Ministerial Decree establishing the methodologies for the analysis of faecal coliforms, PSP (Paralytic Shellfish Poison) biotoxins, DSP (Diarrhetic Shellfish Poison) toxins, mercury and lead in bivalve molluscs

:29-11-1995 GAzn-:1 T.-\ Ur:r-ic1A1.E DlLLA Ru•llf!Ht.h:A I rAUANA Serie :;enaal,, - n. 279 MINISTERO DELLA SANITA DECRETO Jl lu~ 1995. Metodichc di analbi p{'r la determimu:ione dei col.iformi fcc2li, di E.<ieherichia coli, delle salmoneilc, delle bioto.'i.Sine al gali PSP (Paralrfic Slrellfish Poisol !)y ddle tossine DSP (Diarrhclic Shellfish Poisoa), del mcrctirio e dele!oml:lo :ici molluS{:ru bi,alvi. IL MTNISTRO DELLA SANITA Visto ii d(..'Crcto legislativo 30 diccmbrc 1992, n. 530, rccantc attuazionc dclla direttiva 91/492/CEE chc stahiliscc le norme sanitarie applicabili aila produzionc e commcrcializza7ionc dci molluschi bivalvi vivi; Visto ii dccrclo legge 21 luglio 1995, n. 294; Visti i parcri favorevoli de! Consiglio supcriorc di sanila in data 21 scttcmbre 1993 c 12 aprilc 1995; Dccrcta: Art. 1. I. Sono approvatc le mctodiche di analisi allegatc al prcscntc dccreto concementi la detenninazione <lei coliformi fccali, di Escherichia coli, dcllc salmonelle, dcllc biotossine algali PSP (Paralytic Shellfish Poison), dcllc tossinc DSP (Diarrhctic Shellfish Poison), dcl mercurio e de! piombo nci molluschi bivalvi. 2. II prcscnle dccreto sara pubblicato nclla Gaz:::clla U.fficiale dclla Rcpubblica italiana. Roma, 31 luglio 1995 II Mi11istro: GuzzANTI Rcgistrato t1/la Coric d, ,; conli ii JO otlobn 1995 Registro n. I Sanilii, foglio n. 349 27 2')-11-1995 ·-----..----~-. -----~--- ---·-· hLL:CGA'i'O l METOD!CHF.: DI AlJALJ.SI I campioni prelevati da sottoporre ad analisi devono essere costituiti da so,-200 inverteb~ati per aliquota, con criteria inverse alla dimensione delle varie specie. I roolluschi, al mamento d2l control1o, vengono isolati, spazzolati in modo da togliera il fango, le incrostazioni, nonche €::pifi tit epizpi, ecc., eventualmente presenti, lava ti co:-1 acqua clorata (circa 20 ppm) raffreddata con ghiaccio, sciacquati con acqua distillata ste?ile. Cgni si:ngolo mollusco viene aperto co::1 idoneo utensile sterile ed il contenuto (corpo e lic,ru.ido intervalvare) viene lasciato cadere in un recipiente sterile. Preparare un omogeneizzato con un minimo di ~o individui, ed a.ccantonarne una quantita compresa tra 50 e 100 g complessivi. Preparare quindi le seguenti diluizioni dal precedente omogeneizzato: diluizione A: 10 g di cmogeneizzat0 + 90 g di sol. fisioloqica sterile equivalenti a 0,1 g camp./g; diluizione B: 1 ml di diluizione A -'- 9 ml di sol. fisiologica sterile equivalenti a 0,01 g carnp./g; diluizione C: 1 ml di diluizione B + 9 ml di sol. fisiolcgica sterile eqv.ivalenti a 0,001 g camp./g. S2minare le diluizioni di cui sopra secondo :i 2 seguente scl1er:1a: ml 1 diluizione A per pro\retta, in 5 provette contenenti 9 ml di brodo Al ciasctma; ml 1 diluizione B p3r provctta, in 5 provette ccntenenti 9 ml di brodo Al ciascuna; n1l 1 diluizior:.e C per provetta, in 5 provette contenenti 9 ml di brodo Al ciascuna.. In case di molluschi presumibilmente poco contaminati, al fine di una maggiore accuratezza nella valutazione dei risultati, si suggerisc8 la semina diretta di 1 g di omogeneizzato e delle successive diluizioni A e B. In tal caso i valori riportati in tabella 1 dovranno essere divisi per un fattore 10. Le provette, una volta inoculate, vanno incubate a 37 ± 0,5 •c per 3 ore (rivitalizzazione dei germi stressati) e quindi poste a 44 ± 0,1 ·c. Tutte le provette in cui si siano fcrmati, dopo 24 ore di incubazione complessiva, tcrbidita e una cJualsiasi quantita di gas sono considerate positive per coliformi fecali e debbono essere sottoposte alla determinazione successiva. In base al numero delle provette positive si risale al nurnero piu probabile di colifor.rii fecali/J.00 g di rnolluschi applicando la tabella l. 28 B) Determinazione di Eschoriehia coli Calle provette di brodo Al rieultate seminare ricerca di colifonai fecali, brodocoltura in una prcvetta contenente triptonata. Incubare a 44 ·c per 24 ere. positive 0, 1 :ml 10 :ml di p~r la della acgua I..a ricerca di f~;;,cherichia ----90\,i risultera positiva se si rilevE>::ca la fonnazione di indolo ne.lle provette contenenti acqua triptonata. La ricerca dell'indolo viene eseguita aggiungendo a ciascuna provetta di acqua triptonata O, 5 rnl di reattivo di Kovacs. La reazione e positiva se, dopo breve agitazione, si separa tmlla sup.::rf icie del terreno uno strato colorato di rosso ciliegia. In base al numero