Regulation on measures for detection, containment and suppression of Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. the causal agent of potato ring rot, the manner of determining the boundaries of infected and threatened areas and free of harmful organisms, conditions for termination of the ordered measures and manner of notification on taken measures

На основу члана 43. став 2. Закона о здрављу биља („Службени гласник РС”,број 41/09), Министар пољопривреде, шумарства и водопривреде доноси ПРАВИЛНИК о мерама за откривање, спречавање ширења и сузбијање штетног организма Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.проузроковача прстенасте трулежи кртола кромпира, начину одређивања граница зараженог, угроженог и подручја без штетних организама, условима за окончање наложених мера, као и начину обавештавања о предузетим мерама и престанак мера „Службени гласник РС“, број 103 од 11.децембра 2009. I. ОСНОВНЕ ОДРЕДБЕ Члан 1. Овим правилником прописују се мере за откривање, спречавање ширења и сузбијање штетног организма Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. Spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.,проузроковача прстенасте трулежи кртола кромпира, начин одређивања граница зараженог, угроженог и подручја без штетног организма, условима за окончање наложених мера, као и начину обавештавања о предузетим мерама и престанак мера. II. МЕРЕ ОТКРИВАЊА ШТЕТНОГ ОРГАНИЗМА Члан 2. Ради откривања штетног организма Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. Spp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.,проузроковача прстенасте трулежи кртола кромпира (у даљем тексту: штетни организам) спроводи се посебан надзор над штетним организмом који обухвата прегледе биљака и кртола кромпира (Solanum tuberosum L.) и прегледе прописаних објеката. Број, порекло, метод и време узимања узорака приликом прегледа биљака и кртола кромпира и прописаних објеката одређује се у зависности од специфичних система производње кромпира и биологије штетног организма. Члан 3. При прегледу биљака кромпира у пољу у току вегетације врши се визуелни преглед на присуство штетног организма, узимају се узорци биљака и достављају овлашћеној лабораторији (у даљем тексту: лабораторија) ради лабораторијског испитивања. При прегледу кртола кромпира, узимају се узорци кртола семенског кромпира и осталог кромпира који није намењен садњи (у даљем тексту: меркантилни кромпир), првенствено из лотова у складиштима и дистрибутивним центрима ради обављања визуелног прегледа сечењем кртола, односно достављања лабораторији ради лабораторијског испитивања. Семенски кромпир мора да потиче директно од материјала произведеног у складу са званичним програмом контроле и за који је лабораторијским испитивањем утврђено да није заражен штетним организмом. Лабораторијско испитивање из ст. 1. и 2. овог члана спроводи се у складу са међународно прихваћеним процедурама на начин описан у Прилогу овог правилника – Шема тестирања за дијагностику, детекцију и идентификацију проузроковача прстенасте трулежи кромпира (у даљем тексту: Прилог), који је одштампан уз овај правилник и чини његов саставни део. Члан 4. Сумња на појаву штетног организма постоји ако су визуелно уочени типични симптоми болести или је резултат једног од брзих тестова провере (сцреенинг тест) позитиван. Да би се потврдила или отклонила сумња на појаву штетног организма,спроводе се даља лабораторијска испитивања на начин описан у Прилогу од стране овлашћене лабораторије. Приликом спровођења лабораторијских испитивања на одговарајући начин чувају се узорковане кртоле и, када је то могуће, узорковане биљке, преостали екстракт и додатно припремљен материјал за брзе тестове провере (screeniningтеста), нпр. стакалца за имунофлуоресценцију и сву релевантну документацију. Сачувани узорак кртола омогућава и испитивање сортности у случајевима када је то потребно. Када је лабораторијским испитивањем потврђено присуство штетног организма, најмање месец дана од дана потврђене заразе чува се на одговарајући начин узорак вештачки заражених тест биљака плавог патлиџана и изолована култура штетног организма. Члан 5. У случају сумње на појаву штетног организма, предузимају се следеће мере: 1) забрана премештања свих лотова или пошиљака кромпира из којих су узети узорци; 2) додатне превентивне мере ради спречавања ширења штетног организма, у зависности од процењеног степена ризика. Додатне превентивне мере из става 1. тачка 2) овог члана могу укључити надзор над премештањем свих осталих кртола или биљака повезаних са сумњивом појавом, унутар и ван објеката, ограничавање употребе могуће заражених машина и опреме. Члан 6. Ако држалац биља, биљних производа и прописаних објеката или било која друга особа уочи симптоме заразе или посумња на појаву штетног организма,обавезан је да о томе одмах обавести Министарство. III. НАЧИН ОДРЕЂИВАЊА ГРАНИЦА ЗАРАЖЕНОГ,УГРОЖЕНОГ И ПОДРУЧЈА БЕЗ ШТЕТНОГ ОРГАНИЗМА, МЕРЕ ЗА СПРЕЧАВАЊЕ ШИРЕЊА И СУЗБИЈАЊЕ ШТЕТНОГ ОРГАНИЗМА И УСЛОВИ ЗА ОКОНЧАЊЕ НАЛОЖЕНИХ МЕРА Начин одређивања граница зараженог,угроженог и подручја без штетног организма Члан 7. Када се на основу резултата лабораторијског испитивања потврди присуство штетног организма одређују се границе зараженог, угроженог или подручја без штетног организма, тако што се: 1) означава као заражене кртоле или биљке, пошиљке, односно лотови,машине, превозна средства, складишта или њихови делови и други објекти и предмети, укључујући и материјал за паковање, из којих је сваки од узорака узет, као и места производње и парцеле са којих потичу биљке и кртоле; 2) одређује обим могуће заразе евидентирањем чињеница о свим контактима у производном процесу са извором заразе (пре и после вађења кртола) у циљу одређивања обима могуће заразе и ширења штетног организма; 3) разграничава заражено, угрожено и подручје без штетног организма на основу означене и потврђене заразе, обима могуће заразе, као и могућег ширења штетног организма. Члан 8. Одређивање обима могуће заразе врши се евидентирањем: 1) кртола или биљака произведених на месту производње које је означено као заражено; 2) других места производње која су у било каквој вези са кртолама или биљкама које су означене као заражене, као и заједнички коришћене опреме и објеката; 3) кртола или биљака које су произведене на местима производње из тачке2) овога члана или су се налазиле на тим местима истовремено са кртолама и биљкама које су означене као заражене; 4) простора и објеката у којима се обавља манипулација кромпира који потиче са места производње из тач. 1) до 3) овог члана; 5) машина, превозних средстава, складишта или њихових делова, као и других објеката или предмета, укључујући и материјал за паковање, који су могли да дођу у додир са кртолама или биљкама које су означене као заражене; 6) кртола или биљака које су биле ускладиштене или у додиру са неким од прописаних објеката или са предметима из тачке 5) овог члана, пре њиховог чишћења и дезинфекције; 7) кртола или биљака које се сматрају могуће зараженим због клонске повезаности са кртолама или биљкама које су означене као заражене, иако су резултати тестирања негативни. Спроводи се и тест сортности да би се проверио идентитет заражених и клонски сродних кртола или биљака кромпира; 8) места производње кртола или биљака из тачке 7) овог члана. Одређивање могућег ширења штетног организма врши се на основу близине других места производње кромпира и других биљака домаћина, као и заједничке производње и употребе залиха семенског кромпира. Члан 9. Партије кромпира које су клонски сродне са кртолама или биљкама које су означене као заражене подлежу обавезном лабораторијском испитивању, у складу са Прилогом. Мере за спречавање ширења и сузбијање штетног организма Члан 10. Кртоле или биљке које су означене као заражене се уништавају, односно спаљују или на други начин одлажу на месту за одлагање отпада на коме не постоји ризик од ширења штетног организма. Ако је утврђено да не постоји ризик од ширења штетног организма кртоле или биљке које су означене као заражене могу се употребљавати и то: 1) као храна за животиње после термичке обраде на начин који не оставља никакву могућност преживљавања штетног организма; 2) индустријски прерађивати, под условом да се директно допреме до места прераде на коме постоји опрема за одлагање отпада чијим коришћењем је отклоњена опасност од ширења штетног организма и које има систем за чишћење и дезинфекцију превозних средстава која напуштају место прераде; 3) подвргавати и другим мерама под условом да нема опасности од ширења штетног организма. Члан 11. Кртоле или биљке које се сматрају могуће зараженим штетним организмом и кртоле или биљке кромпира које су клонски повезане са онима које су означене као заражене без обзира на резултате тестирања не смеју се користити за садњу, већ се могу: 1) употребити као меркантилни кромпир намењен исхрани, при чему кромпир мора да буде пакован на местима која располажу одговарајућом опремом за одлагање отпада и који је пакован за директну испоруку без препакивања. Са семенским кромпиром дозвољено је руковати на тим истим местима само ако се ради одвојено или након чишћења и дезинфекције, или 2) употребити као меркантилни кромпир намењен индустријској преради, уз директну и брзу испоруку до погона за прераду, који мора да располаже одговарајућом опремом за одлагање отпада и системом за чишћење и дезинфекцију превозних средстава која напуштају место прераде, или 3) употребити или одложити на неки други начин под условом да нема опасности од ширења штетног организма. Члан 12. Отпад који је настао као резултат спровођења мера из чл. 10. и 11. овог правилника и отпад који настаје током руковања, одстрањивања и прераде заражених партија кромпира одлаже се тако да се избегне свака опасност од ширења штетног организма, и то: 1) отпаци кромпира (укључујући одбачени кромпир и кору) и сви други чврсти отпаци који су у вези с кромпиром (укључујући земљу, камење и друге остатке) уклањају се на следећи начин: – одлагањем на за то службено одобреном месту, на којем не постоји опасност од неконтролисаног ширења штетног организма у околину, нпр. испирањем кроз поре земље до пољопривредног земљишта. Отпаци се превозе директно до одређеног места у затвореном превозном средству тако да не постоји опасност од губитка отпада, – спаљивањем, – применом неке друге мере за које је утврђено да не постоји опасност од ширења штетног организма; 2) течни отпад настао у преради који садржи чврсте честице се филтрира или обрађује поступком седиментације ради уклањања чврстих честица које на начин из става 1. тачка 1) овог члана. Течни део отпада неопходно је: 1) загрејати на температури од најмање 60ºC у трајању најмање 30минута или 2) одстранити под службеним надзором на начин који онемогућава да отпаци дођу на било који начин у додир са пољопривредним земљиштем или изворима воде која може бити коришћена за наводњавање пољопривредног земљишта. Члан 13. Машине, превозна средства, складишта и њихови делови и други објекти и предмети, укључујући и материјал за паковање, који су означени као заражени или се сматрају зараженима морају да се очисте и дезинфикују применом одговарајућих метода за чишћење и дезинфекцију којима се отклања опасност од ширења штетног организма. У случају када материјал за паковање из става 1. овог члана није могуће очистити и дезинфиковати тако да се отклони опасност од ширења штетног организма налаже се његово уништавање. Члан 14. На пољу које је означено као заражено спроводе се следеће мере: 1) за време од најмање три вегетационе године после године у којој је утврђена зараза забрањена је садња кртола и биљака као и сетва семена кромпира