Methodical Instructions for determination of pathogens of diplostomoses of freshwater fishes (No.13-4-2/1404 of 1998)

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ (Минсельхозпрод России) Заместитель начальника Департамента ветеринарии ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ В.В.Селиверстов 22.09.98г. №13-4-2/1404 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по определению возбудителей диплостомозов пресноводных рыб 1. Общие положения 1.1. В фауне России и сопредельных государств выявлено 17 видов рода метацеркарий трематод рода diplostomum (отряд strigeidida, семейство diplostomidae), каждый из которых вызывает самостоятельную форму заболеваний. Для их обозначения к названию «диплостомоз» добавляется соответствующая данному виду возбудителя литера латинского алфавита (Приложение 1.). 1.2. Видовая принадлежность возбудителей и вызываемых ими форм диплостомозов определяется по инвазионным метацеркариям и при строгом соблюдении описанной ниже методики сбора и фиксации, приготовления постоянных препаратов и морфометрического анализа, а также с учетом гостальной специфичности (приуроченности к определенной более или менее узкой группе хозяев) метацеркарий, а также их строгой приуроченности к обитанию в определенных органах рыбы (глаза, головной мозг) или отдельных составных частей глаза (хрусталик, стекловидное тело, внутренние оболочки и жидкие среды глаза). 2. Исследование рыб 2.1. Для исследования берут 10-15 экземпляров свежеуснувших рыб обследуемого вида и составляют протокол их исследования, в котором регистрируется дата исследования, вид рыбы и место ее вылова. 2.2. Каждую рыбу взвешивают, измеряют длину от вершины рыла до основания лучей хвостового плавника, проводят визуальный осмотр рыбы с обращением особого внимания на наличие патологических изменении глаз (изменение формы и размеров зрачка, патология глазного яблока), а также точечных кровоизлияний на жаберных крышках и в основании плавников. Выявленные патологии описывают и заносят в протокол обследования рыб. 2.3. На наличие метацеркарий рода diplostomum обследуют глаза и головной мозг рыб и круглоротых. 2.4. Глаза извлекают из орбит и вскрывают с помощью ножниц или препаровальных игл на часовом стекле или чашке Петри в тонком слое воды. Хрусталики и стекловидное тело глаза переносят на отдельные часовые стекла с речной водой, а с внутренних стенок глазного яблока делают соскоб пинцетом. 2.4.1. Хрусталики и стекловидное тело сразу же (пока они не потеряли своей прозрачности) просматривают под бинокуляром, а при наличии в них паразитов разрывают препаровальными иглами на мелкие части и на 0,5 - 1,0 час оставляют в воде. За это время находящиеся в тканях этих органов метацеркарии сами выйдут в воду и могут быть собраны тонко оттянутой пипеткой. Молодые, еще неинвазионные метацеркарии при этом успевают погибнуть, а инва зионные сохранятся в живом виде. 2.4.2. Соскоб с внутренних стенок глаза обследуют компрессорно под бинокуляром. Обнаруженных метацеркарий аккуратно извлекают из содержимого глазного яблока, отмывают в пресной воде. Если метацеркарий в содержимом глазного яблока очень много (десятки и сотни), отмывку их удобнее производить в 0,2л стаканчике методом отмучивания и последовательных сливов. 2.5. Головной мозг извлекают пинцетом из черепной коробки через вскрытую крышу черепа, помещают на часовое стекло с водой и обследуют визуально на наличие кровоизлияний на сосудистой оболочке мозга и в мозговой ткани. Для выявления метацеркарий рода diplostomum головной мозг исследуют под бинокулярным микроскопом компрессорным способом, либо - если метацеркарий очень много, - методом отмучивания и последовательных сливов. 2.6. Собранных метацеркарий подсчитывают (отдельно инвазионных и неинвазионных), отмывают водой, а перед фиксацией изучают прижизненно. 3. Изучение живых метацеркарий 3.1. По живым метацеркариям уточняют их принадлежность к роду diplostomum и выявляют некоторые специфические особенности их морфологии. Для этого собранных метацеркарий помещают на предметное стекло с лупкой и исследуют их под малым увеличением микроскопа, обращая основное внимание на форму, количество и характер расположения известковых телец в теле метацеркарий. 3.2. По форме и размерам известковых телец дифференцируют метацеркарий рода diplostomum от таковых рода tylodelphys: у первых известковые тельца имеют шаровидную форму и разные размеры, у вторых они овальные и практически одинаковые по размерам. 3.3. Количество и характер расположения известковых телец в теле метацеркарий рода diplostomum один из важных морфологических критериев вида метацеркарий (Рис. 1.). Отмечают, к каким из изображенных на указанном рисунке видам обнаруженные метацеркарий наиболее близки по числу известковых телец и характеру их расположения. В глазах одной и той же особи рыбы могут одновременно паразитировать несколько видов рода diplostomum. 3.4. Отсутствие известковых телец в теле метацеркарий рода diplostomum свидетельствует о том, что эти метацеркарий либо еще молодые н не достигли инвазионной стадии развития (чаще встречаются у молоди рыб), либо уже старые, утратившие свою инвази онность особи (чаще обнаруживаются у рыб старше пяти лет). 