delle provette positive si risale al numero piu r;rcbabile di E ~qperichia ~oli/100 g di molluschi applicando la tabella 1. PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER L.1\ DETER.J-UNAZIONE DEI COLI:FORMI NEI MOLLUSCHI. Terreno di coltura Al Il terreno Al, che e disidratata, ha la seguente Lattosio Triptone NaCl Salicina Acqua distillata anche cornmercializzato composizione: g 5 g 20 g 5 g 0,5 q.b. a ml 1000. in forma Dopo aver disciolto i componenti del terreno si aggiunge 1 ml di Triton x-100 e si aggiusta il pH a 6,9 ± 0,1. Si sterilizza in autoclave a 121 •c per 10 rninuti. Il terreno puo essere conse:rvato anche per 7 mesi se mantenuto al buio ed in frigorifero . . Acg1la tri:g tonnta: Triptone NaCl Ac~1a ~istillata g 10 g 5 Distribuire in provette e q.b. a rnl 1000 sterilizzare a 121 ·c per 10 minuti. Reattivo di Kovacs: p-dimetilami~obenzaldeide g 5 alcool amilico ml 75 HCl concentrate ml 25 sciogliere l'aldeide nell'alcool amilico a b.ra. a 50-55 • c. Raffreddarc e aggiungere l 'acido cloridrico. Cons€rvare a +4 ·c a.1 .ouio. !1 coiore della soluzicne al morJento della preparazione e giallo tendente al bruno. Nota La ricerca dei coliformi nei molluschi bivalvi pub es::;ere effettuata mediante la prova del Numero Piu. Probabile o mediante qualsiasi al tro procedirnento batterit":>logico che presenti lo stesso grado di precisione. 29 '9-11-1995 GAZZEITA UFFJCIALE DELLA Rt=.PUBBLICA ht.l.!ANA Serie generale - n. 279 ~.::a:.:.:::::::s.e:.. '!'ABELLA °?!PN TABELLA 1 Numero dei tubi po-sitivi 'Indice MPH 5l{l g dil. A 5xl g dil. B Sxl g dil. C per 100 g (O,lg campione) (0,0lg campione) (0,00lg campione) 0 0 1 200 0 1 0 200 0 2 0 400 1 0 0 200 1 0 1 400 1 1 0 400 l l l 600 1 2 0 600 2 0 0 500 2 0 1 700 2 1 0 700 2 l 1 900 ' 2 2 0 900 2 3 0 1200 3 0 0 900 3 0 1 1100 3 l 0 1100 3 1 1 1400 3 2 0 1400 3 2 1 1700 3 3 0 1700 4 0 0 1300 4 0 l 1700 4 l 0 1700 4 l 1 2100 4 1 2 2600 4 2 0 2200 4 2 1 2600 4 3 0 2700 4 3 1 3300 4 4 0 3400 5 0 0 2300 5 0 1 3100 5 0 2 4300 5 1 0 3300 5 1 1 4600 5 1 2 6300 5 2 0 4900 5 2 1 7000 5 2 2 9400 5 3 0 '7900 5 3 1 10900 5 3 2 14100 5 3 3 17500 5 4 0 13000 5 4 1 17200 5 4 2 22100 5 4 3 27800 5 4 4 34500 5 5 0 24000 5 5 1 34800 5 5 2 54200 5 5 3 91800 5 5 4 160900 30 29-11-1995 GAZZETTA UFFlCIALE DELLA REPUBDLICA ITALIANA Saie g"naale • n. 279 C) Determinazione della salmonalle con metodo rapido 1. MSRV (Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis Medium) Con tale sistema vengono individuate solo le salrnonelle mobili, le quali sono comunque la maggioranza (oltre il 99%). Modalita di esecuzione: prelevare 25 g di polpa e liquido intervalvare di mollusco, omogeneizzare in 225 ml di acqua peptonata tarnponata. Incubare a 37 •c per 20 ore (fase di prearricchirnento). Procedere all'arricchimento selettivo direttamente in piastre di MSRV secondo la seguente procedura: depositare tre gocce (0,1 ml circa) della coltura di prearricchimento in punti separati (e lontani tra lore) della superficie di una piastra di terreno MSRV senza spatolare (effettuare 2 repliche), incubare, senza rovesciare la piastra, a 42 · C per 20-24 ore, osservare, intorno ai punti ai deposizione delle gocce eventuali aloni di crescita ( il colore azzurro del terreno appare leggermente rischiarato): essi sono dovuti a batteri mobili che si riproducono bene nel terreno; gli aloni dovuti a sviluppo 01 salmonelle sono di grandi dimensioni e spesso intercettano il bordo della piastra. La semplice osservazione di un tale alone conferisce alla prova una presuntivita di prescnza di salmonelle, rnentre l'assenza di aloni o la presenza di aloni mol to ristretti ( 0 <1, 5 cm) pennette di escludere la presenza di salmonelle mobili, in caso di positivit~, procedere ccraunque ad un accertamento preliminare rapido sul materiale piu esterno dell'alone mediante il test di agglutinazion e al lattice con 'sieri anti H, lo stesso materiale piu esterno dell'alone prelevato- per le subcolture destinate alle identificazione. Terreno di coltura MSRV: Triptosio Idrolizzato di caseina (acido) Cloruro di sodio Potassio fosfato monobasico Cloruro di magnesia (anidro) Verde malachite ossalato Agar g 4,59 g 4,59 g 7,34 g 1,47 g 10,93 g 0,037 g 2,7 puo essere prove di Acqua distillata pH q.b. a ml 1,000 5,2 ± 0,2 La ricerca. delle salmonelle puo es.sere effet.tuata anche util izzando al tri 1.1et0di rapidi equ'ipollenti, reperibili in commercio, che presentino lo stesso grado di precisione. 31 29-11-1995 GAZLETIA UFFICL\LE DELLA REPUBnUC.