у ботаничком смислу и других биљака домаћина штетног организма или усева за које је утврђено да омогућују ширење штетног организма и уклањање самониклих биљака кромпира и других биљака домаћина штетног организма. У првој сезони производње кромпира која следи после периода из става 1. овог члана, под условом да на пољу најмање две последње вегетационе године током спровођења прегледа нису пронађене самоникле биљке кромпира и друге биљке домаћини,дозвољава се производња искључиво меркантилног кромпира и спроводи лабораторијско испитивање кртола приликом вађења. У сезони производње кромпира која следи после сезоне из става 2. овог члана, дозволиће се, уз одговарајући плодоред,који мора бити најмање двогодишњи за производњу семенског кромпира, производња семенског или меркантилног кромпира, уз спровођење прегледа; 2) током четири вегетационе године после године у којој је утврђена зараза спроводе се мере одржавања поља на угару или коришћење поља као трајног пашњака са интензивном испашом или честом ниском косидбом и уклањање самониклих биљака кромпира и других самониклих биљака домаћина штетног организма. После спровођења мера из става 1. тачка 2) овог члана, у следећој вегетационој години дозволиће се производња семенског или меркантилног кромпира, уз лабораторијско испитивање извађених кртола ако на пољу које је означено као заражено у току спровођења прегледа нису пронађене самоникле биљке кромпира и друге биљке домаћини најмање две узастопне вегетационе године. Члан 15. На осталим пољима унутар места производње које је означено као заражено у вегетационој години која следи после године у којој је утврђена зараза забрањује се садња кртола и биљака кромпира, као и сетва семена кромпира у ботаничком смислу и налаже уклањање самониклих биљака домаћина штетног организма. Изузетно од става 1. овог члана, ако је пре садње утврђено да је отклоњена опасност од самониклих биљака кромпира, може се дозволити садња сертификованог семенског кромпира намењеног искључиво производњи меркантилног кромпира уз обавезно лабораторијско испитивање извађених кртола. У другој и трећој вегетационој години које следе после године у којој је зараза утврђена, после спровођења мера из ст. 1. и 2. овог члана дозволиће се садња искључиво сертификованог семенског кромпира за семенску или меркантилну производњу Поред мера из ст. 1, 2. и 3. овог члана најмање три вегетационе године спроводи се уклањање самониклих биљака кромпира и других биљака домаћина штетног организма ако су присутне, као и лабораторијско испитивање извађеног кромпира са сваког поља. Члан 16. У заштићеним просторима на месту производње које је означено као заражено који су намењени производњи биља није дозвољена садња кртола и биљака кромпира као и сетва семена кромпира у ботаничком смислу, све док се не спроведу мере уништавања штетног организма и не уклоне остаци биљака домаћина, при чему се као минимална мера спроводи замена супстрата за гајење, чишћење и дезинфекција производне јединице и целокупне опреме. После спровођења мера из става 1. овог члана дозволиће се садња искључиво сертификованог семенског кромпира или мини-кртола или микро биљака добијених из културе биљног ткива које потичу из тестираних извора. Члан 17. Ради праћења здравственог стања биља, биљних производа и прописаних објеката у зараженом или угроженом подручју и утврђивања услова за престанак наложених мера, поред спровођења мера из чл. 10. до 16. овог правилника, у току најмање три вегетационе године које следе после године у којој је зараза утврђена: 1) врши се надзор места на којима се производе, складиште, налазе или дорађују кртоле кромпира, укључујући и парцеле, површине, уређаје и опрему; 2) врши се садња унутар зараженог или угроженог подручја, искључиво сертификованог семенског кромпира и обавезно испитивање после вађења семенског кромпира који је произведен на могуће зараженим местима производње; 3) на свим производним површинама унутар зараженог и угроженог подручја са произведеним семенским кромпиром поступа се одвојено од меркантилног кромпира или се врши чишћење и дезинфекција објеката, уређаја и опреме између поступања са семенским и меркантилним кромпиром. IV. НАЧИН ОБАВЕШТАВАЊА О ПРЕДУЗЕТИМ МЕРАМА И ПРЕСТАНАК МЕРА Члан 18. Подаци и информације о потврђеној зарази, као и подаци и информације о престанку мера достављају се међународним организацијама и другим државама у складу са међународном конвенцијом и споразумима обавезујућим за Републику Србију. Министарство ће доставити службеном телу надлежном за заштиту биља државе у којој постоји опасност од ширења заразе следеће податке: 1) назив сорте кромпира и партије; 2) намену (меркантилни или семенски), и када је могуће, категорију семенског кромпира; 3) назив и адресу пошиљаоца и примаоца; 4) датум доспећа партије кромпира; 5) величину испоручене партије кромпира; 6) копију фитоцертификата. V. ЗАВРШНА ОДРЕДБА Члан 19. Овај правилник ступа на снагу осмог дана од дана објављивања у „Службеном гласнику Републике Србије”. Број 110-00-285/2009-09 У Београду, 3. децембра 2009. године Министар, др Саша Драгин, с.р. ПРИЛОГ ШЕМА ТЕСТИРАЊА ЗА ДИЈАГНОСТИКУ, ДЕТЕКЦИЈУ И ИДЕНТIFИКАЦИЈУ ПРОУЗРОКОВАЧА ПРСТЕНАСТЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА Поглавље I ОБЛАСТ ПРИМЕНЕ ШЕМЕ ТЕСТИРАЊА Приказана шема тестирања описује различите поступке укључене у: 1) дијагнозу прстенасте трулежи на кртолама и биљкама кромпира; 2) детекцију Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus у узорцима кртола кромпира и биљкама; 3) идентификацију Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus(C. m. subsp. sepedonicus). Поглавље II I. ОПШТА НАЧЕЛА У поглављима III–ХI овог прилога се налазе стандардни протоколи за поједине методе, потврђени и одобрени реагенси и појединости везане за припрему материјала за тестирање и референтног материјала. У Поглављу III овог прилога се налази и списак лабораторија укључених у процес оптимизације и валидације протокола. С обзиром да протоколи укључују методе детекције карантинског организма,што подразумева и употребу живих референтних култура C.m. subsp. sepedonicus,процедура се мора изводити у прописаним карантинским условима са одговарајућим објектима за одлагање, чување и уништавање отпада у складу са Правилником. Параметри тестирања морају обезбедити уједначене и поновљиве нивое детекције C.m. subsp. sepedonicus према прописаним праговима осетљивости појединих метода. Обавезна је прецизна припрема позитивних контрола. Тестирање у складу са захтеваним прагом осетљивости подразумева правилно постављање, одржавање и калибрирање опреме, пажљиво руковање и чување реагенаса као и предузимање мера за спречавање контаминације између узорака, нпр.раздвајање позитивних контрола од узорака за тестирање. Како би се избегле административне или друге грешке, морају се примењивати стандарди контроле квалитета, посебно при означавању узорака и вођењу документације. Сумња на присуство патогена у узорку подразумева позитиван резултат теста провере узорка, као што је приказано у дијаграмима тока. Ако је резултат првог теста провере (IF или PCR/FISH) позитиван, тада се сумња на присуство C.m. subsp. sepedonicus и потребно је применити и други тест провере. Ако је резултат и другог теста позитиван, тада је сумња потврђена и тестирање се наставља према описаној шеми. Ако је резултат другог теста негативан, тада се сматра да C.m. subsp. sepedonicus није присутна у узорку. Позитиван резултат IF теста се дефинише као позитивно очитавање IF теста потврђено и другим тестом провере (PCR/FISH). Потврђено присуство патогена подразумева изолацију и идентификацију чисте културе Ц.м. ссп. сепедоницус и потврду патогености. 1. Приказ дијаграма тока 1.1. Шема утврђивања присуства проузроковача прстенасте трулежи у кртолама и биљкама кромпира са типичним симптомима прстенасте трулежи (Шема 1) Поступак тестирања се примењује за кртоле и биљке кромпира са типичним симптомима или симптомима који изазивају сумњу на присуство проузроковача прстенасте трулежи. Поступак укључује тест провере, изолацију патогена из зараженог спроводног ткива на хранљиву подлогу и, у случају позитивног резултата, идентификацију чисте културе C.m. subsp. sepedonicus. 1) опис симптома наведен је у тачки 2. овог поглавља; 2) одговарајући тестови су: – IF тест (тачка 4. овог поглавља); – PCR тест (тачка 6. овог поглавља); – FISH тест (тачка 5. овог поглавља); 3) иако је изолација патогена из биљног материјала са типичним симптомима применом методе разређења и засејавања на хранљиву подлогу једноставна, овај поступак може бити значајно отежан у узорцима у поодмаклој фази инфекције.Сапрофитне бактерије које се развијају на оболелом ткиву могу прерасти или инхибирати патогена на хранљивој подлози. Зато се препоручује коришћење и неселективне и селективне хранљиве подлоге (најбоље MTNA или примена биолошког теста из тачке 7. овог поглавља; 4) опис типичне морфологије колоније наведен је у тачки 8. овог поглавља; 5) ако је резултат изолације негативан, али су симптоми болести типични,тада је потребно поновити поступак изолације патогена; 6) поуздана идентификација чисте културе C.m. subsp. sepedonicusпостиже се применом тестова наведених у тачки 9. овог поглавља; 7) тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. 1.2. Шема за утврђивање присуства и идентификацију C.m. subsp. sepedonicus у узорцима кртола кромпира без видљивих симптома (Шема 2) 1) стандардна величина узорка је 200 кртола – ако на располагању нема 200кртола, поступак се може спровести и на мањим узорцима; 2) методе екстракције и концентровања патогена описане су у тачки 3. овог поглавља; 3) ако су резултати најмање два теста, који се темеље на различитим биолошким начелима, позитивни, потребно је извршити изолацију и потврдити присуство патогена. Извршити бар један тест провере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други или више тестова провере, који се темеље на различитим биолошким начелима, како би се потврдио позитиван резултат. Ако су резултати осталих тестова негативни, сматра се да је тај узорак негативан.Даље тестирање није потребно; 4) тест имунофлуоресценције (IF): Користити поликлонална антитела за IFтест, а додатна моноклонална антитела омогућавају већу специфичност (тачка 4.овог поглавља); 5) PCR тест. Користити потврђене и одобрене реагенсе и протоколе за PCR (тачка 6. овог поглавља); 6) FISH тест: Користити потврђене реагенсе и протоколе (тачка 5. овог поглавља); 7) селективна изолација: У многим случајевима, коришћење MTNA или NCP-88хранљивих подлога и 1/100 разређења ресуспендованог талога је одговарајућа метода за директну изолацију C.m. subsp. sepedonicus. Типичне колоније се појављују три до десет дана после засејавања на хранљиву подлогу, када их је могуће пречистити и идентификовати патогена. Пажљивим вађењем и припремом конуса пупчаног дела кртоле кромпира избегава се појава сапрофитних бактерија са кртола кромпира, које на хранљивој подлози конкуришу колонији C.m. subsp. sepedonicus и могу је прерасти. Ако се патоген не може изоловати на хранљивој подлози, потребно је поновити поступак изолације коришћењем биљака из биолошког теста (тачка 8. овог поглавља); 8) биолошки тест се користи за изолацију C.m. subsp. sepedonicusиз екстракта селективним обогаћивањем у биљкама плавог патлиџана (Соланум мелонгена). Тест захтева оптималне услове инкубације, као што је наведено у овој методи. Током примене овог теста, највероватније је да неће доћи до појаве бактерија које инхибирају раст и развој C.m. subsp. sepedonicus на хранљивим подлогама MTNA или NCP-88 (тачка 7. овог поглавља); 9) типична морфологија колоније описана је у тачки 8. овог поглавља; 10) гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бактеријама. Ако се у тестовима провере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање спроводног ткива на месту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке; 11) поуздана идентификација чистих култура C.m. subsp. sepedonicusпостиже се извођењем тестова описаних у тачки 9. овог поглавља; 12) тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. Начело – Поступак тестирања намењен је за откривање присуства скривене заразе у кртолама кромпира. Позитиван резултат најмање два теста провере, темељи се на различитим биолошким начелима, допуњује се изолацијом патогена, после чега, у случају изолације типичних колонија, следи потврда чисте културе C.m. subsp. sepedonicus. Позитиван резултат само једног од тестова провере није довољан да би се узорак сматрао вероватно зараженим. Тестови провере и изолација морају омогућити ниво осетљивости детекције103 до 104 ћелија/ml ресуспендованог талога, укљученог као позитивна контрола у свакој серији тестова. 