4. Фиксация и окраска метацеркарий, приготовление постоянных препаратов 4.1. Фиксацию и окраску метацеркарий проводят уксуснокислым кармином путем добавления краски к живым метацеркариям в минимальном количестве воды. Делать это удобнее всего в биологической пробирке объемом не более 4-5 мл. Соотношение объема краски и воды в пробирке должно быть не менее 10:1. Все после дующие манипуляции по подготовке метацеркарий для монтажа в постоянном препарате осуществляют в той же пробирке путем последовательной смены в ней реактивов тонко оттянутой пипеткой. 4.2. Через 15-20 минут краску слить и заменить на 5-10 минут таким же объемом 1% раствора соляной кислоты в 70° этиловом спирте (дифференцировка окраски). 4.3. Обезвоживание окрашенных метацеркарий производят спиртами возрастающей крепости (85° и двойная смена 96° этилового спирта),просветлении - диметилфталатом (диметиловый эфир фталевой кислоты). Диметилфталат вносят в пробирку специальной «диметилфталатовой» пипеткой, медленно выпуская его по стенке пробирки, непосредственно в спирт. Метацеркарии при этом оказываются на границе более легкого спирта и диметилфталата. Просветление считается законченным, когда метацеркарии опустятся на дно пробирки. После этого поверхностные слои спирта и смеси спирта с диметилфталатом удаляют и заменяют чистым диметилфталатом. 4.4. Монтаж препарата производят на предметном стекле. Для этого в центр предметного стекла помещают каплю диметилфталата с метацеркариями, излишки диметилфталата насколько возможно удаляют и наносят каплю жидкого бальзама, расправляют ее препа ровальной иглой, а метацеркарий равномерно (лучше рядами) размещают на стекле. Через 1-3 часа, когда препарат слегка подсохнет, на него наносят одну-две капли жидкого бальзама и накрывают покровным стеклом. Препарат этикетируют и хранят в течение первого года (пока не высохнут) на лежачих лоточках. 4.5. Если нет возможности завершить процесс изготовления препарата сразу, то его можно прервать на неограниченно долгое время на двух этапах: после дифференцировки окраски, поместив метацеркарий в пробирку с 70° спиртом, или оставить метацеркарий в пробирке с диметилфталатом. 4.6. Приготовление уксуснокислого кармина: в 100мл 45%-ной уксусной кислоты растворить (на водяной бане!) 3-4 г мелко растертого порошка кармина; остывший раствор отфильтровать и разбавить 45%-ной уксусной кислотой в соотношении 1:1. Хранить в плотно закрытой стеклянной посуде. 5. Определение родовой н видовой принадлежности возбудителей диплостомозов пресноводных рыб. 5.1. В отличие от большинства метацеркарий трематод, встречающихся в глазах и головном мозге рыб и круглоротых, метацеркарий рода diplostomun ведут активный (подвижный) образ жизни, никогда не образуя вокруг себя ни цист, ни капсул. В этом отношении они близки только к метацеркариям рода tyiodclphys, от которых, как уже отмечалось, четко отличаются формой и размерами известковых телец (см. п. 3.2.). 5.2. Для видовой диагностики возбудителей диплостомозов рыб используют помимо уже отмеченных выше биологических (гостальная специфичность и приуроченность к обитанию и строго определенных органах рыбы) и морфологических (число известковых телец) признаков целый ряд морфомет рических критериев вида, а именно: длину (А в мкм), ширину (В в мкм) и произведение длины на ширину (А В) тела, роговой и брюшной присосок, органа Брандсса; расстояние от переднего конца тела до центра брюшной присоски (О в мкм); отношения АВ тела к А В органа Брандеса и к АВ брюшной присоски; АВ органа Брандеса и АВ ротовой присоски к А В брюшной присоски; выраженное в процентах отношение В и О к А тела (Рис. 2). 5.3. Определение видовой принадлежности метацеркарий проводят по определительной таблице (Приложение 2). 6. Меры безопасности и личной гигиены 6.1. Лица, проводящие исследования рыб на их зараженность возбудителями диплостомозов, сбор, фиксацию и окраску метацеркарий, а также приготовление реактивов и постоянных препаратов из метацеркарий, должны работать в халатах и соблюдать правила работы с ядовитыми (ледяная уксусная кислота) и огнеопасными (этиловый спирт, диметиловый эфир фталевой кислоты) веществами. 6.2. Приготовление (варка) уксуснокислого кармина должно производиться в вытяжном шкафу и только на водяной бане. 6.3. После окончания работы вымыть руки и лицо теплой водой с мылом, а место работы обработать 2% ным раствором кальцинированной соды. Рис. 1. Число и расположение известковых телец у метацеркарий некоторых видов рода diplostomum: а - d. rutili; б - d. chromatophorum; в - d. helveticum; г - d. ; д - d. phoxini; e - d.mergi; ж - d. pungitii (по Шигину, 1986) Рис. 2. Схема измерений метацеркрий рода diplostomum. Обозначения: am - длина тела; Вm - ширина тела; Арп длина ротовой присоски; Врп - ширина ротовой присоски; Абп -длина брюшной присоски: Вбп - ширина брюшной присоски; Аоб -длина органа Брандеса; Воб ширина органа Брандеса; Аф - длина фаринкса; Вф ширина фаринкса; aз.с. - длина заднего сегмента: 0 расстояние от переднего конца тела до центра брюшной присоски (по Шигину,1986).