NOM-004-SEMARNAT-2002: Especificaciones para aprovechamiento de lodos y biosólidos

18 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES NORMA Oficial Mexicana NOM-004-SEMARNAT-2002, Proteccion ambiental.- Lodos y biosolidos. Especificaciones y limites maximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposicion final. Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-004-SEMARNAT-2002, PROTECCION AMBIENTAL.- LODOS Y BIOSOLIDOS. ESPECIFICACIONES Y UMITES 1\/AXIMOS PERMISIBLES DE CONTAMINANTES PARA SU APROVECHAMIENTO Y DISPOSICION FINAL. CASSIO LUISELLI FERNANDEZ, Subsecretario de Fomento y Normatividad Ambiental de la Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales y Presidente del Comite Consultivo Nacional de Normalizaci6n de Media Ambiente y Recursos Naturales, con fundamento en lo dispuesto en los artfculos 32 Bis fracciones I, II, IV, Vy 39 fracciones I, VIII y XXI de la Ley Organica de la Administraci6n Publica Federal; 4 de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 8 fracci6n V del Reglamento Interior de la Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Natural es; 5o. fracciones Vy VI, 36, 37, 37 Bis, 119, 139 de la Ley General del Equilibria Ecol6gico y la Protecci6n al Ambiente; 5o. fracci6n VI y 60. del Reglamento de la Ley General del Equilibria Ecol6gico y la Protecci6n al Ambiente en Materia de lmpacto Ambiental; 38 fracci6n II, 40 fracciones I y X; 41, 43, 44 y 47 fracci6n IV de la Ley Federal sabre Metrologfa y Normalizaci6n; 28, 31 fracci6n II, 33 y 34 de su Reglamento, expide la siguiente Norma Oficial Mexicana NOM-004-SEMARNAT-2002, Protecci6n ambiental.- Lodos y bios6Iidos.- Especificaciones y lfmites maximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposici6n final, y CONSIDERANDO Que en cum plimiento a lo establecido en la fracci6n I del artfculo 47 de la Ley Federal sabre Metrologfa y Normalizaci6n, con fecha 18 de febrero de 2002 se public6 en el Diario Oficial de la Federaci6n, con caracter de proyecto la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-004-ECOL-2001, Protecci6n ambiental- Lodos y bios6Iidos- Especificaciones y lfmites maximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposici6n final, con el fin de que dentro de los 60 dfas naturales siguientes a su publicaci6n, los interesados presentaran sus comentarios ante el Comite Consultivo Nacional de Normalizaci6n de Media Ambiente y Recursos Naturales, sito en bulevar Adolfo Ruiz Cortines numero 4209, piso 5o., colonia Jardines en la Montana, c6digo postal 14210, Delegaci6n Tlalpan, Distrito Federal o se enviaron al correo electr6nico o al fax que para el efecto se serialaron. Durante el citado plaza, la Manifestaci6n de I mpacto Regulatorio correspondiente estuvo a disposici6n del publico en general para su consulta en el citado domicilio, de conformidad con el artfculo 47 fracci6n I del citado ordenamiento. Que en el plaza de los 60 dfas antes serialado, los interesados presentaron sus comentarios al proyecto en cuesti6n, los cuales fueron analizados por el citado Co mite, realizandose I as modificaciones procedentes al mismo. La Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales public6 las respuestas a los comentarios recibidos en el Diario Oficial de la Federaci6n el dfa 18 de junio de 2003. Que habiendose cumplido con el procedimiento EStablecido en la Ley Federal sabre Metrologfa y Normalizaci6n el Comite Consultivo Nacional de Normalizaci6n de Media Ambiente y Recursos Naturales, en sesi6n ordinaria de fecha 24 de septiembre de 2002, aprob6 la Norma Oficial Mexicana NOM-004-SEMARNAT-2002, Protecci6n ambiental-Lodos y bios6Iidos-Especificaciones y lfmites maximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposici6n final. Por lo expuesto y fundado se expide la siguiente: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-004-SEMARNAT-2002, PROTECCION AMBIENTAL-LODOS Y BIOSOLIDOS-ESPECIFICACIONES Y UMITES MAXIMOS PERMISIBLES DE CONTAMINANTES PARA SU APROVECHAMIENTO Y DISPOSICION FINAL INDICE 0. lntroducci6n 1. Objetivo y cam po de aplicaci6n 2. Referencias Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 3. Definiciones 4. Especificaciones 5. Muestreo y metodos de prueba 6. Evaluaci6n de la conformidad 7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales 8. Bibliograffa 9. Observancia de esta Norma Anexos Opciones para la reducci6n de atracci6n de vectores II Metodo de muestreo de lodos y bios6Iidos Ill Metodo para la cuantificaci6n de coliformes fecales en lodos y bios6Iidos IV Metodo para la cuantificaci6n de Salmonella spp., en lodos y bios6Iidos V Metodo para la cuantificaci6n de huevos de helmintos en lodos y bios6Iidos VI Metodo para la cuantificaci6n de metales pesados en bios6Iidos VII Contenido de la bitacora de control de lodos y bios6Iidos 0. lntroducci6n 19 En las actividades de desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, asf coma en las correspondientes a la operaci6n de las plantas potabilizadoras y de plantas de tratamiento de aguas residuales se generan volumenes de lodos, que en caso de no darles una disposici6n final adecuada, contribuyen de manera importante a la contaminaci6n de la atm6sfera, de las aguas nacionales y de los suelos, afectando los ecosistemas del area donde se depositen. Se ha considerado que los lodos por sus caracterfsticas propias o por las adquiridas despues de un proceso de estabilizaci6n pueden ser susceptibles de aprovechamiento siempre y cuando cumplan con los lfmites maximos permisibles de contaminantes establecidos en la presente Norma Oficial Mexicana o, en su caso, se dispongan en forma definitiva coma residuos no peligrosos; para atenuar sus efectos contaminantes para el media ambiente y proteger a la poblaci6n en general. 1. Objetivo y cam po de aplicaci6n 1.1 Objetivo Esta Norma Oficial Mexicana establece las especificaciones y los lfmites maximos permisibles de contaminantes en los lodos y bios6Iidos provenientes del desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, de las plantas potabilizadoras y de las plantas de tratamiento de aguas residuales, con el fin de posibilitar su aprovechamiento o disposici6n final y proteger al media ambiente y la salud humana. 1.2 Campo de aplicaci6n Es de observancia obligatoria para todas las personas ffsicas y morales que generen lodos y bios6Iidos provenientes del desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, de las plantas potabilizadoras y de las plantas de tratamiento de aguas residual es. 2. Referencias Constancia de no peligrosidad de residuos, anteriormente tramite INE-04-007 modificada su homoclave el 29 de mayo de 2003, mediante el acuerdo por el que se dan a conocer todos los tramites y servicios inscritos en el Registro Federal de Tramites y Servicios que aplica la Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales, ahora procedimiento SEMARNAT-07-007. NMX-B-231-1990, Cribas para la clasificaci6n de materiales granulares, publicada en el Diario Oficial de la Federaci6n el 27 de diciembre de 1990. 3. Definiciones 20 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Para efectos de la presente Norma Oficial Mexican a, se establecen las siguientes definiciones: 3.1 Aguas residuales Las aguas de composicion variada provenientes de las descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrfcolas, pecuarios, domesticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier otro uso, asf coma la mezcla de el las. 3.2 Almacenamiento Accion de mantener en un sitio los lodos y biosolidos, hasta su aprovechamiento o disposicion final. 3.3 Aprovechamiento Es el uso de los biosolidos coma mejoradores o acondicionadores de los suelos por su contenido de materia organica y nutrientes, o en cualquier actividad que represente un beneficio. 3.4 Atraccion de vectores Es la caracterfstica de los lodos y biosolidos para atraer vectores coma roedores, moscas, mosquitos u otros organismos capaces de transportar agentes infecciosos. 3.5 Biosolidos Lodos que han sido sometidos a procesos de estabilizacion y que por su contenido de materia organica, nutrientes y caracterfsticas adquiridas despues de su estabilizacion, puedan ser susceptibles de aprovechamiento. 3.6 Coliformes fecales Bacterias patogenas presentes en el intestino de animales de sangre caliente y humanos. Bacilos cortos Gram negativos no esporulados, tambien conocidos coma coliformes termotolerantes. Pueden identificarse por su tolerancia a temperaturas de 44°C-45°C. Tienen la capacidad de fermentar la lactosa a temperatura de 44.5°C. lncluyen al genera Escherichia y algunas especies de Klebsiel/a. 3. 7 Desazolve La accion de extraer solidos provenientes de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, no incluye los provenientes de las presas o vasos de regulacion. 3.8 Digestion aerobia Es la transformacion bioqufmica de la materia organica presente en los lodos, que es transformada en bioxido de carbono y agua por los microorganismos en presencia de oxfgeno. 3.9 Digestion anaerobia Es la transformacion bioqufmica de la materia organica presente en los lodos, que es transformada en gas meta no y bioxido de carbono y agua por los microorganismos en ausencia de oxfgeno disuelto y combinado. 3.10 Disposicion final La accion de depositar de manera permanente lodos y biosolidos en sitios autorizados. 3.11 Estabilizacion Son los procesos ffsicos, qufmicos o biologicos a los que se someten los lodos para acondicionarlos para su aprovechamiento o disposicion final para evitar o reducir sus efectos contaminantes al media ambiente. 3.12 Estabilizacion alcalina Es el proceso mediante el cual se ariade suficiente cal viva (oxido de calcio CaO) o cal hidratada (hidroxido de calcio Ca(OH)2) o equivalentes, a la masa de lodos y biosolidos para elevar el pH. 3.13 Helminto Termino designado a un amplio grupo de gusanos parasitos (de humanos, animales y vegetales), de vida libre, con forma y tamarios variados. Poseen organos diferenciados, y sus ciclos vitales comprenden la produccion de huevos o larvas, infecciosas o no. 3.14 Huevos de helmintos viables Huevos de h elmintos susceptibles de desarrollarse e infectar. 3.15 La Secretarfa Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Natural es. 3.16 Umite maxi mo permisible 21 Valor asignado a un parametro, el cual no debe ser excedido por los lodos y biosolidos para que puedan ser dispuestos o aprovechados. 3.17 Lixiviado Uquido proveniente de los lodos y biosolidos, el cual se forma por reaccion o percolacion y que contiene contaminantes disueltos o en suspension. 3.18 Lodos Son solidos con un contenido variable de humedad, provenientes del desazolve de los sistemas de alcantarillado urbano o municipal, de las plantas potabilizadoras y de las plantas de tratamiento de aguas residual es, que no han sido sometidos a procesos de estabilizacion. 3.19 Mejoramiento de suelos Es la aplicacion de los biosolidos en terrenos para mejorar sus caracterfsticas ffsicas, qufmicas o microbiologicas. 3.20 Muestra Parte representativa de un universo o poblacion finita, obtenida para conocer sus caracterfsticas. 3.21 Parasito Organismo animal o vegetal que vive sabre o dentro de un individuo de otra especie. 3.22 Patogeno Microorganismo capaz de causar enfermedades, si esta presente en cantidad suficiente y condiciones favorables. 3.23 Salmonella spp. Bacilos motiles por sus flagelos perftricos, que fermentan de manera caracterfstica glucosa y manosa sin producir gas, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. La mayorfa produce sulfuro de hidrogeno (H2S). A menudo, son patogenos para el hombre y los animales cuando se ingieren, ocasionando fiebre tifoidea y enterocolitis (conocida tambien coma gastroenteritis). 3.24 Sistema de alcantarillado urbano o municipal Es el conjunto de obras y acciones que permiten la prestacion de un servicio publico de alcantarillado, incluyendo el saneamiento, entendiendo coma tal la conduccion, tratamiento, alejamiento y descarga de las aguas residuales. 3.25 Solidos Totales (ST) Son los material es residual es que permanecen en los lodos y biosolidos, que han sido deshidratados entre 103°C a 105°C, hasta alcanzar un peso cons tante y son equivalentes en base a peso seco. 3.26 Solidos Volatiles (SV) Son solidos organicos totales presentes en los lodos y biosolidos, que se volatilizan cuando estos se queman a 550°C en presencia de aire por un tiempo determinado. 3.27 Tasa Especffica de Absorcion de Oxfgeno (TEAO) Es la masa de oxfgeno consumida por uni dad de tiempo y por uni dad de masa en peso seco de los solidos total es de los lodos y biosolidos. 3.28 Terrenos con fines agrfcolas Son las superficies sabre las cuales se pueden cu ltivar productos agrfcolas para consumo humano y animal, incluyendo los pastizales. 4. Especificaciones 22 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 4.1 Las personas ffsicas o morales interesadas en llevar a cabo el aprovechamiento o disposici6n final de los lodos y bios6Iidos a que se refiere esta Norma Oficial Mexicana, debera de recabar la "constancia de no peligrosidad de los mismos" en terminos del tramite SEMARNAT-07-007. 4.1.1 En el caso del proceso de estabilizaci6n alcalina, las muestras de lodos deben ser tomadas antes de ser sometidas a este proceso. 4.2 Los lodos y bios6Iidos que cumplan con lo establecido en la especificaci6n 4.1, pueden ser manejados coma residuos no peligrosos para su aprovechamiento o disposici6n final coma se establece en la presente Norma Oficial Mexicana. 4.3 Para que los bios6Iidos puedan ser aprovechados, deben cumplir con la especificaci6n 4.4, 4.5, 4.6, 4.7 y 4.8; y lo establecido en las tablas 1, 2 y 3 de la presente Norma Oficial Mexicana. 4.4 Los generadores de bios6Iidos deben controlar la atracci6n de vectores, demostrando su efectividad. Para lo cual se pueden aplicar cualquiera de las opciones descritas, de manera enunciativa pero no limitativa, en el Anexo 1 u otras que el responsable demuestre que son utiles para ello. Se deben conservar los registros del control por lo menos durante los siguientes 5 (cinco) arias posteriores a su generaci6n. 4.5 Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana los bios6Iidos se clasifican en tipo: excelente y bueno en funci6n de su contenido de metales pesados; y en clase: A, B y C en funci6n de su contenido de pat6genos y parasitos. 4.6 Los If mites maxi mos permisibles de metales pesados se establecen en la tabla 1. TABLA 1 LIMITES MAXIMOS PERMISIBLES PARA METALES PESADOS EN BIOSOLIDOS CONTAMINANTE EXCELENTES BUENOS (determinados en forma total) mg/kg mg/kg en base seca en base seca Arsenico 41 75 Cadmio 39 85 Cromo 1 200 3 000 Cobre 1 500 4 300 Plomo 300 840 Mercurio 17 57 Nfquel 420 420 Zinc 2 800 7 500 4.7 Los lfmites maximos permisibles de pat6genos y parasitos en los lodos y bios6Iidos se establecen en la tabla 2. CLASE A B C TABLA2 LIMITES MAXI MOS PERMISIBLES PARA PATOGENOS Y PARASITOS EN LODOS Y BIOSOLIDOS INDICADOR PATOGENOS BACTERIOLOGICO DE CONTAMINACION Coliformes fecal es Salmonella spp. NMP/g en base seca NMP/g en base seca Menor de 1 000 Menor de 3 Menor de 1 000 Menor de 3 Menor de 2 000 000 Menor de 300 (a) Huevos de helmintos viables PARASITOS Huevos de helmintos/g en base seca Menor de 1(a) Menor de 10 Menor de 35 Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 23 NMP numero mas probable 4.8 El aprovechamiento de los bios61idos, se establece en funci6n del tipo y clase, coma se especifica en la tabla 3 y su contenido de humedad hasta el 85%. TIPO EXCELENTE EXCELENTE 0 BUENO EXCELENTE 0 BUENO TABLA3 APROVECHAMIENTO DE BIOSOLIDOS CLASE APROVECHAMIENTO A • Usos urbanos con contacto publico directo durante su aplicaci6n • Los establecidos para clase By C B • Usos urbanos sin contacto publico directo durante su aplicaci6n • Los establecidos para clase C C • Usos forestales • Mejoramientos de suelos • Usos agrfcolas 4.9 La aplicaci6n de los bios61idos en terrenos con fines agrfcolas y mejoramiento de suelos se sujetara a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Vegetal y conforme a la normatividad vigente en la materia. 