Ministerial Decree approving the Methods for the analysis of feedstuffs - Supplement No. 10

Gv11rr., U111n-\lr rn11, R1rt·111111c, lr\11U DECRFTO 12 aprik l'J'J-t Appnnazionc dd <<\lctodi di anali,i per ii controllo uflkialc dcgli alimenti IK'r animali - Supplcmcnto n. 10». MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE. ALIMENTARI E FORESTALi ISPETTORATO CENTRALE REPRESSION[ FRODI IL M1,1s rrno DILi EI ''·"LE. IL Ml:\ISHRO DLLL\ SA:S:ITA I: IL Ml'ISHRO DfLL'l'Dl'STRI,\. Dfl. ('0\1\IFRCIO r DFIL".\RTI Gl\:\ .\TO Visto ii dem:to lcgislatirn 3 fcbbraio 1993, n. 29. conccrncntc normc per la razionaliaazionc dcll'organiz zazione dclle amministrazioni pubblichc c rcvisionc dclla disciplina in matcria di pubblico impiego, a norma dcll'art. 2 dclla legge 23 ottobre 1992, n. 421; Visti !'art. 43 dcl regio dccrcto-lcggc 15 oltobrc 1925, n. 2033, convcrtito nella lcggc 18 marzo 1926, n. 562, riguardantc la rcpressione dcllc frodi nclla prcparazionc c nel commcrcio di sostanze di uso agrario e di prodotti agrari. e !'art. I 08 <lei rcgolamcnto per l'csccuzione dcllo stcsso rcgio dccrcto-lcggc, appro\'ato con rcgio dccrcto I 0 luglio 1926, n. 1361, i quali prcscrivono chc le analisi occorrenti in applicazionc dclle normc contcnute ncl rcgio dccrcto-kggc e ncl regolamento di esccuzionc suddclli dovranno esscrc eseguite dai laboratori incaricati con i metodi di analisi prescrilti da questo Ministero, di concerto con ii Ministero delle linanzc, ii Ministcro della sanit.'1 ed ii Ministcro detrindustria. dcl commcrcio c dcll'artigianato: Vista la direttiva 93, 70, CEE dclla Commissione dcl 28 luglio 1993, pubblicata nella «Gaaclta U fficialc» de lie Comunita europee n. L 234 dcl 17 settembre 1993, chc tissa ii metodo di analisi per ii dosaggio dell'alofuginone negli alimenti per gli animali: Vista la dire1tiva 93,28/CEE della Commissione <lei 4 giugno 1993, pubblicata nclla «Gazzella Ufticialc» dcllc Comunita europee n. L 179 <lei 22 luglio 1993, che modifica l'allcgato I dclla terza direlliva 72/199/CEE relativamente al metodo per la determinazione delle proteine gregge negli alimenti per gli animali: Visto ii decreto ministerialc 9 novembre 1971, pubblicato nella Ga::.::.etta UJ/iciale della Repubblica italiana n. 308 <lei 6 dicembre 1971, con ii quale sono stati approvati i «Metodi ufficiali di analisi degli alimcnti per uso zootecnico», modificato ed integrato da ultimo con decreto ministerialc 22 luglio 1985 - Supplemento n. 8: Ritenuto neccssario adoltare le opportune disposizioni per conformare le norme nazionali a quclle dellc predette dircttivc comunitarie: 17 Scntito ii rarere della commissionc per l'agg.iornamrn to pcriodico dci metodi utlicia!i di analisi per i prndotti agrari e le sostan1e di uso agra1 io - - sollocommi,sion,: per i mangimi - di cui al d~crcto ministcriale 11 fcbhraio 1981, e successive modificazioni: Visto l'art. 2 della