Order on the implementation of special surveillance to determine the presence of the bacterium clavibacter michiganensis (smith) davis et al. ssp. sepedonicus (spieckermann et kotthoff) davis et al. and laboratory testing procedures

МИНИСТЕРСТВО ЗА ЗЕМЈОДЕЛСТВО, ШУМАРСТВО И ВОДОСТОПАНСТВО Врз основа на член 69 алинеја 5 од Законот за здравјето на растенијата („Службен весник на Република Македонија бр. 29/05, 81/08, 20/09, 57/10 и 17/11“), министерот за земјоделство, шумарство и водостопанство, донесе НАРЕДБА ЗА СПРОВЕДУВАЊЕ НА ПОСЕБЕН НАДЗОР ЗА УТВРДУВАЊЕ НА ПРИСУСТВОТО НА БАКТЕРИЈАТА СТАМВАСТЕВ МСНОАМЕМ55 (5МТН) ПАХ ЕТ А!. 55Р. ФЕРЕрБОМСЏ5 (5ФРГЕСКЕВМАММ ЕТ КОТТНОЕЕ) ПАХ ЕТ А!. И ПОСТАПКИТЕ ЗА ЛАБОРАТОРИСКО ИСПИТУВАЊЕ “ х Со оваа наредба се врши усогласување со одребите на Директивата на Советот бр. 95/85/ЕЕЗ од 4 октомври 1993 за контрола на прстенесто гниење на кртолите и венеење на компирот од СамБаскег тисНтдапеп5ј5 (отП) Вам ек а. о5р. зередоптси5 (орѓесКегтапп ек Коко) Оамј5 ек ај. СЕ(ЕХ број 52199210085, изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2006/56/ЕЗ од 12 јуни 2006 година, СЕГЕХ број 5200610056. Член 1 Со оваа наредба се определува спроведување на посебен надзор за утврдување на присуството на бактеријата СТамраскег тисНијапеп5ј5 (от) ПОамб ек а!. о5р. зередопјси5 (5рѓесКегтапп ес Коко) рам ек а!. предизвикувач на прстенесто гниење на кртолите и венеење на компирот, одредување на распространетоста и во случај на појава мерките кои треба да се превземат за да се спречи ширењето и контролата, со цел ерадикација на прстенесто гниење на кртолите и венеење на компирот, како и на постапките за лабораториско испитување. Член 2 Мерките кои се преземат заради уништување на бактеријата Самраскег тсНтдапеп515 (оти) Оач5 ек а|. 55р. зередопјси5 (5ртесКегтапп ек КокноН) Па ек а!, која го предизвикува прстенестото гниење на кртолите и венеењето на компирот (во натамошниот текст штетен организам), се со цел да се: (а) лоцира и одреди нејзината раширеност и дистрибуција; (6) спречи нејзиното појавување и ширење и (в) ако се пронајде, да се спречи нејзиното ширење и да се контролира заради целосна елиминација. Член 5 () Посебниот надзор фитосанитарниот инспектор го врши за да утврди присуство на штетениот организам во кртолите и кога е потребно на растенијата од компир (Џоѓапит киБегозит |.) кои потекнуваат од местото на производство, за да се потврди отсуството на штетниот организам. (2) При вршењето на посебниот надзор фитосанитарниот инспектор треба да зема примероци мостри од кртоли од семенски и меркантилен компир. Препорачливо е да се земаат примероци мостри посебно од секоја партија во складиштата и да се испитаат со лабораториско тестирање по методот утврден во Прилог 1 кој е составен дел од оваа наредба. Каде е соодветно, фитосанитарниот инспектор може да врши посебен надзор со визуелен преглед со сечење на кртолите. (5) Посебниот надзор, во случај на растенија од компир се спроведува со примена на соодветни методи за земање на примероци-мостри кои подлежат на соодветно лабораториско тестирање или може да се користат и методи препорачани од страна на Европската организација за заштита на растенијата. (4) Бројот, потеклото, стратификацијата и времето на собирање на примероците- мострите се одредува врз основа на сигурни научни принципи, биологијата на штетниот организам и земајки го во предвид начинот на производство на компир, за потврдување на отството на штетниот организмот. Член 4 При вршење на посебен надзор фитосанитарниот инспектор треба да утврди дека нема сомнителната појава или потврдена присутност на штетен организам кај растенијата од компир и кртоли кога се берат, складираат или пласираат на пазар, од сопственици регистрирани согласно Правилникот за формата, содржината и начинот на водење на Регистарот на производители, преработувачи, увозници и дистрибутери на растенија, растителни производи и други објекти и предмети (?). ()Правилникот за формата, содржината и начинот на водење на Регистарот на производители, преработувачи, увозници и дистрибутери на растенија, растителни производи и други објекти и предмети е усогласен со одребите на Директивата на Советот бр.2000/29/ЕЗ од 8 мај 2000 за заштитните мерки против воведување во Заедницата на организми штетни за растенијата или растителните производи и против нивното ширење во Заедницата, се|ех број 2200010029; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2001/35/ЕЗ на 8 Мај 2001 година, се|ех број 2200110055; изменета и дополнета со Директивата бр.2002/28/ЕЗ од 19 март 2002 година, сеѓех број 52002/0028; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2002/56/ЕЗ на 29 април 2002 година, сејех број 5200210056; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр.2002/89/ЕЗ од 28 ноември 2002 година, се|ех број 2200210089; изменета и дополнета со Директивата бр.2005/22/ЕЗ од 24 март 20053 година, се|ех број 5200510022; изменета и дополнета со Регулативата на Советот (ЕЗ) бр.806/2005 од 14 април 2005 година, сејех број 22005К0806; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/47/ЕЗ на 4 јуни 2005 година, сеѓех број 5200510047; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/116/ЕЗ од 4 декември 2003 година, се!ех број 320031.0116; изменета и дополнета со Директивата бр.2004/51/ЕЗ од 17 март 2004 година, сеѓех број 52004/10051; изменета и дополнета со Директивата бр.2004/70/ЕЗ од 28 април 2004 година, се|ех број 220041 0070; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2004/102/ЕЗ на 5 октомври 2004 година, се|ех број 220041/0102; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр. 2005/15/ЕЗ од 28 февруари 2005 година, сејех број 220051/0015;изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/16/ЕЗ на 2 март 2005 година, се|ех број 52005//0016; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2005/77/ЕЗ од 11 ноември 2005 година, сејех број 2200510077; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2006/14/ЕЗ од 6 февруари 2006 година, се|ех број 5200610014; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2006/55/ЕЗ од 24 март 2006 година, се|ех број 520061.0035; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2007/41/ЕЗ од 28 јуни 2007 година, се|ех број 220071 0041; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2008/64 /ЕЗ од 27 јуни 2008 година, сејех број 52008 10064; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата 2008/109/ЕЗ од 28 ноември 2008 година, сеѓех број 3200810109; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр. 2009/7/ЕЗ на 10 февруари 2009 година, се|ех број 520091 0007; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2009/118/ЕЗ на 9 септември 2009 година, сејех број 2200910118; изменета и дополнета со Директивата на Советот бр.2009/145/ЕЗ од 26 ноември 2009 година, сеѓех број 5200910143; изменета и дополнета со Директивата на Комисијата бр.2010/1/ЕУ од 8 јануари 2010 година, сеѓех број 5201010001; Директивата на Комисијата бр.1992/90/ЕЗ од 3 ноември 1992 година за утврдување на обврските кои се однесуваат на производителите или увозниците на растенија, растителни производи и други објекти и за утврдување на деталите за нивна регистрација, се|ех број 51992/0090; Директивата на Комисијата бр.995/50/ЕЗ од 24 јуни 1995 година за определунање на одредени растенија кои не се во Анекс У дел А од Директивата на Советот бр.7//95/ЕЗ, чии производители или складишта, дистрибутивни центри во производните зони на вакви растенија, треба да бидат внесени во службен регистар, се|ех број 2199310050. Член 5 () Во случај на сомневање за појава на штетниот организам, фитосанитарниот инспектор по пријавен случај за сомневање, треба да изврши посебен надзор. При лабораториски тестирања се користи методот утврден во Прилог 1 од оваа наредба и во согласност со условите од Прилог 2 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба, за да се потврди или да се побие сомневањето за појавата на штетниот организам. Во случај, да се потврди сомневањето на штетниот организам, треба да се превземат мерките од Прилог 2 точка 2 од оваа наредба. (2) Заради потврдување или побивање на сомневањето за појава на штетен организм од став (1) од овој член, каде: 1. биле забележани сомнителни дијагностички и визуелни симптоми од болеста, односно биле забележани видливи знаци на болеста; или 2. имунофлуоросцентниот тест од Прилог 1 од оваа наредба или други соодветни тестови биле позитивни, фитосанитарниот инспектор треба да: го забрани пуштањето во промет или преместување на сите партии или пратки од кои се земени примероците, освен оние кои се под нивна контрола и ако е утврдено дека нема опасност од ширење на штетниот организам; превземе мерки за откривање на можниот извор заради утврдување и следење на потеклото на сомневањето за појавата на штетниот организам; воведе соодветни дополнителни заштитни мерки врз основа на проценка на ризик, за да се спречи секакво ширење на штетниот организам. Таквите мерки може да вклучат контрола на местото на производство, пуштањето во промет, преместување на сите други кртоли или растенија внатре или надвор од просторите, кои се поврзани со сомневањето за појавата И воведе карантин на местото на производство со посебен фитосанитарен надзор. Член 6 Ако со посебениот надзор или лабораториски тестирања користени по методот од Прилог 1 од оваа наредба, се потврди присутноста на штетениот организам во примероците-мострите на кртолите од компир, растенијата или деловите од растенијата, фитосанитарниот инспектор имајќи ја во предвид биологијата на штетениот организам, производството, маркетингот и преработувачките капацитети, треба да: (а) ги прогласи за контаминирани кртолите или растенијата, пратката и/или партијата, машините, опремата, превозните средства, садовите, складиштето или сите делови од нив, како и други предмети, вклучувајки ја амбалажата и материјалот за пакување, од кои се земени примероците, местото(ата) на производство и полето(ињата) од каде биле собрани кртолите или растенијата; (6) го одреди, степенот на можната контаминација преку контакт пред или по бербата или преку поврзување на производството со означената контаминација, имајќи ги предвид одредбите од Прилог 5 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба; (в) да демаркира зона врз основа на објавената контаминација до : степенот на можната контаминација И можното ширење на штетениот организмот согласно Прилог 5 точка 2 од оваа наредба. Член 7 () Таму каде што кртолите или растенијата биле прогласени за контаминирани, фитосанитарниот инспекторт треба да изврши тестирање на залихите на компир, кои се клонски сродни со оние опфатени со контаминацијата. Тестирањето на кртолите или растенијата се врши колку што е потребно за одредување на можниот главен извор на инфекција и степен на можна контаминација, со цел да се одреди степенот од ризик. (2) Како резултат од тестирањето понатамошното назначување на контаминацијата, определувањето на степенот од можното заразување и демаркирање на зоната, се изведува согласно член 6 од оваа наредба. Член 8 (1) Кртолите и растенијата, кои се прогласени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба не треба да се садат и под надзор на фитосанитарниот инспекторт треба: да бидат уништени, или на друг начин отстранети, согласно мерките за посебен надзор, утврдени од во Прилог 4 точка 1 кој е составен дел од оваа наредба, ако е утврдено дека не постои никаков ризик од ширење на штетниот организам и отпадот од истите да биде отстранет согласно Прилог 5 кој е составен дел од оваа наредба. (2) Кртолите и растенијата кои се прогласени како контаминирани согласно член 6 точка (6) од оваа наредба под надзор на фитосанитарниот инспекторт: (а) не треба да се садат, без оглед на резултатот од тестирањето наведено во член 7 од оваа наредба залихи од клонско сродни, под контрола на фитосанитарниот инспектор да бидат соодветно користени или отстранети, согласно Прилог 4 точка 2 од оваа наредба на начин ако е утврдено дека не претставуваат никаков ризик од ширењето на штетниот организам; (6) секоја машина, превозно средство, опрема, садови, складишта и делови од нив или други предмети, амбалажа и материјалот за пакување, кои се прогласени за контаминирани или одредени за можно контаминирани согласно член 6 точка (а) и (б) од оваа наредба треба да бидат уништени или исчистени и дезинфицирани со употреба на соодветни методи, согласно Прилог 4 точка 5 од оваа наредба. По извршената дезинфекцијата, ваквите предмети нема да се сметаат како контаминирани; (8) за зоната, која е демаркирана согласно член 6 точка (в) од оваа наредба се утврдува серии од мерки, согласно Прилог 4 точка 4 од оваа наредба. Член 9 Семенскиот компир треба да се тестира за да се утврди дали ги исполнува посебните фитосанитарни барања и дали потекнува непосредно од материјал, кој е добиен во рамките на официјално одобрена програма, со официјални контролирани тестови по методот утврден во Прилог 1 од оваа наредба, дека е слободен од штетниот организам. Ова тестирање се спроведува во: случаи кога контаминацијата влијае врз производството на семенски компир, на растенија за почетна клонска селекција; или во случаи кога треба да се утврди отсуството на штетниот организам на секое растение за почетна клонска селекција или на репрезентативните примероци-мостри од основниот семенски компир или компирот од претходните размножувања. Член 10 Без оглед на одредбите од оваа наредба согласно Правилникот за научни и технички капацитети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи (?), по одобрување од страна на Фитосанитарната управа може да се изврши увоз за внесување или движење на штетни организми, растенија, растителни производи и други објекти и предмети наменети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи, во кои случаи не се применуваат одредбите од членовите 7 и 8 од оваа наредба, под услов да не се наруши контролата врз штетниот организам и да не се предизвика ризик од ширење на штетниот организам. (?) Правилникот за научни и технички капацитети за експериментални, научноистражувачки, селекциони или развојни работи е усогласен со одребите на Директивата на Комисијата бр. 2008/61/ЕС на 17 Јуни 2008 за утврдување на условите под кои одредени штетни организми, растенија, растителни производи и други објекти наведени во анексите од | до У