1.3. Шема за утврђивање присуства и идентификацију C. m. ssp. sepedonicus у узорцима биљака кромпира без симптома (Шема 3) 1) препоручене величине узорака наведене су у тачки 3. подтачка 3.2. овог поглавља; 2) екстракција патогена и методе концентровања описане су у тачки 3.подтачка 3.2. овог поглавља; 3) ако су резултати најмање два теста, који се темеље на различитим биолошким начелима, позитивни, потребно је извршити изолацију и потврду присуства патогена. Извршити бар један тест провере. Када је резултат теста негативан, сматра се да је узорак негативан. У случају да је резултат тог теста позитиван, потребно је извршити други или више тестова провере, који се темеље на различитим биолошким начелима, како би се потврдио позитиван резултат. Ако су резултати осталих тестова негативни, сматра се да је тај узорак негативан.Даље тестирање није потребно; 4) селективна изолација и типична морфологија колоније описани су у тачки8. овог поглавља; 5) IF тест описан је у тачки 4. овог поглавља; 6) PCR тестови описани су у тачки 6. овог поглавља; 7) FISH тест описан је у тачки 5. овог поглавља; 8) биолошки тест описан је у тачки 7. овог поглавља; 9) гајење бактеријске културе или биолошки тест могу бити неуспешни због компетиције или инхибиције сапрофитним бактеријама. Ако се у тестовима провере добију јасно позитивни резултати, а резултати изолације су негативни, поновити тестове изолације из истог ресуспендованог талога или поновити узимање спроводног ткива на месту везивања столона код кртола из истог узорка и, ако је потребно, тестирати додатне узорке; 10) поуздана идентификација чистих култура C.m. subsp. sepedonicusпостиже се извођењем тестова описаних у тачки 9. овог поглавља; 11) тест патогености описан је у тачки 10. овог поглавља. 2. Визуелни преглед за откривање симптома прстенасте трулежи 2.1. Биљке кромпира У европским климатским условима симптоми се ретко проналазе у пољу и то често тек на крају сезоне. Осим тога, симптоми су често прикривени или се могу заменити са симптомима других биљних болести, старења биљака или механичким оштећењима. Зато се симптоми могу врло лако превидети приликом прегледа у пољу.Симптоми увенућа се разликују од оних код проузроковача мрке трулежи; увенуће је обично споро и у почетку ограничено на ивице листова. Млади заражени листови често настављају раст, мада у зараженим деловима спорије, што доводи до формирања листова необичног облика. Због блокаде спроводног ткива у доњем делу стабљике, на листовима се, између лисних нерава често појављују хлоротичне,жуто-наранџасте површине. Временом пропадају заражени делови листа, листови, па чак и стабљике. Често долази само до смањења величине листова и кртола.Повремено су биљке закржљале. Фотографије различитих симптома могу се пронаћи на wеб страници: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main 2.2. Кртоле кромпира У најранијој фази појаве симптома, ткиво кртоле је стакласто или прозирно, без омекшавања око спроводног ткива, посебно у близини пупчаног дела кртоле. У пупчаном делу кртоле, прстен спроводног система може бити мало тамнији од уобичајеног. Први лако уочљив симптом је жућкаста боја спроводног прстена, а када се кртола благо стисне, из спроводних судова излазе мале количине материје сирасте конзистенције, која садржи милионе бактерија. Могућ је развој појаве браон (смеђе, мрке) боје спроводног ткива и симптоми на кртоли су у овом стадијуму слични симптомима мрке трулежи коју проузрокује Ралстониа соланацеарум. У почетку, симптоми су ограничени на један део спроводног прстена, не обавезно близу пупка, а касније се постепено проширују на цео прстен. Како инфекција напредује, долази до потпуног пропадања спроводног ткива; спољни и унутрашњи део кртоле се могу раздвојити. У каснијим фазама инфекције, на површини кртола појављују се пукотине, које су често црвенкасто-смеђе по ивицама. Недавно је у Европи забележено неколико случајева појаве симптома где је средиште кртоле трунуло истовремено са спроводним прстеном што је довело до секундарног напада патогена са стварањем унутрашњих шупљина и некроза. Присуство секундарних гљива или бактерија може прикрити симптоме, услед чега може бити тешко, чак и немогуће, разликовати узнапредовале симптоме прстенасте трулежи од других трулежи кртола. Могућа је појава и нетипичних симптома прстенасте трулежи. Фотографије различитих симптома могу се пронаћи на wеб страници http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. 3. Припрема узорака 3.1. Кртоле кромпира Напомена: – стандардна величина узорка је 200 кртола по тесту. Интензивније узорковање захтева извођење већег броја тестова на узорцима те величине. Већи број кртола у узорку довешће до инхибиције или ће отежати тумачење резултата.Поступак се може применити и за узорке са мање од 200 кртола, када је на располагању мање кртола; – валидација свих метода за утврђивање присуства патогена, које су описане у даљем тексту, базира се на тестирању узорака од 200 кртола; – екстракт кромпира који је описан у даљем тексту може се користити и за утврђивање присуства проузроковача мрке трулежи кромпира, бактерије Ралстониа соланацеарум. Процедура која претходи припреми узорка: опрати кртоле, употребити одговарајућа дезинфекциона средства (при коришћењу PCR теста употребити једињења хлора ради уклањања евентуално присутне ДНК патогена) и детерџенте између сваког узорка, осушити кртоле на ваздуху. Поступак прања је посебно користан али не и обавезан за случајеве обраде узорака са већом количином земље, при извођењу PCR теста или процедуре директне изолације. http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main 3.1.1. Чистим и дезинфикованим скалпелом или ножем за поврће уклонити покожицу са пупчаног дела кртоле тако да се виде спроводни судови. Пажљиво изрезати мали конусни део спроводног ткива на пупчаном делу захватајући што мање околног, неспроводног ткива (видети wеб страну: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Напомена: Све кртоле са потенцијално сумњивим симптомима прстенасте трулежи одвојити посебно и тестирати. Ако се приликом вађења конуса из пупчаног дела уоче потенцијални симптоми прстенасте трулежи, кртоле треба визуелно прегледати. Сваку пресечену кртолу са оваквим симптомима треба оставити два дана на собној температури, а потом чувати у карантинским условима (на 4 до 10 ºC) до спровођења тестирања.Све кртоле у узорку (укључујући и оне са сумњивим симптомима) треба чувати на начин прописан овим правилником. 3.1.2. Извађене конусе из пупчаног дела кртоле који садрже делове спроводног ткива ставити у стерилне посуде које се могу запечатити и/или херметички затворити (ако су посуде већ употребљаване, морају се темељно очистити и дезинфиковати употребом средстава на бази једињења хлора). Узорке је пожељно одмах обрадити. Ако то није могуће, потребно је чувати их у посуди без додатка пуфера, најдуже 72 сата у фрижидеру или најдуже 24 сата на собној температури. Током чувања долази до сушења и суберизације сржног дела конуса,као и до раста и развоја сапрофита, што може ометати утврђивање присуства бактерије проузроковача прстенасте трулежи. 3.1.3. Извађене конусе из пупчаног дела кртоле обрадити коришћењем једног од следећих поступака: а) извађене конусе прекрити довољном количином (око 40 ml) екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога) и ултрацентрифугирати на 50 до 100обртаја/мин, четири сата на температури испод 24 ºC или 16 до 24 сата уз хлађење; б) извађене конусе хомогенизовати са довољном количином (око 40 ml)екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога), било у мешалици (нпр. Waringили Ultra Thurax) било дробљењем у затвореној кеси за мацерацију за једнократну употребу (нпр. кесе Stomacher или Биореба од чврстог политена, 150 mm x 250 mm,стерилизоване зрачењем) користећи гумени чекић или одговарајући апарат за мацерирање (нпр. Хомеx). Напомена: Ако се узорци хомогенизују у блендеру, постоји велика опасност од њихове унакрсне контаминације. Предузети мере опреза у циљу спречавања настајања аеросола или просипања током екстракције. За сваки узорак употребити стерилизоване ножиће и посуде. Током процедуре PCR-а, спречити пренос ДНК на контејнере или апаратуру за мацерирање. За PCR тест препоручује се мацерирање узорака у кесицама за једнократну употребу и даље коришћење епрувета и туба за једнократну употребу. http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main 3.1.4. Одлити супернатант. Ако је превише мутан, разбистрити га ултрацентрифугирањем на мањем броју обртаја (највише 180 г/ 10 минута на температури од 4 до 10ºC) или вакуумском филтрацијом (40 до 100 µm) током које се филтер додатно испира екстракционим пуфером (око 10 ml) (Поглавље Vовог прилога). 3.1.5. Извршити концентрисање фракције бактерије центрифугирањем на 7000 g 15 минута (или 10.000 g 10 минута) на температури од 4 до 10ºC, после чега се пажљиво, без мешања са талогом одлива супернатант. 3.1.6. Ресуспендовати талог у 1,5 ml пелет пуфера (пуфера за растварање талога) (Поглавље V овог прилога). Од ове количине користити 500 µl за тестирање на присуство C.m. subsp. sepedonicus, 500 µl за тестирање на присуство Ралстониа соланацеарум и 500 µl као референтни материјал за чување. У последњи,референтни део од 500 µl додати стерилни глицерол у коначној концентрацији од10 до 25% (v/v), промешати и чувати на температури од –16 до –24 ºC (недељама) или на –68 до –86 ºC (месецима). Делове одвојене за утврђивање присуства бактерија, током тестирања чувати на температури од 4 до 10 ºC.Не препоручује се вишеструко замрзавање и одмрзавање. У случају потребе за транспортом узорака, исти доставити у преносивом фрижидеру у року од 24 до 48сати. 3.1.7. Важно је да се све позитивне контроле C.m. subsp. sepedonicusи узорци држе одвојено да би се избегла контаминација. Ово се односи и на IFплочице и друге тестове. 3.2. Биљке кромпира Напомена: За откривање латентних популација C.m. subsp. sepedonicusпрепоручује се тестирање збирних узорака. Поступак се може погодно применити на збирне узорке са највише 200 делова стабљике (узимање узорака током спровођења надзора се мора темељити на статистички репрезентативном узорку испитиване биљне популације). 3.2.1. Чистим дезинфикованим ножем или маказама за резидбу одрезати 1 до2 цм доњег дела сваке стабљике, одмах изнад површине земљишта. Делове стабљике дезинфиковати кратким потапањем у 70% етанол и одмах осушити упијајућим папиром. Ставити делове стабљике у затворену стерилну посуду. 