4.10 Para la disposici6n final de los lodos y bios61idos, estos deben cumplir con la especificaci6n 4.1 y con los lfmites maximos permisibles para el contenido del indicador de contaminaci6n, pat6genos y parasitos especificados en la tabla 2, para clase C. 4.11 Los sitios para la disposici6n final de lodos y bios61idos, seran los que autorice la autoridad competente, conforme a la normatividad vigente en la materia. 4.12 Los lodos y bios61idos que cumplan con lo establecido en la presente Norma Oficial Mexicana, pueden ser almacenados hasta por un periodo de dos arias. El predio en el que se almacenen debe ser habilitado para que no existan infiltraciones al subsuelo y contar con un sistema de recolecci6n de lixiviados. 4.13 Se permite la mezcla de dos o mas lotes de lodos o bios61idos, siempre y cuando ninguno de ellos este clasificado coma residua peligroso y su mezcla resultante cumpla con lo establecido en la presente Norma Oficial Mexicana. 4.14 Muestreo y analisis de lodos y bios61idos El generador de lodos y bios61idos por media de laboratorios acreditados debe realizar los muestreos y analisis correspondientes para demostrar el cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana y debera conservar los registros por lo menos los siguientes 5 (cinco) arias posteriores a su realizaci6n. 4.15 La frecuencia de muestreo y analisis para los lodos y bios61idos se realizara en funci6n del volumen de lodos genera dos coma se establece en la tabla 4. Volumen generado por ano (Ton/Ano) en base seca Hasta 1,500 TABLA4 FRECUENCIA DE MUESTREO Y ANALISIS PARA LODOS Y BIOSOLIDOS Frecuencia de muestreo y Parametros a determinar analisis Una vez al aria Metales pesados, indicador bacteriol6gico de contaminaci6n, pat6genos y parasitos 24 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Mayor de 1,500 hasta Una vez por semestre Metales pesados, indicador bacteriol6gico 15,000 de contaminaci6n, pat6genos y parasitos Mayor de 15,000 Una vez por trimestre Metales pesados, indicador bacteriol6gico de contaminaci6n, pat6genos y parasitos 4.16 El generador podra quedar exento de realizar el muestreo y analisis de alguno o varios de los parametros establecidos en la presente Norma Oficial Mexicana, siempre y cuando la detecci6n de estos sea en cantidades menores que los lfmites maximos establecidos, o cuando por la procedencia de los lodos y bios6Iidos estos no contengan los contaminantes regulados en la presente Norma Oficial Mexicana, en ambos casos, debera manifestarlo ante la Secretarfa por escrito y bajo protesta de decir verdad. La autoridad se reserva el derecho de verificar dicha informaci6n. 4.17 El generador debera contar con una bitacora de control de lodos y bios6Iidos, de acuerdo a lo establecido en el Anexo VII. 5. Muestreo y metodos de prueba Para el muestreo y determinaci6n de los valores y concentraciones de los para metros establecidos en esta Norma, se deberan aplicar los metodos de prueba establecidos en los anexos II, Ill, IV, Vy VI de la presente Norma Oficial Mexicana. 6. Evaluaci6n de la conformidad La evaluaci6n de la conformidad de la presente Norma Oficial Mexicana se realizara a petici6n de parte, de conformidad a lo dispuesto por la Ley Federal sabre Metrologfa y Normalizaci6n y su Reglamento. El procedimiento de verificaci6n se realizara por la PROFEPA o por las unidades de verificaci6n y laboratorios acreditados y aprobados para llevar a cabo la verificaci6n. En caso de que existan unidades de verificaci6n acreditadas para la presente Norma, la verificaci6n se realizara exclusivamente a traves de las mismas. 7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales Esta Norma Oficial Mexicana no concuerda con ninguna norma o lineamiento internacional, tampoco existen normas mexicanas que hayan servido de base para su elaboraci6n. 8. Bibliografia 8.1 A Guide to the Biosolids Risk Assessments for the EPA Part 503 Rule. EPA 832-B-93-005. Environmental Protection Agency USA September 1995. (Gufa para la evaluaci6n de riesgos en los bios6Iidos por la EPA Parte 503, Reglamento EPA 832-B-93-005.- Agencia de Protecci6n Ambiental de Estados Unidos de America. Septiembre 1995). 8.2 A Plain English Guide to the EPA Part 503 Biosolids Rule. EPA/832/R-93/003. Environmental Protection Agency USA September 1994. (Gufa sencilla de la EPA Parte 503 Bios6Iidos Reglamento EPA/832/R-93/003.-Agencia de Protecci6n Ambiental de Estados Unidos de America. Septiembre 1994). 8.3 APHA, AWNA, WPCF. 1992 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th Ed. American Public Health Association. Washington, D.C. (Metodos establecidos para el analisis de agua y agua residual. 18ava. Edici6n. Asociaci6n Americana de Salud Publica. Washington, D.C.). 8.4 Biosolids Treatment and Management. Processes for Beneficial Use. Marcel Dekker, Inc. 1996. (Tratamiento y Manejo de los Bios6Iidos.- Procesos para Uso Benefico.- Marcel Dekker, Inc. 1996). 8.5 Campos, R., Maya, C. y Jimenez, B. "Estabilizaci6n Termica Alcalina de Lodos Qufmicos con un Alto Contenido de Microorganismos Pat6genos". XIX Encuentro Nacional AMIDIQ, Academia Mexicana de lnvestigaci6n y Docencia en lngenierfa Qufmica, AC. Memorias pp. 365-366, lxtapa- Zihuatanejo, Gro., del 13 al 15 de mayo de 1998. 8.6 Environmental Regulations and Technology. Use And Disposal Of Municipal Wastewater Sludge. EPA 625/10-84-003. Environmental Protection Agency USA September 1984. (Tecnologfas y Regulaciones Ambientales.- Uso y disposici6n de lodos de aguas municipales. EPA 625/10-84-003. Agencia de Protecci6n Ambiental de Estados Unidos de America. Septiembre 1984). 8.7 Environmental Regulations and Technology. Control of Pathogens in Municipal Wastewater Sludge. EPA/625/10-89/006. Environmental Protection Agency USA September 1989. (Tecnologfas y Regulaciones Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 25 Ambientales.- Control de Pat6genos en lodos de aguas municipales. EPA/625/10-89/006. Agencia de Protecci6n Ambiental de Estados Unidos de America. Septiembre 1989). 8.8 Fundamento tecnico para la elaboraci6n de la Norma Oficial Mexicana en materia de estabilizaci6n, manejo y aprovechamiento de lodos provenientes de plantas de tratamiento de aguas municipales e industriales. lnstituto de lngenierfa de la UNAM. 1997. 8.9 Geochemistry, Groundwater and Pollution. C.A.J. Appelo y D. Postma.- A.A Balkema/Rotterdam/ Brookfield/1996. (Geoqufmica, aguas subterraneas y contaminaci6n. C.A.J. Appelo y D. Postma.- A.A. Balkema/ Rotterdam/ Brookfield/ 1996). 8.10 Goepfert, J., Olson, N. and Marth, E., 1968. Behavior of Salmonella typhimurium During Manufacture and Curing of Cheddar Cheese. Applied Microbiology. 16: 862-866. (Comportamiento de la Salmonella typhimurium durante el procesamiento y curado del queso Cheddar. Microbiologfa aplicada 16: 862-866. 8.11 Ground Water, Quality Protection. Larry W. Canter, Robert C. Knox y Deborah M. Fairchild. Lewis Publishers, Inc. 198 (Aguas subterraneas, caracterfsticas de protecci6n.- Larry W. Canter, Robert C. Knox y Deborah M. Fairchild. Lewis Publishers, Inc. 1987). 8.12 Gufa para el manejo, tratamiento y aprovechamiento de lodos residuales de plantas de tratamiento municipales. Comisi6n Nacional del Agua. SGIHUI. 1994. 8.13 Gufa para el manejo, estabilizaci6n y disposici6n de lodos qufmicos. Terna Potabilizaci6n. Comisi6n Nacional del Agua. SGIHUI. 1994. 8.14 Jawetz, E., Melnick, J. y Adelberg, E., 1995. Microbiologfa Medica. Ed. Manual Moderno. Mexico. pp. 803. 8.15 Jimenez B., Barrios, J.A. and Maya, C. 1999. Class B Biosolids Production from Wastewater Sludge with High Pathogenic Content Generated in an Advanced Primary Treatment. Disposal and Utilisation of Sewage Sluge: Treatment Methods and Application Modalities. Water Resources, Hydraulics and Maritime Engineering NTUA. Athens, Greece 13-15 October 1999 (Producci6n de bios6Iidos clase "B" de los lodos de aguas residuales con alto contenido pat6geno generados en un tratamiento primario avanzado. Disposici6n y utilizaci6n de lodos residuales. Metodos de tratamiento y tecnicas de aplicaci6n. Recursos de agua, ingenierfa marftima e hidraulica NTUA. Atenas, Grecia, 13-15 octubre 1999). 8.16 Jimenez C.B., Munoz C.A. M. y Barrios Perez, J. A, 1997. Fundamento Tecnico para la Elaboraci6n de la Norma Oficial Mexicana en Materia de Estabilizaci6n, Manejo y Aprovechamiento de Lodos Provenientes de Plantas de Tratamiento de Aguas Municipales e lndustriales. Elaborado para la Comisi6n Nacional del Agua (CNA) por el lnstituto de lngenierfa, UNAM. Proyecto 8313, pp. 107 (diciembre, 1997). 8.17 Jimenez, B., Chavez, A, Barrios, J.A., Maya, C. y Salgado, G., 1998. Manual "Curso: Determinaci6n y Cuantificaci6n de Huevos de Helminto Norma Mexicana NMX-AA-113-SCFl/992". Grupo Tratamiento y Reuso, lnstituto de lngenierfa UNAM. pp. 160, 8.18 Jimenez, B., Maya, C. y Pulido, M., 1996. Evaluaci6n de las Diversas Tecnicas para la Detecci6n de los Huevos de Helminto, y Selecci6n de una para Conformar la NMX Correspondiente. lnstituto de lngenierfa, UNAM. Mexico. pp. 52. 8.19 Ley General del Equilibria Ecol6gico y la Protecci6n al Ambiente. 1996. 8.20 Manual of good practice for utilization of sewage sludge in agriculture. 2nd. Revision october 1991. Anglian Water. (Manual de buenas practicas para la utilizaci6n de lodos residuales en la Agricultura.- 2a. Revision octubre 1991. Agua). 8.21 Miller, V. And Banwart, G., 1965. Effect of Various Concentration of Brilliant Green and Bile Salts on Salmonellae and Other Microorganisms. Applied Microbiology. 13: 77-80. (Efecto de varias concentraciones de sales de verde brillante y biliares en la Salmonella y otros microorganismos. Microbiologfa aplicada. 13: 77-80). 8.22 Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL/1996, Que establece los lfmites maximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales. (Diario Oficial de la Federaci6n 6 de enero de 1997). 8.23 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFl/1993, Sistema General de Unidades de Medida. (Diario Oficial de la Federaci6n 14 de octubre de 1993). 26 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 8.24 Norma Oficial Mexicana NMX-AA-015-1985, Protecci6n al Ambiente-Contaminaci6n del Suelo-Residuos S6Iidos Municipales-Muestreo-Metodo de Cuarteo-Environmental Protection-Soil Pollution-Municipal Solid Residues-Sampling-Quarter Method (Diario Oficial de la Federaci6n 18 de marzo de 1985). 8.25 Norma Mexicana NMX-AA-113-SCFll1999, Analisis de Agua.- Determinaci6n de Huevos de Helminto. Metodo de Prueba. (Diario Oficial de la Federaci6n 5 de agosto de 1999). 8.26 Reglamento de lodos de clarificaci6n. Alemania. 15 de abril de 1992. 8.27 Reglamentaci6n de la Agencia de Protecci6n Ambiental de los Estados Unidos de America (U.S.E.P.A.) para el Uso o Aplicaci6n de Lodos de Drenaje, Parte 503 del 40 CFR, publicada en el Federal Registry el 19 de febrero de 1993. 8.28 Reglamento de la Ley General del Equilibria Ecol6gico y la Protecci6n al Ambiente en materia de Residuos Peligrosos. (Diario Oficial de la Federaci6n 25 de noviembre de 1988). 8.29 Santos Mendoza, Salvador. "Estabilizaci6n con Cal de Lodos de la Planta Pilato del Tratamiento Primario Avanzado". lngenierfa Ambiental, DEPFI- UNAM. 15 de junio de 1998. Tesis de Maestri a. 8.30 Santos M., S., Campos M., R. y Jimenez C., B. "Una Opci6n de Manejo para el Lado Generado al Tratar el Agua Residual del Gran Canal de la Ci udad de Mexico. 1 er. Simposio Latinoamericano de Tratamiento y Reuso del Agua y Residuos lndustriales. Memorias Torno I, pp. 28-1-28-10, del 25 al 29 de mayo de 1998, Mexico, D.F. 8.31 Satchwell, G.M., 1986. An Adaptation of Concentration Techniques for the Enumeration of Parasitic Helminth Eggs from Sewage Sludge (Adaptaci6n de la Tecnica de Concentraci6n para la Enumeraci6n de Huevos de Helmintos Parasitos Provenientes de Lodos Residuales). Water Res. 20: 813-816. 8.32 Schaffner, C., Mosbach K., Bibit V. and Watson C., 1967. Coconut and Salmonella Infection. Applied Microbiology. 15: 471-475. (I nfecci6n de la Salmonella y coco. Microbiologf a aplicada. 15: 471-475). 8.33 Shiflett M., Lee J. and Sinnhuber, R., 1967. Effect of Food Additives and Irradiation on Survival of Salmonella in Oysters. Applied Microbiology. 15: 476-479. (Efecto de aditivos alimenticios e irradiaci6n en la supervivencia de la Salmonella en ostras. Microbiologfa aplicada. 15: 476-479). 8.34 Silliker, J. Deibel, R. and Chiu, J., 1964. Ocurrence of Gram-Positive Organisms Possessing Characteristics Similar to Those of Salmonella and the Practical Problem of Rapid and Definitive Salmonella Identification. Applied Microbiology. 12: 395-399. (Aparici6n de organismos Gram positivos, poseyendo caracterfsticas similares a la Salmonella, y el problema practico de identificaci6n rapida y definitiva de Salmonella. Microbiologfa aplicada. 12: 395-399). 8.35 Silliker, J., Deibel, R. and Fagan, P., 1964. Isolation of Salmonella from Food Samples: VI Comparison of Methods for the Isolation of Salmonella from Egg Products. Applied Microbiology. 12: 224- 228. (Aislamiento de la Salmonella de muestras alimenticias: VI. Comparaci6n de metodos para el aislamiento de la Salmonella desde productos de huevo. Microbiologfa aplicada. 12: 224-228. 8.36 Sludge Management & Disposal. For The Practicing Engineer. P.A. Vesilind, G.C., Hartman y E.T., Skene. Lewis Publishers, Inc. 1986. (Manejo y disposici6n de lodos. Para lngenieros Profesionales. P.A. Vesilind, G.C. Hartman y E.T., Skene. Lewis Publishers, Inc. 1986). 8.37 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th. Edition. American Public Health Association. American Water Works Association. Water Environment Federation. 1995. (Metodos Estandar para la examinaci6n del agua y aguas residuales, 19th. Edici6n Asociaci6n Americana de salud publica. Asociaci6n Americana de aguas tratadas. Federaci6n Ambiental del Agua 1995). 8.38 Sludge Stabilization. Manual of Practice FD-9. Facilities Development. Water Environment Federation 1993. (Estabilizaci6n de lodos. Manual de practicas FD-9. Facilidades de Desarrollo. Federaci6n Ambiental del Agua 1993). 8.39 Standards for the Use or Disposal of Sewage Sludge; Final Rules. 40 CFR Parts 257, 403 and 503. Environmental Protection Agency. USA Federal Register Friday February 19, 1993. (Estandares para el Uso o Disposici6n de lodos residuales, Reglamento 40 CFR Parte 257, 403 y 503. Agencia de Protecci6n Ambiental de EUA Registro Federal 19 de febrero de 1993). Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 27 8.40 Sludge Conditioning. Manual of Practice FD-14. Water Pollution Control Federation. 1988. Alexandria, VA (Manual de practicas de acondicionamiento de lodos FD-14. Federaci6n para el control de la contaminaci6n en el agua. 1988.) y Alejandrfa, V. A 8.41 Stuart, P. and Pivnick, H., 1965. Isolation of Salmonellae by Selective Motility Systems Applied Microbiology 13: 365-372 (Aislamiento de la Salmonella por selectos sistemas de motilidad. Microbiologfa aplicada 13: 365-372). 8.42 Taylor, W., Betty, C. and Muriel, E., 1964. Comparison of Two Methods for Isolation of Salmonella from Imported Foods. Applied Microbiology 12: 53-56. (Comparaci6n de dos metodos para el aislamiento de Salmonella de alimentos importados. Microbiologfa aplicada. 12: 53-56). 8.43 US EPA 1994, Land Application of Sewage Sludge: A Guide for Land Appliers on the Requirements of the Federal Standards for the Use of Disposal of Sewage Sluge, 40 CFR Part 503. Water Environment Federation. USA pp. 62. (Aplicaci6n de lodos residuales al suelo: una Gufa para aplicadores al suelo en los requerimientos de las normas federales para el uso y disposici6n de lodos residuales, 40 CFR Parte 503. Federaci6n Ambiental del Agua. EUA pp. 62). 