Директивата на Советот 2000/29/ЕС може да се внесат во или движат во рамките на Заедницата или одредени заштитени зони од него, за експерименти или научни цели и за работа на сортната селекција, се|ех број 2200810061. Член 1 (1) Доколку условите тоа го налагаат може да се применат и други дополнителни или построги мерки заради уништување на штетниот организам или да се спречи неговото ширење. (2) Дополнителните мерки од став (1) од овој член можат да вклучат упатство дека може да се сади само семенскиот компир, кој е официјално потврден или официјално прегледан и ги исполнува бараните фитосанитарни стандарди за здравствената состојба на растението. Оваа може да се примени и во случај кога на земјоделците им е дозволено да го употребуваат на нивните сопствени имоти семенскиот компир, кој е добиен од сопствено производство. Член 12 Со денот на влегувањето во сила на оваа наредба престанува да важи Наредбата за систематски контроли и мерки за спречување на ширењето на прстенесто гниење на клубените и венеење на компирот предизвикано од Самраскег тисНјдапеп5ј5 (оти) ГЈам5 ес а!. зор. зередопгси5 (ортесКегтапп ек КоскноП) Вам ек а!. („Службен весник на Република Македонија“ бр. 32/07). Член 15 Оваа наредба влегува во сила осмиот ден од денот на објавувањето во „Службен весник на Република Македонија“. Бр.17-298/ 7 Министер за земјоделство, септември 2011 година шумарство и водостопанство, ПРИЛОГ 1 ТЕСТ ШЕМА ЗА ДИЈАГНОЗА, ОТКРИВАЊЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЈА НА БАКТЕРИЈАТА НА ПРСТЕНЕСТО ГНИЕЊЕ НА КРТОЛИТЕ И ВЕНЕЕЊЕ НА КОМПИРОТ Слаирасѓег тсидапепо5 (5тип) рам ек а! зирр.5ереаотси5 (5рѓескегтапп ек Кокноќ) Кам еќа!. ОПСЕГ НА ТЕСТ ШЕМАТА Следната шема ги опишува различните постапки вклучени во: (1) дијагнозата на прстенестот гниење на кртолите и венеење на растенијата кај компирот, (2) откривање и детекција на Сѓауфасѓег тетдапеп5ф (5тип) Пам5 е! а! 5иБор 5ереаопкси5 (рескегтапп ек Конпоѓ) ДОач5 ек а!. во примероци од кртоли на компири и растенија, (3) идентификација на С/аифастег теријапепо5 (5тип) Пра е! а! 5ир5р. зередоптси5 (Брескегтапп е! Коцноѓ) Оачи5 ек а!. (во натамошниот текст како С. т. 5ирв5р. зередопси5). ОПШТИ ПРИНЦИПИ Во додатоците обезбедени се оптималните протоколи за различни методи, потврдени реагенси и детали за подготовка на материјалите за тестирање и контрола. Лаборатории вклучени во оптимизирањето и потврдувањето на протоколите се наведени во Додаток 1. Бидејќи протоколите вклучуваат откривање на карантински организам и ја вклучуваат употребата на живи култури на С. т. 5иб5р. 5ередопси5 контролен материјал, потребно е да се спроведат постапките под соодветни карантински услови со соодветни средства за отпадните материјали и според условите со соодветни одобренија, издадени од Фитосанитарната управа. Параметрите за тестирање мора да обезбедат веродостојна и репродуктивна детекција на нивоата на С. т. 5ир5р. 5ередолси5 на поставените прагови од избраните методи. Најважно е да се изврши соодветна подготовка на позитивните контроли. Тестирањето според бараните прагови, исто така укажува на точни поставки, одржување и калибрирање на опремата, внимателно ракување и чување на реагенсите и сите мерки за спречување контаминација помеѓу примероците, те. одделување на позитивните контроли од примероците за тестирање. Мора да се применуваат стандардите за контрола, со цел да се избегнат административни и други грешки, особено во врска со означувањето и документацијата. Сомневањето за појавата како што е наведено во член 5 став (2), доколку укажува на позитивен резултат во дијагностицирањето или тестовите за анализа кои се извршени на примерокот, наведено е во графиконите. Ако првиот тест за анализа (Е или РСВК /ЕГ5Н ) е позитивен, тогаш постои сомнеж за контаминација со С. т. 5иб5р. 5ередопси5 и затоа мора да се направи второ тестирање. Ако второто тестирање е позитивно, тогаш се потврдува сомнежот (сомневањето за појавата) и мора да се продолжи тестирањето според шемата. Ако вториот тест за анализа е негативен, тогаш примерокот се смета дека не е заразен со С. т. 5ир5р. 5ередопкси5 Затоа, позитивен |Е тест како што е наведено во член 5 став (2) од наредбата, се дефинира како позитивно |Е читање потврдено со вториот тест (РСВ /Е|5Н). Потврдено присуство, како што е наведено во член 6 од наредбата, укажува на изолација и идентификација на чиста култура на С. т. 5ибзр. 5ереадотси5, со потврда на патогеноста. 1. ДИЈАГРАМСКИ ПРИКАЗ 1.1. Шема на откривање за дијагноза на прстенесто гниење на кртолите и венеење на растенијата кај компирот со симптоми на прстенесто гниење и венеење кај компирот Постапката за тестирање е наменета за кртолите и растенија од компир со симптоми типични за или кои упатуваат на прстенесто гниење и венеење на растенијата кај компир. Постапката вклучува брз тест за анализа, изолација на патогенот од заразеното спроводното ткиво на медиум за дијагностицирање и во случај на позитивен резултат. идентификација на култура на С. т. 5ив5р. зереадотси5. Тубера "аа КОматоарат Ч СЕЗИРНАСРЧО мг расте гија СО ГИКЕТТААЕ Хо га рааат КЕ ГЕСТРНЕСТ ГнАЛЕ е; а Џини ТЕСТОВИ са ) с СТ ОСЛАД ЗАЛЕНИИ ќе тиѓичано мара НЕ а бтирики, е чот УСеДеЛКЏ“, Примолбит НЕ виндизијан се СоЈџер оврајатецо да ј Писчисти со супкдетуди ТЕСТОВИ ЗА ИДЕНУХИКАЦИЈА 2 ТЕК ЗА ГАТСГЕНОСТ ОП о н о Идвоте теста потерича нат "иста не ССРО ле ЗЕБИССИИ ИО прриетокот Не Заре ри иа ми „одек ерес ричојанке е зајаден ге (1) Описот на симптомите е прикажан во Дел 2. (2) Соодветните тестови се следните: ГЕ - тест (Дел 4), РСВ - тест (Деп 6), ЕГ5Н - тест (Деп 5). (3) Иако изопацијата на патогенот од растителниот материјал со типични симптоми со обложување со раствор е директно, обработката може да не успее во понапредните фази од инфекцијата. Сапрофитските бактерии кои растат на заразеното ткиво може да го надрастат или да го инхибираат патогенот на изолираниот медиум. Затоа, се препорачува да се користат и неселективни и селективни медиуми. особено МТМА (Дел 8) или тестот со биоанализа (Дел 7). (4) Во Дел 8 е содржан описот на типична морфологија на колонија. (5) . Ако тестот со изолација е негативен, но симптомите на болеста се типични, тогаш изолацијата мора да се повтори. (6) „Веродостојна идентификација на чиста куптура на С. т. идр. зереаопки5 се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел 9. (7) Тестот за патогеност е опишан во Дел 10. 1.2. Шема за откривање и идентификација на С/ачраскег тепријапеп5ј5 (5тИП) рам ека! зирзр.5ередопкси5 (5рфескегтапп еј Конпов) рам ека!. во примероци од кртоли на компири без симптоми Принцип Постапката за тестирање е наменета за откривање на латентни инфекции во кртоли на компирот. Мора да се потврди позитивен резултат од најмалку два теста, врз основа на различни биолошки принципи, преку изолација на патогенот, проследено со изолација на типични колонии, потврда за чиста култура на С. т. 5ирр. 5ередопѓси5. Позитивниот резултат од само еден тест за анализа не е доволен да се смета за сомнитепен тој примерок. Тестовите за анализа и тестовите со изолација мора да овозможуваат праг на откривање од 102 до 10“ кпеткилммл на гранулат(талог), вклучувајки како и позитивни контроли во секоја серија тестови. ѓ Тимерок ед тези пит) и Енстракцига и ханцзетрацита -а петаечот 121 | ј ОСНОВНИ ТЕСТОЊА ЗА АНАПИ тета Роб тот (ЕН та зА 4) га Е Кегтизриенто та зедов, фимеракат ное ј инфициран го Сп. гареболиио со ГА ЗЕВЕбИЧЕТО БОР СТЕ Ка е ЕРЕС ЕЕ Селестивна иезца (7, Фчалнааног 19: | Коеаили ча чучиана морнар еко Р че ТИОИЧН СОГ ЕФГЕВЕПНОО, ПРЕМАЕННЕОТ НЕ Е иониирѓн Са СП середотсио Ѓ ТЕСТСЗИ з4 ИЛЕНТИВИЧАЦИ а ТЕСТ ЗА ПАТСГЕНОСТ (21 м И двата теста поте Страсвоз СЕН саат“ чнсте киптура как 5 са: НЕ 2 ЗНЈЕЈЕК СЗ тер серебеР Ена м рскот е зараген со Прима Ст (1) „Стандардната големина на примерокот е 200 кртоли, иако постапката може да се користи и со помали примероци/мостри , ако нема 200 кртоли. (2) Во Дел 34 се наведени методите за екстракција и концентрација на патогенот. (3) Ако најмалку два теста направени врз основа на различни биолошки принципи се позитивни, треба да се изврши изолација и потврдување. Треба да се направи најмалку еден тест за анализа. Кога овој тест е негативен, примерокот се смета за негативен. Во случај овој тест да биде позитивен, потребно е да се направи втор или повеќе тестови врз основа на различни биолошки принципи со цел да се потврди позитивниот резултат. Ако вториот или другите тестови се негативни, примерокот се смета за негативен. Не се неопходни понатамошни тестови. (4) Тест со имунофлуоресценција (Е). Секогаш користете поликлонално антитело за |Е тестирањето, дополнителните моноклонални антитела може попрецизно да се определат (види Деп 4). (5) „ РСВ тест. Користете соодветно потврдени РСК реагенси и протоколи (види Дел 6). (6) „ЕЊН тест. Користете соодветно потврдени реагенси и протоколи (види Дел 5). (7) „ Селективна изолација. Со МТМА медиум или МСР-88 медиум и 1/100 раствор од ресуспендираниот гранулат (талог), овој во голем број случаи е соодветен метод за директна изолација на С. т. 5ирор. зередотсиз5. Типични колонии може да се постигнат 3 до 10 дена по засејувањето. Потоа патогенот може да се прочисти и да се идентификува. За целосна експлоатација на неговиот потенцијал, за тестот е потребна внимателна подготовка на сржта (кортексот) од окцата. со цел да се избегнат секундарни бактерии од кртолите кај компирот, кои ќе бидат конкуренти на С. т. 5ирбр. 5ередотси5 на медиумот! хранливата подлога и би можеле да го надрастат патогенот. Ако тестот со подлогата не успее да овозможи изолација од растенијата што се користат за биоанализа (види Дел 8). (8) Тестот со бисанализа се користи за изолација на С. т. 5ир5р. 5ередопси5 од екстрактите на компирот, преку селективно збогатување кај модрите патлиџани (боѓапит теѓопдепа). Тестот бара оптимални услови за инкубација, како што е утврдено во овој метод. Бактериите што го инхибираат С. т. 5иБ5р. зередопси5 на МТМА или МСР-88 медиумот, најверојатно нема да го попречуваат овој тест (види Дел 7). (9) Во Дел 8 е содржан опис на типична морфологија на колонија. (10) Одгледувањето култури или биоанализата може да не биде успешна поради конкуренцијата или попречувањето од сапрофитските бактерии. Ако со тестовите за анализа се постигнат позитивни резултати, но тестовите за изолација се негативни, треба да се повторат тестовите со изолација од истата подлога те пелети или со земање дополнително од спроводното ткиво Во близина на окцата на пресечените кртоли од истиот примерок и ако биде неопходно да се тестираат дополнителни примероци. (11) МВеродостојна идентификација на чиста култура на С. т. зив5р. зередотси5 се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел 9. (12) Тестот за патогеност е опишан во Деп 10. 1.3. Шема за откривање и идентификација на С/амфасѓет тепадапеп5!5 (5тиП) Оам5 ека! зирр.5ередбопсио(5рескегтапп еќ Кокноб) рам ека!. во примероци од растенија од компир без симптоми ( ПаиметСт ББ ЛЕГВЕНТЕ но Тачи 1 н и 1 4 К и | Екрани иоЦенаа, ЕЛА КОЕ Аа 5 а есте зара аг ГечнА рени иа Ајсо сите НСТВЕНАТЕСТТЕН та ЗАГРЕЕ зораџиата тИТЕ СТА ЕН тЕСТЕЕА та даа ини. НЕка Рич ЧЕ арно ини на еее на др ае НА Иг око от чкресот ол, пр Меросот ме иДесфа со га 580745 нА Чи ЌЕСТ ВЛАКНО НН НаасоИЕЕ иа тесен аа оз нер страда ѓ е ) Пранеудеот зе сажизен го Ј Копер еогевунаје За Гиаикротт а тацна Ста геретелој: (1) Види Дел 3.2 за препорачаната големина на примерокот. (2) Во Дел 32 се наведени методите за екстракција и концентрација на патогенот. (3) „Ако најмалку два теста направени врз основа на различни биолошки принципи се позитивни, треба да се изврши изолација и потврдување. Треба да се направи најмалку еден тест за анализа. Кога овој тест е негативен, примерокот се смета за негативен. Во случај овој тест да биде позитивен, потребно е да се направи втор или да се направат повеќе тестови врз основа на различни биолошки принципи, со цел да се потврди позитивниот резултат. Ако вториот или другите тестови се негативни, примерокот се смета за негативен. Не се неопходни понатамошни тестови. (4) Тестот со селективна изолација и типичната морфологија на колонија се прикажани во Дел 8. (5) !Е тестот е опишан во Дел 4. (6) Дел 6 ги опишува РСЌ тестовите. (7) Е|ФБН тестот е опишан во Дел 5. (8) Биоанализата е опишана во Дел 7. (9) „Одгледувањето култури или биоанализата може да не биде успешна поради конкуренцијата или попречувањето од сапрофитските бактерии. Ако со тестовите за анализа се постигнат позитивни резултати. но тестовите за изолација се негативни, треба да се повторат тестовите и ако биде неопходно да се тестираат дополнителни примероци. (10) Веродостојна идентификација на чиста култура на С. т. з5иб5р. зереаопкси5 се постигнува со користење на тестовите наведени во Дел 9. (11) Тестот за патогеност е опишан во Дел 10. 2. ВИЗУЕЛЕН ПРЕГЛЕД ЗА СИМПТОМИ НА ПРСТЕНЕСТО ГНИЕЊЕ НА КРТОЛИТЕ И ВЕНЕЕЊЕ НА РАСТЕНИЈАТА КАЈ КОМПИРОТ 2.1. Растенија од компир Според европските климатски услови, на полињата ретко се забележуваат симптоми и често само на крајот на сезоната. Понатаму, симптомите често се маскирани или се мешаат со другите болести, стареење или механички оштетувања. Затоа, лесно е да не се забележат симптомите при контролата на терен. Симптомите на овенување се сосема различни од оние на кафеавото гниење. венеењето вообичаено е бавно и првично ограничени на краевите од листовите. Младите инфицирани листови често продолжуваат да растат, но помалку во инфицираните зони. Ова создава листови со чудна форма. Листовите поради блокирање на спроводното ткиво во долниот дел на стеблото, често развиваат хлортични, жолти или портокалови области меѓу лисните жили. Инфицираните леторасти, листовите па дури и стеблата со тек на времето на крајот може да изумрат. Често листовите и кртолите се намалени во големина. Повремено растенијата се џуџести и закржлавени. 