leggc 4 <liccmbre 1993. n. 491, che istituiscc ii Ministcro dclle risorsc agricolc. alimcntari c forestali: Dccrcta: Art. I. I. Sono approvati i «Melodi di analisi per ii controllo ufticialc dcgli alimenti per animali» dcscrilli ncl supplcmcnto n. 10. allcgato al prcscnte dccrcto. Art. 2. I. II mctodo «Determina1ionc dellc proteine greggc» descrillo nci «Mctodi ufficiali di analisi degli alimcnti per uso zootccnico - Supplemcnto n. 2» di cui al decrcto ministcrialc 18 luglio 1975, pubblicato nella Ga::.::.ella Uf/iciale dclla Rcpubblica italiana n. 214 dcl 12 agosto 1975, e sostituito dal corrispondente mctodo «Determina zionc <lcllc protcine grcggc» dcscritto nell'allcgato al prcsente dccrcto. Art. 3. I. II presentc dccreto cntra in vigore il giorno ~ucccssivo alla sua pubblicazione nclla Ga::.::.etta l ·'.fliciale dclla Repubblica italiana. 2. II prcscnte decrcto sara pubblicato ndb Ga::.::.ella Cf/iciale dclla Rcpubblica italiana. Roma. 12 aprile 1994 l 'ispettore ge11eralc capo per la repressiune de/le ji-odi GRIMALDI II clirellore centrale def dipartime11to de/le doga11c e delle imposte indirelle FAVALE II clirellorc generate dci scrri::.i 1·ctcri11ari MARAR[LLI II clirellorc generate della prvdu::.ione industriale AMMASSARI AI.U:G,\10 ~IETODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO UFFICIALE DEGLI ALIMENT! PER ANIMAL! - SUPPLEMENTO N. 10 Dctermina1ionc dcll'alofuginonc. Odcrmina,ione dellt: prokine gregge. 21-4-1994 GA,ZFITA. UtFICI\LE DUI.A RIPl'BHI l<A ITAi l.\l\A DETERMINAZIONE DELL'ALOf'UGINONE DL--trans-7 -bromo-6-doro-3-[3-{3-idrossi-2-piperidil) acetonil}-chinazolin-4-(3 H}-one bro midrato I. Scopo c campo d'applicuionc Ii me uxlo serw a detemun1re l'alofuginone nei mangimi. !l limite minimo di determmaz.ione i, di I mg/leg. 2. Principia Dopo ave, trallAlo ii campione con acqua cald.1, l'alofugmone vienc estratto come base libcra in &.cc wo di etile e succ:"5ivamente ripartito come cloridr&IO in aoluzionc acquosa acid&. L'cstraao viene purificaIO mediante cromatografia a IC4!Ilbio ionico. II !Cllon: di alofuginonc vicne detcnnioato mc diante cromatografia liquida ad alta riaoluzione (HPLC) su base inversa, usando un rivclatorc UV. 3. Reattivi 3.1. Aceronicrile per HPLC 3.2. Resina ami>erlite XAD-2 3.3. Acer.zto di ammonio 3.4. Acetaro di etile 3.5. Acido acetico glaciale 3.6. Alotuginone soswua standard (DL-uans-7 -bromo-6-cloro-3-{3-{3-idrossi-2-pipendil)acetonil}-china zolin-4--(3H}-one bromidrato, E 7-64) 3.6.1. Alofuginonc, soluzione madre standard. I 00 µg/ml Pesare con J'approssimazione di 0,1 mg 50 mg di alofuginone (3.6) in un pallonc padua10 da 500 ml. soogliere in soluzionc tampone di 1ce1ato ammonico (3.18). portatt a volume con soluzione iamponc ed agitare, Questa soluzionc i, stabilc pet tre settimane a + 5 • c, sc conserv:aa al buio. 3 .6.2; Soluzioni di rararura In una scric di palloni graduati da 100 ml craslerirc 1.0; 2.0; 3.0; 4,0 c 6,0 ml delb soluzionc madre standard (3.6.1~ Porare a volume con la lase mobiie (3.21) ed agiw-c.