Resolución Nº 869/90/ITINTEC - Sustituye el título y texto de la Norma Técnica Nacional Revisada Nº 202.083 - Leche en polvo

93013 Sustltuyen el titulo y texto de la Norma T6cnlca Nactonal Revlsada 202.083 Leche en Polvo ~ON lJIBI:ClQBAL No." 8OITil'i'1'JIiO-DG LIma. 03 de Dl.c1eJ:D,bre de 1990 OONSIDER.ANDO: Que, por Resoluc!6n Dlrectoral No. O'l2-l'r ITI~DGdel ~ de mnero de 198'7, Ie apro· beS como Nonna TtJon1ca NadOll&1 Bev1Iora e1 Proyecto de Norma 212.083 :I..iI!XmE EN POL· roo Ensayos microbio16gioos. lMtodoa de arb1· traje. Que e1 ComiW.Espec1allzac10 de Leche y Pro· d.uctos Ucteos del IDstituto de Invest1gad.6D Teao.o1dI1ca InduStrial ., de Normas T6cDJca8 (lTINTEQ), ha procecUdo a revlaar 1& c1tada Nor· ma T6c.n.tca Nac10nal ell sea16n reaJ1Iada e1 dfa aD de· Marzo de 1989 secl1n CODSta en e1 acta corresponcUente, " despU6e de uevarae a cabo durante 30 dfas 1& dJscus16D pUblica del Proyecto IIII.tea refertdo lin haber rec1b1do ob8ervac1olJes de acuerdo a1 aviso pubUcado en e1 Dlarto Oft c1al "m. P!:RUANO" e1 eua 03 de Marzo de 1990, ba propuesto a 1& D1reccJDn de NormaU· ac16n y .A8efrU1'am1ento de la 0aUd8d. dellTIN· TEO e1 Proyecto de Norma Tlk:n1ea Nac10nal Re· vtsada, que deblri suatttulr a la aprobeda por Reso1uclOn Directoral 1(0. 0'12-87:-lTINTEO 00. Que, en op1n16n de 1a d1l'ecci6n de Norma· lJsID16n y A.IesOramiento de 1& Ca1i4ad d1ebe Utuitle e1 titulo 'l teIltto de 1& citada Norma por el propuesto por el comiW Especlaliudo, conaervando e1 mtsmo c6dJ&0. :DJ. armonla con 10 diapuesto par el~ 8 del Articulo 59 del Decreto :t.eg1a]atlvo 1N0. 171, OQl1C01'daDte con el fDcIIIo 6 del Articulo ~ del Dtatuto de11TINTJDO, aprobado par BeIIOluc.tm 8upnma No. ~-mJIND del 015 de No· t1embre de 1981...ITJ;NTJ!XJ • el Orpn1smo N· bUco comp;tet1te para. e1aIlorar '1 aprobar laS Normas T6cD1cas Nacionales apl1cab1es a t.od~ 10lI aector.. Dtando a 1a recomendac16n efectuacla par ]a DIrecc16n de NonneUzac1<:Sn '1~am1ento de .. oaudiad, • 10 e.oorda4o per e1 OODIe,to Dl· recttfo del ITINTEO en IU 8la "aaa IIeI1one!s ceIe'lnd8a e1 18 ., 24i de octubre de 1&'73, sal c:omo • 10 cUspuesto por loa artfculoa 18 3 zr de Ja Be8Oluc16n Suprema No. 0II0-81-ilTI/IND del 015 de NOViembre de 1981. S1i: R1!SV.lloLVll:: AI1fAlu1o l~ austttutr e1~o '1 tGto de la Norma 'N1D1ca Nac1oDa1 ReNada ••Q83 1JDCBE ~ l'OLVO. D1IAJoB~. MItodoa de arbitraJe; por 01 Utulo:~ Y PlWDUCTOSLA~.~ mJcrob1016l1· COl, ., e1 teJ.to propuesto por ~ Comit6 msp,. ctaU Z1!do, el JDJsmo quo apareoe en e1 AD8I.O I y forrna. parte integrante de la presente Reso 1Uc16n, aprob4ndose la I'JliItna • part1r de 180 fecba, como Norma 'Ncn1ca iNac10nal Rev1sacIa con el mtsmo oOc:Ugo. Pag. Articulo 2~- Dejar sin efecto la Resolu.c16n Directoral No. O'72-8'7-ITINTEO-DG del 23 de Dlero de 1987, en cuanto a esta. Norma TOO· mea Nac1onal, ReviSada sa reIiere. Reg1strese y. comuniquese. GUILLERMO SALAS OO~OHClB, D1reotor General - ITINTEO. ANEX 0 1 MIlk aDd milk produds. :M!croblo1oglca1 &D&I1QI J)escr1ptoreS: Leche y productos I8cteos A,oiI1s1s microblo16l1co 1. NOBIIAS A OONS'DLTAB rrINTl!lO 3)2.000 LECHE Y DERIVADQS LADI'J!X)S. Ili2xtraoci<Sn de muestras. Genera11d84es 202.031 MANTEQUILLA. ElttracctcSn de mues~ tras. 202.045 QUESOS. iI!l:I:traccl6n de muestras. 202.085 LECBE Y D!lR.lVADOS LAarEClG. DeffDic1o.nes y c1aSlficacl6n. 202.095 LECHE EN POLVO. Extraoci6n, de muestras. 202.000 GRASAS DE LEXlHE. Extraeei6n de muestras. 202.097 LECH1!l ES'l1!mJLlZADA Y LEOHE CONOEN'SADA. EEtracci6n de mues· tras. 202.098 LEOHE CRUDA Y LEOHE PAST.I!RJR1· ZAI>A. !I!llttracclOn. de muestras. 3)4.037 BARINA DIiJ PESdux>. Detecc16n e Salmonella. 217.028 AZUCAR. l'4&Xlos de ensayos micro· bio16g1co en el aZI1car refUledo. 201U81 GELATINAS. Detecci6n de Salmone· lla y StaphylOCOCCUS aureus. 2. OBJETO Y CAMJ"O DE APLICACI01f 2.1 La presente nonna establece loa mIto· dos de ensayo microblol6g!cos que se apUcaD a 1& lache Y los productos l4cteo&. 2.2 Los ensayos Be apllcan a los diferentes productos en 180 forma que se indica a continua cion: ~ iNo. 1 . Numerac16n de microorganismos aeroblOl mes6filos. No. 2 Numerac16D de coliformes. :UWtodo NVP 3.2 Metodo d,e recuento en placa. No.3 Numeraci6D de Escherichia coli. No.4 Investlpc16n de Salmonella. No.5 Numerac16n de St. aureus coagulasa (+) No.6 Prueba de esteril1dad No.7 Numeraci6n de hoDgoS (mohos). No.8 Nw.neracl6n de levaduras. No.9 iNumerac:l.6n de levaduras osm60Jas. PROLOGO A. :R.l!SE,R'iA, HISTOBIOA La presente Norma Tecnica N~ rue elaborade. por el Comitll Espec1a11Zado de LE· CH;E Y PR,ODUOTOS LACI'l!lOa en reuniones llevadas a cabo durante los mesea: de El1ero, Febrero, Marzo, Abrll ., MayO de 1&ll8. S:U cD· digo corresponde &l de 180~ w,L083 LEO.E:iB EN POLVO. mnsayOS microbl016g1cos. M6todO de arbitraje, pero al ser deblQamente camp~ da reemplaza ~ los slgulentes NTN 202.019; <£{ Peruana IJma, Sibado 5 de EDero de 1991 4Imi~&mglDtt3iD PA .,· c g 202.020: 202.021: 202.022, 202.023: 202.03'7: 202. 038, 202.039: 202.041; 202.048; 202.049; 202.050; 202.063: 202.080; 202.081: 20.2.082: 202.088: 202.089, En su etapa de Dlscusi6n PUblica reclb16 ob· servaclones las cuales fuel'Ql1 tratadas por el ComiU ESpeclalizado en reunlones Uevadas a ee bo en los meses de agosto, setiembre y' octu tubre de 1988. Posterlormente. volvi6 a reeibfr observac1One!l 'en su segu;nda eta!Pa de Dlscusioo Pdbllca las que fueron tratadas en reuniones llevadas a cabo en los meses de Noviembre de 1988 Y MarrD de 1989. B. INSTITUOI()Nm QUE PARTIOIPARON EN LA ELABORAOION DE LA PRESEN· TE NORMA TEON'IOA NAOIONAL. ..... Ooordlnadora, Mercedes Candiottl Feij60. OIA:. PlERt7ANA DE ALlMENTOS (PERU· LAO, VirginIa Reyna. OOMlTE NAOIONAL DE :Mill:I)IOAMEN· '1'06, ALIMENTOS Y DROGAS (OONAMAD), Edith Rojas. , GLORIA SA., Rodolfo Malpartida - Juan 'Urias • ..... IN'I'lERNATIONAL ANALYTIOAL SER VICES a.A. (INASSA), Martha Angulo. INS1T1'UTO NACIONAL DE DESARROLLO AGR.OtDUSTlUAL(INDDA), Rosa Rosas. INSTlTOTO NAC. DE NU'I'lUOION, Estbe1' B. de Tovar. rrINTEO/Oficna de Instatacfones y Apoyo TOOnfco, Lufs: Huayna. PAS'l'Et1RIZADORA MARANGA. I UNn.E. CHE, 'oarmen Rosa Lozada. ..... SOOIEDAD GANADERA DEL CENTRO, Virginia Castillo. ..... UNIV. NAC. MAYOR DE SA;N' MAlWOS. Facultad, Parmacia y Bloqufmica, Tom.4s 01 cese. No. 10 Numeracl6n de bacterias lipoUtlcas. No. 11 Numerae16n de Bacillus cereus. APLICACION DEL IlI!