2.2. Кртоли од компири Најраните симптоми се слаба прозирнаст на ткивото, без омекнување околу спроводниот систем, особено во непосредна близина на окцето на кртолата . Спроводните "прстени од окцето може да биде незначително потемен од вообичаената боја. Првиот симптом што може да се идентификува е кога спроводниот прстен има жолтеникава обоеност и кога кртолата нежно ќе се притисне, од жилите изпегува бела сиренкаста материја од бактериск исцедок (ексудат). Оваа материја содржи милиони бактерии. Во оваа фаза може да се развие кафеава боја на спроводното ткиво и симптомите на кртолата во оваа фаза се слични со оние кај кафеавото гниење што го предизвикува Раѓѓола 5ојапасеашт 5тп. Реџаотапа5 5оѓапасеагит. Во почетокот, овие симптоми може да бидат ограничени на само еден дел од спроводниот прстен, тие не мора да биде во близина на окцето и може постепено да се шират на целиот прстен. Како што напредува инфекцијата, доаѓа до пропаѓање на спроводното ткиво, надворешната кора може да се оддели од внатрешната. Кај напредните фази од инфекцијата се појавуваат пукнатини на површината на кртолата, кои често се црвеникаво-кафеави на краевите. Појавени се неколку случаи каде што централно сржта гние во исто време како и спроводниот прстен, што резултира со секундарна инвазија со внатрешно гниење, создавање на шуплини и некроза. Секундарниот напад од габите или бактериите може да ги маскира симптомите и може да биде тешко, дури и невозможно да се направи разлика помеѓу симптомите од прстенесто гниење на кртолите од другите гниења кој се јавува на кртолите. Можни се атипични симптоми. 3. ПОДГОТОВКА НА ПРИМЕРОКОТ 3.1. Кртоли на компири Забелешка: Стандардната големина на примерокот е 200 кртоли по тест. Поинтензивното земање примероци бара повеќе тестови за примероците со оваа гогемина Поголем број кртоли во примерокот доведува до инхибирање (запирање) или тешко толкување на резултатите. Меѓутоа, постапката може последователно да се примени за примероци со помалку од 200 кртоли, каде на располагање се помалку кртоли. Потврдувањето на сите методи за откривање наведени подолу се заснова врз тестирање на примероци од 200 кртоли. Екстрактот од компир што е наведен подолу може, исто така, да се користи за откривање на бактеријата на кафеаво гниење кај компирот, аѓѓола зојапасеатшт. Постапка пред подготвување на примерокот: Измијте ги кртолите. Користете соодветни средства за дезинфекција (соединенија на хлор кога се користи РСЌК. тестот, со цел да се отстранат можните патогени ДНК) и детергенти на секој примерок. Исушете ги кртолите со вентилирање или сушење. Оваа постапка за миење особено е корисна (но не е задолжителна) за примероците со многу почва и ако треба да се изврши РСВ тестот или постапката за изолација. 3.1.1. Со чист и дезинфициран скалпел или нож отстранете ја кората од окцето на секоја кртола, така што ќе се гледа спроводното ткиво. Внимателно отстранете мап дел од спроводното ткиво во подножјето на окцето и внимавајки да се зафати што помалку соседно неспроводно ткиво. Забелешка: Одделете ги сите кртоли со сомнителни симптоми на прстенесто гниење и извршете го тестот одделно. Ако за време на отстранувањето на делот на сржта (кортекс) од окцето се забележуваат симптоми на прстенесто гниење, кртолата треба визуелно да се испита откако ќе се пресече во близина на окцето. Секој пресечена кртола со сомнителни симптоми треба да се суберизира на собна температура во период од два дена во карантин (на температура од 4 до 10“С) се додека не се завршат сите тестирања. Сите кртоли во примерокот (вклучувајќи ги и оние со сомнителни симптоми) треба да се чуваат според Прилог 2. 3.1.2. Соберете ја сржта (кортекс) од окцата во неискористени садови за една употреба кои може да се затворат и/или да се запечатат (во случај садовите да се користат повторно, тие треба темелно да се исчистат и да се дезинфицираат со употреба на соединенија од хпор). По можност, веднаш да се обработи. Ако ова не е можно, треба да се чуваат во сад без додавање на заштита, да бидат ставени во фрижидер не подолго од 72 часа или не подолго од 24 часа на собна температура. Сушењето и суберизацијата на сржта (кортексот). како и растот на сапрофитите за време на чувањето може да го спречи откривањето на бактеријата на прстенесто гниење. 3.1.3. Обработете ја сржта (кортекс) од окцето со една од следните постапки: или (а) покријте ја сржта (кортекс) од окцето со доволно количество (приближно 40мл) пуфер за екстракција (Додаток 3) и извршете миксација со ротирачки мешач (50 до 100 вам) во период од 4 часа на температура под 24"С за 16 до 24 часа во фрижидер, или (б) хомогенизирајте ја сржта (кортекс) од окцето со доволно количество (приближно 40мл) пуфер за екстракција (Додаток 3), или со блендер/ миксер (на пр. Муаппа ог Џига ТНигах) или со кршење во затворено ќесе за смекнување за една употреба (на пр.5готаснег ог Вогеба, цврст политен, 150 мм х 250 мм, стерилизирана со радијација) со употреба на гумен чекан или соодветна апаратура за ситнење ѓна пр. Нотех). Забелешка: Ризикот за напречна контаминација на примероците е висока кога примероците се хомогенизираат со миксер. Треба да избегнувате генерирање на аеросоли или истурање за време на процесот на екстракција. Осигурете ја употребата на свежо стерилизирани ножеви на миксерот и садовите за секој примерок. Ако се користи РСК тестот, избегнувајте пренесување на ДНК на садовите или гпаратурата за ситнење. Се препорачува кршење во ќесиња за една употреба и користење епрувети за една употреба кога се користи РСК. 3.1.4. Претурете го чистиот флуид. Ако е премногу матен. разбистрете го со центрифугирање на ниска брзина (не повеќе од Ча8Уог за 10 минути, на температура помеѓу 4 до 10“С) или со вакумска филтрација (40 до 100 џм), миење на филтерот со дополнителен (10 мп) пуфер за екстракција (Додаток 3). 3.1.5. Концентрирајте го бактерискиот дел со центрифугирање на 7000 г за 15 минути (или 10(000г за 10 минути) на температура помеѓу 4 до 10"Си отстранете го чистиот флуид без да го попречите гранулатот и да не се помеша тапогот. 3.1.6. Ресуспендирајте го гранулатот во пуфер за гранулат од 1.5мл (Додаток 3). Користете 500 џл за да направите тест за С. т. 5ир5р. 5еребопкси5. 500 џп за какѓота зоѓапасеагит и 500 џл за референтни цели. Додадете стерилен глицерол на конечната концентрација од 10 до 2529 (жА) на 500 џл од референтниот коефициент и со остатокот од количеството за тестирање, вортекс и чувајте на температура од -16 до -24"С (недепи) или на - 68 до 86"С (месеци). Зачувајте ги апиквотните броеви на тестот на температура од 4 до 10“ С за време на тестирањето. Не се препорачува повторено замрзнување и кондензација. Ако е потребен транспорт на екстрактот, истиот треба да се изврши во разладена комора во период од 24 до 48 часа. 3.1.7. Важно е сите позитивни контроли на С. т з5ир5р зереботси5 и примероците да се третираат одделно, со цел да се избегне контаминација. Ова се однесува на |!Е слајдовите и на сите тестови. 3.2. Растенија од компир Забелешка: За откривање на латентни популации на С. т. з5иб5р. 5ередолси5, се препорачува тестирање на композитни (сложени) примероци. Постапката може да се користи за композитни (сложени) примероци до 200 делови од стебла. (Онаму каде што се вршат истражувања. тие треба да се прават врза основа на статистички соодветен примерок од растителната популација која се испитува.) 3.2.1. Со чист дезинфициран нож или ножици за режење, отстранете 1 до 2 см сегмент од основата на секое стебло, веднаш над нивото на почвата. Дезинфицирајте ги деловите од стеблото со 7095 етанол и веднаш исушете ги со хартија. Ставете ги сегментите од стеблото во стерилен сад, според следните постапки за примероци: 3.2.2. Обработете ги деповите од стеблото со една од следните постапки: или. (а) покријте ги деловите со доволно количество (приближно 40 мл) пуфер за екстракција (Додаток 3) и извршете миксација со ротирачки мешач (50 до 100 вртења/минута) во период од 4 часа, на температура под 24"С за 16 до 24 часа чување во фрижидер, или (6) веднаш извршете обработка. Со кршење на деловите во цврсто ќесе за смекнување (на пр. 5готаспег ог Виогера) со соодветно количество пуфер за екстракција (Додаток 3), со користење на гумен чекан или соодветна апаратура за ситнење (на пр. Нотех). Ако ова не е можно, деловите од стеблото треба да се чуваат замрзнати не подолго од 72 часа или не подолго од 24 часа на собна температура. 3.2.3. Претурете го чистиот флуид откако ќе отстои 15 минути 3.2.4. Вообичаено, не е потребно понатамошно прочистување на екстрактот или концентрацијата на бактерискиот дел, но тоа може да се постигне со филтрација и/или центрифугирање, како што е опишано во деловите од 3.1.4 до 3.1.6. 3.2.5. Поделете го концентрираниот екстракт за примерок на два еднакви дела. Едната половина чувајте ја на температура од 4 до 10“"С за време на тестирањето, а другата половина чувајте ја со 10 до 259 (У/) стерилен глицерол на температура од -16 до -24"С (недели) или на -68 до -86?С (месеци). ако е потребно понатамошно тестирање. 4. |Е ТЕСТ Принцип Употребата на |Е тестот како основен тест за анализа (скрининг тест) се препорачува поради неговата докажана способност за постигнување на бараните гранични вредности. При употреба на !Е тестот како основен тест за анализа, ако резултатот е позитивен мора да се направи РСК или ЕГ5Н тест, како втор тест за анализа. Кога се користи |Е. тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира анализата. Забелешка: Секогаш користете поликлонални антитела кога |Е тестот се користи како основен тест за анализа. Во случај на позитивен резултат со поликлоналното антитело, понатамошното испитување на примерокот со монокпонално антитело може да овозможи прецизност, но помала чувствителност. Користете антитела со референтна низа на С. т. 5џР5р. зередопси5. Се препорачува титерот да се определи за секоја нова група антитела. Титерот се дефинира како највисок раствор на кој се јавува оптимална реакција кога се врши тестирање на суспензија што содржи од 10? до 10“ клетки на мл од хомогениот вид на С. т. 5ир5р. 5ередолси5 и кога се користи соодветен флуоресцентен изотиоцинатен конјугат (ЕТС), според препораките на производителот. Суровите поликлонални или моноклонални антитела треба да имаат |Е титер од најмалку 1:2000. За време на тестирањето, антителата треба да се користат на работните раствори (УО) во близина на или во ниво на титерот. Користете соодветните антитела. Тестот треба да се изведе на свежо подготвени екстракти. Ако е неопходно, може успешно да се изврши на екстракти што се чуваат на температура од -68 до -86“С со глицерол. Глицеролот може да се отстрани од примерокот со додавање на 1 мл гранулатен пуфер (Додаток 4), рецентрифугирање за 15 минути на 7000 грама и ресуспензија на еднакво количество гранулатен пуфер. Ова често не е неопходно, особено ако примероците се фиксирани на плочки со пламен. (види 2.2). Подгответе одделни позитивни контролни слајдови од хомологени видови или која било друга референтни видови на С. т. 5ивзр 5ередоптси5. ставена во екстракт од компир, како што е наведено во (Додаток 2) и по избор, во пуфер. Природно заразеното ткиво (кое се одржува со лиофилизациа или замрзнување на температура од --16 до -24?С) треба. каде што е можно, да се користи како слична контрола на истиот слајд. Како негативни контроли, користете ги апиквотите на екстрактот од примерокот што претходно покажал негативен резултат. Користете повеќекратни микроскопски плочки, по можност со 10 прозорчиња со дијаметар од најмалку 6 мм. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). 41. Подгответе ги плочките за тестирање користејќи една од следните постапки: (а) За гранулатите (талог) со релативно мал седимент на скроб: Со пипета земете стандардно количество (15 џл е соодветно за прозорец со дијаметар од 6 мм -- за поголеми прозорци користете поголеми количества) од 11090 раствор на ресуспендираниот гранулат од компирот и ставете го на првиот прозорец. Потоа, земете слично количество нерастворен гранулат (171) и ставете го врз другите прозорци во редот. Вториот ред може да се користи како дупликат или како втор примерок, како што е прикажано на слика НА (6) За другите гранулати (талози) : Подгответе децимални раствори (1/10 и 1/100) од ресуспендираниот гранулат во пуфер за гранулати. Со пипета земете стандардно количество (15 џл е соодветно за прозорец со дијаметар од 6 мм -- за поголеми прозорци користете поголеми количества) од ресуспендираниот гранулат и секој раствор во редот прозорци. Вториот ред може да се користи како дупликат или како втор примерок, како што е прикажано на слика 2. 4.2. Исушете ги капките на собна температура или со загревање на температура од 40 до 45 “С. Фиксирајте ги бактериските клетки на плочката со загревање (15 минути на температура од 60 “С), запалување со 9595 етанол или според упатствата од добавувачите на антитела. Ако е неопходно, фиксираните плочки потоа може да се чуваат замрзнати во сува кутија во копку што е можно пократок период (максимално до 3 месеци) пред да се продолжи со понатамошно тестирање. 4.3. |Е постапка (а) Според подготовката на плочката за тестирање, наведено во 4.1(а): Подгответе сет двократни раствори антитела во |Е пуфер. Првата комора треба да содржи "2 од титерот (Т/2), а другите 7л од титерот (1/4), 15 од титерот (Т/2), титерот (Т) и двојно од титерот (21). (6) Според подготовката на плочката за тестирање, наведено во 4.1(6): Подгответе го работниот раствор (УО) на антителата во |Е пуфер. Работниот раствор влијае на специфичноста. Слика 1. Подготовка на плочката за тестирање, според 4.1ѓа) и 4.Зѓа) Раствори на ресуспендиран гранулат 1400 1/4 Ши 1/ 1/7 Раствори на ресуспендиран гранулат (Тститер) | Т2. Т/4 Ти Т УДЈ -... Двократни раствори на антисерум/антитела Примерок 1 е. е. е. е. е. Дупликат примерокот 1 или примерокот 2 ге ее. Слика 2. Подготовка на плочката за тестирање. според 4.1(6) и 4.3(6) Работен раствор од антисерум/антитело 14 10 400 Празно Празно " децимален раствор на ресуспендиран гранулат Примерок 1 е. е. е. Ф. Ф. Дупликат примерокот 1 или примерокот 2 еве. 4.3.1. Распоредете ги плочките на влажна хартија. Целосно покријте го секој тест прозорец со растворот од антитела. Количеството антитела што се применува на секој прозорец мора да биде најмалку колку количеството екстракт што се користи. Следната постапка треба да се изврши ако нема специфични упатства од добавувачите на антитела: 4.3.2. Извршете инкубација на плочките на влажна хартија, покриени, во период од 30 минути на собна температура (18 до 25“С). 4.3.3. Протресете ги капките од секоја плочка и внимателно измијте со |Е пуфер. Измијте со потопување за 5 минути во |Е пуфер - (Тжееп) (Додаток 3) и потоа за време од 5 минути во |Е пуфер. Избегнувајте предизвикување аеросоли или пренос на капките. кое може да резултира со напречна контаминација. Внимателно отстранете ја влажноста со нежно бришење. 