3.2.2. Обрадити делове стабљике помоћу једног од следећих поступака: а) делове стабљике прекрити довољном количином (приближно 40 ml)екстракционог пуфера (Поглавље V овог прилога) и ултрацентрифугирати на 50 до100 обртаја/мин четири сата на температури испод 24 ºC или 16 до 24 сата уз хлађење; б) делове стабљике измацерирати у чврстој кеси за мацерацију (нпр.Стомацхер или Биореба) са одговарајућом количином екстракционог пуфера(Поглавље V овог прилога) користећи гумени чекић или одговарајућу опрему за мацерирање (нпр. Хомеx). Ако то није могуће, делове стабљике чувати у фрижидеру најдуже 72 сата или на собној температури најдуже 24 сата. 3.2.3. Након 15 минута таложења, одлити супернатант. 3.2.4. Даље избистравање екстракта или концентровање фракције бактерија обично није потребно, али се може постићи филтрирањем и/или центрифугирањем. 3.2.5. Поделити чисти или концентровани екстракт узорка на два једнака дела. Једну половину чувати на температури од 4 до 10 ºC током тестирања,а другу половину оставити за случај употребе у додатним тестирањима: у екстракт се додаје 10–25% (v/v) стерилног глицерола и чува на температури од –16 до –24ºC (недељама) или на –68 до –86 ºC (месецима). 4. IF тест Начело– Употреба IF теста као главног теста провере препоручује се због његове доказане уједначености у постизању захтеваних прагова осетљивости методе. Када се IF тест користи као главни тест провере и ако је IF очитавање позитивно, додатно се као други тест користи PCR или FISH тест. Када се IF тест користи као други тест провере и IF очитавање је позитивно, даља тестирања у циљу комплетирања анализа се изводе према дијаграму тока. Напомена: Када се IF тест користи као главни тест провере, увек користити поликлонална антитела. У случају позитивног IF очитавања с поликлоналним антителима, даља провера употребом моноклоналних антитела може повећати специфичност, али и умањити осетљивост теста. Употребити антитела за референтни сој C.m. subsp. sepedonicus.Препоручује се одређивање титра за сваку нову серију антитела. Титар се дефинише као највеће разређење у коме долази до оптималне реакције при тестирању суспензије која садржи 105 до 106 ћелија по ml одговарајућег соја C.m. subsp. sepedonicus уз коришћење флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC) коњугата у складу с препорукама произвођача. Неразређена поликлонална и моноклонална антитела треба да имају IF титар најмање 1:2000. Током тестирања користити радна разређења антитела, која су близу или једнака титру. Користити потврђена и одобрена антитела (видети wеб страницу: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Тестирање треба извршити на свеже припремљеним екстрактима узорака, а по потреби, тестирање се може успешно извршити и на екстрактима који су били чувани на температури од –68 до –86 ºC са додатком глицерола. Глицерол уклонити додавањем 1 ml пелет пуфера (пуфера за растварање талога), поновним центрифугирањем на 7000 g у трајању од 15 минута и ресуспендовањем талога у једнакој запремини пелет пуфера. Овај део процедуре често није потребан,нарочито ако су узорци фиксирани на микроскопска IF стакла пламеном. На одвојеним микроскопским стаклима припремити позитивну контролу и то хомологни или неки други референтни изолат C.m. subsp. sepedonicus,растворен у екстракту кромпира и по избору у пуферу. На истој IF плочици треба, где год је то могуће, користити и позитивну контролу коју чини природно заражено ткиво (лиофилизовано или замрзнуто на –16до –24 ºC). http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main Негативну контролу могу представљати и делови екстракта узорака који су у ранијем тестирању показали негативан резултат. Користити микроскопске плочице са више бунарчића, по могућности са 10отвора пречника најмање 6 mm. Применити идентичан поступак тестирања на узорке и на позитивне и негативне контроле. 4.1. Припремити IF плочице за тестирање једним од следећих поступака: а) за талоге са релативно малом количином наталоженог скроба: у први бунарчић пипетом одмерити стандардну запремину разређења од 1/100ресуспендованог талога кромпира (15 µl је довољно за бунарчиће пречника 6 mm –повећати запремину за веће бунарчиће). Потом у остале бунарчиће у истом реду пипетом одмерити сличну запремину неразређене суспензије (1/1) талога. Други ред се може користити као дупликат првог или за други узорак како је приказано на Шеми 4; б) за остале суспензије талога: припремити децимална разређења (1/10 и1/100) ресуспендованог талога у пуферу за талог. У један ред бунарчића пипетом одмерити стандардну запремину ресуспендованог талога и сваког разређења (15 µlје довољно за бунарчиће пречника 6 mm – повећати запремину за веће). Други ред се може користити као дупликат првог или за други узорак као што је приказано на Шеми 5. 4.2. Оставити да се капљице осуше на собној температури или их загревати до температуре од 40 до 45 ºC. Ћелије бактерија фиксирати на IF плочицу загревањем (15 минута на 60 ºC), провлачењем кроз пламен, 95%-тним етанолом или према посебним упутствима произвођача антитела. Уколико је то неопходно, фиксиране плочице се могу чувати замрзнуте у десикатору у краћем временском интервалу (највише до три месеца). 4.3. IF поступак: а) У складу са поступком за припрему плочица за тестирање како је описано у 4.1 а): припремити двоструки низ разређења антитела у IF пуферу. Први бунарчић мора имати 1/2 титра (Т/2), а остали 1/4 титра (Т/4), 1/2 титра (Т/2),титар (Т) и двоструки титар (2Т); б) у складу с поступком за припрему плочица за тестирање како је описано у 4.1 б): Припремити радно разређење антитела у IF пуферу. Радно разређење утиче на специфичност. 4.3.1.Поређати плочице на навлажени папир. Сваки бунарчић потпуно испунити разређењем антитела. Запремина антитела мора бити једнака запремини нанесеног екстракта. Уколико не постоје посебна упутства произвођача антитела, потребно је следити следећу процедуру: 4.3.2. Инкубирати прекривене плочице на влажном папиру 30 минута на собној температури (18 до 25 ºC). 4.3.3. Капљице са сваке плочице отрести и плочице пажљиво испрати IFпуфером. Потопити плочице у IF пуфер-Tween (Поглавље V овог прилога) па у IFпуфер, у трајању од по пет минута. Спречити стварање аеросола или пренос капљица јер би могло доћи до унакрсне контаминације узорака. Плочице пажљиво осушити упијајућим папиром. 4.3.4. Поређати плочице на навлажени упијајући папир. Бунарчиће попунити разређеним FITC коњугатом који се користи за одређивање титра. Запремина коњугата нанесеног на бунарчић мора бити једнака запремини нанесеног антитела. 4.3.5. Инкубирати покривене плочице на влажном папиру, 30 минута на собној температури (18 до 25 ºC). 4.3.6. Отрести капљице коњугата са плочица. Испрати и опрати плочице како је претходно описано (4.3.3). Плочице пажљиво осушити. 4.3.7. На сваки бунарчић пипетом нанети 5–10 µl 0,1 М глицерола са фосфатним пуфером (Поглавље V овог прилога) или комерцијално доступно средство против изблеђивања и ставити покровно стакло. 4.4. Очитавање IF теста: 4.4.1. Прегледати припремљене плочице под епифлуоресцентним микроскопом са одговарајућим филтерима за ексцитацију FITC-а, под уљном или воденом имерзијом и увећањем од 500-1000 х. Прегледати сваки бунарчић уздуж и попреко,под правим углом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. Прво треба прегледати плочицу с позитивном контролом. Ћелије морају бити изразито флуоресцентне и потпуно обојене на утврђеном титру антитела или радног разређења. У случају да код обојености дође до одступања, IF тест се мора поновити. 4.4.2. Утврдити да ли јасно флуоресцентне ћелије које се уочавају у бунарчићима имају морфологију карактеристичну за C.m. subsp. sepedonicus(видети wеб страницу: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитет флуоресценције мора бити једнак или бољи од оног који даје позитивни контролни изолат, при једнаком разређењу антитела. Занемарити непотпуно обојене или слабо флуоресцентне ћелије. Уколико се посумња на контаминацију, тест се мора поновити (нпр. ако због контаминације пуфера све плочице у серији показују позитивне ћелије или ако су позитивне ћелије пронађене (изван бунарчића) на површини плочице). 4.4.3. Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу теста имунофлуоресценције. У концентрованом екстракту издвојених конуса пупчаних делова кртоле или делова стабљике увек се очекује и присуство популација флуоресцентних ћелија са нетипичном морфологијом или унакрсна реакција са сапрофитним бактеријама сличне величине и грађе као C.m. subsp. sepedonicus. 4.4.4. Приликом очитавања у обзир се узимају само флуоресцентне ћелије типичне величине и морфологије у титру или радном разређењу антитела како је описано у тачки 4. подтачка 4.3. овог поглавља. 4.4.5. Тумачење очитавања IF теста: а) уколико се утврди присуство јасно флуоресцентних ћелија карактеристичне морфологије, одредити просечан број типичних ћелија по микроскопском видном пољу и израчунати број типичних ћелија по mlресуспендованог талога (Поглавље VI овог прилога). http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main Очитавање IF теста је позитивно за узорке који имају најмање 5 x 10³типичних ћелија по ml ресуспендованог талога. Овакав узорак се сматра потенцијално контаминираним и потребно је извршити даље тестирање; б) очитавање IF теста је негативно за узорке који имају мање од 5 x 10³ћелија по ml ресуспендованог талога и узорак се сматра негативним. Није потребно даље тестирање. 5. FISH тест Начело – уколико се у FISH тесту као првом тесту провере добије позитиван резултат, IF тест се користи као други обавезни тест провере. Ако се FISH тест користи као други тест провере и ако се њиме добије позитиван резултат, за постављање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање према дијаграму тока. Напомена: Користити потврђене и одобрене олиго-пробе специфичне за бактерију C.m. subsp. sepedonicus (Поглавље IX овог прилога). Прелиминарна тестирања применом ове методе треба да омогуће поновљиву детекцију најмање 10³ до104 ћелија C.m. subsp. sepedonicus по ml додатих екстракту узорка претходно доказаног као негативног. Поступак треба извршити на свеже припремљеним екстрактима узорака, али се успешно може применити и на екстракт узорка који је био чуван са глицеролом на температури од –16 до –24 ºC или од –68 до –86 ºC. За негативну контролу употребити делове екстракта узорака који су у ранијем тестирању на C.m. subsp. sepedonicus доказани као негативни. За позитивну контролу припремити суспензије које садрже 105 до 106ћелија/ml 0,01М фосфатног пуфера (ПБ) C.m. subsp. sepedonicus (нпр. сојNCPPB 4053, или PD 406) из културе старе 3 до 5 дана (за припрему видети Поглавље ИВ овог прилога). Припремити одвојене плочице за позитивну контролу са хомологим или неким другим референтним изолатом C.m. subsp. sepedonicus,раствореним у екстракту кромпира, као што је наведено у Поглављу ИВ овог прилога. Коришћење еубактеријске олиго-пробе обележене FITC-ом омогућава контролу процеса хибридизације јер ће се обојити све еубактерије присутне у узорку. Контролни материјал тестирати применом исте процедуре као и узорке. 5.1. Фиксирање екстракта кромпира Следећи протокол се заснива на процедури Wullings и сар., (1998): 5.1.1. Припремити раствор за фиксирање (Поглавље IX овог прилога). 5.1.2. Пипетом одмерити 100 µl екстракта сваког узорка у Eppendorfепрувету па центрифугирати осам минута на 7000 г. 5.1.3. Уклонити супернатант и растворити талог у 500 µl фиксатива припремљеног највише 24 сата раније, промешати и инкубирати преко ноћи на 4ºC. Алтернативни фиксатив је 96 % етанол. При томе је потребно растворити талог у 50 µl 0,01М ПБ и 50 µl 96% етанола, промешати и инкубирати на 4 ºC 30 до 60 минута. 5.1.4. Центрифугирати осам минута на 7000 г, уклонити супернатант и ресуспендовати талог у 75 µl 0,01М ПБ (Поглавље V овог прилога). 