\8AYO DE ACUEBDO AI. PBODU01'O Proaucto -l!lDsayo 8 rea.'lIzar en eI produo&oNt Leche cruda - 1, 2. Leche pasteurlzada. - I, 2, 3. Leche esterUizadB: t1HT-6 Apertlzada - 8. Lec'he en palvo - 1, 2, 4, 5. Leche modiflcada - No hay NTN. I..er-.he compuesta - I, 2, 3. Derlvados termentados: Yogurt - 2, 7, 8. Keflr - No hay N'nN'• ..... Ottos fennentados - No hay NTN. Quesos: MBdurados - 2, 3, 4, 5, 8. No madurados - 2, 3, ., 5, 7, 8. ..... Fundidos - 2, 3, 4, 8, 7, 8. Derlvados grasos ......, Cremas: Pasteurizada - I, 2, a. Esterlzada: UHT - 6. Aportlzada - 6. MantequWa - 1, 2, 8, 10. Grasa - 1, 10. ..... Acelte - I, 10. Derlvados azucarados: r: Lache condensada - I, 2, 5, 9. ManJarblanco - I, 2, 7, 9. Natwaa - 1, 2, 7, 9 .. P08tres: F1anes .... No hay NTN. .... Pudinea - No hay NTN. "Mousse" - No bar NTN. Helados - 1, 2, 4, 5. NOTA: Oualquier tipo de producto l6cteo esterlllzado debe ser sumetldo 0 1& prueba de esterllldad segl1n eI caso (URl' 0 apertfsl,da). 3. JrmDIOS DE om:mvo Y UAUl'lVOS NOTA: Inclu,e tamblen los med101 de eal t tlvo alterDativos (ver Ap6nd1oe) EaIa10 wcroorpnlsmos aerobl08 mes6fUos MedIoII c1e Illa1th'o .... A«a1' Plate COUnt, Oolitormes y D. coU• MedlOI c1e ealtI90 caIdo laotosado--verde br11lante bills al 2% (1) , Caldo lAurll suJlato triPtoIIa (2) Agar JIlosfna uu1 de metl1eDo BMB (l) Agoar Jl:D&) '(2) Agar-violeta roJo bills (VBBA) (3) OB.1o peptonado, 0 trtptonado BeactlTo de Indo! ..... C'&ldo MR-VP ..... So1ucl6n roJo de metUo SoIucf6n de nafto1 Bo1uclcSn de bkSr6Jddo de potaalo .Agar cltrato :.Al'ar vio1eta 1010 bWa (VRBA.) para reo .cuento en pJaca B8saJo St. aureua. HecIIoe c1e ClaBIYo Oaldo CHoUtti Carltoni Apr Bafrd Parker .... Oaldo fDfuSfdn de oerebro COJ'8II6n Agar blaDOo 81 2o~ 0 1'8lI'fina est6rfl ..... P1as'ma coaguJaIa mTA BaIa70 HoDgoI HecIIott Ie~ .... Agar OJ:IIotraclcJlDa glucose; (OGA) BaM)'O I.evaduru MdGit f!e bUlth'o AgAr paps, dextrosa <PDJJ) BDIa10 I[JpoUtlCOl!l M~.lO"f ~ ~o g,:.;ctt Blue IA~ 0 Agar trIbUili'lna E'asayo se.tmoneJJa Pr&-enrfqueclmlenfo :MecUoe tie thO Agua fosfatad'aCBufferada 0 tamponada)' Verde brUlante a1 0.1% 0 verde de mall quIta aI O,ot~ C&lc!o laiotosado (1') 0 Oaldo trlptIcase; soya (OASOY) (2) Ellsayo EnrIqueclmlento selectlvo Medlos de Cl1IItivo Caldo tetmtfonado wl'de brWante (I)' Caldo ~ppaport m ..... oaIdo selenlto cISt1na (3) £Mayo .Aislam1ento selectlvo HeI1Ios Ie ClII1fIvo Agar wl'de brflIante rojo de tenol modi flcado (l) 93014 t£{ Peruano Lima, Sibado 5 de Enero de 1991 cmwtmmWi5 Agar blsmuto sultito (1) Agar 5a1monella-Sh1gella (~) Para la numerac16n de 1evacfuras osm6flJaS el medio OGA debe tener un 40% de &lUCiO sa; (I, 2, 3,) se ref1ere al orden de prio1'ldB4 en que deben usarse los pOSibles medios al· temattvoI. IDayo Pruebas bioqufm1cas M'edIos de caHIYo .Agar DUtritiVO inelJn8do .... 1'81 (epr triPle de $Z'I1ear '!J hierro1 .... lAM (agar eon bierro , liS.ina) SDlI Jagar suUlto indoI motiUt'y)' Calc10 Urea""0Pruebas serol6g1caa JIedfos de C1IltIYo euero fls!ol6gico .... AntiSUero 0 (poivalente) EDIaJo Prueba de esterUldad Medlos de caIttvO Agar Pla.te COunt CaldO cerebrd co'rari6n m4s 0.1% de aJmid6n soluble Caldo eerebro coraz6n m4s 0,05% de clorhi· dn!.to de elsterna m4s 0,1% de almldOn soluble 1' mfU'!i6n eerebro (,()razOn maL'! 0,05% de clor'hidrato de cisterna mAs 0,1% de alm~d6n soluble (1) Atl'!' !"',~ ~.&.le!'Obt('lll se~ B~er (2) Agar .,pll'~t·lvll para &naefOblos (3) 4. APAT:l..ATOO 4.1 H~moge.'*'.M()l'apropkl.do. 4.2 BrJ.1"!'M an4utl"a PnSfbll1dad 0,1 g. ".31 J3.'a.f!.1) de- s~a. tennoregulable. 4,4. Autoclave. 4. IS Hilmo de est.erU1zaci6n. 4..6 J!:';tufl!,s de 1nl1\1Mcl6n f.errnoreguJable •. 'I Contador de colonJas. 01.8 Mechero BUJlI!eni. 5. MATER.'IALES &.1 TodoS los materi4tles .. lItlUzarse 80ft 108 com'Omnente empleados en baCf,eriologfa lY d.eben ser estdrUes 'I ma.nil'uIados con 1& debida a.sepsla. &.1.1 PJacas de Petri de vidr10 de 100 mm :It 15 1Dm. Is.! Jl Ptpetas baeterlolCSglO6l graduadas al cW cbnO de 1 11I1.; II ml 'I 10 mI. 5.l.3'1'lD>8 de cultivo de vidr10 de 100 mm x 13 mm: 1110 mm :I 16 mm '!J 200 mm x 18 ~. 8.1.4 AAS y eeuJllf de tnoculacl6n IS.1.1S Matraoes Erlenmeyer de 250 mI Y 2000 ml D.1.6 lD5p4tulas apropiada,s para eztens16n. 8.1.'7 OUcharas aproptadas. 5.1.8 campanu de rermentae16n. &.1.9 PortaobJetoe de vtdrio. 6. PBEPAlUOION Y DILtTOION DE 1JAI l'tiUJ!S1'RA 8.1. Se comJena el examen tan pronto co mo se~ de la mU8Stra. 81 no se pudlera efectuar en la prlmera hOra despuls del mues tree, Be ref11gera & ()lP C - ~ C. SI. 1M mues traI 0llt4n conge1adaB, se desoongelan en su en vase orfglnal (0 en el reclplente donde fueron P8~. envtedas 81 laboratorio) en rerriPdacl6n & 1'10 S90 por un mAximo de 18 h. '!J se com.ie~ e1 awWsis una va coasegWda la descongelaDJ6D completa 0 cuando el proceso estc! Y& tea avanzado que pennita tomar las BUbmuestraIJ a4ecIlad88. 8.2 Sa pella. el vasa y se introc!ucen en 61 10 I mu/menos 0,1 g 0 m1 representattvol ae la muestra del aUmento. lUI. Be at\Bdeun vol$1en de ~t, fgUaI a 9 woes la muestra COO ml) , Asf Ie ob tiel'''' la rtl11V'16n 100 (pote.ncla 3 negativa~• 6.4 Sa aglta el homogenlzado (dil 10 poten cia 1 negativa) ) '!J se pipetea. una poref6n de de 1 mI en 'l1n tubo con 9 m1 de d1Iu~te, ob teni~ose la dUue16n 10 (pOtenc~a 2 negativa) 8.5 Be mezcla el Uquldo culdad.osammte 88 pirando 10 veoes con una pipeta eetm11. 6.8 Be transfiere con Ia mlsma ptpeta 1 mI & otro tubo cont<:mendo 9 ml de etIuYeD.te , se mezcla con UM nueva pipeta estlJriI, Be ob ttene la dUuel6n 10 (potenela 3 negatlva). 6.7 Be repiten los pasos 6.5 '!J 8.8 batIta co~ el numero de diIucione.s c:le8eadM. 8.8 CoDSe1'V81 8.8.1 Leche eondensada Los envases cerrados se colocan en un 1:Jafl.o de agua a ~ 0 ~ por 10 min.-15 mJn. Lue~o con las precaucaclones de aseps1a &de ouada8 ee abren los envases Y Be procede tal como se Indica desde eI p4rrafo 8 2. NOl'A.- La preparaci6n '1 dilucJ6n de fa muestra se oomplementa con Ia Tabla J. 8.8.:1 Leche estetIUzada - Pre 1ncuIIiaoIdD 6.8.2.1 tJBT sa taman .,en~. como mfnJmo, que lid presenten 8lteradones. Be Bmplan, con un iUgod6n con alcohol, loll enVlSel. Los envasea se eometen a una temperatura de 329 O. por 10 d. Si durante este tiempo se observa alterac10nes (p6rdf.da del pro dUcto, coagu1aci6p u otra), estos enVllS. deben sepe.rarse para d.etenninar los de reotol. 