-\ ITALIANA Serie gcncru/e - n. 27'-) D) Determinazione delle biotossine algali PSP (Paralytic Shellfish Poison) 1. PRINCIPIO l. l Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale di un estratto di molluschi in topi adulti. La presenza di tcssina PSP provoca la morte degli animali. 2. MATERIALI 2.1 Si utilizzano topi albini di razza Swiss di peso cornpreso fra i 19 e 21 g. Seil peso e >21 o <19 si applica il fattore di correzione del peso. Non si possono utilizzare topi con peso >23 g e topi gia usati. 3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 I molluschi da analizzare vengono puliti esternamente lavandoli car, acqua. Si aprono tagliando i muscoli adduttori e si rimuovono i tessuti molli (polpa) del mollusco dalla conchiglia. Non si debbono usare ne calore ne anestetici prima di aprire il mollusco e bisogna evitare di danneggiare o tagliarne il corpo. 3.2 Circa 100-150 g di polpa vengono trasferiti su una retina di plastica, dove vengono lasciati scolare per 5'. 3.3 Si omogeneizza il campione in frullatore elettrico. 4. ESTRAZIONE DEL CAMPIONE 4.1 Si pesano 100 g di materiale omogeneizzato. 4.2 Si aggiungono 100 ml di HCl 0,25 N, si agita e si verifica che il pH non sia cornpreso fra 2 e 2,5. 4.3 La miscela viene portata ad ebollizione e si lascia bollire lentamente per 5'. 4.4 Si lascia raffreddare a temperatura ambiente e si veri!ica nuovamente il valore del pH che deve essere compreso fra 2 e 2, 5. Per · abbassarlo si aggiunge HCl 5 N, agitando fino ad ottenere il valore del pH voluto. Per alzare il pH si aggiunge alla miscela NaOH 0,1 N lasciandola cadere a gocce ed agitando costantemente per prevenire una alcalinizzazione locale e di conseguenza la distruzione della tossina. 4. 5 Si trasferisce la mi see la in un cil indro graduate da 200 ml e si porta a volume con acqua. 4.6 Si centrifuga la miscela a 3000 r.p.m. per 5'. 4.7 Il sopranatante viene trasferito in una be~ta e si controlla di nuovo il pH. 32 29-1 l-l 995 GAZZUTA UH!ClALE DLLLA REi'i.JUi:LICA lTAU,'.:--l:, 5. 1 Si inccula ncl pe:r-.i toneo di ciascun t.opo tes i: 1 ml di estratto acido. 5.2 Si annota con un cronometro il tempo all'inizio della inoculazionc e si osserva attentarnente il topo per stabilire il tempo di rnorte indicate dall'ultimo recpiro. 5.3 Si puo usare per l'iniziale detcrminazione un topo !;Olo, ma e preferibile usarne 2 o 3. 5.4 Seil tempo di rnorte o la mediana dei tempi di morte dei topi e <5 minuti si fauna diluizione per ottenere un tempo di morte compreso tra 5 e 7 rninuti. 5.5 Seil tempo di morte di 1 o 2 topi a cui estate iniettato l'estratto non diluito risulta >7 minuti, tre o piu topi devono esscre inoculati per stabilire la tossicita del campione. 5.6 See ~ecessaria una elevata diluizione, della soluzione aggiungendo gocce di HCl portare il pH ad un valore tra 2 e 2,5. z~ aggiusta il pH (0,1 o 0,01 N) per 5.7 Si inoculano tre topi con la diluizione che da un tempo di morte di 5-7 minuti. 6. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 6 .1 Si determina il tempo mediano di morte dei topi tenendo presente anche quel~i sopravvissuti e tramite la tabella 2 si determinano i corrispondenti valori di unita topo. 6. 2 Se il peso degli animali e <19 g o >21 g si opera una correzione per ciascun topo moltiplicando le unita topo corrispondenti al tempo di morte peril fattore di correzione del peso per quel topo ricavato in base alla tabella 3 ed infine si sceglie il valore mediano delle unita topo corrette per gruppo (considerare il tempo di morte dei sopravvissuti come >60 minuti o equivalente a <0,875 U.T~ nel calcolo della mediana). 6.3 Si convertono le U.T. in µg di tossina/ml moltiplicandole peril valore del fattore di conversione (C.F.). Quest'ultimo e data dal rapporto tra µg di tossina PSP della soluzione di riferirnento inoculata in peritoneo e l'U.T. corretta: µg di tossina/100 g di polpa = (µg/ml) x fattore di diluizione X 200. 33 29-11-1995 G.!.ZZtTTA UFFICALl3 DELLA RU'CBBLIC.\ ITALIA~{.\ Serie genera!e - n. '279 . r......,. ...... r ~-··- ----~--~--- . 7. STANDARDIZZAZIO?H: DEL }lETODO BIOLOGICO 7.1 Preparare una soluzione standard di lavoro di PSP, utilizzando una soluzione madre USA, fino ad ottenere una concentrazione di 1 µg/ml. Si ottiene portando i ml di soluzione standard madre a 100 ml con acqua distillata. Questa soluzione e stabile numerose settimane a 3-4 ·c. 7.2 Calcolo del valore del C.F. (fattore di conversione). 7. 2. 1 Si diluiscono aliquote di 10 ml di soluzione standard di lavoro (1 µg/ml) con 10-15-20-25-30 ml di H20. Il pH della diluizioni deve essere compreso fra 2 e 4 e non deve mai superare 4,5. 7. 2. 