5.1.5. У бунарчиће чистих плочица нанети 16 µl фиксираних суспензија како је приказано на Шеми 6. На сваку плочицу нанети два различита, неразређена узорка и употребити 10 µl за припремање разређења 1:100 (у 0,01М ПБ). Преостали фиксирани раствор узорка (49 µl) чувати на –20 ºC после додавања једнаке запремине 96%-тног етанола. Ако FISH тест треба поновити, центрифугирањем уклонити етанол и додати једнаку запремину 0,01 ПБ (уз мешање). 5.1.6. Плочице осушити на ваздуху (или у сушници на 37 ºC) па их фиксирати провлачењем кроз пламен. На овом кораку се може прекинути поступак и наставити следећи дан. Плочице треба чувати на собној температури у сувом простору без прашине. 5.2. Предхибридизација и хибридизација 5.2.1. Припремити раствор лизозима који садржи 10 мг лизозима (Sigma L-6876) у 10 ml пуфера (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, pH 8,0). Тај се раствор може чувати, али се само једном сме замрзнути и одмрзнути. Сваки узорак добро прекрити са приближно 50 µl раствора лизозима и инкубирати десет минута на собној температури. Затим само једном потопити плочицу у деминерализовану воду и пажљиво осушити филтер папиром. Алтернативно, уместо лизозима додати 50 µl 40 до 400 µg ml–1 протеиназе К у пуферу (20 mM Трис-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) на сваки бунарчић и инкубирати на37 ºC 30 минута. 5.2.2. Дехидратацију ћелија извршити узастопним потапањем плочица у50%-тни, 80%-тни и 90%-тни етанол, у трајању од по једног минута. Плочице поставити на држач и осушити на ваздуху. 5.2.3. Припремити влажну комору за инкубацију тако што се дно херметички затворене кутије прекрива упијајућим или филтер папиром потопљеним у 1x хyбмиx (Поглавље IX овог прилога). Кутију претходно инкубирати у апарату за хибридизацију нуклеинских киселина на 55 ºC најмање десет минута. 5.2.4. Припремити раствор за хибридизацију и то 45 µl по плочици(Поглавље IX овог прилога) и претходно инкубирати пет минута на 55 ºC. 5.2.5. Ставити плочице на термоблок на 45 ºC и нанети по 10 µlхибридизованог раствора на сваки од четири бунарчића. 5.2.6. Ставити два покровна стакалца (24 x 24 mm) на сваку плочицу пазећи при том да у бунарчићима не остане ваздух. Ставити плочицу у претходно загрејану влажну комору и хибридизовати у мраку (преко ноћи) у апарату за хибридизацију на 55 ºC. 5.2.7. Припремити три посуде са 1 л Ултра чисте воде, 1Л 1x хyбмиx (334 ml 3x хyбмиx и 666 ml Ултра чисте воде) и 1Л 1/2x хyбмиx (167 ml 3x хyбмиx и833 ml Ултра чисте воде). Сваку посуду претходно инкубирати у воденом купатилу на 55 ºC. 5.2.8. Скинути покровна стакалца, а предметне плочице ставити на држач. 5.2.9. Вишак пробе уклонити инкубирањем у трајању од 15 минута на 55ºC у посуди са 1x хyбмиx. 5.2.10. Пренети држач плочица у раствор за прање (1/2 x хyбмиx) и инкубирати још 15 минута. 5.2.11. Плочице накратко уронити у Ултра чисту воду и ставити на филтер папир. Вишак влаге уклонити филтер папиром. У сваки бунарчић пипетом нанети 5до 10 µl заштитног раствора против изблеђивања (нпр. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA или еквивалентна) па целу предметну плочицу покрити великим покровним стаклом (24 x 60 mm). 5.3. Очитавање FISH теста 5.3.1. Плочице прегледати под епифлуоресцентним микроскопом, коришћењем уљане имерзије, с увећањем 630 или 1000 х. Са филтером прикладним за флуоресцеин-изотиоцијанат (FITC), еубактеријске ћелије (укључујући већину грам негативних ћелија) се у узорку виде као флуоресцентно зелене. Употребом филтера за тетраметилродамин-5-изотиоцијанат, ћелије C.m. subsp. sepedonicus,обојене са Cy3, виде се као флуоресцентно црвене. Упоредити морфологију ћелија узорка с морфологијом ћелија позитивних контрола. Ћелије морају бити јасно флуоресцентне и у потпуности обојене. Ако дође до одступања у обојености, FISHтест се мора поновити. Прегледати сваки бунарчић уздуж и попреко под нормалним углом и дуж спољне ивице. За узорке у којима је видљив мали број ћелија или их уопште нема прегледати најмање 40 микроскопских видних поља. 5.3.2. Уочити да ли су видљиве јасно флуоресцентне ћелије у бунарчићима морфологије карактеристичне за C.m. subsp. sepedonicus (види wеб страницу: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитет флуоресценције мора бити једнак или јачи него код позитивне контроле. Ћелије које нису у потпуности обојене или су слабе флуоресценције се не узимају у обзир. 5.3.3. Уколико постоји сумња да је дошло до контаминације, тест се мора поновити(нпр. све плочице у серији због контаминације пуфера показују позитивне ћелије или су позитивне ћелије пронађене изван бунарчића, на површини плочице). 5.3.4. Постоји неколико проблема у вези са специфичношћу FISH теста. У концентрованом екстракту издвојених конуса пупчаних делова кртоле или стабљике увек се очекује и присуство популација флуоресцентних ћелија са нетипичном морфологијом или унакрсна реакција са сапрофитним бактеријама сличне величине и грађе као C.m. subsp. sepedonicus, мада знатно ређе него код IF теста. 5.3.5. У обзир се узимају само флуоресцентне ћелије типичне величине и морфологије. 5.3.6. Тумачење резултата FISH теста: а) резултати FISH теста сматрају се важећим ако се у свим позитивним и ни у једној негативној контроли применом FISH филтра уочава присуство јасно зелених флуоресцентних ћелија чија је величина и морфологија типична за C.m. subsp. sepedonicus и ако се применом филтера за родамин уочавају јасне црвене флуоресцентне ћелије. Ако се уоче јасне ћелије карактеристичне морфологије, одредити просечни број типичних флуоресцентних ћелија по микроскопском видном пољу и израчунати број типичних ћелија по mlресуспендованог талога (Поглавље VI овог прилога). Потенцијално позитивним се сматрају узорци са најмање 5 x 10³ типичних ћелија по ml ресуспендованог талога и потребна су им даља тестирања. Негативним се сматрају узорци с мање од5 x 10³ типичних ћелија по ml ресуспендованог талога; б) FISH тест је негативан ако се применом филтера за родамин не уоче снажно флуоресцентне црвене ћелије чија је величина и морфологија типична за C.m. subsp. sepedonicus, под условом да се применом филтера за родамин уоче типичне изразито флуоресцентне црвене ћелије у препаратима позитивне контроле. 6. PCR тест Начела – када се употребом PCR теста као првог теста провере добије позитиван резултат, IF тест се користи као други обавезни тест провере. Ако се коришћењем PCR теста као другог теста провере добије позитиван резултат, за постављање коначне дијагнозе треба обавити даље тестирање према дијаграму тока. http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main Коришћење ове методе као главног теста провере препоручује се само уколико је доступна специјализована експертиза. Напомена: Прелиминарна тестирања применом ове методе треба да омогуће поновљиву детекцију најмање 10³ до 104 ћелија C.m. subsp. sepedonicus по mlкоје су додате екстракту узорка претходно доказаног као негативног. За постизање највећег степена осетљивости и специфичности у свим лабораторијима, потребно је извођење огледа за стандардизацију (оптимизацију)методе. Користити потврђене и одобрене реагенсе и протоколе за PCR. Пожељно је одабрати метод који подлеже интерној контроли. Предузети одговарајуће мере опреза како би се избегла контаминација узорка циљном ДНК. PCR тест треба да обављају искусни стручњаци, у специјализованим лабораторијима за молекуларну биологију. Негативне контроле (за екстракцију ДНК и PCR поступак) треба увек у поступку обрадити последње како би се утврдило да ли је евентуално дошло до било каквог преношења ДНК. У PCR тест укључити следеће негативне контроле: – екстракт узорка у коме претходно током тестирања није доказано присуство Ц. м. субсп. Сепедоницус; – пуфер коришћен за екстракцију бактерије и ДНК из узорка; – PCR-реакциони микс. У PCR тест укључити следеће позитивне контроле: – аликвоте ресуспендованих талога у које је додата C.m. subsp. sepedonicus (Поглавље ИВ овог прилога); – суспензију од 106 ћелија по ml вирулентног изолата C.m. subsp. sepedonicus у води (нпр. NCPPB 2140 или NCPPB 4053); – ако је могуће, у PCR тесту користити и ДНК екстрахован из позитивних контролних узорака. Да би се избегла могућа контаминација, позитивне контроле припремити просторно одвојено од узорака за тестирање. С обзиром да примена PCR протокола захтева коришћење екстракта узорака са што мање земље, пре почетка процедуре извођења теста, узорке кромпира је пожељно добро опрати. 6.1. Методе пречишћавања ДНК Позитивну и негативну контролу користити на претходно описан начин.Контролни материјал припремити на исти начин као и узорке. Доступне су различите методе пречишћавања циљане ДНК из комплексних супстрата узорка у циљу уклањања инхибитора PCR реакције и других ензимских реакција и методе концентровања циљане ДНК у екстракту узорка. Метода која следи је стандардизована за коришћење са потврђеном и одобреном PCR методом у (Поглавље VIII овог прилога). а) Метода према Пастрику (2000): 1. Пипетом одмерити 220 µl лизис пуфера В100 mM NaCl, 10mM Трис-HCl (pH 8,0), 1mM ЕДТА (pH 8,0)] у Eppendorf тубу од 1,5 ml; 2. Додати 100 µl екстракта узорка и ставити у термоблок или водено купатило на 95 ºC 10 минута; 3. Ставити тубу на лед у трајању од пет минута; 4. Додати 80 µl основног шток раствора Lysozyme (50 мг лизозима по ml у10 mM Трис HCl, pH 8,0) и инкубирати на 37 ºC 30 минута; 5. Додати 220 µl раствора Easy DNA® А (Инвитроген), добро измешати на вортексу и инкубирати на 65 ºC 30 минута; 6. Додати 100 µl раствора Easy DNA® Б (Инвитроген) и снажно измешати на вортексу до постизања униформног вискозитета узорка; 7. Додати 500 µl хлороформа, измешати на вортексу док се вискозитет не умањи и смеса постане хомогена; 8. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 ºC да се поделе фазе и створи међуфаза; 9. Пренети горњу фазу у нову Eppendorf тубу; 10. Додати 1 ml 100% етанола (-20 ºC), кратко промешати на вортексу и инкубирати на леду 10 минута; 11. Центрифугирати на 15.000 g 20 минута на 4 ºC и уклонити етанол од талога; 12. Додати 500 µl 80% етанола (-20 ºC) и промешати окретањем тубе; 13. Центрифугирати на 15.000 g 10 минута на 4 ºC сачувати талог, а уклонити етанол; 14. Оставити талог да се суши на ваздуху или у вакуумској центрифуги (ДНК спеед вац); 15. Ресуспендовати талог у 100 µl стерилне Ултра чисте воде и оставити на собној температури најмање 20 минута; 16. Чувати на -20 ºC до извођења PCR-а; 17. Било који бели талог издвојити центрифугирањем и за PCR употребити 5µl супернатанта који садржи ДНК; б) друге методе – за екстракцију ДНК могу се применити и друге методе(нпр. Qiagen DNeasy Plant Kit), уколико је доказана еквивалентност у прочишћавању ДНК из контролних узорака који садрже 10³ до 104 патогених ћелија по ml. 6.2. PCR 6.2.1.Припремити узорке за тестирање и контролне узорке за PCR према одобреним протоколима (Поглавље VIII овог прилога). Припремити разређење екстракта ДНК из узорка 1:10 у Ултра чистој води). 6.2.2. У неконтаминираном простору припремити одговарајући реакциони микс за PCR према објављеним протоколима (Поглавље VIII овог прилога). Одобрени PCRпротокол је мултиплекс реакција која такође укључује унутрашњу PCR контролу. 6.2.3. Додати 5 µl екстракта ДНК у стерилне епрувете за PCR, за PCRреакцију која се изводи у 25 µl. 6.2.4. Укључити и негативну контролу која садржи само PCR реакциони микс,а уместо узорка додати исти извор Ултра чисте воде који је коришћен за припремуPCR реакционог микса. 6.2.5. Ставити епрувете у уређај за PCR (thermal cycler) и покренути стандардизовани PCR програм (Поглавље VIII овог прилога). 6.3. Анализа PCR продуката 6.3.1. Умножене PCR продукте раздвојити електрофорезом у агарозном гелу.