6.8.2.1 Jl~ Pe fonts una mue!ltra minima de 10 latas, que no presenten aboJIaduras 0 detertor08 en los oJ.erres. Be lawn 'las latas con IOluci6n jabonosa, enjuagindolas con e.bundante agua Y tie 8eC8II con una toalla. Be colOO9n laS latas sabre hojQ8 de papel de fUtro perfecfamente Ifmpl88. . T.~ "..tt"'(f t'lo '1'.'1 l<>tRR se someten a una tn. CUba.ci6n por 10 d a 5S!C para deteetar mIcro Organf:lmos term6fi1os y la otra mitad a 3290 por 21 d para la deteeel6n de mieroorgantsmos me66fDos. Durante la Pl'Wlba de pr&-1ncub8c16n, Be examina tv agttan las lataa oada 2 d. Y se 88 paran aquelIas que muestren hinchamiento 0 pSrdfda de material. Estas latas Separadea de ~ ser examlD8l1as para detenntnar los defee. too en 1a hermetle1dad ~l eierre. 93015 LIma, Sibado l) de Enero de 1991 e:Peruano TABLA. 1 DILtrf'ENTES 'f MBTODCS DE l1BEPARACION DB MUBS"l'B&S DB I.oEOJIES Y PRODUcros LAC1l'EOS Tamafiode ]a mueeL1'8 fMb,es, pro4uctOS 1 m1610 JfqU1d08 de 1ache ml 9 m1 6 90 m1 \ie ana pepto. nada es~ri1 a1 O,1D'" se adtal IAebe en po1vo, suero de 1acheen po1vo, suero de mantequUla en P01vo, laotosa Queso 10 g 10 g 90 ml de e;gua ~toDad& es tmil al 0,1% 90 mI. cle citrato de 8Od10 a12% 90 mI. ~ soIucl6D, de Cltrato de sodfo 111 2'10 Se aclt6 a CfI~ ClOD per1aIJ de vldrio esMrl1es para' tacmtar la bomogenlzacl6n Be·agtfa a 46~O c!OD perlM de 'rid11o eet6rlIes para facU1. tar Ia hom~ Be 11eda a 4190 cutda'Ddo que eI V880 de 180 Ucua40ra estA eetASm to It 90 mI. de agua peptonada esUrD a1 0,1% con 1M de EllnulSionante (et·:~ 80) Flan, natillaS, postres, 1eche conclensada, crema heIados 10 g 90 ~ de agua peptonada esthU a1 0,1lift Se agita a 4&:0 90 mI de solueiOn BUffer Posfato pH 7,0 BsUril10 g Leches fennenta d8S Yogurt--------------------------'!;..---'""l • 1a preparacl6n cle las muestras es neeesario limit&' 1a veJoe1dac! '1 tiemPo de tuneionam1ento de los aparato$ electrico.s en coDtacto con 180 mueet1'a problema, d8bic!o' &. que una «ICe. aJ\'a exposIcl6n a la velocidad pOdrla. produci r lesf.operI b80terlaDa8 plr efecto m8CIl1Dlco 0 ~"8do calor 10 que ooducilia; a reeuentos baJOS. "II; P!EtOCl!lDIM1ENTO Todas las determ1naclones Be deben nacer por duplicado sobre 18, misma muestra preps· racIa, utilizt dose acrem4s un blanco. Los reo ultados sa expresan por g 0 fn1 fe muestra. de pendiendo de 1a naturaleza del producto. 'Z.1 Numeraelon de mlcroorganismos .aere Ido8 mesMUo8 7.1.1 Se transfiere 1 ml. de la primera diluci6n (10 potencia 1 negatdva) en placas de Petri es~ril, sa deja fluir el contenido y se procede en 1a misma forma con cads una. de las sIgu1entes diluciones. 7.1.2 Be vierte inmediatamente el Agar Plate Count tundido y enfriado a 4590 en las p1ae'al! ~ Petri ., Ie m«.cla. por m.ed:1o de mo vimlentos de valv~n seguido de movlm.1entos clrcuIares . 7.1.3 Be deja soUdificar el med.io de eultivo, Be invierten las placas y se ineuOOn a una tem· peratura de 32\'0 a 8590 basta 48 h. 'l.1.. 'l'I'anBcurrldo este tiempo, se selecoio· nan las placas correspf>ndientes que contengan entre 30 '1 300 colonias, ut!l1zando un contador de colonias. No confUneIr las colonias en punta. de alfiler con pequefias partfeulas de polvo no diSUeltos. 'fJ1.1 ~ eDOODtr'ar eJ. recuento por lid de muestr'a lie multipUca el total de coloDfal 'POl" plaea, par 1a 1"8CIprooa de 1a cmu.ct6.D uti· l1zada.' • S1 todas latJPIacas diBOD menos de 8IlJ ca& se infonna el nmnero de 00lonfas en 1a pIae&. Bi no hay co1onias se expresa como Menor de 10. '1.2 NIIDIfII'8eI6D de eoIfrOI'lllfJ8 7.2.1 Mt!todo del n'dmero m4s probatile (N'MP) '7.2.1.1 Ensayo presuntivo a) Be usa to ml del media ca1do~ verde br1llante bUls :It% con una conoentradli5n de 40 gIl contenic!o en tuboe de eDSayo provIs. to. de campanas t!e tennentaal6n. b) Se pipetea 1 ml de eRda cU1Uc16n (10 potenc1a .t, 10 palencia .2, 10 DOtenc1a -I) en tuboI' que conttenea el me4Io de CQItiTo, atm· lando tres tubos por cada dllucl6n. Ere 1II.c\d)a a 3600 - ~ dUrante ,. h., 48 h. e) "-das 181 M h lie anotiln los tubos que mUMtNn procIucOi6n de fU., tie "oem a 18 &lltufa 108 tubos CR' nl!'glll.~. Pae!ldqs 1M 48 h Be &Dotan 108tubas que m'l.1.4!Stren p1'Od11COf6n de guo d) Be escogen los tubos positlvos para e1 pag. 93016 Lima, sabado 5 de Ellero de 1991 'E{ Peruano en5ayo de confirmac16n, para tal fin Se selec clona la d1luc16n mas elevada en la que los tres tubos son positivos para. producci6n de gas y la,s slgulentes dos dilueiones JXtas altas., Por ejempl0. si las tres 'llltlmas positivas fueron: Por ejemplo, si las tres ultimas diluciones positivas fueron; 1:10; 1:100; 1:1000 y los numeros de tubos posi tives en cada diluci6n 3, 2, 1 respectivamen te, los resultados se reportaran como 1:10 = 3; 1:100 = 2 Y 1:1000 = 1. E1 NMP "" 150 wer Tabla 2). '1.2.1.2 DlSayo de coDt1rDl8c1on se mezela bien el contenido de los tuOOs post llvos y se extienda, con una asa de Kolle, una asada. de cada tubo en la superflcie de placa.s conteniendo agar eosina azul de metUeno (EMB) 0 agar ENtDO 0 agar violets. rojo bi lls (VRBA) y se Incuba a. 35 ·0 - 37 ~c du rante ~ h Q 48 h. U.1.3 Leetura a) Se efectUa la lectura segUn el agar em pleado; en agar EMB las colonras de cohtor mes presentan coor negro 0 con centro negro o la formacl6n de colon1as mucosas rosado naran,ja. En agar ENDO son colonias rojas roo deada:s de halo rojo. En 8.iar VRBA son colo was rojo oscuro COIl un cllametro mayor de 5 mm. b) Be anota el numero de tubos connrma dos de cada diluci6n, como baetenes colifor mea positivo. c) se detenn1na para cada una de las tres diluciones selecciQnad.a.S, el nl1mero de tubos que dieron un resultado conf1rma.torio de co .:formes. Referirae lila Tabla 2 del NMP y ano tar el NMF! baalindoae en loa niveles de dilu· ci6n de la muestra. y el numero de tubas po sitivos confirmados de cada diluc16n seleccio nada. Por ejemplo, 8i en el modelo dado en el punto 7.2.1.1 d), todos loa tubos positivos en w.s tres diluciones seleccionadas (1:10; 1:100 y 1'1000) conducen a. resultados confirmatoriOlS positivos para bacteriaa coliformes. aiendo los valores para cada diluci6n 3, 2 Y 1 respectiva,· mente; para. obtener el NMP de bacterlas co· llformes por gramo de muestra, se va. a. la Ta bla 2 Y results. ser 150. '1.2.U N~i6n de Escherichia coU a) Se aiSla, par IIepara<lO, una asada. de cacla tuOO gas positivo del ensa.yo presunti· vo de coliformes (7.2.1.1 d), sobre una. placa de agar EMB, 0 agsr ENDO 0 agar VRBA. c) Be ineuban las plaCas invertldas por 24 h. a. 44 ·C m4sjmenos 0,1 ·C. el Be selecciona una colonia t1pica de ca· da plaCa para. Uevar So ca:bo la Proeoc. del IMVIC, con la t1nal1dad de confirmar 1a pre· almCla de Escherichia coli. PAg. d) 1"J.'r'~eba IMVIO. d.1) Prueba, de Iadol (KOVACS, 19%8) Sa inoculan tubos con caldo peptonadO 0 triptOllado a: partir de eulUvos puros, Be Jncu ban los tubos a 35 ·C - 37 ·C por 24: h. Be adiciona. 