2 Viene scel ta quell a diluizione che iniettata in tre o piu topi per via intraperitoneale alla dose di l ml deterrnina la rnort!e degli animali in un tempo mediano di 5-7 minuti. 7.2.3 La diluizione scelta viene provata con variazioni di +l rnl di H2o (ad esempio se 10 ml di standard diluiti con 25 ml di H20 uccidono i topi in 5-7 minuti, si provano soluzioni diluite 10 + 24 a 10 + 26). Si inietta un gruppo di topi con 1 ml di ciascuna delle 2 o 3 diluizioni che determinano la morte nel tempo mediano di 5-7 minuti. 7. 2. 4 Si inietta ll:na dose. di 1 ml intraperitoneale e si determina corrispondente al tempo trascorso iniezione e l'ultimo respiro del topo. a ciascun topo per via il tempo di morte fra l'esecuzione della 7. 2. 5 Si ripete la prova 1 o 2 giorni p.iu tardi usando le diluizioni preparate come sopra descritto, che differiscono per variazioni di + 1 ml di H2O rispetto alla diluizione usata. 7. 2. 6 Si ripete poi l 'intero test partendo diluizioni ottenute dalla soluzione standard di µg/ml) preparata fresca prima dell'uso. con nuove lavoro (1 7.2.7 Si calcola il tempo mediano di morte per ciascun gruppo di 10 topi utilizzati e per ciascuna delle diluizioni preparate. Se tutti i gruppi di 10 topi iniettati con qualunque diluizione darmo ternpi mediani di morte <5 o >7 minuti non si tiene conto dei risultati .di questa diluizione nei calcoli successivi. D'altra parte, se anche per uno solo dei gruppi di 10 topi iniettati con una qualsiasi diluizione si verifica un tempo mediano di rnorte compreso tra 5 e 7, minuti si includono nei calcoli tutti i gruppi di 10 topi usati con questa diluizione, anche se alcuni dei tempi mediani di morte sono·<5 o >7 minuti. 7. 2. 8 Dal tempo mediano di morte · per ciascun gruppo di 10 topi di ciascuna delle diluizioni selezionate si deterrnina il tempo mediano di U.T./ml tramite la tabella 2. 34 29-11-1995 GAZZETTA UFFiCIALE DELLA Rr:PUilDL!CA ITALIAN:\ Serie gt•icralc - n. 279 7.2.9 Si dividono i µg tli tossina calcolati per 1 ml per le U.T./ml al fine di ottenere il fattore di conversione {C.F.) il quale esprime i µg di tossina equivalenti ad 1 U.T. 7. 2 .10 Si calcola il val ore medio del c. F. e si usa tale valore come punto di riferimento per controllare le prove di routine. 7.2.11 I valori di C.F. possono variare in modo significativo nell 'ambi to dello stesso laboratorio se le tecniche e i topi non sono rigidamente controllati. 8. USO DELLO STANDARD PER PROVE DI ROUTINE SUI MOLLUSCHI 8.1 Si controlla periodicamente il valore del C.F. 8.1.1 Se i molluschi sono analizzati rneno di una volta a settimana, si determina il val ore del C. F. in ciascun giorno in cui sono effettuate le prove, iniettando 5 topi con opportune diluizioni dello standard di lavoro. 8.1.2 Se le prove vengono effettuate in giorni diversi nell 'ambi to di una settimana, e necessario fare sol ta.nto un controllo settimanale con diluizioni di standard tali che il tempo mediano di morte risul ti cornpreso tra 5 e 7 rninuti. Il valore del c;F. cosi determinate dovrebbe essere compreso nel valore medic del C.F. ± 20%. 8. 1. 3 Se il control lo non cade in questo ambi to, si completa un gruppo di 10 topi (aggiungendone 5 ai 5 gia iniettati) e si inocula un secondo gruppo di 10 topi con la stessa diluizione di standard. 8.1.4 Si media il valore del C.F. per il secondo gruppo con quello del primo e si prende il risultato come nuovo valore di C.F. Variazioni del C.F. >20% rappresentano una significativa modificazione della risposta dei topi alla tossina o alle tecniche di laboratorio. Modificazioni di questo tipo richiedono un cambiamento del valore del C.F. 8.1.5 Controlli ripetuti del valore di C.F. di solito conducono a risultati compresi in una variazione del ± 20%. Se si riscontrano frequentemente variazioni piu arnpie sarebbe opportune procedere ad un controllo di tutta la tecnica prima di continuare con le normali prove di routine. 35 29-! l-1995 G-\ZZETTA UFflC!.\LE DELLA REPUBBUCA lTALJANA Serie generale - n. 279 ~.....,.........:,,: -:,:, =============""-""···'"'· ,,., ,,,, ,,., =========..,=~--===,.-========= DETER.~INAZIO~'E TOSSINE IDROSOLUBILI - P.S.P. Tempo di morte (minuti) 1:00 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 U.T. 100 66,2 38,3 26,4 20,7 16,5 13,9 11,9 10,4 9,33 8,42 7,67 7,04 6,52 6,06 5,66 5,32 5,00 4,73 4,48 4,26 4,06 3,88 3,70 3,57 3,43 3,:n 3,19 3,08 2,98 2,28 2,79 2,71 2,63 2,56 2,50 2,44 2,38 2,32 2,26 2,21 2tl6 2,12 2,08 2,04 2,00 1, 96 Tempo di morte (minuti) 36 5:00 05 10 15 20 30 40 45 50 6:00 15 30 45 7:00 15 30 45 8:00 15 30 45 9:00 30 10:00 30 11: 00 30 12:00 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 30 40 60 TAl!ELLA 2 U.T. 1,92 1,89 1,86 1,83 1,80 1,74 1,69 1,67 1,64 1,60 1,54 1, •18 1,43 1,39 1,35 1,31 1,28 1,25 1,22 1, 20 1,18 1,16 1,13 1,11 1,09 1,075 1,06 1,05 1,03 1,015 1,000 0,99 0,98 0,972 0,965 0,96 0,954 0,948 0,942 0,937 0,934 0,917 0,80/3 0,375 29-I l-1995 GAZZEITA UFFlCIALE DELLA Rfl'UBilLICA ITAUANA Serie r;mcrale - n. 27' . ---~•h- - -W ., -•--•- ..... -===:::.