·Queste soluzioni hanno concen trazioni rispettivamenrr di 1,0; 2.0; 3,0; 4,0 c 6.0 µg/ml di alofuginonc. Queste soluzioni devono essere preparatt al momen10 dell'uso. 3.7 Acido cloridnco (p., ca. I ,I 6 g/ml~ 3.8. Metanolo 3.9 N itrato di argemo 3.10. Ascorbato di sodio 3.11. Carbonate di sodio 3 .12. Cloruro di sotiiu 3.i3. EDTA (acido etilendiammmotetncwcc, sale l.llSOdico) 3 i~. Acqu• pe, HPLC 3.15. .h)1uz1one di c,Ho,,11.lu ci, sod10 10 g/100 ml ; 16. Solu:1•Jne <li .art>onato d; 1odio ,arnra::a con cloruro di sod,o 5 g!l00 ml Sciogliere 50 g di carbonaro di s0d10 13.I 1\ in acoua. ponare a I I ed agt1unger~ cloruro di sod,o (3.12) itno a sacur2z,one. 3.! 7. :\c1dn dor.d:ico, circa (\l mol/l ?or.arc l O m! d, HCl (3. 7 ) con acq1,;a a I 3. i 6 Soluz,one ,amoonc d, aceraco d, .mmon,o. circa 0.25 mol/1 Scio~liere 1°.~ g di accraro di ammon,o (3.J\ e 30 ml d, ac,do aceuco :3.SJ ,n acoua ;3.i4l e ponare a I !. 18 21-4-1994 GALZHIA Urrll'IALL DUI.·\ Rt::l'L'lilH.IL\ hAI.IA~A <.;aic gcncralt' - n. 92 • 3.19. Prq,.ruionc dclla raina unbedire XAD-2 Sciacquare wi quantiwm> oppommo di amberlirc (.U) con acqua 6no a eliminazione c:ompleta di cuai gli ioni cloruro, eliminazsone che Yiene ~ eseguendo una prova al nima> di UJCDU> (3.20) sulla lue acquosa che c aaca mcssa cla pane. Sciacquare quindi la raina con SO ml di mecanolo (3.Bi eliminare ii metanolo e consenare la resina in metanolo fn:sco. 3.20. Soluzione di nitrato di ugmto, circa 0,1 mol/1 Sciogliere 0,17 g di niu-aw di argento (3.9) in 10 ml di acq11&. 3.21. Fae mooile per HPLC . Mescoiae 500 ml di aceam1aile (3.li 300 ml di soluzione campone di acetaUl ammonia, (3.18) e 1 200 ml di .cqua (3.14). ~ ii pH a 4.3 con acido acetico (3.5). hr paaarc la toluzione aan venro un filuo di 0.22 µm (4.8) e depssarla (ad es., soaoponmdola per IO minuti a uaaamenu, con ulttuuoni~ Qusta soluzione i, subile per un mese se conse1'/ata al buio in un conreni~ chiuso. 4. Appanccbiamre 4.1. Bagno ad uhnsuoni <1.2. Evaporare rotanre a film <1.4. Apparea:luanu-a per HPLC con nvelatore a ultravtoleai a lunghezza d'onda variabile oppure con rivc latott a serie di ciiocli <!.<I.I. Colonna per aomatopafia liquida. 300 mm x 4 mm, C 18, con riempimento da 10 µm o colonna equivalence 4S. Colonna di veuo (300 mm x 10 mm) provvma di filcro in veuo e di rubineao di arresto 4.6. Filtri in· fibra di vccro. dwnet:'O 150 mm 4.7. Film • membrana, 0,45 µm 4.8. Film a membm:a, 0.22 µm 5. Procedimenro No;a: L'alofugmone come base liMl:a < instabile in soh.u,one akalina e in soi'..!.l1one di ac<1.ato cii etile. Non deve rcstare m acetato di etile per oltre 30 minuti. ;. I. Generalici 5. ! . ; . Analizzarc oo campione dj mang,me in biaoco, per accer".are l'assenza dell'alofugmcne o di al.re sostanze cap.c, di snll!rierirc. 