0,2 mI. - 0,3 ml, sie reactivo de Indol a cada tuba y se agita: Se deJan los tubos en reposo par 10 min Y Be observa los resultados. Un color rojo oscu ro en la superflcie constituya una. prueba. po 1l1tiva. Un eo1or naranJa Indica la. presencia probable de escatol y puede ser reportado co mQ una reacc16n positiva. d.2).Prueba c1e1 Bojo de .Hetlla (LJ'l1TOV.l961) Be inoculan tuOOs con Daldo MR-VP a par tir de cultivos puros. se jneuban los tubas &35 ·C-37·Cpor 5el.. Be pipetea por aeparado, 1 ml, de cads cul tivo a un tubo de prueba. V9oCI~ y se a.d1cl0n3. I) iOtas de soluci6n Rojo de Mettio. Se agita. Se anota como Rojo de MetH:> positivo la aparici6n de un color rojo, como negativo, la a.parici6n de un color amarillo. . d.3\ Prueba de Voges·Proskaaer (LJUrOV, 1963; LEVINE, 1916), t5e inocula So partir de cultivos purOB, tubos cop Caldo MR-VP )- se tncuban a 35-37.0 por "8 h. Se plpetea, por separado, 1 mI. de cada. cut tivo a un tuba de ptueba vaefo, se ad1clona 0,6 mi. de soluci6n de Dattol y 0,2 ml, de soluc16n d~ 1'.idr6x1do de potasio. se agitan los tUbas, sa deja;n en reposo por 2 h. - 4 h. Y Be observan 1'>8 resultados. Be anota el desarrollo de un color rosado e. car mesl como pruebe. positiva. d.4) Prueba de Citrato de Sodio {KOSEK. 1923; SIMMONS, :L9Z6) Be inoculan los tuOOs de Agsr Oitrato con c61ulaa de cultivo puro. A fin de sembra,r un 1n6c.:ula pequefi,o, Be usa una aguJa recta.. La transferencia de nu trientes con el inOculo podria invaUdar Ie. prue· ba. Se incuban los tUbos a 37 ·0 ...,; 3'1 0C por 48 b. Be anota como positivo un crec1m1entQ viSi· ble acompa;ftado de un cambio de color dQ4 me dio del verde al azul. • Con los resultados obtenid06 en 180 prueba. IMVIC se consulta la Tabla 3 Y luego la Tabla. 2 para obtener el NMP de m. coho 7.2.2 M6todo de reouento en placa. '1.2.2.1 Be coloca 1 mi. de cada, cWuclon en placa:s de Petri ester1les. 93017 t£{ Peru-ana Lima, Sabado 5 de Enero de 1991 7.2.2.2 Be ai'1ade a cada placa, conteniendo el in6culo, 10 ml, - 15 mI. de agar violeta ro jo bills (VRBA) a una. temperatura de 44,5 oQ + D,S. 7.2.2.3 Se mezc1a e1 contentdo de la placa, con movimiento de bala:nceo y de rotacicn. Se deja que solidifique la mezela (5 min. a 10 min) sobre W16 superficie niveIada. A continuaci6n, se afiade otros 3 ml, a. 4 mt. del medio f~dido, de tal modo que se forms una ~apa. que cubra 18 superflcie del medIo solidificado, evttaado sst 1a formaci6n de colonlas superflcia.1~s.. 7.2.2.4 Se invierten y S9 Incuban las placas durante 24 h a 35 "0-37 00. 7.2.2.5 Se consfderan como bactel'ias colt fonnes solamente las colomas rojo oscuro que miden D,S mm. 0 mas de diimetro y q'.le se encuentren presentes en placas que eonten gan entre 20 'J 200 colonias. Sf as posible, se selecclona para e1 reeuento solamente aquellas placas con no m4s de 150 de estes colonias. 6e multiplies. el n'limero de colonlas por 1a dilu cim correspondfente para. obtener e1 numero de bacterias coliformes por gramo 0 ml, de muestra. 7.3 Deteccf6n de Sa.lmonel... 7.3.1 Para el caso de lech'} en polvo sa muestrean 60 unidades de 25 go. cada una y se mezclan. A partir de esta mezela se toman 16 unldades de 100 g, ca.da. una, pam el anali· sis. Luego por cada muestra de 100 g. que sa analiza, sa adiciona 900 mI. de agua fosfatada bufferada es~rit. Be adlciona.20 ml. de solu ci6n de verde brillante al 0,1% como fnhibidor, s6lo en el caso de muestras muy contamfna: daB. 7.~.2 Para el caso de quesos, heIados U otro, se toms. 25 g. del producto para 225 mI. de caldo de pre-eIlrlquecl:miento (lactosado 0 CASOY). 7.3.3 Se incuba a 35~7 'C por 18 h. a 24h. 7.3.4 Se lleva 1 mI. del cultivo anterior a 10 mI. de caldo 1letmtionado verde brillante (0 (aldo Rappanor 0 caldo selenito cistina) 0 Qien 10 mI. del cu1tivo a. 100 mI. de uno de los caldos de enriquecimiento selectivo para el caso de la lache en polvo. Be incuba a. 43 ~ + 0,1 \'0 por 24 b. 7.3.5 A partir de lOB cu1tiws 1IJCubados sa reaUzan aislamlentos en pllllCas con agar verde brillante rojo de fenol modiffcado y agar biS muto sulfito. Be incuba a 35 °C-37 00 duran te 24 h. en caso del agar verde brillante rojo de fenol mod1ffcado y 48 h. en caso &l1 agar bismuto sUlfito. 7.3.6 AI cabo de este tiempo, sa examfnan las placas. Las colonfas sospechosas de Salmo· nella en agar verde brillante rojo de fenol son incoloras, de un color fntermedio entre el rosa y el fucsia 0 entre transll1cidas y opacas y el PAg. medic que las rodea varia. entre el rosaceo a rojo. En eO! agar bismuto sulfito son pardas, grises "i negras; Y presentan a veces un brtllo metalico. En medio que las room es, por 10 general, oscuro al principio, volvtendose mas tarde negro a medida que aumenta el perlodo de incubaci6n. 7.3.7 Las colonias sospechosas de Salmo nella (ver Nota) se someten a las siguientes pruebas de diferenciaci6n rbtoqutmfca) en tu· bas conteniendo los respectivos medios. •• NOTA Be puede someter a confirmacf6n cualquier colonia sospechosa pues el reconocl miento de Salmonella- es en gran parte un pro Dlema de experiencia, ya que la apariencfa de las colonias puede vanar en algo no 8610 de es pecie sino tambien en funci6n del media 'aWl· zado, * Se recomienda semsrar en tubas de agar nutritivo e inclinado e Incubar It 35 oC-37 00 por 24 h. si es que se va a Continuar con 1a prueba de ccnfirrnaci6n serol6gica. 7.3.7.1 TSI (agar triple de azliC3.r y blerro) a) Se inocula en agar TSr. Be incuba a. 35 °C-37 °C por 24 h. b) Los cultivos sospechosos de Salmonella presentan reaccion alcalina en el agar inclinado del medio (color rojo, lactosa y saearosa nega tivos) y reaccion acida en la columna de agar (color amarillo, fermentaci6n de gtucosa) con 0 sin producci6n de H2S (ennegrectmlento del media). 