-,,,==-c--"'C::==========· . -- ......... ... ................ ...., ......... .....,... ,~ ....... ------------·· DETERMINAZIO~"E TOSS!h"E IORCSOLUBIL! - F.S.P. · - Fattori di correzione del peso Peso del topo (g) Unita topo 10 0,50 10, 5. 0,53 11 0,56 11,5 0,59 12 0,62 12,5 0,65 13 0,675 13,5 0,70 14 0,73 14,5 0,76 15 0,785 15,5 0,81 16 0,84 16,5 0,86 17 0,88 17,5 0,905 18 0,93 18,5 0,95 19 0,97 19,5 0,985 20 1,000 20,5 1,015 21 1,03 21,5 1,04 22 1,05 22,5 1,06 23 1,07 E) Oeterminazione delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poison) l. PRIHCIPIO 1.1 Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoncale dell'estratto dell'epatopancreas di molluschi in topi adulti. La presenza di tossina DSP provoca negli anirnali malessere generale e morte. 2. ¥.ATERIALI 2.1 Si utilizzano topi albini di razia swiss del peso di 18-20 g. 2. 2 Introdurre gli animali nelle strut"ture di stabulazione nelle stesse condizioni ambientali in cui si svolgera il saggio per almeno cinque giorni prima dello stesso. 37 2()-11-1995 Serie generate • n. 279 3. ZSTRAZIONB D~LLA TOSSINA 3.1 Pulire rnolJ.uschi, retina di minut.i.. esternamE,nte con acqua una quanti ta opportuna di prelevare g 25 cli epatopancreas e trasferirli su una plastica dove vengc,n.o lc1sciati sgocciolare per 5 3.2 Omog0n0izzaro gli epatcpanc~eas con omogeneizzatore a ca,;itazicn.-~; pesare g 2C: tl.i o,,,:Jgcn(-!izzzito eel cstrarli con nl 100 di acetone mant0nendoli per 2 minuti a tempcrat~ra arnb.i.ente. J. J F.:i.l tr.:lre per ca:rta da f il tro c,:.imunr.;;. 3. 4 Riprendere il res iduo rir.msto sul f il tro e ripetere le oper~zioni descritte nel punti 3.2 e 3.3 per altre due volte, estraendo con 50 ml di acetone ogni volta. 3.5 Riunire i tre e.str~tti evapor.:itore rotante a 30-40 anche l'acqua residua. e far • C. Non evaporare l'acetone in e necessario eliminare 3.6 Risospendere il residua in nl 10-15 di acqua distillata. 3.7 Es:trarre la sospensione acq-J.csa con ml 50 di ctcre etilico. Nel c3so si formi, all'interfac~ia delle due fasi, un'emulsione non risol~bile, questa va separata, addizionata con 10 ml di acq1.,::t e rh,stratta con 25 ml di ete::.·2; l 'eventuale u.lteriore emulsione viene eliminata. Riunire le fasi eteree. 3.2 Ripctere l'operazione del punto 3.7 per due volte lavando con p.iccole quantita di 2cqua; riuni:o~ 9li estratti eterei ed cvaporare. J.9 Sospende~e il residua in ml 4 dl Tween 60 all'l%. Curare la forrnaz ione di .un' emulsicne or.!ogene3 c s0nza grumi, cventualmente con l'uso di ultrasuoni. 4.1 Pssare i t0pi ed nnnotaz·G il peso di ciascuno, indi inoculare int:ccperitoneo trc topi con 1 r.11 della so.spensione doll'estrc:tto. 4.2 Tcnere gli anim~li in o~s~rvaziona per 6 or~, controllando il loro state ogni 15 minuti. Assumere come tempo di sopravviv".?nza l 'intervallo tra l' inoculazionc e l 'ultimo ccntrollo in cui risultavano vivi. 5. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 5.1 Correggere in funzione del peso dei singoli topi i relativi tempi di sopravvivenza osservati, moltiplicandoli per i fattori di correzione riportati nella tabella 4. 38 29-1 l-lS05 G,'.ZZl:TT.\ UFncu,.LE DI:LLA REPUBDLICA hALIANA Se, ie ger.erule - n. 279 ~=~·.::.~,:--·•---,---~-=~·-=----··--=--==·==--=· ==-=·=--================ 5.2 Se almeno due topi hanno un tempo di sopra-..rvivenza inferiore alle 5 ore il saggio risulta positivo. 5.3 Se alrneno due topi hanno un tempo di sopravvivenza superiore alle 5 ore il saggio risulta negativo. 5.4 Se si verifica quanto previsto al punto 5.3, ma il terzo topo ha un tempo ·di sopravvivenza inferiore alle 3. ore, il saggio viene ripetuto su 4 topi, aumentando in proporzione la quantita di epatopancreas di partenza ed il volume della soluzione di Tween. Si determina la mediana dei sette tempi di sopravvivenza registrati complessivamente: se questa e inferiore alle 5 ore il saggio si considera positive. TABELLA 4 FATTORI DI CORREZIONE Peso del topo Fattore (g) 18,0 1,14 18,5 1,10 19,0 1,06 19,5 1,03 20,0 1,00 F) Metodo di analisi per la determinazione del mercurio nei molluschi bivalvi (Decisione 90/515/CEE della Commissione del 26 sctteml:>re 1990) 1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Il rnetodo di analisi consente la determinazione del contenuto totale di rnercurio nei molluschi. 