4.3.4. Распоредете ги плочките на влажна хартија. Покријте ги тест прозорците со раствор од ЕПТС конјугат кој се користи за определување на титерот. Количеството конјугат што се применува на секој прозорец мора да биде идентично како количеството антитела што се користи. 4.3.5. Извршете инкубација на плочките на влажна хартија, покриени, во период од 30 минути на собна температура (18 до 25“С). 4.3.6. Истресете ги капките од конјугатот од секоја од плочката. Измијте како што е наведено во (4.3.3). Внимателно отстранете го вишокот влажност. 4.3.7. Со пипета земете 5 до 10 џл од ОМ глицерол збогатен со фосфат (Додаток 3) или комерцијално средство против избледнување на секој прозорец и покријте со микроскопско стакленце. 4.4. Читање на |Е тестот: 4.441. Разгпедајте ги плочките на епифлуоресцентен микроскоп со филтри соодветни за екситација на ЕТПТС, со потопување во масло или вода, со зголемување од 500 до 1000. Скенирајте ги прозорците по два дијаметри под прав агол и околу периметарот. За примероците кои не покажуваат или покажуваат мал број клетки, набњудувајте најмалку 40 микроскопски полиња. Проверете ја прво позитивната контролна плочка. Клетките мора да бидат светли флуоресцентни и целосно прекриени со титерот од антитела или работниот раствор. !Е тестот (Дел 4) мора да се повтори ако прекриеноста не е доволна. 4.4.2. Набтудувајте за светлите флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија на С. т. 5ир5р. 5ередотси5 во тест прозорците на тест плочките. Интензитетот на флуоресцентноста мора да е еднаков или подобар од сојот на позитивната контролна на истиот раствор на антитела. Клетките со нецелосно прекривање или со слаба флуоресценција мора да се отфрлат. Ако има сомнеж за контаминацијата, тестот мора да се повтори. Ваков може да биде случајот кога сите плочки во групата покажуваат позитивни клетки поради контаминацијата на пуферот или ако се забележат позитивни клетки (надвор од прозорците на плочката) на прекривката на плочката. 443 Постојат неколку проблеми што се карактеристични за тестот со имунофлуоресценција. Основните популации флуоресцентни клетки со атипична морфологија и сапрофитски бактерии со големина и морфологија слична на С. т. 5ирор зередопсиз, најверојатно ќе се појават во сржта (кортексот) на компирот и на сегментите од стеблото. 4.4.4. Треба да се земат предвид само клетки со типична големина и морфологија на титерот или работниот раствор на антитела, како што е во 4.3. 4.4.5. Толкување на читањето на !|Е тестот: ѓа) Ако се забележат светли флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија, пресметајте го просечниот број типични клетки по микроскопско поле и пресметајте го бројот на типични клетки по мл ресуспендиран гранулат (Додаток 4). |Е читањето е позитивно за примегроците со намалку 5 х 108 типични клетки на мл ресуспендиран гранулат. Примерокот се смета за потенцијално контаминиран и потребно е понатамошно тестирање. (6) !Е читањето е негативно за примероците со помалку од 5 х 10" клетки на мл ресуспендиран гранулат и примерокот се смета за негативен. Не е потребно понатамошно тестирање. 5. ЕГБН тест Принцип Кога се користи ЕГ5Н тест како прв тест за анализа и ако истиот е позитивен, мора да се направи |Е тест, како втор задолжителен тест за анализа. Кога се користи ЕГ5Н тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира дијагнозата. Забелешка: Користете верификувани специфични олиго-проби за С. т. зир5р. 5еребопјси5 (Додаток 7). Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 103 до 10“ клетки од С. т. 5ифр. зередолкси5 на мл, додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резуптат. Следната постапка пожелно е да се врши на свежо подготвен екстракт од примерок, но исто така, може успешно да се изврши и на екстракт од примерок што се чува во глицероп на температура од --16 до -24"С или -68 до -86“С. Како негативни контроли, користете ги аликотите на екстрактот од примерокот што претходно покажал негативен резултат за С. т. 5ир5р. 5ередотси5. Како позитивни контроли, подгответе суспензии кои ќе содржат 10? до 109 клетки на мл од С. т. 5ир5р. 5ередотси5 (на пр. МСРРВ 4053, или РО 406) во 0,01 М фосфатен пуфер (РВ) од три до пет дневна култура (подготовка види Додаток 2). Подгответе одделни позитивни контролни плочки од хомогениот сој или кој било друг референтен сој на С. т. 5ир5р. зередолси5, ставена во екстракт од компир, како што е наведено во (Додаток 2). Користењето на Е!5Н означена еубактериска олиго-проба нуди контрола за процесот на хибридизација, бидејќи ќе ги прекрие сите еубактерии што се присутни на примерокот. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). 5.1. Фиксирање на екстрактот од компир Следниот протокол се базира на УЧиШпа5 ес а!.. (1998) 5.1.1. Подгответе раствор за фиксираење (види Додаток 7). 5.1.2. Со пипера земете 100 џл од секој екстракт на примерок во Епендорфова епрувета и центрифугирајте 8 минути на 7000 грама. 5.1.3. Отстранете го чистиот флуид (супернатантот) и растворете го гранулатот во 500 џл фиксатор, претходно подготвен за помалку од 24 часа. Измешајте во вортекс - ротирачка мешалица и инкубирајте или еден час или преку ноќ на температура од 4“С. Алтернативен фиксатор е 9696 етанол. За да го користите истиот, растворете го гранулатот од чекорот 5.1.2 во 50 џл ОдЈ1М РВ и 50 џпл 96 9 етанол. Измешајте и инкубирајте на температура од 4"С за време од 30 до 60 минути. 5.1.4. Центрифугирајте 8 минути на 7000 грама. отстранете го чистиот флуид и ресуспендирајте го гранулатот во 75 џл 001 М РВ (види Додаток 3). 5.1.5. Нанесете 46 џп од фиксираните суспензии на чиста плочка за повеќекратно тестирање, како што е прикажано на сликата 3. Нанесете два различни нерастворени примероци по плочка и користете 10 џл за да направите 1:100 раствор (во 0.01М РВ). Останатиот раствор од примерокот (49 џл) може да се чува на температура од -20"С по додавање на 1 количество 969 етанол. Во случај да треба да се повтори Е!5Н анализата, остранете го етанолот со центрифугирање и додадете еднакво количество ООЈМ РВ (измешајте во вортекс- вртечка мешалица). Следната постапка пожелно е да се врши на свежо подготвен екстракт од примерок, но исто така, може успешно да се изврши и на екстракт од примерок што се чува во глицероп на температура од --16 до -24"С или -68 до -86“С. Како негативни контроли, користете ги аликотите на екстрактот од примерокот што претходно покажал негативен резултат за С. т. 5ир5р. 5ередотси5. Како позитивни контроли, подгответе суспензии кои ќе содржат 10? до 109 клетки на мл од С. т. 5ир5р. 5ередотси5 (на пр. МСРРВ 4053, или РО 406) во 0,01 М фосфатен пуфер (РВ) од три до пет дневна култура (подготовка види Додаток 2). Подгответе одделни позитивни контролни плочки од хомогениот сој или кој било друг референтен сој на С. т. 5ир5р. зередолси5, ставена во екстракт од компир, како што е наведено во (Додаток 2). Користењето на Е!5Н означена еубактериска олиго-проба нуди контрола за процесот на хибридизација, бидејќи ќе ги прекрие сите еубактерии што се присутни на примерокот. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). 5.1. Фиксирање на екстрактот од компир Следниот протокол се базира на УЧиШпа5 ес а!.. (1998) 5.1.1. Подгответе раствор за фиксираење (види Додаток 7). 5.1.2. Со пипера земете 100 џл од секој екстракт на примерок во Епендорфова епрувета и центрифугирајте 8 минути на 7000 грама. 5.1.3. Отстранете го чистиот флуид (супернатантот) и растворете го гранулатот во 500 џл фиксатор, претходно подготвен за помалку од 24 часа. Измешајте во вортекс - ротирачка мешалица и инкубирајте или еден час или преку ноќ на температура од 4“С. Алтернативен фиксатор е 9696 етанол. За да го користите истиот, растворете го гранулатот од чекорот 5.1.2 во 50 џл ОдЈ1М РВ и 50 џпл 96 9 етанол. Измешајте и инкубирајте на температура од 4"С за време од 30 до 60 минути. 5.1.4. Центрифугирајте 8 минути на 7000 грама. отстранете го чистиот флуид и ресуспендирајте го гранулатот во 75 џл 001 М РВ (види Додаток 3). 5.1.5. Нанесете 46 џп од фиксираните суспензии на чиста плочка за повеќекратно тестирање, како што е прикажано на сликата 3. Нанесете два различни нерастворени примероци по плочка и користете 10 џл за да направите 1:100 раствор (во 0.01М РВ). Останатиот раствор од примерокот (49 џл) може да се чува на температура од -20"С по додавање на 1 количество 969 етанол. Во случај да треба да се повтори Е!5Н анализата, остранете го етанолот со центрифугирање и додадете еднакво количество ООЈМ РВ (измешајте во вортекс- вртечка мешалица). Слика 3. Приказ на Е!/5Н плочка Примерок 1 Празно Празно Празно Примерок 2 Еј О, (Ој О О Прозорец1 Прозорац 2 Прозорец 3 Прозорец 4 Прозорец 5 Примерок 1 Празно Празно Празно Примерок 2 СО СО СО О, СО) Прозорецб Прозорец7 Прозорец 8 Прозорец 9 Прозорец 10 Плочка 1 Плочка 2 5.1.6. Со вентилирање исушете ги плочките (или со сушач на плочки на температура од 37“С) и фиксирајте ги со запалување. Во оваа фаза, постапката може да се прекине и да се продолжи со хибридизација наредниот ден. Плочките треба да се чуваат на собна температура, на суво место каде што нема прав. 5.2. Предхибридизација и хибридизација 5.2.1. Подгответе раствор од лизозим со 10мг лизозим (5иата 1- 6876) во 10мл пуфер (100 мМ Тг5- НС, 50 мм ЕОТА, рна0). Овој раствор може да се чува, но може да се замрзнува и да се одмрзнува само еднаш. Добро покријте го секој примерок со приближно 50 џл раствор од лизозим и инкубирајте 10 минути на собна температура. . Потоа, потопете ги плочките во деминерализирана вода само еднаш, а потоа исушете со филтер хартија. Како аптернатива, наместо пизозин, додадете 50 џп од 40 до Ж4ООрџг мл - 1 протеиназа К во пуферот (20 мМ Тп5- НС! , 2 мМ СаС!, , рН 7.4) во секоја комора, на температура од 37“С за време од 30 минути 5.2.2. Дехидрирајте ги клетките во серија етанол од 509, 8096 и 9695, по минута во секоја од нив Исушете ги плочките на држач за плочки, со вентилирање. 5.2.3. Подгответе влажна комора за инкубација со покривање на дното на вакумска кутија користејќи марамче или филтер хартија натопена во Ѓх хибмике (пубтих) (Додаток 7). Претходно инкубирајте ја кутијата во печка за хибридизација на температура од 55“С за време од 10 минути. 5.2.4. Подгответе го растворот за хибридизација (Додаток 7) дозволувајќи 45 џл по плочка и прединкубирајте 5 минути на температура од 55“С. 5.2.5. Ставете ги плочките на жешка плоча на температура од 45"С и нанесете 10 џл од растворот за хибридизација на секоја од четирите комори на плочката (плочките). 526. Користете две плочки (24 х 24мм) за секој слајд, без да се пропушта воздух. Ставете ги плочките во претходно загреана влажна комора и хибридизирајте преку ноќ во печка на температура од 55“С на темно. 5.2.7. Подгответе три лабораториски чаши со 1л ултра чиста вода (ЏРМА, 1 л Тх (пубтр) (334 мл Зх (пуБтк) и 666 мл ЏРААЈЛ) и 1л од 172х (Рубтк) (167 мл Зх (вуртБд и 833 мл ЏРМА. Претходно инкубирајте ја секоја од нив во водена када на температура од 55“С. 5.2.8. Отстранете ги плочките од слајдовите и ставете ги на држач за плочки. 5.2.9. Измијте го вишокот на сондата со инкубација од 15 минуги во лабораториска чаша со 1х (нуБткх) , на температура од 55“С. 5.2.10. Пренесете го држачот на плочки во раствор за миење од “2 (НУБтр)ј и извршете инкубација дополнителни 15 минути. 5.2.11. Кратко потопете ги плочките во ЏРУЈ и ставете ги на филтер хартија. Отстранете го вишокот влажност со покривање на површината со филтер хартија. Со пипета земете 5 до 10 џл раствор против избледнување (на пр. Мескачне!д, Места | абогакоте5, СА, Џ5А или еднакви) на секој прозорец и користете голема плочка (24 х 60 мм) на целата површина. 5.3. Читање на ЕГ5Н тестот 5.3.1. Набњудувајте ги плочките под микроскоп опремен за епифлуоресценција на 630 или 1000х потопени во масло. Со филтер соодветен за флуореосцентни изотиоцинатни (ЕПС) геубактериски кпетки (вклучително повеќето грам негативни клетки) во примерокот се прекриени со флуоресцентно зелено Со филтер за тетраметилродамин-5-изотиоцинат, Суз3- обоени кпетли од СС. т. 5ирор. мзередотси5 имаат флуоресцентна црвена боја. МКССпоредете ја морфологијата на клетката со таа на позитивните контроли. Клетките мора да бидат светли флуоресцентни и целосно прекриени. ЕГ5Н тестот (Дел 9.4) мора да се повтори ако прекриеноста не е доволна. Скенирајте ги прозорците по два дијаметра под прав агол и околу периметарот. За примероците кои не покажуваат или покажуваат мал број клетки, набтудувајте најмалку 40 микроскопски полиња. 5.3.2. Набњтудувајте светли флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија на С. т. 5иббр. 5ередопси5 во тест прозорците на тест плочките. Интензитетот на флуоресцентноста мора да биде еднаков или подобар од сојот на позитивната контрола. Клетките со нецелосно прекривање или со слаба флуоресценција мора да се отфрлат. 5.3.3. Ако има сомневање за контаминација, тестот мора да се повтори. Ваков може да биде случајот кога сите плочки во групата покажуваат позитивни клетки поради контаминацијата на пуферот или ако се забележат позитивни клетки (надвор од прозорците на плочката) на прекривката на плочката. 5.3.4. Постојат неколку проблеми што се карактеристични за Е!5Н тестот. Основните популации флуоресцентни клетки со атипична морфологија и сапрофитски бактерии со големина и морфологија слична на Ст зир5р. зередопси5 најверојатно ќе се појават од сржта (кортексот) од окцата во компирот и на сегментите од стеблото, иако многу поретко во споредба со |Е тестот. 5.3.5. Разгледајте ги само флуоресцентните клетки со типична големина и морфологија, види 5 3.2. 5.3.6. Толкување на резултатите од ЕГ5Н тестот: (а) Валидни резултати од Е!5Н тестот се постигнуваат ако се разгледуваат светли зелени флуоресцентни клетки со големина и морфологија типична за С. т. 5ирор. зередопси5 , со употреба на ЕС филтер и ако се разгледуваат светли црвени флуоресцентни клетки со употреба на родамински филтер кај сите позитивни контроли и не кај негативните контроли Ако се забележат светли флуоресцентни клетки со карактеристична морфологија, пресметајте го просечниот број типични клетки по микроскопско поле и пресметајте го бројот на типични клетки по мл ресуспендиран гранулат (Додаток 4). Примероците со најмалку 5 х 10? типични клетки на мл ресуспендиран гранулат се сметаат за потенцијално . контаминирани. Потребно е понатамошно . тестирање. Примероците со помалку од 5 х 10“ типични клетки на мл ресуспендиран гранулат се сметаат за негативни. (6) ЕГ5Н тестот е негативен ако не се забележат светли црвени флуоресцентни клетки со големина и морфологија типична за Ст. зирзр. з5ередотси5, користејќи родамински филтер, под успов тие типични светли флуоресцентни клетки да се набтудуваат во изработените позитивни контроли кога се користи родаминскиот филтер. 