7.3.7.2 Hidrol1sfs de ]a Urea. a) Se siembra en 'Corma a:bunclante en el caldo urea. b) Be incuba a. 35 QC,........a7 00 por 24 fl. c) La reacci6n positive. se manifiesta por el vi~aje del indicador a rosado fntenso. . 7.3.7.3 Agar de hierro y Uslna (LIA) a) Se sie~bra, en estrfa., en 1a: superficie inclinada del agaJ,' y por picadura en el fondo. b) Be ineuba a 35 0C - 37 0C por U h. c) Un color pUrpura con produccf6n de 8H2 y Ii vecas de gas, fndican una reacci6n po' sitiva. Un color amarillo indica. una: reacc16n negativa.. 7.3.7."1 Agar 81M «SU1flto·Indal·HoWity) a) Be siembra, par pfcadura profunda, en agar sm. b) Be incuba a 35 ·C-37 !O por 24 h. c) La. reaccl6D positiva de Be,lmonella sa maniffesta por preSencia de turbfder; homog6· nea (movilidad), formacf6n del sulturo de hi dr6geno (color negro). AI agregar el Teactivo de KOVACS no sa forma el anfIlo raJa en 18 superficfe (indol negatlvo). 93018 Lima, S8.bado 5 de Enero de 1991 'E,{ Peruano 7.3.8 8i las pruebas bioqufmicas Indican presencia de 8e.lmonella se precede a connr marlas mediante las pruebas sero16~cas. 7.3.8.1 Sa ensaya, primero el antisuero con culttvos testlgos a tin de comprobar 6U dica· cia. 7.3.8.2 En una: 13.m.ina. porta-objetos se co Ioea una. gota de suero fisiol6gico esteril y a es te se le adtctona, con una. aguja. de inocula.ci6n, una porci6n de Is oopa. pura que sa ha aislado del agar nutritivo, luego se le adiciona una gota d.e suero polivalente ("0). Si se observa la reacctdn de aglutanaci6n as salmonella post tiva. 7.3.8.3 Se considerara como una pruc!J!l ne gativa si no se produce aglutinaci6n. ~t"s cultivos deberan probarse tambien con antrsue ro polivalente H <flagelar). 7.3.9 Cuando sea necesarto, sa lleva. a cabo la tipificaci6n en instituciones especiaJizadas en este tipo de analisis. El nombre de esta instituci6n debe ser Ineluido en el informe del ensayo. 7.3.10 Para. efectos de Interpretar resulta dos soore Detecci6n de Salmonella ~ ttenen es cuenta las consideraciones siguientes: 7.3.10.1 61 no se detecta 8e.lmonella des pues del atslamlento en piace, a partir de los medios de emiquecimiento se in:Grro.a. "Ausen cia en x g" 0 "No se detect6 S~"J.Qnella. en x K del material exa.minado", 7.3.10.2 Si se detecta 8almonella del\pue& del a.isIamiento en place. en ambos medias de enriquecimienta se in!orma "Se detecto saimo nella en x g del material examlnado", Si 5610 se d.etecta en uno de los m.edios es convenlen te contmuar con el procedimiento. 7.3.10.:J En caso de que se h3ya. reaJizado la tipifica.ci6n serol6giea se informs. "lA Bal· monella identifica.da pertenece 8 los siguiente.s tipo.s: '204 Numeracioo de estafiiococos coagulasa pe;tsitivos (NMP). Metodo del numero mas probable. 7.4.1 Be toms Con tma. pipets., por tripll· ca.do, 1 mL de cada una de las diluciones (10·1, 10·2 Y 10-3) preparados como se indica en el capItulo 6 segUn e1 caso, y se transfieren a tu· bos conteniendo 19 mI. de caldo de enriqueei miento para estafilococos, segUn Giolitti ~i canton!, '1.4~ Los tuj)os con el caldo mencloDado <iSl 7.4.1. deben ser previamente regener8ldo8 a lO()oC durante 2.0 min. y enlriados a tem,Jc. ratura ambiente. A excepciOn del caso en que e1 medIo de cultiyo haya side preparado e1 mi6. mo dJa de! ensayo. '1.4.3 Be adiciona agar blanco al 2% 0 pa rafina esteril hasta una altura de 2 em. a 3 em., para dar condiciones de ann.erobiO&ls en los tubos. Para el mismo fin sa puede util1zar una jarra de annerobiosls. 7.4.4. Los tubas se Incuban a 3590 - 37·C., durante 24 h. a. 48 h. 7.4.5 Con una pipeta Pasteur es~ri1 se transfiere un in6culo de los tubas que muestren ennegrecimiento. del medio a placas de Agar Baird Parker, previamente secas. Se extiende el culttvo hasta sequedad de lao superfieie del agar empleando Is. esp4tula de Digralsky. 7.4.6 Se mcuOOn las placas en posicion in· vertidas 35'!C. - 37~C., durante 30 h. a 48 h. 7.1:7 Pasadas las 30 h. de lncubacion, las cololI~;n d:picas (nunea menor de 5) se some ten a la pruebs. de la coagul88a. son cotomes negras, br.Ilaatas, conozas y rodeadas por zoo nas elaraa que contrastan con el medio opaco. 'M.9 Prueba de 180 eeagula.sa (cont1nnaci6n) 7.4.8.1 Be hace subcultfvos a. pertir de las colonias tipicas en caldo in!Us16n de cerebro corazon y se ineuban las 51embras durante 24 h. a 3590. - 37?0. 7.4.8.3 Sa aiiade 0,1 mi. de los sub·cultlvos resuItantes a 0,3 ml, ~. pla$l!la . coaguIasa. Eli ...'A ell tubes pequeiios"'y se Incuban a 35'0. 37°0. 7.4.8.3 A las 4 h. se examinan los . tuOOs para: verificar 51 el medio aparece eoo.gulado, en caso que sea negative, se continlla la mcu baciOn basta. 24 horas. 24 h. La tormaci6n de coagulo bien visible es demostrativo de producci6n de coegulasa. 7.4.8.4 Se anota el resultado en cuanto una reaccion es positiva ya. que el co8gu10 puede dtsolverse mas tarde. 7.4.9 Se determina e1 nlimero mas probable (NMP) de estatilococos coagulasa positivos, anotando el nlimero de tubos oontirmados de cada diluci6n. refer1dos a la Tabla del Nlimero mas Probable (Tabla 2). 7.4.10 Be exi>resa el nlimero m4s probable por gramo 0 mI de muestra. 7.5 Numeracl6n de hoDgos y iewduras . 7.5.1 Se coloca por duplicado en placas de Petri esteriles 1 mI del in6culo de la serie de diluciones, 1uego se adiciona aproximadamente 15 cm3., del media esteril (OOA) mantenido a la temperatura de 45 ~C ± 1 ~C. 7.5.2 Se deja solidifiear y se incuba a 22 ~C 2 ?O de 3 d a 5 d. 7.5.3 Be seleecionan las pla.cas que conten gan de 30 a 100 co10nias y se cuenta separa~ n:.ente colonias de hongos y levaduras. 7.5.4 Se ca.lcula e1 nlimero y se informa c0 mo el nlimero de hongos y levaduras por ml 0 gI'11Illo respectivamente. 93019 T,[ Peru-ana 7.6 Prueba de esterl1ldad 7.6.1 Para produetos UIlT 7.6.1.1 Se siembra 0,1 ml del produc~l pre viamente incubado (6.8.2.1) sobre el agar Pla te Count. 7.6.1.2 Be incuba a 32.c por 48h. 7.6.1.3 Transcurrldo este tiempo y utWzan do un contador de colonlas se procede a la lec tura. '1.6.1.4 Be lnforma el resultado del nmnero de microorganismos mes6fllos, aerobios f fa-. cultatlvos vlables. '1.6.2 Para produetos~ '1.6.2.1 A partir de 6.8.2.2 una vez transeu rridos los tlempos de preincubaci6n, sa desm fectan las tatas con alcohol al 70%, dejando al gunos ml de alcohol sobre la parte que sa va a abrlr (opuesta a las claves de identlflcaci6n). 7.6.2.2 Se flamea r4.pidamente y con un abrl dor previamente esterWzado, se abre la lata basta que por la abertura sa pUeda introduclr la pipeta esterllizada. 