Ministerial Decree approving the official method for the analysis of enzymes of lactic acid of milk

D.M. 10 novembre 1997 (1). Ufficializzazione del metodo di analisi per la «Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel latte». (1) Pubblicato nella Gazz. Uff. 3 gennaio 1998, n. 2. L'ISPETTORE GENERALE CAPO DELL'ISPETTORATO CENTRALE REPRESSIONE FRODI DI CONCERTO CON IL DIRETTORE GENERALE DEL DIPARTIMENTO DELLE DOGANE E DELLE IMPOSTE INDIRETTE DEL MINISTERO DELLE FINANZE IL DIRETTORE GENERALE DEL DIPARTIMENTO DEGLI ALIMENTI E NUTRIZIONE E DELLA SANITÀ PUBBLICA VETERINARIA DEL MINISTERO DELLA SANITÀ IL DIRETTORE GENERALE PER LO SVILUPPO PRODUTTIVO E LA COMPETITIVITÀ DEL MINISTERO DELL'INDUSTRIA, DEL COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO Visto l'art. 2 del decreto legislativo 4 giugno 1997, n. 143, che istituisce il Ministero per le politiche agricole; Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente norme per la razionalizzazione dell'organizzazione delle amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di pubblico impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n. 421; Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033, convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l'art. 108 del regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge, approvato con regio decreto 1° luglio 1926, n. 1361, i quali prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione suddetti dovranno essere eseguite dai laboratori incaricati con i metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il Ministero delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero dell'industria, del commercio e dell'artigianato; Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n. 327 «Regolamento di esecuzione della legge 30 aprile 1962, n. 283», e successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande; Vista la legge 3 maggio 1989, n. 169, sulla disciplina del trattamento e della commercializzazione del latte alimentare vaccino; Visto il decreto interministeriale 26 marzo 1992, pubblicato nel supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale n. 90 del 16 aprile 1992, con il quale è stata data attuazione alla decisione n. 91/180/CE concernente la fissazione di metodi di analisi e prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente; Visto il decreto del Presidente della Repubblica 14 gennaio 1997, n. 54, pubblicato nel supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale n. 59 del 12 marzo 1997, con il quale è stata data attuazione alle direttive n. 92/46 e n. 92/47 in materia di produzione ed immissione sul mercato di latte e di prodotti a base di latte; Considerato che, come noto, l'acido lattico, quale prodotto della fermentazione del lattosio, è un parametro qualitativo indice dello stato di conservazione del prodotto latte; Ritenuto pertanto opportuno disporre di un metodo analitico che tramite il dosaggio dell'acido lattico fornisca elementi informativi a supporto di un giudizio di genuinità e qualità del prodotto latte sia sotto il profilo igienico-sanitario che di composizione; Ritenuto altresì indispensabile porre a disposizione di tutti gli istituti e laboratori pubblici idonei metodi di analisi per il controllo del latte, perché le analisi da essi compiute risultino uniformi nei procedimenti e nei risultati; Sentito il parere della Commissione UE - a norma della direttiva n. 83/189/CE, che dispone una procedura di notifica nel settore delle norme e regolamentazioni tecniche - al fine di prevenire l'adozione di norme che possano creare ostacoli alla libera circolazione delle merci; Sentito il parere della Commissione per l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agrari e le sostanze di uso agrario - sottocommissione per i formaggi - di cui al decreto ministeriale 11 febbraio 1981 e successive modificazioni, alla quale con decreto ministeriale 19 dicembre 1992 è stato attribuito anche l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi del prodotto agricolo latte; Vista la legge 14 gennaio 1994, n. 20, contenente disposizioni in materia di giurisdizione e controllo della Corte dei conti; Decreta: Articolo unico 1. È approvato il metodo ufficiale di analisi relativo alla «Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel latte» descritto nell'allegato al presente decreto. 