2. PRINCIPIO Il campione e mineralizzQto con miscela solfonitrica; lo ione mercuric e ridotto allo state metallico con cloruro stannoso ed estratto dalla soluzione in corrente di aria. I vapori di mercuric sono convogliati in cella cilindrica con finestra di quarzo pasta nel canunino ottico di uno spettrofotometro per assorbimento atomico e la determinazione si esegue misurando l 'assorbimento alla lunghezza d'onda di 253,6 nanometri. 3. APPARECCHIATUlU\ 3.1 Omogenizzatore ad immersione in acciaio inox 3.2 Digestore costituito da un pallone della capacita di 100 ml rnunito di cello smeriglio su cui e innestato un refrigerante in vetro borosilicate (fig. 1). 39 29-11-1995 G.V..ZETrA UFrICIALE DELLA REPUBRLlCA ITALIANA Serie gl!nerale • n. 279 3.3 Dispositivo per la riduzione del mercuric e trascinamento dei vapori, costituito da un sistema chiuso di gorgogliamento e da m·1,:1 pompa peri.st'lltica per la generazior.e d1c1lla c:orrente d' a.r i.a (fig. 2) . 3.4 Spc~trofotomet~o r0r assorbimento atomico munito di cella cilindri.ca con finestra di quarzo av.ante car:ind.no ottico di 100 mm e diametr-o interno di 2 o min, e di lampv.da a rnercurio ( a scarica o a catodo cavo). 4. REA'I'TIVI 4.1 Sol~zione di rifcrimento contenente 1000 µg/ml di mercuric Diluire questa soluzione, al memento dell'uso, con acido solforico 1 Nin mode da ottenere una concentrazione di 1 µg/ml di mercurio. 4.2 Miscela solfonitrica (1:1) Miscelare volumi uguali di acido nitrico concentrate 65% ed acido solforico concentrate 98%. 4. 3 Soluzione di 12% p/v) Sciogliere di idrossilarnina cloridrata di idrossilamina (concentrazione 12 g di cloruro di sodio e 12 g di cloridrato in acqua e portare a volume di 100 ml. 4.4 Saluzione di claruro stannoso biidrato (concentrazione 10% p/v) Scicc Jl lore 1 O solforico 1 N (4.5) acido solforico. g di cloruro stannoso biidrato i:?1 acido e portare a volume di 100 ml con lo stesso 4.5 Soluzicne di acido solforico 1 N Diluire opportunarnente acido solfDrico al 98% puro per analisi di ~etalli in tracce. 5. PROCEDIMENTO 5.1 Mineralizzazione 5.1.1 Pesare direttamente nel pallone del digestore circa 3 g (con la pfecisione di ± o, 01 g) del carnpione accuratamente omogeneizzato ed aggiungere 10 ml di miscela solfonitrica (4.2). Agitare e lasciare a temperatura ambiente per circa 10 minuti e riscaldare quindi cautamente con microfiamrna regolando la temperatura in modo da mantenere la soluzione solfonitrica sempre in ebollizione incipiente·. Proseguire il riscaldamento fino ad ottenere una soluzione lirnpida. Raffreddare il pallone ed aggiungere dall'alto del refrigerante 30-40 ml di acqua. Far bollire per altri 20 rninuti per l'eliminazione degli ossidi di azcto. Raffreddare, lavare il refri.gerante con 20 nl di acqu:1 di.s tillata, tras fe1- ire in 1=:-,a l l-or!r2 t t\:ratc da J. 00 e 1;1:::r~t:3re c.1 vol1.1r.1e C~{Jr: 1.~-1.-':~;n...:ia <:!istill.J.·::.o. .. 40 29-11·· l 995 r ~ "" ( \j "'.. ;-.,.f':111, --·•-·~-""' ,. .. i!'f' I Ii ~,-'--c·::;: ~ ~ B g e --s flaur~ 2 41 S:·; ;. · ~:..:,: :!" . .. <·.' - i!. ::-i) ·········- ·······- =· =----,..=,,.----- ·-· ····-··--·: -· .. - . ·- .. ··- .... ~:-, .. -:--.. = ... , ........ --c=.',C .. '.7. ..• 5.2 Detsrminazione quantitativa 5.2.l Lettura spettrofotometrica :Predisporre lo strtEJento n,"':<lle seguenti cond.i z ioni operative: Lunghezza d'onda: 253 1 6 nanometri. Lettura: con registratore. Trasferire 5 ml di soluzione del campione nineralizzato nella boccia di gorgog1 i-~·ur:entu; Ag01i1 .. mg~.re O, 5 ml di cl or id.ca to di idrossilamina e colli:::gare il palloncino al sistGma di gorqogl iarr.ento. Versa re dall' imbuto di carico 1 ml di cloruro stannoso E~d iniziare iIT..mediatamente il gorgoglia:mE',nto dell'aria. Registrare il segnale dGll'assorbanza che cresce gradatarnente fine ad un massimo e quindi di~inuisce lentam8nte: effettuare la lettura in corrispondenza del massimo. 5.2.2 Curva ai tar~tura Trasferire in 5 palloni tarati da 100 ml, rispcttivarnente, 10 ml di miscela solfonitrica e O ml - 1 ml - 2 ml - 3 ml - 4 ml di soluzione di Port2r.e al volume palloncino. r.i.ferimento di 100 ml contenente 1 µg/Lll di mercuric. con acqua distillata ciascun Eseguire su queste soluz icni la m.i.sura dell' assorbanza comG descritto al punto 5.2.1. Con i valori ottenuti si costruisce la curva di taratura. 