7.6.2.3 De cada lata se membra una serle de 3 tubos para aerobios y otra serle de 3 tubes para anaerobios. a) Para la deteccl6n de aerobios, se trans flere con una pipeta esterll 3 ml de leche en cada uno de los tubas de ]a ser:Ie conteniendO 2'1 ml de caldo cerebro coraz6n adicionado de almld6D. b) Para 1& deteccl6n de anaerobios, se traDafiere con una pipeta esteril 3 ml de leche en cada uno de los tubOs de ]a serle conte Diendo 2'1 ml de caldo cerebro coraz6n sdlclo nado de clstefna y de almid6n. Luego se coloca en una jana de anaerobiosts, y sl no se cuenta con ella, se adlciona a cada tuOO una capa de :I m1a 3 ml de paraflna est6r1L 7.6.2.4 Be incuban las serles de tubas lnd1 cados en '1.6:U a y '1;6.2.3 b por 72 h a ]a mls ma temperatura de pre-incubacl6D de cada la ta. '1.6.2.5 Para ]a comprobaCi6n del desarrollo bacterlano se procede de la sIgu1ente manera: a) AerobJos Be inocula 1 ml de cada uno de los cultl vos indicados en 7.6.2.3. a en IgUaI n1lme ro de placas Petri esteriles y lie adlclona de 15 ml a 20 ml del medio Plate Count Agar, f1incUdo y temperado alrededor de 45 .c. Be mezela por medlo de movlmlento de vaivcm, seguldo de movlmlentos c1rcUlares; se deJa solidiflcar y se recubre con aproxl madamente 5 ml del medio esWrll; Be deja soUdWcar y se Incuban las pJacaa en po slc16n invertlda a las mismas temperatu Pag. ras de pre.incubaci6n basta por '12 h y se procede a la lectura correspondiente. El producto se constdera que cumple con la prueba de esterllidad comercla1 cuando m4xlmo un tubo de la baterla de los aero b10s presenta desarrollo conflrmado. b) 4DMrobIo8 Be inocula 1 ml de cada uno de los eui tlvos indicados en '1.6.2.3 0 en igUal &11 mero de placas de Petri esteriles' y se les adlciona de 15 ml a 25 ml de agar Bm adicionado de cistelna. y de almid6n fun ifidoy tempIado alrededor de 50'0. Se mezcla por medio de mov:lmlento de vaiven seguidos de mov.1mientos clrn:U:l res; Be dejan solldificar, se colocan en po slci6n invertlda dentro de una jarra de anaerobiosis y se incuban a las tem:,l'!r3 turas de pre-ineubac16n, hasta por '43 b. Luego Be precede a la lactura correspon dlente. El prOducto Be consldera que cumple con ]a prueba de esterllidad comercla1 cuando nlng11n tubo de la baterla de los anaero bios presenta desarroUo. NOTA.-Todos los medios de cult1vo II qull!os. deben ser *ecientemente preparados, esterllizados y ..tern perados entre 2O\'C y" 4O'1C. El procedlmlento ,descrito de '1.6.2.1 a '1.6.2.5 Be de~ realizar en una c4mara 0 ambi,mte est6ril ., paralelamente sa ~be trabaJar con un blanco: 'l.'l NumeraclcSn de UpoJitlcos 7.'1.1 Be usa el medio Sjplrit Agar adlcIo Dado del reactlvo lipasa 0 tambi el agar trl butlrlna adlcionado del reactlvo glicerln trlbu tlrato. 7.7.2 Be trabaja con dlluclones 0 Be toma 10 ml de ]a prlmera dUuci6n y se Ie adlclOna 90 ml del medio fUndldo y atempera<1o a 45 'lO Be homogenlza y luego Be vlerte en 4 CS 5 placa8. 7.7.3 Be lneuba a 30~ durante'll Do 7.7.4 Al cabo de este tlempo, Be IProcede a la lectura de las cqlonlas de germenes con BOo Uvldad UpolItlca. Be escogen aquellas plaCM que presenten entre 20 y 200 colonias. 7.7.4.1 SI se emplea el medio Sjph'it Blue Apr adlcionado del reactlvo lipasa, se cueotan las colonias de color azul rodeadaS de una ZO na de precipitac16n azul claro. '1.7.4.2 81 Be emplea e1 media agar tributt. J'ina, adicionado del reactlvo de gUcerln trlbu tirato, las colorUas Be encuentran rodeadas de un halg transparente. 93020 1£( Peruano Lima, Sibado 5 de Enero de 1991 NORMAS LEGALES S. INFORMB DEL ENSAYO 'l.1 Foil el fnforme del ensa.,o Be debe indl- . CIlZ' el resultado obtenido. Be debe tambhin mencionar eua1quler eoncUc16n de operae1~ DO eapeclficada en esta norma 0 sefta1a4a como opClcma1 as1 comO cualquier cf1'CUDSt&,nc1a que pueda haber fnfluido en el resuttado. 8.2 A .rectos de comparar resultedo.s de en IaJ08 Jlevados a cabo IPOr labOratorios' dUeren tel, en el lDforme se debe tndlcar en forma .. pec1a1: C8ntidad de muestra ensai8da. Temperatura 1 tiempo de pre.Jncubac1&i 1/0 incubacl6n apUcad08. Oantldad de muestra ensayada. 8.3 En el informe se debe fnclulr todOI los detaUea para 18 complete ldent1ficacf6n de 18 taueatra. I. ANTEQ:DBN'I'II' 9.1 APHA. CODlpencUum 01 methodI tor- GI8 microbIological examination of foods. Edlto~ Marvin Speck. 1978. USA. 9.2 HeltJemann, :R; Mar8IIa11, T. aDd SIDltll, P. :R. MicrbblOlog:[ca1 methods for ClOD08Iltrated milk and dJ7 mta. Q.3 lOMBI'. IIlcroorpnfjpnoe de loll AU mentos. Vol. t. 'NcDIcaI de ADQIIII IIIcrobIoo l6gicos. Editorial AcrIbfa.DsIdL 9.4 ISOITO M/80 9 NI02 P 1IIlerobloloafe. DIrectives Generaelspour 18 recherche ~ SUo pbylOCOC!CWl aureu8. 9.5 ISO/TO WSo 9 R ZIP UIcI'obloJolfe. Directives Gene1'ales IIOUI' Ja~ del satmoneDA. 9.6 1'rINTJCO .019; ....; ... .a.I3; 2&037; 2O'J.oa&; •• -.0&1: . .ocs: 2O/J.08O: 8.083: ••.G81:- .... .088; '-.089. 9.'1 :Ratto, Marfa AlfDa: et at. 00Dtr01 MIaIo bloI6BfCO de Leche ., ProcIuct.oI Uct.eos. ..... dos Recomend8doI. 1983.LlDIa-IWd. 'IAI! LAB Nl7MERO MAS PROBABLE (NMP) POR GRAMO DE MUEST.RA Y' 95% DE L1MI'1'I'S DB CONl'l4N'ZA UsaDdo tres mhos con po1'Olones de 0, 1 r. 0, 01 r y 0,001 r; ~ Nlimero de tubos poslUvos NMP NMP Lfmlte 0,1 0,01 0,001 Por g Menor. Mayor a f 0 0 0 (3 0 0 1 3 0,5 8 0 1 0 3 (0,5 13 1 0 0 4 (0,5 20 1 0 1 '1 1 21 1 1 0 '1 1 23 1 1 1 11 3 38 1 2 0 11 3 88 2 0 i 9 1 882 0 14 3 ft 2 1 0 15 II "2 1 1 • " ..2 2 0 11 , "'12 2 1 28 10 1I.50 3 0 0 23 4. 120 8 0 1 39 '1 130 3 0 2 64 15 880 8 1 0 43 '1 210 3 1 1 '15 14 330 S 1 2 120 30 880 S :a 0 93 15 380 S II 1 150 80 (40 3 2 2 210 85 4'10 8 3 0 240 36 1 aoo 3 3 1 480 '11 24.00 8 8 2 1100 150 4800 I )2400 ( - ) = Mayor y Menor INTERPRETACION ESTADISTICA Todas las conslderaclones estadfstlcas es· t4n Involueradas en los limItes de confianza da· dos en esta Tabla. La Interpretac16n estrlcta de estos lImItes, es que sl siempre se aflrma que la densldad verdadera de los microorganlsmos descansa entre estos lImItes, entonces el 95% de tales aflrmaclones sal'll correcto. Reclentemente, un tratamlento estadfstlco PAg. y progratna computarizado ha sldo dlvulgadoi en late cualquler m1mero de m1lltlplos puede ser usado para cuaIquler n11mero de muestras y cU luelonesi ., el prograDia l'llpldamente produclrl promedl6s de NMP y de lImItes de conffanza a cualquler nlvel de slgnlflcact6n. Aunque pro cedimlentos para tales manlpulaclones fueron conocldos antes del Pr0«ram8 en menct6n. late factlltanl el uso de m1Utiplos de~ Impa res y el promedlar dlversos valores de NMP. 93021 Lima, Sabado 5 de Enero de 1991 i£( Peruano TABI.A a INTERPRETACION DE IA PRUEBA DEL IMVlO Eschel'1nchta coll Tipo I (Tiplco) Prueba del Indol + PI'IIeba delrojo de..mo + Prueba de Voges Proskaaer log 10, 3.51 2,5 g 0,4 g 15g ISg 109 6g 4g 0,3 g 8g 0,025 g 20g 15g 109 10 I 10 ~ 21 ind!