5 .12. Proceaere a una prova di recupero, anaii=ndo un carr:pione del mang,me in bianco nnforzaio con u,1a quanuca di aloiuginone simile a quella preseme nel campione. Per rinforzarc al iivello di 3 mg/leg, aggiungerc 300 ul della soluzione di riserva stand..rd (3.6.1) • IO g de! mang:me in biancc. mescolate e acundere IO minuo pnma di praceden, affes=one (52). Nata. Ai !ini de! prcsem, metodo. ii ma:igi.-ne in bianco deve avere una composizione simile a cuella ciel camp1cne. ed all'anaiis, !'alotugmone non deve nsulure present:. " .., Estra.z10nr Pesare 10 g dcl camo,one prepar-•w. con l"appross1maz1one di 0.01 g. ii' una proven.;, da ccnt.-iiug:a da 20:) ml. agpungere 0.5 g di ascori>ato sodico (3.10), 0.5 g d, EDTA (3.13) e 20 ml di acqua e agitarc. immergcre la provetu in hgncmar,a (80 •q per 5 m1nuc. Dopo aver fct:o raffreddare a temper:arura amb1eme. agg,ungcre 20 ml di soluzione di carbonaio di sodio (3.15} ed agicarc. Agglungcre immedia tamence I 00 ml di acetate di etile (3.4) ed agitare vtiroroumente a mane per I 5 secancli. lnuodurrc oumdi la provcru nel bagnc ultrasonico (4.1) per 3 m,nuo ed alien tare ii cappo. Cenrriiug:arc per 2 mmuti e deantarc la fase di· acetato calico. urraveno un fih:ro ,n fibra di veuo (4.6), in un imbuto separatore da 500 ml. Ripetere !"estraz1one de! camp,one con una secon.u porz1one di I 00 ml di accuto di etiic. Lavare gii estntti combmao. per un minute, con 50 ml di soluzione di arbonato di sociio saturau con cloruro di sod,o (J.! 6) ed elimmare lo scram acquoso. Estrarre lo strato or!?anico. pe, un minuto. con 50 ml di ac,do clondico (3. i 7). Raccogliere lo stra10 ac,do mienore m un ,mbuto separatore da ~O ml. R,estrarre lo str:ato organ,co per 1.5 mmuu con am, 50 ml di acido cloridnco e aggiungcre al pnmo esuano. Lavare ,!?ii estrato ac,di combinat, •!?,canuo oer IO second, con IO ml cii acetate cii etilc (:;.4). 19 21-4-1994 GAZZETTA UFFICIALE DELLA REPUBBLICA iTALI/\NA Serie generate - n. 92 Trasferin: quantiiativamcnte lo su:aro acquoso in un pallone da 250 ml ed climinare la faae orpa.ica. F:ir c:vaporve ruao l'acewo di etile rimancnce dalla 1ohmone acida mediante un c:vaponu,re rowuc a film (4.2~ La iemperatura de! begnpmaria non de'le supeive i 40 •c. Con un woro di cira 2S mbar wao I' aceiaro di etile resjduo vicne rimoao cnm> S minuti , 38 • C. S.3. Purifia.zione S.3.1. Prepanzione della colonna di amberlite Per ciucun estrall0 di campione vicne prq,anta una colonna XAD-2. Mediante metanolo (3.8) awe rire in una colonna di vcuo (4.5) 10 g di amberlitc prepama (3.19~ Aggiungere un piccolo tappo di Jana di vcuo alla 10mmi1a de! leao della rcsinL Drcnare ii metanolo dalll colonna e lavarc la n:sina con JOO ml d'acqua, fmnando ii f111S10 quando ii liquido raggiunge la 10mmi1a dcl lcuo clclla resin&. Far equiubrare la colonna per 10 minuti prima dell'uso. Eviwe comunquc cbe la colonna Ii cuicchi. 