8.44 US EPA/625IR921013 1992, Environmental Regulation and Technology, Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge pp. 152. (Tecnologfa y Regulaci6n Ambiental. Control de pat6genos y atracci6n de vectores en lodos residuales). 9. Observancia de esta Norma 9.1 La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana corresponde a la Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales, por conducto de la Procuradurfa Federal de Protecci6n al Ambiente, asf coma a los gobiernos estatales, municipales y del Distrito Federal, en el ambito de sus respectivas competencias. Las violaciones a la misma se sancionaran en los terminos de la Ley General del Equilibria Ecol6gico y la Protecci6n al Ambiente, sus reglamentos y demas ordenamientos jurfdicos aplicables. La Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales, por conducto de la Procuradurfa Federal de Protecci6n al Ambiente, asf coma los gobiernos estatales, municipales y del Distrito Federal, en el ambito de su respectiva competencia, llevaran a cabo de manera peri6dica o aleatoria los muestreos y analisis de los lodos y bios6Iidos, con objeto de verificar el cumplimiento de los lfmites maximos permisibles de contaminantes establecidos en la presente Norma Oficial Mexicana. TRANSITORIOS PRIMERO.- La presente Norma Oficial Mexicana entrara en vigor a los 60 dfas posteriores al de su publicaci6n en el Diario Oficial de la Federaci6n. SEGUNDO.- Con fundamento en lo dispuesto en el artfculo 47 fracci6n IV de la Ley Federal sabre Metrologfa y Normalizaci6n, provease la publicaci6n de este proyecto en el Diario Oficial de la Federaci6n. Mexico, Distrito Federal, a los quince dfas del mes de abril de dos mil tres .- El Subsecretario de Fomento y Normatividad Ambiental de la Secretarfa de Media Ambiente y Recursos Naturales, y Presidente del Comite Consultivo Nacional de Normalizaci6n de Media Ambiente y Recursos Natural es, Cassio Luiselli Fernandez. Rubrica. ANEXOI OPCIONES PARA LA REDUCCION DE ATRACCION DE VECTORES Los responsables podran aplicar cualquiera de las siguientes opciones para el control de atracci6n de vectores o cualquier otra que se demuestre que es efectiva. Opci6n 1: Reducci6n en el contenido de s61idos volatiles La atracci6n de vectores se reduce si la masa de s6Iidos volatiles en los bios6Iidos es reducida por lo menos un 38% durante su tratamiento. Este porcentaje es equivalente al conseguido mediante digestion aer6bica o anaer6bica mas alguna reducci6n adicional que ocurra despues de que los bios6Iidos salen de las instalaciones de estabilizaci6n, tales coma el procesamiento en lechos de secado o lagunas o mediante el composteo. Opci6n 2: Digestion adicional de los bios61idos digeridos anaer6bicamente 28 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Frecuentemente, los biosolidos han sido reciclados a traves del tratamiento biologico de las aguas residuales o han transitado durante largos periodos por los sistemas de alcantarillado. Durante este tiempo, sufren una degradacion biologica sustancial. Si los biosolidos son subsecuentemente tratados mediante digestion anaerobia, su atraccion de vectores sera reducida adecuadamente. Debido a que ingresan al digestor parcialmente estabilizados, la reduccion de solidos volatiles despues del tratamiento frecuentemente es menor de 38%. Baja estas circunstancias, pudiera no ser factible la reduccion de 38% requerida en la opcion 1. La opcion 2 permite al operador demostrar la reduccion de atraccion de vectores probando una porcion de los biosolidos previamente digeridos en una unidad a escala de laboratorio. Se demuestra la reduccion, si despues de la digestion anaerobia de los biosolidos por 40 dfas adicionales, a una temperatura entre 30°C y 37°C, la reduccion de los solidos volatiles en los biosolidos es menor de 17%. Opci6n 3: Digestion adicional de los bios61idos digeridos aer6bicamente Esta opcion es apropiada para los biosolidos digeridos aerobicamente que no pueden cumplir con la opcion 1, incluye a aquellos producidos por plantas de aireacion extendida donde el tiempo mfnimo de residencia para los biosolidos en el tren de aguas generalmente excede de 20 dfas. En estos casos, los biosolidos ya estaran sustancialmente degradados antes de la digestion aerobia. Baja esta opcion, se considera que los biosolidos digeridos aerobicamente con 2% de solidos o menos, han logrado la reduccion de atraccion de vectores si despues de 30 dfas de digestion aerobia en una prueba de laboratorio a 20°C, la reduccion de los solidos volatiles es menor de 15%. Esta prueba solamente es aplicable a los biosolidos lfquidos digeridos aerobicamente. Opci6n 4: Procesos aerobics a mas de 40°C Esta opcion se aplica primordialmente a los biosolidos composteados que tambien contienen agentes abultadores organicos parcialmente descompuestos. Los biosolidos deben ser tratados aerobicamente por 14 dfas o mas, tiempo durante el cual la temperatura debera rebasar siempre los 40°C y el promedio sera mayor de 45°C. Esta opcion pudiera aplicarse a otros procesos aerobicos, tales coma la digestion aerobica, sin embargo, las opciones 3 y 4 parecen mas faciles de cumplir para los otros procesos aerobicos. Opci6n 5: Adici6n de materia alcalina Se considera que los biosolidos reducen adecuadamente su atraccion de vectores si se adiciona suficiente materia alcalina para lograr lo siguiente: ♦ Elevar el pH por lo menos hasta 12, medido a 25°C, y sin ariadir mas materia alcalina, mantenerlo por 2 horas, y ♦ Mantener un pH de al menos 11,5 sin la adicion de mas materia alcalina durante otras 22 horas. Estas condiciones tienen la intencion de asegurar que los biosolidos puedan ser almacenados por lo menos durante varios dfas en las instalaciones de tratamiento, transportados y posteriormente aplicados sin que el pH descienda a niveles en los que ocurre la putrefaccion y se atraen vectores. Opci6n 6: Reducci6n en la humedad de bios61idos que no contienen s61idos sin estabilizar Se considera que la atraccion de vectores se reduce si los biosolidos no contienen solidos sin estabilizar generados durante el tratamiento primario y su contenido de solidos es por lo menos del 75% antes de ser mezclados con otros material es. Por consiguiente, la reduccion debe lograrse removiendo agua y no mediante la adicion de materiales inertes. Es importante que los biosolidos no contengan solidos sin estabilizar porque los desechos de comida parcialmente degradados que seguramente existen en tales biosolidos atraerfan a pajaros, algunos mamfferos y posiblemente a insectos aun si el contenido de solidos es mayor del 75%. Opci6n 7: Reducci6n en la humedad de bios61idos que contienen s61idos no estabilizados Se considera que la habilidad para atraer vectores de cualesquier biosolido se reduce adecuadamente si su contenido de solidos se incrementa al 90% o mas sin importar si se trata de biosolidos provenientes del tratamiento primario. El incremento debe conseguirse removiendo agua y no mediante la dilucion con solidos inertes. El secado hasta este punto limita severamente la actividad biologica y destroza o descompone los compuestos volatiles que atraen vectores. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 29 La manera en que se manejan los biosolidos secos, incluyendo su almacenamiento antes de la aplicacion puede propi ciar la atraccion de vectores. Si estos se exponen a una humedad alta, la superficie exterior tendra un alto contenido de humedad y posiblemente atraera vectores. Esto debe ser prevenido adecuadamente. Opci6n 8: Tasa especifica de absorci6n de oxigeno (TEAO) para bios6Iidos digeridos aer6bicamente Frecuentemente, los biosolidos digeridos aerobicamente son circulados a traves de los procesos biologicos de tratamiento aerobico de las aguas residuales hasta por 30 dfas. En estos casos, los biosolidos que entran al digestor aerobico ya estan parcialmente digeridos, lo cual dificulta cumplir con la Opcion 1. La Tasa Especffica de Absorcion de Oxfgeno (TEAO) es la masa de oxfgeno consumida por unidad de tiempo y por unidad de masa en peso seco de los solidos totales de los biosolidos. La reduccion en la atraccion de vectores puede demostrarse si la TEAO de los biosolidos que son aplicados, determinada a 20°C, es igual o me nor de 1,5 mg de O2/h/g de solidos total es (peso seco). Esta prueba se basa en el hecho de que, si los biosolidos consumen muy poco oxfgeno, su valor coma fuente alimenticia para los microorganismos es muy baja coma para atraerlos. Se pueden utilizar otras temperaturas para la prueba si los resultados se corrigen sabre la base de 20°C. Esta prueba solamente es aplicable a los biosolidos aerobicos. Opci6n 9: lncorporaci6n de bios6Iidos al suelo Los biosolidos deben ser incorporados al suelo dentro de las 6 horas posteriores a su aplicacion sabre el terreno. La incorporacion se consigue arando o medi ante al gun otro metodo que mezcle los biosolidos con el suelo. Si los biosolidos son Clase A con respecto a patogenos, el tiempo entre la aplicacion y el procesado no debe exceder de 8 horas. ANEXOII METODOS DE MUESTREO DE LODOS Y BIOSOLIDOS Consiste en o btener una porcion del volumen generado, la cual debe conservar la integridad de todos sus constituyentes desde el momenta en que es tomada la muestra (parte representativa de un universo o poblacion finita obtenida para conocer sus caracterfsticas) y hasta el final de su analisis o determinacion en el laboratorio. El tiempo en que estas permanecen estables dependera de sus caracterfsticas y metodo de preservacion utilizado. El muestreo constituye una parte integral y fundamental para evaluar la calidad de los lodos y biosolidos, para su deposito final. El tamario y numero de muestras dependen de las fuentes generadoras, asf coma de los procesos utilizados para su estabilizacion. Es importante considerar la seleccion del sitio de muestreo, la homogeneidad y representatividad de la muestra, el grado de degradacion, el volumen, tipo de analisis y la accesibilidad al sitio seleccionado para el muestreo. 1. Metodo Obtener muestras representativas de lodos y biosolidos para determinar su contenido de Coliformes fecal es, Salmonella spp., huevos de helmintos, tasa especffica de absorcion de oxfgeno, contenido de solidos totales y solidos volatiles, arsenico, cadmio, cromo, cobre, plomo, mercurio, nfquel y zinc. 1.1 Equipoy materiales Solo se relacionan los equipos y material es que son de relevancia para el presente metodo. 1.1.1 Equipo. 1.1.1.1 Bascula con capacidad minima de 100 kg y precision de 10 g. 1.1.1.2 Bascula con capacidad minima de 10 kg y precision de 1 g. 1.1.1.3 Criba M 2.00 segun Norma Mexicana NMX-B-231-1990. 1.1.2 Materiales. 1.1.2.1 Bieldos. 1.1.2.2 Balsas de polietileno de 0,70 m x 0,50 my calibre minima del No. 200. 30 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 1.1.2.3 Balsas de polietileno de 1, 10 m x 0,90 my calibre mfnimo del No. 200. 1.1.2.4 Batas de hule. 1.1.2.5 Broch a de tamario adecuado para la limpieza. 1.1.2.6 Cascos de seguridad. 1.1.2. 7 Esco bas. 1.1.2.8 Guantes de carnaza. 1.1.2.9 Ligas de hule de 1,5 mm de ancho. 1.1.2.10 Marcadores de tinta permanente, preferentemente color negro. 1.1.2.11 Mascarillas protectoras. 1.1.2.12 Overoles. 1.1.2.13 Papelerfa y varios (formatos de muestreo, lapices, gomas y otros). 1.1.2.14 Papelerfa y varios (informe de campo, marcadores, ligas, etc.). 1.1.2.15 Palas curvas. 1.1.2.16 Recogedores. 1.1.2.17 Tablas de inventario, tamario carta u oficio. 1.1.2.18 Tambos metalicos de forma cilfndrica, con capacidad de 20 L. 1.1.2.19 Balsas de polietileno esteril sin pastilla de tiosulfato o recipientes de polietileno o propileno inerte, de boca ancha y con tapa y cierre hermetico, de 500 ml de capacidad y sus ceptibles de ser esterilizados en autoclave, para coliform es fecales. 1.1.2.20 Recipientes de polietileno o propileno inerte o de vidrio, de boca ancha y con tapa y cierre hermetico, de 50 ml, para metales. 1.1.2.21 Recipientes de polietileno o propileno inerte, de boca ancha y con tapa y cierre hermetico, de 500 ml de capacidad, para huevos de helmintos, s6Iidos y TEAO. 2. Tipos de lodes 2.1. Muestras lfquidas o semis6Iidas Colectar la muestra directamente del vertedor en un recipiente de plastico de 20 L, hasta obtener el doble del volumen por utilizar para cada uno de los analisis por realizar, coma mfnimo. 2.1.1 Tuberfas Colectar la muestra directamente de la tuberfa a traves del grifo de purga que presente un diametro interno mfnimo de 3,8 cm. 2.1.2 Canales Colectar la muestra en el vertedor o en otro punto donde el lodo este bien mezclado. 2.1.3 Digestores Colectar la muestra de un tanque mezclado que es alimentado a traves de lfneas provenientes de diferentes niveles en el digestor. Antes del muestreo asegurarse de eliminar el lodo acumulado previamente en las lfneas. 2.1.4 Tanques Mezclar completamente el tanque y colectar varias muestras a diferentes profundidades y puntos. Juntar todas las muestras en una sola antes de realizar el analisis. 2.1.5 Lodos de sitios especfficos en plantas de tratamiento Los siguientes puntos de muestreo se recomiendan para el muestreo de lodo en plantas de tratamiento de agua residual. 2.1.6 Lado primario Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 31 Conducir el lodo desde el tanque de estabilizacion hasta el carcamo antes del bombeo, mezclar perfectamente y colectar una muestra representativa en este punto. Alternativamente colectar muestras de la bomba de lodos y de las tuberfas, cercanas a estas. 2.1. 7 Lodo activado Colectar muestras en: a) carcamo de bombeo b) de la bomba o tuberfa adyacente c) del punto de descarga de los lodos de retorno al afluente primario El punto de muestreo se debe localizar en una region de buena agitacion para la suspension de solidos. 2.1.8 Lado digerido Colectar muestras en la tuberfa de descarga del digestor al equipo o lechos de secado. 2.1.9 Lodos del lecho de secado Colectar muestras del mismo tamario en diferentes puntos del I echo sin incluir arena. Mezclar totalmente. 2.1.10 Lado filtrado Colectar porciones del mismo tamario (utilizar cortadores de galletas) en la descarga del filtro. 2.1.11 Azolves Para el caso de los azolves, aplica cuando ha sido extrafda una muestra representativa de la zona donde se encuentran depositados. 2.2 Muestras solidas Para conformar las muestras se usa el metodo del cuarteo. Para eso: Se toman de 4 a 8 balsas de polietileno de 0,70 m x 0,50 mo 1,10 m x 0,90 m, se selecciona al azar el mismo numero de sitios diferentes. Posteriormente, se llena cada una de las balsas con el material de cada sitio y se trasladan a un area plana horizontal de aproximadamente 4 m x 4 m, preferentemente de cementa pulido o similar y bajo techo y se deposita su contenido en montfculo. Traspalear el material con pala o bieldo, para obtener una mezcla homogenea. A continuacion, dividir en cuatro partes aproximadamente iguales A, B, C y D y eliminar las partes opuestas A y C o By D. Repetir esta operacion hasta dejar 10 kg aproximadamente de lodo o biosolido. La pila resultante sirve para determinar en el laboratorio el contenido de Coliformes fecales, Salmonella ssp., huevos de helmintos, contenido de solidos totales y solidos volatiles, arsenico, cadmio, cromo, cobre, plomo, mercurio, nfquel y zinc. El material restante se usa para determinar el peso volumetrico de los lodos in situ, conforme al punto 8. Trasladar la muestra al laboratorio en balsas de polietileno debidamente selladas e identificadas (vease marcado). Evitar que queden expuestas al sol durante su transporte, ademas tener cuidado en el manejo de la balsa que contiene la muestra para que no sufra ninguna ruptura. El tiempo maxima de transporte de la muestra al laboratorio, no debe exceder de 8 horas. 