-desh1dratada reconstituido en Is. forma cada en el envase. A 3 Agar EosJua azul de meWcao • (EMB de Levine; Levine, 1921). Composlcl6n: Peptona Lactosa Fosfato dlpot4s1co Eosina amarilla (sol. ocuosa 2% m/v) Azul de metfleno (sol. acuosa 0,25% mlv) Agar Prepand6u.: Afiadfr los Jngred1entes a. 955 m1 de e.gua destilada, Oalentar hasta ebulllc16n para con segu1r la dJsoluci6n coinpleta. AutocIavar a 121'lO. dul'ante 15 minutos. E1 pH f1Jml deber4 ser .,.1. Eldste en el comerdlo en forma desh1drata. da, prepararlo slguiendo ~ mstrucclones del envase, A.4 Agar manltol, yema de hllevo. 'POUmlxfna, 1"0,10 de renol (MYP) (Mossel y cot, 1967) Composlcl6u. del med10 buec Extracto de carne 1 g Peptona 10 g d-Manito1 10 g Cloruro s6d1co 10 g Rojo de reno; 0,025 g Agar 15 r Prepa.raco,l6n del med!o completo: Aiiadfr los componentes So 890 mI. de agua. destllada, mezclar bien y calentar a ebulllcl6n basta disoluc16n co:npleta. J::nfrIar a ~~. y ajustar el lJH del medio a 7.2 + O .~ . Repa.r ~ en vollimenes de 90 mI. y esterU1zar a 121'10. durante 15 minutos. EpfrJar a 45?C. y ~ a 90 ml, de medio base, 10 ml, de emU1s16n de yema de huevo (prepararla en la forma seftala. da en el medio 3 0 utllizar un producto comer ctat adecuado) y 1 ml, de soluc16n aouosa al 0,1% de sul!ato ' de poIlmlxina B esterW,z"do por fU tracl6n. Elt1ste en el comercto en torma ~t­ drata!fa, prcpararlo s1gulendo las fnStrucc10nes del envaae. A,S Agar &rlhuUrlDa Compostd6Q del med10 base: Reptooa especial ~ ! Extr&cto de leva.dura 8 f: .A(ar ~r 1'repuar.t6n: Suspender los lXlgredlentes en un 1 d'3 stua destilada, mezclar bllm y cale,ntar a ebU1l1cl6D !!Mfa tUsoluc16n completa. AJustar el pH a 7.1lI. Dtstrlbu.Ir· en w1Wnenes de 100 mI. ., esterD1zar 10. APENDICB A. M)ed1os de eultlvo tea Para la preparac16n de los diferen me dios de cultivo se debe consultar las Normas Ttkn1cas Naclonales 2()4. oa7; 207 .028 y 209.181. Los medios de cultivo cuya preparac16n se 1DdIca a continuacl6n no apareeen en las nor mas menclonadas, A.l Agar blsmuto sultlto (ModWcado por Wilson y Blair) CompoeJcI.6nc Extracto de came Peptona o. pal1petoua Glucosa Fosfato d1s6d1co Sulfato ferroso Indlcador BJsmuto Sulfito Verde BrWante Agar PreparacI6D: SUspender los companentes en un 1100 de agua dest1lada, mezclar bien y calentar basta ebulllcl6n con agitaci6n frecuente para. dOO1 ver las sustanclas solubles. 8e rorma un precl pitado que no llet'llo a dfsolverse. Enfr1ar tasta 45~?C y distrfbuir en placas de Petri en oantldades de 15-20 mI. No esterUizar. La sa lectlv1dad del med10 dfsminuye 48 bs. despu~s de su preparac16n, El medio mdste en el comereto en fonna deah1dratada. Prepararlo slgu1endo las mstrue dones del envase. ~ 2 Agar EDdo Ooml1081d6D: Peptona Lactosa 1l'oSfato dipot4s1co Sulfito s6dico Pucsfna b4s1ca A~ PrelJaraeI4D: E1 med10 debe US8!'Se el m!smo dfa de su preparaci6n. AfiaCUr todos los componentes, ex cepto el sulfito s6dico y la rucsina b4s1ca a 1 I. de .agua dest~, cillentar basta ebUl11c16n para consegulr la dIsolucl6n compIeta., d1strlbuir en cantldades de 100 mI. y estlrWzar a l21~O. du-o rante 15 min. Imnediatemente antes de utlll. zarlo, fundir el agar y afiadir a cada. 100 mI., 1 mI. de una soluc16n de fucsina Wsica al 4'$' (en alcohol etDlco del 95%) y 2,5 mI. du UDa 801ucf6n acuosa de sUlfito s6d1co nl 10% ('La, solucl6n de SU1t1to debe prepararSe inmediata mente antes de su usa). Mezclar bien y dlstrl. bulr en cantidades de 16-20 mi. en placas dQ Petri. pH f1nal del medlo, ".5. magar Endo exlste en el comercfo en forma PAg. 93022 Lima, Sabado 5 de Enero de 1991 ,£{ Peruano 5g ~I 5g algod6n. Distribuir en vol\imenes de 10 mI. en tubos contenlendo tubos de rermentacion In vertldos (75' x 10 rom) Y esteriUza;r a 121 90 durante 10 min. Existe en el eomercio en forma deshldrata· da, prepararlo en la forma Indlcada en a1 en vase. A.9 C':ldo MR-VP (BA>jo de MeIDo seJtdn Voges-proskauer) <:lomposlcl6n: Proteosa peptons. Glucosa Fosfato dlpottisico Preparael6n: Mad!r los componentes a un L de AgUa destllada, calentar suavemente agitando eon frecuencla basta dtsoluct6n compIeta, diStributr volumenes de 5 ml. en tubes de cultlvo yes terilizar a 121 ~C durante 15 min. Eldste en el comercfo en fonna deshfdrata da; prepararlo slgnlendo las Instrucclones del envasa. .1..10 Caldo tetratfonato -verde brlDaDte mocJ1ftcadG \'Or KauffmaDD Composkl6n del mecJlo bue: Triptosa 0 proteosa pePtona Sales blUares Carbooato eli1cfco T1osulfato s6dlco Pre!''l,racl6n tel medlo baBe: Afiadlr todos los componentes 11 un I. de agua destllada y mezcIar para disolver los rna terlales soIubles . Enfrlar y conservar, st es necesarlo, a s--.3 ~. El m1smo dia. en que e1 medlo va a utillzarse, afiadlr por lltro, 2 mI. de una solucl6n acuosa esterll R1 0.5% de verda brll1ante pTev1amen~ esterlUzada poT eb!~l1lc16n durante 10 mm, y, 20 ml . de una solucf6n de yodo, agltar 1entamente para mezclar, resuspen der e1 preclpftado y dist~lbulr a.s~ptlcamente en In forma necesarla. El medio no debe ea lentarse despues de la adlcl6n del ~odo. Soluet6n de yodo: Para prepararla, disOlver 5 II de yoduro de potaslo y 6 g de yodo ertste llzado en 10 mI. de agua destUade. esterU en un frasc{l f'sterU. Dllutr hasta 20 m1. con agt1a destllada, est~ril y conservar en la oscurldad. E1 enldo tetratlonato ex1s~ en et comercfo en forma deshfdratada; prepatarlo slguietldo las instrucelones del envase. A.ll Ca.ldo tripton,ado Disolver 10 g de trlptona en un Utro de agua destllada, distrlbulr en porclones de 5 ml en tubos de 150 x 15 mm . y esterlItzar a 121 9C durante 15 min. A.12 }\fedio selectJvo para ana.erobfos (para prueba c1e .esterI1ldad) Composicl6n: Extraeto de levadura. 5 g Extraeto de came 3 g Trlptona 15 g Glueosa 0,5 g CLNa 2, ~ It NaHPO. 