 5.2. Numunenin alınması Beklenen asit sayısına bağlı olarak tartılacak numune miktarı Tablo 1‘e göre belirlenir ve belirlenen miktardaki numune erlene tartılır. Tablo 1- Tartılacak numune miktarı Beklenen asit sayısı* Numunenin kütlesi (g) Tartım hassasiyeti (g) < 1 20 0,05 1-4 10 0,02 4-15 2,5 0,01 15-75 0,5 0,001 >75 0,1 0,0002 *Asit sayısı: Oleik asit cinsinden serbest yağ asitliğinin yaklaĢık iki katını ifade eder. 5.3. Analiz Erlene 50–150 mL arasındaki miktarda nötralize edilmiĢ çözücü karıĢımı ilave edilerek numune çözülür. Fenolftalein eĢliğinde 0,1 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile renk değiĢene kadar karıĢtırılarak titre edilir. (Fenolfetaleinin hafif pembe rengi en az 10 saniye kalıcı olmalıdır.) 0,1 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisinin sarfiyatı 10 mL‘yi geçerse, titrasyonda 0,5 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi kullanılmalıdır. Titrasyon sırasında bulanıklık oluĢursa çözücü karıĢımından bulanıklık kayboluncaya kadar ilave edilir. 6. Sonuçların ifade edilmesi Serbest yağ asitliği: % oleik asit cinsinden ifade edilir Analiz iki paralel olarak yapılır. Ġki hesaplamanın aritmetik ortalaması olarak sonuç verilir. Serbest yağ asitliği ağırlıkça yüzde olarak aĢağıdaki formülle hesaplanır: m MAcV m MA cV    10 100 1000 Burada: V = Harcanan etanollü potasyum hidroksit çözeltisi hacmi (mL) c = Ayarlı etanollü potasyum hidroksit çözeltisinin deriĢimi (M ), MA = Oleik asitin molekül ağırlığı (= 282); m = Numune miktarı (g) EK-3 Peroksit Değeri Tayini 1. Kapsam Bu metot hayvansal ve bitkisel katı ve sıvı yağlardaki peroksit değerinin belirlenmesinde kullanılan yöntemi tanımlamaktadır. Bu analiz için alınmıĢ numuneler ıĢıktan uzakta, Ģilifli cam veya mantar tıpa ile hava almayacak Ģekilde kapatılmıĢ, tamamen dolu cam kaplar içinde ve soğukta saklanmalıdır. 2. Tanım Peroksit değeri: Tanımlanan analiz Ģartları altında potasyum iyodürü okside eden bir kilogram yağdaki aktif oksijenin milieĢdeğer ağırlığıdır. 3. Prensip Asetik asit-kloroform çözücü karıĢımı içinde çözünen numunenin potasyum iyodür çözeltisi ile muameleye tabi tutulması ve açığa çıkan serbest iyotun, ayarlı sodyum tiyosülfat çözeltisi ile titre edilmesidir. 4. Malzemeler Kullanılacak tüm ekipman indirgen veya yükseltgen maddelerden arınmıĢ olmalıdır. ġilifli yüzeylere kayganlaĢtırıcı yağ sürülmemelidir. 4.1. ġilifli cam balon: 250 mL‘lik Kullanım öncesinde kuru olmalı ve önceden içerisinden saf, kuru inert gaz (azot veya tercihen karbondioksit) geçirilmelidir. 4.2. Büret: 25 ya da 50 mL‘lik (0,1 mL taksimatlı) 5. Kimyasallar 5.1. Kloroform: Analitik saflıkta ve kuru inert bir gaz geçirilerek oksijeni uzaklaĢtırılmıĢ. 5.2. Buzlu (glasiyel) asetik asit: Analitik saflıkta ve kuru inert bir gaz geçirilerek oksijeni uzaklaĢtırılmıĢ. 5.3. DoymuĢ potasyum iyodür sulu çözeltisi: Ġyot ve iyodat içermeyen, taze hazırlanmıĢ ve aĢırı doymuĢ. 5.4. Sodyum tiyosülfat çözeltisi: (0,01 M veya 0,002 M‘lık) Kullanımdan hemen önce ayarlanmıĢ. 5.5. NiĢasta çözeltisi: 10 g/L ‘lik. Çözünebilir doğal niĢastadan taze hazırlanmıĢ sulu çözelti. 6. Prosedür Analiz direk güneĢ ıĢınlarından uzakta günıĢığının yayıldığı bir ortamda veya yapay ıĢık altında yapılmalıdır. Numune, beklenen peroksit değerine göre Tablo 1 kullanılarak Ģilifli balon içerisine 0,001g hassasiyetle tartılır. Tablo1- Tartılacak numune miktarı Beklenen peroksit değeri (meq aktif oksijen/kg yağ) Numune ağırlığı (g) 0 – 12 5,0 – 2,0 12 – 20 2,0 – 1,2 20 – 30 1,2 – 0,8 30 – 50 0,8 – 0,5 50 – 90 0,5 – 0,3 Balona 10 mL kloroform ilave edilir ve hızlı bir Ģekilde karıĢtırılarak numune çözülür. ÇözülmüĢ numunenin üzerine 15 mL asetik asit ve 1 mL potasyum iyodür çözeltisi ilave edilerek balonun kapağı hızlıca kapatılır ve 1 dakika çalkalanır. Balon, 15°C ile 25°C arasındaki sıcaklıkta ve karanlık ortamda 5 dakika bekletilir. Kapak açılır ve balona 75 mL saf su ilave edilir. Balonda oluĢan serbest iyot niĢasta çözeltisi indikatörlüğünde ve titrasyon süresince kuvvetlice çalkalanarak sodyum tiyosülfatla (beklenen peroksit değeri 12‘nin altında ise titrasyonda 0,002 M ve 12‘nin üstünde ise 0,01 M sodyum tiyosülfat çözeltisi kullanılarak) titre edilir. EĢ zamanlı olarak bir kör deneme yapılır. Eğer kör denemede 0,01 M sodyum tiyosülfat çözeltisinin sarfiyatı 0,05 mL‘yi aĢarsa kimyasallar değiĢtirilir. 7. Sonuçların ifade edilmesi Analiz iki paralel olarak yapılır. Sonuç iki hesaplamanın aritmetik ortalamasıdır. Peroksit değeri (PV) kilogram baĢına aktif oksijenin milieĢdeğer ağırlık cinsinden aĢağıdaki formül ile hesaplanır; m cVV PV   )(1000 0 Burada; V = Analiz için harcanan ayarlı sodyum tiyosülfat çözeltisinin hacmi, (mL) V0 = Kör deneme için harcanan ayarlı sodyum tiyosülfat çözeltisinin hacmi, (mL) c = Harcanan sodyum tiyosülfat çözeltisinin kesin molaritesi; m = Numunenin ağırlığı, (g) EK-4 Kapiler Kolonlu Gaz Kromotografisi ile Mumsu Maddelerin Tayini 1. Kapsam Bu metot, zeytinyağı ve pirina yağında mumsu maddelerin analizi için kullanılan yöntemi tarif eder. Mumsu maddeler karbon atomlarının sayılarına göre ayrılır. Yöntem özellikle de mekanik ekstraksiyon ile elde edilen zeytinyağı ile çözücü ekstraksiyonu ile elde edilen pirina yağını ayırt etmek için kullanılır. 2. Prensip Uygun bir iç standart ilave edilen yağ numunelerinin aktif sulu silikajel içeren kolon kromatografisi ile fraksiyonlarına ayrılması ve trigliseritlerden daha az polaritede fraksiyonlara ayrılmıĢ numunenin test koĢulları altında doğrudan kapiler kolonlu gaz kromatografisi (GC) cihazıyla analiz edilmesidir. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. Erlen: 25 mL‘lik 3.2. Musluklu kromatografik cam kolon: Ġç çapı 15 mm ve uzunluğu 30-40 cm 3.3. Gaz kromatografi cihazı: Kapiler kolonla çalıĢmaya uygun, kolona direk bağlanabilen sistemle donatılmıĢ aĢağıdaki özelliklere sahip, 3.3.1. Termostatik fırın: Kolonlar için sıcaklık programına sahip 3.3.2. On-column enjeksiyon bloğu: Kolonun içine direk giriĢ için 3.3.3. Alev-iyonizasyon dedektörü. 3.3.4. Bilgisayar sistemi ve yazıcı: PC aracılığıyla gaz kromotografi verilerini kayıt edebilecek 3.3.5. Kapiler kolon: Uzunluğu 8 -12 m, iç çapı 0,25-0,32 mm, film kalınlığı 0,10-0,30 μm olan cam ya da eritilmiĢ silisten. (SE-52, SE-54 veya eĢdeğeri kolon) 3.4. Mikroenjektör: Kolona doğrudan (on-column) enjeksiyon için, 10 μL‘ lik 3.5. Elektrovibratör 3.6. Vakumlu döner buharlaĢtırıcı (rotary evaporator) 3.7. Kül fırını 3.8. Analitik terazi: ± 0,1 mg hassasiyette 3.9. Genel laboratuvar cam malzemeleri 4. Kimyasallar 4.1. Silikajel: Granül büyüklüğü 60-200 μm arasında olmalıdır. Silikajel kül fırınında 500 ºC‘de en az dört saat bekletilir. Soğuduktan sonra, silikajel miktarına bağlı olarak % 2 oranında su ilave edilir. SulandırılmıĢ silikajel homojenize etmek için iyice çalkalanır. Kullanmadan önce karanlık bir yerde en az 12 saat tutulur. 4.2. n-hekzan: Kromatografik saflıkta 4.3. Etil eter: Kromatografik saflıkta 4.4. n-heptan: Kromatografik saflıkta 4.5. Ġç standart: % 0,1‘lik (m/v) lauril araĢidat standart çözeltisi. n-hekzan ile hazırlanır. Ġç standart olarak palmitil palmitat ya da miristil stearat kullanmak da mümkündür. 4.5.1. Sudan I (1-fenil-azo-2-naftol): % 1‘lik. n-hekzan/dietileterin 99:1 (v/v) oranındaki karıĢımı içerisinde hazırlanır. 4.6. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 4.7. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen Yüksek saflıkta kuru hava 5. Prosedür 5.1. Kromatografi kolonun hazırlanması: 15 g silikajel n-hekzanla bulamaç hale getirilerek cam kolona boĢaltılır. Silikajelin kolona kendiliğinden yerleĢmesi için beklenir. Kolon içeriğini daha homojen hale getirmek için elektrovibratör kullanılarak yerleĢme tamamlanır. Safsızlıkları uzaklaĢtırmak için 30 mL n hekzan kolondan geçirilerek yıkama yapılır. 5.2. Numunenin hazırlanması 25 mL‘lik erlen içine tam olarak 500 mg numune tartılır ve tahmin edilen mumsu madde miktarı doğrultusunda uygun miktarda iç standart çözeltisi ilave edilir. Örneğin, zeytinyağı için 0,1 mg lauril araĢidat ve pirina yağı için 0,25-0,50 mg arasında lauril araĢidat içeren standart çözeltisi eklenir. Yıkama iĢlemini görsel kontrol edilmek isteniyorsa yıkamaya baĢlamadan 100 µL sudan I boyası, kolona aktarılma aĢamasındaki numune çözeltisi içine eklenir. Erlen içerisine 2 mL n-hekzan ilave edilerek karıĢtırılır ve karıĢım kromatografi kolonuna aktarılır. Erlen tekrar 2 mL n-hekzan ile çalkalanarak kromatografi kolonuna aktarılır. n-alkanları uzaklaĢtırmak için 70 mL n-hekzan kolondan geçirilir ve çözücü (n hekzan) silikajel seviyesinin 1 mm üstünde kalacak Ģekilde çözücünün geçmesine izin verilir ve cam kolonun musluğu kapatılır. Daha sonra her 10 saniyede yaklaĢık 15 damla akıĢ hızı sağlanacak Ģekilde günlük hazırlanmıĢ n-hekzan:etil eter (99:1 oranında) karıĢımı ile kromatografik yıkama yapılarak yaklaĢık 200-220 mL süzüntü toplanır. Numune yıkama iĢlemi oda sıcaklığında yapılmalıdır. Renklendirici olarak kullanılan sudan I boyasının alıkonma zamanı trigiliseritler ile mumsu maddeler arasında olduğundan bant kolonun alt noktasına ulaĢtığında yıkama iĢlemine son verilir. Çünkü tüm mumsu maddeler yıkanarak alınmıĢtır. Toplanan süzüntüdeki çözücüler 2 mL kalana kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. Kalan çözücü zayıf azot akımı altında uçurulduktan sonra kalıntı üzerine 2-4 mL n heptan eklenir. 5.3. Gaz kromatografisi ile analiz 5.3.1. Hazırlık Kapilar kolon giriĢ kısmı direk enjeksiyon sistemine, çıkıĢ kısmı dedektöre bağlantı yapılarak kolonun gaz kromatografisi cihazına takılması sağlanır. Eğer kolon ilk kez kullanılacak ise Ģartlandırılmalıdır. Bunun için kolondan biraz taĢıyıcı gaz geçirilir ve sonra cihaz açılır. Fırın kademeli ısıtılarak yaklaĢık 4 saat sonra 350 ºC‘ye ulaĢması sağlanır. Bu sıcaklıkta en az 2 saat bırakılır ve cihaz analizin yapılacağı çalıĢma koĢullarına ayarlanır (gaz akıĢı düzenlenir, ateĢleme yapılır, fırın, dedektör ve enjektör sıcaklığı ayarlanır vb.). Analiz için gerekli olan duyarlılıktan en az iki kat yüksek duyarlılıkta sinyal kaydedilmelidir. Baseline, herhangi bir pik olmaksızın doğrusal olmalı ve herhangi bir sapma göstermemelidir. Negatif doğrusal sapma : Kolon bağlantılarının doğru yapılmadığını gösterir. Pozitif sapma : Kolonun yeterince Ģartlanmadığını gösterir. 5.3.2. ÇalıĢma Ģartlarının seçimi ÇalıĢma Ģartları genellikle aĢağıdaki Ģekildedir: fırın sıcaklığı: 20 °C/dk 5 °C/dk 20 °C/dk BaĢlangıç 80 °C (1dk) 240°C 325°C (6 dk) 340 °C (10 dk) Dedektör sıcaklığı: 350 ºC, Enjeksiyon miktarı: 1 µL (2-4 mL n-heptan çözeltisinden) TaĢıyıcı gaz: Seçilen gaz için doğru doğrusal akıĢ hızında helyum ya da hidrojen olabilir. Cihaz duyarlılığı: aĢağıdaki Ģartlara uygun olmalıdır: KoĢullar, tüm mumsu maddelerin ayrılması ve yeterli pik çözünürlüğü (ġekil 1) elde edilebilecek Ģekilde kolon ve gaz kromatografisinin özelliklerine bağlı olarak değiĢtirilebilir; iç standardın (C32) alıkonma zamanı 18±3 dakika olmalıdır. En iyi temsilci mumsu madde piki tüm skalanın en az % 60‘ında yer almalıdır. Söz konusu pik alanlarının doğru değerlendirilmesi amacıyla pik integrasyon parametreleri oluĢturulmalıdır. En yüksek sıcaklıkta, tüm skalanın %10‘undan fazla pozitif sapmaya izin verilmemelidir. 5.3.3. Analiz performansı 10 μL‘lik bir mikro enjektör yardımıyla 1μL numune çözeltisi alınır ve iğne boĢalana kadar piston geri çekilir. Ġğne enjeksiyon sisteminin içine sokularak bir-iki saniye sonra hızlıca enjekte edilir. YaklaĢık beĢ saniye sonra iğne yavaĢça çıkarılır. Mumsu maddeler ve sterol esterleri tamamen ayrılana kadar analize devam edilir ve veriler kaydedilir. Baseline her zaman gerekli koĢulları karĢılamalıdır. 5.4. Piklerin tanımlanması Pik tanımlaması, alıkonma zamanı bilinen mumsu maddelerin karıĢımının aynı Ģartlarda analiz edilmesiyle elde edilen tanımlanmıĢ piklerle yapılır. ġekil 1‘de bir zeytinyağına ait mumsu maddelerin kromatogramı verilmiĢtir. 5.5. Mumsu madde miktarının hesaplanması Bilgisayar programı yardımı ile iç standart olan lauril araĢidat ve C40 – C46 arasındaki alifatik esterlerin pik alanları saptanır. Esterlerin her birinin mumsu madde içeriği (mg/kg yağ) aĢağıdaki formüle uygun olarak hesaplanır. mA mA s sx    1000 (mg/kg)Ester Burada: Ax = Milimetre karede her esterin pikinin alanı; As = Milimetre karede iç standardın pikinin alanı; ms = Eklenen lauril araĢidin miligram cinsinden miktarı; m = Analiz numunesinin gram cinsinden miktarı 6. Sonuçların ifade edilmesi C40 – C46 arasındaki istenilen farklı mumsu maddelerin toplamı olarak mg/kg (ppm) cinsinden verilir. C40-C46 esterleri arasında karbon sayılarına göre pik bileĢenlerini gösteren zeytinyağına ait örnek bir kromatogram ekteki Ģekilde verilmiĢtir. Eğer C46 esteri kromatogramda iki defa görülüyorsa C46 esterinin belirgin Ģekilde büyük olduğu pirina yağında mumsu madde fraksiyonu analiz edilerek bu pikin tanımlanması önerilir. Sonuçlar bir ondalık basamak ile verilir. ġekil 1 Zeytinyağının mumsu maddeler kromatogramı* I.S. = Lauril araĢidat 1 = Diterpenik esterleri 2 + 2' = C40 esterleri 3 + 3' = C42 esterleri 4 + 4' = C44 esterleri 5 = C46 esterleri 6 =Sterol esterleri ve triterpenik alkol * Sterol esterlerin ayrımından sonra kromatogramda belirgin hiçbir pik (trigliseridler) görülmemesi gereklidir. EK-5 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi Ġle Sterol ve Eritrodiol+Uvaol (Triterpenik dialkoller) BileĢiminin ve Miktarının Tayini 1. Kapsam Bu metot zeytinyağı ve pirina yağındaki sterol kompozisyonu ve toplam sterol miktarı ile triterpenik dialkollerin belirlenmesi yöntemini tanımlar. 2. Prensip Ġç standart olarak α-kolestanol ilave edilmiĢ yağ numunesi etanollü potasyum hidroksit ile sabunlaĢtırıldıktan sonra sabunlaĢmayan maddeler dietil eterle ekstrakte edilir. Sterol ve triterpenik dialkoller fraksiyonu diğer sabunlaĢmayan maddelerden bazik silikajel plaka üzerinde ince tabaka kromotografisi kullanılarak ayrılır. Plaka üzerinden alınan sterol ve triterpenik dialkol bandı trimetil-silil esterlerine dönüĢtürülerek kapiler kolonlu GC ile analiz edilir. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. ġilifli geri soğutucu: 250 mL‘lik balona uygun 3.2. Ayırma hunileri: 500 mL‘lik 3.3. ġilifli balon: 250 mL‘lik 3.4. Cam plaka ince-tabaka kromatografisi için gerekli olan malzemeler 3.5. UV lamba: 366 veya 254 nm dalga boyu olan. 3.6. Enjektörler: 100 μL ve 500 μL‘lik. 3.7. Huni ve siyah bant süzgeç kâğıdı 3.8. Ağzı Ģilifli armudi balon: 50 mL‘lik 3.9. Deney tüpü: Konik dipli ve contalı kapağı olan, 10 mL‘lik. 3.10. Gaz kromatografi cihazı: Kapiler Kolonlu, Split/Splitless enjeksiyon sistemi ile aĢağıdaki parçaları bulunan 3.10.1. Kolonlar için termostat kontrollü, ±1º C hassasiyetle çalıĢabilen fırın. 3.10.2. Split sisteme uygun liner içeren ve sıcaklığı ayarlanabilen enjeksiyon bloğu 3.10.3. Alev-iyonizasyon dedektörü 3.10.4. Gerekli bilgisayar sistemi ve bilgisayar sistemine bağlı yazıcı 3.11. Kapiler kolon: Uzunluğu 20-30 m, iç çapı 0,25–0,32 mm, % 5 difenil-% 95 dimetilpolisiloksan içeren ve film kalınlığı 0,10–0,30 μm olan, camdan ya da eritilmiĢ silisten (SE-52 , SE-54 veya eĢdeğeri kolon) 3.12. Gaz kromatografi enjektörü: SertleĢtirilmiĢ iğneli 10 μL‘lik. 3.13. Analitik terazi: 0,1 mg hassasiyetli 3.14. Desikatör 4. Kimyasallar 4.1. Potasyum hidroksit: En az % 85 saflıkta 4.2. 2 M Etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: 130 g potasyum hidroksit 200 mL saf su içinde soğutularak çözülür ve etanolle bir litreye tamamlanır. Bu çözelti koyu renkli ĢiĢede ağzı iyice kapatılarak maksimum 2 gün saklanır. 4.3. Etil eter: Analitik saflıkta 4.4. 0,2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: 13 g potasyum hidroksit 20 mL saf su içinde çözülür ve etanolle 1 litreye tamamlanır. 4.5. Susuz sodyum sülfat: Analitik saflıkta 4.6. Cam plakalar: Silikajel ile kaplanmıĢ, floresan özelliği olmayan, 0,25 mm kalınlıkta. (Kullanıma hazır olarak bulunmaktadır.) 4.7. Toluen: Kromatografik saflıkta 4.8. Aseton: Kromatografik saflıkta 4.9. n-hekzan: Kromatografik saflıkta 4.10. Etil eter: Kromatografik saflıkta 4.11. Etanol: Analitik saflıkta 4.12. Etil asetat: Analitik saflıkta 4.13. Ġnce-tabaka kromatografisi için referans çözelti: Kolesterol veya fitosteroller ile eritrodiol veya uvaolün etil asetat içindeki % 5‘lik çözeltisi. 4.14. % 0,2 lik etanollü 2,7-dikloroflorosein çözeltisi: Birkaç damla 2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ilave edilerek hafifçe bazik hale getirilir. 4.15. Susuz piridin: Kromatografik saflıkta 4.16. Heksametil disilizan: Analitik saflıkta 4.17. Trimetilklorosilan: Analitik saflıkta 4.18. Sterol trimetilsilil eterin referans çözeltileri: Bunları içeren yağlardan elde edilen saf sterol ya da sterol karıĢımlarından kullanılacağı zaman hazırlanır. 4.19. α-kolestanol (GC saflıkta) iç standart çözeltisi: Etil asetatta hazırlanmıĢ % 0,2‘lik (m/v) çözelti. 4.20. Fenolftalein çözeltisi: 10 g/L‘lik, etanolle hazırlanmıĢ. 4.21. Hareketli faz: n-hekzan/etil eter 65:35 (v/v) oranındaki karıĢımı 4.22. Silillendirme reaktifi: piridin/hekzametil disilazan/trimetil klorosilan 9:3:1 (v/v/v) 4.23. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 4.24. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen, helyum, azot ve kuru hava 5. Prosedür 5.1. SabunlaĢmayan maddelerin hazırlanması 5.1.1. Numunenin sterol içeriğinin yaklaĢık % 10‘u kadarına karĢılık gelecek % 0,2‘lik α kolestanol çözeltisi 500 μL‘lik enjektör kullanarak 250 mL‘lik balona ilave edilir. Örneğin, 5 g numune için zeytinyağına 500 μL, pirina yağına ise 1500 μL % 0,2‘lik α-kolestanol çözeltisi ilave edilir. Ilık su banyosunda azot gazı akımında kurutulduktan ve balon soğutulduktan sonra filtre edilmiĢ numuneden aynı balona 5±0,01 g tartılır. Önemli miktarda kolesterol içeren yağlar kolestanol ile aynı çıkıĢ zamanında pik verebilir. Böyle numunelerin sterol fraksiyonu iç standart ilave ederek ve etmeyerek ikili analiz ile belirlenir veya kolestanol yerine iç standart olarak betülinol kullanılır. 5.1.2. Balona 2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisinden 50 mL ilave edilir ve balon geri soğutucuya takılır. SabunlaĢmanın gerçekleĢmesi için (çözelti berrak hale gelene kadar) mantolu ısıtıcıya konularak kaynayıncaya kadar ısıtılır. Berraklık oluĢtuktan (yaklaĢık 20 dk) sonra geri soğutucunun üzerinden 50 mL saf su ilave edilir. Geri soğutucu çıkarılır ve balon yaklaĢık 30 º C sıcaklığa soğutulur. 5.1.3. Balonun içindekiler birkaç defa saf suyla çalkalanarak 500 mL‘lik ayırma hunisine dikkatlice aktarılır. YaklaĢık 80 mL etil eter ayırma hunisine ilave edildikten sonra 60 saniye kadar güçlü bir Ģekilde çalkalanır (çalkalama esnasında gaz basıncı artacağından kapaklı ayırma hunisi ters çevrilerek musluktan havası alınmalıdır) ve faz ayrımı için bekletilir. Alt faz ikinci bir ayırma hunisine alınır. Ġlk ayırma hunisinde kalan üst fazdan her seferinde 60-70 mL etil eter kullanılarak aynı Ģekilde iki ekstraksiyon daha yapılır ve ikinci ayırma hunisine alınır. Herhangi bir emülsiyon oluĢumu az miktarda etanol ilavesiyle yok edilebilir. 5.1.4. Tek bir ayırma hunisinde toplanan üç eter ekstraktı yıkama suyu nötr bir reaksiyon verene kadar (fenolftalein indikatörlüğünde) saf su (her seferde 50 mL) ile yıkanır. Yıkama suyu atıldıktan sonra, eter fazı susuz sodyum sülfat ile filtre edilerek darası alınmıĢ 250 mL‘lik Ģilifli balona süzülür. Huni az miktarda etil eter ile yıkanır. 5.1.5. Birkaç mL etil eter kalıncaya kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda (30 o C sıcaklıkta) etil eter damıtılarak uzaklaĢtırıldıktan sonra hafif bir vakum veya azot akımı kullanılarak kuru hale getirilir. Tamamen kuruması için 103 ± 2 ºC sıcaklıktaki etüvde yaklaĢık 15 dakika tutulur ve desikatörde soğutulduktan sonra tartılır. 