5.3.2. Purifia.zione dcl a.mpione Transfcrire quantitativamcnte l'cstraao (5.2) sulla sommiti della colonna di ambcrlite prcpama (5.3.1) ed eluire, scanando l'cluaro. D wso di eluizione non dcvc supeive 20 ml/min. Riprcndcre ii pallone con 20 ml di acido cloridrico (3.17) cd usare quc:st'ultimo liquido per lavue la colonna di rcsinL Eliminare cvcnruali rcsidui di 10luzione acida insufflando aria. Eliminare i liquidi di lavaggio . .Aggiungere 100 ml di me111nolo (3.8) alla colonna e lasciar eluire per S-10 minuti, raccoglicndo l'eluatO in un pallone da 250 ml. Lasciar equilibrare per 10 minuti ii metanolo rcsiduo con la rcsina e continuare l'eluizione con un fiusso non supcriore a 20 ml/min. raccoglicndo l'eluaro nello SteSSO pallone. Evaporve ii mctanolo sull' c:vaporarore rotante a film (4.2) ; la iemperatura del begnomaria non de'le supcnre i 40 •c. Trasfcrire quantitativamcnr.e ii n:siduo in un pallone gmduam da 10 ml usando la bx mobile (3.21~ Ponare a wlume con la fuc mobile ed agiwe. Far~ un'aliquota •~ an @mi a mcmbrma (4.7). Riscrvare qucsta soluzione. per la clcterminazione medianr.e HPLC (S.4~ S.4. Dctenninazione medianr.e HPLC S.4.1. Parameai I parametri qui riporuti 10no di rifcrimcnro. Possono cssere waavia utilimr.e aluc conciizioni aoma rograficbe in grado di dare risulwi equivalcnti. Colonna di aolnaIOgrafia liquid& (4.4.1) Fae mobile per HPLC (3.21) Velociia fiusso: 1.S - 2 ml/min. Lunghczza d'onda di rivelazione : 243 nm Volume inieaaro: 40 - 100· µ.I Vcrificare la stabiliti .de! sistema cromarografico inieuando parccchie wlte la 10luzione tirolau (3.6.2) contenente 3,0 µ.g/ml fino a ottenimenro di altezze di picco e tempi di ritenzione COSW1ti. S.4.2. Curva di wawra lniett2re ciascuna soluzione di iaratura (3.6.2) parccchie wlr.e e misurare le alr.ezze (aree) dei picchi per ciascuna conccnauione. Caicolare una curva di taratura riportando l'alcezza media dei picchi o UQ delle soluzioni di watura sulle ordinate e le corrispondenti concenauioni in µg/ml sulle ascisse. 5.43. Soluzione di campione lnieaare parecchie volte l'esaatto di cam?ione (5.3.2) usando lo scesso volume usato per le 10luzioni di tararura e determinare l'alte:u media (area) dei picchi di alofuginone. 6. Calcolo dei risultati Dall'alu:zza media (area) dei picchi di alofuginone della soluzione di cam?ione dedurre la concentra zione dclla soluzione di campione in µ.g/ml basandosi sulla curva di tararura (S.4.2~ II conienuto di alofuginone ..,. (mg/leg) del camp,one e dato dalla formula seguente : • C X 10 ... m dove: c . concentruione di aloiuginone dclla soluz,one di campionc in L1giml. m · massa della quanutii di sostan.:a cia anaii:.zare. in grammi. 20 21-4-1994 G.