3. Preparaci6n de la muestra La secuencia del muestreo por parametro se debe realizar conforme con lo descrito en los puntos correspondiente con el proposito de minimizar sesgos en los resultados. 4. Recipientes para cada parametro A la muestra, antes de ser procesada, se le determinara el contenido de solidos totales en por ciento en peso, para el caso del TEAO el contenido de estos debera ser menor o igual al 2%. 4.1 Coliformes fecales y Salmonella spp. Los recipientes de polietileno o polipropileno inerte de 500 ml de capacidad, antes del muestreo deben ser esterilizados preferentemente en autoclave. Posteriormente, se deposita la muestra que corresponda a 4 g de solidos totales. Etiquetarlo y mantenerlo en refrigeracion hasta su analisis. 32 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 4.2 Huevos de helmintos, S61idos totales y S61idos volatiles y TEAO Los recipientes de polietileno o polipropileno inerte de 500 ml de capacidad, antes de la toma de muestra deben ser enjuagados primero con agua potable a chorro y luego con agua destilada. Para el caso de huevos de helmintos, se toma el peso en fresco que corresponda a 2 g de s61idos totales. Para el caso de s61idos totales y volatiles y TEAO se llenan los recipientes hasta un 75% de su capacidad total, se cierran, etiquetan y mantienen en refrigeraci6n, hasta su analisis, excepto para TEAO que se mantiene a temperatura ambiente. 4.3 Compuestos inorganicos: arsenico, cadmio, cobre, cromo, mercurio, nfquel, plomo y zinc El recipiente de polietileno o polipropileno inerte de vidrio de 50 ml de capacidad, antes de la toma de muestra se debe enjuagar primero con agua potable a chorro y luego destilada. Posteriormente, se deposita la muestra hasta el total de la capacidad, se cierra, se etiqueta y se mantiene en refrigeraci6n hasta su analisis. 4.4 Preservaci6n y almacenamiento de la muestra La preservaci6n y tiempo maxi mo para el analisis de cada uno de los parametros es la siguiente: PARAMETROS PRESERVACION * TIEMPO MAXIMO DE ANALISIS Coliformes fecales y Salmonella spp. 4°c 48 horas Huevos de helmintos 4°c 30 dfas Arsenico, cadmio, cobre, cromo, nfquel, plomo y zinc 4°c 180 dfas Mercurio 4°c 13 dfas 3 (plastico) 38 dfas b (vidrio) S61idos totales 4°c 24 horas S61idos volatiles 4°c 24 horas Tasa especffica de absorci6n de oxfgeno ** No requiere lnmediato *A partir de su toma y hasta antes de iniciar el analisis, la muestra debe mantenerse en refrigeraci6n. **Si la muestra es tomada en el laboratorio, debe mantenerse la temperatura constante o ambiente durante el transporte y analizarla inmediatamente. 5. Control de calidad El programa de muestreo debe operar un sistema control de la calidad. 5.1 El responsable del muestreo debe mantener los registros de los nombres y tftulos de los tecnicos que realizaron el muestreo y el del encargado de control de calidad que verific6 los mismos y las bitacoras o formatos en los que se contengan cuando menos la siguiente informaci6n: a) ldentificaci6n de la muestra. b) Cantidad de muestra utilizada. c) Tipo de muestra. d) Tipo de analisis a realizar. e) Ademas, debe mantener la informaci6n original reportada por el personal tecnico que intervino en el muestreo, traslado y recepci6n de las muestras, asf coma de la informaci6n complementaria. 6. Etiquetado La muestra se identifica con una etiqueta, la cual debe contener la siguiente informaci6n: • Localidad, Municipio y Estado. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL • Fecha y hara del cuarteo. • Condiciones climatol6gicas. • Cantidad de lodos tom ados para el cuarteo, en kg. • Cantidad de lodos obtenidos para la selecci6n en subproductos, en kg. • Datos del responsable del cuarteo. • Observaciones. 7. Calculos 33 7.1 Para determinar el peso volumetrico del lodo se utilizan recipientes limpios, sin abolladuras. La bascula empleada debera estar nivelada. 7.2 A continuaci6n se pesa el recipiente vacfo, tomando este peso coma la tara del recipiente. Se llena hasta el tape con el lodo homogeneizado obtenido de las partes eliminadas del primer cuarteo ( descrito anteriormente). 7.3 El recipiente se golpea contra el suelo tres veces dejandolo caer desde una altura de 10 cm. Llenar hasta el tape teniendo cuidado de no presionar al colocarlo en el recipiente; esto con el fin de no alterar el peso volumetrico que se pretende determinar. 7.4 Es importante vaciar dentro del recipiente todo el material, sin descartar los finos. Para obtener el peso neto del lodo, se pesa el recipiente con estos y se resta el valor de la tara. Cuando no se tenga suficiente cantidad de material para llenar el recipiente se marca en este la altura alcanzada y se determina dicho volumen. El peso volumetrico del lodo se cal cul a mediante la siguiente formula: Pv= 1Jv don de: Pv: Peso volumetrico del lodo, en kg/m 3 P: Peso del lodo (peso bruto me nos tara), en kg V: Vol um en del recipiente, en m 3 8. lnterferencias (1) Colectar las muestras en el momenta cuando el parametro a analizar es inestable, por ejemplo la Tasa Especffica de Absorci6n de Oxfgeno (TEAO), o cuando se requiere realizar lo antes posible el analisis (por ejemplo el analisis microbiol6gico). ANEXOIII METODO PARA LA CUANTIFICACION DE COLIFORMES FECALES EN LODOS Y BIOSOLIDOS El presente metodo establece la tecnica para llevar a cabo la cuantificaci6n del grupo coliformes fecal es en lodos y bios61idos, con el fin de evaluar la calidad y la eficiencia de los diferentes tratamientos, y es aplicable para la evaluaci6n de la calidad de lodos y bios61idos. 1. Principios del metodo Este metodo de analisis se basa en que: 1.1 Las bacterias presentes en una muestra pueden ser separadas por agitaci6n, dando por resultado una suspension de celulas bacterianas, uniformemente distribuidas. 1.2 A traves de diluciones suces ivas de la muestra se obtienen in6culos de, al menos, una celula para obtener crecimiento en el media de cultivo (tubas positivos), y otros que al sembrarse dan resultado en por lo menos, un tuba de la serie. 1.3 La combinaci6n de resultados positivos y negativos permite realizar una estimaci6n de la densidad bacteriana por media de calculos de probabilidad. 1.4 La tecnica seleccionada permite el estudio de un volumen de muestra suficiente para obtener resultados significativos, considerando la alta turbidez que la muestra pudiera presentar a causa de la gran 34 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 cantidad de material acumulado. En caso de aplicar tecnicas coma filtro de membrana se correrfa el riesgo de un calculo de coliform es fecal es inferior al real. 2. Muestreo, preparaci6n y acondicionamiento de la muestra El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluaci6n de calidad de lodo. 2.1 La muestra debera ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y previamente esterilizados. 2.2 Las muestras deben ser colocadas en hieleras con balsas refrigerantes o hielo inmediatamente despues de su tom a. 2.3 Los tiempos de conservaci6n en refrigeraci6n y transporte deben reducirse al mfnimo. 2.4 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinara el contenido de s6Iidos totales (ST) en por ciento en peso y posteriormente se obtendra el peso en fresco que corresponda a 4 g de ST. 2.5 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeraci6n y no transcurrir mas de 48 horas. 3. Reactivos y materiales 3.1. Reactivos 3.1.1 Alcohol etflico. 3.1.2 Cal do lauril-triptosa con purpura de bromocresol (C. L.T.). 3.1.3 Caldo lactosado con purpura de bromocresol (C.L.). 3.1.4 Media EC. 3.1.5 Fosfato monopotasico. 3.1.6 Cloruro de magnesia. 3.1.7 Hidr6xido de sodio. 3.1.8 Agua destilada. 3.2 Materiales 3.2.1 Asa de inoculaci6n. 3.2.2 Barras magneticas. 3.2.3 Bulba de goma. 3.2.4 Espatula. 3.2.5 Frascos de 500 ml de capacidad con tapa de cierre hermetico, boca ancha y con capacidad de esterilizaci6n en autoclave. 3.2.6 Gradillas y canastillas de acero inoxidable. 3.2.7 Guantes de latex. 3.2.8 Mechero de Bunsen, lam para de alcohol o similar. 3.2.9 Pipetas graduadas de vidrio de 1,5 y 10 ml. 3.2.10 Portapipeteros de acero inoxidable. 3.2.11 Tapabocas. 3.2.12 Tapanes de acero inoxidable para tubas de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm ode 12 mm x 120 mm). 3.2.13 Tubas de Durham (7 mm x 4,5 mm ode 5 mm x 4 mm). 3.2.14 Tubas de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o 12 mm x 120 mm). 3.2.15 Tubas de rosca (13 mm x 100 mm). 4. Aparatos e instrumentos Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 4.1 Autoclave a una presi6n de 1,05 kg/cm 2 y una temperatura de 121 °C. 4.2 Balanza analftica con intervalo de medici6n de 0,0001 a 10,00 g. 4.3 Balanza granataria con intervalo de medici6n de 0, 1 a 100 g. 4.4 Bario de agua (con agitaci6n) con capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C. 4.5 Estufa de esterilizaci6n con capacidad para medir temperatura de 170°C± 10°C. 4.6 I ncubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C. 4.7 Parrilla con agitaci6n y calentamiento. 4.8 Potenci6metro con intervalo de medici6n de 6,9°C ± 0,2°C. 4.9 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura entre 2 y 4°C ± 0,2°C. 5. Procedimiento 35 Los puntos siguientes describen la secue ncia del metodo de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos. 5.1 Preparaci6n de medias de cultivo y soluciones 5.1.1 Cal do lauril-triptosa con purpura de bromocresol (C. L.T.). Formula Triptosa 20,00 g Lactosa 05,00 g Fosfato dipotasico (K2HPO 4) 02,75 g Fosfato monopotasico(KH2 PO4) 02,75 g Cloruro de sodio(NaCI) 05,00 g Lauril sulfato de sodio 00, 10 g Purpura de bromocresol 00,01 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver los ingredientes o 35,6 g del media que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y 0,01 g de purpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitaci6n, en 1 L de agua destilada. Verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Distribuir en volumenes de 10 ml en tubas de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. El volumen final no debe variar mas de 0, 1 ml. El media ya una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo, durante no mas de una semana. 5.1.2 Caldo lactosado con purpura de bromocresol (C.L.). Formula Extracto de carne 06,00 g Peptona 10,00g Lactosa 10,00g Purpura de bromocresol 0,01 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver los ingredientes o 13,0 g del media C.L. que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y 0,01 g de purpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitaci6n, en 1 L de agua destil ada. 36 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N. Distribuir volumenes de 10 ml del media en tubas de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. El volumen final no debe variar mas de 0, 1 ml. El media ya una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo, durante no mas de una semana. 5.1.3 Media lfquido A-1 Formula Lactosa 5,00 g Triptosa 20,00 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g Salicina 0,50 g Eter p-isooctilfenil de polietilenglicol (Triton X-100 y Haas, o equivalente) 01,00 ml Agua destilada 1 000,00 ml Calentar hasta la disolucion de los ingredientes solidos. Ariadir el eter p-isooctifenil de polietilenglicol. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0, 1, en caso contrario ajustar con una solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N. Distribuir volumenes de 10 ml en tubas de ensayo con campana de Durham, tapar con tapones de aluminio. Esteriliza r en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. Este media se debe conservar en oscuridad a temperatura ambiente durante no mas de 7 dfas. 5.1.4 Media EC Formula Triptosa o tripticasa 20,00 g Lactosa 05,00 g Mezcla de sales biliares 1,50 g Fosfato dipotasico (K2HPO4) 4,00 g Fosfato monopotasico (KH2 PO4) 1,50 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver los ingredientes o 37,0 g del media EC que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, con la ayuda de una parrill a de agitacion, en 1 L de agua destilada. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N. Distribuir volumenes de 10 ml del media en tubas de ensayo, conteniendo en su interior tubas de Durham invertidos, tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. El volumen final no debe variar mas de 0, 1 ml. El media ya preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo, durante no mas de una semana. 5.1.5 Solucion madre de tampon A Formula Fosfato monopotasico (KH2PO4) 34,00 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver el fosfato monopotasico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solucion de hidroxido de sodio 1 Ny aforar a 1 L de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 °C, durante 15 minutos y Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 37 almacenar en refrigeracion (entre 2 y 4°C). La solucion es estable durante meses. Desechar cuando se observe turbiedad. 5.1.6 Solucion madre de tampon B Formula Cloruro de magnesia (MgCb .6H2O) 8,10 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver el cloruro de sodio de magnesia en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada, posteriormente esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Almacenar en refrigeracion (entre 2 y 4°C). La solucion es estable durante meses, desechar cuando haya turbiedad. Solucion tampon de fosfatos (agua de dilucion). 5.1.7 Adicionar 1,25 ml de la solucion madre de tampon A y 5 ml de la solucion madre de tampon By aforar a 1 L con agua destilada. Distribuir volumenes de 9,2 ml y 36 ml en tubas de rosca y frascos con tapa de cierre hermetico, respectivamente. Esterilizar en autoclave a 121 °C, durante 15 minutos y almacenar a temperatura ambiente. 5.1.8 Solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N Formula Hidroxido de sodio (NaOH) 04,00 g Agua recien destilada 1 000,00 ml Preparacion: Pesar 4,0 g de hidroxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recien destilada y libre de CO2 para abatir la carbonatacion de la solucion. Almacenar en frasco con tapon de rosca. 5.1.9 Solucion de hidroxido de sodio 1 N Formula Hidroxido de sodio (NaOH) 40,00 g Agua recien destilada 1 000,00 ml Preparacion: Pesar 40 g de hidroxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recien destilada y libre de C~ para abatir la carbonatacion de la solucion. Almacenar en frasco con tapon de rosca. 5.2 Calibracion de aparatos Todos los equipos utilizados deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante o bien contra equipos certificados. 5.3 Seguridad Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de latex y cubrebocas, para evitar cualquier riesgo de infeccion. Se debe lavar y desinfectar el area de trabajo, asf coma el material utilizado por el analista, antes y despuesdelensayo. 5.4 Manejo de residuos Todos los residuos de la muestra analizada y sobrantes seran esterilizados en autoclave antes de su desecho. 