5.2. Sterol ve triterpenik dialkol fraksiyonunun ayrılması 5.2.1. Bazik plakaların hazırlanması: Silikajel plakaları 0,2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisine 10 saniye süreyle tamamen daldırılır, sonra kuruması için çeker ocakta iki saat bırakılır ve son olarak 100 ºC‘deki etüvde 1 saat bekletilir. Etüvden çıkarılır ve kullanılıncaya kadar kalsiyum klorür bulunan desikatörde bekletilir. Bu Ģekilde bir iĢleme tabi tutulan plakalar 15 gün içerisinde kullanılmalıdır. Bazik silikajel plakaları sterol ve triterpenik dialkol fraksiyonlarını ayırmak için kullanılacağı zaman sabunlaĢmayan maddeleri alümina ile iĢleme tabi tutmaya gerek yoktur. Ġnce tabaka kullanıldığında tüm asidik bileĢikler (yağ asitleri ve diğerleri) numunenin ilk uygulandığı çizgide kalacak, sterolleri içeren bant da alifatik ve triterpen alkolleri içeren banttan net bir Ģekilde ayrılacaktır. 5.2.2. Hareketli faz, yürütme tankı içine yaklaĢık 1 cm yükseklikte olacak Ģekilde doldurulur. Alternatif olarak 50:50 (v/v) oranındaki n-hekzan/etil eter karıĢım hareketli faz olarak da kullanılabilir. Yürütme tankının kapağı kapatılır ve sıvı-buhar dengesinin oluĢması için en az yarım saat kadar 15-20 ºC arasındaki ortam sıcaklığında bekletilir. Yürütme tankının iç duvarına çözeltiye batırılmıĢ filtre kâğıdı Ģeritleri konulabilir. Bu iĢlem, yürütme süresini yaklaĢık üçte bir oranında azaltır ve bileĢenlerin daha düzgün ve belirgin bir Ģekilde ayrımını sağlar. Yürütme tankının içindeki çözelti her çalıĢmada yenilenmelidir. 5.2.3. SabunlaĢmayan maddelerin etil asetatta yaklaĢık % 5‘lik çözeltisi hazırlanır. Çözeltinin 300 μL‘lik kısmı 100 μL‘lik enjektör kullanarak silikajel plakanın alt ucuna yaklaĢık 2 cm mesafede mümkün olduğu kadar ince ve düzgün bir çizgi halinde enjekte edilir. (Damlacıkların küçük olmasına ve birbiriyle karıĢmayacak Ģekilde verilmesine dikkat edilmelidir.) Kontrol için plakanın çizgi ile aynı hizadaki bir ucuna 2-3 μL referans çözeltiler damlatılır, böylece yürütmeden sonra sterol+triterpen dialkol bandı tanımlanabilir. 5.2.4. Plaka 5.2.2.‘de belirtildiği Ģekilde hazırlanmıĢ olan yürütme tankına konulur. Ortam sıcaklığı 15-20 ºC arasında tutulmalıdır. Yürütme tankının kapağı derhal kapatılır ve hareketli faz plakanın üst kenarının yaklaĢık 1 cm altına gelinceye kadar yürütme iĢlemine devam edilir. ĠĢlem sonunda tanktan çıkarılan plaka kuruması için bir süre normal ortamda ya da hafif sıcak hava akımında bekletilir. Yüksek sıcaklık ayrımı kötüleĢtirir. 5.2.5. Plakaya % 0,2‘lik 2,7-dikloroflorosein çözeltisi homojen Ģekilde püskürtülür ve hafifçe kurutulur. Plaka üzerinde referans gölge esas alınarak sterol ve triterpen dialkol bandı sınırları UV ıĢık altında iĢaretlenir. (ġekil 1) 5.2.6. Metal bir kazıma spatulası kullanarak iĢaretlenmiĢ alandan silikajel kazınır. Kazınan silikajel içine süzgeç kâğıdı yerleĢtirilmiĢ huniye konulur. Darası alınmıĢ 50 mL‘lik ağzı Ģilifli armudi balonda süzüntü toplanacak Ģekilde 10 mL sıcak etil asetat spatula ile dikkatlice karıĢtırılarak huniye aktarılır. Süzüntü aynı balonda toplanacak Ģekilde hunideki kalıntı üç kez etil eterle (her sefer yaklaĢık 10 mL) yıkanır. Süzüntüdeki çözücüler düĢük sıcaklıktaki (40 ºC‘yi aĢmayacak Ģekilde) vakumlu döner buharlaĢtırıcıda 4-5 mL kalıncaya kadar uçurulur. Kalan çözelti kuru hale gelene kadar hafif bir azot akımı altında uçurulur. Birkaç damla aseton ilave edilir ve kuruyana kadar tekrar hafif bir azot akımı altında uçurulur. 5.3. Trimetilsilil eterlerin hazırlanması. 5.3.1. Sterol ve triterpen dialkol fraksiyonu içeren ağzı Ģilifli armudi balona silillendirme reaktifinden sterol ve triterpen dialkol miktarının her miligramı için 50 μL oranında ilave edilir. Nem, analiz sonucunu olumsuz etkilemektedir. Piyasada kullanıma hazır silillendirme reaktifleri bulunmaktadır (örneğin bis-trimetilsilil, triflor asetamid + % 1 trimetil klorosilan). Bunlar eĢit miktarda susuz piridin ile seyreltilerek kullanılmalıdır. Pridin yerine aynı miktardaki asetonitril de kullanılabilir. 5.3.2. Ağzı Ģilifli armudi balonun ağzı kapatılır, sterol ve triterpen dialkol tamamen çözünene kadar dikkatlice balon döndürülerek (ters çevirmeden) cidarlarda kalan sterollerin de silillendirilmesi sağlanır. Ortam sıcaklığında 15 dk kadar bekletilir. Berrak çözelti GC‘ye enjeksiyon için hazırdır. OluĢabilecek hafif opaklık normaldir ve herhangi bir soruna yol açmaz. Askıda beyaz parçacık oluĢması veya pembemsi rengin oluĢması ortamda nem mevcut olduğunu veya reaktifin bozulduğunu gösterir. Eğer bunlar gözlenirse analiz mutlaka tekrarlanmalıdır. 5.4. Gaz kromatografisi ile analiz 5.4.1. Ön iĢlemler 5.4.1.1. Kolon giriĢ kısmı split enjeksiyon sistemine, çıkıĢ kısmı dedektöre bağlantı yapılarak gaz kromatografisi cihazına takılır. Gaz kromatografisi cihazının genel kontrolü yapılır (gaz akıĢı, dedektör ve kayıt edicinin iĢleyiĢinin etkinliği vb) 5.4.1.2. Eğer kolon ilk kez kullanılacak ise Ģartlandırılmalıdır. Kolonun içinden düĢük akıĢ hızı ile taĢıyıcı gaz geçirilir. Kolon, çalıĢma sıcaklığının en az 20 ºC‘nin üzerinde olacak Ģekilde kademeli olarak ısıtılır ve bu sıcaklıkta en az 2 saat süre tutulur. ġartlandırma sıcaklığı kolon için belirtilen en yüksek sıcaklığın 20 ºC altında olmalıdır. Cihaz çalıĢma Ģartları ayarlanır (gaz akıĢı düzenlenir, ateĢleme yapılır, fırın, dedektör ve enjektör sıcaklığı ayarlanır vb.). Baseline, herhangi bir pik olmaksızın doğrusal olmalı ve herhangi bir sapma göstermemelidir. Negatif doğrusal sapma : kolon bağlantılarının doğru yapılmadığını, Pozitif sapma : kolonun yeterince Ģartlanmadığını gösterir. 5.4.2. ÇalıĢma koĢulları 5.4.2.1. ÇalıĢma Ģartları aĢağıdaki Ģekildedir:  fırın sıcaklığı: 260 ± 5 ºC,  enjeksiyon sıcaklığı: 280-300 ºC,  dedektör sıcaklığı: 280-300 ºC,  taĢıyıcı gazın doğrusal hızı: helyum 20 - 35 cm/s, hidrojen 30-50 cm/s,  split oranı: 1:50-1:100 aralığı,  cihaz hassasiyeti: en düĢük değerin 4 ile 16 katı arasında,  enjekte edilen madde miktarı: 0,5-1 μL trimetilsilil ester çözeltisi. AĢağıdaki gerekliliklere uygun bir kromotogram almak için bu koĢullar değiĢtirilebilir:  ß-sitosterol için alıkonma zamanı 20 ± 5 dk olmalı,  Kampesterol piki zeytinyağı için (ortalama içerik % 3) tam kromatogramın % 20±5‘i; soya yağı için (ortalama içerik % 20) tam kromatogramın %80±10‘u.  Tüm steroller ve triterpen dialkoller mutlaka ayrılmalıdır. Piklerin ayrılmasına ek olarak aynı zamanda pikler de birbirinden tamamen ayrılmalıdır. Yani pik bir sonraki pikten önce mutlaka baseline‘a dönmelidir. 5.4.3. Prosedür 5.4.3.1. 10 μL‘lik mikro enjektör kullanarak 1 μL hekzan alınır, içine 0.5 μL hava çekilir ve bunu takiben örnekten 0.5-1 μL alınır. Ġğneyi boĢaltmak için enjektörün pistonu kaldırılır. Ġğne enjeksiyon ünitesinin zarına batırılır ve bir-iki saniye sonra hızlıca enjekte edilir, beĢ saniye kadar sonra iğneyi yavaĢça çıkarılır. Otomatik enjeksiyon sistemi kullanılabilir. 5.4.3.2. Mevcut sterollerin ve triterpen dialkollerin trimetilsilil esterleri tamamen elde edilinceye kadar kayıta devam edilir. Baseline düz olmalıdır. (5.4.1.2) 5.4.4. Piklerin tanımlanması Her bir pikin tanımlanması alıkonma zamanları ve aynı koĢullar altında analiz edilen sterol ve triterpen dialkol trimetilsilil esterlerinin alıkonma zamanlarının karĢılaĢtırılmasıyla yapılır. Bazı yağlar için sterol ve triterpen dialkol kompozisyonu tipik kromatogramları ġekil 2 ve 3 de gösterilmektedir. SE-52 ve SE-54 kolonları için β-sitosterole göre göreceli alıkonma süreleri Tablo-1‘de verilmiĢtir.: Tablo-1 Steroller ve triterpen dialkoller için göreceli alıkonma süreleri Pik 1 Tanımlama Göreceli alıkonma süresi Ticari Adı IUPAC Adı SE 54 kolonu SE 52 kolonu 1 kolesterol Δ-5-kolesten-3β-ol 0,67 0,63 2 kolestanol 5α-kolestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadien 3β-ol 0,73 0,71 * ergosterol [24S]-24-metil-Δ-7-22-kolestatrien 3β ol 0,78 0,76 4 24-metilen-kolesterol 24-metilen-Δ-5,24-kolesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol (24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol (24R)-24-metil-kolestan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol (24R)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3β ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23 stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien 3β-ol 0,95 0,95 10 klerosterol (24S)-24-etil-Δ-5,25-kolastadien-3β ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol (24R)-24-etil-Δ-5-kolestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etil-kolestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etiliden-5-kolesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5.24 stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien 3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etil-Δ-7,24-kolestadien 3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3β-ol 1,16 1,16 17 eritrodiol 5α olean-12en-3β28 diol 1,41 1,41 18 uvaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52 1- ġekil 2 ve 3‘te kromatogramlardaki numaraları ifade etmektedir. 5.4.5. Sterol Miktarının Hesaplanması 5.4.5.1 α-kolestanol ve sterol piklerinin alanları integratör kullanarak hesaplanır. Yukarıda listelenen steroller arasında bulunmayan bileĢiklere ait pikler göz önünde bulundurulmaz. α -kolestanol için cevap katsayısı 1‘e eĢittir. 5.4.5.2. Her bir sterolün miktarı aĢağıdaki Ģekilde mg/kg örnek cinsinden hesaplanır: m m s    s x A 1000A xsterol Burada: Ax = sterol x‘in pik alanı; As = α -kolestanol pik alanı ms = miligram cinsinden eklenen α -kolestanol kütlesi; m = gram cinsinden saptama için alınan numunenin kütlesi. 5.4.6. Triterpen dialkollerin hesaplanması Eritrodiol ve uvaol yüzdesinin hesaplanması Burada: ΣA = sterollerin toplam pik alanı Er = eritrodiol pik alanı Uv = uvaol pik alanı 6. Sonuçların değerlendirilmesi 6.1. Her bir sterol miktarı örneğin mg/kg cinsinden ve toplamları da ―toplam steroller‖ olarak mg/kg cinsinden hesaplanır. 6.2. Her bir sterol yüzdesi, ilgili pik alanının sterollerin toplam pik alanına oranından hesaplanır. 100 A A x sterol % x   Burada: Ax = x‘in pik alanı ΣA = sterollerin toplam pik alanı 100 A UvEr UvEr uvaol) l(eritrodio %      1 2 3 4 Şekil 1 Sterol ve Triterpenik dialkollerin tespiti için kazınması gereken bölgeleri gösteren pirina yağına ait ince tabaka plakası Burada; 1- Squalen 2- Triterpen ve alifatik alkol 3- Steroller ve Triterpenik dialkoller 4- BaĢlangıç ve serbest yağ asitleri Şekil 2 Ham Zeytinyağının sterol ve triterpenik dialkollerin fraksiyonunun gaz kromatogramı (iç standart içeren) Şekil 3 Rafine Zeytinyağının sterol ve triterpenik dialkollerin fraksiyonunun gaz kromatogramı (iç standart içeren) EK-6 Kapiler Kolonlu Gaz Kromatografisi ile Mumsu Maddelerin, Yağ Asitleri Metil Esterleri ve Yağ Asitleri Etil Esterlerinin Tayini 1. Kapsam Bu metot, zeytinyağlarında mumsu maddelerin, yağ asitleri metil esterleri ve etil esterlerinin tayini için kullanılan yöntemi tarif eder. Mumsu maddeler ve alkil esterler karbon atomların numaralarına göre ayrılır. Bu metot, pirina yağı ile zeytinyağını birbirinden ayırmak ve natürel sızma zeytinyağı için kalite parametresi olarak natürel sızma zeytinyağına hile amacı ile karıĢtırılan düĢük kalitedeki bazı deodorize yağ (kolon yağı), ham zeytinyağı ve natürel birinci zeytinyağı gibi karıĢım yağların tespiti için kullanılır. 2. Prensip Ġç standart ilave edilen numunelerin (katı veya sıvı yağ) aktif sulu silikajel içeren kolon kromatografisi ile fraksiyonlarına ayrılması ve trigliserollerden daha az polaritede fraksiyonlara ayrılmıĢ numunenin test koĢulları altında doğrudan kapiler kolonlu gaz kromatografisi cihazıyla analiz edilmesi. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. Erlen: 25 mL‘lik 3.2. Gaz kromatografi için musluklu cam kolon: Ġç çapı 15 mm ve uzunluğu 30-40 cm olan 3.3. Kapiler kolonla çalıĢmaya uygun gaz kromatografisi Kapiler kolonla doğrudan bağlanabilen sistemle donatılmıĢ ve aĢağıdakileri ihtiva eden sistem: 3.3.1. Kolonlar için sıcaklık programına sahip termostatik hazne 3.3.2. Kolonun içine doğrudan giriĢ için soğuk enjektör 3.3.3. Alev-iyonizasyon dedektörü 3.3.4. PC aracılığıyla gaz kromatografi verilerini saklayabilecek bilgisayar sistemi ve yazıcı 3.3.5. Cam ya da eritilmiĢ silisten (Fused silica) kapiler kolon: Uzunluğu 8 -12 m, iç çapı 0,25-0,32 mm, film kalınlığı 0,10-0,30 μm olan (SE-52, SE-54 veya eĢdeğeri kolon) 3.4. Mikroenjektör: Kolona doğrudan enjeksiyon için, 10 μL‘ lik 3.5. Elektrovibratör 3.6. Vakumlu döner buharlaĢtırıcı (rotary evaporator) 3.7. Kül fırını 3.8. Analitik terazi: ± 0,1 mg hassasiyette 3.9. Genel laboratuvar cam malzemeleri 4. Kimyasallar 4.1. Silikajel: Tane büyüklüğü 60-200 μm arasında Silikajel kül fırınında 500 ºC‘de en az dört saat bekletilir. Soğuduktan sonra, silikajel miktarına bağlı olarak % 2 oranında su ilave edilir. SulandırılmıĢ silikajel homojenize etmek için iyice karıĢtırılır. Kullanmadan önce karanlık bir yerde en az 12 saat tutulur. 4.2. n-hekzan: Kromatografik saflıkta 4.3. Etil eter: Kromatografik saflıkta 4.4. n-heptan veya isooktan: Kromatografik saflıkta 4.5. % 0,05‘lik (m/v) lauril araĢidat standart çözeltisi (mumsu maddeler için iç standart): n-heptan ile hazırlanır. Burada, palmitil palmitat, miristil stearat yada araĢidil laurat kullanmak da mümkündür. 4.6. % 0,02‘lik (m/v) metil heptadekanoat standart çözeltisi (metil ve etil esterler için iç standart): n-heptan ile hazırlanır 4.7 Sudan I (1-fenil-azo-2-naftol): % 1 oranında, hekzanla hazırlanmıĢ 4.8. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 4.9. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen ve kuru hava 5. Prosedür 5.1. Kromatografi kolonun hazırlanması: 15 g silikajel n-hekzanla bulamaç hale getirilerek cam kolona boĢaltılır. Silikajelin kolona kendiliğinden yerleĢmesi için beklenir. Kromatografik dolguyu daha homojen hale getirmek için elektrovibratör kullanılarak tam olarak yerleĢmesi sağlanır. Safsızlıkları uzaklaĢtırmak için 30 mL n-hekzan kolondan geçirilirilerek yıkama yapılır. 25 mL‘lik erlen içine tam olarak 500 mg numune tartılır ve tahmin edilen mumsu madde miktarı doğrultusunda uygun miktarda iç standart çözeltisi ilave edilir. Örneğe bağlı olarak zeytinyağı için 0,1 mg, pirina yağı için 0,25-0,50 mg arasında lauril araĢidat içeren ve zeytinyağı için 0,05 mg metil heptadekanoat içeren standart çözeltisi eklenir. Süzme iĢlemini görsel kontrol edebilmek için süzmeye baĢlamadan 100 µL sudan I boyası, kolona aktarılma aĢamasındaki numune çözeltisi içine eklenir. Erlen içeriğine 2 mL n-hekzan ilave edilerek karıĢtırılır ve karıĢım kromatografi kolonuna aktarılır. Erlen tekrar 2 mL n-hekzan ile yıkanarak kromatografi kolonuna aktarılır. Çözücü (n-hekzan) silikajel seviyesinin 1 mm üstünde kalacak Ģekilde akıĢa izin verilir ve cam kolonun musluğu kapatılır. Daha sonra her 10 saniyede yaklaĢık 15 damla akıĢ hızı ayarlanarak günlük hazırlanmıĢ n-hekzan:etil eter (99:1 oranında(v/v)) karıĢımı ile kromatografik yıkama yapılarak 220 mL süzüntü toplanır. Bu fraksiyon mumsu maddeleri, metil ve etil esterleri içerir. Toplanan süzüntü numune oda sıcaklığında 22 ± 4 °C‘de tutulmalıdır. Renklendirici olarak kullanılan sudan I boyası, trigliseritleri boyadığından altta kalan renksiz kısım mumsu maddeleri temsil etmektedir. Renklenen kısım kolonun alt noktasına ulaĢtığında süzme iĢlemine son verilir. Toplanan renksiz kısım mumsu maddelerdir. Toplanan süzüntü numunedeki çözeltisi 2 mL kalana kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. Kalan çözücü zayıf azot akımı yardımı ile uçurulur, sonra kalıntı üzerine 2-4 mL n heptan veya isooktan eklenir. 5.2. Gaz kromatografisi ile analiz 5.2.1. Hazırlık Kolon giriĢ kısmı doğrudan enjeksiyon (on-column) sistemine, çıkıĢ kısmı dedektöre bağlantı yapılarak gaz kromatografisine takılır. Eğer kolon ilk kez kullanılacak ise Ģartlandırılmalıdır. Kolonun içinden düĢük akıĢ hızı ile taĢıyıcı gaz geçirilir ve cihaz açılır. Kademeli olarak ısıtılarak yaklaĢık 4 saatte 350 ºC‘ye ulaĢması sağlanır. Bu sıcaklıkta en az 2 saat kalır, cihaz çalıĢma Ģartları ayarlanır (gaz akıĢı düzenlenir, ateĢleme yapılır, fırın, dedektör ve enjektör sıcaklığı ayarlanır vb.). Baseline, herhangi bir pik olmaksızın doğrusal olmalı ve herhangi bir sapma göstermemelidir. Negatif doğrusal sapma : Kolon bağlantılarının doğru yapılmadığını gösteririr. Pozitif sapma : Kolonun yeterince Ģartlanmadığını gösterir. 5.2.2. ÇalıĢma koĢulları ÇalıĢma Ģartları genellikle aĢağıdaki Ģekildedir: fırın sıcaklığı: 80 °C baĢlangıç sıcaklığında 1 dk bekletildikten sonra 20 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 140 °C ye çıkarılır. Daha sonra 5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 335 °C ye çıkarılır ve 20 dakika bekletilir. 20 °C/dk 5 °C/dk BaĢlangıç 80 °C (1dk) 140 °C 335 °C (20dk) Dedektör sıcaklığı: 350 ºC, Enjeksiyon miktarı: 1 µL n-heptane çözeltisi (2-4 mL ) TaĢıyıcı gaz: seçilen gaz için doğrusal hızda helyum ya da hidrojen olabilir. Cihaz hassasiyeti: aĢağıdaki Ģartlara uygun olmalıdır: ÇalıĢma koĢulları, mumsu maddelerin, yağ asitleri metil ve etil esterlerinin ve lauril araĢidat iç standardının çok iyi bir Ģekilde ayrıldığı yeterli pikler (ġekil 2, 3 ve 4) elde edilebilmesi için kolon ve gaz kromatografisinin özelliklerine bağlı olarak değiĢtirilebilir. Genelde, metil ve etil esterleri iç standardı metil heptadekonat piki skalada tam olarak görüldüğünde mumsu maddelere ait en yüksek pikin de tüm skalada % 60‘ın üzerinde görülebilmesi gerekmektedir. Pik alanlarından istenilen doğru değerlendirmenin yapılabilmesi amacıyla pik entegrasyon parametreleri oluĢturulmalıdır. En yüksek sıcaklıkta, tüm skalanın % 10‘nundan fazla pozitif sapma olmamalıdır. 5.2.3. Analiz performansı 10 µL‘lik bir mikro enjektör yardımıyla 10 µL numune çekilir. Ġğne enjeksiyon sisteminin içine sokularak bir-iki saniye sonra hızlıca enjekte edilir, yaklaĢık beĢ saniye sonra yavaĢça çıkarılır. Mumsu maddeler ve sterol esterleri tamamen ayrılana kadar analize devam edilir Baseline her zaman gereken koĢulları karĢılamalıdır. 5.2.4. Piklerin tanımlanması Pik tanımlaması, alıkonma zamanı bilinen mumsu maddeler karıĢımının aynı Ģartlarda analiz edilmesiyle elde edilen tanımlanmıĢ piklerle yapılır. Zeytinyağının ana yağ asitleri (palmitik ve oleik) metil ve etil esterleri karıĢımından alkil esterleri belirlenir. 