У сваки бунарчић 2,0%-тног (v/v) агарозног гела у трис-ацетат ЕДТА пуферу (ТАЕ)нанети најмање 12 µl ампликона ДНК из сваког узорка, помешане с 3 µl боје и пропустити уз напон од 5 до 8 V В/цм. Употребити одговарајући ДНК маркер, нпр.100 бпладдер (Поглавље VIII овог прилога). 6.3.2. Обојити електрофоретске траке ДНК у гелу потапањем гела у етидиум бромид (0,5 мг/л) у трајању од 30 до 45 минута. Предузети одговарајуће мере опреза при раду са овим мутагеном. 6.3.3. Обојени гел прегледати на краткоталасном УВ трансилуминатору (нпр.л = 302 нм), и потражити умножене фрагменте очекиване дужине (Поглавље VIIIовог прилога) и документовати их. 6.3.4. Приликом сваког новог налаза/случаја проверити аутентичност умноженог PCR продукта извођењем анализе уз помоћ рестрикционих ензима на узорку преостале умножене ДНК и то инкубацијом при оптималној температури и у оптималном времену с одговарајућим ензимом и пуфером (Поглавље VIII овог прилога). Настале фрагменте раздвојити електрофорезом у агарозном гелу како је претходно наведено и после бојења етидиум бромидом на УВ трансилуминатору посматрати карактеристичну матрицу (образац) рестрикционих фрагмената и упоредити је са позитивном контролом пре и после раздвајања. Тумачење резултата PCR теста: PCR тест је негативан ако у тестираном узорку није видљив PCR продукт очекиване дужине који је специфичан за C.m. subsp. sepedonicus, али је видљив у свим позитивним контролним узорцима (код мултиплекс PCR-а са прајмерима за унутрашњу контролу који су специфични за биљку домаћина: у тестираном узорку се мора умножити други продукт PCR-а очекиване величине). PCR тест је позитиван ако је видљив PCR продукт који је специфичан за C.m. subsp. sepedonicus и који је очекиване дужине и рестрикционог обрасца, под условом да није умножен ни у једном узорку који представља негативну контролу.Поуздана потврда позитивног резултата представља и успешно понављање теста с другим паром PCR прајмера (тачка 9. подтачка 9.3. овог поглавља). Напомена: Уколико се очекивани фрагмент (позитивна реакција) добије у узорку позитивне контроле која садржи C.m. subsp. sepedonicus у води, а негативни резултат добије у узорку позитивне контроле која садржи C.m. subsp. sepedonicus у екстракту кромпира, претпоставља се да је дошло до инхибицијеPCR реакције. У мултиплекс PCR протоколима који се изводе употребом унутрашњихPCR контрола, сматра се да је дошло до инхибиције реакције ако није добијен ни један од два продукта. Такође, ако се из једне или више негативних контрола добије очекивани продукт, може се сумњати да је дошло до контаминације. 7. Биолошки тест Напомена: Прелиминарно тестирање овом методом треба да омогући поновљиво откривање присуства 10³ до 104 цфу C.m. subsp. sepedonicus по ml, додатих екстрактима узорака који су у ранијем тестирању били негативни (за припрему видети Поглавље ИВ овог прилога). Највећа осетљивост детекције може се очекивати ако се користе свеже припремљени екстракти узорака и оптимални услови за раст и развој патогена.Међутим, ова метода може успешно да се примени и употребом екстраката који су чувани са глицеролом на температури од -68 до -86 ºC. Неке сорте плавог патлиџана представљају одличну селективну подлогу за обогаћење и раст C.m. subsp. sepedonicus, чак и у одсуству симптома, а уједно су и одличне за утврђивање биљака домаћина. Услови раста треба да су оптимални како би се умањио ризик од добијања лажно негативних резултата. Детаљи у вези са гајењем биљака се налазе у (Поглавље Х овог прилога). 7.1. На преосталу количину ресуспендованог талога остављеног за тестирање из 3.1.6 или 3.2.5 применити методу инокулације зарезивањем или методу инокулације ињекцијом. Користити само биљке плавог патлиџана у стадијуму два до три права листа, до потпуне развијености трећег правог листа. По једном узорку потребно је 15 до 25 биљака патлиџана, како би се у потпуности искористио ресуспендовани талог и осигурала ефикасна инокулација. 7.2. У циљу смањења тургора, биљке патлиџана не заливати један до два дана пре инокулације. 7.3. Инокулација зарезивањем. 7.3.1. Држећи биљку међу прстима, пипетом нанети капљицу (око 5–10 µl)ресуспендованог талога на стабљику и то између котиледона и првог листа. 7.3.2. Стерилним скалпелом направити дијагонални рез, дуг око 1 цм и дубок око 2/3 дебљине стабљике, почевши од нанесене капљице ресуспендованог талога. 7.3.3. Чврсто затворити рез стерилним вазелином из шприца. 7.4. Инокулација ињекцијом. Стабљике плавог патлиџана инокулисати непосредно изнад котиледона ињекцијом с танком иглом (не мањом од 23Г). Узорак поделити на биљке плавог патлиџана, тако да свака биљка добије одговарајућу количину. 7.5. Позитивна контрола: пет биљака инокулисати суспензијом од 105 до 106ћелија по ml воде познате културе C.m. subsp. sepedonicus и, када је могуће, екстрактом природно зараженог ткива кртола (тачка 4. овог поглавља)истом методом инокулације. 7.6. Негативна контрола: пет биљака инокулисати истом методом инокулације користећи стерилни пелет пуфер (пуфер за растварање талога). 7.7. Биљке гајити у карантинским просторијама до четири седмице на 18 до24 ºC, уз довољну количину светла и високу влажност (70 до 80%) и адекватно заливати како би се спречило накупљање воде или увенуће због недостатка воде. C.m. subsp. sepedonicus се не развија на температурама изнад 30 ºC, а оптимална температура је 21 ºC. У циљу спречавања унакрсне контаминације, биљке позитивне и негативне контроле гајити на јасно одвојеним столовима у стакленику или полицама у комори за раст или, у случају да је простор ограничен, побринути се да су биљке јасно одвојене између појединих поступака у току извођења процедуре. Ако се биљке за различите узорке морају гајити близу једна другој, раздвојите их погодним платном. Пазити да не дође до унакрсне контаминације приликом прихрањивања, заливања, прегледања и сваког другог поступка с биљкама. Од кључне важности је да у стакленицима и коморама за гајење не буде никаквих инсеката јер они могу пренети бактерију с узорка на узорак. 7.8. Појаву симптома редовно проверавати после седам дана од инокулације.Пребројати биљке које показују симптоме. C.m. subsp. sepedonicus изазива увенуће листова патлиџана које може почети као увелост ивица или између нерава листова. Увенуло ткиво у почетку изгледа тамнозелено или прошарано, али касније постаје бледо па некротично. Увела површина између лисних нерава често изгледа масно, као да је натопљена водом. Некротично ткиво често има светложуту ивицу.Биљке не угину увек; што је период пре него што се симптоми почну развијати дужи, већа је могућност преживљавања. Биљке могу прерасти заразу. Младе биљке патлиџана много су осетљивије на присуство ниског нивоа популација C.m. subsp. sepedonicus него старије биљке; због тога се користе биљке у или непосредно пре фазе три права листа. Увенуће може бити изазвано и популацијом других бактерија или гљивица које су присутне у екстракту ткива кртола. То су: Ралстониа соланацеарум,Ерњиниа царотовора субсп. царотовора и Ерњиниа царотовора субсп. атросептица,Ерњиниа цхрyсантхеми, Пхома еxигуа вар. фовеата, као и популације великог броја сапрофитних бактерија. Нарочито Ерњиниа цхрyсантхеми може изазвати симптоме на листовима и увенуће које је врло слично симптомима C.m. subsp. sepedonicus.Једину разлику представља појава тамњења-црњења стабљика у случају инфекција бактеријом Ерњиниа цхрyсантхеми. Друге врсте увенућа се разликују од оних које проузрокује C.m. subsp. sepedonicus зато што цели листови или целе биљке врло брзо вену. C.m. subsp. sepedonicus се од Ерњиниа спп може брзо и лако раздвојити и извођењем бојења и/или реакције по Грам-у. 7.9. Одмах по уочавању присуства симптома на биљкама патлиџана, потребно је извршити ре изолацију, користећи делове увенулог ткива лишћа или ткива стабљике. Листове и стабљике биљака патлиџана површински дезинфиковати брисањем са 70%-тним етанолом. Ткиво измацерирати и применити IF или PCR тест на соку патлиџана и изолацију патогена на погодну (селективну) хранљиву подлогу (тачка8. овог поглавља). Такође се може применити и бојење/реакција по Грам-у(Поглавље ХИ овог прилога). Извршити идентификацију чисте културе C.m. subsp. sepedonicus и проверу патогености (тачке 9. и 10. овог поглавља). 7.10. У одређеним околностима, нарочито у условима неповољним за раст и развој биљака, могуће је да се, чак и после периода инкубације од четири недељеC.m. subsp. sepedonicus налази латентно у биљкама патлиџана. Ако ни после четири недеље од инокулације не дође до појаве симптома на биљкама треба извести IF/PCR тест на збирном узорку састављеном од делова стабљике (1 цм од сваке биљке за тестирање, узет изнад места инокулације). Ако је тест позитиван,поновно извршити изолацију патогена на одговарајућу (селективну) хранљиву подлогу, према поступку из тачке 8. овог прилога. Извршити идентификацију чисте културе C. m. subsp. sepedonicus и проверу патогености (тачке 9.и 10. овог поглавља). Тумачење резултата биолошког теста – валидни резултати биолошког теста се добијају ако биљке у позитивној контроли показују типичне симптоме, ако се из тих биљака може поново издвојити бактерија и ако на биљкама негативне контроле не дође до појаве симптома. Биолошки тест је негативан ако тестиране биљке нису заражене C.m. subsp. sepedonicus, а под условом да је утврђено присуство C.m. subsp. sepedonicus у позитивним контролама. Биолошки тест је позитиван ако су тестиране биљке заражене C.m. subsp. sepedonicus. 8. Изолација C.m. subsp. sepedonicus Напомена: Дијагноза се може потврдити само ако се C.m. subsp. sepedonicusизолује, а затим изврши и идентификација добијеног изолата (тачка 9. овог поглавља),и ако се потом потврди и патогеност добијеног изолата (тачка 10. овог поглавља). Иако је C.m. subsp. sepedonicus захтеван организам, може се изоловати из ткива са карактеристичним симптомима. Приликом изолације лако може доћи до прерастања колоније овог патогена са колонијама брзо растућих сапрофитних бактерија па је зато изолација директно из екстракта ткива кртола или стабљике тешка. Директна изолација C.m. subsp. sepedonicus могућа је коришћењем одговарајуће селективне хранљиве подлоге и разређења ресуспендованог талога добијеног из издвојеног конуса пупчаног дела кртоле или из стабљика кромпира. Изолације је потребно извршити из свих кртола или делова стабљике кромпира са симптомима као и из тестираних биљака патлиџана код којих нису примећени симптоми или је IF/PCR тест из збирног узорка био позитиван (тачка 7.подтачка 7.10.). По потреби, треба користити и мацерирање стабљика патлиџана,према прописаној процедури. Позитивна контрола: припремити децимална разређења суспензије 106 цфу поml C.m. subsp. sepedonicus (нпр. NCPPB 4053 или ПД 406). Позитивне контроле припремити потпуно одвојено од узорака који се тестирају, да би се избегла могућност контаминирања узорака. Пре употребе за рутинско тестирање узорака, проверити погодност сваке серије селективне хранљиве подлоге за раст и развој патогена. Контролни материјал подвргнути истим принципима тестирања као и узорак или узорке. 8.1. Гајење на селективној хранљивој подлози 8.1.1. Из одвојене количине од 100 µl ресуспендованог талога добијеног из кртоле кромпира или биљног сока биљака патлиџана припремити децимална разређења у пелет пуферу (пуфер за растварање талога из тачке 3. овог поглавља). 