2. È fatto salvo il principio del mutuo riconoscimento in virtù del quale la qualità e l'autenticità del latte legalmente fabbricato e/o commercializzato in un altro Stato membro o Paese firmatario dell'accordo sullo S.E.E. e immesso sul mercato italiano possano altresì essere controllate tramite metodi di analisi alternativi che offrano garanzie equivalenti al metodo di cui al presente decreto. 3. Il presente decreto è inviato alla Corte dei conti per il controllo preventivo di legittimità ed entrerà in vigore il giorno successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana. Allegato Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel latte 1 - Scopo e campo di applicazione. Determinazione del tenore in acido lattico, come somma di acido D-lattico e L-lattico, nel latte crudo, pastorizzato e sterilizzato. 2 - Riferimenti. D.M. 26 marzo 1992 - Attuazione della decisione n. 91/180/CE - Allegato I - Metodi di campionamento. 3 - Principio. La determinazione enzimatica dell'acido Llattico e D-lattico viene eseguita sul latte, deproteinizzato e diluito opportunamente, utilizzando gli enzimi L-lattato deidrogenasi, D(-)-lattato deidrogenasi. In presenza di questi enzimi, gli ioni L-lattato e D(-)-lattato vengono ossidati a piruvato dal cofattore nicotinamide-adenin dinucleotide (NAD) che, a sua volta, si riduce a NADH. L-LDH o D-LDH lattato + NAD piruvato + NADH + H+ Poiché l'equilibrio di questa reazione è quasi completamente spostato dalla parte del lattato, si sottrae il piruvato per mezzo di una reazione catalizzata dall'enzima glutammato-piruvato transaminasi (GPT) in presenza di L-glutammato. piruvato + L-glutammato GPT L-alanina + α-chetoglutarato In tal modo, l'equilibrio viene spostato dalla parte del piruvato e del NADH. La quantità di NADH formatosi nella reazione, equivalente a quella di L-lattato e di D-lattato iniziali, viene dosata per via spettrofotometrica. 4 - Reattivi. 4.1 - Acqua bidistillata. 4.2 - Soluzione diluita di Carrez I. Sciogliere 3,60 g di ferrocianuro di potassio (K4[Fe(CN)6]-3 H2O) in 100 ml di acqua (4.1). 4.3 - Soluzione diluita di Carrez II. Sciogliere 7,20 g di solfato di zinco (ZnSO4-7 H2O) in 100 ml di acqua (4.1). 4.4 - Soluzione di idrossido di potassio 2 N circa. 4.5 - Soluzione Tampone (acido L-glutammico 0,1 M in tampone glicilglicina 0,6 M a pH10). Sciogliere in un pallone tarato da 50 ml, 3,96 g di glicilglicina e 0,73 g di acido L-glutammico con circa 40 ml di acqua (4.1), aggiungere 3,8 ml di soluzione di idrossido di sodio 10 M e portare a volume con acqua (4.1). La soluzione è stabile per almeno tre mesi se conservata in frigorifero. 4.6 - Soluzione NAD (nicotinamide 47 mM). Sciogliere 0,21 g di beta nicotinamide adenina dinucleotide monoidrato (beta NAD+) in 6 ml di acqua (4.1). La soluzione è stabile almeno un mese se conservata in frigorifero. 4.7 - Soluzione GPT (enzima glutammato-piruvato transaminasi). Centrifugare una sospensione commerciale dell'enzima (solitamente in ammonio solfato 3,2 M e con attività di circa 80 U/mg) a 4000 rpm per 10 minuti; prelevare il surnatante limpido e scartare il residuo. La soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero. 4.8 - Soluzione D-LDH (enzima D(-)-lattato deidrogenasi) da lactobacillus leichmannii. Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela glicerolo acqua, da 5 mg/ml e con attività specifica di circa 300 U/mg). La soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero. 4.9 - Soluzione L-LDH (enzima L-lattato deidrogenasi). Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela glicerolo-acqua, da 10 mg/ml e con attività specifica di circa 550 U/mg). La soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero. 4.10 - Soluzione Standard-D-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base alla esattezza della pesata). Pesare esattamente 42,6 mg circa di D(-)lattato di litio anidro oppure 49,7 mg circa di D-Lattato di sodio (titolo > 99%) e scioglierli in 100 ml di acqua (4.1). Prelevare 10 ml e diluirli a 100 ml. La soluzione corrisponde a circa 40 mg/l di acido D(-) lattico. Se si dispone di soluzioni già pronte, diluirle fino a ottenere una concentrazione finale nota di circa 40 mg/l. 4.11 - Soluzione Standard-L-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base alla esattezza della pesata). Pesare esattamente 42,6 mg circa di L-lattato di litio anidro oppure 49,7 mg circa di L-Lattato di sodio (titolo > 99%) e scioglierli in 100 ml di acqua (4.1). Prelevare 10 ml e diluirli a 100 ml. La soluzione corrisponde a circa 40 mg/l di acido L lattico. Se si dispone di soluzioni già pronte, diluirle fino a ottenere una concentrazione finale nota di circa 40 mg/l. 5 - Apparecchiatura. 5.1 - Provette graduate da 10 ml con tappo. 5.2 - Pipette con puntali monouso per volumi di 20, 100, 200, 500, 1000 microlitri. 5.3 - Spettrofotometro. 5.4 - Cuvette in quarzo o in plastica monouso con cammino ottico da 1 cm. 5.5 - Bacchette con estremità appiattite, tali da entrare nelle cuvette (5.4). 6 - Campionamento. Vedi punto 2. 7 - Procedimento. 7.1 - Preparazione del campione. 7.1.1 - Pesare 5 g di campione in una provetta da 10 ml (5.1). Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez I (4.2) e mescolare. Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez II (4.3), mescolare e neutralizzare con alcune gocce idrossido di potassio (4.4). Portare a volume con acqua (4.1). 7.1.2 - Filtrare. 7.2 - Determinazione. 7.2.1 - Preparare una serie di cuvette (5.4) e denominarle: B: cuvetta per la prova del bianco St: cuvetta per il controllo degli standard D-Lattico (4.10) e L-Lattico (4.11) C: cuvetta per la determinazione del campione. 7.2.2 - Con pipette (5.2), pipettare in tutte le cuvette, nell'ordine: 1,00 ml di soluzione Tampone (4.5); 0,20 ml di soluzione NAD (4.6); 0,02 ml della soluzione GPT (4.7). 7.2.3 - Con pipette (5.2), pipettare in: cuvetta B: - 1,00 ml di acqua (4.1) cuvetta St: - 0,50 ml di standard D-Lattico (4.10) e 0,50 ml di standard L-Lattico (4.11). cuvetta C: - 1,00 ml di campione filtrato (7.1.2) Mescolare con le bacchette (5.5) (una per cuvetta) e lasciar riposare per 5 minuti. 7.2.4 - Determinazione dell'acido D-Lattico. Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono denominati E1 e, abbinati alle rispettive cuvette, diventano: E1B l'estinzione iniziale del bianco per il D-Lattico E1St l'estinzione iniziale dello standard D-Lattico E1C l'estinzione iniziale del campione per il D-Lattico. 7.2.5 - Aggiungere nelle cuvette: 0,02 ml di soluzione D-LDH (4.8) Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti. 7.2.6 - Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono denominati E2 e, abbinati alle rispettive cuvette, diventano: E2B l'estinzione finale del bianco per il D-Lattico E2St l'estinzione finale dello standard D-Lattico E2C l'estinzione finale del campione per il D-lattico. 7.2.7 - Determinazione dell'acido L-Lattico. La determinazione, continua nelle stesse cuvette ancora contenenti le soluzioni della determinazione dell'acido D-lattico. Le estinzioni finali relative all'acido D-Lattico (7.2.6) costituiscono anche le estinzioni iniziali per l'acido L-Lattico. E2B l'estinzione iniziale del bianco per l'L-Lattico E2St l'estinzione iniziale dello standard L-Lattico E2C l'estinzione iniziale del campione per l'L-lattico. 7.2.8 - Aggiungere nelle cuvette: 0,02 ml di soluzione L-LDH (4.9) Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti. 7.2.9 - Misurare le estinzioni delle cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono denominati E3 e, abbinati alle rispettive cuvette, diventano: E3B l'estinzione finale del bianco per l'L-Lattico E3St l'estinzione finale dello standard L-Lattico E3C l'estinzione finale del campione per l'L-lattico). 