5.2.5. Mumsu madde miktarın hesaplanması Bilgisayar programı yardımı ile iç standart olan lauril araĢidat ve C40–C46 arasındaki alifatik esterlerin pik alanları saptanır. Esterlerin her birinin mumsu madde içeriği (mg/kg yağ) aĢağıdaki formüle uygun olarak hesaplanır. Burada: Ax = Her esterin pik alanı; As = Ġç standardın pik alanı; ms = Eklenen lauril araĢidin miligram cinsinden miktarı; m = Analiz numunesinin gram cinsinden miktarı 5.2.6. Metil ve etil esterleri miktarının hesaplanması Ġç standart olarak kullanılan metil heptadekanoat ile C16–C18 arasındaki yağ asitleri metil ve etil esterlerinin pik alanları saptanır. Esterlerin her birinin alkil ester içeriği (mg/kg yağ) aĢağıdaki formüle uygun olarak hesaplanır. Burada: Ax = C16 ve C18 esterlerinin ayrı ayrı pik alanları; As = iç standart olarak ilave edilen metil heptadekanoat‘ın pik alanı; ms = Eklenen metil heptadekanoat miligram cinsinden miktarı; m = Analiz numunesinin gram cinsinden miktarı 6. Sonuçların ifade edilmesi C40–C46 arasındaki farklı mumsu maddelerin içerikleri ve bu içeriklerin toplamı mg/kg (ppm) cinsinden verilir. C16–C18 arasındaki metil ve etil esterleri içerikleri ve bu içeriklerin toplamı mg/kg (ppm) cinsinden verilir. Etil ve metil esterlere ait örnek kromatogramlar ġekil 2,3 ve 4‘te verilmiĢtir C40-C46 esterleri arasında karbon sayılarına göre pik bileĢenlerini gösteren zeytinyağına ait örnek bir kromatogram ekteki ġekil 1‘de verilmiĢtir. Tanımlama amacıyla, eğer C46 esteri bölünmüĢse, C46 pikinin ağır bastığı pirina yağı mumsu madde analizi kuvvetle tavsiye edilir. mA mA s sx    1000 (mg/kg)Ester mA mA s sx    1000 (mg/kg)Ester ġekil 1 Zeytinyağının mumsu maddelerinin kromatogramı* Alıkonulma zamanı 5‘ten 8 dakikaya kadar olan kesim yağ asitleri metil ve etil esterleridir. I.S. = Lauril araĢidat 1 = Diterpenik esterleri 2 + 2' = C40 esterleri 3 + 3' = C42 esterleri 4 + 4' = C44 esterleri 5 = C46 esterleri 6 =Sterol esterleri ve triterpenik alkol * Sterol esterlerin ayrımından sonra kromatogramda belirgin hiçbir pik (trigliseridler) görülmemesi gereklidir. ġekil 2 Natürel Zeytinyağının Metil Esterleri, Etil Esterleri ve Mumsu Maddelerine ait kromatogram Burada: 1- Metil C16 6- Squalen 2- Etil C16 7- Lauril araĢidat I.S. 3- Metil heptadekanoat I.S. A-Diterpenik esterler 4- Metil C18 B-Mumsu maddeler 5- Etil C18 C-Sterol ve triterpenik esterler ġekil 3 Natürel Sızma Zeytinyağı Metil Esterleri, Etil Esterleri ve Mumsu Maddeleri kramotogramı Burada: 1- Metil heptadekanoat I.S. A- Diterpenik esterler 2- Metil C18 B- Mumsu maddeler 3- Etil C18 C- Sterol ve triterpenik esterler 4- Squalen 5- Lauril araĢidat I.S. ġekil 4 Natürel Sızma Zeytinyağı ve aynı yağın %20 deodorize yağ içeren karışımına ait kromatogram Burada: 1- Metil miristat I.S. 6- Metil oleat 2- Metil palmitat 7- Metil stearat 3- Etil palmitat 8- Etil linoleat 4- Metil heptadekanoat I.S. 9- Etil oleat 5- Metil linoleat 10- Etil stearat EK-7 2-Gliseril Monopalmitat Yüzde Miktarının Tayini 1. Kapsam Bu metot 2-gliseril monopalmitatın değerlendirilmesiyle trigliseritlerin 2-pozisyonundaki palmitik asitin yüzdesinin belirlenmesi için gerekli yöntemi tanımlar ve oda sıcaklığındaki (20 ºC) sıvı bitkisel yağlara uygulanabilir 2. Prensip Yağ numunesi hazırlandıktan sonra, pankreatik lipaz etkisiyle gerçekleĢen 1- ve 3 pozisyonundaki trigliserit moleküllerinin kısmi ve spesifik hidrolizlenmesi sonucu görünür durumdaki 2 pozisyonlu mono-gliseritler ayrılır. Monogliserit fraksiyonundaki 2-gliserit monopalmitat yüzdesi silillendirilmenin ardından kapiller kolonlu GC kullanılarak belirlenir. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1 Erlen: 25 mL‘ lik 3.2 Beherler: 100, 250 ve 300 mL‘ lik 3.3 Musluklu kromatografik cam kolon: Ġç çapı 21-23 mm, uzunluğu 400 mm olan, 3.4 Mezürler:10, 50, 100 ve 200 mL‘ lik 3.5 Balonlar: 100 ve 250 mL‘lik 3.6 Vakumlu döner buharlaĢtırıcı 3.7 Cam santrifüj tüpleri: 10 mL‘ lik, konik dipli, kapaklı 3.8 Santrifüj cihazı: 10 ve 100 mL‘lik tüplere uygun 3.9 Su banyosu: 40 ±0,5 ºC‘ye ayarlanabilen 3.10 Pipetler: 1 ve 2 mL‘ lik, dereceli 3.11 Plastik enjektör: 1 mL‘ lik (tıbbi enjektör) 3.12 Mikro enjektör: 100 μL‘lik 3.13 Ayırma hunisi: 1000 mL‘ lik 3.14 Kapilar gaz kromatografi cihazı: On-column enjeksiyon bloğuna sahip ve ±1 ºC hassasiyetli termostat kontrollü fırın ile donanımlı, kapiler kolonla çalıĢmaya uygun 3.15 Soğuk enjeksiyon bloğu (on column): Kolonun içine direk enjeksiyon için 3.16 Alev-iyonizasyon dedektörü (FID) 3.17 Bilgisayar sistemi ve yazıcı: Gaz kromotografi verilerini kaydedebilecek 3.18 Kapiler kolon: Uzunluğu 8-12 m, iç çapı 0,25-0,32 mm, film kalınlığı 0,10-0,30 μm olan cam ya da eritilmiĢ silisten (Fused silica), metilpolisiloksan ya da % 5 fenil metilpolisiloksan ile kaplanmıĢ, 370 ºC sıcaklıkta kullanıma uygun 3.19 Enjektör: 10 μL‘lik. En az 7,5 cm uzunluğunda sertleĢtirilmiĢ iğnesi olan ve kolonun içine direk enjeksiyon için uygun 4. Kimyasallar 4.1. Silikajel: Tanecik boyutu 0,063-0,200 mm olan (70/280 mesh), HazırlanıĢı; Slikajel 160 ⁰C‘lik etüvde 4 saat kurutulur, desikatörde oda sıcaklığına soğutulur. % 5 oranında su eklenir (152g silika jel+8g saf su) ağzı kapatılıp dikkatlice homojenize edilir. Kullanmadan en az 12 saat önce hazırlanmalıdır. 4.2. n-hekzan: Kromatografik saflıkta, 4.3. Ġzopropanol 4.4. Ġzopropanolun 1:1 lik (v/v) sulu çözeltisi 4.5. Pankreatik lipaz enzimi: Lipaz aktivitesi 2,0-10 ünite/mg olan (aktivitesi 2-10 mg/ünite olan enzim ticari olarak mevcuttur), 4.6. Tampon çözelti: 1:1 (v/v) oranında seyreltilmiĢ HCl çözeltisi ile pH‘sı 8‘ e ayarlanmıĢ 1 M‘lık tris (hidroksimetil)aminometanın sulu çözelti 4.7. Sodyum kolat çözeltisi: Enzimatik saflıktaki kimyasalın sulu % 0,1‘lik çözelti. Bu çözelti hazırlandıktan sonra 2 hafta içinde kullanılmalıdır. 4.8. Kalsiyum klorür çözeltisi: % 22‘ lik (m/v) sulu çözeltisi, 4.9. Dietil eter: Kromatografik saflıkta 4.10. Yıkama çözeltisi; n-hekzan:dietil eter (87:13, v/v) 4.11. Sodyum hidroksit çözeltisi: % 12‘lik (m/v), 4.12. Fenolftalein çözeltisi: %1‘lik (m/v). %96‘lık (v/v) etanolle hazırlanır. 4.13. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 4.14. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen Yüksek saflıkta kuru hava 4.15. Silillendirme reaktifi: 9:3:1 (v/v/v) oranında piridin/heksametil disilazan/trimetil klorosilan karıĢımından hazırlanır. Piyasada kullanıma hazır silillendirme reaktifi bulunmaktadır (örneğin eĢit miktarda susuz piridin ile seyreltilerek kullanılan bis-trimetilsilil triflor asetamid + % 1 trimetil klorosilan). 4.16. Referans numune: Saf monogliseritler veya numunedeki yüzde miktara benzer miktarda olan ve yüzde bileĢimi bilinen monogliserit karıĢımı. 5. Prosedür 5.1 Numunenin hazırlanması: 5.1.1 Numunenin serbest yağ asitliği oleik asit cinsinden % 3‘ün altındaysa silikajel kolon kromotografisinden önce nötralizasyon iĢlemine gerek yoktur. Eğer % 3‘ ün üzerinde ise aĢağıdaki prosedür uygulanır; 5.1.1.1 Ayırma hunisine 50 g numune tartılır ve 200 mL n-hekzan eklenerek numune çözülür. 100 mL izopropanol ve yağın serbest asitlik eĢdeğerinin % 5 fazlası olacak Ģekilde % 12‘ lik NaOH çözeltisi eklenir. 1 dakika kuvvetlice çalkalanır. 100 mL saf su ilave edilerek tekrar çalkalanır. Faz ayrımı beklenir. Altta bulunan sabun fazı uzaklaĢtırılır. Çözünmeyen safsızlıklar da uzaklaĢtırılır. Hekzan fazı fenolftalein ile pembe renk vermeyinceye kadar 50 60 mL izopropanol çözeltisi (1:1) ile birkaç kez yıkanır. Hekzan, tamamen uzaklaĢana kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. Bu uygulamanın sonunda yağın serbest asitliği % 0,5‘ in altına düĢer. 5.1.2 25 mL‘lik erlene hazırlanan yağ numunesinden tam 1g tartılır. 10 mL yıkama çözeltisi içinde çözülür. Kolon kromatografisinden önce en az 15 dk bekletilir. Eğer numune çözeltisi bulanıksa santrifüj edilerek kolon kromatografisine uygun hale getirilir (500 mg silika jel içeren hazır katı faz ekstraksiyon (SPE) kartuĢları kullanılabilir.) 5.1.3 Kolonun hazırlanması: Kolonun dibine cam pipetle bir parça cam yünü yerleĢtirilir. Kolona yaklaĢık 30 mL yıkama çözeltisi eklenir. Kolondaki hava uzaklaĢtırılır. Bir beherde 80 mL yıkama çözeltisi içinde 25 g silikajel ile süspansiyon hazırlanır. Huni yardımıyla kolona transfer edilir. Bütün silikanın kolona aktarılması için yıkama çözeltisi ile defalarca yıkanır ve kolona eklenir. Musluk açılarak çözücü seviyesi silikajelin 2 mm üstüne gelinceye kadar akıtılır. 5.1.4 Kolon kromatografisi: Kolon kromatografisine uygun hale getirilmiĢ numuneli çözelti hazırlanan kolona transfer edilir. Süzüntü, tartımı alınmıĢ 250 mL‘lik balonda toplanacak Ģekilde musluk açılır ve numune silikajel seviyesine gelene kadar akıtıldıktan sonra akıĢ hızı 2 mL/dk olacak Ģekilde150 mL yıkama çözeltisi kolondan geçirilir. Böylece numune ortalama 60-70 dakikada kolondan geçer. Vakumlu döner buharlaĢtırıcıda çözücü uçurulur. Son kalıntılar da azot gazı altında uçurulur. Balon tartılır ve geri alınan miktar hesaplanır. Eğer kullanıma hazır SPE kartuĢları kullanıldıysa Ģu yol izlenir: 3 mL n-hekzan ile Ģartlandırılan kartuĢ üzerine 5.1.2‘ de hazırlanan çözeltinin 1 mL‘ si eklenir. Çözelti geçirildikten sonra 4 mL yıkama çözeltisi ile yıkanır. Toplanan çözelti 10 mL‘ lik tüpe alınarak azot gazı altında uçurulur. SPE‘ den önce ve sonra numunenin yağ asidi kompozisyonunun kontrol edilmesi gerekir. 5.2 Pankreatik lipaz ile hidroliz: 5.2.1 Hazırlanan numuneden santrifüj tüpüne 0,1 g tartılır. Her bir eklemeden sonra iyi bir Ģekilde karıĢtırılarak 2 mL tampon çözelti, 0,5 mL sodyum kolat çözeltisi ve 0,2 mL kalsiyum klorür çözeltisi sırasıyla eklenir. Tüpün ağzı kapatılır ve 40 ±0,5 ⁰C sıcaklığa getirilmiĢ su banyosunda tutulur. 5.2.2 Tüpe 20 mg lipaz eklenir. Dikkatlice karıĢtırılır. Kapağın ıslanmaması gerekir. Su banyosunda (40±0,5 ⁰C) tam olarak 2 dakika tutulur. Sonra 1 dakika kuvvetlice çalkalanır ve soğutulur. 5.2.3 1 mL dietil eter eklenir, kapağı kapatılıp kuvvetlice çalkalanır. Santrifüjlenir. Eter fazı mikro enjektörle temiz kuru bir tüpe alınır. 5.3 Silil türevlerinin hazırlanması ve gaz kromatografisi: 10 mL‘lik konik dipli bir tüpe mikro enjektör yardımıyla 5.2.3‘ te hazırlanan çözeltiden 100 μL alınır. Çözücü hafif azot akımında uçurulur, 200 μL silillendirme reaktifinden eklenir. Kapağı kapatılır ve ayrılması için 20 dakika bekletilir. 20 dakikanın sonunda kromatografi koĢullarına göre 1-5 mL n-hekzan eklenerek GC için hazır hale getirilir. 5.4 Gaz kromatografisi (GC): ÇalıĢma koĢulları: Enjeksiyon bloğunun sıcaklığı çözücünün kaynama noktasının (68 ºC) altında olmalıdır Dedektör sıcaklığı: 350 ºC Fırın Sıcaklığı: 60 ºC baĢlangıç sıcaklığında 1 dk bekletildikten sonra 15 ºC/dk sıcaklık artıĢı ile 180 ºC ye çıkarılır. Daha sonra 5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 340 °C ye çıkarılır ve 13 dakika bekletilir. 15 °C/dk 5 °C/dk BaĢlangıç 60 °C (1dk) 180 °C 340 °C (13dk) TaĢıyıcı gaz: Hidrojen ya da helyum Doğrusal akıĢ hızı ġekil 1‘deki gibi bir kromatogram elde edilecek Ģekilde ayarlanmalıdır. Alıkonma zamanı trigliseritlerin C54 piki 40±5 dakikada çıkacak Ģekilde ayarlanmalıdır (ġekil 2). (2-gliseril monopalmitat pikinin yüksekliği tüm skalanın en az % 10‘ u kadar olmalıdır.) Enjeksiyon miktarı: numunenin 5 mL n-hekzandaki çözeltisinden 0,5-1 μL 5.4.1 Piklerin tanımlanması Pik tanımlaması, alıkonma zamanı bilinen monogliserit karıĢımının aynı Ģartlarda analiz edilmesiyle elde edilen tanımlanmıĢ piklerle yapılır. 5.4.2 Miktarın hesaplanması Bilgisayar programı yardımı ile pik alanları hesaplanır. 6. Sonuçların ifade edilmesi: 2-gliseril monopalmitatın yüzdesi ilgili pik alanının toplam pik alanına (ġekil 2) oranından aĢağıdaki Ģekilde hesaplanır: % 2-gliseril monopalmitat = 100  A Ax Ax: gliseril monopalmitat pikinin alanı ∑A : Monogliserit piklerinin toplam alanı Sonuçlar bir ondalık olarak verilir. ġekil 1 % 20 esterifiye yağ ve % 80 rafine zeytinyağı karışımının lipaz ile parçalanmasından sonra silil reaktifi ile reaksiyonundan sonraki kromotogramı ġekil 2 A Kromatogramı, esterifiye edilmemiş zeytinyağının mumsu maddeler fraksiyonunun digliserid fraksiyonu ile aynı zamanda veya hemen sonrasında (8-12 m kapiler kolon) elde edilen çözeltinin lipaz aktivasyonundan sonra silillendirmesi ile elde edilmiştir. Lipaz aktivasyonundan sonra trigliserid miktarı % 15‘i geçmemelidir. 1 = Serbest yağ asitleri 2 = Monogliseridler 3 = Digliseridler 4 = Trigliserdiler * = 2-monopalmitin **= Trigliserid C54 ġekil 3 B Kromatogramı, esterifiye edilmiş zeytinyağının mumsu maddeler fraksiyonunun digliserid fraksiyonu ile aynı zamanda veya hemen sonrasında (8-12 m kapiler kolon) elde edilen çözeltinin lipaz aktivasyonundan sonra silillendirmesi ile elde edilmiştir. Lipaz aktivasyonundan sonra trigliserid miktarı % 15‘i geçmemelidir. 1 = Serbest yağ asitleri 2 = Monogliseridler 3 = Digliseridler 4 = Trigliserdiler * = 2-monopalmitin **= Trigliserid C54 7. Notlar Not 1: Uygun lipaz aktivitesine sahip olan lipaz enzimleri piyasada bulunmaktadır. Not 2: Lipaz aktivitesinin kontrol edilmesi; 165 mL 100 g/L‘lik arap zamkı çözeltisi, 15 g ezilmiĢ buz ve 20 mL nötralize yağ karıĢımı uygun bir çalkalayıcı içinde yaklaĢık 10 dakika çalkalanarak yağ emülsiyonu hazırlanır. 50 mL‘lik behere bu emülsiyondan 10 mL konulur, ardından 0,2 g/mL‘lik sodyum kolat çözeltisinden 0,3 mL ve 20 mL saf su ilave edilir. Beher içeriği 37 °C‘de sabit sıcaklıkta tutularak pH 8,3‘e ulaĢıncaya kadar 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisi damlatılır. Üzerine 0,1g/mL‘lik lipaz çözeltisinden yeteri kadar (1 mL) ilave edilir edilmez kronometre çalıĢtırılır ve pH tekrar 8,3 oluncaya kadar 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisinden damla damla eklenmeye devam edilir. Dakikada tüketilen alkali hacmi kaydedilir. Veriler kullanılarak, x ekseni zaman ve y ekseni pH seviyesini sabit tutmak için gerekli alkali çözeltisi olacak Ģekilde grafik biçiminde kaydedilir. Doğrusal bir grafiğin elde edilmesi gerekmektedir. Burada, m MV A 100  A= Lipaz Aktivitesi (lipaz unit/mg) V= Grafikten hesap edilen bir dakikada tüketilen sodyum hidroksit miktarı (mL) M= Sodyum hidroksitin molaritesi m= Kullanılan lipazın kütlesi (mg) Bir ―Lipaz Unit‖ dakikada 10 μeq asidi açığa çıkaracak lipaz miktarını ifade eder. (μeq/dk) EK-8 Ultraviyole IĢığında Özgül Soğurma Tayini 1. Amaç ve kapsam Bu metot, zeytinyağı ve pirina yağının ultraviyole ıĢıkta spektrofotometrik olarak incelenmesi yöntemini tanımlamaktadır. Elde edilen sonuçlar saklama ve iĢleme sırasında yağda meydana gelebilecek kalite değiĢimlerinin göstergesidir. Bu yöntemde belirtilen özgül dalga boylarındaki soğurma, yağlarda bulunan konjuge dien ve trien yapılarından kaynaklanmaktadır. Özgül soğurma 1% 1cm E (% 1‘lik çözeltinin 1 cm ıĢık yolundaki soğurması) ―soğurma katsayısı‖ olarak bilinen K ile eĢdeğerdir. 2. Prensip Uygun bir çözücüde çözünen numunenin belirtilmiĢ olan dalga boylarında saf çözücüye karĢı soğurmasının spektrofotometrik olarak belirlenmesidir. Tam olarak % 1‘lik (w/v) konsantrasyondaki numunenin özgül soğurması; 10 mm‘lik hücrede, izo-oktan kullanılıyorsa 232 ve 268 nm‘de, siklohekzan kullanılıyorsa 232 ve 270 nm‘de belirlenir. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. Spektrofotometre: 220-360 nm arasındaki dalga boylarında okuma yapabilen 3.2. Kapaklı kuvartz küvetler: Su veya kromatografik saflıkta uygun baĢka bir çözücü ile doldurulduklarında soğurma değerleri arasındaki fark 0,01 den büyük olmayan ve 1 cm‘lik ıĢık yoluna sahip 3.3. Balon jojeler: 25 mL‘lik 3.4. Analitik terazi: 0,0001 g hassasiyette 4. Kimyasallar Aksi belirtilmedikçe kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olacaktır. 4.1. Çözücü: 4.1.1. Ġzo-oktan (2.2.4-trimetilpentan): Spektrofotometrik saflıkta, 232 nm ve 268 nm‘de ölçüm için. 4.1.2. Siklohekzan: 232 nm ve 270 nm‘de ölçüm için 4.1.3. Kullanılacak çözücü 10 mm‘lik hücrede distile suya karĢı yapılan ölçümde 232 nm‘de 0,12‘den az, 250 nm‘de 0,05‘ten az özgül absorbansa sahip olmalıdır. 5. Prosedür 5.1. Numune homojen olmalı ve herhangi bir safsızlık içermemelidir. Ortam sıcaklığında sıvı olan yağlar yaklaĢık 30 °C‘de süzgeç kâğıdından süzülmelidir. 5.2. Tam olarak 0,25 g numune hassas bir Ģekilde 25 mL‘lik balon jojeye tartılır. Seçilen çözücü ile çözülerek, çözücü ile 25 mL'ye tamamlanır ve homojenize edilir. Elde edilen çözelti tamamen berrak olmalıdır. Eğer çözeltide opaklık veya bulanıklık varsa tekrar filtre edilmelidir. 5.3. Elde edilen bu çözelti küvete doldurulur ve yağ içeren bu çözeltinin soğurmaları spektrofotometrede 232-276 nm arasında uygun dalga boylarında saf çözücüye karĢı ölçülür. Ölçülen özgül soğurma değerleri 0,1-0,8 aralığında olmalıdır. Aksi takdirde, daha deriĢik veya daha seyreltik çözeltiler kullanılarak ölçümlerin mutlaka tekrarlanması gerekmektedir. Tüm dalgaboyu aralığında özgül soğurma ölçümü yapılması gerekli olmayabilir. 6. Sonuçların hesaplanması 6.1. ÇeĢitli dalga boylarında aĢağıdaki formülle hesaplanan özgül soğurmalar (soğurma katsayıları) kaydedilir: sc E K    Burada: Kλ = λ dalga boyundaki özgül soğurma; Eλ = λ dalga boyunda ölçülen soğurma; c = Yağ çözeltisinin konsantrasyonu (g/100 mL) s = Kuvartz küvetin geniĢliği (cm) Sonuçlar iki ondalıklı olarak ifade edilmelidir. 6.2. K aĢağıdaki formülle hesaplanır; 2 44    mm m KK KK Burada; Km: m dalga boyunda özgül soğurma En yüksek özgül soğurma (Km); izo-oktan kullanılıyorsa 268 nm‘de, siklo-hekzan kullanılıyorsa 270 nm‘de elde edilmelidir. Bulunan K sonucu E olarak da verilebilir. BİLGİ/AÇIKLAMALAR-1 Spektrofotometrenin kalibrasyonu 1. Spektrofotometre belirli aralıklarla hem dalga boyu tepkisi hem de tepkilerin doğruluğu açısından kontrol edilmelidir. 2. Dalga boyu bir cıva buhar lambası veya uygun filtreler vasıtasıyla kontrol edilebilir. 3. Spektrofotometrenin kontrolü aĢağıdaki iĢlemler uygulanarak yapılır. 0,2000 g saf potasyum kromat tartılır ve 1000 mL‘lik balon joje içinde 0,05 M potasyum hidroksitle çözdürülerek 1000 mL ye tamamlanır. Elde edilen çözeltiden tam olarak 25 mL alınır ve 500 mL‘lik balonjojeye aktarılır. Daha sonra 0,05 N potasyum hidroksitle 500 mL ye tamamlanır. Elde edilen bu çözeltinin özgül soğurması 1 cm‘lik bir küvet kullanılarak 275 nm‘de potasyum hidroksit çözeltisine karĢı (kör) ölçülür. Ölçülen soğurma değeri 0,200 ± 0,005 olmalıdır. EK-9A Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Gaz Kromatografisi Ġle Tayini 1. Kapsam Bu yöntem Ek-9B‘de belirtilen yönteme uygun olarak elde edilen yağ asidi metil esterlerinin belirlenmesi prosedürünü tanımlar. Polimerize olmuĢ yağ asitleri için uygun değildir. 2. Kimyasallar 2.1. TaĢıyıcı gaz Ġnert gaz (azot, helyum, argon, hidrojen, v.b. tam olarak kurutulmuĢ ve oksijen içeriği 10 mg/kg‘dan az.). Sadece kapiler kolonlar için taĢıyıcı gazı olarak kullanılan hidrojen gazı analizin hızını iki katına çıkarabilir. Ancak tehlikeli olabileceğinden gerekli güvenlik önlemleri alınmalıdır. 2.2. Yardımcı gazlar 2.2.1. Yüksek saflıkta hidrojen: (saflık ≥ % 99,9) Organik bileĢen içermeyen 2.2.2. Yüksek saflıkta kuru hava: Organik bileĢen içermeyen 2.3. Referans standart Saf yağ asitlerinin metil esterlerinin karıĢımı veya analiz edilecek yağ ile benzer özeliklere sahip, kompozisyonu bilinen bir yağın metil esterleri kullanılır. Çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin oksidasyonunu engellemek için önlem alınmalıdır. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. Gaz kromatografi cihazı; 3.1.1. Fırın: Kolonlar için termostat kontrollü, ±0,1 ºC hassasiyetle çalıĢabilen 3.1.2 Enjeksiyon bloğu: Split-splitless sisteme uygun liner içeren ve sıcaklığı ayarlanabilen 3.1.3 Alev-iyonizasyon dedektörü (FID) 3.1.4. Gerekli bilgisayar sistemi ve bilgisayar sistemine bağlı yazıcı 3.2. Kapiler kolon: Uzunluğu en az 60 m, iç çapı 0,25–0,32 mm, film kalınlığı 0,10–0,30 μm olan, genellikle sabit fazı poliglikol (poli(etilen glikol) 20,000), polyester (bütandiol polisüksinat) veya polar polisiloksan (siyanosilikonlar) olan. Sabit fazı çapraz bağlı olanlar uygundur. C18:3 ve C20 asitlerinin tanımlanması ve ayrılmasında polar polisiloksanların kullanımı bazı sorunlara neden olabilmektedir. 3.2.1. Kolonun Ģartlandırılması Eğer kolon ilk kez kullanılacak ise Ģartlandırılmalıdır. Kolon, fırın sıcaklık programıyla ortam sıcaklığından baĢlayarak 3 °C/dk artacak Ģekilde kolonun dayanabildiği en yüksek sıcaklığın 10 ºC altındaki sıcaklığa kadar arttırılarak Ģartlanır. ġartlandırmaya, baseline herhangi bir pik olmaksızın doğrusal oluncaya kadar devam edilir, baseline sapma göstermemelidir. Baseline doğrusal olduktan sonra bir saat bu sıcaklıkta tutulmalıdır. Ġzotermal koĢullar altında çalıĢmak için fırın tekrar 180 °C‘ye ayarlanır. Negatif doğrusal sapma: Kolon bağlantılarının doğru yapılmadığını gösterir. Pozitif sapma : Kolonun yeterince Ģartlanmadığını gösterir. 3.3. Gaz kromatografi enjektörü: SertleĢtirilmiĢ iğneli, 10 μL‘lik (0.1 μL taksimatlı) 4. Prosedür 4.1. ÇalıĢma koĢulları ÇalıĢma Ģartları aĢağıdaki Ģekildedir:  Fırın sıcaklığı: 165 °C baĢlangıç sıcaklığında 15 dk bekletildikten sonra 5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 200 °C ye çıkarılır.  Enjeksiyon sıcaklığı: 250 ºC,  Dedektör sıcaklığı: 260-280 ºC,  TaĢıyıcı gazın akıĢ hızı: 1,2 mL/dk (Analiz süresinin kısaltılması ya da daha belirgin ayrım yapılabilmesi için taĢıyıcı gazın akıĢ hızı ayarlanır. )  Enjekte edilen madde miktarı: 1 μL Split oranı: ÇalıĢılan numuneye göre optimize edilir. 4.2. Numune miktarı Ek-9B‘ye göre hazırlanmıĢ 0,1–0,2 μL metil ester çözeltisi kolona enjekte edilir. Esterlerin çözeltinin içinde olmadığı durumda, kromatografik kalitedeki heptan içinde yaklaĢık 100 mg/mL‘lik çözeltisi hazırlanır ve bu çözeltiden 0,1-1 μL enjekte edilir. Ġz miktardaki maddelerin analizi yapıldığında örnek miktarı 10 kata kadar arttırılabilir. 