6. РСВ тест Принципи Кога се користи РСК тест како прв тест за анализа и истиот е позитивен, мора да се направи !|Е тест, како втор задолжителен тест за анализа. Кога се користи РСК тестот како втор тест за анализа и резултатот е позитивен, потребно е понатамошно тестирање според шемата на постапки, со цел да се комплетира дијагнозата. Целосно искористување на овој метод како основен тест за анализа се препорачува само кога постои специјализирана експертиза. Забелешка: Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 10“ до 10“ клетки од С. т. 5ивзр. 5ередопкеи5 на мл додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат. Експериментите за оптимизација може да бидат потребни за да се постигнат максимапни нивоа на чувствителност и специфичност во сите лаборатории. Користете соодветно потврдени РСК реагенси и протоколи. Пожелно е да изберете метод со внатрешна контрола. Користете соодветни мерки на претпазливост за да избегнете контаминација на примерокот со целна ДНК. РСК тестот треба да го вршат искусни техничари во специјални лаборатории за молекуларна биологија, со цел да се минимизира можноста за контаминација со целната ДНК. Негативните контроли (за ДНК екстракција и РСК постапките) треба секогаш да се третираат како конечни примероци во постапката, за да се види дали се појавило пренесување на ДНК. Следните негативни контроли треба да бидат вклучени во РСВ тестот: екстракт на примерок што претходно бил тестиран и се покажал како негативен за С. т. 5ибр. 5ередопои5 , пуфер контроли кои се користат за екстракција на бактеријата и ДНК од примерокот, РСК - реактивен микс. Треба да се вклучат следните позитивни контроли: аликоти на суспендиран гранулат на кој е додаден С. т. 5ибор. 5ередболтси5 (подготовка, види Додаток 21, суспензија од 10“ клетки на мл од С. т. 5ифЏ5р. 5ередопки5 во вода од вирулентен изолат (на пр. МСРРВ 2140 или МСРРВ 4053), ако е можно, исто така. користете ја ДНК извадена од позитивните контролни примероци во РСВ тестот. Со цел да избегнете можна контаминација, подгответе ги позитивните контроли во одделна средина од онаа каде што ќе се тестираат примероците. Екстрактите од примероци треба да бидат исчистени од земја Затоа, во одредени случаи. се препорачува да се подготват екстрактите од измиени компири. во случај кога се користат РСК протоколи. 6.1. Методи за прочистување на ДНК Користете позитивни и негативни контролни примероци како што е прикажано погоре. Подгответе го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). Достапни се разновидни методи за прочистување на ДНК од сложените супстрати на примероците, така што се отстрануваат инхибиторите наРСК и другите ензиматски реакции и концентрирање на целната ДНК во екстрактот на примерокот. Следниот метод е да се употребува со потврден РСВ метод, прикажан во Додаток 6. 6.1. (а) Метод според Пастрик (Раз5нк) (2000) 1. Со пипета земете 220 џп пуфер за лизирање (100 мМ НаС!, 10 мМ Ти5-НС! РН 8,0 1 мМ ЕОТА рН 8,0) во 1.5 мл Епендорфова епрувета. 2. Додадете 100 џл екстракт од примерок и ставете го на грејач или водена када, на температура од 95“С за време од 10 минути. 3. Ставете ја епруветата во мраз 5 минути. 4. Додадете 80 џл раствор од лизозим (50 мкг лизозим на мл во 10 мМ Тѓт5 НС(рн 8,0) и инкубирајте на температура од 37“С 30 минути. 5. Додадете 220 џп од Еа5у ДНАФ раствор А (инвитроген), добро промешајте и инкубирајте на температура од 65"С за време од 30 минути. 6. Додадете 100 џл од Еазу ДНАФ раствор Б ѓ(инвитроген), силно измешајте се додека преципитатот слободно не протече во епруветата и примерокот е еднакво вискозен. 7. Додадете 500 џл хлороформ и мешајте се додека не се намали вискозноста и додека смешата не стане хомогена. 8. Центрифугирајте на 15000г 20 минути на температура од 4"С за да ги одделите фазите и да се формира интерфазата. 9. Пренесете ја горната фаза во нова епендорфова епрувета. 10. Додадете 1мл од 100?“ етанол (-20“С), кратко мешајте и инкубирајте на мраз 10 минути. 11. Центрифугирајте на 15000г за 20 минути на температура од 4"Си остранете га етанолот од плочката. 12. Додадете 500 џл од 809 етанол (-20 “С) и мешајте со вртење на епруветата. 13. Центрифугирајте на 15000г за 10 минути на температура од 4"Си остранете го етанолот и задржете ја пелетата. 14. Дозволете плочката да се исуши или користете ДНК комора. 15. Ресуспендирајте ја плочката во 100 џл стерилна ЏРУУ и оставете ја на собна температура најмалку 20 минути. 16. Чувајте на температура од -20"С се додека не е потребна за РСВ . 17. Со центрифугирање, отстранете ги белите преципитати и користете 5 џл од супернатантот кој содржи ДНК за РСК . 6.1.6) Други методи Други методи за екстракција на ДНК (на пр. Отадеп ОМеа5у Р|ап! Ки) може да се применат под услов ако се докаже дека се еднакво ефикасни во прочистувањето на ДНК од контролните примероци што содржат 10?“ до 10“ патогенски клетки на мл. 6.2. РСВ 6.2.1. Подгответе ги тест и контролните шаблони за РСК според потврден протокол (Додаток 6). Подгответе еден децимален раствор на ДНК екстракт на примерок (1:10 ин ЏРМЈ). 6.2.2. Подгответе соодветен РСК реактивен микс во неконтаминирана средина, според објавениот протокол (Додаток 6). Потврдениот РСВ протокол е многустрана реакција која, исто така, вклучува внатрешна РС контрола. 6.2.3. Додадете 5 џп ДНК екстракт на 25 џп РСВ реакција во стерилни РСК епрувети. 6.2.4. Вклучете го негативниот контролен примерок што содржи само РСВ реактивен микс и додадете го истиот извор на ЏРУУ. како што е направено во РСК миксот на местото од примерокот. 6.2.5. Ставете ги епруветите во истиот термоциклатор кој се користи во прелиминарното тестирање и спроведете ја соодветно оптимизираната РСК програма (Додаток б). 6.3. Анализа на РСВК производот 6.3.1. Разложете ги РСВ ампликоните/ производите со електрофореза со агарозен гел. Излејте најмалку 12 џл амплифицирана ДНК реактивна мешавина од секој примерок измешан со 3 џл пуфер за полнење (Додаток 6) во 2.095 (му) агарозни гелови во трис-ацетат-ЕОТА (ТАЕ) пуфер (Додаток 6) на 5 до 8 М на см. Користете соодветен ДНК маркер, на пр. 100 бр скала. 6.3.2. Откријте ги ДНК врските со обложување со етидиум бромид (0.5 мг на л) за време од 30 до 45 минути, имајќи предвид соодветни мерки за претпазливост при ракувањето со овој мутаген. 6.3.3. Набњудувајте го обложениот гел на УВ трансилуминација на кратки бранови (на пр. А с 302 нм) за засилени РСВ производи со очекувана гопемина (Додаток 6) и документирајте. 6.3.4. За сите нови наоди/случаи треба да ја потврдите автентичноста на РСК ампликонот, преку изведување рестриктивна ензимска анализа на примерок од останатата амплифицирана ДНК, со инкубација на оптимална температура и време, со соодветен ензим и пуфер (види Додаток 6). Растворете ги обработените фрагменти со електрофореза со агарозен гел како претходно и набтудувајте ја карактеристичната рестриктивна шема на фрагментот под УВ трансилуминација, по обложување со етидиум бромид и споредете со дијагностицираните и недијагностицираните позитивни контроли. Толкување на резултатите од РСК тестот: РСК ќе биде негативен ако С. т. 5ибор. 5ередопси5 - специфичниот РСВ производ со очекувана големина не се забележи на примерокот. но се забележува за сите позитивни контролни примероци (во случај на повеќеслојна РСВ анализа со внатрешни контролни параметри карактеристични за растенија: вториот РСК производ со очекувана големина мора да се засили со примерокот што се анализира). РСВ тестот ќе биде позитивен, ако се забележи С. т. 5ир5р. 5ередбопси5 специфичниот РСК производ со очекувана големина и рестриктивна шема (кога е потребно), под услов да не се засили со која било од негативните контролни примероци. Исто така, може да се добие веродостојна потврда со повторување на тестот со вториот комплет РСК параметри (Дел 9.3). Забелешка: Може да се посомневате на инхибиција на РСК, ако очекуваниот производ се добие од позитивен контролен примерок со С. т. 5ир5р. 5ередопси5 во вода, но се добиваат негативни резултати од позитивните контроли со С. т. 5иБ5р. зередотси5 кај екстрактот од компир. Кај повеќеслојните РСК протоколи со внатрешни РСК контроли, инхибицијата на реакцијата е назначена кога не се добива ниту еден од производите. Може да има сомневање за контаминација ако очекуваниот производ се добие од еден или од повеќе негативни контроли. 7. ТЕСТ СО БИОАНАЛИЗА Забелешка: Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи репродуктивно откривање на најмалку 103 до 10“ клетки кои формираат колонии од С. т. зирб5р. зередотсиз5 на мл додадени на екстракт од примерок кој претходно бил тестиран и покажал негативен резултат (подготовка, види Додаток 2). Највисоко ниво на чувствителност при откривање може да се очекува кога се користи свежо подготвен екстракт од примерок и кога има оптимални услови за растење. Меѓутоа, методот може успешно да се користи за екстракти што се чувале во глицерол на температура од -68 до -86“С. Некои видови модри патлиџани овозможуваат одлична средина за селективно збогатување за раст на С. т. 5ир5р. зередопси5, дури во отсуство на симптоми и обезбедуваат одличен тест за потврдување на домаќинот. Условите за растење треба да бидат оптимални за да се намали ризикот за погрешни негативни резултати од тестирањето. За детали во врска со културите, види Додаток в. 7.1. Распредепете го целиот останат производ од тестот на ресуспендирана плочка, како што е претставено во делот 3.1. или 3.2.5 помеѓу модрите патлиџани, користејќи еден од методите дадени подолу (7.3 или 7.4) Користете само растенија во втора или трета фаза на листови се до целосно ширење на третиот вистински лист. Со цел да се обезбеди целосно искористување на ресуспендираната плочка, како и ефективна инокулација, за постапките што се опишани подолу потребни се 15 до 25 модри патлиџани по примерок. 72. Не ги наводнувајте модрите патпиџани еден или два дена пред инокулацијата, со цел да се намали тургорниот притисок. 7.3. Надолжна инокулација 7.3.1. Со држење на растението меѓу двата прста, пипетирајте една капка (приближно 5 до 10 Џџп) од суспендираната плочка на стеблото меѓу котиледоните и првиот пист. 7.3.2. Со употреба на стерилен скалпер направете дијагонален пресек, околу 1.0 см долг и приближно длабок 2/3 од дебелината на стеблото, почнувајќи со нанесување на капки од ресуспендираниот талог од плочката. 7.3.3. Затворете го пресекот со стерилен вазелин од шприц. 7.4. Инокулација со шприц Инокулирајте ги стеблата на модриот патлиџан веднаш над котиледоните, со користење на шприц со хиподермичка игла (не помалку од 23 ГП). Распределете го примерокот помеѓу модрите патлиџани. 7.5. Како позитивна контрола, инокулирајте 5 растенија со водена суспензија од 40" до 10“ клетки на мл од позната куптура на С. т. 5ирр. 5ередопки5, каде што е возможно, од природно инфицирано ткиво од кртола ѓ(види Дел 4) со истиот метод на инокулација (7.3 или 7.4). 7.6. Како негативна контрола, инокулирајте 5 растенија со стерилен пуфер од талог со истиот метод на инскулација (7.3 или 7.4). 7.7. Инкубирајте ги растенијата во карантински услови за време до 4 недели, на температура од 18 до 24“С. Инкубирајте ги растенијата со доволно светлина и висок степен на влажност (70 до 809) и наводнуваје за да спречите напукнување и венеење поради недостаток на вода. Клетките на С. т. 5ир5р. зередолси5 умираат на температура на 30“С, а оптимална температура е 21"С. За да избегнете контаминација, инкубирајте ги растенијата од позитивната и негативната контрола на одделни маси/полици во оранжерија или комора за растење, во случај ако нема доволно простор, обезбедете строга поделеност помеѓу третманите. Ако растенијата од различни примероци мора да се инкубираат заедно, одделете ги со соодветни прегради. При фертилизација, наводнување, испитување и друг вид манипулации, внимавајте да избегнувате напречна контаминација. Важно е оранжеријата и коморите за растење да бидат слободни од сите штетни организми. бидејќи тие може да ја пренесуваат бактеријата од еден примерок на друг. 7.8. По една недепа редовно испитувајте за појава на симптомите. Избројте го бројот на растенија што покажуваат симптоми. С. т. 5ир5р. 5ередотси5 предизвикувајки паѓање на листовите кај модриот патлиџан, кое може да започне со омекнување на краевите или нерватура на растението. Заразеното ткиво на почетокот може да изгледа темнозелено или со дамки, но станува побледо пред да стане некротично. Венеењето меѓу лисните жили често изгледаат како да се мрсни и наводенети. Некротичното ткиво често има светложолта маргина. Растенијата не мора да умрат, колку е подолг периодот пред да се развијат симптомите, толку е поголема шансата за преживување. Растенијата можат да ја надрастат инфекцијата. Младите модри патлиџани се поподложни на мали популации од С. т. 5ибзр. зеребопси5 во споредба со постарите, па оттаму. неопходно е да се користат растенија во или веднаш пред фаза 3 на листовите. Венеењето, исто така, може да го предизвикаат популации од други бактерии или габи присутни во талогот од ткивото од кртолата. Тука се вклучени Кајњѓопѓа зоѓапасеаѓгит, Епипѓа сагокоиога 5ир5р. сагокоуога и Е. сагокуога зирор. акозериса, Етилпѓа спгузаптет!, Рнота ехдиа чаг. ѓоиеаѓа, како и гопеми популации на сапрофитни бактерии. Особено Етлипѓа сигузаптет! може да предизвика симптоми, а листовите и овенувањето слично како и симптомите на С. т. 5ирор. 5ередопкси5. Единствената разлика е зацрнувањето на стеблата во случај на инфекциите со Етилѓа спгузаптет!. Другите видови венеење може да се разликуваат од оние предизвикани од С. т. 5иб5р. 5ередботси5, бидејќи целите лисја или растенија венеат многу брзо. Исто така, може да се подготви и Грам боење: Овој тест ќе направи разлика помеѓу С. т. 5ии5р. зередопки5 и Етипѓа спгузапѓтету. 