\11ui., U111( 1 \I I 1>11 L\ RU'l Bill IL\ I r.,11A~., Saic Rt'llcrale - n. 92 7. Coa-1ida d~ risulcati 7.1. ldentim L"idenr:ua dcil'analia puo csscre conlermau mediantc co-cromatografia oppure usando un rivelatore a scric di diodi in cui vengono confrontati gli !p<'mi dell' cstraao di campione e della soluzionc di tan nm (3.6.2) conien~tc 6.0 µ.g/ml. 7.1.1. Co-cromatcgrafia Un estraao di campione VJenc • nnforzato • mediant.te agg,uma di un quanutativo adeguato di solu zione di wuun (3.6..2~ II quanriw,vo di aiofugmonc aggtunto devc csscre anaiogo • quello srimaco di alofuginonc trDYatc ncll'..estraao di campione. Solo l'aitezza del picco di alofuginone dovrebbc ~sere aumentata aggiungendo un quanrir:ativo oppor runo dopo aver cenuco canto sia della quamiu di alofuginonc aggiunta chc della diluizione dcll'e straao. La ampiczza dcl picco, a meta della sua altc:ua massima. devc n~ntratt nel :: IO ¾ dcll'am piez:u originale. 7. I .2. Rivel&ZJone a serie di diodi I risultati sono valutati con i scguenti cmeri : a) le l=ghezze d'onda massime di assorbimenco dcgli spemi relativi al campione ed allo standard. reg,stntc all'apice dcl pie.co, devoo.o esscre le stcssc entro un marg,nc dctcrminato dal potcre d1 risoluzione del sisccma di rivelazione. Per la rivclazicne a scrie di diodi, csso si sirua tipicamcnte cncro :: 2 nm; b) en 225 c 300 run, gli spectri relatrn al campione ed allo stanriard reg,strat1 a!'."apce del p1cco cromatografico, non devono csscre diffcrcnti per le pani dcllo spcruo compr= era il 10 c ii l 00 ¾ · defl'assori:Mn~ !'dmff. Qacsto criccrio vicne rispcnaco quando sono prescnti gii stcss1 massimi e quando in n=un punto che V1ene osservaco la d=u,onc era i due spcari super-a il I 5 % dell'assorbanz.a dcll'analita standard; c) era 2:.5 c 300 nm, gli spcmi relatiVJ al campione, regisaati ncl trano ascendentc, all'ap,ce. nei = discendentc del p1cco cromacdgnfico, non devono =re diffcrenti ~r quelie paru dcllo spenro compresc en il IO cd il 100 ¾ dcll'assorbanza relaova. Questo cntcrio viene soddisfano quando sono presenci gli stessi massimi e quando in nessun punto che viene osserv2co la deviazione c.-. gh spea:n supera il I 5 % dell'assorb.n.ZJI di spcttto dell'ap,cc. Se uno di questi cmcri nor. VJene soddisfano, la pre,scnza del!'ar.aliu non e confermaca. 7 2. Ripctibiiici La diff.m:nza tn i risultati di d1.1t determmazioni parallel, effectuate sullo stcs.so camp,onc non deve supcrue 0.5 mg/kg per contenuu di aioiugrnonc fine ad un massimo di 3 mg!icg 7 .3 Recupero Po,r il ca.mpionc in biar,co rinfo,-.Alo il rccupcro devc csscrc di almeno 80 % . 8. Risulrari di uno srudio cffettua?o in cooperazione £ s1210 organ1:.:zato uno ,rudio in coopcruione (') in cu, tre ::amp1oni sono stati ,naliuaa da otro laboruon. Media(') s, C\'," rec. (1) uniU 1n m~iic& n ~. non nvclato Campione A (b1ar.co} a~pen1 nCt"YU[O n.d. Risuh:ati C.mpton~ B 1siannato) 2ppcna avoo nC'f'Y\JlO dut- mesi 2.80 ' . ' ,..,. 