4.3. Analiz Genel olarak çalıĢma Ģartları 4.1.‘deki gibi olmalıdır. Fırın sıcaklığı programlandıktan sonra tüm pikler çıkana kadar sabit sıcaklıkta ayrıma devam edilir. Analiz sırasında 12 karbondan daha düĢük yağ asitlerinin ayrılması gerektiğinde, daha düĢük sıcaklıkta ve 20 karbondan daha büyük yağ asitlerinin ayrılması gerektiğinde ise daha yüksek sıcaklıkta çalıĢmak mümkündür. Örneğin, numune 12 karbondan daha düĢük yağ asitlerini içeriyorsa enjeksiyon 100 o C‘de yapılır (eğer butirik asit varsa 50 ya da 60 o C de kullanılabilir) ve hemen sıcaklık 4-8 o C/dk hızla optimum sıcaklığa artırılır. Belli durumlarda, her iki prosedür birleĢtirilebilir. Tüm bileĢenlerin ayrımı yapılana kadar sabit sıcaklıkta programa devam edilir. Eğer sıcaklık programı yapılamıyorsa 100-195 ˚C arasındaki iki sabit sıcaklık kullanılır. Eğer gerekiyorsa piklerin maskelenmesi durumunda (C18:3 ve C20:0 veya konjuge C18:3 ve C18:2‘nin eĢzamanlı olarak bulunması gibi) numune analizinin farklı polaritede iki sabit fazda yapılması önerilir. 4.4. Referans kromatogramın ve referans grafiklerin hazırlanması Numunenin çalıĢma Ģartlarıyla aynı Ģartlar altında referans standart karıĢımı analiz edilir ve yağ asitleri kompozisyonu için alıkonma süreleri veya alıkonma mesafeleri ölçülür. Alıkonma süresinin veya mesafesinin logaritmasını her doymamıĢlık derecesi için karbon atomu sayısının bir fonksiyonu olarak gösteren yarı logaritmik kâğıda iĢaretlenerek bir referans grafik elde edilir. Ġzotermal koĢullarda aynı derecede doymamıĢ olan düz zincirli asitler için grafikler düz çizgiler Ģeklinde olmalıdır. Bu çizgiler mümkün olduğunca paralel olmalıdır. Piklerin maskelenmesine neden olacak koĢullardan yani numunedeki iki bileĢeninin ayırt edilemeyeceği durumlardan kaçınmak gerekir. 5. Sonuçların ifade edilmesi 5.1. Nitel analiz Numunenin metil ester pikleri 4.4.‘te hazırlanan grafiklerle tanımlanır, gerektiğinde interpolasyon yapılır. 5.2. Nicel analiz 5.2.1. Kompozisyonun belirlenmesi Ġstisnai durumlar dıĢında toplam pik alanlarından numunenin yağ asitleri kompozisyonun bağıl yüzdeleri hesaplanır. 5.2.2. Hesaplama metotları 5.2.2.1. Genel Her bir yağ asidi yüzdesi, ilgili pik alanının yağ asitlerinin toplam pik alanına oranından hesaplanır. % i Yağ Asidi = 100 A A i Burada: Ai = Ġlgili yağ asidine ait pikin alanı A = Tüm yağ asidi piklerinin alanlarının toplamı Sonuçlar 2 ondalıklı olarak verilir. Buradaki bağıl alanlar temel alınarak yapılmıĢ hesaplamanın sonuçlarının, kütlece yüzdeyi ifade ettiği kabul edilir. Bu varsayımın geçerli olmadığı durumlar için düzeltme faktörleri kullanılır. 5.2.2.2. Düzeltme faktörlerinin kullanılması Karbon sayısı sekizden az olan yağ asitlerinin ya da ikincil grup bulunan yağ asitlerin bulunması durumunda, özellikle yüksek derecede kesinlik istendiğinde, pik alanlarının yüzde oranlarını yağ asitlerinin kütlece yüzde oranlarına çevirmek için düzeltme faktörleri kullanılır. Düzeltme faktörleri, numuneyle aynı koĢullar altında kompozisyonu bilinen metil esterlerinin referans karıĢımının analiziyle elde edilen kromatogram yardımıyla belirlenir. Bu referans karıĢım için bileĢen i’nin kütlesinin yüzde oranını aĢağıdaki formülle bulunur: 100 m m i Burada: m i = Referans karıĢım içindeki yağ asidi i‘nin kütlesi m = Referans karıĢımdaki değiĢik yağ asitlerinin kütleleri toplamı Referans karıĢım kromatogramından elde edilen yağ asidi i‘nin yüzde oranı (alan/alan) aĢağıdaki gibi hesaplanır: 100 A A i Burada: A i = Yağ asidi i‘ye karĢılık gelen pikin alanı A = Tüm yağ asidi piklerinin toplam alanı Bunu takiben düzeltme faktörü aĢağıdaki gibi hesaplanır:      mA Am K i i i Genellikle düzeltme faktörleri KC16‘yla göreceli olarak ifade edilir, göreceli faktörler aĢağıdaki gibi hesaplanır: 16 ' C i i K K K  Numunedeki her yağ asidi i‘nin içeriği, metil esterlerin kütlece yüzdesi olarak ifade edilir:   100 ' '     ii ii AK AK Sonuçlar 2 ondalıklı olarak verilir. 5.2.2.3. Ġç standardın kullanılması Bazı analizlerde (örneğin tüm yağ asitlerinin ölçülmemiĢ olduğu ve özelikle 4 ve 6 karbonlu asitlerin 16 ve 18 karbonlu asitlerle birlikte bulunduğu veya numunenin içindeki yağ asidinin tam miktarının belirlenmesinin önemli olduğu durumlarda) iç standart kullanılması gerekir. Ġç standart olarak 15 veya 17 karbonlu yağ asitleri sıklıkla kullanılır. Eğer varsa düzeltme faktörü kullanılarak hesaplama yapılmalıdır. BileĢen i‘nin metil esterler olarak ifade edilen kütlece yüzdesi aĢağıdaki formülle hesaplanır. 100 ' '    ss iis AKm AKm Burada: Ai = Yağ asidi i‘ nin pik alanı; As = Ġç standardın pik alanı; K ' i = Yağ asidi i için düzeltme faktörü (K Cl6‘ya göre); K ' s = Ġç standart için düzeltme faktörü (K C16‘ya göre); m = Numunenin mg cinsinden kütlesi; ms = Ġç standardın mg cinsinden kütlesi Sonuçlar bir ondalıklı olarak verilir. 6. Trans-izomerlerin analizi Karbon sayısı 10–24 arasındaki yağ asitlerinin trans-izomer miktarlarının belirli polaritedeki kapiler kolonlar kullanılarak tespit edilmesi mümkündür. 6.1. Kapiler kolon: Uzunluğu 60 m, iç çapı 0,25–0,32 mm, film kalınlığı 0,10–0,30 μm olan, siyanopropisilikon ile kaplanmıĢ (SP 2380, C.P. sil 88, silor 10 veya eĢdeğeri) silikadan yapılmıĢ. 6.2. Metil esterler Ek 9B‘de belirtilen prosedür ile hazırlanır. Serbest yağ asitliği % 3‘ün üzerinde olan numuneler Ek 7 fıkra 5.1 uyarınca nötralize edilmelidir. 6.3. ÇalıĢma koĢulları  Fırın sıcaklığı: 150 C-230 C (örneğin; 165 °C baĢlangıç sıcaklığında 15 dk bekletildikten sonra 5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 200 °C ye çıkarılır.)  Enjeksiyon sıcaklığı: Split/splitless sistem kullanılıyorsa 250 C, kolona doğrudan enjeksiyon (on-column) sistemi kullanılıyorsa kolonun baĢlangıç sıcaklığı;  Dedektör sıcaklığı: 260 C  TaĢıyıcı gaz: 1,2 mL/dk akıĢ hızında helyum veya hidrojen Enjekte edilen miktar, hassas Ģartlar altında C20 metil esteri (araĢidik) piki tüm skalanın % 20‘sine eĢit ya da daha fazla olacak Ģekilde ayarlanmalıdır. 6.4. Her bir pikin tanımlanması, alıkonma zamanları ve aynı koĢullar altında analiz edilen referans karıĢımlarının alıkonma sürelerinin karĢılaĢtırılmasıyla yapılır. Trans yağ asitleri aynı yağ asidinin cis izomerinden önce çıkar. Örnek kromatogram ġekil 1‘de verilmiĢtir. ġekil 1 Yağ asitlerinin trans-izomerlerinin kromatogramı (kapiler kolon kullanılarak) 6.5. ÇeĢitli trans yağ asitlerinin yüzdeleri ilgili pikin alanı ile mevcut diğer tüm pik alanları toplamları arasındaki iliĢki temel alınarak hesaplanır. AĢağıdaki yüzdeler dikkate alınmalıdır;  transoleik izomerlerin toplamı olarak TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nin Ek-1‘inde yer alan trans oktadekenoik asitlerin yüzdesi (T 18:1);  translinoleik izomerlerin toplamı olarak TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nin Ek-1‘inde yer alan trans-trans [(TT) 18:2] ile cis-trans ve trans-cis oktadekadienoik asitlerin yüzdesi [(CT+TC) 18:2];  translinolenik izomerlerin toplamı olarak TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nin Ek-1‘inde yer alan trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans cis-cis, oktadekatrienoik asitlerin yüzdesi [(TCT+CCT+CTC+TCC) 18:3]. Sonuçlar iki ondalık olarak verilir. EK-9B Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Hazırlanması Yağ asitleri metil esterlerini hazırlamak için aĢağıdaki iki yöntemden biri kullanılır Metot A: Potasyum hidroksitin metanolik çözeltisi ile trans-esterifikasyon Metot B: Metanol içinde sodyum metilat aracılığıyla ısıtılarak metillendirme ve bunu takiben asit ortamında esterifikasyon. C o zü cü Her bir metot aĢağıda belirtilen yağ kategorilerine ve belirlenecek olan analitik parametreye göre uygulanır: (a) Gerçek ve teorik ECN42 trigliserid içerikleri arasındaki farkın (∆ECN42) hesaplanması: — Metot A tüm yağ kategorilerindeki numunelere uygulanır. (silikajel kolonun içerisinden geçirilerek saflaĢtırıldıktan sonra) (b) Yağ asidi kompozisyonunun saptanması: — Metot A aĢağıdaki yağ kategorilerindeki numunelere doğrudan uygulanır: serbest yağ asitliği % 3,3‘ten az olan natürel zeytinyağları, rafine zeytinyağı, riviera rafine pirina yağı, pirina yağı — Metot B aĢağıdaki yağ kategorilerindeki numunelere doğrudan uygulanır: serbest yağ asitliği % 3,3‘ten fazla olan natürel zeytinyağları, ham pirina yağı; (c) Yağ asitlerinin trans-izomerlerinin saptanması: — Metot A aĢağıdaki yağ kategorilerindeki numunelere doğrudan uygulanır: serbest yağ asitliği % 3.3‘ten az olan natürel zeytinyağları, rafine zeytinyağı, riviera rafine pirina yağı, pirina yağı — Metot A tüm yağ kategorilerindeki numunelere uygulanır. (silikajel kolonun içerisinden geçirilerek saflaĢtırıldıktan sonra) serbest yağ asitliği % 3,3‘ten fazla olan natürel zeytinyağları, ham pirina yağı; Yağ Numunelerinin SaflaĢtırılması: Gerektiğinde, numuneler IUPAC 2.507 sayılı yöntemde tarif edilen Ģekilde bir silikajel kolonundan geçirilerek, hekzan/dietil eterle (87:13, v/v) ile yıkanarak saflaĢtırılır. Buna alternatif olarak silikajel fazlı katı-faz ekstraksiyon (SPE) kartuĢları kullanılabilir. Silikajel kartuĢ (1 g, 6 mL) vakumlu süzme sistemine yerleĢtirilerek 6 mL hekzan ile Ģartlandırılır. Kolonun kurumasını önlemek için vakum serbest bırakılır ve bunu takiben 0,5 mL hekzan içerisinde yağ (0,12 g kadar) çözeltisi kolonun içine konulur ve vakumlanır. Kolon vakum altında 10 mL hekzan/dietil eter (87:13 v/v) çözeltisi ile yıkanır. Toplanan süzüntü homojenize edilir ve iki eĢit hacme bölünür ve vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. Bunlardan biri GC için diğeri HPLC için hazırlanır. Yağ Asidi Metil Esterlerini Hazırlama Metotları 1. Metot A: Potasyum hidroksitin metanollü çözeltisi ile trans-esterifikasyonu 1.1. Kapsam Bu metot zeytinyağlarına ve serbest yağ asitliği % 3,3‘ten az olan pirina yağlarına uygulanır. Serbest yağ asitleri potasyum hidroksit ile esterifiye edilemezler. Yağ asitlerinin etil esterleri, gliseridik esterlerden daha düĢük oranda trans-esterifiye olurlar ve sadece kısmi olarak metillendirilebilirler. 1.2. Prensip Bu metot, sabunlaĢma meydana gelmeden önce ara bir aĢama olarak metil esterlerin metanollü potasyum hidroksit ile trans-esterifikasyonu ile oluĢması prensibine dayanır. 1.3. Kimyasallar Metanol: % 0.5‘ten (m/m) fazla su içermeyen Heptan: Kromatografik saflıkta. Metanollü potasyum hidroksit çözeltisi: 2 M 1.4. Malzemeler Kapaklı deney tüpleri: 5 mL‘lik. DerecelendirilmiĢ veya otomatik pipetler: 2 mL ve 0,2 mL 1.5. Prosedür 5 mL‘lik kapaklı deney tüpünün içerisine 0,1 g yağ numunesi tartılır. 2 mL heptan ilave edilir ve çalkalanır. 0,2 mL 2 M metanollü potasyum hidroksit çözeltisi eklenir, kapağı sıkıca kapatılıp 30 saniye kuvvetlice çalkalanır. Üst faz berraklaĢana kadar bekletilir. Metil esterleri içeren üst fazı ayrılır. Heptan çözeltisi gaz kromatografisine enjeksiyon için hazırdır. Haptan çözeltisi kromatografik analize kadar buzdolabında saklanmalıdır. Çözelti 12 saat içinde kullanılmalıdır. 2. Metot B: Metanollü sodyum metilat katalizörü eĢliğinde ısıtılarak metillendirilmesi ve bunu takiben asit ortamda esterifikasyonu 2.1. Kapsam Bu metot zeytinyağlarına ve serbest yağ asitliği % 3,3‘ten fazla olan pirina yağlarına uygulanır. 2.2. Prensip Bu yöntemin prensibi serbest yağ asitlerinin nötralizasyonu ve gliseridlerin metillendirilmesine ve bunu takiben yağ asitlerinin asit ortamda esterifikasyonuna dayanır (IUPAC yöntem 2.301 baĢlık 4.2). 2.3. Kimyasallar  Heptan: Kromatografik saflıkta  Metanol: Su içeriği % 0.05‘ten (m/m) az olan  Metanolü sodyum metilat çözeltisi: 0.2 M  Fenolftalein çözeltisi: % 0.2 lik metanollü  Metanollü sülfürik asit çözeltisi: 0,5 M (100 mL metanole 3 mL % 96‘lık sülfürik asit eklenir)  Doygun sodyum klorür çözeltisi 2.4. Malzemeler  ġilifli balonjoje: 50 mL‘lik  Geri soğutucu  Kaynama taĢları  Cam huni 2.5. Prosedür 0,25 g yağ numunesi 50 mL‘lik balon jojeye tartılır, bir huni yardımıyla 10 mL 0,2 M metanollü sodyum metilat ve kaynama taĢları ilave edilir. Geri soğutucuya takılır, çalkalanır ve kaynama noktasına getirilir. Çözelti 10 dakika içerisinde Ģeffaf hale gelir. Bu tepkime 15 dakika içerisinde tamamlanır. Balon ısıtıcıdan alınır, geriye akıĢ sonlanana kadar beklenir, soğutucu çıkarılır ve iki damla fenolftalein çözeltisi ilave edilir. Çözelti renksiz olana kadar birkaç mL 0,5 M metanollü sülfürik asit ilave edildikten sonra üzerine 1 mL fazlası eklenir. Soğutucu takılır ve 20 dakika tekrar kaynatılır. Isıtıcıdan alınır ve balonjoje akan su altında soğutulur. Soğutucu çıkarılır ve 20 mL doygun sodyum klorür çözeltisi ilave edilir ve çalkalanır. 5 mL heptan ilave edilir, balonjojenin ağzı kapatılır ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. Faz ayrımı için beklenir. Sulu faz, balon boynunun alt noktasına gelene kadar doygun sodyum klorür çözeltisi ilave edilir. Balonunun boyun kısmında yer alan faz me til ester içermektedir. Bu çözelti GC‘ye enjekte edilmeye hazırdır. Metot B ile metilllendirme mutlaka bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. 2.6. Metot B ile metillendirme iĢlemine alternatifler 2.6.1. Metot C 2.6.1.1. Prensip Bu metot, numunenin metanol-hidroklorik asit ile ağzı kapalı vialde 100 °C‘de metillendirilmesine dayanır. 2.6.1.2. Malzemeler  Dayanıklı cam vial: 5 mL‘lik (40- 45 mm yüksekliğinde, 14-16 mm çapında).  Pipetler: 1 ve 2 mL‘lik. 2.6.1.3. Kimyasallar Hidroklorik asitin % 2‘lik metanollü çözeltisi: Çözelti, gaz halindeki hidroklorik asit ve susuz metanolden hazırlanır. Hekzan: Kromatografik saflıkta 2.6.1.4. Prosedür Daha önceden sodyum sülfatla kurutulmuĢ ve filtre edilmiĢ olan 0,2 g yağ ve 2 mL hidroklorik asit-metanol çözeltisi cam viale konulur. Kapağı kapatılır. Vial 100 °C‘de 40 dk tutulur. Vial akan su altında soğutulur, kapağı açılır ve 2 mL saf su ve 1 mL hekzan ilave edilir . Santrifüjlenir ve hekzan fazı GC‘de analiz edilmek üzere alınır. 2.6.2. Metot D 2.6.2.1. Prensip Bu metot, numunenin geri soğutucu altında metanolhekzansülfürik asit ile ısıtılarak metillendirilmesi ve bu esterlerin petrol eteri ile ekstraksiyonu prensibine dayanır. 2.6.2.2. Cihaz ve malzemeler  Deney tüpü: Ortalama 1 m uzunluğunda hava soğutmalı yoğuĢturucuya bağlanabilen, cam bağlantı yeri olan 20 mL‘lik  Pipet: 5 mL‘lik.  Ayırma hunisi: 50 mL‘lik  Beher: 10 mL‘lik ve 25 mL‘lik  Konik tabanlı deney tüpü: 15 mL‘lik 2.6.2.3. Kimyasallar  Metillendirme reaktifi: 75:25:1 (v/v/v) oranında susuz metanolhekzankonsantre sülfürik asit (d = 1.84 g/cm 3 )  Petrol eteri  Susuz sodyum sülfat 2.6.2.4. Prosedür 0,1 g yağ 20 mL‘lik deney tüpünün içerisine konulur ve 5 mL metillendirme reaktifi ilave edilir. Geri soğutucuya yerleĢtirilir ve kaynayan su banyosunda 30 dakika ısıtılır. Kaynamayı kontrol etmek için, deney tüpünün içerisine cam baget konulur ve su banyosunun sıcaklığı 90 °C‘de tutulur. Miktarı bilinen karıĢım, 10 mL saf su ve 10 mL petrol eterinin yardımıyla 50 mL‘lik ayırma hunisine konulur. Kuvvetlice çalkalanır ve faz ayrımı beklenir. Sulu faz atılır ve eter fazı iki defa 20 mL saf su ile yıkanır. Ayırma hunisine az miktarda susuz sodyum sülfat ilave edilir ve çalkalanır. Birkaç dakika çökmesini bekledikten sonra filtre edilir ve süzüntü 15 mL‘lik konik tabanlı deney tüpünde toplanır. Çözelti su banyosunda azot gazıyla uçurulur. 3. Metillendirme yöntemlerinin kesinlik parametreleri A ve B yöntemlerinin kesinliğinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi Uluslararası Zeytin Konseyi tarafından COI/T.20/DOC.24 sayılı yöntemi aracılığıyla yayınlanmıĢtır. Zeytinyağı ve Pirina Yağından Yağ Asidi Esterleri Gaz Kromatografisi Analizi Ġçin Öneriler 1. Prosedür Heptan içerisindeki yağ asidi metil esterleri çözeltisinin kromatografik analizleri ISO-5508 standardına uygun olarak ve kapiler kolon kullanılarak (uzunluğu 60 m ve iç çapı 0,25 mm veya 0,32 mm) siyanopropilsilikon fazı ile yağ asitlerinin trans-izomerlerinin saptanması yöntemi ile gerçekleĢtirilir (COI/T.20/Doc. no.17). ġekil 2‘de pirina yağının yağ asitleri metil ve etil esterleri ve metil esterlerin trans izomerlerini içeren tipik kromatogramı verilmektedir 2. Hesaplamalar 2.1. Yağ asidi kompozisyonu ve ∆ECN42‘nin hesaplamaları için aĢağıdaki yağ asitleri dikkate alınacaktır: Miristik (C14:0) Palmitik (C16:0) Metil ve etil estere karĢılık gelen tüm piklerin toplamı. Palmitoleik (C16:l) Metil ester ω9 ve ω7 izomerlerine karĢılık gelen tüm piklerin alanlarının toplamı. Heptadekanoik / Margarik (C17:0) Heptadesenoik / Margoleik (C17:l) Stearik (C18:0) Oleik (C18:l) Metil ester ω9 ve ω7 izomerleri, etil ester, metil esterlerin trans izomerlerine karĢılık gelen tüm piklerin alanlarının toplamı. Linoleik (C18:2) Metil ve etil esterlerin ve metil esterin trans-izomerlerine karĢılık gelen tüm piklerin alanlarının toplamı. AraĢidik (C20:0). Linolenik (C18:3). Metil ester ve metil esteri trans-izomerlerinin piklerinin alanlarının toplamı. Eikosenoik (C20:l). Behenik (C22:0). Lignoserik (C24:0). Toplam alanın hesaplanmasında squalen alanı dikkate alınmamalıdır. 2.2. Trans-C18:l yüzdelerinin hesaplanması için bu yağ asidinin metil esterlerine karĢılık gelen pik kullanılmalıdır. [trans-C18:2 + trans-C18:3] toplamı için bu asitlerin trans izomerlerine karĢılık gelen tüm piklerin toplamı alınmalıdır. Toplam alanın hesaplanması için 2.1‘de belirtilen tüm pikler dikkate alınmalıdır (COI/T.20/Doc. No. 17). Her yağ asidinin yüzdesi aĢağıdaki formüle göre hesaplanır: alan toplam 100Alan(X) %  X ġekil 2 Soğuk metilasyon metodu uygulanan pirina yağı kromatogram (Başka şekilde belirtilmediği taktirde pikler metil ve etil esterlere karşılık gelir) EK-10 Uçucu Halojenli Çözücülerin Tayini 1. Metot Metodun prensibi çözücüyle ekstrakte edilen yağlarda tetrakloroetilen miktarının tespitine dayanır. Aynı metotla 1,1,1 trikloroetan, dibromoklorometan ve bromoform da tespit edilebilir. 2. Cihaz ve malzemeler: 2.1. Gaz kromatografi cihazı: Elektron yakalama dedektörlü (ECD) 2.2. Head space (HS) cihazı 2.3. Kapiler kolon: uzunluğu 25-50 m, iç çapı 0,25-0,35 mm (SE 52/54 veya eĢdeğeri) 2.4. TaĢıyıcı ve yardımcı gaz: Kromatografik saflıkta azot veya hidrojen 1 5 ,9 6 C 1 8 :1 e ti l 1 9 ,1 6 C 1 8 :2 e ti l (Dakika) 3 1 ,3 0 s q u a le n 9 ,2 1 C 1 6 e ti l 2.5. 10-15 mL‘lik cam balon ya da 20 mL‘lik HS vialleri, teflon kaplanmıĢ ve enjektör giriĢine uygun alüminyum tıpa (HS vial kapağı) 2.6 Hermetik kapatma aleti 2.7. Gaz Ģırıngası: 0,5-2 mL‘lik 2.8. ġırınga: 1µL ve 5µL‘lik 2.9. Pipet veya Ģırınga: 40 µL‘lik 3. Kimyasallar Standart; Gaz kromotografiye uygun saflıkta halojenli çözücüler. 4. Prosedür 4.1. Cam balona yaklaĢık 3 g yağ tartılır ve hermetik olarak kapatılır. 70 °C‘de 1 saat ısıtılır. Bir enjektör kullanılarak 0,2-0,5 mL dikkatlice head space‘e verilir. Gaz kromatografi cihazı aĢağıdaki koĢullara ayarlanır: Enjeksiyon sıcaklığı: 150 °C Fırın sıcaklığı : 70-80 °C Dedektör sıcaklığı: 200-250 °C Sıcaklıklar, elde edilen sonuçlara göre ayarlanabilir. 4.2. Standart çözelti: Kalıntı bulunmayan rafine zeytinyağı kullanılarak 0,05-1 ppm aralığında (numunede beklenen miktara göre değiĢebilir) hazırlanır. Gerekliyse halojen standartlar pentan ile seyreltilebilir. 4.3. Kantitatif değerlendirme: Numunedeki pik yüksekliği, standart çözeltideki pik yüksekliği ile karĢılaĢtırılır. Eğer sapma %10‘dan büyükse standart sapma %10‘u geçmeyecek Ģekilde standart yeniden hazırlanarak tekrar numune enjekte edilmelidir. Madde içeriği her bir enjeksiyondan elde edilen sonuçların ortalaması alınarak verilmelidir. 4.4. Sonuçların verilmesi: Halojenli çözücülerin toplamı ppm (mg/kg) olarak ifade edilir. Bu metodun tespit limiti; 0,01mg/kg‘dır. EK-11 Natürel Zeytinyağlarına Ait Duyusal Özelliklerin Tespiti 1. Amaç ve kapsam Bu metodun amacı, natürel zeytinyağının lezzet karakteristiklerini değerlendirmek için ihtiyaç duyulan kriterleri saptamak ve sınıflandırması için metodolojiyi geliĢtirmektir. 