38 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 5.5 Preparaci6n de la muestra a) Suspender X g de materia fresca que correspondan a 4 g de s6Iidos totales en 36 ml de agua de diluci6n y asf obtener una diluci6n de 10-1. b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitaci6n, a velocidad baja (800 rpm), hasta la completa disoluci6n. 5.6 Preparaci6n de diluciones Por el origen de las muestras se requieren in6culos menores a 1 ml, utilizando diluciones seriadas de submultiplos de 10. a) Se preparan diluciones decimal es seriadas a partir del homogeneizado resultante (10-1) lo antes posible, reduciendo al mfnimo la sedimentaci6n. Transferir 1 ml en 9 ml de agua de diluci6n (10-2) y asf sucesivamente hasta obtener la diluci6n deseada. b) Cada diluci6n debe ser homogeneizada perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos, hacienda un area con la murieca de 30 cm de arriba abajo o con un sistema de agitaci6n que proporcione resultados equivalentes. Es importante efectuar la agitaci6n siempre de la misma manera, para obtener resultados com parables. c) Se debe utilizar una pipeta esteril diferente, para cada una de las diluciones decimales subsecuentes. Para aforar el lfquido de la pipeta, debera aplicarse la punta de esta en el interior del cuello manteniendola en posici6n vertical, inclinando el tuba. Nunca se debe introducir, a la muestra, mas de la tercera parte de la pipeta. d) Si una muestra o un late de muestras va a ser analizado por primera vez, utilizar al menos cuatro series de tres (o cinco) tubas cada una, posteriormente tres series de tres tubas seran suficientes. 5.7 Determinaci6n de coliformes fecales 5.7.1 Prueba directa (media A-1) La prueba directa del media lfquido A-1 es un metodo de un solo paso que no requiere confirmaci6n. Sin embargo, su uso representa un mayor costo ya que este media no se encuentra en forma deshidratada, siendo necesario prepararlo a parti r de sus ingredientes basicos. a) Adicionar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubas conteniendo lfquido A-1 corrdctamente etiquetados. lncubar durante 3 horas a 35 ± 0,5° C. b) Una vez transcurrido el tiempo los tubas se transfieren a un bario de agua a una temperatura de 44,5 ± 0,2°C y se incuban durante otras 21 ± 2 horas. c) La presencia de gas en cualquier cultivo en media A-1 a las 24 horas o menos de incubaci6n es una reacci6n positiva que indica la existencia de coliformes de origen fecal. 5.7.2 Prueba indirecta 5.7.2.1 Prueba presuntiva (caldo lauril-triptosa o caldo lactosado) a) Transferir 1 ml de las diluciones seleccionadas a cada una de las series de tubas correspondientes conteniendo el caldo lauril o caldo lactosado e incubar a 35 ± 0,5°C. b) Examinar cada tuba a las 24 ± 2 horas. La acidificaci6n, con o sin producci6n de gas (cambio de coloraci6n de purpura a amarillo), a partir de la fermentaci6n de la lactosa en el media de cultivo, indica una prueba presuntiva JDSitiva de la presencia de bacterias del grupo coliformes. En caso contrario reincubar durante otras 24 horas mas. c) La acidificaci6n del media, con o sin formaci6n de gas dentro de las 48 ± 3 horas, constituye una prueba presuntiva positiva. Cuando no existe acidificaci6n del media, constituye una prueba. 5.7.2.2 Prueba confirmativa flama del (media EC) a) Los tubas positivos de la prueba presuntiva se resiembran por triple asada ( esterilizada al mechero y enfriada) en tubas de fermentaci6n presuntiva negativa que contengan caldo EC e incubados a 44,5 ± 0,2°C en bario de agua. b) Examinar cada tuba a las 24 ± 2 horas. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 39 c) El resultado sera positivo cuando haya producci6n de gas a partir de la fermentaci6n de la lactosa contenida en el media EC. Los tubas sin formaci6n de gas se desechan. 6. Calculos 6.1. El NMP de coliformes fecales se obtiene a partir del c6digo compuesto por los tubas con resultado positivo en el media EC o en A1. Si se inoculan tres series de tres tubas y se utilizan volumenes decimal es diferentes a los indicados en la tabla, se obtiene el c6digo formado por el numero de tubas con resultados positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a traves de la siguiente formula: NMP=(NMP de tablas) X (10/mayor volumen inoculado) ( 1) Por ejemplo: en media EC se obtuvo el c6digo 3/3 para la serie de la diluci6n 0,01; 2/3 para la serie de la diluci6n 0,001 y 1/3 para la serie de la diluci6n 0,0001. 6.2 El c6digo es de 3, 2, 1; el fndice de coliform es en tabla es de 150, por lo que el resultado es: NMP/g ST= (150) x (10/0,01) = 150 000 NMP/g ST=1,5 x 10 5 coliform es fecal es (2) (3) 6.3 Cuando se inoculan mas de tres volumenes decimales, para la composici6n del c6digo se utilizan los resultados positivos corresJX)ndientes a tres series consecutivas inoculadas. 6.4 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubas multiples son omitidos de las tablas del NMP. Asf los c6digos coma 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junta con muchos otros, no estan incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con una frecuencia mayor de 1 %, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el c6digo del NMP no aparezca en tablas, se utilizara la siguiente formula: NMP = (Numero de tubas positivos x 100)/ ✓ [(ml muestra tubas neg.) x (ml muestra total)] (4) La frecuencia de obtenci6n de resultados que nose encuentren en las tablas debe ser baja ( < 1 %), de otra forma se tendra que revisar y confirmar el procedimiento de la prueba. 7. Expresi6n de resultados 7.1. La densidad de los coliformes fecales se expresa coma NMP de coliformes por g de materia seca o ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los If mites de confianza al 95% para cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubas positivos posibles. Para su utilizaci6n se proporcionan c6digos formados por tres algoritmos correspondientes al numero re tubas con resultados positivos en tres series consecutivas. 7.2. lnterferencias La posible presencia de otras bacterias que producen acido a partir de lactosa, lo que se elimina en la prueba confirmativa a la temperatura de 44,5°C. Es importante que los tubas de Durham colocados en los tubas de fermentaci6n, una vez preparados y esterilizados, no presenten aire en su interior. En caso contrario se pueden obtener resultados positivos falsos. 8. lnforme de prueba El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos: a) Todos los datos necesarios para la identificaci6n completa de la muestra; b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8, y c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del analisis, asf coma cualquier operaci6n no especificada en el metodo, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados. ANEXOIV METODO PARA LA CUANTIFICACION DE Salmonella spp. EN LODOS Y BIOSOLIDOS 40 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 El presente metodo establece la tecnica para llevar a cabo la cuantificacion de Salmonella spp. mediante la tecnica de tubas multiples o numero mas probable (NMP) en lodos y biosolidos, con el fin de evaluar su calidad y la eficiencia de los tratamientos de los mismos. Este metodo es aplicable para la evaluacion de la calidad de los lodos y biosolidos. 1. Principia Este metodo de analisis se basa en los siguientes principios: 1.1 A partir de un enriquecimiento con medias selectivos, que contienen sustancias inhibidoras, se favorece la multiplicacion de Salmonella spp., reconstituyendo a su vez la vitalidad de las celulas dariadas y, de igual forma, impidiendo el desarrollo de bacterias coliformes asociadas. 1.2 Una vez realizada la seleccion, las bacterias presentes en una muestra pueden ser separadas por agitacion, dando por resultado una suspension de celulas bacterianas, uniformemente distribuidas, a traves de diluciones sucesivas de la muestra. 1.3 La aplicacion de pruebas bioqufmicas que permiten conocer el perfil bioqufmico de las cepas en estudio para compararlo, con el que generalmente exhiben las cepas del genera Salmonella spp. 2. Muestreo, preparaci6n y acondicionamiento de la muestra El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluacion de calidad del lodo, por lo cual, este debera efectuarse de acuerdo a lo referido en el Anexo II de esta Norma. 2.1 La muestra debera ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y previamente esterilizados. 2.2 Las muestras deben ser colocadas en hieleras con balsas refrigerantes o hielo inmediatamente despues de su tom a. 2.3 Los tiempos de conservacion en refrigeracion y transporte deben reducirse al minima. 2.4 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinara el contenido de solidos totales (ST) en por ciento en peso y posteriormente se obtendra el peso en fresco que corresponda a 4 g de ST. 2.5 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeracion y no transcurrir mas de 48 horas. 3. Reactivos y materiales 3.1 Reactivos 3.1.1 Agar Hierro Lisina (LIA). 3.1.2 Agar Sulfito de Bismuto. 3.1.3 Agar Tri pie Azucar Hierro (TSI ). 3.1.4 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD). 3.1.5 Alcohol etflico. 3.1.6 Caldo de Selenito Cistina. 3.1. 7 Cal do de Tetrationato. 3.1.8 Cloruro de magnesia. 3.1.9 Cristales de yodo. 3.1.10 Fosfato monopotasico. 3.1.11 Solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N. 3.1.12 Solucion de hidroxido de sodio 1 N. 3.1.13 Solucion tampon de fosfatos (agua de dilucion). 3.1.14 Verde brillante. 3.1.15 Yoduro de potasio Viernes 15 de agosto de 2003 3.2 Materiales 3.2.1 Barras magneticas. 3.2.2 Bulba de goma. 3.2.3 Cajas Petri esteriles (100 x 15 mm.). 3.2.4 Espatula. DIARIO OFICIAL 41 3.2.5 Frascos de 100 ml de capacidad con tapa de cierre hermetico y capacidad de esterilizado en autoclave. 3.2.6 Frascos de 1 L de capacidad con tapa de cierre hermetica. 3.2.7 Gradillas y canastillas de acero inoxidable, matraces Erlenmeyer de vidrio, de 1 y 2 L de capacidad. 3.2.8 Guantes de latex. 3.2.9 Matraz aforado de 1 L. 3.2.10 Mechero de Bunsen, lampara de alcohol o similar. 3.2.11 Pipetas graduadas de vidrio de 1, 5 y 10 ml. 3.2.12 Portapipeteros de acero inoxidable. 3.2.13 Tapabocas. 3.2.14 Tapanes de acero inoxidable para tubas de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o 12 mm x 120 mm). 3.2.15 Tubas de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm ode 12 mm x 120 mm). 3.2.16 Tubas de rosca (13 mm x 100 mm). 4. Aparatos e instrumentos 4.1 Autoclave a una presi6n de 1,05 kg/cm 2 , y una temperatura de 121°C. 4.2 Balanza analftica con intervalo de medici6n de 0,000 1 a 10,00 g. 4.3 Balanza granataria con intervalo de medici6n de 0, 1 a 100 g. 4.4 Bario de agua (con agitaci6n) con capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C. 4.5 Estufa u horno con capacidad para operar a una temperatura de 180°C ± 10°C. 4.6 I ncubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C. 4.7 lncubadora con capacidad para operar a una temperatura de 41°C ± 0,2°C. 4.8 Parrilla con agitaci6n y calentamiento. 4.9 Potenci6metro con intervalo de medici6n de 6,5 a 7,5 ± 0,2 pH. 4.10 Refrigerador con capacidad para operar entre 2 y 4°C ± 0,5°C. 5. Procedimiento Los siguientes puntos describen la secuencia del metodo de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos. 5.1 Preparaci6n de medias de cultivo y soluciones 5.1.1 Cal do tetrationato Formula Proteosa peptona o triptona 05,00 g Sales biliares 01,00 g Carbonato de calcio 10,00g Tiosulfato de sodio 30,00 g 42 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 I Agua destilada 1 000,00 ml Disolver los ingredientes o 16 g del media, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en agua destilada y calentar hasta ebullici6n, posteriormente distribuir en volumenes de 100 ml en recipientes esteriles y conservar entre 5 y 8°C. Antes de usar el media, agregar 2 ml de soluci6n de yodo yoduro y 1 ml de soluci6n de verde brillante 1: 1 000 por cada 100 ml de caldo, a cada recipiente. Una vez que la soluci6n de yodo yoduro ha sido adicionada al media, este debera ser utilizado de forma inmediata. Nunca se debe volver a calentar. 5.1.2 Cal do selenito cistina Formula Triptona o polipeptona 05,00 g Lactosa 04,00 g Fosfato dis6dico 10,00g Selenito acido de sodio 04,00 g L- Cistina 00,01 g Agua destilada 1 000,00 ml Preparaci6n: Disolver los ingredientes o 23 g del media, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en agua destilada. Calentar hasta ebullici6n durante 10 minutos en un bario de agua y distribuir en volumenes de 10 ml en tubas de ensayo, para esterilizar 10 minutos por arrastre de vapor. Verificar que el pH sea ce 7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. El media se debe utilizar el mismo dfa de su preparaci6n. 5.1.3 Agar sulfito de bism uto Formula Extracto de carne de res Peptona Glucosa Fosfato dis6dico (anhidro) Sulfato ferroso (anhidro) Sulfito de bismuto Verde brillante Agar 05,00 g 10,00g 05,00 g 04,00 g 00,30 g 08,00 g 00,025 g 20,00 g Agua destilada 1 000,00 ml Suspender los ingredientes o 52 g del media, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada, calentar hasta su disoluci6n com pl eta, agitando frecuentemente. Verificar que el pH sea de 7,6 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Enfriar a 60°C y distribuir en cajas de Petri esteriles. El media no debe esterilizarse en autoclave, el sobrecalentamiento afecta su selectividad. 5.1.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) I F6,mula Xilosa 03,75 g Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 43 L Lisina 05,00 g Lactosa 07,50 g Sacarosa 07,50 g Cloruro de sodio 05,00 g Extracto de levadura 03,00 g Rojo de fenol 00,08 g Agar 15,00g Tiosulfato de sodio 06,80 g Desoxicolato de sodio 02,50 g Citrato de hierro y amonio 00,80 g Agua destilada 1 000,00 ml Suspender los ingredientes o 52 g del media, q..ie se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada. Agitar frecuentemente y dejar que hierva durante 1 minuto, evitar un sobrecalentamiento, si bien, su reacci6n puede ser satisfactoria, las colonias tienden a ser muy pequerias. E3 media nunca se debe esterilizar en autoclave. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Enfriar a no menos de 50°C pero abajo de 60°C y vaciar en cajas Petri esteriles. 5.1.5 Agar verde brillante (VB) Formula Extracto de levadura 03,00 g Proteosa peptona numero 3 polipeptona 10,00g Cloruro de sodio 05,00 g Lactosa 10,00g Sacarosa 10,00g Rojo de fenol 00,08 g Verde brillante 00,0125g Agar 20,00 g Preparaci6n Suspender los ingredientes o lo indicado por el media, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada, mezclar bien y calentar hasta ebullici6n. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0, 1 en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 12 minutos, cualquier sobrecalentamiento del media disminuye su selectividad. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en cajas de Petri esteriles. 5.1.6 Agar S.S. Formula Extracto de carne 05,00 g *Polipeptona 05,00 g Lactosa 10,00g Sales biliares 08,50 g Citrato de sodio 08,50 g 44 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Tiosulfato de sodio 08,05 g Citrato ferrico 01,00 g 13,50 g Verde Verde brillante soluci6n al 0, 1 % 00,33 g Rojo neutro 00,25 g * La pol1peptona se puede sustItuIr por 2,5 gramos de peptona de casefna y 2,5 gramos de peptona de carne. Suspender los ingredientes o 60 g del media que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada y calentar a ebullici6n hasta disoluci6n completa. No esterilizar en autoclave. Posteriormente verificar que el pH sea de 7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en cajas Petri esteriles. 5.1.7 Agar nutritivo** Formula Extracto de carne 03,00 g Peptona 05,00 g Agar 15,00g Agua destilada 1 000,00 ml ** Se puede sustItuIr por agar 1nfus16n cerebro-coraz6n o similar. Suspender los ingredientes en agua, dejar reposar entre 5 y 10 minutos, calentar a ebullici6n hasta su completa disoluci6n, para posteriormente verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N y esterilizar a 121 °C por 15 minutos. Dejar enfriar a no menos de 50°C y debajo de 60°C y distribuir en cajas Petri esteriles. 5.1.8 Agar triple azucar hierro (TSI) Formula Polipeptona 20,00 g Cloruro de sodio 05,00 g Lactosa 10,00g Sacarosa 10,00g Glucosa 01,00 g Sulfato ferroso am6nico 00,20 g Tiosulfato de sodio 00,20 g Rojo de fenol 00,025 g Agar 13,00g Agua destilada 1 000,00 ml Suspender los ingredientes o 65 g del media, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada; mezclar perfectamente y calentar a ebullici6n, agitando ocasionalmente hasta su completa disoluci6n. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una soluci6n de hidr6xido de sodio 0, 1 N. Enfriar a 60°C y distribuir en volumenes de 4 ml en tubas de rosca y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Los tubas se inclinan, de manera que el media de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una parte inclinada de 2 a 3 cm. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 45 5.1.9 Agar hierro lisi na (LIA) Formula Peptona o gelisato 05,00 g Extracto de levadura 03,00 g Glucosa 01,00 g L Lisina 10,00g Citrato ferrico amonico 00,50 g Tiosulfato de sodio 00,04 g Purpura de bromocresol 00,02 g Agua destilada 1 000,00 ml Suspender los componentes o segun indicaciones del media que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada, y calentar hasta ebullicion con agitacion frecuente. Verificar que el pH sea de 6, 7 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en volumenes de 4 ml en tubas de rosca, para esterilizar en presion a 121 °C por 12 minutos. Posteriormente dejar enfriar los tubas en posicion inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de media de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm. 5.1.10 Solucion madre de tampon A Formula Fosfato monopotasico (KH2PO4) 34,00 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver el fosfato monopotasico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solucion de hidroxido de sodio 1 Ny aforar a 1 000 ml con agua destilada y esterilizar en autoclave a una presion de 1,05 kg/cm 2y una temperatura de 121°C, durante 15 minutos. Almacenar en refrigeracion entre 2 y 4°C. La solucion es estable durante meses, pero se debe desechar cuando se observe turbiedad. 5.1.11 Solucion madre de tampon B Formula Cloruro de magnesia (MgCb .6H2O) 81,00 g Agua destilada 1 000,00 ml Disolver el cloruro de magnesia en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Almacenar en refrigeracion entre 2 y 4°C. La solucion es estable durante meses, pero se debe desechar cuando se observe turbiedad. 5.1.12 Solucion tampon de fosfatos (agua de dilucion) Adicionar 1,25 ml de la solucion patron A y 5 ml de I a solucion patron By aforar a 1 L con agua destilada, para distribuir volumenes de 9,2 ml y 36 ml en tubas de rosca y frascos con tapa de cierre hermetico, respectivamente, y esterilizar en autoclave a una presion de 1,05 kg/cm 2 y una temperatura de 121 °C, durante 15 minutos. Almacenar a temperatura ambiente. 5.1.13 Solucion de hidroxido de sodio 0, 1 N Formula Hidroxido de sodio (NaOH) 04,00 g Agua recien destilada 1 000,00 ml Preparacion: 46 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Pesar 4,0 gramos de hidr6xido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recien destilada y libre de C~ para abatir la carbonataci6n de la soluci6n y almacenar en frasco con tap6n de rosca. 5.1.14 Soluci6n de hidr6xido de sodio 1 N Formula Hidr6xido de sodio (NaOH) 40,00 g Agua recien destilada 1 000,00 ml Preparaci6n: Pesar 40,0 gramos de hidr6xido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recien destilada y libre de C~ para abatir la carbonataci6n de la soluci6n, almacenar en frasco con tap6n de rosca. 5.1.15 Soluci6n de yodo yoduro Formula Cristales de yodo 06,00 g Yoduro de potasio 06,00 g Agua destilada 20,00 ml Disolver el yoduro de potasio en el agua destilada y agregar lentamente los cristales de yodo hasta su completa disoluci6n y almacenar en oscuridad. 5.2 Calibraci6n de aparatos Todos los equipos utilizados deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante o bien contra equipos certificados. 5.3 Seguridad Durante el procesado de la muestra se deben utilizar guantes de latex y cubrebocas, para evitar cualquier riesgo de infecci6n. Se debe lavar y desinfectar el area de trabajo, asf coma el material utilizado por el analista, antes y despuesdelensayo. 5.4 Manejo de residuos Todos los residuos de la muestra analizada y sobrantes seran esterilizados en autoclave antes de su desecho. 5.5 Preparaci6n de la muestra a) Suspender X gramos de materia fresca que correspondan a 4 gramos de s61idos totales en 36 ml de agua de diluci6n y asf obtener una diluci6n de 10-1. b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitaci6n, a velocidad baja (800 rpm), hasta la completa disoluci6n. 5.6 Enriquecimiento a) Suspender X g de materia fresca que correspondan a 4 g de s61idos totales en 36 ml de caldo de tetrationato, obteniendo una diluci6n de 10-1. b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con la ayuda de una parrilla de agitaci6n, a baja velocidad (800 rpm) hasta la completa disoluci6n. c) I ncubar durante 22 ± 2 horas a 37°C ± 0,2°C. 5.7 Preparaci6n de diluciones a) Una vez transcurrido el tiempo de incubaci6n, preparar las diluciones decimales seriadas transfiriendo ml de caldo de tetrationato en 9 ml de agua de diluci6n (10-2) y asf sucesivamente hasta obtener la diluci6n deseada. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 47 b) En cada diluci6n se debe homogeneizar perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos, hacienda un area con la murieca de 30 cm de arriba a abajo o con un sistema de agitaci6n que proporcione resultados equivalentes. Es importante efectuar la agitaci6n siempre de la misma manera, para obtener resultados com parables y utilizar una pipeta esteril diferente, para cada una de las diluciones decimales subsecuentes. c) Adicionar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubas conteniendo caldo selenito cistina correctamente etiquetados. Para aforar el lfquido de la pipeta, debera aplicarse la punta de esta en el interior del cuello manteniendola en posici6n vertical, inclinando el tuba. Nunca se debe introducir en la muestra, mas de la tercera parte de la pipeta. d) I ncubar durante 24 ± 2 horas a 41 °C ± 0,2°C. e) Realizar la observaci6n del virado de coloraci6n, considerando un color anaranjado intenso coma positivo de la prueba correspondiente. 5.8 Aislamiento e identificaci6n bioqufmica de Salmonella spp. a) El aislamiento y la identificaci6n no son indispensables para la cuantificaci6n de Salmonella spp., pero son necesarios coma control para el laboratorio de que las bacterias fueron correctamente identificadas. b) A partir de un cierto numero de tubas positivos (con virado anaranjado), con la ayuda de un asa, sembrar por estrfa para obtener colonias aisladas sabre la superficie de placas de alguno de los medias diferenciales selectivos. Los medias utilizados pueden ser agar verde brillante, agar sulfito de bismuto, agar XLD, agar SS. c) I ncubar a 35°C durante 24 horas. d) Observar los cultivos para identificar las colonias sospechosas para Salmonella spp. coma sigue: • agar verde brillante: colonias rojas o rosas rodeadas del media rojo. • agar bismuto de sulfito: colonias negras con o sin brillo metalico, rodeadas de un halo cafe que posteriormente se transform a en negro. • agar XLD: colonias rojas, generalmente presentan el centro negro. • agar SS: colonias translucidas, transparentes u opacas y algunas veces con centro negro. e) Para la identificaci6n bioqufmica se seleccionan al menos 2 colonias tfpicas sospechosas de cada placa, que se encuentren bien aisladas. f) Tocar con un asa recta cada colonia e inocular por estrfa en una placa conteniendo agar nutritivo (u otro media similar). lncubar a 35°C ± 0,2°C por 24 horas. g) A partir de colonias perfectamente aisladas inocular 2 tubas, uno con agar triple azucar y hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estrfa en la superficie inclinada y por picadura en el fondo. lncubar a 35°C durante 24 horas. h) Observar el crecimiento en los tubas y considerar positivas las colonias que den las siguientes reacciones: • agar TSI: en el fondo del tuba se observa virado color amarillo debido a la fermentaci6n de la glucosa, en la superficie del media se intensifica el color rojo. En la mayorfa de los casos se observa coloraci6n negra a lo largo de la picadura, debido a la producci6n de H2S. • agar LIA: se observa coloraci6n purpura en todo el tuba, en ocasiones se observa la producci6n de H2S, con ennegrecimiento a lo largo de la picadura. i) Existen pruebas alternas cualitativas, aunque de mayor costo, que pueden ser empleadas coma es el caso de la prueba miniaturizada APl-20E y la confirmaci6n serol6gica que permiten identificar la especie y el serotipo, respectivamente. j) Si el laboratorio lo prefiere es factible utilizar el caldo de selenito cistina coma media de enriquecimiento y el caldo de tetrationato coma media selectivo. 6. Calculos 6.1 El NMP de Salmonella spp. se obtiene a partir del c6digo compuesto por los tubas cnn resultado positivo en el caldo de selenito cistina. Si se inoculan tres series de tres tubas y se utilizan volumenes 48 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 decimales diferentes a los indicados en tablas, se obtienen el c6digo formado por el numero de tubas con resultados positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a traves de la siguiente formula: NMP = (NMP de tablas) x (10/mayor volumen inoculado) ( 1) Por ejemplo: en media selenito cistina se obtuvo el c6digo 3/3 para la serie de la diluci6n 0, 1; 2/3 para la serie de la diluci6n 0,01 y 1/3 para la serie de la diluci6n 0,001. El c6digo es de 3, 2, 1 al consultar en las tablas obtenemos un valor de 150, el resultado es: NMP/g ST= (150) x (10/0, 1) = 15 000 NMP/g ST= 1,5 x 10 4 Salmonella (2) (3) 6.2 Cuando se inoculan mas de tres volumenes decimales, para la composici6n del c6digo se utilizan los resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas inoculadas. 6.3 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubas multiples son omitidos de las tablas del NMP. Asf los c6digos coma 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junta con muchos otros, no estan incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con una frecuencia mayor de 1 %, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el c6digo del NMP no aparezca en tablas, se utilizara la siguiente formula: NMP = (Numero de tubas positivos x 100)/ ✓ [(ml muestra tubas neg.) x (ml muestra total)] (4) La frecuencia de obtenci6n de resultados que nose encuentren en las tablas debe ser baja (me nor 1 %), de otra form a se tendra que revisar y confirmar. 7. Expresi6n de resultados 7.1 La densidad de Salmonella spp. se expres a coma NMP de coliform es por g de materia seca o ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los lfmites de confianza al 95% para cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubas positivos posibles. 7.2 Para su utilizaci6n se proporcionan c6digos form ados por tres algoritmos correspondientes al numero de tubas con resultados positivos en tres series consecutivas. 8. lnforme de prueba El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos: a) Todos los datos necesarios para la identificaci6n completa de la muestra. b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8. c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del analisis, asf coma cualquier operaci6n no especificada en el metodo, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados. ANEXOV METODO PARA LA CUANTIFICACION DE HUEVOS DE HELMINTOS EN LODOS Y BI0S OLIDOS El presente metodo tiene por objeto establecer la tecnica para la detecci6n, enumeraci6n, determinaci6n y de la viabilidad, en caso requerido, de huevos de helmintos en muestras de lodos y bios6Iidos, con el fin de evaluar la calidad de estos subproductos y la eficiencia de los sistemas de tratamiento a los que estan sujetos. 1. Principia La prueba se basa en el siguiente principio: 1.1 Por media de lavados continuos, combinados con diversas etapas de filtraci6n y flotaci6n se logra la separaci6n de los huevos de helmintos del resto de las partfculas de mayor y menor tamario, asf coma su concentraci6n. 1.2 Permite, en caso de ser requerido, determinar la viabilidad de los huevos de helminto y con ello confirmar la calidad de diversos procesos de estabilizaci6n en lodos. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 49 2. Muestreo, preparaci6n y acondicionamiento de la muestra El muestreo cons tituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluaci6n de calidad del lodo, por lo cual, este debera efectuarse de acuerdo con lo referido en el punto 5 de esta Norma. 2.1 Preparar recipientes de plastico inerte de 500 ml de boca ancha y de cierre hermetico, previamente desinfectados con cloro comercial, lavados con agua potable a chorro y enjuagados con agua destilada. 2.2 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinara el contenido de s6Iidos totales (ST) en por ciento en peso para, posteriormente, tomar en los recipientes el peso en fresco (X) que corresponda a 2 g de ST, para todo tipo de lodos. 2.3 Mantener la muestra a una temperatura de 4°C ± 2°C hasta su llegada al laboratorio. 2.4 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeraci6n hasta su analisis. 3. Reactivos y materiales 3.1 Reactivos 3.1.1 Acetato de etilo (C2H5.OCOOCH3) (opcional). 3.1.2 Acetato de sodio trihidratado (CH3 COO Na. 3H2O) ( opcional). 3.1.3 Acido acetico (CH3 COOH) (opcional). 3.1.4 Acido sulfurico 0, 1 N (H2SO4). 3.1.5 Alcohol etflico (C2 H5 OH). 3.1.6 Agua destilada. 3.1.7 Eter etflico. 3.1.8 Hipoclorito de sodio10% (NaCIO). 3.1.9 Formaldehfdo 37% (opcional). 3.1.10 Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 .?H2 0). 3.1.11 Tween 80 al 0,1%. 3.2 Materiales 3.2.1 Barras magneticas. 3.2.2 Bulba de goma. 3.2.3 Embudo de plastico con diametro de 20 cm. 3.2.4 Espatula. 3.2.5 Gradillas para tubas de centrffuga 50 ml. 3.2.6 Guantes de latex. 3.2.7 Manguera para conexi6n de matraz. 3.2.8 Matraces aforados Erlenmeyer de 1 L de capacidad. 3.2.9 Matraz Kitazato de 4 L. 3.2.10 Pipetas de 10 ml de plastico. 3.2.11 Pizeta de plastico de 1 L. 3.2.12 Probetas graduadas de 10 ml, 50 ml y de 1 L. 3.2.13 Recipientes de cierre hermetico de 1 a 3 L de capacidad. 3.2.14 Recipientes de plastico inerte con paredes internas lisas de 3 L de capacidad. 50 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 3.2.15 Recipientes de plastico inerte, boca ancha, de 500 ml de capacidad ysusceptibles de ser esterilizados en autoclave. 3.2.16 Tamiz de 20 µm (milimicras) de poro (opcional). 3.2.17 Tamiz de 150 a 170 µm (milimicras) de poro. 3.2.18 Tapabocas. 3.2.19 Tubas de centrffuga conicos, de plastico 50 y 200 ml (ode mayor capacidad). 4. Aparatos y/o instrumentos 4.1 Agitador de tubas con control de velocidad y adaptable a tubas de diferentes tamarios. 4.2 Autoclave capaz de operar a una presion de 1,05 kg/cm 2 y una temperatura de 121 °C. 4.3 Balanza granataria con intervalo de medicion de 2,0 a 800 g ± 0,2 g. 4.4 Bomba de vacfo con control de velocidad de succion. 4.5 Camara de Sedgwich-Rafter o disco Doncaster. 4.6 Campana de extraccion. 4.7 Centrffuga, capaz de mantener los intervalos de operacion de 660 ± 300 g. 4.8 Densfmetro (hidrometro), con intervalo de medicion de 1,0 a 1,4 g/cm 3. 4.9 lncubadora con capacidad para operar a una temperatura de 26°C ± 0,2°C. 4.10 Licuadora con contenedor de plastico inerte, paredes lisas y con capacidad de 2 L. 4.11 Mascarilla antigas con carbon activado o similar. 4.12 Microscopio optico equipado para hacer iluminacio n (Kohler), cam po claro, con objetivos de 10 a 100 X, y platina movil removible. 4.13 Parrilla con agitacion magnetica. 4.14 Potenciometro con intervalo de medicion de 0 a 14 ± 0,2 unidades de precision. 4.15 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura de 4 °C ± 0,2°C. 5. Procedimiento 5.1 Preparacion de soluciones Los siguientes puntos describen la secuencia del metodo de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos. 5.1.1 Solucion acido alcohol, homogeneizar 650 ml de acido sulfurico 0,1 N con 350 ml de alcohol etflico. Almacenar la solucion en un recipiente hermetico. 