8 - Espressione dei risultati. 8.1 - Calcolo La formula generale di calcolo è: C(in mg/l) = V*PM *∆E ε*d*v dove: V = volume finale del test (2,24 ml - per bianco, campione e standard D-Lattico, 2,26 per bianco, campione e standard L-Lattico) v = volume della soluzione analizzata (0,50 ml per gli standard, 1,00 ml per il campione e 1,00 ml per il bianco) PM = peso molecolare dell'acido lattico (90,1 sia nella forma L che nella forma D) d = spessore della cuvetta (1 cm) Î = coefficiente di estinzione molare a 340 nm del NADH pari a 6,3 DeltaECD = (E2C-E1C) = differenza estinzioni acido D-Lattico DeltaECL = (E3C-E2C) = differenza estinzioni acido L-Lattico DeltaEStD = (E2St-E1St) = differenza estinzioni standard D-Lattico DeltaEStL = (E3St- E2St) = differenza estinzioni standard L-Lattico DeltaEBD = (E2B-E1B) = differenza estinzioni bianco D-Lattico DeltaEBL = (E3B-E2B) = differenza estinzioni bianco L-Lattico. 8.2 - Verifica della validità del metodo - Prova di recupero. Si confronta il valore determinato delle soluzioni standard di acido D-Lattico e di acido L-Lattico con il valore teorico delle stesse. Il volume finale del test di controllo (V) è pari a 2,24 ml per l'acido D-Lattico e a 2,26 per l'acido L-Lattico; il volume di standard usato è pari a 0,5 ml. Sostituendo nella formula, si ottiene: Conc. Standard D-Lattico (mg/l) = 64,07 * (DeltaEStD-DeltaEBD) Conc. Standard L-Lattico (mg/l) = 64,64 * (DeltaEStL-DeltaEBL) I valori determinati degli standard devono corrispondere ai valori dichiarati iniziali con recupero pari almeno al 95%. 8.3 - Tenore di acido D-Lattico in mg/Kg di latte. Il volume finale del test è 2,24 ml e il volume di campione è pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella formula e facendo riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene: Conc. D-Lattico (mg/Kg) = 32,03 * (DeltaECD DeltaEBD) * 10/G 8.4 - Tenore in acido L-Lattico in mg/Kg di latte. Il volume finale del test è 2,26 ml e il volume di campione è pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella formula e facendo riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene: Conc. L-Lattico (mg/Kg) = 32,32 * (DeltaECL - DeltaEBL) * 10/G 8.5 - Il tenore finale di acido lattico in mg/Kg di latte (p.p.m.) è dato dalla somma delle concentrazioni del D-Lattico e del L-Lattico. Per la somma, devono essere prese in considerazione solo le concentrazioni superiori a 4 mg/Kg di latte. Determinazione acido lattico Tabella riassuntiva Bianco Standard Campione B ST C Aggiungere nelle cuvette ml ml ml Soluzione Tampone(4.5) 1,00 1,00 1,00 Soluzione NAD (4.6) 0.20 0,20 0,20 Soluzione GPT (4.7) 0,02 0,02 0,02 Acqua (4.1) 1,00 -- Standard D-Lattico(4.10) -- 0,50 Standard L-Lattico(4.11) -- 0,50 Campione filtrato (7.1.2) -- -- 1,00 Leggere le estinzioni E1B E1St E1C Soluzione D-LDH (4.8) 0,02 0,02 0,02 Leggere estinzioni E2B E2St E2C Soluzione L-LDH (4.9) 0,02 0,02 0,02 Leggere estinzioni E3B E3St E3C 9 - Osservazioni. 9.1 - La temperatura di lavoro ottimale deve essere compresa fra 20 e 25 gradi C. 9.2 - La quantità di acido lattico (D o L) non deve essere inferiore a 2 mg in cuvetta, corrispondente a 4 mg/kg nel campione operando come descritto. La quantità di 4 mg/kg pertanto diviene la quantità minima determinabile di acido lattico. 9.3 - La quantità di acido D-Lattico normalmente riscontrabile è inferiore a 4 mg/kg e pertanto il tenore di acido lattico totale nel campione in esame sarà dato dalla somma dei due enantiomeri solo quando la quantità di D-Lattico risulterà superiore a 4 mg/kg. In caso contrario, il tenore di acido lattico sarà dato dalla quantità del solo acido L-Lattico. 10 - Precisione del metodo. 10.1 - Su un latte con tenore di acido lattico pari a circa 10 mg/kg, sono state eseguite 15 determinazioni. Dalle valutazioni statistiche si è ricavato: Coefficiente di variazione (C.V.) = 10% Intervallo di confidenza (x ± 2 s) = x ± 2