2. Uygulama alanı Tarif edilen metot sadece naturel zeytinyağlarına ve bu tür yağların bir panel olarak seçilen, eğitilen ve gözlemlenen bir grup tadımcı tarafından yağdaki kusurlarının Ģiddetine, aromasına (meyvemsilik) ve diğer pozitif özelliklerine göre sınıflandırılmasında ya da etiketlenmesinde kullanılabilir. Ayrıca isteğe bağlı etiketleme için bulgular sağlar. Bu prosedürde atıf yapılan UZK standartlarının güncel versiyonları uygulanır. 3. Duyusal analiz için genel terimler IOC/T.20/Doc. No 4 ‗duyusal analiz: genel terimler‘ standardındaki terimlerdir. 4. Özel terimler 4.1. Pozitif özellikler Meyvemsi: Zeytinin çeĢidine bağlı olarak sağlıklı, taze, yeĢil ya da olgun meyveden elde edilen yağın algılanan karakteristik meyvemsi aroması. Bu koku direk olarak ve/veya burunun arkasında algılanır. Acılık: YeĢil zeytinden veya rengi dönük zeytinlerden üretilmiĢ yağın karakteristik ilk tadıdır. Dilin "V" bölgesindeki tat alma hücreleri ile algılanır. Yakıcılık: Yağın duyusal karakteristiği olan yakma hissidir. Çoğunlukla hasat zamanının baĢlangıcında hala yeĢil olan zeytinlerden üretilen yağlarda hissedilir. Bu his, tüm ağız boĢluğunda algılanabilir, özellikle boğazda hissedilir. 4.2. Negatif özellikler Kızışma-çamurumsu tortu: KızıĢma; yığın olarak saklanan veya depolanan zeytinlerden üretilen yağların, anaerobik fermantasyonunun ileri safhalarındaki zeytinlerden üretilen yağların karakteristik tat ve kokusunu tanımlar, Çamurumsu tortu; depolama tanklarının ya da fıçıların dibinde biriken tortuyla temasta bırakılan yağlarda anaerobik fermantasyon sonucu oluĢan karakteristik tat ve kokuyu tanımlar Küflü-rutubetli-topraksı: Nemli koĢullarda uzun süreli depolama sonucunda çok sayıda küf ve mayanın geliĢmiĢ olduğu meyvelerden üretilen ya da yerden (topraktan, çamurdan) toplanan meyvelerin yıkanmadan üretime katılması ile elde edilen yağların karakteristik tat ve kokusu. Şarabımsı-sirkemsi/asidik-ekşimsi: Bazı yağların Ģarap veya sirkeyi hatırlatan karakteristik tat ve kokusu. Bu tat ve koku zeytinlerin veya zeytin hamurunun preslenmesinde iyi temizlenmemiĢ hasırlar kullanılması nedeni ile aerobik fermantasyonunun baĢlaması ve sonucunda asetik asit, etil asetat ve etanol oluĢmasından kaynaklanır. Ransid: ġiddetli bir oksidasyon sürecine maruz kalan yağın karakteristik tat ve kokusudur. Islak odun(don vuruğu): Don zararına uğramıĢ zeytinlerden elde edilmiĢ yağın tadı. 4.3. Diğer negatif özellikler Isıtılmış veya yanmış: Üretim sırasında ısıtma iĢleminin yüksek sıcaklıkta ve/veya uzun süreli uygulanması sonucu oluĢan karakteristik tat ve kokudur. Bu durum, özellikle karıĢtırma sırasında hamur sıcaklığının yüksek olması sonucu oluĢur. Samansı-odunsu: KurumuĢ zeytinlerden üretilmiĢ yağların karakteristik tadı. Kaba: Bazı eski yağların ağızda yarattığı kalın, macunsu his. Makine yağı: Yağın; mazot, makine yağı veya mineral yağı anımsatan tadı. Karasu: Yağın, karasu ile uzun süreli teması sonucu fermente olmasından kaynaklanan tat. Salamura: Salamura zeytinlerden elde edilmiĢ yağın tadı. Metalik: Zeytinin ezme, karıĢtırma, presleme veya yağın depolanması esnasında metalik yüzeylerle uzun süreli temasta bulunmasından kaynaklanan tat. Hasırımsı: Yeni tasiriye torbalarıyla preslenmiĢ zeytinlerden elde edilen yağın karakteristik tadı. Bu tat, tasiriye torbalarının yeĢil veya kurutulmuĢ ottan yapılmıĢ olmasına bağlı olarak değiĢebilir. Kurtlu: Zeytin sineği (Bactrocera oleae) kurtlarının yoğun zararına uğramıĢ zeytinlerden elde edilen yağın tadı. Salatalık: Yağın, özellikle hava geçirmez özellikle teneke kaplarda çok uzun süre depolanması sonucu oluĢan 2,6 nonadienalden kaynaklanan tat. 4.4. Etiketleme için isteğe bağlı terminoloji Panel lideri, talep edildiğinde yoğunluk ve hissedilen özelliklere göre aĢağıdaki sıfatlara karĢılık gelen tanım ve aralıklara uyan yağları sertifikalandırabilir. Pozitif özellik (meyvemsi-yeĢil ya da olgun-yakıcı-acı) algılanan yoğunluğa göre: (i) Yoğun: medyan değeri 6‘dan büyük olduğunda kullanılabilir. (ii) Orta: medyan değeri 3-6 olduğunda kullanılabilir. (iii) Hafif: medyan değeri 3‘ten az olduğunda kullanılabilir. Meyvemsi: Zeytinin çeĢidine bağlı olarak sağlıklı, taze, yeĢil ya da olgun meyveden elde edilen yağın algılanan karakteristik meyvemsi aromasıdır. Bu koku direk olarak ve/veya burunun arkasında algılanır. YeĢil Meyvemsi: Taze, sağlıklı yeĢil meyveden elde edilen yağların algılanan karakteristik meyvemsi aromasıdır. Taze ve yeĢil zeytinden gelen duyusal özellik zeytin çeĢidine bağlıdır. Direk olarak ve/veya burnun arkasında hissedilir. Olgun Meyvemsi: Taze, sağlıklı olgun meyveden elde edilen yağların karakteristik aromasıdır. Taze zeytinden gelen duyusal özellik zeytinin çeĢidine bağlıdır. Direk olarak ve/veya burnun arkasında hissedilir. Dengeli: Yağın verdiği koku, tat ve his özellikleri bakımından acı ve/veya yakıcı özelliğinin medyan değeri meyvemsi özelliğinin medyan değerinin 2 puan üstünde olan yağlardır. YumuĢak Yağ: Acı ve yakıcılık özellikleri meydanlarının 2 veya daha az olan yağlar 5. Tadım bardakları IOC/T.20/Doc. No 5, ―Tadım Bardakları‖ standardına uygun bardaklar. 6. Tadım Odası IOC/T.20/Doc. No 6 ―Tadım Odalarının Hazırlanması‖ standardına uygun olmalıdır. 7. Ekipmanlar Tadımcının, görevini gerektiği gibi yerine getirebilmesi için gerekli aĢağıdaki aksesuarlar, her bir tadım kabininde temin edilmiĢ ve kolayca eriĢilebilir durumda olmalıdır. Numuneyi içeren, numaralandırılmıĢ, ağzı saat camı ile kapatılmıĢ ve 28±2˚C de tutulmuĢ tadım bardakları; Duyusal değerlendirme formu (ġekil 1) Tükenmez veya silinmeyen kalem Elma dilimleri ve/veya su, karbonatlı su ve/veya galeta içeren tabak Oda sıcaklığında su Genel kuralları içeren liste (bkz madde 9.3 ve 10.1) Tükürme kabı 8. Panel lideri ve tadımcılar 8.1. Panel lideri Panel lideri; yağ çeĢitleri konusunda uygun eğitimi almıĢ bir uzman olmalıdır. Panelde kilit pozisyondadır ve panelin organizasyonundan ve iĢleyiĢinden sorumludur. Panel liderinin görevi, temel eğitimde duyusal analiz ortamının hazırlanması, titiz davranması, duyusal yeteneğe sahip olması, testlerin organize edilmesi, testleri planlanması konusunda yeteneğe ve sabıra sahip olması, bilimsel yolla testleri gerçekleĢtimesidir. Panel lideri, tadımcıların yeteneklerini tespit etmek amacı ile onları seçme, eğitme ve izlenmesinden sorumlu tek kiĢidir. Onlar testleri ve kesin kabul ve reddetme kriterleri ile ilgili prosedürleri oluĢturmaktan ve her zaman objektif olarak tadımcıları değerlendirmekten sorumludurlar. IOC/T.20/Doc.No 14 ‗tadım panelistlerinin seçimi, eğitimi, performanslarının takibi‘ standardı rehber alınır. Panel lideri güvenilir ve objektif kanıtlarla panelin performansından ve ayrıca geliĢiminden sorumludur. Her koĢulda metot ve tadımcıların kontrol altında olduklarını her zaman kanıtlamalıdırlar. Panelin periyodik kalibrasyonu önerilir. (IOC/T.20/Doc. No 14, §5) Panel lideri panelin kayıtlarını tutmakla yükümlüdürler. Bu kayıtlar izlenebilir olmalıdır. Uluslararası duyusal analiz standartlarının kalite gereksinimlerini sağlamalı ve numunelerin gizliliğini her zaman güvence altına almalıdırlar. Bu yöntemin özelliklerine uygun alet ve ekipmanların test koĢullarına uygun olarak temizlenmesi, bakımı ve bunların kanıtlanabilir kayıtlarının tutulmasından, envanterinden sorumludurlar. Analizden sonra numunelerin saklanmasının yanı sıra laboratuvara geliĢine kadar numunelerin kabulu ve saklanması ile görevlidir. Bunu yaparken, prosesin izlenebilirliği ve garanti altına alınabilirliğinin sağlanması için yazılmıĢ prosedürler oluĢturulması amacı ile numunelerin gizli tutulmasından ve tam anlamıyla saklandığından emin olmalılar. Bununla birlikte, tadımcılar tarafından oluĢturulan verilerin birleĢtirilmesi ve istatistiksel olarak iĢlenemesi ile beraber önceden oluĢturulmuĢ protokollerle belirlenmiĢ uygun deneysel tasarıma göre tadımcılara örnekleri hazırlamak, kodlamak ve sunmaktan sorumludur. Bu standardı tamamlamak ve panel iĢlevlerini tam anlamıyla sağlamak için gerekli olabilecek diğer prosedürlerin taslak haline getirilmesi ve geliĢtirilmesi ile görevlidir. Panelin tam anlamı ile çalıĢıp çalıĢmadığından emin olmak için panelin sonuçlarını, natürel zeytinyağının analizleri ile çalıĢan diğer panellerden elde edilen sonuçlarla karĢılaĢtırmak için yollar aramalıdır. Panel lideri panel üyelerini cesaretlendirici ve onların arasındaki merak ve yarıĢma ruhunu teĢvik edici olmalıdır. Bunun için panel liderinin, yaptıkları iĢ ve elde edilen sonuçlar hakkında panel üyelerini bilgilendirmek suretiyle iki yönlü bilgi akıĢı sağlandığından emin olmaları Ģiddetle önerilmektedir. Ġlave olarak kendi fikirleri gizli olmalı ve panelistler arasında kendi kriterlerini diğer tadımcılara kabul ettirecek olası liderlerin oluĢmasını önlemelidir. Tadımcıları yeterli sayıda toplamalı ve testlerin performansı hakkında soruları cevaplamalı, ancak numune hakkında herhangi öneri yapmaktan kaçınmalıdır. 8.2. Tadımcılar Zeytinyağında yapılan duyusal testleri tadımcı olarak yapan kiĢiler herhangi bir mecburiyet hissetmeden ve parasal ödeme olmadan gönüllü yapmalıdırlar. Adaylara yazılı bir baĢvuru yapmaları tavsiye edilir. Adaylar, benzer örnekleri ayırabilme becerilerine göre panel lideri tarafından seçilmeli, eğitilmeli ve izlenmelidirler. Panelistlerin tutarlılıklarının eğitimle arttırılabilceği unutulmamalıdır. Tadımcılar gerçek duyusal inceleyicileri gibi kendi kiĢisel hislerini bir kenara koymalı ve algıladıkları duyuları raporlayacak Ģekilde hareket etmelidir. Bunu yapmak için her zaman sessiz, sakin, acele etmeden, tattıkları numuneye duyusal ilgilerini tamamıyla vererek çalıĢmadırlar. Her test için 8 ile 12 tadımcı gerekmektedir. Ancak bazı kayıplar olacağı düĢünülerek fazladan deneyimli tadımcıların bulunması uygun olabilir. 9. Tadım koĢulları 9.1. Numunenin sunumu Tadımı yapılacak örnek ilgili dökümanda (COI/T.20/Doc No:5) belirtilen standart tadım bardağı ile sunulmalıdır. Bardağa 12,8-14,6 g veya 14-16 ml yağ örneği konulur ve ağzı saat camı ile kapatılır. Bardakların üzeri her bir örnek için rakamlar veya rakam-harf kombinasyonu kullanılarak rastgele kodlanmıĢ olmalıdır. Kodlama yapılan kalem koku içermemelidir. 9.2. Tadım koĢulları, numune sıcaklığı ve tadım zamanı Örnekler koyulduktan sonra tadım bardaklarının üzeri saat camı ile kapatılarak 28 ± 2°C‘ye ayarlı ısıtıcılarda tadımcılara sunulmalıdır. Bu sıcaklık tat ve koku veren bileĢenlerin en iyi algılanabildiği sıcaklık olması nedeniyle önemlidir. Çünkü, düĢük sıcaklıkta aroma maddelerinin uçuculuğu daha düĢük iken ( IOC/T,20/Doc. No 5 ) yüksek sıcaklıklar ısıtılmıĢ yağlara özgü uçucu bileĢiklerin oluĢumunu yol açmaktadır. Tadım yapılacak ortam sıcaklığı 20-25 ºC arasında olmalıdır. (IOC/T20/Doc. No6) Sabahları test için en uygun zamandır. Gün içinde tatma ve koklama periyotlarının optimum algılandığı zamanlar olduğu ispatlanmıĢtır. Koklama ve tat alma duyuları yemekten önce yükselirken, daha sonra düĢüĢe geçer. Her ne kadar bu kriterlerde açlığın tadımcının dikkatini dağıtabileceği olasılığı çok ciddiye alınmasa da tadımcının ayırt etme kapasitesini düĢürebilir. Bu nedenle tadım zamanının sabah 10:00 ile öğlen 12:00 arasında olması tavsiye edilmektedir. 9.3. Tadımcının uyması gereken kurallar Tadımdan en az 30 dakika öncesine kadar sigara veya kahve içmemelidir. Tadım saatine kadar kokusu kaybolmayacak herhangi bir parfüm, kozmetik ürünü veya sabun kullanmamalıdır. Tadımdan bir saat öncesine kadar hiçbir Ģey yiyip içmemelidir. Eğer kendini fiziksel olarak iyi hissetmiyorsa ve bilhassa koklama veya tatma duygusu bundan etkilenmiĢse, ya da iĢine konsantre olmasını engelleyen herhangi bir psikolojik etki altındaysa, tadımcı testten çekilmesi görüĢüyle veya panelin geri kalanı için ortalama değerlerden olası sapmayı düĢünerek yerinde kararların alınması için panel liderini bilgilendirmelidir. Tadımcı duyusal değerlendirme formunda verilen bilgileri dikkatlice okumalı, kendisini görevini rahat ve sakin bir Ģekilde yapmak üzere hazır hissedinceye kadar teste baĢlamamalıdır, eğer herhangi bir Ģüphe duyarsa panel liderine danıĢmalıdır. Tadım sırasında tadımcı sessiz kalmalıdır. Tadımcı sıra kendine geldiğinde ona tahsis edilen bölümde bulunmalı ve iĢi bittiğinde düzenli ve sessiz bir Ģekilde ayrılmalıdır. Tadım sırasında konsantrasyonu bozacak davranıĢlardan uzak durulmalı ve sessiz ortam sağlanmalıdır. 10. Duyusal değerlendirme ve naturel sızma zeytinyağının sınıflandırılması prosedürü 10.1. Tadımın yapılması Tadımcı, bardağı saat camıyla kapalı tutarak eline alır ve nazikçe eğer; sonra bardağın cidarını mümkün olduğu kadar çok ıslatmak için bardağı bu pozisyonda hafifçe çalkalar. Bu aĢama tamamlanır tamamlanmaz, saat camını açar ve yağı değerlendirmek için yavaĢ ve derin nefesler alarak koklar. Koklama 30 saniyeyi aĢmamalıdır. Eğer bu süre zarfında hiçbir sonuca varılmamıĢsa, tekrar denemeden önce kısa bir süre dinlenmelidir. Koklama testi bittiğinde, tadımcı lezzet testini uygulamaya geçer ( kapsamlı koklama-tatma dokunma hissi). Lezzet testi için yaklaĢık 3 mL yağ içeren ufak bir yudum alınır. Yağı, ağzın ve dilin ön kısmından kenarlar boyunca arka kısma, damağa ve gırtlağa doğru gönderir. Yağı ağız boĢluğunun tümüne dağıtmak çok önemlidir. Çünkü dört esas tadın (tatlı, tuzlu, asitli ekĢi ve acı) algılanma yoğunluğunun, dil, damak ve gırtlağın alanına bağlı olarak farklılık gösterdiği bilinen bir gerçektir. Tadımcının acı ve yakıcı tatlara konsantre olup, tadını alabilmesi için, yeterli miktarda yağın, dilin arkası üzerinden, damak ve gırtlağa çok yavaĢ yayılması, esas olarak çok önemlidir; bu böyle olmadığı takdirde, bazı yağlarda her iki uyarı da dikkatlerden kaçar veya acılık, yakıcılık tarafından gölgelenebilir. Kısa ve ard ardına alınan nefes ile havanın ağıza doğru itilmesi, tadımcının sadece numunenin tüm ağız boĢluğuna yayılmasını değil aynı zamanda tadımcının, bu hava kanallarını zorlanması sonucu burnun arka kısmında aromatik kokuları algılamasını da sağlar. Yakıcılığın algılanmasında elle tutulur bir algılamanın dikkate alınması gerekir. Bu amaçla, yağın yutulması tavsiye edilebilir. Bir gün içerisinde en fazla üç panel (oturum) düzenlenmesi ve her panelde en fazla dört tadım yapılması önerilmektedir. Ardı ardına yapılan tadımların duyularda yorgunluğa veya kayba sebep olacağı için bir önceki tadımdan kalan yağın ağızdan uzaklaĢtırılması için bir ürün kullanılması gerekmektedir. Bunun için bir dilim elmanın çiğnenmesi ve tükürük kabına atılması önerilir. Daha sonra ağız oda sıcaklığındaki az bir miktar su durulanır. Ġki oturum arasındaki süre en az 15 dk olmalıdır. 10.2. Duyusal değerlendirme formunun tadımcılar tarafından kullanımı Tadımcılar tarafından kullanılacak olan duyusal değerlendirme formu ġekil 1‘de yer almaktadır. Paneldeki her bir tadımcı, tadım bardağındaki yağı, önce koklar (1) , daha sonra tadar, sonra negatif ve pozitif özelliklerin her biri için algıladığı yoğunluğu duyusal değerlendirme formundaki 10 cm‘lik skalaya iĢaretler. (1) Tadımcı yağı kokladığında aĢırı derecede yoğun bir kusur tespit ederse tadıma devam etmeyebilir ancak bunu duyusal değerlendirme formuna not etmelidir. Tadımcı meyvemsiliği yeĢil veya olgun olarak algıladığında, duyusal değerlendirme formunaki ilgili kutucuğu iĢaretler. Eğer tadımcı, 4. bölümde yer almayan herhangi bir negatif özellik algılayacak olursa, bunları ―diğerleri‖ baĢlığı altına, özellikleri en doğru tarif eden terim veya terimleri kullanarak kaydeder. 10.3. Verilerin panel lideri tarafından değerlendirilmesi Panel lideri, her bir tadımcı tarafından doldurulan duyusal değerlendirme formunu toplar ve kaydedilen yoğunlukları gözden geçirir. Herhangi bir anormallik gözlemlediğinde, tadımcıyı duyusal değerlendirme formunu revize etmeye ve eğer gerekliyse, testi tekrar etmeye davet eder. Panel lideri her bir tadımcının verilerini, bilgi/açıklama bölümünde belirtilen hesaplamaları yapmak amacıyla IOC/T20/Doc. No 15 dekine benzer bir bilgisayar programına kaydeder. Belirli bir numune hakkındaki veriler kullanılarak, 9 duyusal özelliği temsil eden 9 sütundan ve her bir tadımcı için bir satırdan oluĢan tablo oluĢturulur. Eğer bir kusur, panelin en azından %50‘si tarafından ‗‘diğerleri‘‘ baĢlığı altına girilmiĢse, panel lideri negatif özelliğin medyanını hesaplar ve karĢılık gelen sınıflandırmayı belirler. Duyusal değerlendirmesi yapılan yağın meyvemsi özelliğinin yeĢil veya olgun olarak panel lideri tarafından onaylanması için tadımcıların en az %50 si tarafından tespit edilmesi gereklidir. Normal koĢullarda duyusal analizin bir defa yapılması yeterlidir ancak, çeliĢkili değerlendirmeler olduğu takdirde veya yağın sınıfını belirleyen güçlü değiĢkenlik katsayısının %20‘nin üzerinde olduğu durumlarda panel lideri duyusal analizi tekrarlatmalıdır. ÇeliĢkili değerlendirmeyi doğrulamak için üçüncü kez duyusal analiz yapılmalıdır. Tekrarlanan testler farklı oturumlarda yapılmalıdır. ÇeliĢkili durumlarla sıkça karĢılaĢılıyorsa panel lideri tadımcılara ilave eğitim vermelidir (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5) ve tekrar edilebilirlik indeksi ve sapma indeksi kullanılarak panel performansı kontrol edilir (IOC/T.20/Doc. No 14, § 6). 10.4. Yağın Sınıflandırılması Yağ, kusurların medyanı ve meyvemsiliğin medyanı ile birlikte aĢağıdaki gibi sınıflandırılır. En yoğun Ģekilde hissedilen kusurun medyanı, kusurların medyanı olarak belirlenir. Kusurların ve meyvemsiliğin medyanı bir ondalık sayı Ģeklinde verilir. Yağ, kusurların medyanı ve meyvemsiliğin medyanları Tablo 1‘de verilen değerler dikkate alınarak karĢılaĢtırılarak sınıflandırılır. Bu aralıkların limitleri belirlenirken metot hatası hesaplamaya alınmalıdır. Ġstatistiksel bir tablo veya bir grafik kullanılan bilgisayar programları sınıflandırmanın görsel hale gelmesini sağlar. Tablo 1 Kusurların Ortancası/Medyanı (Md) Meyvemsi Özellik Ortancası/Medyanı (Mf) Natürel Sızma Zeytinyağı Md=0 Mf >0 Natürel Birinci Zeytinyağı 0< Md ≤ 3,5 Mf >0 Ham zeytinyağı* Md > 3,5 *Meyvemsi özellik ortancası 0‘a eĢit olduğunda kusurların ortancası 3,5‘ a eĢit ya da 3,5‘ dan küçük olsa bile ham zeytinyağı olarak kabul edilir. 10.5. Özel durum Eğer meyvemsilik dıĢındaki diğer pozitif özelliklerin medyanı 5‘ den büyükse, panel lideri bu değeri analiz sertifikasında belirtmelidir. Duyusal Değerlendirme Formu KUSURLARIN ALGILANMA YOĞUNLUĞU: KızıĢma/Çamurumsu tortu * Küflü/rutubetli /Topraksı * ġarabımsı/sirkemsi/asidik-ekĢimsi * Islak odun (Don vuruğu) Ransid Diğer Negatif Özellikler Tanımlar Metalik □ Samansı/odunsu □ Kurtlu □ Kaba □ Salamura □ IsıtılmıĢ/yanmıĢ □ Kara su □ Hasırımsı □ Salatalık □ Makine yağı □ (*) seçilmeyen kusurun üzerini çiziniz POZĠTĠF ÖZELLĠKLERĠN ALGILANMA YOĞUNLUĞU: Meyvemsi yeĢil □ olgun □ Acılık Yakıcılık Tadımcının adı: tadımcının kodu: Numune kodu: Tarih/Ġmza: Yorumlar: ġekil 1- Duyusal değerlendirme formu BİLGİ/AÇIKLAMALAR Medyanın ve Güven Aralıklarının Hesaplanma Yöntemi Medyan Xm medyan gerçek sayısı olarak tanımlanır. Xm; 0.5‘ten daha az olmayan Xm sayısının üzerinde olmayan X dağılım değerlerinin eĢ zamanlı olasılığı (P) ve 0.5‘ten daha fazla olmayan Xm sayısının altındaki X dağılım değerlerinin olasılığı (P) ile karakterize edilir. BaĢka bir ifadeyle, medyanın, artan bir sıralamayla düzenlenmiĢ bir sayılar dağılımının 50nci yüzdeliğinde olduğudur. Diğer bir deyiĢle, sıralanmıĢ bir tek sayılar setinin orta noktası veya sıralanmıĢ bir çift sayılar setinin iki orta noktasının ortalamasıdır. Güçlü standart sapma Ortalama etrafındaki değiĢkenliği güvenilir bir Ģekilde tahmin edebilmek için, Stuart ve Kendall‘a göre tahmin edilen güçlü standart sapmayı referans göstermek gereklidir. Formül, N‘in gözlemlerin sayısı olduğu yerde, asimptotik güçlü standart sapmayı verir, IQR interkuartil aralık ya da incelenmekte olan verilerin değiĢkenliğinin güçlü tahminidir ve belirli bir olasılık dağılımındaki vakalarının tam %50‘sini kapsar. Ġnterkuartil enterval, % 75nci ve % 25inci arasındaki fark büyüklüğünü hesaplamak suretiyle hesaplanır. IQR = % 75inci – % 25inci Yüzde birlik, dağılım değerlerinin Xpc‘den az ve spesifik bir yüzde birden küçük ve eĢit olma olasılığı (P) ve eĢzamanlı olarak dağılım değerlerinin Xpc‘den az veya eĢit ve spesifik bir yüzde birden daha büyük ve eĢit olma olasılığı (P) olgusuyla karakterize edilen Xpc değeridir. Yüzde birlik, seçilen dağılım fraksiyonunu belirtir. Medyan durumunda, bu 50/100‘e eĢittir. Pratikte, yüzdelik, dağılım veya yoğunluk eğrisinden iki ucu birleĢtirilen spesifik bir alana tekabül eden dağılım değeridir. Örneğin, 25inci yüzde birlik, 0.25 veya 25/100‘e eĢit bir alana tekabül eden dağılım değerini temsil eder. Güçlü değiĢkenlik katsayısı (%) % CVr, analiz edilen sayılar setinin yüzde değiĢkenliğini belirten bir saf sayıyı temsil eder. Bu sebepten, panel değerlendiricilerinin güvenilirliğini kontrol etmek için çok kullanıĢlıdır. % 95’teki medyanın güven aralıkları %95‘teki güven aralıkları (ilk çeĢidin hata değeri 0,05 veya % 5‘e eĢittir), Ģayet bir deneyi sonsuz kereler tekrar etmek mümkün olsaydı, medyan değerinin değiĢebileceği aralığı temsil eder. Pratikte bu aralık, testin birçok kez tekrar edilebildiği varsayımına dayanarak seçilen çalıĢma koĢullarında testin değiĢebilirlik aralığını belirtir. % rCV‘de olduğu gibi aralık, testin güvenilirliğini değerlendirmeye yardımcı olur.     ½P½  XmXXmXPMe N IQR S 35.1 25.1             100100 Yüzdelik n XpcXP n XpcXP 100   Me S rVC Üst C.I.(Güven Aralığı) = Me + (cS*) Alt C.I.(Güven Aralığı) = Me – (cS*) Burada 0.95 güven aralığı için C=1.96‘dır. EK-12 Pirinada Yağ Miktarı Tayini 1. Cihaz ve malzemeler 1.1. Ekstraksiyon ekipmanı: 200, 250 mL‘lik yuvarlak dipli ağzı Ģilifli balona uygun 1.2. Elektrikli ısıtıcılı banyo ( kum banyosu, su banyosu) veya ısıtıcı tabla, 1.3. Analitik terazi, 1.4. Etüv: Maksimum 80 °C‘ye ayarlanabilen, 1.5. Etüv: 103±2 °C‘ye ayarlanabilen sıcaklık kontrollü hava akımında veya düĢük basınçta çalıĢabilen, 1.6. Mekanik öğütücü: Temizlenmesi kolay ve küspeyi, ısıtmadan ve içerisindeki su, uçucu madde ve yağ kaybına meydan vermeden, 1 mm çapındaki delik büyüklüğünde bir elekten tamamen geçecek Ģekilde öğütebilen 1.7. Ekstraksyon kartuĢu ve süzgeç kâğıdı veya içerisinde hekzanda çözünen madde bulunmayan pamuk 1.8. Desikatör 1.9. Elek: 1 mm çapında gözenek büyüklüğüne sahip, 1.10. Sünger taĢı: Küçük parçalar halinde önceden kurutulmuĢ 2. Kimyasallar n-Hekzan: Tam buharlaĢma sonrası kalıntı miktarı 0,002g/100mL olan teknik saflıkta 3. Prosedür 3.1. Numunenin hazırlanması Numune gerekirse, önceden iyice temizlenmiĢ mekanik bir öğütücüde öğütülür. Öğütücü temizliğinin tamamlanması için numunenin yaklaĢık olarak yirmide biri kullanılır ve bu kısım öğütüldükten sonra atılır. Bundan sonra numunenin diğer kısmı öğütülür, öğütülen kısım toplanır, dikkatlice karıĢtırılır ve zaman geçirmeden hemen analize baĢlanır. 3.2. Analiz numunesi Öğütme iĢlemi biter bitmez, öğütülen kısımdan ekstrakte edilecek madde miktarına göre, 10 g kadar numune 0,01 g hassasiyetle tartılarak alınır. 3.3. Ekstraksiyon kartuĢunun hazırlanması Tartılan numune kartuĢa konulur ve cam pamuğu ile kapatılır. Eğer filtre kâğıdı kullanılıyorsa analiz numunesi konulduktan sonra sarılarak iyice kapatılır. Nem ve uçucu madde miktarını azaltmak için kartuĢ içeriği ile birlikte 80 °C‘yi geçmeyen bir etüvde uygun bir süre tutulur. 3.4. Yuvarlak dipli balonun hazırlanması Balonun içerisine bir veya iki tane sünger taĢı konulur ve 103±2 °C‘ye ayarlanmıĢ etüvde kurutulur. Desikatörde en az bir saat tutulduktan sonra 0,001 g hassasiyetle tartılır. 3.5. Birinci ekstraksiyon Ġçerisinde analiz numunesi bulunan ekstraksiyon kartuĢu veya süzgeç kâğıdı ektraksiyon cihazına konur. Balona yeteri miktarda (yaklaĢık 1,5 sifon) hekzan ilave edilir. Balon ekstraksiyon cihazına takılır. Ekstraksiyon hızı saniyede en az 3 damla olacak Ģekilde ısıtma iĢlemi çok Ģiddetli olmayacak Ģekilde ayarlanır. En az 4 saatlik bir ekstraksiyondan sonra ısıtıcı kapatılarak soğumaya bırakılır. KartuĢ ekstraksiyon cihazından çıkarılır ve hava akımı altında kartuĢ tarafından emilmiĢ olan çözücünün büyük bir kısmı uzaklaĢtırılır. 3.6. Ġkinci ekstraksiyon KartuĢ içindeki numune bir havana boĢaltılır, 10g kadar kum ilave edilerek mümkün olduğu kadar ince öğütülür (eğer mikro öğütücü varsa kum olmadan öğütülebilir.) KarıĢım tekrar kartuĢa doldurularak yine cihaza konur. Aynı balon kullanılarak 2 saat daha ekstrakte edilir. Ekstraksiyon balonundaki çözelti berrak olmalıdır. Eğer değilse, filtre kağıdı kullanılarak çözelti, tartımı alınmıĢ baĢka bir ekstraksiyon balonuna süzülür ve filtre kağıdı hekzan ile çok iyi Ģekilde yıkanır. 3.7. Çözücünün uçurulması ve kalıntının tartımı Çözücünün büyük bir kısmı elektrikli ısıtıcılı banyoda distilasyonla uzaklaĢtırılır. Kalan iz miktardaki çözücü 103 ±2 °C sıcaklığa ayarlanmıĢ etüvde 20 dk süreyle ısıtılarak uzaklaĢtırılır. Bu iĢlemi kolaylaĢtırmak için hava akımı (tercihen inert gaz) veya düĢük basınç kullanılabilir. Balon bir desikatörde en az bir saat tutularak oda sıcaklığına tekrar getirilir ve 0,001 g duyarlıkla tartılır. Isıtma iĢlemi aynı Ģartlar altında 10 dk süre ile ikinci bir kez tekrarlanır, soğutulur ve tartılır. Bu iki tartım arasındaki fark 0,01 g‘ı geçmemelidir. Aksi halde aradaki fark 0,01 g‘ı geçmeyinceye kadar 10‘ar dakikalık sürelerle ısıtma iĢlemi tekrarlanmalıdır. Balonun son tartısı kaydedilir. Analiz iki paralel olarak yapılır. 4. Sonuçların ifade edilmesi ve hesaplama 4.1. Hesaplama metodu ve formüller; a) Hekzan ekstraktı, alınan ürünün ağırlıkça yüzdesi olarak aĢağıdaki formülden hesaplanır: 0 1 100 m mS  Burada ; S : Alınan ürün ekstraktının ağırlıkça yüzdesi 0 m : Analiz numunesinin ağırlığı, g 1 m : Ekstraksiyon balonunun en son tartımındaki ekstraktın miktarı, g Sonuçların tekrar edilebilirliği yeterli görülürse iki paralelde elde edilen değerlerin aritmetik ortalaması sonuç olarak alınır. Aksi halde analiz tekrarlanır. Sonuçlar bir ondalık olarak verilir. a) Ekstrakttaki yağ yüzdesi kuru madde bazında aĢağıdaki formülle hesaplanır; U S   100 100 (%) yağ kiEkstraktta S: Yukarıdaki formülden bulunan ekstrakt miktarı U: Nem ve uçucu madde miktarı 4.2. Tekrar edilebilirlik Aynı analizci tarafından peĢ peĢe veya iki analizci tarafından eĢ zamanlı olarak yapılan paralel analizler arasındaki fark 100 g numune baĢına 0,2 g hekzan ekstraktını geçmemelidir. Eğer tatmin edici bir sonuç elde edilmediyse, iki farklı örnekte analiz tekrarlanır. Eğer iki sonuç arasındaki fark 0,2‘den farklı olursa 4 çalıĢmanın aritmetik ortalaması alınır. EK-13 Stigmastadienlerin Tayini 1. Amaç Natürel zeytinyağı ve ham pirina yağında düĢük konsantrasyonlarda bulunan stigmastadienlerin miktarının belirlenmesidir. 2. Kapsam Bu metot hidrokarbon içeriği 0,01- 4,0 mg/kg arasında bulunan tüm bitkisel yağlara uygulanabilir. Metot özellikle natürel zeytinyağında rafine bitkisel yağların (rafine zeytinyağı, pirina yağı, ayçiçeği yağı, palm yağı vs.) varlığını tespit etmeye uygundur. Bunun nedeni rafine yağların stigmastadien içermesi, natürel yağların ise içermemesidir. 3. Prensip SabunlaĢmayan maddelerin elde edilerek steroidal hidrokarbon fraksiyonunun silikajel üzerinde kolon kromatografisi ile ayrıĢtırılması ve kapiler kolonlu GC ile analiz edilmesidir. 4. Cihaz ve malzemeler 4.1. Geri soğutucu: 250 mL‘lik balon ile kullanıma uygun 4.2. Ayırma hunileri: 500 mL‘lik kapasiteye sahip. 4.3. ġlifli balon: 100 mL‘lik yuvarlak dipli 4.4. Vakumlu döner buharlaĢtırıcı. 4.5. Cam kromatografi kolonu: Ġç çapı 1,5-2,0 cm, uzunluğu 50 cm olan, teflon vanalı ve dibinde cam yün liflerinden bir tıpa veya sertleĢtirilmiĢ camdan bir disk olan 4.6. Gaz kromatografi cihazı: Alev iyonizasyon dedektörüne sahip kapiller kolonlu, split – splitless veya doğrudan kolona enjeksiyon sistemli ve ± 1 °C hassasiyetiyle çalıĢabilen fırınlı. 4.7. Kapiler kolon: Uzunluğu 25 m, iç çapı 0,25–0,32 mm, film kalınlığı 0,25 μm olan, camdan ya da eritilmiĢ silisten, % 5 fenil metilpolisiloksan ile kaplanmıĢ . Benzer veya daha düĢük polariteye sahip farklı kolonlar da kullanılabilir. 4.8. Gaz kromatografi enjektörü: SertleĢtirilmiĢ iğneli, 10 μL‘lik 4.9. Mantolu ısıtıcı veya elektrikli ısıtıcı 4.10. Bilgisayar sistemi ve yazıcı: 5. Kimyasallar Tüm kimyasallar, aksi belirtilmediği takdirde analitik saflıkta olmalıdır. Kullanılan su, saf su veya en azından eĢdeğer saflıkta bir su olmalıdır. 5.1. Hekzan: Kromatografik saflıkta. (Aynı saflıkta heptan yada izooktan kullanılabilir) 5.2. Etil alkol: % 96‘lık (v/v) 5.3. Susuz sodyum sülfat: Analitik saflıkta, 5.4. Etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: % 10‘luk 50 g potasyum hidroksite 10 mL su ilave edilir, karıĢtırılır ve karıĢımı 500 mL etanol içerisinde çözülür. Etanollü potasyum hidroksit çözeltisi beklediği takdirde kahverengine döner. Günlük hazırlanmalı ve ağzı sıkıca kapatılmıĢ koyu cam ĢiĢelerde muhafaza edilmelidir. 5.5. Silikajel: Kolon kromatografisi için 70-230 mesh. Genelde silikajel doğrudan kullanılabilir. Ancak bazı silikajel partileri düĢük aktivite göstererek kötü kromatografik ayrıma neden olabilir. Bu koĢullar altında, silikajel aĢağıdaki Ģekilde muameleye tabi tutulmalıdır. Silikajel asgari dört saat boyunca 550 °C‘de ısıtarak aktive edilir. Isıtma sonrasında silikajel desikatörde soğutulur ve Ģilifli balona aktarılır. % 2‘si kadar su ilave edilir ve içerisinde topaklaĢma olmayıncaya kadar çalkalanır. Buna alternatif olarak ekstra saf silikajel kullanılabilir. 5.6. Stok çözelti (200 ppm): % 99 saflıkta 10 mg kolesta-3.5-dien 50 mL hekzan içerisinde çözülerek hazırlanır. 5.7. Standart çözelti (20 ppm): Stok çözeltiden hekzanla seyreltilerek hazırlanan kolesta-3.5-dien. Stok ve standart çözelti 4 °C‘den daha düĢük sıcaklıkta muhafaza edildikleri taktirde en az dört ay boyunca stabil kalır. 5.8. n-nonakosan çözeltisi (100 ppm): Hekzan içerisinde hazırlanır. 5.9. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 5.10. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen ve kuru hava 6. Prosedür 6.1. SabunlaĢmayan maddenin hazırlanması 6.1.1. 250 mL‘lik Ģilifli balona 20 ± 0,1 g yağ tartılır, 1 mL standart kolesta-3.5-dien (20μg) çözeltisi ve 75 mL % 10‘luk etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ilave edilir. Balon çalkalanarak geri soğutucuya bağlanır ve hafif ısıda 30 dk boyunca kaynatılır. Numunenin bulunduğu balon ısıtıcıdan indirilir ve soğuması beklenir (Numune dibe çökeceğinden dolayı tamamen soğumasına izin verilmez). Balona 100 mL su ilave edilir ve 100 mL hekzan yardımıyla balon içeriği ayırma hunisine aktarılır. KarıĢım 30 s boyunca kuvvetlice çalkalanır ve faz ayrımı beklenir. Herhangi bir emülsiyon oluĢumu az miktarda etil veya metil alkol ilavesiyle yok edilebilir. 6.1.2 Ġkinci bir ayırma hunisine alt fazı alınır. Kalan üst fazdan 100 ml hekzan kullanılarak aynı Ģekilde bir ekstraksiyon daha yapılır. Hekzan ekstrakları tek bir ayırma hunisinde toplanır ve yıkama suyu nötr bir reaksiyon verene kadar (fenolftalein indikatörlüğünde) en az üç kez 100 ml etanol/saf su (1:1) ile yıkanır. 6.1.3 Hekzan ekstraktı yaklaĢık 50 g susuz sodyum sülfattan geçirilir, huni 20 mL hekzanla yıkanır ve 30 °C ve düĢük basınç altında kuruyana kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. 6.2. Steroidal hidrokarbon fraksiyonlarının ayrılması 6.2.1. Cam kromatografi kolonun hazırlanması: Silikajel kolonu hazırlamak için, kromatografi kolonunun içine yaklaĢık 5 cm‘lik bir derinliğe kadar hekzan dökülür ve 15 g silikajel 40 mL n-hekzanla bulamaç hale getirilerek kolona boĢaltılır. Çökelmeyi tamamlamak için elektrovibratör kullanılır. YaklaĢık 0,5 cm‘lik bir yüksekliğe kadar susuz sodyum sülfat ilave edilir ve son olarak fazla hekzan süzülür. 6.2.2. Hazırlanan numune 1 mL hekzan ile kromotografik kolona aktarılır. Balondaki kalıntı tekrar 1 mL hekzan ile yıkanarak kromotografik kolona aktarılır. Kolondan hekzan akıĢ hızı 1 mL/dk olacak Ģekilde ve sodyum sülfat seviyesinin 1 mm üstüne gelinceye kadar izin verilerek hekzan geçirilmeye baĢlanır. Süzüntünün yaklaĢık ilk 25-30 mL‘si (birinci fraksiyon) atılır, sonraki 40 mL‘lik süzüntü (ikinci fraksiyon) toplanır ve 100 mL‘lik yuvarlak dipli Ģilifli balona aktarılır. Birinci fraksiyon doymuĢ hidrokarbonları (ġekil 1 a), ikinci fraksiyon ise steroidal hidrokarbonları içerir. Sonraki süzüntü (üçüncü fraksiyon) squalen vb bileĢikleri içerir. DoymuĢ ve steroidal hidrokarbonların iyi Ģekilde ayrılmasını sağlamak için fraksiyon hacimlerinin optimizasyonu gereklidir. Bunun için birinci fraksiyonun hacmi, ikinci fraksiyon analiz edildiğinde doymuĢ hidrokarbonları temsil eden pikler düĢük olacak Ģekilde ayarlanmalıdır (ġekil 1 c). Bu piklerin çıkmadığı ancak standart pik yüksekliğinin düĢük çıktığı durumda seyreltme hacmi azaltılmalıdır. GC koĢullarının 6.3.1.‘de gösterilen Ģekilde ayarlanması durumunda GC analizi sırasında üst üste gelen herhangi bir pik belirmez. Ġkinci fraksiyonun hacminin optimizasyonu, daha sonra çıkan bileĢiklerle iyi bir ayrım gerçekleĢtiğinde genellikle gerekli değildir. Buna rağmen standarda göre yaklaĢık 1,5 dakika daha düĢük bir alıkonma süresi olan büyük bir pikin mevcudiyeti squalenden kaynaklanmaktadır ve kötü bir ayrım olduğunun göstergesidir. 6.2.3. Ġkinci fraksiyon 30 °C ve düĢük basınç altında kuruyuncaya kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur ve hızlıca 0,2 mL hekzan (on-column kullanılıyorsa 1-2 mL) içerisinde çözülür. Analiz edilene kadar çözelti buzdolabında saklanır. (6.1.3 ve 6.2.3‘de hazırlanan numuneler oda sıcaklığında ve kuru tutulmamalıdır. Elde edilmelerinden hemen sonra çözücü ilave edilmeli ve çözeltiler buzdolabında saklanmalıdır.) 6.3. Gaz kromatografisi 6.3.1. ÇalıĢma Ģartları: 6.3.1.1. Split/splitless  Enjeksiyon sıcaklığı: 300 °C,  Dedektör sıcaklığı: 320 °C,  Enjeksiyon hacmi: l μL,  Fırın sıcaklığı: 235 °C baĢlangıç sıcaklığında 6 dk bekletildikten sonra 2 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 285 °C ye çıkarılır.  Split oranı: 1:15  TaĢıyıcı gaz: yaklaĢık 120 kPa basınçta helyum veya hidrojen 6.3.1.2. On-column  Fırın sıcaklığı: 80 °C baĢlangıç sıcaklığında 1 dk bekletildikten sonra 20 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 220 °C ye çıkarılır. 3,5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 260 °C ye çıkarılır ve bu sıcaklıkta 10 dk bekletilir. Bu koĢullar, aĢağıda verilen Ģartları karĢılayan kromatogramlar elde edilmesi için GC ve kolonun niteliklerine uygun olarak ayarlanabilir: Ġç standardın alıkonma zamanı 19±5 dk Ġç standart piki tam kromatogramın en az % 80‘i GC sistemi kolesta-3.5-dien ve n-nonakosan çözeltisi enjekte edilerek kontrol edilmelidir. Kolesta-3.5-dien piki mutlaka n-nonakosandan önce gelmelidir. (ġekil 1 c); bu durum gözlenmezse fırın sıcaklığı düĢürülür ve/veya polaritesi daha düĢük bir kolon kullanılır. 6.3.2. Piklerin tanımlanması Ġç standart piki ortalama 19±5 dk da gelir. Ġç standardın alıkonma zamanı 1 kabul edilirse 3.5stigmastadien piki ise yaklaĢık 1.29 dur (ġekil 1 b.). 3,5-stigmastadien genelde az miktarda izomer içerir ve genellikle her ikisi birlikte tek bir pik oluĢturur. Buna rağmen kolonun polaritesi fazla ise veya yüksek bir çözünürlük gücü varsa izomer stigmasta3.5dienden önce ve buna yakın küçük bir pik halinde belirebilir. Stigmastadienlerin tek bir pik olarak gözlenmesi için polaritesi düĢük ya da daha geniĢ bir iç çapı olan kolonla değiĢtirilmesi önerilir. Stigmastadienlerin daha iyi tanımlanabilmesi için, rafine bitkisel yağ veya rafine prina yağı analiz edilir. Böylece stigmastadienler belirgin ve kolaylıkla teĢhis edilebilir. 6.3.3. Miktarın hesaplanması Stigmastadienlerin içeriği aĢağıdaki formüle göre hesaplanır:   oc cs MA MA kgmgienStigmastad   / Burada: As= stigmastadien pik alanı (eğer pik iki izomer halinde gözlendiyse iki pik alanının toplamı), AC= iç standart pik alanı (kolesta-3.5-dien), MC= eklenen standart miktarı, (μg) MO= numune miktarı, (g). Tespit limiti: yaklaĢık 0,01 mg/kg Zeytinyağı numunelerinden elde edilen kromatogramlar ġekil 1a İç standartla birlikte natürel zeytinyağından elde edilen birinci fraksiyonun (30 mL) kromatogramı ġekil 1b 0,10 mg/kg stigmastadien içeren zeytinyağından elde edilen ikinci fraksiyonun (40 mL) kromatogramı ġekil 1c Birinci fraksiyondan az miktar içeren ikinci fraksiyonun (40 mL) kromatogramı ġekil 2 Rafine zeytinyağı numunesinden elde edilen, 3.5 stigmastadien izomerlerini gösteren kromatogram EK – 14 Gerçek ve Teorik ECN 42 Trigliserid Ġçeriği Arasındaki Maksimum Farkın Tayini 1. Kapsam Zeytinyağı bileĢimindeki eĢdeğer karbon sayısı 42 olan triaçilgliserollerin (TAGs) yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile elde edilen deneysel değeri (ECN42HPLC) ile yağ asidi kompozisyonundan hesaplanan teorik değeri (ECN42Teorik) arasındaki mutlak farkın belirlenmesini kapsar. 2. Amaç ve uygulama alanı Bu metot, zeytinyağı ve pirina yağındaki az miktarda tohum yağı (linoleik asit açısından zengin olan) varlığının tespiti için uygulanır. 3. Prensip Metot, eĢdeğer karbon sayısı (ECN) 42 olan triaçilgliserollerin HPLC ile belirlenen deneysel ECN değeri ve GC ile tespit edilen yağ asidi kompozisyonundan hesaplanan teorik ECN değeri arasındaki farkın saf zeytinyağlarında belirli bir sınırda olması prensibine dayanır. TGK-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliğinde belirtilen değerlerden daha büyük bir fark, o yağın tohum yağı içerdiğini iĢaret etmektedir. 4. Metot EĢdeğer karbon sayısı (ECN) 42 olan triaçilgliserollerin teorik içeriğinin ve bunun HPLC‘den elde edilen veriler ile arasındaki farkın hesaplanması, aĢağıda belirtilen 3 metotla elde edilen verilerin birlikte değerlendirilmesi ile belirlenir:  Yağ asidi kompozisyonunun kapiler gaz kromatografisiyle tayini,  ECN 42 olan triaçilgliserollerin teorik miktarının hesaplanması  ECN 42 olan triaçilgliserollerin HPLC ile tayini. 4.1. Cihaz ve malzemeler 4.1.1. Cam balon: 250 ve 500 mL‘lik 4.1.2. Beher: 100 mL‘lik 4.1.3. Musluklu cam kromatografi kolonu: Uzunluğu 450 mm, iç çapı 21 mm olan 4.1.4. Ayırma hunisi: 250 mL‘lik 4.1.5. Baget: 600 mm uzunlukta 4.1.6. Cam huni: 80 mm çapında 4.1.7. Balon joje: 50 mL‘lik 4.1.8. Balon joje: 20 mL‘lik 4.1.9. Vakumlu döner buharlaĢtırıcı. 4.1.10. HPLC cihazı: Kolon sıcaklığı ayarlanabilen termostat kontrollü 4.1.11. Enjeksiyon bloğu: 10 μL‘lik enjeksiyon için 4.1.12. Refraktif indeks dedektör: Diferansiyel refraktometre (Tam-ölçek duyarlılığı en az 10 4 birim) 4.1.13. Kolon: Uzunluğu 250 mm, iç çapı 4,5 mm olan ve % 22-23 oranında karbon içeren oktadesilsilan Ģeklinde, 5 μm partikül çapında silika ile doldurulmuĢ paslanmaz çelik kolon 4.1.14. Bilgisayar sistemi ve yazıcısı: HPLC verilerini kaydedebilecek 4.2. Kimyasallar HPLC‘de kullanılan hareketli fazın gazları giderilmiĢ olmalıdır. Net ayrım görüldüğü sürece hareketli faz kullanılmaya devam edilir. 4.2.1. Petrol eteri veya hekzan: Kromatografik saflıkta 4.2.2. Etil eter: Yeni distile edilmiĢ peroksitten arındırılmıĢ 4.2.3. Yıkama çözücüsü: Kolon kromatografisinde kullanılan petrol eteri/dietil eter karıĢımı 87:13 (v/v). 4.2.4. Silikajel: Su içeriği % 5 olacak Ģekilde standardize edilmiĢ 70-230 mesh tane büyüklüğünde 4.2.5. Cam yünü 4.2.6. Aseton: HPLC saflıkta 4.2.7. Asetonitril veya propionnitril: HPLC saflıkta 4.2.8. Hareketli faz: asetonitril + aseton (oranlar arzu edilen ayrılmayı sağlamak amacıyla; 50:50 (v/v) oranından baĢlanarak ayarlanır). 4.2.9. Çözücü: aseton 4.2.10. Standart trigliseridler: Piyasada bulunan triaçilgliseridler (tripalmitin, triolein, vs.) Standardizasyon amacıyla kullanılabilir ve alıkonma süreleri karĢıt gelen karbon sayılarına göre belirlenebilir veya buna alternatif olarak soya yağından (30:70 soya yağı:zeytinyağı karıĢımı) ve saf zeytinyağından referans triaçilgliserid kromatogramı elde edilebilir (ġekil 1,2,3,4 ve 5). 