7.9. Откако ќе се забележат симптомите кај модрите патлиџани, треба да се изведе реизолација, со користење на ткиво од овенат лист или ткиво од стеблото на растенијата ѓвиди 3.1.3 за мацерација на ткиво). Извршете говршинска дезинфекција на листовите и стеблата на модриот патлиџан. со третман со 709, етанол. Направете !Е или РСЊВ. тест на сокот од модрите патлиџани и извршете изолација на соодветен (селективен) медиум (види Дел 8). Може, исто така, да се подготви Грам боење (Додаток 9) Идентификувајте грочистени култури на С. т. 5ибзр. 5ередопси5 и потврдете ја патогеноста (види Дел ди 10). 7.10. Во одредени околности, особено кога нема оптимални услови за растење, можно е С. т. 5ирзр. 5ереаопси5 да постои како латентна инфекција во модрите патлиџани, дури и по периодот на инкубација до 4 недели. Ако не се забележат симптоми по 4 недели, направете |Е/ РСВ на композитен примерок од 1см делови од стебло на секое растение за тестирање земено над местото на инокулација. Ако тестот е позитивен, треба да се направи реизолација на соодветен (селективен) медиум. следејќи ја постапката наведена во Дел 8. Идентификувајте прочистени култури од С. т. 5ирор. 5ередботси5 и потврдете ја патогеноста (види Дел Чи 10). Толкување на резуптатите од тестот со биоанализа. Валидни резултати од бисанализа се добива кога растенијата од позитивната контрола покажува типични симптоми, бактериите може да се реизолираат од тие растенија и нема симптоми на негативните контроли. Биоанализата е негативна ако тест растенијата не се заразени со С. т. 5иѓ5р. зередопки5 и под услов да биде откриен С. т. з5ир5р. зередолси5 во гозитивните контроли. Тестот со биоанализа е позитивен ако тест растенијата се инфицирани со С. т. 5ирор. зередолси5. 8. ИЗОЛАЦИЈА НА С. т. 5ирзр. 5ереаопкси5 Забелешка: Дијагнозата е комплетна ако се изолира С. т. 5ирор. зередопкси5, ако потоа се идентификува (види Дел 9) и се потврди со тест за патогеност (Дел 10). Иако С. т. з5ирор. зередотсиз е сложен организам, може да се изолира од симптоматското ткиво. Меѓутоа, може да биде надраснат од брзо растечките сапрофитски бактерии и затоа се тешки изолациите директно од екстратот на ткивото од кртолата или стеблото (Делови 3.1.6 или 3.2.5). Со селективен медиум и соодветен раствор на ресуспендиран мацерат од сржта (кортексот) од окцата или стеблата на компирите може да биде возможна изолација на С. т. 5ирор. 5ередолои5 . Изолирањето ќе се направи од сите симптоматски кртоли ипи сегменти на стеблото на компирот и модрите патлиџани каде што не се забележани симптоми, но ГЕРСК тестот од композитниот примерок беше позитивен (види Дел 7.10). Мацерацијата на стеблата на модрите патлиџани, кога е неопходно, треба да се прави како што е опишано во Дел 3.1.3. Како позитивни контроли, подгответе децимални раствори од суспензија од 10“ сти на мл С. т. 5ирр. зередолси5 (на пр. НСРРВ 4053 или РО 406). Со цел да избегнете можна контаминација, подгответе ги позитивните контроли во одделна средина од онаа каде што ќе се тестираат примероците. За секоја новоподготвена група селективен медиум. неговата соодветност за раст на патоген треба да се тестира пред да се користи за тестирање на рутински примероци. Тестирајте го контролниот материјал на идентичен начин како и примерокот (примероците). 8.1. Селективно посејување на плочка 8.1.1. Направете 10-кратни раствори во мацератен пуфер од 100 џл апикот/количество од ресуспендиран примерок на компир или сок од модар патлиџан (Додаток 3). 8.1.2. Изолирањето од нерастворениот концентрат од компирот вообичаено не успева поради тешкиот раст на С. т. зиф5р. зередотси5 и од влијанието од сапрофитите. Бидејќи бактеријата е вообичаено присутна во големи популации кај заразените ткива, сапрофитите може вообичаено да се растворат, а да остане патогенот. Затоа, се препорачува да се нанесе 100 џп од секој примерок, 1/400 до 1/10000 раствори на МТМА медиум или МСР -88 медиум (Додаток 5) (ако се користат Петри садови со дијаметар од 90мм. треба да се усогласи волуменот за алтернативни големини на садот). со инструменти за нанесување (стапче) и техниката за нанесување на плоча. Забелешка: Алтернативна стратегија, исто така, е да се нанесе прво 100 џл аликот/ количество од екстракт на компир врз првата плочка. со нанесувач и потоа да се отстрани нанесувачот на втора плочка. отстранувајќи ги остатоците останати на нанесувачот, на крајот повторете го ова со трета плочка, со што ќе овозможите ефект на растворување преку нанесувачот. 8.1.3. Инкубирајте ги плочките на темно, на температура од 21 до 23“С. 8.1.4. Првичните испитувања на плочките, вклучувајки упатување кон контролните плочки, се бројат какви било С. т. 5ир5р. зеребопкси5 колонии, се создадени по 3 дена, со понатамошни анализи по 5, 7 и евентуална по 10 дена. 8.2. Прочистување на сомнителните колонии Забелешка: Субкултурирањето на колониите слични на С. т. 5ир5р. 5ередопси5 слични колонии треба да се изврши на УСМ медиуми за инокулација на модар патлиџан и/или последователна идентификација, ова треба да се направи пред плочките да прераснат, те пожелно е по три до пет дена. 82.1. Нанесете ги колониите слични на С. т. 5ибор. 5ередопеси5 на еден од следните медиуми: ( дадени во Додатокот 5): хранлив декстрозен агар (само за субкултури), квасен пептонски гликозен агар. квасен екстракт со минерални соли. Инкубирајте на температура од 21 до 24“С во период од десет дена. С. т. 5ирзр. зередопси5 бавно расте, вообичаено генерира точковидни, кремасти, куполообразни колонии, во период од 10 дена. 8.2.2. Нанесете одново за да добиете чистота. Стапките на раст се подобруваат со субкултурата. Типичните колонии се кремасто-бели или со боја на спонова коска, често жолтеникави, кружни, мазни, подигнати, со конвексни куполи, мукоидно течни, со целосни маргини и најчесто со дијаметар од 1 до 3 мм. Едноставно Грам боење (Додаток 9) може да помогне при селектирање на колониите за понатамошно тестирање. 8.2.3. Идентификувајте ги претпоставените култури (види Дел 9) и направете тест за патогеност (види Дел 10). 9 ИДЕНТИФИКАЦИЈА Идентификувајте чисти култури на изолати на С. т. 5ирзр. 5ереаолси5, со користење на најмалку два од следните тестови, врз основа на различни биолошки принципи Вклучете ги познатите референтни соеви каде што е соодветно за секој извршен тест. 9.1. Хранливи и ензимски идентификациски тестови Определете ги следните фенотипски карактеристики кои се универзално присутни или отсутни кај С. т. 5ир5р. 5ередолиси5, според методите на ето апа 5јеаач (1987), Кетеп: ек а!. (1990), 5срааа (2001), Апопутои5 (1987) Сите медиуми треба да се инкубираат на температура од 21"С и да се испитаат по шест дена. Ако нема раст, инкубирајте до период од 20 дена. Сите тестови мора да вклучуваат позната контрола на С т зив5р зередопси5. Хранливите и физиолошките тестови мора да се направат со користење на култури од хранлив агар. Морфолошките споредби мора да се направат од култури на хранлив агар со додаток на декстроза. Тестови Очекуван резултат Тест со оксидација Инертен или со ферментација (О/Ф) неделна оксидација Активност на оксидазата Раст на температура од 27“Ц Активност на уреазата Хидролиза на ескулин Хидролиза на скроб - или слаба Толеранција од 7Чо Мас! Индол производство кои Активност на каталаза Генерирање Н25 Користење цитрат Ликвификација на желатин Кисел глицерол Киселина од лактоза - или слаба Киселина од рамноза ка Киселина од салицин Грам боење (Додаток 9) 9.2. |Е-тест (а) Подгответе суспензија од приближно 10“ клетки на мл во !Е пуфер (Додаток 3). (6) Подгответе серија двократен раствор од соодветниот антисерум. (в) Спроведете ја постапката за |Е тестот (Деп 4). (гу Позитивен |Е тест се постигнува ако |Е титерот на културата е еднаков со оној на позитивната контрола. 9.3. РСК тест (а) Подгответе суспензија од приближно 10“ клетки на мл во уптра чиста вода (ЏРМЛ. (6) Загрејте ТООџл од кпеточната суспензија во затворени епрувети во термостат ипи жешка када на температура од 100“"С четири минути. Ако е потребно, додадете свежо подготвен МаоН на конечната концентрација од 0,О5М, кое ќе помогне за кпеточното разградување. Тогаш, примероците може да се чуваат на температура од -16 то -24"С се додека не бидат потребни. (ву Применете ги соодветни постапки за РСК за да се засилат специфичните ампликонитпродукти на С. т. 5ирор. зередопкси5. (на пр. ТРазшк, 2000: 5ее Аррепах 4; Ц апд де Воег, 1995, МИ5 е а!., 1997, Ра5пк апда Катеу,1999, 5спааад ека!.. 1999.) (гу Позитивна идентификација на С. т. 5ирзр. 5ередолси5 се добива ако РСВ амппиконите/продуктите се со иста големина и имаат поплиморфизми со иста рестриктивна должина на фрагмент како и кај низата од позитивната контрола. 94 ЕЊБН тест (а) Подгответе суспензија од приближно 10“ клетки на мл во ултра чиста вода (ЏРМУ.). (6) Спроведете ја постапката за Е!5Н тестот (Дел 5). (е) Позитивен Е|5Н тест се добива ако се постигнат истите реакции од културата и позитивната контрола. 9.5. Профилирање на масните киселини (ПМК) - (ЕАР) (а) Растете ја културата на трипитказен соја- агар (Оход) за време од 72 часа на температура од 21“С (ж/- 1“). (6) Користете ја соодветната постапка за (ЕАР) (Јапе, 1991. 5ѓ|еадч, 1992). (в) (ЕАР) - тестот е позитивен ако профилот на претпоставената култура е идентичен со оној на позитивната контрола. Присуството на карактеристични масни киселини е 15:14 масни киселини и естери (Антеисо А), 15-00 Исо, 15:0 Антеисо, 16:0 Исо, 16:0 и 17:0 Антеисо (15:1 Апѓењо А, 15:0 150, 15:0 Апѓењо, 16.0 (50, 16:0 1 17:00 Ап|ејо) укажува на С. т. 5ирзр. 5ередолки5 Другите родови, како што се Ситорасѓетит, Атнгорастет апа Мксгососсиз5, исто така, имаат дел од овие киселини, но 15:1 Антеисо А е ретка киселина кај овие бактерии, но се појавува кај сите Слаифасѓег 5рр.. помеѓу 1 до 59. Кај С. т. зирор. зередопси5, вредноста најчесто е 596. 96. ВОХ-РСК (а) Подгответе суспензија од приближно 10“ клетки на мл во ултра чиста вода (ЏРМЈ). (6) Применете го тестот според постапката (5тиН еј а!., 2001) 10. ТЕСТ ЗА ПОТВРДУВАЊЕ Тестот за патогеноста мора да се изведе како конечна потврда за дијагнозата на С. т. 5ибз5р. 5ереаопси5 и за процена на вируленцијата на културите идентификувани како С. т. 5иф5р. зеребопси5 10.4. Подгответе инокулум од приближно 10“ клетки по мл од три дневни култури од изолат што треба да се тестира и соодветна низа од позитивна контрола од С. т. 5ир5р. 5ередопкси5. 10.2. Инокулирајте 5 до 10 стебла од модар патлиџан од млади израстоци во фаза 3 на листот (Дел 7.3 или 7.4). 10.3. Инкубирајте на температура од 18 до 24“С, со доволно светлина и висока влажност, со соодветно наводнување со цел да се избегне исушување или стрес од дехидрирање (Дел 7.7). Со чисти култури, типичното венеење би требало да се случи во рок од две недели, но растенијата кои не покажуваат симптоми (види Дел 7.8) за ова време треба да се инкубираат до три недели, на температура која е соодветна за растот на модриот патпиџан, но не над 25"С (Додаток 8). Ако и по трите недели нема симптоми, културата не може да се потврди како патогена форма на С. т. 5ир5р. 5ереболтси5 . 10.4. Изолирајте од симптоматските растенија, со отстранување на дел од стеблото, 2 см над точката на инокулација. Пулверизирајте и суспендирајте мало количество стерилна дестилирана вода или 50 мМ фосфатен пуфер (Додаток 3). Изолирајте од суспензијата со помош на раствор нанесувајќи на МТМА апд УРОА (Додаток 5), инкубирајте три до пет дена. на температура од 21 до 23"С и набњудувајте го формирањето на колонии типични за С. т. 5ив5р. зередопси5 . Додаток 1 Лаборатории вклучени во оптимизацијата и потврдувањето на протоколите (За контакт со научните центри: посетете ја интернет страница ририИогит.ецгора.еи пИРиБЦелго/бапсо/Ноте!тагп. Додаток 2 Подготовка на позитивни и негативни контроли за основни- скрининг тестови РСВЛЕи ЕН Одгледувајте 72-часовна култура од вирулентни соеви на С. т. 5ив5р. зередолси5 (МСРРВ 4053 или РО 406) на МТМА базален медиум и суспендирајте во 10 мМ фосфатен пуфер за да пстигнете клеточна густина од приближно 1 со 2108 сѓи мл. Ова вообичаено се гостигнува со слабо матна суспензија еднаква на оптичка густина од 0,20 на 600 пт. Отстранете ја сржта (кортексот) на окцата од 200 кртоли земени од сорти со бела кора, за кои а познато дека не се заразени од С. т. 5иб5р. 5ередопеи5. Обработете ги окцата со вообичаени методи и ресуспендирајте го талогот во 10мл. Подгответе 10 стерилни од 1,мл микроепрувети со 9Обџл од ресуспендираниот талог. Пренесете 100 џп од суспензијата С. т. ирбзр. зередотси5 во првата микроепруветка. Измешајте со вртечка мешалица. Дефинирајте ги децималните нивоа на контаминација со понатамошно растворање во наредните пет микроепрувети. Шесте контаминирани микроепрувети ќе се искористат како позитивна контрола. Четирите неконтаминирани микроепрувети ќе се искористат како негативни контроли. Соодветно означете ги микроепруветите. Подгответе аликоти од 100 џл во стерилни микроепрувети од 1,5 мп. така што ќе добиете девет дупликати од секој контролен примерок. Чувајте на температура од -16 то -24"С се до употребата. Присуството и количината на С. т. з5ирзр. 5ередопси5 во контролните примероци треба најпрво да се потврди со !Е тестови За РСВ тестот, направете екстракција на ДНК од позитивните и негативните контролни примероци, со секоја серија примероци за тестирање. за ГЕ и ЕГ5Н тестот, направете биоанапиза на позитивните и негативните контролни примероци, со секоја серија примероци за тестирање. За !Е, ЕН и РСК анализата, С. т. зир5р. 5ередопси5 мора да се открие најмалку во 10“ и 10" клетки/мл од позитивните контроли и не се забележува во негативните контроли. Додаток 3 Пуфери за постапките за тестирање ОПШТО: Неотворени стерилизирани пуфери може да се чуваат до една година. 1. Пуфери за постапката за екстракција 1.4. Пуфер за екстракција (50 мМ фосфатен пуфер, рН 7,0) Овој пуфер се користи за екстракција на бактеријата од ткивата на растенијата со помош на хомогенизација или протресување. Ма2НРО4 (анхидрозен) 4,26 г КН2РОА 272 Дестипирана вода 1.00л Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. Може да бидат корисни и дополнителни компоненти како што се следните: Цел Количина (на литар) Снегулки од Луброл Дефлокулација ШЧЌ. 05г ОС силиконска Агенс против пенање 1,0 мп антипена Ш“К натриумтетра Антиоксидант 1,0 г пирофосфат | Поливинилпиролидон | Врзување на РСВ 50 г 4000 (ПВП-40) инхибиторите “За користење со хомогенизирачкиот метод за екстракција. 