2H 0 2,5 g Cisterna HOI 0, I) g Agar 15 tl A&'UR 1,000 k'~ S'e dfsuelven todos los lngredlentes en el ngua. Se ajusta el pH a 7,1 + 0.1 . Se esterillza a 121 ~C por 20 min. 1G gis, 5g 5g "Or 5; 1,2 g 3g 10 g 10 ~ 20 g 0,5% m/v' a 121~C. durante 15 min. Enfrlar a 80~C. y afia dir a 100 ml. de medic base, 1 g. de tributirina (gUcerlna trIbutirato) neutra, caelntada a 80,0 Mezclar homogeneamente mediante movimlen tos oscllatorlos. Despu~s del enfriamiento, el medlo de cultivo debe presentar turbldez }:o· mogenea. 5egUn Richards Y Sadex pueden uti lizarse tambien, en lugar de trlbutirina, otros gllrerldos como Trlolafna y trilinoleina. Existe en el comerelo en forma deshldrata da. Prepararl0 sigulendo las Instrucclonss del envase. A.6 Agar vloleta roJo bUls (VBBA) Composlcl6D: Extracto de levadura B g Peptona 7 g Oloruro s6dlco IS t Sales blUares N11m. 3 1,6 AI Lactosa 10 I Rajo neutro (sol. 1% mlv) 3 ml OriStal VIolete (sal ocuosa 0.1% m[v) Agar 15 It Preparad6n: Afiacfir los componentes a un I. de AgUa destlIada, calentar a ebuIllol6n basta t1Isalucl6u eompleta, enfmr a 50-609C, ajustar Ia reac ckSn de tal forma que el pH desput!s de la es terlllzacl6n sea de 7,4, dlstrlbuir al medto y esterfIlzarl0 a 121~ durante 15 min. A.7 caIdo cIe enrfqueclmlenfo para Staphy10c00l'iU ser6n GlclIlttl ., Cantohl COmpOslcl6n: Trlptona Extraeto de carne Extracto de !Gw.dura CIoruro de lItlo Mamol Cloruro s6dleo Olleina Plruvato de sodlo Preparacl6n 'del medlo cODllPleto: D!solver los lngredlentes en un 1. de agUa destllada y ltjustar el pH a 6.9. Repa~lr en can tldades de 19 mI. en tubos de prueba de 20 z 200 rom. y esteriIlzar a 1159q durant~ 20 min. En esta forma, el medlo puooe 5$:" conser. vado a. 4!C. durante 10-12 d. Antes del uso, regenerar pI medlo por calentamiento a 100 ~ en bafio de agua por 20 min . Enfrhr, a1lc{onar 0,1 ml. de una solucl6n al 1% (mN) de ~lu· rlto de TlOtaslo ester'lIzada. por filtrac'6n a ~da tUbo. Estc medio extste en el comerefo en f(lr. ma deshldratada; prepararlo slgulen.do las In d1caclones del envase . A.S Ca1do laetosado verde brUlante bills Z% (CLVBB) Oompostcl.6n: Peptona Lactosa BJUs de buey desecada Verde brllIante (sol. aeuosa al 2,66 ml. Preparael6n: Dlsolver 1a Peptona y In Lactosa. en 500 mt. de agtla destflada y afiadfr Ill. bllis de buey dl Buelta en 200 ml. de agua destilada. Completar el volumen basta aproxiJnadamente 975 mI. con &gUa destilada y ajustar el pH a 7.4. Aiiadlt al verde brillante completar el volume,1 total Julsta un 1., agltar y nItTar si es nece;;ar!') por "Pk~. 93023 Li.DJa., sa~Q 5 de Enero de 1991. 1£(Peruano A.13 Agar iDtusi6n cerebro coraz6n Compostc16n : InfUS16n de- cerebro de temero .• .•.. •... Infusi6n de coraz6n de vacuno ... ... •. Peptona 0 proteosa peptona ••• .•• ••• '" Oloruro s6tUco ••. ••• ••••••.••••• Fosfato c:'Us6d1co •.. •.. ••• ••• •• Glucosa ••• ••. ••• • . Alar ,.. •.• •.•• ..••.••.....• Agua Clorhidrato de cistefna '" •.. •.• ••• Alm1d6n soluble ... ... .• .... . .... Be adiciona 180 infusi6n de cerebro de temero f 1& lnfusl6n de coraz6n de vacuno a 550 ml. de agua destilada, luego se adiclODlU1 los otros lngredientes, se calienta a ebulllci6n con agita· ci6n basta disoluci6n completa y se esterillZa a 121 -o durante 15 min. Existe en el comercio en forma deshidratada, y se prepara siguiendo las tnstrucciones del envase. NOTA.- Para el caso del caldo cerebro coraz6n mas 0,05% de clorhidrato de cistefna mas 0,1% de almid6n solubre es la misma com posici6n exceptu4ndose 180 8odici6n del agar. As!. mismo, para e1 caso del caldo cerebro cora.z6n mas 0,1% de almid6n soluble se excepttia 180 adf J1.14 Agar para aneroblos serUu Brewer ComposIcl6D: Extracto de levadura ... ... ... . ..... Triptona ...•• . .•. Proteosa igual peptona. . . .. . . •. Dextrosa . C1oruro s6dico.. • .. .• Agar . Tioglicolato s6dico '" .. . . .. •. .. Sulfoxllato de formaldehido s6dico .. . . Rasazurlna certificada . .. . .. Agua '" . 200 ml 2501D1 10 8 6 8 3,6 8 a I 15 I 650 ml Adicl0J1l9'lo en una proporc1Qn .de O,Q5o/e Adicionarlo en una proporcii60 de 0.1~ ci6n del agar y del c1orhidra,to de cJstefDa; J se prepara de la manera siguiente: Be adiciona 1& lnfusi6n del cerebro de teme. ro y la infusi6n de coraz6n de vacuno a 650 m1 de agua destilada, 1uego se adiclonan los otros Ingredientes. Se reparte eo tubas, vol11meDea de 5 ml Y se esterillza a 121 ~ durante 15 mIa. El pH final debe ser 7,4. Para obtener los meJores resultados, se util1za. el medio e1 mlsm.o dfa de su preparaci6n; en caso contrario, se hiene 0 se trata 801 vapor el medio durante algUnos mI nutos y se enfria antes de usarlo. Existe en el comerclo en forma deshldrata· da y se prepara slguiendo las instrucclODe8 del envase. a I a 8 10 8 10 I e 8 20 • I 8 II 0,(lO3 8 1000 ml PREPARACION Be d1suelven los componentelJ 8Xl 1 000 mi. de agua destilada frla, y se caIienta basta ebu Ulcl6n para diso1ver e1 medio por comp1eto. Se distribuye en frascos y se esterWza en el euto clave durante 15 min a una presi6n de 15 Ib (121 ~C). Be reparte e1 medio en c4pSUlas petri empleando 50 - 75 ml. del medio en c4pSUlas petri de 95 mm x 15 - 20 mm. Para obtener mejores resultados se utUizan tapaderas poro BaS en las c4psUlas que contlenen el medio duo A~5 caklo Laurtl sulfato trlp&osl CoDqJOstcl6n: 'l':riptoS80, triptona 0 trtptlcas .. .• ••.• •• Lactosa . Fosfato dlpot4sico ••. •.. •. • . •• ••• •.• Fosfato monopot4sico •.. ... •" ••• •••• Cloruro s6d1co .. .. Lauril sulfato s6dlco •.. • • .. rante 180 solldWcaci6n a fin de obtener una au· perficie seea, Se inocUla 180 superf1c1e del mecUo por frotis 0 veteado. Be cubre Ia ClI.psQJa ~. CUlada con una tapadera de cApsUla PETRI anaenobia de Brewer. Es esenc1al qu8 81 anU10 de precinto dentro de Ia tapadera bags un per. fecto contacto con e1 media. Este precinto DO debe romperse antes del final del perlodo de In· cubac~6n. Pueden bacerse la!I pJacas colocando e1 lnoculante en la c4psula meacl4ndolo can e1 me dia antes de que se solidifique. La reaccl6n. fl· nal del medio sem de un pH de 7,3. 20 ir a I 3,'m Ir I,'m 8 a 8 0,1 8 PRENBACION fermentac16n Invertldos (75 :It 10 mm) '1 Be g. terWza a 121 ~ durante 15 min. pH f1nal 6.& Be disue1ven los componentes en 1 1 de agua aproxln:1adQmente. Exlste en el comerclo en for· destllada, se distrtbuyeo en vo1mnenes de 10 m1 rna deshidratada; y se prepara siguiendo las 1DI. en tuOOs de 150 x 15 nun, contenlendo tubas de trucclones del envase. Pag. 93024