4.2.11. Katı faz ekstraksiyon (SPE) kartuĢu: 1 g silika fazlı ve 6 mL hazneli 4.3. Numunenin hazırlanması Bazı giriĢim yapan maddeler yanlıĢ yüksek sonuçlara sebep olacağından, numune kızartma yağlarındaki polar maddelerin saptanması için kullanılan IUPAC 2.507 yöntemine uygun olarak saflaĢtırılmalıdır. 4.3.1. Kromatografik kolonun hazırlanması Kolon yaklaĢık 30 mL yıkama çözücüsü ile doldurulur ve kolon içerisine, baget yardımıyla dibe doğru bastırarak bir parça cam yünü yerleĢtirilir. 100 mL‘lik bir behere sırasıyla 80 mL yıkama çözücüsü, 25 g silikajel ilave edilir. Hazırlanan karıĢım bir cam huniyle cam kolon içerisine boĢaltılır. Beher içinde kalan silikajelin tamamı yıkama çözücüsü ile yıkanarak kolon içine alınır. Cam kolonun musluğu açılır ve yıkama çözücüsü seviyesi silikajelin yaklaĢık 1 cm üstünde kalacak Ģekilde akıtılır. 4.3.2. Kolon kromatografisi 50 mL‘lik balon joje içerisine; daha önceden süzülmüĢ ve homojenize edilmiĢ susuz yağ numunesinden 2,5±0,1 g tartılır ve 20 mL yıkama çözücüsü ilave edilerek çözülür. Gerektiğinde çözme iĢlemini kolaylaĢtırmak için hafifçe ısıtılır. Oda sıcaklığında soğutulur ve hacmi yıkama çözücüsü ile 50 mL‘ye tamamlanır. Daha önceden sabit tartıma getirilmiĢ 250 mL‘lik, cam balonda süzüntünün toplanması sağlanacak Ģekilde; tamamlanan karıĢımdan bir pipet ile 20 mL alınarak hazırlanan kolon içerisine boĢaltılır ve musluk açılır. Sıvı karıĢım silikajel seviyesine yaklaĢtığında toplam 150 mL yıkama çözücüsü parça parça kolona ilave edilir. Süzüntünün musluktan akıĢ hızı yaklaĢık 2 mL/dk‘ya ayarlanır (150 mL yıkama çözücüsü kolondan 60-70 dakikada geçmelidir.). 250 mL‘lik cam balonda toplanan süzüntüdeki çözücü vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uçurulur. Balonda kalan ve HPLC analizi ve metil esterlerin hazırlanmasında kullanılacak olan bu kalıntı tartılır. Kalıntı miktarı; natürel sızma, natürel birinci, rafine ve riviera zeytinyağları kategorileri için baĢlangıçta kolona ilave edilen numune miktarı üzerinden en az % 90‘ı, ham zeytinyağı ve pirina yağları için ise en az % 80‘i olmalıdır. 4.3.3. SPE KartuĢu ile SaflaĢtırma Vakum altında 6mL hekzan SPE kartuĢunun kurumasına izin vermeden geçirilerek aktive edilir. 2mL‘lik viale 0,12 g numune (0,001 g duyarlılıkla) tartılır ve 0,5 mL hekzan ilave edilerek çözülür. Hekzanda çözülmüĢ numune 10 mL hekzan-dietil eter (87:13 v/v) içeren çözelti ile SPE kartuĢa ilave edilerek süzülür. Toplanan fraksiyondaki çözücüler düĢük basınç ve oda sıcaklığında vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uzaklaĢtırılır. Kalıntı, TAG analizleri için 2 mL asetonda çözülür. 4.4. HPLC analizi 4.4.1. Kromatografik analiz için numunelerin hazırlanması SPE kartuĢla saflaĢtırılmıĢ numune kullanılacaksa; hazırlanan numune HPLC‘ye belirtilen oranda enjekte edilir. Kolon kromotografisi ile hazırlanan numune kullanılacaksa; Numunenin % 5‘lik çözeltisi; 10 mL‘lik balon joje içine 0,5 ± 0,001 g numune tartılarak ve aseton ile çözülerek10 mL‘ye tamamlanması ile hazırlanır. 4.4.2. Prosedür Tüm sistemi temizlemek için hareketli faz 1,5 mL/dk hızla akacak Ģekilde pompa ayarlanır. Doğrusal baseline elde edinceye kadar beklenir. Hazırlanan numuneden 10 μL enjekte edilir. 4.4.3. Sonuçların hesaplanması ve açıklanması Alan normalleĢtirme yöntemi kullanılır (ECN42‘den ECN52‘ye kadar olan TAG‘lere karĢılık gelen pik alanları toplamlarının % 100‘e eĢit olduğu kabul edilir). Her triaçilgliseridin bağıl yüzdesi aĢağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: % triaçilgliserid = pikin alanı x 100/ pik alanlarının toplamı Sonuçlar 2 ondalık olarak verilmelidir. 4.4.4 Triaçilgliserid piklerinin çıkıĢ sırası, genelde ECN = CN-2n iliĢkisi ile tanımlanan eĢdeğer karbon sayısı hesaplanarak saptanır. Burada CN karbon sayısı ve n çift bağların sayısıdır. Bu çift bağların bağlandıkları karbon atomu dikkate alınarak çok daha kesin olarak saptanabilir. Eğer no, nl ve nln sayıları sırasıyla oleik, linoleik ve linolenik asitlerin bileĢiminde bulunan çift bağlar ise, eĢdeğer karbon sayısı aĢağıdaki formüldeki iliĢkiyle hesaplanabilir: ECN = CN  dono  dlnl  dlnnln Burada do, dl ve dln katsayıları referans triaçilgliseridler yardımıyla hesaplanır. Bu metotta belirtilen koĢullar altında elde edilen bağıntı aĢağıdaki formül uygulanarak elde edilene yakın olacaktır. ECN = CN  [2,60 no]  [2,35 nl] – [2,17 nln] 4.4.5 ÇeĢitli triaçilgliserid referansının ayrıĢmasını triolein yardımıyla hesaplamak mümkündür. α = RT´/RTtriolein ĠndirgenmiĢ alıkonma süresi: RT´ = RT – RTçözücü f‘ye karĢı (çift bağların sayısı) log α grafiği yardımıyla referans triaçilgliseridlerde bulunan yağ asitlerinin tüm triaçilgliseridlerinin alıkonma sürelerinin belirlenmesi mümkündür (ġekil 1). 4.4.6. Kolon, trilinolein pikinin diğer triaçilgliserid piklerinden net bir Ģekilde ayrılmasını sağlamalıdır. Ayrıma ECN 52 piki görülene kadar devam edilir. 4.5. Yağ asiti kompozisyonu verilerinden (% pik alanı) triaçilgliserol kompozisyonunun (%mol) hesaplanması 4.5.1. Yağ asitlerinin kompozisyonunun saptanması Yağ asidi kompozisyonunun saptanması EK 9A‘ ya göre gerçekleĢtirilir. Yağ asidi metil esterleri EK 9B‘ye göre gerçekleĢtirilir. 4.5.2. Yağ asitlerinin hesaplanması Yağ asitleri ve bunlara karĢılık gelen ECN aĢağıdaki tabloda görülmektedir. Tabloda sadece 16 ve 18 karbon atomuna sahip olan yağ asitleri dikkate alınmıĢtır. Yağ asidi (Y.A) Kısaltma Molekül ağırlığı (MA) ECN Palmitik asit P 256,4 16 Palmitoleik asit Po 254,4 14 Stearik asit S 284,5 18 Oleik asit O 282,5 16 Linoleik asit L 280,4 14 Linolenik asit Ln 278,4 12 4.5.3. Alan %‘lerinin tüm yağ asitleri için mol cinsine çevrilmesi PMA %Alan P P mol  SMA %Alan S S mol  PoMA %Alan Po Po mol  OMA %Alan O O mol  LMA %Alan L L mol  LnMA Alan %Ln Ln mol  (1) 4.5.4. Yağ asitlerinin % 100‘e normalleĢtirilmesi Ln) L O Po S (P mol 100 P mol (1,2,3) P mol %    Ln) L O Po S (P mol 100 S mol (1,2,3) S mol %    Ln) L O Po S (P mol 100 Po mol (1,2,3) Po mol %    Ln) L O Po S (P mol 100 O mol (1,2,3) O mol %    Ln) L O Po S (P mol 100 L mol (1,2,3) L mol %    Ln) L O Po S (P mol 100 Ln mol (1,2,3)Ln mol %    Elde edilen sonuç, TAG‘ların genel (1,2,3-) pozisyonundaki her yağ asidinin mol cinsinden yüzdesini verir. Bunu takiben doymuĢ yağ asitleri P ve S (SFA * ) ile doymamıĢ yağ asitleri Po, O, L ve Ln (UFA ** ) hesaplanır: molSmolPmolSFA %%%  molSFAmolUFA %100%  4.5.5. TAG‘ların 2- ve 1,3- pozisyonlarında yağ asidi bileĢiklerinin hesaplanması Yağ asitleri aĢağıda belirtildiği gibi 1- ve 3- pozisyonları için iki özdeĢ grup, 2- pozisyonu için bir grup olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Ayrıca doymuĢ (P ve S) ve doymamıĢ (Po, O, L ve Ln) yağ asitleri de farklı katsayılarla gruplandırılır. 4.5.5.1. 2- pozisyonunda doymuĢ yağ asitleri [P(2) ve S(2)] 06,0)3,2,1(%)2(%  molPmolP 06,0)3,2,1(%)2(%  molSmolS (3) (2) (4) 4.5.5.2. 2-pozisyondaki doymamıĢ yağ asitleri [Po(2), O(2), L(2) ve Ln(2)]:  S(2) mol % -P(2) mol%100 UFA mol % (1,2,3) Po mol % (2) Po mol %     S(2) mol % -P(2) mol%100 UFA mol % (1,2,3) O mol % O(2) mol %     S(2) mol % -P(2) % mol100 UFA mol % (1,2,3) L mol % (2) L mol %     S(2) %mol -P(2) mol%100 UFA mol % (1,2,3)Ln mol % (2)Ln mol %    4.5.5.3. 1,3-pozisyondaki yağ asitleri [P(l,3), S(l,3), Po(l,3) O(l,3), L(l,3) ve Ln(1,3)]: (1,2,3) P mol% 2 P(2) mol % -(1,2,3) P mol % P(1,3) mol %  (1,2,3) S mol% 2 (2) S mol % -1,2,3) ( S mol % S(1,3) mol %  (1,2,3) Po mol% 2 Po(2) mol % -1,2,3) ( Po mol % Po(1,3) mol %  (1,2,3) O mol% 2 (2) O mol % -1,2,3) ( O mol % O(1,3) mol %  (1,2,3) L mol% 2 L(2) mol % -1,2,3) ( L mol % (1,3) L mol %  (1,2,3)Ln mol% 2 (2)Ln mol % -1,2,3) (Ln mol % (1,3)Ln mol %  4.5.6. Trigliseridlerin (Triaçilgliserol) hesaplanması 4.5.6.1. Tek yağ asitli TAG‘lar (AAA, burada LLL, PoPoPo) 10000 )3,1(%)2(%)3,1(% % molAmolAmolA molAAA   4.5.6.2. Ġki yağ asitli TAG‘lar (AAB, burada PoPoL, PoLL) 10000 2)3,1(%)2(%)3,1(% %   molBmolAmolA molAAB 10000 )3,1(%)2(%)3,1(% % molAmolBmolA molABA   (5) (6) (7) (8) 4.5.6.3. Üç yağ asitli TAG‘lar (ABC, burada OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) 10000 2)3,1(%)2(%)3,1(% %   molCmolBmolA molABC 10000 2)3,1(%)2(%)3,1(% %   molAmolCmolB molBCA 10000 2)3,1(%)2(%)3,1(% %   molBmolAmolC molCAB 4.5.6.4. EĢdeğer karbon sayısı 42 olan triaçilgliseroller AĢağıdaki ECN si 42 olan trigliseridler HPLC‘de beklenen elüsyon sırasına göre denklem 7, 8 ve 9‘a uygun olarak hesaplanır (normalde sadece üç pik). LLL PoLL ve pozisyonel izomer LPoL OLLn ve pozisyonel izomerler OLnL ve LnOL PoPoL ve pozisyonel izomer PoLPo PoOLn ve pozisyonel izomerler OPoLn ve OlnPo PLLn ve pozisyonel izomerler LLnP ve LnPL PoPoPo SLnLn ve pozisyonel izomerler LnSLn PPoLn ve pozisyonel izomerler PLnPo ve PoPLn EĢdeğer karbon sayısı 42 olan triaçilgliseroller, pozisyonel izomerleri dahil olmak üzere dokuz triaçilgliserolden oluĢur. Sonuçlar virgülden sonra 2 basamak olarak verilmelidir. 5. Sonuçların değerlendirilmesi GC den elde edilen verilerle hesaplanan teorik trigliserit miktarları ile HPLC analizi ile bulunan TAG miktarları karĢılaĢtırılır. HPLC‘den elde edilen ECN 42 verisi ile teorik olarak bulunan ECN 42 verisi arasındaki fark Türk Gıda Kodeksi-Zeytinyağı ve Pirina Yağı Tebliği‘nde söz konusu zeytinyağının kategorisi için belirtilen değerlerden daha büyük ise numunenin tohum yağı içerdiği sonucuna varılır. Sonuçlar 2 ondalık olarak verilmelidir. 6. Örnek: 6.5.1. GC verisinden yağ asitlerinin mol cinsinden yüzdesinin hesaplanması (alan yüzdesi) AĢağıdaki veriler yağ asidi kompozisyonu için GLC aracılığıyla elde edilmiĢtir: Yağ Asidi P S Po O L Ln Molekül Ağırlığı 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 Alan %‘si 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0 (9) 6.5.2. Alan %’sinin tüm yağ asitleri için mollere çevrilmesi P mol03900,0 256,4 10 P mol  S mol01054,0 284,5 3 S mol  Po mol00393,0 254,4 1 Po mol  O mol26549,0 282,5 75 O mol  L mol03566,0 280,4 10 L mol  Ln mol00359,0 278,4 1 Ln mol  Toplam = 0,35821 mol TAG‘lar 6.5.3. Yağ asitlerinin % 100 normalleĢtirilmesi 887,10% 0,35821 100P mol 0,03900 (1,2,3) P mol %    942,2% 0,35821 100 S mol 0,01054 (1,2,3) S mol %    097,1% 0,35821 100 Po mol 0,00393 (1,2,3) Po mol %    116,74% 0,35821 100 O mol 0,26549 (1,2,3) O mol %    955,9% 0,35821 100 L mol 0,03566 (1,2,3) L mol %    002,1% 0,35821 100Ln mol 0,00359 Ln(1,2,3) mol %    100,0 % mol Toplam %  Bkz. formül (1) Bkz. formül (2) Bkz. formül (1) Bkz. formül (1) Bkz. formül (1) Bkz. formül (1) Bkz. formül (1) Bkz. formül (2) Bkz. formül (2) Bkz. formül (2) Bkz. formül (2) Bkz. formül (2) TAG‘ların 1,2,3- pozisyonlarında doymuĢ ve doymamıĢ yağ asitlerinin toplamı; %13,8292,942 %10,887 % SFA mol %  Bkz. formül (3) 86,171 % %13,829-100,000 % UFA mol %  Bkz. formül (3) 6.5.4. TAG’ların 2- ve 1,3- pozisyonlarında yağ asidi kompozisyonlarının hesaplanması 6.5.4.1. 2- pozisyonunda doymuĢ yağ asitleri [P(2) ve S(2)] mol653,0%0,06%10,887P(2) mol %  Bkz. formül (4) mol177,0%0,06%2,942S(2) mol %  Bkz. formül (4) 6.5.4.2. 1.3-pozisyonlarında doymamıĢ yağ asitleri [Po(l,3), O(l,3), L(l,3) ve Ln(l,3)] mol262,1%)177,0653,0100( 86,171 % 1,097 % (2) Po mol %  mol296,85%)177,0653,0100( 86,171 % 74,116 % (2) O mol %  mol457,11%)177,0653,0100( 86,171 % 9,955 % (2) L mol %  mol153,1%)177,0653,0100( 86,171 % 1,002 % (2)Ln mol %  6.5.4.3. 1.3- pozisyonlarında yağ asitleri [P(l,3), S(l,3), Po(l,3), O(l,3), L(l,3) ve Ln(l,3)] mol004,16%887,10 2 0,653 - 10,887 P(1,3) mol %  mol325,4%942,2 2 0,177 - 2,942 S(1,3) mol %  mol015,1%097,1 2 1.262 - 1,097 Po(1,3) mol %  mol526,68%116,74 2 85,296 - 74,116 O(1,3) mol %  Bkz. formül (6) Bkz. formül (5) Bkz. formül (5) Bkz. formül (5) Bkz. formül (5) Bkz. formül (6). Bkz. formül (6). Bkz. formül (6). mol204,9%955,9 2 11,457 - 9,955 L(1,3) mol %  mol927,0%002,1 2 1,153 - 1,002 Ln(1,3) mol %  6.5.5. Trigliseridlerin hesaplanması 2- ve 1,3-pozisyonlarında hesaplanmıĢ yağ asidi kompozisyonlarından (Yukarıya bakınız): Yağ Asitleri 1,3-poz. 2-poz. P % 16,004 % 0,653 S % 4,325 % 0,177 Po % 1,015 % 1,262 O % 68,526 % 85,296 L % 9,204 % 11,457 Ln % 0,927 % 1,153 Toplam % 100,0 % 100,0 AĢağıdaki trigliseridler (triaçilgliseroller-TAG) hesaplanmıĢtır: LLL PoPoPo PoLL, 1 pozisyonel izomerli SLnLn, 1 pozisyonel izomer PoPoL, 1 pozisyonel izomer PPoLn, 2 pozisyonel izomerler OLLn, 2 pozisyonel izomerler PLLn, 2 pozisyonel izomerler PoOLn, 2 pozisyonel izomerler 6.5.5.1. Tek yağ asitli TAG'lar (LLL, PoPoPo) Bkz. formül (7) PoPoPo mol 00013,0 10000 015,1%262,1%015,1% PoPoPo mol %    LLL mol 09706,0 10000 204,9%457,11%204,9% LLL mol %    6.5.5.2. Ġki yağ asitli TAG’lar (PoLL, SLnLn, PoPoL) Bkz. formül (8) 02141,0 10000 2%9,204%11,457%1,015 LLPo PoLL mol %    01069,0 10000 %9,204%1,2629,204 % LPoL mol %    PoLL mol 03210,0 Bkz. formül (6). Bkz. formül (6). 00092,0 10000 2%0,927%1,153%4,325 LnLnS SLnLn mol %    00002,0 10000 %0,927%0,1770,927 % LnSLn mol %    SLnLn mol 00094,0 00236,0 10000 2%9,204%1,262%1,015 LPoPo PoPoL mol %    00118,0 10000 %1,015%11,457%1,015 PoLPo mol %    PoPoL mol 0354,0 6.5.5.3. Ġki yağ asitli TAG’lar (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Bkz. formül (9) 00374,0 10000 2%0,927%1,262%16,004 PPoLn mol %    00012,0 10000 2%1,015%0,653%0,927 LnPPo mol %    00375,0 10000 2%16,004%1,153%1,015 PoLnP mol %    = PPoLn mol 00761,0 14556,0 10000 2%0,927%11,457%68,526 OLLn mol %    14555,0 10000 2%9,204%85,296%0,927 LnOL mol %    14544,0 10000 2%68,526%1,153%9,204 LLnO mol %    = OLLn mol 43655,0 03399,0 10000 2%0,927%11,457%16,004 PLLn mol %    00111,0 10000 2%9,204%0,653%0,927 LnPL mol %    03397,0 10000 2%16,004%1,153%9,204 LLnP mol %    PLLn mol 06907,0 01605,0 10000 2%0,927%85,296%1,015 PoOLn mol %    01603,0 10000 2%68,526%1,262%0,927 LnPoO mol %    01604,0 10000 2%1,015%1,153%68,526 OLnPo mol %    PoOLn mol 04812,0 TAGler mol 69512,042 ECN Not: Hesaplamalar pratik olarak bilgisayar programı yardımıyla yapılabilir. (www.internationaloliveoil.org/estaticos/view/224-testingmethods) Çift bağların sayısı (n) ġekil 1 f’ye (çift bağların sayısı) karşı log α grafiği Not: La = laurik asit; My = miristik asit; P = palmitik asit; St = stearik asit; O = oleik asit; L = linoleik asit; Ln = linolenik asit. ġekil 2 Yüksek linoleik asit içeren zeytinyağı (Hareketli Faz: Propionitril) Kromotogram açıklaması: ECN42: (1) LLL; (2 + 2‘) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO ġekil 3 Yüksek linoleik asit içeren zeytinyağı (Hareketli Faz: Aseton:Asetonitril/50:50) Kromotogram açıklaması: ECN42: (1‘) LLL + PoLL; (2‘) OLLn + PoOLn; (3‘) PLLn; ECN44: (4‘) OLL + PoOL; (5‘) OOLn + PLL; (6‘) POLn + PPoPo; ECN46: (7‘) OOL + PoOO; (8‘) PLO + SLL + PoOP; (9‘) PLP + PoPP; ECN48: (10‘) OOO; (11‘) POO + SLL + PPoO; (12‘) POP + PLS; ECN50: (13‘) SOO; (14‘) POS + SLS ġekil 4 DüĢük linoleik asit içeren zeytinyağı (Hareketli Faz: Propionitril) Kromotogram açıklaması: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS Şekil 5 DüĢük linoleik asit içeren zeytinyağı (Hareketli Faz: Aseton/Asetonitril) Kromotogram açıklaması: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS. EK–15 Kapiler Gaz Kromatografisi ile Alifatik Alkol Miktarının Tayini 1. Kapsam Bu yöntem, katı ve sıvı yağların alifatik alkol içeriklerinin saptanması prosedürünü tanımlar. 2. Prensip Ġç standart olarak 1-eikosanol ilave edilmiĢ yağ numunesi etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile sabunlaĢtırılır ve bunu takiben sabunlaĢmayan maddeler dietil eterle ekstrakte edilir. Alkol fraksiyonu diğer sabunlaĢmayan maddelerden bazik silikajel plaka üzerinde ince tabaka kromatografisi kullanılarak ayrılır. Silikajel üzerinden alkol bandı alınır ve trimetil-silil esterlerine dönüĢtürülerek GC ile analiz edilir. 3. Cihaz ve malzemeler 3.1. ġilifli geri soğutucu: 250 mL‘lik balona uygun 3.2. Ayırma hunileri: 500 mL‘ lik 3.3. ġilifli balon: 250 mL‘lik 3.4. 20 x 20 cm cam plaka ince-tabaka kromatografisi için gerekli olan malzemeler 3.5. UV lamba: 366 veya 254 nm dalga boyu olan. 3.6. Enjektörler: 100 μL ve 500 μL‘lik. 3.7. Huni ve siyah bant süzgeç kâğıdı 3.8. Ağzı Ģilifli armudi balon: 50 mL‘lik 3.9. Deney tüpü: Konik dipli ve contalı kapağı olan 10 mL‘lik. 3.10. Gaz kromatografi cihazı: Kapiler Kolonlu Split/Splitless enjeksiyon sistemi ile aĢağıdaki parçaları bulunan 3.10.1. Kolonlar için termostat kontrollü, ±1º C hassasiyetle çalıĢabilen fırın. 3.10.2. Split sisteme uygun liner içeren ve sıcaklığı ayarlanabilen enjeksiyon bloğu 3.10.3. Alev-iyonizasyon dedektörü 3.10.4. Gerekli bilgisayar sistemi ve bilgisayar sistemine bağlı yazıcı 3.11. Kapiler kolon: Uzunluğu 20-30 m, iç çapı 0,25–0,32 mm, %5 difenil-%95 dimetilpolisiloksan içeren ve film kalınlığı 0,10–0,30 μm olan, camdan ya da eritilmiĢ silisten (SE-52 , SE-54 veya eĢdeğeri kolon) 3.12. Gaz kromatografi enjektörü: SertleĢtirilmiĢ iğneli 10 μL‘lik. 3.13. Analitik terazi: 0,1 mg hassasiyetli 3.14. Desikatör 4. Kimyasallar 4.2. 2 M Etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: 130 g potasyum hidroksit (en az % 85 saflıkta) 200 mL saf su içinde soğutularak çözülür ve etanolle bir litreye tamamlanır. 4.3. Dietil eter: Analitik saflıkta 4.4. 0,2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi: 13 g potasyum hidroksit 20 mL saf su içinde çözülür ve etanolle 1 litreye tamamlanır. 4.5. Susuz sodyum sülfat: Analitik saflıkta 4.6. Cam plakalar: Silikajel ile kaplanmıĢ, floresan özelliği olmayan, 0,25 mm kalınlıkta. (Kullanıma hazır olarak bulunmaktadır.) 4.7. Benzen: Kromatografik saflıkta 4.8. Aseton: Kromatografik saflıkta 4.9. n-hekzan: Kromatografik saflıkta 4.10. Dietil eter: Kromatografik saflıkta 4.11. Kloroform: Analitik saflıkta 4.12. Ġnce-tabaka kromatografisi için referans çözelti: Kolesterol veya fitosterollerin kloroform içindeki % 5‘lik çözeltisi . 4.13. % 0,2 lik etanollü 2,7-dikloroflorosein çözeltisi: Birkaç damla 2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ilave edilerek hafifçe bazik hale getirilir. 4.14. Susuz piridin: Kromatografik saflıkta 4.15. Heksametil disilizan 4.16. Trimetilklorosilan 4.17. 20-28 karbonlu alifatik alkol trimetilsilil eterlerinin referans çözeltileri (bunları içeren yağlardan elde edilen saf alkol ya da alkol karıĢımları günlük hazırlanır.) 4.18. Kloroformda hazırlanmıĢ % 0,1‘lik (m/v) 1-eikosanol çözeltisi, (iç standart) 4.19. TaĢıyıcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 4.20. Yardımcı gazlar: Yüksek saflıkta hidrojen Yüksek saflıkta kuru hava 5. Prosedür 5.1. SabunlaĢmayan maddelerin hazırlanması 5.1.1. 500 μL‘lik enjektör kullanarak 250 mL‘lik balona, numunenin alifatik alkol içeriğinin yaklaĢık % 10‘u kadar % 0,1‘lik 1-eikosanol ilave edilir. Örneğin, 5 g numune için zeytinyağında 250 μL, pirina yağında ise 1500 μL % 0,1‘lik 1-eikosanol çözeltisi ilave edilir ve çözücü azot gazı altında uçurulur. Nemi alınmıĢ, filtre edilmiĢ numuneden balona tam 5 g tartılır. 5.1.2. Balona 2 M etanolik potasyum hidroksit çözeltisinden 50 mL ilave edilir ve balon geri soğutucuya takılır. SabunlaĢmanın gerçekleĢmesi için (çözelti berrak hale gelene kadar) mantolu ısıtıcıya konularak kaynayıncaya kadar ısıtılır. Berraklık oluĢtuktan (yaklaĢık 20 dk) sonra geri soğutucunun üzerinden 50 mL saf su ilave edilir. Geri soğutucu çıkarılır ve balon yaklaĢık 30 º C sıcaklığa soğutulur. 5.1.3. Balonun içindekiler birkaç defa saf suyla çalkalanarak 500 mL‘lik ayırma hunisine dikkatlice aktarılır. YaklaĢık 80 mL dietil eter ayırma hunisine ilave edildikten sonra 30 saniye kadar güçlü bir Ģekilde çalkalanır ( çalkalama esnasında gaz basıncı artacağından kapaklı ayırma hunisi ters çevrilerek musluktan havası alınmalıdır) ve faz ayrımı için bekletilir. Alt faz ikinci bir ayırma hunisine alınır. Ġlk ayırma hunisinde kalan üst fazdan her seferinde 60-70 mL dietil eter kullanılarak aynı Ģekilde iki ekstraksiyon daha yapılır ve ikinci ayırma hunisine alınır. Herhangi bir emülsiyon oluĢumu az miktarda etil veya metil alkol ilavesiyle yok edilebilir. 