1.2. Пуфер за плочката (10 мМ фосфатен пуфер, рн 7,2) Овој пуфер се користи за ресуспензија и растворање на сржта (кортекс) на окцето од кртолата на компирот, по концентрација на талогот со помош на центрифугирање. Ма2НРО4 12Н20 ОТ МаНн2РО4 2Н20 0.4 г Дестилирана вода 1,ООЛ Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автокпав на температура од 121"С за време од 15 минути. 2. Пуфери за |Е тест 2.1. ГЕ - пуфер (10 мМ фосфатен солен пуфер (РВ5), рН 7.2) Овој пуфер се користи за растворање на антитела. Ма2НРО4 12Н20 27 МаН2РО4.2Н20 О4г Мас! ВО г Дестилирана вода ТОЛ Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. 2.2. |Е -пуфер -Тњеен Овој пуфер се користи за миење на плочките. Додадете 0.19, Тњеен 20 на |ГЕ пуферот. 2.3. Глицерол третиран со фосфатен пуфер. рн 7,6 Овој пуфер се користи како флуид за зголемување на прозорците на /Е плочките за да се зголеми флоуресценцијата. Ма2НРО4.12Н20 32 г МаН2РО4 2Н2О 0415 г Глицерол 50 мл Дестилирана вода 100 мл Растворите на засилувач против бледеење се комерцијално достапни, на пр. (9 Меска5не!до (естог Царогаќконе5) или СКИиого ( |ејса). Ма2НРО4 12Н20 ОТ МаНн2РО4 2Н20 0.4 г Дестилирана вода 1,ООЛ Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автокпав на температура од 121"С за време од 15 минути. 2. Пуфери за |Е тест 2.1. ГЕ - пуфер (10 мМ фосфатен солен пуфер (РВ5), рН 7.2) Овој пуфер се користи за растворање на антитела. Ма2НРО4 12Н20 27 МаН2РО4.2Н20 О4г Мас! ВО г Дестилирана вода ТОЛ Растворете ги состојките, проверете ја рН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121“С за време од 15 минути. 2.2. |Е -пуфер -Тњеен Овој пуфер се користи за миење на плочките. Додадете 0.19, Тњеен 20 на |ГЕ пуферот. 2.3. Глицерол третиран со фосфатен пуфер. рн 7,6 Овој пуфер се користи како флуид за зголемување на прозорците на /Е плочките за да се зголеми флоуресценцијата. Ма2НРО4.12Н20 32 г МаН2РО4 2Н2О 0415 г Глицерол 50 мл Дестилирана вода 100 мл Растворите на засилувач против бледеење се комерцијално достапни, на пр. (9 Меска5не!до (естог Царогаќконе5) или СКИиого ( |ејса). Додаток 4 Определување на нивото на контаминација кај !Е и Е!Г5Н тестовите 1. Пресметајте го средниот број на типични флуоресцентни клетки по поле на набгудување (с) 2. Пресметајте го бројот на типични флуоресцентни клетки на секој прозорец од микроскопските слајдови (С) С сс х 5/5 Каде што: 5 “ површината на прозорецот на слајд со повеќе места, и 5 - површината на полето на објективот. 5 - па/ДО2К2 каде што | - коефициент на полето (варира од 8 до 24, во зависност од типот на окуларот) К коефициент на епруветата (1 или 1.25) О г зголемување на објективот (100х, 40х итн.) 3. Пресметајте го бројот на типични флуоресцентни клетки на мл суспендирана плочка (М) М-С ха ОООухЕ Каде што: уз волуменот на ресуспендираната плочка на секој прозорец, и Е г факторот на растворање на ресуспендираната плочка. Додаток 5 Медиуми за изолација и култура на С. т. 5ир5р. 5ередботси5 (а) општ медиуми за растење Агар за потхранување (МА) Агар за потхранување (ОЌсо) 23,0 г Дестилирана вода тол Растворете ги состојките и стерилизирајте со автокпав на температура од 121“С за време од 15 минути. Хранлив дестрозен агар (МОА) Ожсо Баско хранлив агар со 195Д(-) гликоза (монохидратен). Стерилизирајте со автоклав на температура од 115"С за време од 20 минути. Квасен пегтонски гликозен агар (УРОА) Квасен екстракт (ОЌќсо) 50 Бакто-пептон (Орисо ) БОГ Д(н) гликоза (монохидрат) 10.0г Бакто-агар (Оќсо) 15,0 г Дестипирана вода тол Растворете ги состојките и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. Медиум со квасен екстракт со минерални соли (УСМ) Бакто-квасен екстракт (Отсо ) 20г Д(н) гликоза (монохидрат) 25 КаНРОА 0.25 г КН2РОА 0.25 г М9504.7Н20 0.1 г Мп5О4.Н20 0.015 г Мас! 0,05 г Ее504.7Н2О0 0.005 г Бакто-агар (Оќсо) 18 г Дестилирана вода 1ОЛ Растворете ги состојките и стерилизирајте количества од О5л медиум со автоклав на температура од 115"С за време од 20 минути. (6) Потердени селективни медиуми за раст МТМА медиум Освен ако нее поинаку наведено, сите медиумски компоненти се од ВОН. Квасен екстракт (ОЌсо) 20г Манитол 25Г К2НРОА 0.25 г КН2РОА 0,25 г Мас! 0,05 г Ма504.7Н20 ОД г Мп504.Н20 0.015 г Ее5047Н2О 0,005 г Агар (оксоид бр. 1) 16,0 г Дестилирана вода тол Растворете ги состојките. усогласете ја рН вредноста на 7.2. По автоклавот (на температура од 121"С за време од 15 минути) и разладување до 50“С, додајте антибиотици: Триметоприм 0,0б6г, налидиксична киселина 0.002 г, амфотерицин Б 0,01 г. Групирајте ги растворите антибиотици: Риметоприм (5ијта) и налидиксична киселина (Бата) ѓи двете на 5мгмл), во 9695 метанол, амфотерицин Б (бата) (1мгимл) во диметил сулфоксид. Групираните раствори се стерилизираат со филтер. Забелешка: Трајноста на базичниот медиум е три месеци. Откако Ќе се додадат антибиотиците. трајноста е еден месец кога се чува во фрижидер. МСР -88 медиум Агар за потхранување ( БИсо) 23 г Квасен екстракт ( Оќсо) ФТ Д-манитол ог Ка2НРОА 2 КН2РОА 05 г М9504 7Н20 0.25 г Дестилирана вода ТОЛ Растворете ги состојките. усогласете ја рН вредноста на 7,2. По загревање во автоклавот и разладување до 50"С, додајте ги следните антибиотици: Полимиксин Б сулфат (бата) О,0О0Зг, налидиксична киселина (5иата ) 0,008 г, Цикпохексимид (5ата) 0 2Г. Растворете ги антибиотиците во групите раствори, како што следува: Налидиксична киселина во 001 М МаоН, цикпохексамид во 50965 етанол. полимикин Б сулфат во дестилирана вода. Групираните раствори се стерилизираат со филтер. Забелешка: Трајноста на базичниот медиум е три месеци. Откако ќе се додадат антибиотиците. трајноста е еден месец кога се чува во фрижидер. Додаток 6 Потврден РСК протокол и реагенси Забелешка" Прелиминарното тестирање со овој метод треба да овозможи откривање на најмалку 10? до 10“ клетки од С. т. 5ир5р. 5ередолтси5 на мл додадени на екстракт од примерок. Прелиминарното тестирање. исто така, не покажува лажни позитивни резултати со панел селектирани бактериски соеви. 1. Многустран РСК протокол со внатрешна РСК контрола (Ра5ик, 2000) 1.1. Олигонуклеотидни прајмери Преден прајмер Р5А-1 5" ске си ака ада года даа аа -3“ Обратен прајмер Р5А-К 5" ќас каа дак ан кса сн сос с -3! Преден прајмер М5-7-Е 5" дад дса ака аса дак ска каа ќас -3" Обратен прајмер М5-8-В 5"- (сс дса дот кса сек аса да -3" Очекувана големина на ампликонот/продуктот од шаблонот на С. т. 5иб5р. зередопси5 ДНК -502 бп (Р5А-збир прајмери). Очекувана големина на ампликонот/продуктот од 18С РРНА внатрешна РСВ контрола “377 бп (М5 -прајмерски збир). 1.2. РСК реактивен микс Реагенс Количина по Конечна реакција концентрација Стерилна ЏРМ/ 15,725Џџ 10ХРСВпуфер(1)(15ММ 25! 1х (1,5 тМ Мас!2) М9С!2) В5А (дел В) (1090) 025Ш 0,1 “5 4-ПТР тх (220 мм) 0.125 ц! 01 мм Ргтег Р5А-1 (10 ЏМ) 0.5 0,2 иМ Ретег Р5А-Н (10 џМ) 0.5 џл 0.2 им Рптег М5-7-Е (10 џм) (д) ОД џ! 0,04 џМ Ртег М5-8-В (10 џм) ѓе) Ол 0,04 џМ Так полимераза (5 Џи О2ц! 1,0 () Волумен на примерокот 5ОШ Вкупно волумен |25,0џ! (1) Методи каде што е потврдено користење Таа полимераза од страна на Реши Ејтег (АтриТаа ог боја) ) и Срсо ВВ. (2) Концентрација прајмери М5-7-Е и НМ5-8-Ккаде што е направена оптимизација за екстракција на сржта (кортексот) од окцата на компирот, со користење на метод за хомогенизација и прочистување на ДНК, според Разнк (2000) (види Дел 6.1.а) и 6.2). Реоптимизација на концентрациите на реагенсот е потребна ако се користи екстракцијата со протресување или друг метод за ДНК изолација. 1.3. Услови на РСВ реакција Спроведете ја следната програма: (1.) 3 минути на температура од 95“С (денатурација на шаблон ДНК) 1 циклус од: (2.) 1 минута на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК) 10 циклуси од: 25 циклуси од: 1 циклус од: Забелешка: Оваа програма е оптимизирана за употреба со МЈ НВезеагср РТС 200 термоциклатор. Може да биде потребна модификација на времетраењето на (3.) 1 минута на температура од 64"С (хибридизација на прајмерите) (4.) 1 минута на температура од 72“С (продолжување на копија) (5.) 30 секунди на температура од 95"С (денатурација на шаблон ДНК (6.) 30 секунди на температура од 62"С (хибридизација на прајмерите) (7.) 1 минута на температура од 72"С (продолжување на копија) (8.) 5 минути на температура од 72“С (завршно продолжување) (9.) држете на температура од 4“С. циклусите (2.), (3.) (4.), (5.), (5.) и (7.) за примена со другите модели. 1.4. Анализа на ампликон/продуктот со рестриктивен ензим. РСК производите засилени од ДНК на С. т. 5ибр. 5ередоптси5 генерираат карактеристичен полиморфизам со ограничена должина на фрагментот со ензим Ва! | по инкубација на температура од 37“С, за време од 30 минути. Рестриктивните фрагменти добиени од специфичните фрагменти на С. т. зирор. зередотсиз се со големина од 282 Бр и 220 Бр. 2. Подготовка на пуфер за електрофореза 2.1. Бромфенол сино (1096-готов раствор) Бромфенол сино ог Дестилирана вода (бидест) 50 мл 2.2. Пуфер за електрофореза Глицеропл (86 90) 3.5 мл Бромфенол сино (5.1) 300 џл Дестилирана вода (бидест) 6.2 мл 3. 10х Тпо Асеѓаје ЕОТА (ТАЕ) пуфер, рН 8.0 Те пуфер 48.4г Глацијална оцетна киселина 11.42 мл ЕОТА (дисодиумова сол) 872 Дестилирана вода 1,ооП Растворете до 1х пред употреба. Исто така, комерцијално е достапен (на пр. |пуќгодеп или еднаков на него). Додаток 7 Потврдени реагенси за Е15Н тестот 1. Опигопроби Специфична проба Ста -СМ5-СУ3-О01: 5“ на сда дос дса са! ск ќас аса -3" Неспецифична еубактериска проба ЕЏВ-338-ЕТС. 5- да! дес кос са! ада ад! -3" 2. Раствор за фиксирање ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ! ФИКСАТОРОТ СОДРЖИ ПАРАФОРМАЛДЕХИД КОЈ Е ТОКСИЧЕН (ОТРОВЕН). НОСЕТЕ РАКАВИЦИ, НЕМОЈТЕ ДА ГО ВДИШУВАТЕ. ПРЕПОРАЧЛИВА Е РАБОТА ВО ИЗОЛИРАНА КОМОРА. (1) Загрејте 9 мл вода за молекуларна анализа (на пр. ултра чиста вода (ЏРМЈЛ на приближно 60"С и додадете 0.4г параформалдехид. Параформалдехидот се раствора по додавање неколку капки ТМ МаОН и промешување со магнетен мешач. (2) Усогласете ја рН вредноста на 7,0 со додавање на 1мп од ОМ фосфатен пуфер (РВ; рН 7.О) и пет капки од 1 М НС! Проверете ја рН вредноста со индикаторски ленти и усогласете ако е неопходно со НС! или МаОН. ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ! НЕ КОРИСТЕТЕ РН МЕТАР ЗА РАСТВОРИТЕ СО ПАРАФОРМАЛДЕХИД. (3) Филтрирајте го растворот преку мембрански филтер од 0,22 џм и заштитете го растворот од прашина, се чува на температура од 4"С додека не се употреби. (4) Забелешка" Аптернативен раствор за фиксирање: 969; етаноп. 3. Зх НуБтик Мас! 27М Тп5-НС! 60 мМ (пХ 7.4) ЕОТА сфилтрирајте стерилизирано и загреано во автокпав) 15 мм Разредите до 1х ако е потребно. 4. Раствор за хибридизација 1х Нуртрс Натриум додецил сулфат (505) 0.04 96 Проба ЕЏВ 338 5 па! Проба СМ5СУ 301 5 па Подгответе количини од растворот за хибридизација според пресметките во табелата. За секој слајд (кој содржи два различни примерока во дупликат) потребен е 90 џл раствор за хибридизација. Табела: Препорачани количини за подготовка на миксот за хибридизација 2 слајда 8 слајда Стерилна ЏРМУ 50,1 200.4 Зх Нубти 30,0 120.0 1 95 505 0.9 2.6 проба ЕЏВ 338 (100 4,5 18,0 па ил) проба СМ5СУ 301 (100 | 4,5 18,0 | па /ил) Вкупно волумен (џл) 90,0 2600 Забелешка: Сите раствори што содржат олигопроби се чувствителни на светлина, чувајте ги на темно на температура од -20"С. Заштитете ги од директна сончева светлина или вештачка светлина додека се употребуваат. 5. 04М фосфатен пуфер. рн 7.0 Ма2НРО4А 8,52 г КН2РОА 544 г Дестилирана вода Т,ООЛ Растворете ги состојките, проверете ја РН вредноста и стерилизирајте со автоклав на температура од 121"С за време од 15 минути. Додаток 8 Култура од модар патлиџан Засадете семе од модар патлиџан (Џоѓапит теѓопдепа) во пастеризиран компост за семе. Пресадете го расадот со целосно раширени котиледони (10 до 14 дена) во пастеризиран компост за садење. Модрите патлиџани треба да се одгледуваат во оранжерија со следните средински услови : Должина на денот: 44 часа или природна должина на денот ако тоа е повеќе; Температура: Ден: 241 до 24“С, Ноќ: 15“С. Осетлива сорта модри патлиџани : Васк Веацку". | опа Тот". Вита", Ва|5а5 Додаток 9 Постапка за Грам обојување (Нискеѓ5 модификација) (Ооеќесн, 1981)! Кристално виолетов раствор Растворете 2г кристално виолетово во 20мл 9596 етанол. Растворете О,8г амониум оксалат во 8Омл дестилирана вода Измешајте ги двата раствора. Луголов јод- раствор Јод ТЕ Калиум јодид 2Г ! Исто така може да се користат комерцијално достапни раствори и комппети за обојување. Дестилирана вода 300 мл Иситнете ги цвртите честици во аван. Додадете ги во водата и мешајте за да се растворат, во затворен сад. Контрастно обојување со шафранов раствор Готов раствор: Сафранин О ЕЈ (Г 959; етанол 100 мл Измешајте и оставете. Растворете. 1:10 за добивање работен раствор. Постапка за обојување 1. Подгответе брисови/премаски, исушете и фиксирајте со загревање. 2. Потопете го слајдот со кристален виолетов раствор една минута. 3. Кратко измијте со дестилирана вода. 4. Потопете со пугопов јод една минута. 5. Измијте со дестилирана вода и исушете. 6. Извршете обезбојување со 959, етанол, додавајте во насока на капките, се додека не се отсрани бојата или потопете со нежно триење триесет секунди. 7. Измијте со дестилирана вода и исушете. 8. Потопете со шафранов раствор 10 секунди. 9. Измијте со дестилирана вода исушете. Грам позитивните бактерии се бојата виолетово-сино, грам негативните бактерии се бојата розово-црвено. ПРИЛОГ 2 1. Во случај на сомнителна појава за која е идентификуван позитивен резултат на тестот, се применува методот од Прилог 1 од оваа наредба, се чека потврда или негирање од добиените резултати, при што треба да се задржат и соодветно да се конзервираат: сите кртоли што се земени за примероци, кога тоа е возможно, сите растенија земени како примероци; останатите екстракти и дополнително изготвениот материјал за тестот. на пример стаклата за имунофлуоресценција и сите документи, се додека не се завршат наведените методи. Задржувањето на кртолите ќе овозможи разновидно тестирање кое се врши по потреба. 