8.1.2. Изолација из ресуспендованог талога, без претходног разређивања обично не успева због тешког гајења C.m. subsp. sepedonicus и велике конкурентске способности сапрофита. С обзиром да је у зараженом ткиву биљке бактерија обично присутна у популацијама високог нивоа, сапрофити се могу одстранити разређивањем, док патоген остаје. Стога се препоручује наношење 100 µl из сваког узорка (код употребе Петријевих шоља пречника 90 mm, док за Петријеве шоље других величина треба прилагодити количину), 1/100 до 1/10 000 разређене суспензије на храњиву подлогу MTNA или на NCP-88 (Поглавље VII овог прилога),техником размаза. Напомена: Алтернативна могућност је размаз почетне количине од 100 µlресуспендованог талога на прву подлогу, а затим прављење размаза истим штапићем на другој и трећој подлози, при чему се на њих наносе остаци екстракта с претходне подлоге. На овај начин се добија ефекат сличан ефекту коришћења разређења. 8.1.3. Засејану подлогу инкубирати у мраку на 21 до 23 ºC. 8.1.4. Прва провера подлога и процена појаве и развоја колонија налик C.m. subsp. sepedonicus, у поређењу са подлогама позитивне контроле, се врши после 3 дана, а наредне процене после 5, 7, и евентуално 10 дана. 8.2. Пречишћавање сумњивих колонија Напомена: Колоније сличне C.m. subsp. sepedonicus треба даље пренети на храњиву подлогу YГМ ако ће се користити за инокулацију патлиџана и/или даљу идентификацију; то треба учинити пре него на подлогама дође до прерастања колонија, односно најбоље после три до пет дана. 8.2.1. Размазом нанети колоније сличне C.m. subsp. sepedonicus на једну од следећих хранљивих подлога: хранљиви агар с додатком декстрозе(користи се само за пресејавање изолата), агар са додатком квасца, пептона и глукозе,агар са додатком екстракта квасца и минералних соли. Састав хранљивих подлога наведен је у Поглављу VII овог прилога. Засејану подлогу инкубирати на 21 ºC до 24 ºC у трајању до 10дана. C.m. subsp. sepedonicus споро расте, обично ствара кремасте,куполасте колоније са шиљатим врхом. Фотографије типичних колонија C.m. subsp. sepedonicus се могу видети на wеб страници http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). 8.2.2. Пречишћавање изолата се постиже поновним размазима и исцрпљивањем на одговарајућим хранљивим подлогама. Ниво пораста се повећава пресејавањем.Типичне колоније су кремасто-беле или боје слоноваче, понекад жуте, заокружене,глатке, повишене, конвексно-куполасте, слузаво-течне, с целим ивицама и обично1 до 3 mm у пречнику. Једноставно бојење по Грам-у (Поглавље ХИ овог прилога)може помоћи при избору колонија за даље тестирање. 8.2.3. Извршити идентификацију изабраних колонија (тачка 9. овог поглавља)и проверити патогеност изолата (тачка 10. овог поглавља). 9. Идентификација Идентификација чисте културе добијених изолата C.m. subsp. sepedonicusврши се коришћењем најмање два од наведених тестова који се заснивају на различитим биолошким принципима. Према потреби, укључити познате референтне изолате за сваки тест. 9.1. Одгајивачки и ензимски тестови за идентификацију Фенотипска својства универзално присутна или одсутна код бактерије C.m. subsp. sepedonicus утврдити према методама Lelliott и Stead (1987), Клемент и сар. (1990), Schaad и сар. (2001), непознати аутор (1987) и сл. Све хранљиве подлоге инкубирати на 21 ºC и прегледати након шест дана. Ако не дође до раста колонија, инкубирати до 20 дана. У све тестове треба укључити познату контролу C.m. subsp. sepedonicus. Одгајивачке и физиолошке тестове изводити коришћењем културе са храњивог агара. Морфолошка упоређења извршити у односу на културе на храњивом агару са додатком декстрозе. http://forum.europa.eu.int/ Тестови Очекивани резултати Тест оксидације/ферментације (О/Ф) инертан или слабо оксидативан Активност оксидазе – Раст на 37 ºC – Активност уреазе – Хидролиза ескулина + Хидролиза скроба – или слаба Толерантност на 7% раствора NaCl – Стварање индола – Активност каталазе + Стварање H2C – Коришћење цитрата – Растварање желатина – Стварање киселине из глицерола – Стварање киселине из лактозе – или слаба Стварање киселине из рамнозе – Стварање киселине из салицина – Бојење по Граму (Поглавље XI) + 9.2. IF тест а) припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у IF пуферу(Поглавље V овог прилога); б) припремити двострука разређења раствора погодног антисерума; в) применити IF поступак (тачка 4. овог поглавља); г) IF тест је позитиван ако је IF титар културе једнак титру позитивне контроле. 9.3. PCR тест а) припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml у Ултра чистој води; б) загрејати 100 µl суспензије ћелија бактерије у затвореним епруветама у термоблоку или у врелом воденом купатилу четири минута на 100 ºC.Разлагање ћелија се, по потреби, може убрзати додавањем свеже припремљеног NaOHдо коначне концентрације од 0,05М. До употребе узорци се могу чувати на -16 до-24 ºC; в) употребити одговарајуће PCR процедуре за умножавање специфичних фрагмената C.m. subsp. sepedonicus (нпр. Пастрик, 2000; видети ПоглављеVIII овог прилога; Ли и де Боер, 1995; Миллс и сар., 1997; Пастрик и Раинеу,1999; Сцхаад и сар., 1999); г) Идентификација C.m. subsp. sepedonicus је позитивна ако су PCRпродукти исте величине и имају исти полиморфизам дужине рестрикционих фрагмената као и позитивни контролни изолат. 9.4. FISH тест а) припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml Ултра чисте воде; б) применити FISH поступак (тачка 5. овог поглавља); в) FISH тест је позитиван ако су постигнуте реакције културе и позитивне контроле једнаке. 9.5. Профилирање масних киселина (ФАП) а) Културу гајити на триптиказа-соја-агару (Оџоид) 72 сата на 21 ºC (+/- 1 ºC); б) применити одговарајући ФАП поступак (Јансе, 1991; Стеад, 1992); в) ФАП тест је позитиван ако је профил тестиране културе идентичан профилу позитивне контроле. Присуство карактеристичних масних киселина: 15:1Антеисо А, 15:0 Исо, 15:0 Антеисо, 16:0 Исо, 16:0 и 17:0 Антеисо, у великој мери указује да се ради о C.m. subsp. sepedonicus. Родови бактерија као Цуртобацтериум, Артхробацтер и Мицроцоццус такође имају неке од ових киселина,али 15:1 Антеисо А је киселина која се ретко може пронаћи у овим бактеријама,али се појављује у свим бактеријама рода Цлавибацтер и то између 1 до 5%. Код C.m. subsp. sepedonicus вредност је обично око 5%. 9.6. БОX-PCR а) припремити суспензију од приближно 106 ћелија по ml Ултра чисте воде; б) применити тест у складу с процедуром (Смитх и сар., 2001). 10. Тест потврде Тест провере патогености се користи за коначно потврђивање присуства C.m. subsp. sepedonicus и за процену вирулентности култура идентификованих као C.m. subsp. sepedonicus. 10.1. Припремити инокулум од приближно 106 ћелија по ml из култура изолата који се тестира, старости три дана и одговарајућег изолата позитивне контроле C.m. subsp. sepedonicus. 10.2. Инокулисати стабљике 5 до 10 mlадих сејанаца плавог патлиџана у фази 3 прва листа (тачка 7. подтачка 7.3. или 7.4. овог поглавља). 10.3. Инокулисане сејанце инкубирати на 18 до 24 ºC уз довољну количину светла и високу релативну влажност и адекватно заливати како би се избегло накупљање воде или стрес од суше (тачка 7. подтачка 7.7. овог поглавља).Код инокулације чистим културама, типично увенуће се појављује у року од две недеље, док се биљке које не испољавају симптоме (видети тачка 7. подтачка 7.8.овог поглавља) после тог времена инкубирају још недељу дана на температурама повољним за раст плавог патлиџана, али не вишим од 25 ºC (Поглавље Х овог прилога). Ако симптоми нису присутни ни после три недеље, добијена култура се не може потврдити као патогени изолат C.m. subsp. sepedonicus. 10.4. Изолацију из биљака са симптомима извршити одстрањивањем дела стабљике дужине 2 цм изнад места инокулације који се потом уситни и раствори у малој количини стерилне дестиловане воде или 50 mM фосфатном пуферу (Поглавље Vовог прилога). Изолација патогена се потом врши размазом добијеног мацерата наMTNA и YПГА подлоге (Поглавље VII овог прилога), инкубирањем три до пет дана на21 до 23 ºC и утврђивањем да ли су формиране типичне колоније бактерије C.m. subsp. sepedonicus. Поглавље IIИ ЛАБОРАТОРИЈЕ УКЉУЧЕНЕ У ОПТИМИЗАЦИЈУ И ВАЛИДАЦИЈУ ПРОТОКОЛА Лабораторија (1) Место Држава Агентур фüр Гесундхеит унд Ернäхрунгссицхерхеит Беч и Линз Аустрија Департемент Геwасбесцхерминг Мерелбеке Белгија Плантедиректоратет Лунгбy Данска Централ Сциенце Лабораторy Yорк Енглеска Сцоттисх Агрицултурал Сциенце Агенцy Единбургх Шкотска Лаборатоире Натионал де ла Протецтион дес Вéгéтауx, Унитé де Бацтéриологие Ангерс Француска Лаборатоире Натионал де ла Протецтион дес Вéгéтауx, Статион де Qуарантаине де ла Поmmе де Терре Ле Рхеу Француска Биологисцхе Бундесансталт Клеинмацхноњ Немачка Пфланзенсцхутзамт Ханновер Ханновер Немачка Плантензиектенкундиге Диенст Wагенинген Холандија Норwегиан Цроп Ресеарцх Институте, Плант Протецтион Центре Аас Норвешка Дирецç]о-Герал де Протецç]о дас Цултурас Лисбон Португалија Национални институт за биологијо Љубљана Словенија Центро де Диагностицо де Алдеаррубиа Саламанца Шпанија *1 За контакт са научницима: видети wеб страницу: хттп://форум.еуропа.еу.инт/Публиц/ирц/санцо/Хоме/маин Поглавље IV ПРИПРЕМА ПОЗИТИВНИХ И НЕГАТИВНИХ КОНТРОЛА ЗА ОСНОВНЕ ТЕСТОВЕ ПРОВЕРЕ PCR/IF И FISH ТЕСТОВИ Направити суспензију културе вирулентног изолата C.m. subsp. sepedonicus(NCPPB 4053 или ПД 406) гајеног 72 сата на MTNA основној хранљивој подлози у 10 mM фосфатном пуферу концентрације приближно 1–2 x 108 цфу/ml. То је обично слабо мутна суспензија оптичке густине 0,20 на 600 нм. Извадити конус пупчаног дела из 200 кртола беле сорте кромпира за које је познато да нису заражене бактеријом C.m. subsp. sepedonicus. Обрадити конусе уобичајеном методом и ресуспендовати талог у 10 ml. Припремити десет стерилних микроепрувета од 1,5 ml са 900 µlресуспендованог талога. У прву микроепрувету додати 100 µl суспензије C.m. subsp. sepedonicusи измешати на вортексу. У следећих пет микроепрувета припремити децимална разређења бактеријске суспензије. Ових шест микроепрувета са зараженим екстрактом користити за позитивну, а четири микроепрувете са незараженим екстрактом користити за негативну контролу.У складу с тим, означити микроепрувете. У микроепруветама од 1,5 ml припремити аликвоте од 100 µl тако да се добије девет копија сваког контролног узорка. До употребе чувати на -16 до -24ºC. Присуство и количину присутне C.m. subsp. sepedonicus у контролним узорцима прво потврдити IF тестом. За PCR тест, извршити екстракцију ДНК у позитивним и негативним контролним узорцима за сваку серију узорака за тестирање. http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main За IF и FISH тестове, извршити тестирање позитивних и негативних контролних узорака за сваку серију узорака за тестирање. Код IF, FISH и PCR тестова,потребно је утврдити присуство C.m. subsp. sepedonicus у концентрацији од најмање 103 и 104 ћелија/ml код позитивних контрола и ни у једној негативној контроли. Поглавље V Пуфери за тест процедуре Стерилисани пуфери који нису отварани могу се чувати до једне године. 1. Пуфери за екстракцију 1.1. Екстракциони пуфер (50 mM фосфатни пуфер, pH 7,0) Овај пуфер се користи за екстракцију бактерије из биљног ткива хомогенизацијом или трешењем. На2ХPO4 (анхидровани) 4,26 г КХ2PO4 2,72 г Дестилована вода 1,00 Л Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121ºC 15 минута. Следећи састојци могу бити корисни: Намена Количина (по Л) Пахуљице Луброл Дефлокулант* 0,5 г ДЦ силикон против стварања пене Средство против 1,0 ml стварања пене * Тетранатријум пирофосфат Антиоксидант 1,0 г Поливинилпиролидон-40000 (ПВП-40) Везивање PCR инхибитора 50 г * За употребу код методе екстракције хомогенизацијом 1.2. Пелет пуфер (Пуфер за растварање талога-10 mM фосфатни пуфер, pH 7,2) Овај пуфер се користи за ресуспендовање и разређивање екстракта конуса извађених из пупчаних делова кртола кромпира, после концентровања талога центрифугирањем. На2ХПО x 12Х2О 2,7 г НаХ2PO4 x 2Х2О 0,4 г Дестилована вода 1,00 Л Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121ºC 15 минута. 