5.1.2 Solucion de formalina al 0,5%, ariadir 5 ml de formaldehfdo al 37% y aforar a 1 000 ml con agua destilada. Homogeneizar y almacenar en recipiente hermetico. 5.1.3 Solucion patron de aceto-acetico, agregar 15 g de acetato de sodio trihidratado, 3,6 ml de acido acetico y aforar a 1 000 ml de agua destilada. Homogeneizar y almacenar en frasco hermetico durante 2 a 3 meses. 5.1.4 Solucion de sulfato de zinc (ZnSO4) con gravedad especffica de 1,3. Disolver 800 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.?H2O) en 1 000 ml de agua destilada, mezclar en la parrilla magnetica hasta homogeneizar totalmente. Medir la densdad con el densfmetro y, segun sea el caso, ajustar la densidad a 1,3 agregando sulfato de zinc o agua destilada, segun se requiera. Almacenar en recipiente hermetico y verificar densidad cada mes. 5.1.5 Tween 80 al 0, 1 %, ariadir 1 ml del reactivo en 999 ml de agua destilada y homogeneizar en parrilla de agitacion hasta su completa disolucion. Almacenar en recipiente hermetico durante 2 a 3 meses. 5.2 Calibracion de aparatos Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 51 Todos los equipos deben ser calibrados o ajustados de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o bien, contra equipos certificados. 5.3 Seguridad 5.3.1 Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de latex y cubreboca, para evitar cualquier riesgo de infecci6n. 5.3.2 Se debe lavar y desinfectar el area de trabajo, asf coma el material utilizado por el analista, antes y despuesdelensayo. 5.3.3 La agitaci6n de las soluciones con eter debera realizarse en sitios ventilados o dentro de una campana de extracci6n, considerando su inflamabilidad. Evitar la inhalaci6n, el contacto con los ojos, piel o ropa, ya que es un reactivo sumamente t6xico. 5.4 Manejo de residuos 5.4.1 Todos los residuos de la muestra analizada seran esterilizados en autoclave antes de su desecho. 5.4.2 Aquel material que sea reutilizado, pero que no pueda ser esterilizado en autoclave debera ser colocado en hipoclorito de sodio (10%), durante un dfa, antes de ser lavado. 5.5 Concentraci6n y separaci6n de los huevos de helminto. La recuperaci6n de los huevos de helminto de la muestra se realizara efectuando los siguientes pasos: a) Por 1 minuto y con la ayuda de una licuadora homogeneizar el peso en freso que corresponda a 2 g de ST. Utilizar para ello 200 ml de una soluci6n de Tween 80 al 0, 1 %, integrando los enjuagues del recipiente que originalmente contenfa la muestra. b) Recuperar homogeneizado y enjuagues del vaso de la licuadora en un recipiente de plastico de 2 L, utilizar para ello 800 ml de la soluci6n de Tween 80 al 0, 1 %. c) De jar sedimentar la muestra al menos durante 3 horas. d) Aspirar el sobrenadante por vacfo y filtrar el sedimento a traves del tamiz de poro seleccionado (150 a 170 µm). Enjuagar recipiente y tamiz con 1 L de agua destilada, para lo cual se recomienda utilizar una pizeta. El filtrado y los enjuagues se recuperan en el reci piente de plastico de 2 L. e) Dejar sedimentar al menos durante 3 horas. f) Aspirar el sobrenadante por vacfo y recuperar sedimento y enjuagues, con agua destilada, en un tuba de centrffuga de 200 ml o mayor capacidad. g) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. h) Aspirar el sobrenadante por vacfo y desecharlo. Resuspender la pastilla en 150 ml de la soluci6n de sulfato de zinc. Homogeneizar la pastilla con ayuda de un agitador de tubas y, s6Io en caso de ser necesario, utilizar aplicadores de plastico o espatula de tefl6n para lograr su completa disoluci6n. i) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. j) En caso de contar con un tamiz de 20 µm de poro se recomienda efectuar un segundo filtrado, cuya finalidad es remover el detritus de menor tamario y facilitar a lectura de los huevos de helminto en el sedimento final al microscopio. Para ello, filtrar el sobrenadante y recuperar la pelfcula que ha quedado retenida sabre la malla con el volumen de agua destilada que sea necesario (utilizar pizeta), en un tuba de 200 ml de centrffuga, desechar filtrado y pasar al inciso i. En caso contrario verter el sobrenadante en un recipiente de 2 Ly romper la densidad con 1 L de agua destilada. k) Sedimentar al menos durante 3 horas. I) Una vez transcurrido el tiempo de sedim entaci6n aspirar el sobrenadante por vacfo y recuperar el sedimento resultante en un tuba de centrffuga de 200 ml o mayor capacidad, incluir los enjuagues del recipiente. m) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. n) Aspirar el sobrenadante por vacfo y resuspender el sedimento por agitaci6n, con ayuda de un agitador de tubas (si es necesario, utilizar aplicadores). La soluci6n resultante se recupera en un tuba c6nico de centrffuga de 50 ml, incluyendo el agua destilada de enjuague. 52 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 o) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. p) Aspirar el sobrenadante y con ayuda de un agitador de tubas resuspender la pastilla en 15 ml de la soluci6n de alcohol-acido (u opcionalmente, el patron de aceto-acetico) y, posteriormente, agregar 10 ml de eter (o acetato de etilo, que es menos t6xico). Agitar suavemente y, de vez en cuando, destapar para dejar escapar el gas que se desprenda. Por seguridad, realizar todo este proceso dentro de la campana de extracci6n (en el laboratorio) o con mascarilla de protecci6n antigas (en campo). q) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. r) Aspirar el sobrenadante, hasta 2 mm por arriba de la parte c6nica del tuba de 50 ml (aproximadamente 5 ml). Realizarlo bajo las mismas condiciones de seguridad (en el laboratorio) dentro de la campana de extracci6n o (en campo) con mascarilla de protecci6n antigas. s) Efectuar un primer enjuague agregando H2SO4 0, 1 N (o formalina 0,5%). t) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. u) Aspirar el sobrenadante, dejando 5 ml y realizar un segundo enjuague agregando HzSO4 0, 1 N (o formalina 0,5%). v) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos. w) Aspirar el sobrenadante dejando 5 ml del mismo. 5.6 Determinaci6n de viabilidad y lectura al microscopio a) Si no es necesario determinar la viabilidad, proceder a la cuantificaci6n, en caso contrario, incubar el tuba con la muestra durante 4 semanas a 26°C ± 0,2°C. Dejar la tapa del tuba floja para que entre aire y, por lo menos una vez por semana, verificar que el nivel del lfquido no disminuya. Si es necesario, agregar agua destilada. b) Una vez transcurrido el tiempo de incubaci6n, homogeneizar la pastilla y proceder a la cuantificaci6n de los huevos. Para la lectura verter el sedimento final en una celda de Sedgwich Rafter o Disco Doncaster. En caso necesario, y para evitar la sobreposici6n de estructuras y del detritus no eliminado, distribuir en alfcuotas y homogeneizar con agua destilada. S6Io aquellos huevos donde se observe la larva se consideran viables. El Anexo 1 muestra algunos ejemplos. c) Como paso opcional, y antes de realizar la lectura al microscopio, ariadir hipoclorito de sodio (10%) en igual volumen al sedimento final y dejar reposar durante 10 minutos. Aforar con agua destilada. d) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos y decantar hasta dejar 5 ml del sobrenadante. e) Realizar un segundo enjuague con agua destilada y centrifugar bajo las mismas condiciones. Lo anterior permite una mayor claridad en el contenido interno de los huevos (especialmente de Ascaris y Trichuris), una mejor diferenciaci6n y, en consecuencia, un conteo mas rapido. f) Aspirar sobrenadante hasta 5 ml del volumen final. 6. Calculos 6.1 La formula para calcular g es: g = Li.!:.Q.rn2 k don de: g = fuerza relativa de centrifugaci6n k = constante cuyo valor es 89, 456 r = radio de la centrffuga en cm rpm = revoluciones por minuto 6.2 Para el calculo del por ciento de s6Iidos total es (ST), se utiliza el % de humedad coma sigue: % de s6Iidos total es = 100% -% de humedad (2) 7. Expresi6n de resultados Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 53 % de s6Iidos total es = 100% -% de humedad 7.1 Expresar los resultados en numero de huevos/2 g de s6Iidos total es (volumen de muestra analizada). H/2g ST don de: H = numero de huevos lefdos en la muestra gST = gramos de s6Iidos totales de la muestra analizados 7.2 lnterferencias (3) 7.2.1 La sobreposici6n de estructuras y/o detritus no eliminados en el sedimento puede dar una evaluaci6n err6nea al dificultar la lectura. En tal caso, es importante diluir con agua destilada y hacer las alfcuotas que se consideren necesarias para queen cada una se realice el conteo. 7.2.2 La falta de experiencia en la identificaci6n de generos es un elemento comun de sobreconteo. 7.2.3 En caso de que la muestra presente la formaci6n de hongos durante el proceso de incubaci6n se recomienda remplazar el H2SO4 0, 1 N por una soluci6n de formalina 0,5%. 8. lnforme de la prueba I ncluye especificar los siguientes puntos: a) Todos los datos necesarios para la identificaci6n completa de la muestra. b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8. c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del analisis, asf coma cualquier operaci6n no especificada en el metodo, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados. ANEXOVI METODO PARA LA CUANTIFICACION DE METALES PESADOS EN BIOSOLIDOS El presente metodo tiene por objeto establecer la tecnica para la determinaci6n de arsenico, cadmio, cobre, cromo, plomo, mercurio, nfquel y zinc, en muestras de bios6Iidos, por espectrofotometrfa de absorci6n at6mica, donde el analisis de los elementos se efectua individualmente. 1. Principia El metodo analftico se basa en la atomizaci6n de la muestra para liberar los atomos, a los que se les aplica una energfa de una longitud de onda especffica que es absorbida e induce al electron a pasar a un estado excitado. Esta energfa absorbida es proporcional a la concentraci6n del elemento en la muestra analizada. 2. Reactivos y materiales 2.1 Reactivos 2.1.1 Acido clorhfdrico grado suprapuro. 2.1.2 Acido nftrico grado suprapuro. 2.1.3 Acido nftrico. 2.1.4 Acido percl6rico grado suprapuro. 2.1.5 Acido sulfurico grado suprapuro. 2.1.6 Acetona. 2.1.7 Agua tipo 11, que tiene las siguientes caracterfsticas: resistividad mayor de 10 egohm -cm a 25°C y conductividad me nor de 0, 1 Siem a 25°C. En lo subsiguiente se le llamara agua. 2.1.8 Aire comprimido seco y limpio. 2.1.9 Borohidruro de sodio. 2.1.10 Cadmio metalico. 2.1.11 Cloruro de mercurio. 2.1.12 Cloruro de potasio. 54 2.1.13 Cloruro o sulfato estanoso. 2.1.14 Cobre metalico. DIARIO OFICIAL 2.1.15 Detergente no i6nico, libre de metales. 2.1.16 Gases: acetileno, nitr6geno, grado absorci6n at6mica. 2.1.17 Hexano. 2.1.18 Hidr6xido de sodio. 2.1.19 Nfquel metalico. 2.1.20 Nitrato de plomo. 2.1.21 Oxido de lantano. 2.1.22 Permanganato de potasio. Viernes 15 de agosto de 2003 2.1.23 Soluciones estandar de referencia certificada de arsenico, cadmio, cobre, cromo, plomo, nfquel, mercurio y zinc, de 100 ppm. 2.1.24 Tri6xido de arsenico. 2.1.25 Tri6xido de cromo. 2.1.26 Zinc metalico. 2.2 Materiales 2.2.1 Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad. 2.2.2 Capsula de porcelana de 50 ml de capacidad. 2.2.3 Embudos de filtraci6n de diferentes capacidades. 2.2.4 Goteros. 2.2.5 Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 2.2.6 Matraces volumetricos de diferentes capacidades. 2.2.7 Membranas de ruptura. 2.2.8 Micropipetas o pipetas Eppendorf de diferentes capacidades. 2.2.9 Papel filtro Whatman numero 40. 2.2.10 Pipetas volumetricas de varias capacidades. 2.2.11 Puntas de plastico para micropipetas. 2.2.12 Recipientes de polietileno, propileno ode vidrio de 50 ml. 2.2.13 Vasos de precipitado de diferentes capacidades. 2.2.14 Vasa de tefl6n de 100 ml. 2.2.15 Vidrio de reloj. Toda el material volumetrico utilizado por este metodo debe ser clase A y ser de uso exclusivo para este procedimiento. 3. Equipo S6Io se mencionan los equipos que son de relevancia para el presente metodo. 3.1 Balanza analftica con intervalo de medici6n de 0,0001 a 80 g ± 0,0001 g 3.2 Para la digestion de las muestras: a) Parrilla de calentamiento con regulador. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 55 b) Horno de microondas, capaz de liberar de 575 W a 1 000 W de potencia. El incremento ce la potencia debe ser mfnimo 1%/s sistema de control de presi6n dentro de cada uno de los vasos y sistema de ventilaci6n de 2,8 m 3/minuto. c) Horno con intervalo de temperatura de 0-160°C. d) Autoclave con valvula de seguridad que se abra a 15 lb y un man6metro para indicar la presi6n interna. 3.3 Espectrofot6metro de absorci6n at6mica, con lo siguiente: a) Sistema 6ptico. Fot6metro de haz sencillo o doble. b) Monocromador con rango espectral de 190 a 900 nm . c) Ancho de banda espectral de 0,2, 0,7 y 2,0 nm. d) Sistema de flam a con control de gases. e) Sistema de generador de hidruros. f) Sistema de quemador con alineaci6n de la flam a manual o automatica, y quemador de 10 cm. g) Lam paras de catodo hueco o de descarga sin electrodo, de acuerdo a los metal es a analizar. h) I nterfase con registrador o un adecuado sistema automatizado para el procesamiento de datos. 4. Recolecci6n, preservaci6n y almacenamiento de muestras 4.1 Recolecci6n La muestra debe tomarse en recipientes de polietileno o de vidrio y boca ancha de 50 ml y llenando hasta el tape. 4.2 Preservaci6n y almacenamiento de la muestra La muestra debe refrigerarse inmediatamente a 4°C por un tiempo maxima de 6 meses, excepto para el caso del mercurio quese requiere analizar antes de 28 dfas. 5. Procedimiento Los siguientes puntos describen la secuencia del metodo de prueba, el que se debe realizar conforme a lo descrito. 5.1 Preparaci6n de disoluciones 5.1.1 Acido nftrico al 10% v/v. Diluir 16 ml de HNO3 RA, en 100 ml de agua. 5.1.2 Acido clorhfdrico al 15% v/v. Diluir 40 ml de HCI RA, en 100 ml de agua. 5.1.3 Acido clorhfdrico 1 :1. Diluir 50 ml de HCI RA con 50 ml de agua. 5.1.4 Acido clorhfdrico al 1,5% v/v. Diluir 3,4 ml de HCI en 100 ml de agua. 5.1.5 Soluci6n de borohidruro de sodio. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 ml de una soluci6n de hidr6xido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacfo. 5.1.6 Soluci6n de hidr6xido de sodio al 1 % p/v. Pesar 1 g de hidr6xido de sodio y diluir a 100 ml con agua. 5.1.7 Soluci6n de permanganato de potasio. Pesar 5 g de permanganato de potasio y diluirlo a 100 ml. Considerar el porcentaje de pureza. 5.1.8 Agua regia. Ariadir tres volumenes de HCI RA a un volumen de HN~ RA. 5.1.9 Soluciones para realizar la curva de calibraci6n. A partir de la soluci6n que se indica en el punto 3.1.2.3, realizar las diluciones necesarias con un pH = 2. Preparar mfnimo cinco concentraciones, las que deben estar en el intervalo de trabajo del laboratorio. 