2. Во случајот на позитивна потврда на штетниот организам, треба соодветно да се задржи и да се конзервира: материјалот од точка (1) од овој Прилог; примерок од заразениот материјал од модриот патлиџан инокулиран со кртола или растителен екстракти изолираната култура на штетниот организам, се додека не помине најмалку еден месец од постапката. ПРИЛОГ 3 1. Елементите што треба да се земат предвид во определувањето на степенот на можна контаминација согласно член 6 точка (6) од оваа наредба го вклучуваат следното: кртолите или растенијата одгледувани на место на производство определено како контаминирано согласно член 6 точка ѓа) од оваа наредба: местото (та) на производство од одредена производна единица со кртоли или растенија, определени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба, како и оние кои директно ја користат производната опрема и објект или имаат заеднички изведувач на работите; кртолите или растенијата произведени на местото(та) на производство наведени во претходната алинеа или се присутни на такви места на производство, за време кога кртопите или растенијата означени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба биле присутни на местото на производство што е наведено во алинеа (1) од оваа точка; просториите, скпадиштата каде што се чува компирот од местата на производство, наведени во алинеите 1.2 и3 од оваа наредба; сите машини, опрема, превозни средства, садови. алати. складови или делови од нив и какви било други предмети. вкпучувајки и материјапи и амбапажа за пакување кои можеле да бидат во контакт со кртолите или растенијата определени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба; кртолите или растенијата складирани или доаѓаат во контакт со кои било објекти или предмети наведена во претходната алинеа, пред чистење и дезинфекција на ваквите објекти и предмети; како резултат на тестирањата согласно член 7 од оваа наредба, кртолите или растенијата со сестринска или родителска врска со кртолите или растенјата определени како контаминирани согласно член 6 точка (а) од оваа наредба и за кои, иако можеби на тестот покажале негативен резултат од штетниот организмот, појавата на контаминација е веројатна преку кпонаплната врска. Може да се преземат различни тестови за да се потврди идентитетот на контаминираните и клонално поврзаните кртоли или растенија и местото (та) на производство на кртолите или растенијата наведени во претходната алинеа. 2. Елементите што треба да се земат предвид во определувањето на степенот на раширеност согласно член 6 точка (в) од оваа наредба, треба да го вклучуваат следното: близината до другите места на производство на компири или други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам и заедничко производство. складирање и користење на семени материјал. 3. Фитосанитарниот инспектор согласно член 6 од оваа наредба, треба да извести: (а по потврдувањето на присуството на штетниот организам при лабораториски тест со користење на методот од Прилог 1 од оваа наредба и барем за : сортното име на партијата со компири и типот (меркантилен, семенски, итн) и каде што е можно семенската категорија на компирите. (6) фитосанитарниот инспектор по утврдување и завршување на сите испитувања на присуството на штетниот организам, треба да обезбебеди: дата на потврдување на контаминацијата; краток опис на извршените испитувања за идентификација на изворот на можно ширење на контаминацијата. вклучувајки и бројот на земени примероци: информации за идентификувани или претпоставени извори на контаминација, детали за степенот на определената контаминација, вклучувајки и бројот на местата на производство и бројот на пратките со назнака на сортата и ако се работи за семе, категоријата; податоци за демаркираната зона, вклучувајки и бројот на местата на производство, кои не се определени како контаминирани, но се вклучени во зоната и сите други податоци поврзани со утврдената појава од штетниот оргамнзам. 4. Кога постои ризик од контаминација на компирот, Државниот инспекторат за земјоделство треба да ги извести другите држави кои се засегнати и да достави информации кои треба да се усогласат и исполнат: сортното име на партијата со компири, името и адресата на испраќачот и примачот, датата на доставената пратка. големината на доставената пратка компири и копија од пасошот за растенија или најмалку бројот на пасошот за растенија или фитосанитарниот сертификат или регистарскиот број на одгледувачот или дистрибутерот и копија од испратницата. ПРИЛОГ 4 1. Официјални контролни мерки, од член 8 став (1) од оваа наредба, се: користење на кртолите од компир како сточна храна по третманот со загревање (варење на кртолите), така што да се елиминира ризикот за преживување на штетниот организам; или фрлање на официјално одобрени места за отпад каде што нема ризик за ширење на патогенот во животната средина, (на пример да се спречи продирањето во земјоделско земјиште); или палење, или индустриска преработка со директно и навремено пренесување во фабрика за обработка, на официјално одобрени места за фрлање на отпадот, за која е утврдено дека нема ризик од ширење на штетниот организам и каде има систем за чистење и дезинфекција на возилата; или други мерки. под услов да се утврди дека нема ризик за ширење на штетниот организам при таквите мерки. Останатиот отпад кој произлегува од точка 1 од овој Припог се отстранува согласно Прилог 5 од оваа наредба. 2. Соодветната употреба или отстранување на кртолите или растенијата определени како можно контаминирани согласно членот 6 точка (б) и членот 8 став (2) од оваа наредба. фитосанитарниот инспектор треба да спроведе контрола во секое време и каде компирите треба да се пакуваат или да се обработуваат во капацитети каде има соодветно отстранување на отпадот, наведени во првата и втората алинеа од точка 1 на овој Прилог се: употреба на меркантилните компири наменети за конзумација, пакувани за директен транспорт и нивно користење без препакување, на место со соодветни капацитети за отпад, или употреба на меркантилните компири за индустриска преработка и директна достава до фабриката за обработка, која располага со соодветен капацитет за отпадот и со систем за чистење и дезинфекција на возилата што излегуваат од фабриката; или друга употреба под услов да се утврди дека нема ризик од ширење на штетниот организам. 3. Соодветните методи за чистење и дезинфекција на од член 8 точка (6) од оваа наредба се тие за кои што е утврдено дека нема ризик за ширење на штетниот организам и се користат под надзор на фитосанитарниот инспектор. 4 Серијата мерки што ги спроведува фитосанитарниот инспектор во рамките на определената зона. согласно член 6 точка (в) и члан 8 точка (в) од оваа наредба, го вклучат следното: 4.4. на местата на производство определено како контаминирано согласно член 6 точка (а) од оваа наредба: (а) во поле определено како контаминирано; или 4.1.1. за време од најмалку три години на одгледување, после годината кога е утврдена контаминацијата; се преземат мерки за елиминација на самоникнати растенија од компир и други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организам и нема да се садат меркантилен, растенија или семенски компир или други растенија кои природно може да се домаќини на штетниот организам или посеви за кои има ризик за ширење на штетниот организам; во првата сезона на посевот по периодот утврден во претходните алине од точка 4.1.4. и под успов полето да биде исчистено од други самоникнати растенија од компир и други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам за време на официјални инспекции за најмалку две последователни години на одгледување пред садење. ќе се дозволи само производство на меркантилен компир, а собраните кртоли ќе се тестираат според методот од Прилог 1 од оваа наредба; за време на сезоната на собирање на компирите, по извршување на активностите од претходниот став и по соодветен ротациски циклус, која изнесува најмалку две години, ако се одглрдуваат компири за семе, компирите може да се садат или за семе или меркантилен, се врши официјално испитување и посебен надзор, согласно член 3 став (1) од оваа наредба; или 41.2 за време на четирите години на одгледување, после годината кога е утврдена контаминацијата; се преземат мерки за елиминација на случајно самоникнати растенија од компир и други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организам: полето треба да биде одржувано под угар за време на сезоната или да биде одржувано како пасиште со често косење и испасување на животните; во првата сезона на посевот по периодот утврден во претходните алинеи од точка 41.2. и под услов полето да биде исчистено од други самоникнати растенија од компир или други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам за време на официјалните инспекции за најмалку две последователни години на одгледување пред садење, ќе се дозволи одгледување на семенски и меркантилен компири, а собраните кртоли се тестираат согласно Прилог 1 од оваа наредба; (б) во сите други полиња од контаминираното место на производство кога фитосанитарниот инспектор утврдува дека условите се задоволени и е елиминиран ризикот од самоникнати растенија од компир и други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот организам: во годината на одгледување после годината кога е утврдена контаминација, не се сади меркантилен, растенија или семенски компир, или други растенија кои може природно да бидат домаќини на штетниот организам: или може да се насадат одобрени сертифицирани семиња само за производство на меркантилен компир; во втората година на одгледување после годината кога е утврдена контаминација, се садат само одобрени сертифицирани семиња или компири за семе, кои се официјално тестирани дека се без присуство на прстенесто гниење и се одгледуваат под инспекциска контрола на местата на производство, различни од оние наведени во точка 4.1 без разлика дали се работи за производство на семе или меркантилен компир; најмалку по третата година на одгледување после годината кога е утврдена контаминација, се садат само одобрени сертифицирани семиња или компири за семе, кои се одгледуваат под инспекциска контрола, без разлика дали се работи за производство за семе или меркантилен компир: секоја година на одгледување, наведена во претходните алинеи, ќе се преземат мерки за елиминирање на самоникнати растенија од компир и други растенија кои може да бидат домаќини на штетниот случајните, ако се присутни и секое тестирање на компирите од полето, а собраните кртоли се тестираат согласно Прилог 1 од оваа наредба; (В) веднаш по определувањето на контаминацијата, согласно член 6 точка (а) од оваа наредба, и по првата година на одгледување, се врши чистење и дезинфекција на целокупната механизација и складиштата на местото на производство, како и опремата вклучена во производството на компир. со користење на соодветни методи. согласно точка 3 од овој Прилог; () во единица производство во заштини простори што е определена како контаминирана потребна е целосната замена на медиумот-супстратот за одгледување: нема да се садат кртоли, растенија или оригинално семе. освен ако производната единица била предмет на официјален надзор на мерки за елиминирање на штетниот организмот и отстранување на целокупниот материјал на сите носители домаќини на растенија, вклучувајки целосна громена на медиумот/супстратот за одгледување, чистење и дезинфекција на единицата за производство, како и целата опрема. по што ќе следува одобрување за производство од страна на фитосанитарниот инспектор и производството на компири се врши од одобрени сертифицирани семиња или од миникртоли или микрорастенија изведени од тестирани извори: 4.2. во рамките на демаркираната зона, без оглед на мерките наведени во точка 4.4 се врши следното: (а) веднаш по определувањето на контаминацијата, ќе извршат чистење и дезинфекција на целокупната механизација и складиштата на местото на производство, како и опремата вклучена во производството на компир. со користење на соодветни методи, како што е наведено согласно точка 3 од овој Прилог; б) веднаш и најмалку во текот на три сезони. по определување на контаминација: се обезбеди посебен надзор од фитосанитарниот инспектор над просториите каде се врши производството, чувањето или манипулацијата со кртолите, заедно со просториите каде што се ракува со механизацијата; се бара садење само со одобрено семе или семе добиено со официјална контрола за сите насади на компир во таа зона и тестирање после собирањето на сите компири. одгледани на местата на производство означени како можно контаминирани согласно член 6 точка (6) од оваа наредба; се бара одделно ракување со собраните компири и оние наменети за преработка и конзумација во сите простории во рамки на зоната или се обезбедат систем за чистење и дезинфекција за оние наменети за семе и залихите од меркантилен компир, се спроведа посебен надзор, согласно член 3 став (1) од оваа наредба; (8) се дефинираат програми каде што е возможно, за замена на целокупниот семенски материјал, на одредени временски интервали. ПРИЛОГ 5 Официјално одобрените методи за отстранување на отпадот, од Прилог 4 точка 1 од оваа наредба, треба да се во согласност со следните одредби, така што ќе се согледува секој ризик за ширење на штетниот организам што може да се идентификува: (а) отпад од компирите (вклучува исфрлени и неупотребливи компири и кората од компирите), како и каков било друг цврст отпад поврзан со компирите (вклучувајки почва, камења и други остатоци) се отстранува; или фрлање на официјално одобрени места за отпад каде што нема ризик за ширење на штетниот организам во животната средина, на пример, да се спречи продирањето во земјоделско земјиште. Отпадот се одвезува директно на место каде што има карантински услови. така што нема да има ризик од губење на отпадот; или палење; или други мерки, под услов да се утврди дека нема ризик за ширење на штетниот организам при таквите мерки. (б) течен отпад: пред отстранувањето, течниот отпад што содржи цврсти честици ќе се подложи на филтрирање или процес на обработка за да се отстрани цврстот материјал. Ваквиот цврст материјал се отстранува како што е наведено во точка (а) од овој Прилог. Потоа, течниот отпад: се загрева на минимум 60“С, целото количество за време од 30 минути пред фрлањето; или се отстранува на друг начин под официјално одобрување и контрола, така што не постои ризик дека отпадот може да дојде во контакт со земјоделското земјиште. Можностите наведени во овој Прилог исто така, се однесуваат и на отпадот поврзан со ракување, отстранување и обработка на контаминираните пратки.