0.45 0.43 16 l S Sb 74 S,, oev11z1onr- nandard ddla nproauc10ii1t. C\', coeffic1cme- ci1 vanu:1onc :11/•) ~= rccuocro t•/o ). Cl nit Analut '.9SJ. lUfr,, !251-1250 21 Campion, C 1,pell~,1 appen1 ! dopo Oce"Y\110 d~ mcsi 2.89 2,.45 0,40 0.42 !4 . 8S 75 21-4-1994 G,111,11A U!F!(L\11 Ill!!.-\ R1:•r 1rn11L\ ln11\,.\ DETERMINAZlONE DELLE PROTEINE GREGGE l. 5<::opo c campo d'applicazionc II mc!Odo ocrmene di dete:minare :I cont<nu,o in ~rctc1n~ g,--.~-., de, mang,m1 • parTne dal conte· nuco m az~to. dosaw sernncio K,e!d2hl. 2. Principia II campionc vicne digcnto ,n acido soiforico in prcscnza di :m cacaliuatorc. La solUZJonc ac1da viene alolinizuia con un2 soluzione d'idrossido di so<iio. L·ammoniaca liberacasi vtcne isoi2ta per distilla uone e vicne raccoita in un2 quantili detcrminau di acido solforico, ii cui eccesso e moluo con una sohuionc standard d'idrossido di sodio. 3. R~ttivi 3.!. Sol faro di potassio 3.2.. Catalizzamre: ossido rame,co C.JO p.a.~ o solfato di ramc (IO pencau:irato. CuSO. · 5H,O 3.3. Zinco in pnelli 3.4. Acido solforico Pa - 1.84 g/ml 3S. Acido solforico 0,5 mol/1 3.6. Acido solforico 0, I moll! 3.7. lndicatore al rosso di metile: saogiiere mg 300 di rosso di mctilc in ml 100 di eunolo. al 95-96% (v/V) 3.8. Soluzionc d'idrossido di sodio (e possibiie usare auello di pure= tecnic2). 40 g/100 ml (m/v: 40%) 3.9. Soluziocc d'idrouido di sodio 3.10. Soluzione d'idrossido di sodio c 0,25 mol/1 0,1 molil 3.1 I. Pietra ::,omice in grandli. lavau con acido cJoridrico e c:ilanau 3.12. Aceunilide (P./F. - I 14 •c. N - 10,36 %) 3.13. Saccuosic (esentc da azoto) 4. Appuccchiarura Apparecchi di qiinerali=ionc. distillazione e molazione s«ondo d mecodo cil Kjeldahl 5. Mctodo di opcnarc 5. l. ,',! inerai,::.za::;iont P=re. con !'approssimaz1onc di 1 m~, I g del omp1one ~ ,naodur!o nel pallone dell'apparecch10 di mine!"'.Ji:czazione. Aggiungcre g 15 di solfam di potass10 (3.1). una quantica appropnata di acallzzatore (3.1) (da g 0,3 a g 0,4 di ossido rameico. oppure da g 0.9 a g l.l di solfaco di rame (In pcntaidraco1 ml 25 di acido solforico (3.4) e quaichc gr.anello di pietra pom1ce (3.11 ). Mcscolare. Riscaldare ii pallone pnma moderatameni:e, ag,cando di canto in canco. ie necessano. fino a c:arbonizzazione della massa cd a scorn~= dell.i schiwna; quindi piu intcnsamentc sino a ebollizione regolare de! liquido. II riscalda mento e adeguato se l'acido bollendo si condensa sulle parcti de! pallone. Evicare che le pareu si sum scaldino e che particelle crganiche vi adcriscano. Quando la solurione divenu limpida e di colore verde pallido prolungare l'ei>ollizione ancora per due ore. Lasciar quindi raifreddare. 