5.2.3 Ca.lcolo Riportare sulla curva di taratura la misura dell'assorbanza eseguita al punto 5.2.1 e calcolare la concentrazione del mercuric nella soluzione. Il val9re ottenuto diviso per il peso del campione prelevato (5.1.1) espresso in grarnmi da il conte:1uto in mercurio dei molluschi espresso in microgrammi per gramme. G) Hetodo di analisi par la determinazione del piombo nei molluschi bivalvi (Decisione 90/515/CEE della Commissione del 26 settem.bre 1990) l. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Il metodo di analisi consente la determinazione del contenuto totale di piombo nei rnolluschi. 2. PUINCIPIO D~L METODO Il contenuto totale di piombo nei molluschi ~ determinate mediante 1a Spettrofotometria di assorbimento atomico, in fornetto di grafite. Allo scopo di ~idurre gli effetti interferenti della matrice durante la misura spettrofotometrica ~ utilizzato il metodo delle addizioni standards. La mineralizzazione del campione 6 condotta ~cdiante incEnerimento a secco. 42 29-11-1''95 =====·--- ==c...c=-=- ... -·========-- -- ------------- 3. REEi.TTIVI 3.1 Acido nitrico 65% pure per anali.si, mctalll in tracce 3.2 Acido cloridrico 37% 3.3 Acido nitrico 65% 3.4 Fosfato biacido di ammonio (NH4H2P0 4 ) 3.5 Nitr~to di magnesia (Mg(N03)2) 3.6 Modificante di matrice: sciogliere 4 g di fosfato biacido di am:monio (3.4} e 0,2 g di nit.ra·to di maqnesio (3.5) in acgua. e portare a 100 ml. 3.7 Soluzione concentrata di riferimento di piombo (100 rng Pb/L): sciogliere 159,9 mg di nitrate di pior.ilio (Pb(N03 ) 2 ) in acqua in tm pallone tarato da 1000 ml, aggiungere 10 ml di acido nitrico (3.1}, portare al volume di lL ed agitare. Mantenere la soluzione in bottiglia di vetro borosilicato. 3.8 Soluzione di riferimento di pio~~o (1 mg Pb/L): pipettare· 1, O ml della soluzione di riferimento (3. 7), in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 1 ml di acido ni trice ( 3. 1) e portare al volume di 100 ml con acqua ed agitare. 3.9 Soluzione diluita di riferimento di piombo (10,0 e 20,0 µg Pb/L): pipettare 1, O e 2, O ml della soluzione di riferimento (3.8) in palloni tarati da 100 ml, aggiungere a ciascuno 1 ml di acido nitrico (3.1) e portare al volume di 100 ml con acqua ed agitare. Mantenere la soluzione in bottiglia di polietilene. Preparare le soluzioni fresche ogni giorno. 3.10 Argon ultrapuro. 4. APPARECCHIATURE, VETRERIA E !'11.TERIALE VARIO 4.1 Omoger.eizzazione 4.2 Capsule di platino a fondo piatto, o capsule di quarzc 4.3 Piastra riscaldante, termorcgolabile 4.4 Forno a muffola, rivestito internamente in quarzo, con programmatore elettronico di temperatura 4.5 Bilancia analitica 4.6 Palloni tarati, capacit~ 100 e 1000 ml, con tappi a smeriglio in vetro 4.7 Pipette tarate, di volumi differenti (da 50 µLe 5 ml) con puntali di plastica 4.8 Bottiglie di polietilene, capacita 100 ml 4.9 Spettrofotometro ad assorbimento atomico, munito di fornace di grafite, correttore del fondo, autocampionatore con cuvette in teflon, stampante, lampade a catodo cave per piombc, tubi di grafite pirolizzati piattaforme del L'vov ecc. Tutta la vetreria deve essere di vetro borosilicate o ve.tro di qualita simile. Prima dell'uso la vetreria deve essere lavata a caldo con una soluzione di acido cloridrico (3.2) 1:3 43 29-11-199.i GAi.ZETTA ur;·::ciALE DELLA REPi.iaBL!CA hAUANA S,•rfe genrra!e • n. 279 (v /v) , quindi risciacquata con acqua distillata, trattata a cal do con una soluzione di acido ni trice ( 3. 3) 1: 3 (v /v) , e infine risciacquate con acqua bidistillata. La vetreria deve essere asciugata e conservata in un luogo al riparo da possibili contaminazioni. Le cuvette in teflon devono essere trattate nello stesso modo. 5. PRETR...~TTA¥..ENTO DEL CNiPIONE 5.1 Campione Il campione deve essere conservato in modo tale che la sua composizione non sia alterata per disidratazione, condensazione o alterazione. 5.2 Campione per analisi Il campione per l'analisi deve essere rappresentativo dell'. intero campione. Eszo deve essere preparato rapidamente macinando 100 g di prodotto fino a completa o~ogeneizzazione. ~. PROCEDURA 6.1 Incenerirnento a secco 2,00 g del prodotto accuratamente omogeneizzato e pesato in capsula di platino, sono sottoposti ad essiccarnento e quindi a carbonizzazione su piastra riscaldante in maniera lenta e graduale al fine di evitare perdite per proiezione di matrice. Il residua carbonioso, trasferito in muffola, viene incenerito per 8 ere alla temperatura di 400 + 10 •c. Dopo tale trattamento le ceneri devono risultare perfettamento bianche. Nel caso contrario il residuo, trattato con poche gocce di HN03 e nuovamente essiccato, viene sottoposto ad un nuovo ciclo di incenerimento per almeno 4 ore. Le ceneri riprese con 1 rnl di HN03 (3 .1), vengono riscaldate fino a completa dissoluzione trasferite in un palloncino tarato da 50 ml e portate a volume con H20 bidistillata. 