5.1.10 Soluciones para verificar el 0,2 unidades de absorbancia. A partir de la soluci6n que se indica en el punto 3.1.2.3, realizar las diluciones necesarias con un pH= 2, hasta obtener 2 ppm. 56 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Tambien se pueden preparar estas soluciones en el laboratorio, coma se indica a continuacion, siempre y cuando se verifique su concentracion con una solucion estandar de referencia. a) Arsenico: Disolver 1,320 g de trioxido de arsenico, As 203 en agua conteniendo 4 g de NaOH. Diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml= 1.00 mg As (Ill). b) Cadmio: Disolver 0, 10 g de cadmio metalico en 4 ml de HNO3, adicionar otros ocho ml de HN~ y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 µg de Cd. d) Cobre: Disolver 0, 10 g de cobre metalico en dos ml de HNO3, adicionar 10 ml de HNO3 y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml= 100 µg Cu. e) Cromo: Disolver 0, 1923 g de CrO3 en agua. Cuando la disolucion sea com pl eta, acidificar con 10 ml de HNO3, y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml = 100 µg Cr. f) Mercurio: Disolver 0, 1354 g de cloruro de mercurio, HgCb, en aproximadamente 70 ml de agua, ariadir un ml de HNO3y diluir a 100 ml con agua. 1,00 ml= 1,00 mg Hg. g) Nfquel: Disolver 0, 10 g de nfquel metalico en 10 ml de HN~ caliente, enfriar y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml= 100 µg Ni. h) Plomo: Disolver 0, 1598 g de nitrato re plomo, Pb(N~)2, en una minima cantidad de HN~ 1 :1, adicionar 10 ml de HNO3y diluir a 1 000 ml con agua. 1,00 ml= 100 µg Pb. i) Zinc: Disolver 0, 100 g de Zinc metalico en 20 ml de HCI 1: 1 y diluir a 1 000 ml en agua. 1,00 ml= 100 µg Zn. El acido nftrico utilizado para la preparacion de estas soluciones es grado suprapuro. 5.2 Limpieza del material 5.2.1 El material de vidrio debe sumergirse durante una hara en una disolucion de acido nftrico al 10% (ver 6.1.1) y enjuagarse con agua. 5.2.2 En caso de que el material presente adherencias, debe dejarse remojando de 12 a 24 horas con acido nftrico al 10% (6.1.1 ), o con acido clorhfdrico 15% (ver 6.1.2) o con agua regia (ver 6.1.8). Despues debe ser enjuagado con suficiente agua, hasta remover toda la disolucion acida. 5.2.3 En los casos en que el material presente grasa, agregarle acetona o hexano y distribuirlo por todas las paredes del material. Desechar el disolvente de acuerdo al procedimiento de desechos y, posteriormente, enjuagar con agua. Continuar coma se indica en el punto 6.2. 5.2.4 Los recipientes de muestras deben lavarse con disolucion de detergente, enjuagarse con agua de la I lave y dejarlo remojando toda la noche en acido nftrico al 10% (6.1.1 ). Posteriormente, enjuagarlo con agua. 5.2.5 Verificar que el lavado de material se efectuo correctamente. 5.2.6 Guardar en cuanto este seco para evitar contaminacion por partfculas en el aire. 5.3 Preparacion de la muestra Las muestras de lodos y biosolidos, requieren, en general, un tratamiento previo antes del analisis. Los metales totales incluyen la combinacion de los que se encuentran en la fase organica yen la inorganica, asf coma los disueltos yen partfculas. Notas: a) Durante todo el procedimiento analftico donde se mencione utilizacion de acidos, estos deben ser grado suprapuro. b) Procesar las muestras de control establecidas en su programa de AC, por cada serie de digestion. 5.3.1 Digestion por horno Homogeneizar perfectamente la muestra, verificando que no existan solidos adheridos en el fondo del recipiente. En seguida, vaciar aproximadamente 10 g en una capsula de porcelana (a peso constante) y colocarla en el horno hasta que el material este a peso constante. El horno debe estar a 100°C. 5.3.2 Digestion por parrilla Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 57 5.3.2.1 Pesar y registrar de uno a dos gramos de la muestra en un vaso de precipitado de 100 ml o en un crisol de platino y ariadir 10 ml de HNO3 concentrado. Cubrir con un vidrio de reloj y calentar lentamente hasta que exista reflujo de vapores, cuidando que no alcance la temperatura de ebullicion. Calentar casi a sequedad. 5.3.2.2 Enfriar y lavar el vidrio de reloj con agua. Adicionar otros 5 ml de HN~ concentrado. Cubrir y continuar calentando hasta digestion completa, que es cuando la solucion adquiere apariencia cristalina y los vapores son blancos. Agregar el acido necesario para obtener esto. 5.3.2.3 Evaporar hasta obtener un volumen aproximado de 2 ml, enfriar y enjuagar el vidrio de reloj con agua. Ariadir 10 ml de HCL 1:1 (ver 6.1.3) y 15 ml de agua. Calentar nuevamente por 15 minutos para redisolver precipitados que se hayan form ado. 5.3.2.4 Enfriar, enjuagar las paredes del vaso y vidrio de reloj con agua. Vaciar el contenido a un matraz volumetrico de 50 ml, filtrando a traves de papel filtro numero 40, para remover el material insoluble que pueda tapar el nebulizador. Aforar al volumen correspondiente. 5.3.3 Digestion por autoclave 5.3.3.1 En un vaso de teflon de 100 ml, transfiera 0,5 g de la muestra seca. Marque y pese los vasos antes y despues para obtener el peso exacto de la muestra. 5.3.3.2 Ariadir 5 ml de HN~, tapar los recipientes hermeticamente y la autoclave. Encender el equipo y dejarl o en operacion a 15 lb, aproximadamente una hara. El laboratorio debe validar el tiempo de digestion, con el equipo que utilizara para tal fin. 5.3.3.3 Sacar y enfriar a temperatura ambiente los vasos de teflon. 5.3.3.4 Abrir y filtrar a traves de papel filtro numero 40, si se requiere, para retener materiales insolubles. Lavar las paredes con agua y diluir la muestra a 50 ml. 5.3.4 Digestion por horno de microondas Para usar el horno de microondas coma fuente de energfa, en la digestion de la muestra, se sigue el mismo procedimiento descrito en el punto 6.3.3, excepto que el tiempo de la digestion puede variar de 30 a 50 min dependiendo de las caracterfsticas de la muestra y de la potencia aplicada. 5.4 Analisis instrumental 5.4.1 Determinacion de cadmio, cobre, cromo, nfquel, plomo y zinc, por aspiracion directa flama-aire-acetileno. 5.4.1.1 Conectar la lam para de catodo hueco o descarga sin electrodos y encender el equipo. 5.4.1.2 Seleccionar la longitud de onda y el ancho de banda espectral de acuerdo al metal a analizar, siguiendo el protocolo del laboratorio o el manual del fabricante. En la tabla 1 se proponen las longitudes de onda y el ancho de banda espectral con los que se pueden analizar los elementos. Tabla 1. Relacion de longitud y ancho de banda para los elementos analizados por flama Elemento Longitud de onda (A) Ancho de banda espectral (nm) Cd 228,8 0,7 Cr 357,9 0,7 Cu 324,8 0,7 Ni 232,0 0,7 Pb 217,0 0,7 Zn 213,9 0,7 5.4.1.3 Ali near la lam para vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la maxima energf a. 5.4.1.4 Esperar de 10 a 20 minutos para que se estabilice el instrumento. 5.4.1.5 Ajustar las condiciones de la flama aire-acetileno, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Encender la flam a. Permitir que el sistema alcance el equilibria de temperatura. 58 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 5.4.1.6 Aspirar el blanco y ajustar el instrumento a cero. 5.4.1. 7 Aspirar la disoluci6n del estandar (5.1.10) con la concentraci6n necesaria (ver tabla 2) para obtener 0,2 unidades de absorbancia. Ajustar con esta disoluci6n el instrumento y si es necesario tambien ajustar el quemador, hasta obtener el valor mas cercano a 0,2 unidades de absorbancia. Tabla 2. Relacion de concentraciones para calibracion del instrumento utilizando flama Elemento Concentracion ppm Cd 1,5 Cr 4,0 Cu 2,0 Ni 7,0 Pb 9,0 Zn 1,0 5.4.1.8 Aspirar las disoluciones estandar, mini mo cinco concentraciones (ver 5.1.10), para realizar la curva de calibraci6n y un blanco de reactivos. El primer punto debe ser igual o mayor al limite de cuantificaci6n del metodo y el ultimo debe estar dentro del intervalo lineal. 5.4.1.9 Proceder a analizar las muestras problema y las muestras control. Si las lecturas de las muestras estan fuera del intervalo de la curva de calibraci6n, efectuar la(s) diluci6n(es) que sean necesarias, hasta obtener val ores en el intervalo de trabajo. 5.4.2 Determinaci6n de mercurio y arsenico por gen erador de hidruros. 5.4.2.1 I nstalar la lam para correspondiente al metal que se va a analizar en el instrumento y encenderlo. Esperar de 20 a 30 minutos para su estabilizaci6n. 5.4.2.2 Seleccionar la longitud de onda y el ancho de banda espectral. En la tabla 3 se proponen las longitudes de onda y ancho de banda para cada uno de los elementos. Elemento fas Hg Tabla 3. Relacion de longitud y ancho de banda para los elementos analizados por generador de hidruros Longitud de onda (A) Ancho de banda espectral (nm) 193,7 0,7 253,7 0,7 5.4.2.3 Ali near la lam para vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la maxima energia. 5.4.2.4 Alinear la celda de cuarzo vertical, horizontal y rotacionalmente, hasta obtener la minima energia. Esperar de 20 a 30minutos para su estabilizaci6n. 5.4.2.5 Ajustar y optimizar los flujos de aire-acetileno y encender la flama. Esperar aproximadamente 10 minutos para su estabilizaci6n. Este ajuste s 610 se requiere para la determinaci6n de arsenico. 5.4.2.6 Abrir el tanque de nitr6geno y ajustar la presi6n de acuerdo a las especificaciones del fabricante, para transportar el hidruro form ado a la celda de cuarzo. 5.4.2. 7 Colocar en el recipiente del reductor la disoluci6n de borohidruro de sodio (ver punto 5.1) y conectar al sistema segun las especificaciones del instrumento. 5.4.2.8 Conectar el vaso de reacci6n vacfo al sistema generador y esperar el tiempo suficiente a que se estabilice el sistema. Cuando se ha estabilizado, registrar el cero en el espectrofot6metro (autocero). Retirar el vaso. 5.4.2.9 Conectar otro vaso de reacci6n con 10 ml de HCI 1,5%, permitir la entrada del hidruro form ado y registrar el cero. Repetir esta operaci6n hasta obtener el cero por lo menos tres veces. Retirar el vaso. 5.4.2.10 Vaciar en otro vaso de reacci6n, 10 ml de disoluci6n estandar, para obtener el 0,2 unidades de absorbancia. En la tabla 4 se indican las concentraciones, con las que se obtiene el 0,2 unidades de absorbancia. Repetir esta operaci6n hasta que se obtenga por lo menos tres veces la misma lectura, la cual debera ser aproximadamente de 0,2. En caso de existir variaci6n en las lecturas, verificar la alineaci6n de la lam para y de la celda de cuarzo. Viernes 15 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL Tabla 4. Relacion de concentraciones para calibraci6n del instrumento utilizando generador de hidruros Elemento Concentraci6n, ng fas 5 Hg 50 59 5.4.2.11 De forma similar al punto anterior, realizar la curva de calibraci6n con un minima de cinco concentraciones y por lo menos tres lecturas independientes. Limpiar el sistema hacienda pasar acido clorhfdrico al 1,5% cada tres lecturas. 5.4.2.12 Una vez determinada la curva de calibraci6n, proceder a analizar el blanco, las muestras problema y las muestras control, coma se indica en los dos puntos anteriores. Si las lecturas de las muestras estan fuera del intervalo de la curva de calibraci6n, efectuar la(s) diluci6n(es) que sean necesarias, hasta obtener valores en el intervalo de trabajo. 6. Calibraci6n Todos los instrumentos y materiales de medici6n utilizados, deben ser calibrados y verificar su calibraci6n peri6dicamente con material es y/o sustancias de referencia certificadas, de acuerdo con el AC establecido. 6.1 Verificaci6n de la calibraci6n espectrofot6metro de absorci6n at6mica lndependientemente del elemento a analizar, realizar dicha verificaci6n del instrumento coma se indica a continuaci6n. 6.1.1 Co nectar la lam para de cobre y encender el equipo. 6.1.2 Seleccionar la longitud de onda a 324,8 nm y el ancho de band a a 0, 7 nm. 6.1.3 Ali near la lam para horizontal, vertical y rotacionalmente, hasta obtener la maxima energf a. 6.1.4 Una vez encendida la lam para y alineada, esperar de 10 a 20 min. para la estabilizaci6n del instrumento. 6.1.5 Ajustar las condiciones de la flama aire-acetileno, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Encender la flam a. Permitir que el sistema alcance el equilibria de temperatura. 6.1.6 Aspirar un blanco. 6.1.7 Aspirar una disoluci6n estandar de cobre de 2 ppm (ver punto 5.1.10), la que debe dar 0,2 unidades de absorbancia, ± lo establecid o en los resultados obtenidos de las validaciones analfticas. 7. Calculos 7.1 lnterpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibraci6n, para obtener la concentraci6n en mg/I (A). En seguida realizar los calculos, tomando en cuenta los factores de diluci6n y peso de la muestra con la formula siguiente: don de: AxBxFD mg/ kg= C A: Concentraci6n en mg/I de la muestra a interpolar en la curva de calibraci6n. B: Volumen al que se llev6 la muestra (ml). C: Peso de la muestra (g). FD: Factor de diluci6n. (2) En los instrumentos que tienen integrado un procesador de datos, se puede obtener directamente la concentraci6n del elemento. 7.2 Reporte de resultados 7.2.1 Nose deben repo rtar concentraciones de elementos por debajo del If mite de cuantificaci6n. 7.2.2 Reportar los resultados del analisis en mg/kg. 8. lnterferencias 60 DIARIO OFICIAL Viernes 15 de agosto de 2003 Probablemente no existira nunca un metodo analftico que este totalmente libre de alguna interferencia por parte de la naturaleza de la muestra, sin embargo, en absorcion atomica, por ser una tecnica muy especffica, las interferencias estan bien definidas coma tambien los medias para su tratamiento. 8.1 I nterferencia por matriz: la principal interferencia para este tipo de muestras es la presencia de materia organica y solidos en suspension, lo que se elimina mediante una adecuada digestion de la muestra. 8.2 I nterferencia de absorcion no especffica (fondo). La absorcion molecular y la dispersion de la luz causadas por partfculas solidas en la flama pueden causar errores positivos. Para evitar este problema se debe utilizar la correccion de fondo del instrumento. Estos solidos ademas de presentar una barrera ffsica al paso de la luz de la lampara en la flama, forman depositos en la cabeza del quemador, sin embargo, esto se puede evitar aspirando continuamente agua acidulada. 8.3 lnterferencias ffsicas. Estan relacionadas con las diferentes propiedades existentes entre las muestras y los estandares. Las cuales pueden cfectar a la aspiracion y eficiencia de nebulizacion en el sistema de atomizacion. Si las soluciones presentan diferencias de viscosidad y/o tension superficial, la eficiencia de nebulizacion no sera igual y los resultados analfticos se ven afectados. La presencia de otros compuestos ademas del elemento de interes puede afectar a los resultados analfticos. Estas interferencias pueden ser corregidas utilizando el metodo de adicion interna (adicion de estandares). 8.4 Las interferencias en generador de hidruros se presentan por presencia de otros elementos o moleculas presentes en la muestra. Los efectos se ven reflejados en una disminucion de la cantidad de hidruro form ado y por lo tanto, en una disminucion de la serial analftica. La forma de eliminar este ti po de interferencias es modificando la concentracion del acido y/o del borohidruro de sodio. 9. Manejo de residues 9.1 Cada laboratorio debe considerar dentro de su programa de control de calidad (CC) el tratamiento de los residuos generados durante la determinacion. 9.2 Confinamiento. El laboratorio debe contar con areas especiales, que tengan serialamientos adecuados, para almacenar temporalmente las soluciones contaminadas con metal es pesados. 9.3 Todas las muestras que cumplan con la norma de descarga al alcantarillado pueden descargarse en el mismo. ANEXOVII CONTENIDO DE LA BITACORA DE CONTROL DE LODOS Y BIOSOLIDOS 1.- Generador 2.- Produccion en base seca (Ton.) por: dfa y mes 3.- Fecha muestreo 4.- Laboratorio que analizo 5.- Salida del producto: • fecha • cantidad en base seca (Ton.) • destinatario Nombre de archivo: 004semarnat Directorio: E:\Sicat\Noms \2003 Plantilla: C :\Documents and Settings \Edicion-25\Datos de programa \Mi crosoft\Plantill as \model o. dot Titulo: CASSIO LUISELLI FERNANDEZ, Subsecretario de Fomento y Normatividad Ambiental de la Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Nat Asunto: Autor: Edicion-25 Palabras clave: Comentarios: Fecha de creaci6n: 18/08/03 3:58 a.m. Cambio numero: 2 Guardado el: 18/08/03 3:58 a.m. Guardado por: DGN Tiempo de edici6n: 2 minutos Impreso el: 18/08/03 4:02 a.m. Ultima impresi6n completa Numero de paginas: Numero de palabras: Numero de caracteres: 43 20,368 (aprox.) 104,897 (aprox.)