5.2. Dis1iiia:,ont Aggiungerc con precauzionc un quanuuuvo d'acoua suif::1ente a sc1ogiiere compietamence , solfau. lasoar raffred~. .., ggiungere quincii quakhe granello di zinco (3.3). lnuodurre nel matracc:o collettorc delfapparecchio di disullazione mi 25 esan:amente m1surau di ac,do solfcnco (3.5) oppurc (3.6) a seconda de! con1enum di azow che s1 presume e quaiche gocc1a di ,ndiacore 21 rosso di metile (3.7). Collocare ii pallone al condensacore dell'apparccch10 di disullazione ed ,mmergere r~uem1ca di quest·ulumo per almeno cm 1 nel liquido de! macracc10 collen:ore (cfr. osserv:u1one 8.J). Versare lenca mcnce ncl i,allonc ml 100 di soluzaone di idrossico di sodio (3.8) senu perdica cii ammonaaca 1c:r. osscrvazione 8.1 ). Scal~re ii pallone fine • disnllaz,one completa Jelrammoniac~. ll. IJ2 Ci.vn.TT\ llf Fl<l.\i ! rn, 1, R: Pt BB' 1, " I, \11 ,', \ Saie grncrul,· - n. 92 5.3. :!"ito!a:r.io111 T,wlar-e nd matncao co!fettorc l'«:c=o di acico soifor;co p-u mezzo di •c,u sc:u:r.ionc di id.,.-.,ssido di sodio (.3.9) o (3.10~ sccourlo la <.:0nc-.entr.uion~ ddl'acirlo solfo:ico 1;ril.irzuo, sino a raggiungimemo del puntc finale. 5.4. fulJll ,n bianco P~ ·conat>llatt se I resttivi sono =nri da awro. effrttuare una prova ,n bianco (mineraliuarione, da.;til la:r.Jone e ucolu.ione) usando g 1 di sac=-osio (3.13) ,nvece del c.amp,onc. 6. Calcclo dei risultari Calcobrc il tcnorc di proteinc gre~ con ls formula segucntc : ('\/0 - V,) X C X 0.014 X 100 X 6.25 m dove: V, volume di NaOH (3.9 o 3.10) usato nclla prova in bianco V, volume (ml) di NaOH (3.9 o 3.10) usato nrlla riioluionc drl c.amp1one c concmauione (mol/1) di idross,do di sodio (3.9 o 3.10) m massa (g) del campione 7. Verifica de! metodo 7.1. Riptsibiliui La diffe-renz:a en, i risuhati di ciur detennina:r.ioni parallele cffeauau sullo steuo c.ampionc- non ~c oitrepassatt : 0.2 % in valorc assoluto, per contcnuti in prcteinr gre~ inieriore al 20 ¾ 1.0 •.t. sul nsulwo piu clevaa:,, contcnuti comprai in 20 e -40 ¾ 0,4 % in valott usoluto, per cont£nuti superiori al -40 "lo. Aaurasc=a Eseguire l'anaJisi (mineralizzazionc. distillaziooe t titoluione) su 1.5-2.0 g di acetanilide (3.12) in presenza di g 1 di sacarosio (3.13) : .g I di acetanilide amsllffl8 14.80 ml di ac:ido solforico (3.5). II recupero de"Ve essere di almeno il 99 •to. 8. Osscrvazjoni 8.1. Gli apparecchi possono esscrc oel tipo manualc, semiau comatico od automatico. Se un appatecchio richietlr un a:nasammto tn mineralizzuione e ciistilluion~. in qucsto caso ii tnvasamento deve esserc eftemiaw senza perdite. Se il pallone dell' apparccchio di distillazione non e provvisto di un imbuto sepantore, agg,unzere la soluz.ione d'idrossido di sodio immediacameme prima di collegare il pallone al rcfrigeramc, lasciando colare lentamente ii liquido lungo le parcn. 8.2. Se ii pro<iotto minerali=to si solidifica, ricommciare la derem,inazione usancio un quancicativo di ac,cio solfonco (3.4) superiore a quclio spec-ificaw in precedenza. 8.3. Per i prodotti pavcri cii sost:anze azotate, ii volume di acido soltonco (3 6) da 1nuodurre ne! mai:racc,o ouo essere rioono, sr necessario, a ml 10 o 15 e parum a ml 25 con acqua. 94A2601 L'i.,p,·ttore x,mnule capo per la reprnsione de/le frodi GRIMALDI 23