5.1.4. Tek bir ayırma hunisinde toplanan üç eter ekstraktı yıkama suyu nötr bir reaksiyon verene kadar (fenolftalein indikatörlüğünde) saf su (her seferde 50 mL) ile yıkanır. Yıkama suyu atıldıktan sonra, eter fazı susuz sodyum sülfat ile filtre edilerek darası alınmıĢ 250 mL‘lik Ģilifli balona süzülür. Huni az miktarda dietil eter ile yıkanır. 5.1.5. Birkaç mL dietil eter kalıncaya kadar vakumlu döner buharlaĢtırıcıda dietil eter damıtılarak uzaklaĢtırıldıktan sonra hafif bir vakum veya azot akımı kullanılarak kuru hale getirilir. Tamamen kuruması için 100 ± 2 ºC sıcaklıktaki etüvde yaklaĢık 1 saat tutulur ve desikatörde soğutulduktan sonra tartılır. 5.2. Alifatik alkol fraksiyonlarının ayrılması 5.2.1. Silikajel plakaları 0,2 M etanollü potasyum hidroksit çözeltisine 10 saniye süreyle tamamen daldırılır, sonra kuruması için çeker ocakta iki saat bırakılır ve son olarak 100 ºC‘deki etüvde 1 saat bekletilir. Etüvden çıkarılır ve kullanılıncaya kadar kalsiyum klorür bulunan desikatörde bekletilir. Bu Ģekilde bir iĢleme tabi tutulan plakalar 15 gün içerisinde kullanılmalıdır. Bazik silikajel plakaları alifatik alkol fraksiyonlarını ayırmak için kullanılacağında sabunlaĢmayan maddeleri alümina ile iĢleme tabi tutmaya gerek yoktur. Ġnce tabaka kullanıldığında tüm asidik bileĢikler (yağ asitleri ve diğerleri) numunenin ilk uygulandığı çizgide kalacak, alifatik ve triterpen alkolleri içeren bant sterolleri içeren bantdan net bir Ģekilde ayrılacaktır. 5.2.2. Benzen/aseton karıĢımı 95:5 (v/v) yürütme tankı içine yaklaĢık 1 cm yükseklikte doldurulur. Alternatif olarak 65:35 (v/v) oranındaki hekzan/dietil eter karıĢımı da kullanılabilir. Yürütme tankının kapağı kapatılır ve sıvı-buhar dengesi oluĢması için en az yarım saat kadar 15-20 ºC arasında bekletilir. Yürütme tankının iç duvarına çözeltiye batırılmıĢ filtre kâğıdı Ģeritleri konulabilir. Bu iĢlem, yürütme süresini yaklaĢık üçte bir oranında azaltır ve bileĢenlerin daha düzgün ve belirgin bir Ģekilde ayrımını sağlar. Yürütme tankının içindeki çözelti her çalıĢmada yenilenmelidir. 5.2.3. SabunlaĢmayan maddelerin kloroformda yaklaĢık % 5‘lik çözeltisi hazırlanır. Çözelti, 100 ìL‘lik enjektör kullanarak 300 ìL‘lik kısmı silikajel plakaya, alt ucuna yaklaĢık 2 cm mesafede mümkün olduğu kadar ince ve düzgün bir çizgi halinde verilir. (Damlacıkların küçük olmasına ve birbiriyle karıĢmayacak Ģekilde verilmesine dikkat edilmelidir.) Kontrol için plakanın bir ucuna, çizgi ile aynı hizaya 2-3 ìL referans çözeltisi damlatılır, böylece alifatik alkol bandı taĢınmadan sonra tanımlanabilir. 5.2.4. Plaka 5.2.2.‘de belirtildiği Ģekilde hazırlanmıĢ olan yürütme tankına konulur. Ortam sıcaklığı 15-20 ºC arasında tutulmalıdır. Yürütme tankının kapağı derhal kapatılır ve numunenin taĢınması plakanın üst kenarının yaklaĢık 1 cm altına gelinceye kadar iĢleme devam edilir. ĠĢlem sonunda tanktan çıkarılan plaka kuruması için bir süre normal ortamda ya da sıcak hava akımında bekletilir. 5.2.5. Plakaya % 0,2‘lik 2,7-dikloroflorosein çözeltisi homojen Ģekilde püskürtülür ve hafifçe kurutulur. UV ıĢık altında plaka üzerinde, referans gölge esas alınarak alifatik alkol bandı sınırları iĢaretlenir. Alifatik ve terpenik alkol bantları bazı alifatik alkollerin terpenik alkoller bandına karıĢması ihtimaline karĢı bantlar birlikte gruplandırılmalıdır. 5.2.6. Metal bir kazıma spatulası kullanarak iĢaretlenmiĢ alandan silikajel kazınır. Kazınan silikajel içine süzgeç kağıdı yerleĢtirilmiĢ huniye konulur. Darası alınmıĢ 50 mL‘lik ağzı Ģilifli armudi balonda süzüntü toplanacak Ģekilde 10 mL sıcak kloroform spatula ile dikkatlice karıĢtırılarak huniye aktarılır. Süzüntü aynı balonda toplanacak Ģekilde hunideki kalıntı üç kez dietil eterle (her sefer yaklaĢık 10 mL) yıkanır. Süzüntüdeki çözücüler düĢük sıcaklıktaki (40 ºC‘yi aĢmayacak Ģekilde) dönerli vakum buharlaĢtırıcıda 4-5 mL kalıncaya kadar uçurulur. Kalan çözelti kuru hale gelene kadar hafif bir azot akımı altında uçurulur. Birkaç damla aseton ilave edilir ve kuruyana kadar tekrar hafif bir azot akımı altında uçurulur. 105 ºC‘deki etüvde 10 dakika bekletilir ve desikatörde soğutulduktan sonra ağzı Ģilifli armudi balon içeriği ile birlikte tartılır. 5.3. Trimetilsilil eterlerin hazırlanması. 5.3.1. Alifatik alkol fraksiyonu içeren ağzı Ģilifli armudi balona 9:3:1 (v/v/v) oranında piridin/hekzametil disilazan/trimetil klorosilan karıĢımından oluĢan silillendirme reaktifinden alifatik alkol miktarının her miligramı için 50 μL oranında ilave edilir. Nem, analiz sonucunu olumsuz etkilemektedir. Piyasada kullanıma hazır silillendirme reaktifi bulunmaktadır (örneğin bis-trimetilsilil, triflor asetamid + % 1 trimetil klorosilan). Bunlar eĢit miktarda susuz piridin ile seyreltilerek kullanılmalıdır. 5.3.2. Ağzı Ģilifli armudi balonun ağzı kapatılır, alifatik alkol tamamen çözünene kadar dikkatlice balon döndürülerek (ters çevirmeden) cidarlarda kalan alifatik alkollerin de silillendirilmesi sağlanır. Ortam sıcaklığında 15 dk kadar bekletilir. Berrak çözelti GC‘ye enjeksiyon için hazırdır. OluĢabilecek hafif opaklık normaldir ve herhangi bir soruna yol açmaz. Beyaz askıda bir parçacığın oluĢması veya pembemsi rengin oluĢması nemliliğin mevcut olduğunu veya reaktifin bozulduğunu gösterir. Eğer bunlar gözlenirse analiz mutlaka tekrarlanmalıdır. 5.4. Gaz kromatografisi ile analiz 5.4.1. Ön iĢlemler 5.4.1.1. Kolon giriĢ kısmı split enjeksiyon sistemine, çıkıĢ kısmı dedektöre bağlantı yapılarak gaz kromatografisi cihazına takılır. Gaz kromatografisi cihazının genel kontrolü yapılır (gaz akıĢı, dedektör ve kayıt edicinin iĢleyiĢinin etkinliği vb) 5.4.1.2. Eğer kolon ilk kez kullanılacak ise Ģartlandırılmalıdır. Kolonun içinden düĢük akıĢ hızı ile taĢıyıcı gaz geçirilir. Kolon, çalıĢma sıcaklığının en az 20 ºC‘nin üzerinde olacak Ģekilde kademeli olarak ısıtılır ve bu sıcaklıkta en az 2 saat süre tutulur. ġartlandırma sıcaklığı kolon için belirtilen en yüksek sıcaklığın 20 ºC altında olmalıdır. Cihaz çalıĢma Ģartları ayarlanır (gaz akıĢı düzenlenir, ateĢleme yapılır, fırın, dedektör ve enjektör sıcaklığı ayarlanır vb.). Baseline, herhangi bir pik olmaksızın doğrusal olmalı ve herhangi bir sapma göstermemelidir. Negatif doğrusal sapma : kolon bağlantılarının doğru yapılmadığını, Pozitif sapma : kolonun yeterince Ģartlanmadığını gösterir. 5.4.2. ÇalıĢma Ģartları 5.4.2.1. ÇalıĢma Ģartları aĢağıdaki Ģekildedir:  Fırın sıcaklığı: 180 °C baĢlangıç sıcaklığında 8 dk bekletildikten sonra 5 °C/dk sıcaklık artıĢı ile 260 °C ye çıkarılır ve bu sıcaklıkta 15 dk bekletilir.  enjeksiyon sıcaklığı: 280-300 ºC,  dedektör sıcaklığı: 280-300 ºC,  taĢıyıcı gazın doğrusal ivmesi: helyum 20 - 35 cm/sn, hidrojen 30-50 cm/s,  split oranı: 1:50-1:100 aralığı,  cihaz hassasiyeti: en düĢük değerin 4 ile 16 katı arasında,  enjekte edilen madde miktarı: Trimetilsilil ester çözeltisinin 0,5-1 ìL‘si. AĢağıdaki gerekliliklere uygun bir kromatogram almak için bu koĢullar değiĢtirilebilir:  Alkol C26 için alıkonma zamanı 18 ± 5 dk ,  Alkol C22 piki zeytinyağı için tam kromatogramın % 80 ± 20‘i; tohum yağı için tam kromatogramın %40 ± 20‘si.  Tüm alkoller mutlaka ayrılmalıdır. Ayrılmaya ek olarak aynı zamanda pikler de birbirinden bağımsız olmalıdır. Yani pik bir sonraki pikten önce mutlaka baseline‘a dönmelidir. 5.4.2.2. Yukarıdaki Ģartlar alkollerin standart trimetilsilil esterleri karıĢımı tekrar tekrar enjekte edilerek ve çalıĢma Ģartları mümkün olan en iyi sonuçları verecek Ģekilde ayarlanarak kontrol edilir. 5.4.2.3. Piklerin integrasyonu için parametreler dikkate alınan piklerin alanlarının doğru bir Ģekilde değerlendirilmesini sağlayacak Ģekilde ayarlanmalıdır. 5.4.3. Analitik prosedür 5.4.3.1. 10 μL‘lik enjektör kullanarak 1 μL hekzan alınır, içine 0,5 μL hava çekilir ve bunu takiben örnekten 0,5-1 μL alınır. Ġğneyi boĢaltmak için enjektörün pistonu kaldırılır. Ġğne enjeksiyon ünitesinin zarına batırılır ve bir-iki saniye sonra hızlıca enjekte edilir, beĢ saniye kadar sonra iğne yavaĢça çıkarılır. 5.4.3.2. Mevcut alifatik alkollerin trimetilsilil esterleri tamamen elde edilinceye kadar iĢleme devam edilir. Baseline düz olmalıdır. 5.4.4. Piklerin tanımlanması Her bir pikin tanımlanması alıkonma zamanları ve aynı koĢullar altında analiz edilen alifatik alkoller Trimetilsilil ester karıĢımlarının alıkonma zamanlarının karĢılaĢtırılmasıyla yapılır. Natürel zeytinyağının alifatik alkol kromatogramı ġekil 1‘de gösterilmektedir. 5.4.5. Miktarın hesaplanması 5.4.5.1. 1-eikosanol ile C22, C24, C26 ve C28 alifatik alkollerinin pik alanları integratör kulanılarak hesaplanır. 5.4.5.2. mg/kg örnek cinsinden ifade edilen her bir alifatik alkol miktarı aĢağıdaki Ģekilde hesaplanır: mA m s s    1000A x Alkol x Burada: Ax = Alkol x‘in pik alanı; As = 1-eikosanol pik alanı ms = mg cinsinden eklenen 1-eikosanol kütlesi; m = g cinsinden saptama için alınan numunenin kütlesi. 6. Sonuçların değerlendirilmesi 6.1. Her bir alifatik alkol miktarı örneğin mg/kg cinsinden ve toplamları da ―toplam alifatik alkol‖ olarak kaydedilir. ġekil 1 Natürel zeytinyağının alkol fraksiyonunun kromatogramı 1 = Eikosanol 2 = Dekosanol 3 = Trikosanol 4 = Tetrakosanol 5 = Pentakosanol 6 = Heksakosanol 7 = Heptakosanol 8 = Oktakosanol EK-16 Zeytinyağında Yabancı Yağın Tespiti 1. Kapsam Bu metod zeytinyağındaki diğer bitkisel yağların varlığını tespit etmek için kullanılır. Linoleik asit değeri yüksek olan bitkisel yağlar (soya yağı, kanola yağı, ayçiçeği yağı vb.) ve fındık yağı, yüksek oleik asitli ayçiçeği yağı, pirina yağı gibi oleik asit değeri yüksek olan bazı bitkisel yağlar tespit edilebilir. Tespit limiti, karıĢtırılan yabancı yağın cinsine ve zeytinin çeĢidine bağlıdır. Fındık yağı için tespit limiti genellikle %5-15 arasındadır. Bu metot zeytinyağına katılan yabancı yağın cinsini belirlemek için kullanılamaz. Sadece zeytinyağının saf olup olmadığını belirlemek için kullanılır. 2. Prensip Yağ silikajel kartuĢlu katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile saflaĢtırılır. Triaçilgliserol (TAG) kompozisyonu propiyonitril mobil fazı kullanılarak, refraktif indeks dedektörlü, ters faz HPLC ile belirlenir. Yağ asidi metil esterleri, saflaĢtırılmıĢ yağdan soğuk metanollu KOH (Ek-9B) ile metillendirilerek hazırlanır ve esterler yüksek polaritede kolon kullanılarak gaz kromatografi ile analiz edilir (Ek-9A). Teorik triaçilgliserol kompozisyonu, yağ asitleri kompozisyonu üzerinden, triaçilgliserollerdeki yağ asitlerinin, 2 pozisyonundaki doymuĢ yağ asitleri hariç, 1,3 ve 2 pozisyonlarının rastgele dağılımını tahminleyen bilgisayar programı yardımı ile hesaplanır. Hesaplama programı Ek-14‘de tarif edilen prosedürün modifiye edilmiĢ halidir. Teorik ve deneysel (HPLC) olarak bulunan triaçilgliserol kompozisyonundan hesaplanmıĢ birkaç matematiksel algoritma ve sonuç değerler ile saf zeytinyağından elde edilen veriler karĢılaĢtırılır. 3. Materyal ve Kimyasallar 3.1. Yağın SaflaĢtırılması 3.1.1. Erlen: 25 ml‘lik 3.1.2. Vial: 5 ml‘lik 3.1.3. Silikajel kartuĢ: 1 g (6 ml). Katı faz ekstraksiyonu için 3.1.4. n-hekzan: Analitik saflıkta 3.1.5. Hekzan/dietileter karıĢımı: 87:13 (v/v) 3.1.6. N- heptan: Analitik saflıkta 3.1.7. Aseton: Analitik saflıkta 3.2. Triaçilgliserollerin HPLC ile Analizi 3.2.1. Mikro enjektör 3.2.2. Propiyonitril/ HPLC süper saflıkta 3.2.3. HPLC kolonu: 25 cm uzunluğunda ve 4 mm iç çapında. RP 18 (4 µm partikül boyutlu) 3.3. Yağ asidi metil eserlerinin hazırlanması (Ek-9B) 3.3.1. Metanol: %0,5 ten az su içeren 3.3.2. Heptan: Analitik saflıkta 3.3.3. 2 M metanollü KOH çözeltisi: 1,1 g KOH 10 ml metanolde çözülür. 3.3.4. Kapaklı vial: 5 ml‘lik 3.4 Yağ Asidi Metil Esterlerinin GC ile Analizi (Ek-9A) 3.4.1. Mikro enjektör: 5 µL‘lik 3.4.2. TaĢıyıcı gaz: Yüksek saflıkta hidrojen veya helyum 3.4.3. FID dedektör için: Yüksek saflıkta hidrojen veya oksijen 3.4.4. Yardımcı gaz: Yüksek saflıkta azot veya helyum 3.4.5. Kapiler kolon: 50–60 m uzunluğunda, 0,25–0,30 mm iç çapında, sianopropilpolisiohegzan veya sianopropilfenilsilogzan,( SP-2380 veya eĢdeğeri) 0,20-0,25 μm film kalınlığında. 4 Malzemeler 4.1. Vakum sistemi: Katı faz ekstraksiyonu için 4.2. Döner buharlaĢtırıcı 4.3. HPLC Donanımı 4.3.1. Gaz giderici: Mobil faz için 4.3.2. Enjeksiyon valfi: 10 μl‘lik 4.3.3. Yüksek basınç pompası 4.3.4. Termostatik fırın sistemi 4.3.5. Refraktif indeks dedektörü (RID) 4.3.6. Bilgisayarlı Ġntegrasyon sağlayan veri toplayan sistem 4.4. GC Donanımı 4.4.1. Split enjeksiyon sistemi 4.4.2. Alev iyonizasyon dedektörü (FID) 4.4.3. Programlanabilir fırın 4.4.4. Bilgisayarlı Ġntegrasyon sağlayan veri toplayan sistem 4.4.5. Excel yüklü bilgisayar 5 Analiz prosedürü 5.1. Yağın SaflaĢtırılması SPE kartuĢ vakum altında 6mL hekzan ile yıkanır. KartuĢun kurumasını önlemek için vakum kaldırılır ve kartuĢ altına erlen konulur. 0,5 ml hekzan içerisinde çözülmüĢ yaklaĢık 0,12 g numune kartuĢa verilir Hekzanda çözülmüĢ numune SPE kartuĢa ilave edilerek 10 mL hekzan-dietil eter (87:13 v/v) içeren çözelti ile yıkanarak vakum altında süzülür. Toplanan fraksiyon homojenize edilip yarısı baĢka bir erlene aktarılır. Her iki erlendeki çözgen karıĢımı düĢük basınç altında ve oda sıcaklığında vakumlu döner buharlaĢtırıcıda uzaklaĢtırılır. Kalıntılardan biri TAG analizleri için 1 mL asetonda çözülür ve 5 ml lik viale alınır. Kalıntılardan ikincisi yağ asitleri kompozisyonu analizi için 1 ml heptanda çözülerek 5 ml lik viale alınır. Yağın saflaĢtırılması IUPAC method 2.507‘de tarif edildiği Ģekilde silikajel kolon kullanılarak yapılabilir. 5.2. HPLC ile Trigliseritlerin Analizi HPLC çalıĢma koĢulları, kolon sıcaklığı: 20 °C, mobil faz: propionitril akıĢ hızı: 0,6 ml/dk olacak Ģekilde ayarlanır. Baseline stabil olduğunda solvent enjeksiyonu yapılır. Eğer baselinda 12-25 dakikaları arasında sapma olursa, örneği çözmek için farklı tipte aseton veya aseton/propiyonitril (25:75) karıĢımı kullanılır. Bazı tip asetonlar, baselineda bahsedilen dakikalarda sapmaya sebep olur. SaflaĢtırılmıĢ yağın aseton içerisindeki çözeltisinden (%5) 10 μl enjeksiyon yapılır. Analiz yaklaĢık 60 dakika sürer. Trilinolein piki 15,5 dakikada gelecek ve LLL/OLLn ile OLL/OOLn pikleri arasında ayrım iyi olacak Ģekilde, ġekil 1 ‗de verilen kromotograma benzer bir kromatogram elde edilene kadar fırın sıcaklığı ve akıĢ hızı ayarlanmalıdır. Pik 2‘nin (OLLn+PoLL) yüksekliği tam skalanın en az %3‗üne ulaĢmalıdır. 5.3. Yağ Asidi Metil Esterlerinin Hazırlanması 1 ml n-heptan içerisinde çözünmüĢ saflaĢtırılmıĢ yağ örneğine, 0,1 ml 2N metanollü KOH çözeltisi eklenir ve tüpün ağzı sıkıca kapatılır. Tüp 15 saniye boyunca hızla çalkalanır ve üst faz berraklaĢana kadar beklenir (5 dakika). Heptan fazı gaz kromatografiye enjeksiyon için hazırdır. Bu çözelti oda sıcaklığında en fazla 12 saat bekletilebilir. 5.4. Yağ Asidi Metil Esterlerinin GC ile Analizi Trans doymamıĢ yağ asitlerinin belirlenmesi için Ek-9A‘da tarif edilen metot kullanılmalıdır. GC çalıĢma Ģartları; Fırın sıcaklığı: 165 C‘de 10 dk beklendikten sonra dakikada 1,5 C‘lik artıĢla 200 C‘ye çıkarılmalıdır. Enjeksiyon bloğu için tavsiye edilen sıcaklık trans yağ asidi oluĢumunu minimize etmek için 220-250 C‘dir (bkz. Ek-9A). Dedektör sıcaklığı 250 °C‘dir. Kolon baĢlangıç basıncı yaklaĢık 130 kPa‘ da taĢıyıcı gaz olarak Helyum veya Hidrojen kullanılmalıdır. Split modunda 1 µL nejeksiyon yapılılır. ġekil 2‘de verilen kromatograma benzer bir kromatogram elde edilmelidir. C18:3 ve C20:1 piklerinin ayrılmasına özellikle dikkat edilmelidir (C18:3 piki C20:1 pikinden önce gelmelidir). Bu Ģartların sağlanması için sıcaklık ve/veya kolon basıncı optimize edilmelidir. Palmitik asit ve palmitoleik asit farkının minimize edilmesi için enjeksiyon koĢulları (sıcaklık, split oranı ve enjeksiyon hacmi) ayarlanır. C20:0 pikinin yüksekliği belirlenen trans izomer tam skalasının yaklaĢık %20‘si kadar olmalıdır. Eğer C18:0 piki düzgün gelmezse örnek miktarı azaltılır. 6. Piklerin Tanımlanması 6.1. HPLC Kromatogramı ġekil 1‘de saf zeytinyağına ait tipik trigliserit kromatogramı görülmektedir. Piklerin integrasyonu için 3 baseline yolu izlenmelidir: Ġlki 1 nolu pikin baĢlangıcı ile 3 nolu pikin bitimi arasında; Ġkincisi 4 nolu pikin baĢlangıcı ile 8 nolu pikten önceki çukurun arasında; üçüncüsü 8 nolu pikten önceki çukurluk ile 18 nolu pik bitiminin arasında. Toplam alan 1 nolu pikten 18 nolu pike kadar tüm piklerin (belirlenmiĢ ve belirlenmemiĢ) alanlarının toplamıdır. Her bir pik yüzdesi aĢağıdaki formülle hesaplanır. TAG x (%) = 100 (A x + A T ) Yüzdeler 2 ondalık olarak verilmelidir. 6.2. GC Kromatogramı ġekil 2‘de saf zeytinyağına ait yağ asidi alkil esterleri kromatogramı görülmektedir. AĢağıda verilen yağ asitlerine ait yüzdeler hesaplanmalıdır. Palmitik; P (C16:0) = metilesterler + etil esterler Stearik; S (C18:0) = methyl ester Palmitoleik; Po (C16:1) = iki cis izomerin metil esterleri toplamı Oleik; O (C18:1) = iki cis izomerin metil esterleri toplamı + etil ester + trans-izomerler Linoleik; L (C18:2) = metil esterler+ etil esterler + trans-izomerler Linolenik; Ln (C18:3) = metil esterler + trans-izomerler AraĢidik; A (C20:0) = metil ester Eicosenoik (gadoleik); G (C20:1) = metil ester Etil ve trans-izomerlerin esterleri GC kromatogramında bulunmayabilir. Toplam alan C14:0 den C:24:0 e kadar squalen hariç görünen tüm piklerin toplamıdır. Her bir pik yüzdesi aĢağıdaki Ģekilde hesaplanır: FA x (%) = 100 (A x + A T ) Sonuçlar 2 ondalık olarak verilmelidir. Bilgisayar programı ile hesaplamada 100‘e tamamlama otomatik olarak yapıldığından bu iĢleme gerek yoktur. ġekil 1. ―Chamlali‖ zeytinyağına ait TAG lerin HPLC Kromatogramı. Kromatografik piklerin ana bileĢenleri. (1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL; (6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO; (10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP; (13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO; (18) POS+SLS. Tablo 1. 20 C kolon sıcaklığında mobil faz olarak propiyonitril kullanılarak HPLC‘ de natürel zeytinyağının TAG lerin belirlenmesine ait tekrar edilebilirlik verileri. EC N HPLC Pikler i TAGs Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3 Örnek 4 Örnek 5 O rt a la m a (% ) R S D r (% ) O rt a la m a (% ) R S D r (% ) O rt a la m a (% ) R S D r (% ) O rt a la m a (% ) R S D r (% ) O rt a la m a (% ) R S D r (% ) 42 1 LLL 0,020 7,23 0,066 5,18 0,095 4,10 0,113 0,95 0,34 1,05 2 OLLn+PoLL 0,085 7,44 0,24 1,78 0,26 2,25 0,35 2,02 0,50 2,83 3 PLLn 0,023 15,74 0,039 5,51 0,057 5,62 0,082 4,35 0,12 6,15 44 4 OLL 0,47 1,52 1,53 0,42 2,62 0,98 3,35 1,05 4,37 1,13 5 OOLn+PoOL 1,07 2,01 1,54 0,46 1,61 0,71 1,72 1,07 1,77 2,40 6 PLL+PoPoO 0,11 12,86 0,24 4,37 0,65 1,32 1,35 0,73 2,28 1,24 7 POLn+PPoPo + PPoL 0,42 5,11 0,49 2,89 0,55 2,01 0,85 1,83 1,09 1,96 46 8 OOL+LnPP 6,72 0,63 8,79 0,31 11,21 0,42 13,25 0,33 15,24 0,23 9 PoOO 1,24 2,86 1,49 0,95 1,63 0,85 2,12 0,45 2,52 0,56 10 SLL+PLO 2,70 0,65 4,05 0,70 6,02 0,65 9,86 0,53 11,53 0,31 11 PoOP+SPoL+ SOLn+SPoPo 0,64 4,42 0,69 3,02 0,79 1,23 1,53 0,89 1,70 1,66 48 12+13 OOO+PLP+ PoPP 49,60 0,07 48,15 0,06 42,93 0,06 33,25 0,10 24,16 0,06 14 SOL 0,82 1,72 0,92 1,56 1,05 1,32 1,25 1,05 1,60 1,77 15 POO 22,75 0,25 21,80 0,20 21,05 0,30 20,36 0,35 20,17 0,14 50 16 POP 3,05 0,46 4,56 0,42 4,98 0,52 5,26 0,41 5,57 0,38 17 SOO 6,87 0,21 5,56 0,33 4,86 0,43 4,12 0,72 3,09 0,69 18 POS+SLS 1,73 1,23 1,65 1,10 1,54 0,99 1,49 1,10 1,41 1,00 n= 3 RSDr= Tekrar edilebilirliğin bağıl standart sapması ġekil 2. Pirina yağının soğuk metanollu KOH ile transesterifikasyonundan elde edilen yağ asidi alkil esterleri GC kromatogramı. 7. Zeytinyağında Yabancı Yağ Tespiti Saf zeytinyağından elde edilen verilere dayalı matematiksel algoritmaların karĢılaĢtırılması yöntemi yoluyla zeytinyağında yabancı yağ tespitinin hesaplaması metodu IOC/T.20/Doc. No 25 standartının Ek-1‗inde düzenlenmiĢtir.