6.2 Bianco Condurre l'intero procedimento di mineralizzazione, o~ettendo la porzione del carnpione da analizzare. 6.3 Determinazione spettrofotometrica 6.3.1 Condizioni strurnentali La rnisura strurnentale e eseguita rnediante uno Spettrofotometro di assorbimento atomico, rnunito di fornace di grafite ed autocampionature, gestiti da un computer complete di stampante grafica. I parametri strurnentali peril piombo sono i seguenti: Misura strurnentale: Metodi di calibrazione: Modo di misura: Fenditura (nm): 44 Assorbanza Addizioni standards Area di picco 0,7 ,...,-;;:-• 29-11-1995 GAZZETIA UFFICIALE DELLA REPUBULICA fTALIANA Serie generate - n. 279 Lunghezza d'onda: Introduzione del carnpione: Tempo di misura, durante l'atornizzazione (sec.): Repliche: Correttore del fondo: Tubicini pirolitici di grafite con ~metri del fornetto di grafite Stadio Ternperatura Rampa Numero (. C) 1 90 10 2 130 10 3 450 15 4 800 15 5 1800 0 6 2500 2 7 20 2 Parametri dell'autocamnionatore Volumi (µL) Standard Campione ( 20 µ,g/L Pb) Bianco Campione 20 1· addizione 10 20 2. addizione 20 20 6.3.2 Misura strumentale 283,3 campionatore automatico 3· 3 inserito durante l'atomizzazione piattaforma del Tempo Isoterma 10 20 20 20 3 2 2 L'vov Flusso gas (ml/min) 300 300 300 300 0 300 300 Bianco Modifican. di rnatrice Mg(NO3)2+NH4H2PO4 40 5 20 5 10 5 5 Se lo Spettrofotometro dispone di un computer, la concentrazione del piombo nella soluzione del campione e calcolata direttamente dallo strumento con il metodo delle aggiunte standards, e riportata sulla starnpante. 45 29-11-1995 GAZZETfA UFF!CIALE DELLA RF.PUBilUCA hALIANA Serie generate - n. 279 Se lo strurnento non dispone di un computer, e necessario costruire la retta di taratura con il metodo delle aggiunte standards, riportando in ascisse il valore di concentrazione e i~ ordinata le assorbanze corrispondenti. Riportati i tre punti corrispondenti alle tre letture, rispettivamente del campione, del campione piu la prima aggiunta e del campione piu la seconda aggiunta, costruire la retta passante per i tre punti e prolungarla fino ad intercettare l'asse delle X. Il valore di concentrazione corrispondente all'intercetta rappresenta il valore di concentrazione di piornbo, nella soluzione del campione. Il metodo correttamente se campicne con le linearita. 6.3.3 Calcolo delle aggiunte standards e applicato i valori di assorbanza del campione e del due aggiunte rientrano nel campo della Il contenuto del piom.bo nel campione e calcolato mediante la seguente formula: c • V C == 1000 • m C = contenuto di piombo espresso in mg/kg del campione analizzato c = contenuto di piombo espresso in µg/L nella soluzione del campione V = il volume della soluzione espresso in ml m = la porzione del campione per l'analisi espressa in grammi 7. Accuratezza L'accuratezza del metodo e in funzione della disponibilita di adeguati materiali standards di riferimento. Qualora non siano disponibili materiali simili alla matrice alimentare da analizzare e necessario ricorrere a prove di recupero sulla matrice opportunamente addizionata dell'analista. a. Limite di rivelabilita Il limite di rivelabilita del metodo, utilizzando il procedimento di incenerirnento a secco, per una porzione di campione di 5 g, e pari a 0,020 mg/kg. 9. Riproducibilita a) per concentrazioni fino a 100 µg/kg il CV e inferiore a 0,20; b) per concentrazioni tra 100 µg/kg e 1000 µg/kg il CV e inferiore a 0,15; c) per concentrazioni maggiori di 1000 µg/kg il CV e inferiore a 0,10. 46 :-J--11-1995 .','crie g;:ncrafa • 11. 279 H) Hodr,li ta di co~ti tuzio:10 dr:l G-3.mpicnc ell. r:,ol lu:::r:115. bi·,:;,11 vi dcstinnto ~lle nnalisi 1. Il ca:mpionc di r:1011. uschi bi vol vi da sottoporri?- u-:3. nnal isi deve essere costituito da 50-300 invertebrati per aliquota in relazione al tipo di analisi ed alla specie di molluschi oggetto del prelievo, con criteria inverse alla dimensione dei molluschi. 2. Ciascuna delle aliquote di cui al punto 1 puo essere utilizzata per un solo tipo di accertarnento anal i tico (microbiologico, chimico, biotossicologico, fisico). 3. I campioni dei molluschi bivalvi devono essere mantenuti, dal memento del prelievo al memento in cui viene iniziata la prima analisi, a temperatura non superiore a +6 ·c. 4. I controlli microbiologici vengono eseguiti con le modalita previste dall'art. 4 del decreto legislative 3 marzo 1993, n. 123. 95A7125 47