2. Пуфери за IF тест 2.1. IF пуфер (10 mM фосфатни пуфер с додатком соли (ПБС), pH 7,2) Овај пуфер се користи за разређивање антитела. На2ХPO4 x 12Х2О 2,7 г НаХ2PO4 x 2Х2О 0,4 г NaCl 8,0 г Дестилована вода 1.0 Л Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121ºC 15 минута. 2.2. IF пуфер – Тwеен Овај пуфер се користи за испирање IF плочица. IF пуферу додати 0,1% Tween 20. 2.3. Фосфатни пуфер с глицеролом pH 7,6 Овај пуфер се користи као раствор за прекривање бунарчића у IF тесту како би се појачала флуоресценција. На2ХPO4 x 12Х2О 3,2 г НаХ2PO4 x 2Х2О 0,15 г Глицерол 50 ml Дестилована вода 100 ml Комерцијални раствори нпр. Вецтасхиелд® (Вецтор Лабораториес) или Цитифлуор® (Леица). Поглавље VI ОДРЕЂИВАЊЕ НИВОА КОНТАМИНАЦИЈЕ У IF И FISH ТЕСТОВИМА 1. Избројати просечан број типичних флуоресцентних ћелија по видном пољу(c) 2. Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по бунарчићу микроскопске плочице (C) C = c x S/s где је С = површина бунарчића IF плочице са више бунарчића и s = површина поља објектива. s = pi2/4G2K2 где је i = коефицијент поља (варира од 8 до 24 зависно од типа окулара) K = коефицијент тубе (цеви) (1 или 1,25) Г = повећање објектива (100x, 40x итд.). Израчунати број типичних флуоресцентних ћелија по ml ресуспендованог талога (Н) N = C x 1000/u x F где је u = запремина ресуспендованог талога у сваком бунарчићу, и F = фактор разређења ресуспендованог талога. Поглавље VII ХРАНЉИВЕ ПОДЛОГЕ ЗА ИЗОЛАЦИЈУ И ГАЈЕЊЕ C. M. SUBSP. SEPEDONICUS 1. Опште хранљиве подлоге 1.1. Хранљиви агар (НА) Хранљиви агар (Difco) 23,0 г Дестилована вода 1,0 L Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 ºC 15 минута. 1.2. Хранљиви агар са декстрозом (НДА) Difco бацто хранљиви агар који садржи 1% Д(+) глукозе (монохидрата). Стерилисати у аутоклаву на 115 ºC 20 минута 1.3. Агар са квасцем, пептоном и глукозом(YПГА) Екстракт квасца (Difco) 5,0 г Бацто пептон (Difco) 5,0 г Д(+) глукоза (монохидрат) 10,0 г Агар Бацто (Difco) 15,0 г Дестилисана вода 1,0 Л Растворити састојке и стерилисати у аутоклаву на 121 ºC 15 минута. 1.4. Агар са екстрактом квасца и минералним солима (YГМ) Бацто екстракт квасца (Difco) 2,0 г Д(+) глукоза (монохидрат) 2,5 г К2ХPO4 0,25 г КХ2PO4 0,25 г MgSO4.7H2O 0,1 g МнСО4.Х2О 0,015 г NaCl 0,05 г FeSO4.7Х2О 0,005 г Bacto agar (Difco) 18 г Дестилована вода 1,0 Л Растворити састојке и стерилисати 0,5 литара хранљиве подлоге у аутоклаву на 121 ºC 15 минута. 2. Селективне хранљиве подлоге које су прошле валидацију 2.1. MTNA хранљива подлога Осим ако није другачије наведено, сви састојци су из БДХ. Екстракт квасца (Difco) 2,0 г Манитол 2,5 г К2ХPO4 0,25 г КХ2PO4 0,25 г NaCl 0,05 г МgСО4.7Х2О 0,1 г МнСО4.Х2О 0,015 г FeSO4.7Х2О 0,005 г Агар (Оxоид но. 1) 16,0 г Дестилована вода 1,0 Л Растворити састојке, подесити pH на 7,2. Након стерилизације у аутоклаву на 121 ºC у трајању од 15 минута и хлађења на 50 ºC, додати антибиотике: триметоприм 0,06 г, налидиксилну киселину 0,002 г, амфотерицин Б0,01 g киселина (Сигма) (оба 5 мг/ml), у 96% метанолу, амфотерицин Б (Сигма) (1мг/ml) у диметил сулфоксиду. Шток раствори се стерилишу филтрацијом. Концентровани раствори антибиотика: триметоприм (Сигма) и налидиксилна киселина (Сигма) (оба 5 мг/ml), у 96%-тном метанолу, амфотерицин Б(Сигма) (1мг/ml) у диметилсулфоксиду. Напомена: Рок трајања основне хранљиве подлоге је три месеца. Након што се додају антибиотици, рок трајања је месец дана, и то уколико се припремљена подлога чува у фрижидеру. 2.2. NCP-88 Хранљиви (Difco) 23 г Екстракт квасца (Difco) 2 г Д-манитол 5 г К2ХPO4 2 г КХ2PO4 0,5 г МgСО4.7Х2О 0,25 г Дестилована вода 1,0 Л Растворите састојке, подесите pH на 7,2. Након стерилизације у аутоклаву(на 121 ºC 15 минута) и хлађења на 50 ºC, додајте следеће антибиотике:Полимиксин Б сулфат (Сигма) 0,003 г, налидиксилна киселина (Сигма) 0,008 г,циклохексимид (Сигма) 0,2 г. Шток растворе антибиотика направити на следећи начин: растворити налидиксилну киселину у 0,01 М NaOH циклохексимид у 50% етанолу, полимиксин Б сулфат у дестилованој води. Основни раствори су стерилисани филтрирањем. Напомена: Рок трајања основне храњиве подлоге је три месеца. Након што се додају антибиотици, рок трајања је месец дана, и то када се чува у фрижидеру. Поглавље VIII ПОТВРЂЕНИ И ОДОБРЕНИ ПРОТОКОЛИ И РЕАГЕНСИ ЗА PCR Напомена: Прелиминарна тестирања треба да омогуће поновљиву детекцију од најмање10³ до 104 ћелија C.m. subsp. sepedonicus по ml екстракта узорка. Током прелиминарних тестирања не сме доћи до појаве лажно позитивних резултата код одабраних бактеријских изолата. 1. Протокол за мултиплекс PCR са унутрашњомPCR контролом (Пастрик, 2000) 1.1. Олигонуклеотидни прајмери Узводни прајмер ПСА-1 5´- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3´ Низводни прајмер ПСА-Р 5´- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3´ Узводни прајмер НС-7-Ф 5´- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc-3´ Низводни прајмер НС-8-Р 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ Очекивана дужина умноженог производа из ДНК C.m. subsp. sepedonicus= 502 бп (пар прајмера ПСА). Очекивана дужина умноженог производа из 18С рРНА унутрашње контроле = 377бп (пар прајмера НС). 1.2. PCR реакциони микс Реагенс Количина Коначна по реакцији концентрација Стерилна Ултра чиста вода 15,725 µl 10x PCR пуфер1 (15mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5mM MgCl2) БСА (фракција В) (10%) 0,25 µl 0,1% Смеса д-НТП (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Прајмер ПСА-1 (10 µМ) 0,5 µl 0,2 µМ Прајмер ПСА-Р (10 µМ) 0,5 µl 0,2 µМ Прајмер НС-7-Ф (10 µМ)2 0,1 µl 0,04 µМ Прајмер НС-8-Р (10 µМ)2 0,1 µl 0,04 µМ Таљ полимераза (5 У/µl)1 0,2 µl 1,0 У Запремина узорка 5,0 µl Укупна запремина 25,0 µl (1) валидација методе је извршена уз коришћење Таљ полимеразе Перкин Елмер (AmpliTaw или Gold) и Гибцо БРЛ. (2) оптимизација концентрације прајмера НС-7Ф и НС-8-Р је извршена за екстракцију из пупчаног конуса кромпира методом хомогенизације и пречишћавања ДНК према Пастрик (2000) (Поглавље II тачка 6. подтачка 6.1. и 6.2). Уколико се користи екстракција трешењем или нека друга метода изолације ДНК, потребно је извршити поновну оптимизацију концентрације реагенаса. 1.3. Услови PCR реакције Извести следећи програм: а) 1 циклус: 3 минута на 95 ºC (денатурација ланца ДНК); б) 10 циклуса: 1 минут на 95 ºC (денатурација ланца ДНК); в) 1 минут на 64 ºC (везивање прајмера); г) 1 минут на 72 ºC (хибридизација); д) 25 циклуса: 30 секунди на 95 ºC (денатурација ланца ДНК); ђ) 30 секунди на 62 ºC (денатурација ланца ДНК); е) 1 минут на 72 ºC (продужавање копије); ж) циклус: 5 минута на 72 ºC (коначно продужавање); з) држати на 4 ºC. Напомена: Оптимални услови коришћења овог програма су дефинисани за коришћење наPCR МЈ Ресеарцх ПТЦ 200 thermal cucler. Модификација трајања корака циклуса је вероватно потребна у случају употребе других модела thermal cucler-а. 1.4. Анализа продукта умножавања рестрикционим ензимом PCR производи умножени из ДНК C.m. subsp. sepedonicus испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом Bgl II после инкубације на 37 ºC 30 минута. Рестрикциони фрагменти добијени из специфичног фрагмента C.m. subsp. sepedonicus су величине 282 бп и 220бп. 2. Припрема боје за електрофорезу 2.1. Бромфенол плаво (10%-тни концентровани раствор) Бромфенол плаво 5 г Дестилована вода (бидестилована) 50 ml 2.2. Пуфер за бојење Глицерол (86%) 3,5 ml Бромфенол плаво (5.1) 300 µl Дестилована вода (бидестилована) 6,2 ml 3. 10х Трис ацетатни и ЕДТА пуфер (ТАЕ), pH 8,0 Трис пуфер 48 г Глацијална сирћетна киселина 11,42 ml ЕДТА (динатријумова со) 3,72 г Дестилована вода 1,00 Л Разредите 1x пре употребе. (нпр. Инвитроген или замена) Поглавље IX ПОТВРЂЕНИ И ОДОБРЕНИ РЕАГЕНСИ ЗА FISH ТЕСТ 1. Олиго-пробе Специфична проба за C.m. subsp. sepedonicus CMS-CY3-01: 5´- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3´ Неспецифична еубактеријска проба EUB-338-FITC: 5´- gct gcc tcc cgt agg agt -3´ 2. Раствор за фиксирање Раствор за фиксирање садржи параформалдехид који је токсичан. Носити рукавице и не удисати га. Препоручује се рад у дигестору. а) загрејати 9 ml воде за употребу у процедурама молекуларне биологије(нпр. Ултра чисте воде) на око 60 ºC и додати 0,4 g параформалдехида.Параформалдехид се раствара после додавања пет капи 1Н NaOH и мешања на магнетној мешалици; б) подесити pH на 7,0 додајући 1 ml 0,1М фосфатног пуфера (ПБ; pH 7,0) и5 капи 1Н HCl. Вредност pH проверити И помоћу индикатор трака и ако је потребно подесите pH помоћу HCl или NaOH. У растворима са параформалдехидом не потребљавати пх метар; в) профилтрирати раствор кроз мембрански филтер од 0,22 µm и до даље употребе чувати на 4 ºC и заштитити од прашине. Напомена: Алтернативни раствор за фиксирање: 96%-тни етанол. 3. 3x Хyбмиx NaCl 2,7 М Трис-HCl 60mM (pH 7,4) ЕДТА (филтер стерилисани у аутоклавима) 15 mM Разредите до 1х према потреби 4. Раствор за хибридизацију 1x Хyбмиx Натријум додецил сулфат (СДС) 0,01% Проба ЕУБ 338 5 нг/µl Проба CMSCY301 5 нг/µl Припремити количине раствора за хибридизацију према прорачунима у Табели1. Предложене количине за припремање смесе за хибридизацију (у даљем тексту:Табела 1). За сваку плочицу (са 2 различита узорка у дупликату) треба 90 µl раствора за хибридизацију. Табела 1. 2 плочице 8 плочица Стерилна ултра чиста вода 50,1 200,4 3x хyбмиx 30,0 120,0 1% СДС 0,9 3,6 Проба ЕУБ 338 (100 нг/µl) 4,5 18,0 Проба CMSCY301 (100 нг/µl) 4,5 18,0 Укупна запремина (µl) 90,0 360,0 Напомена: Све растворе који садрже олиго-пробе осетљиве на светлост чувати у мраку на –20 ºC. Током употребе заштитити их од директне сунчеве светлости или електричног светла. 5. 0,1М фосфатни пуфер, pH 7,0 Na2ХPO4 8,52 г КХ2PO4 5,44 г Дестилована вода Растворити састојке, проверити pH и стерилисати у аутоклаву на 121ºC 15 минута. Поглавље X ГАЈЕЊЕ ПЛАВОГ ПАТЛИЏАНА Посејати семе плавог патлиџана (Соланум мелонгена) у пастеризовани компост за семе. Пресадити сејанце са потпуно развијеним котиледонима (10 до 14дана) у пастеризован компост у саксијама. Плави патлиџани би требало да се гаји у стакленику под следећим условима: 1) дужина дана: 14 сати или природна дужина дана, ако је дужа од 14 сати; 2) температура: дан: 21 до 24 ºC, ноћ: 15 ºC. Осетљиве сорте плавог патлиџана: „Black Beauty”, „Long Tom”, „Rima,„Balsas” (wеб страница http //forum.europa.eu.int/Public /irc/sanco/Home/main). Поглавље XI ПОСТУПАК БОЈЕЊА ПО ГРАМ-У (ХУЦКЕРОВА МОДIFИКАЦИЈА) (DOETSCH, 1981) а) Раствор кристал виолета Растворите 2 g кристал виолета у 20 ml 95%-тног етанола. Растворите 0,8 g амонијум-оксалата у 80 ml дестиловане воде. Помешати два раствора. б) Луголов раствор Јод 1 g Калијум-јодид 2 g Дестилована вода 300 ml Уситнити састојке користећи тучак и аван. Додати састојке води и промешати да се растворе у затвореној посуди. в) Раствор шафранина за контраст Основни раствор: Шафранин О 2,5 g 95%-тни етанол 100 ml Промешати и чувати. Разредити: 1:10 за добијање радног раствора. Поступак бојења: 1. Припремити размазе, осушити на ваздуху и фиксирати их загревањем. 2. Плочицу прелити раствором кристал виолета и држати један минут. 3. Кратко испрати текућом водом. 4. Прелити Луголовим раствором један минут. 5. Испрати текућом водом и просушити филтер-папиром. 6. Боју уклонити 95%-тним етанолом, који се додаје кап по кап или се размаз урони на 30 секунди и лагано протресе. 7. Испрати текућом водом и просушити филтер-папиром. 8. Прелити раствором шафранина 10 секунди. 9. Испрати текућом водом и осушити филтер-папиром. Грам позитивне бактерије се боје љубичасто-плаво; грам негативне бактерије се боје ружичасто-црвено.