Presidential Order No. 225 on measures for controlling the spread on tomatoes and potatoes of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

F ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ ÔÇÓ ÅËËÇÍÉÊÇÓ ÄÇÌÏÊÑÁÔÉÁÓ ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ Áñ. Öýëëïõ 214 6 Ïêôùâñßïõ 2000 ÐÑÏÅÄÑÉÊÏ ÄÉÁÔÁÃÌÁ ÕÐ� ÁÑÉÈ. 255 ÌÝôñá ãéá ôïí Ýëåã÷ï ôïõ ðáèïãüíïõ âáêôçñßïõ ôùí ãå ùìÞëùí êáé ôçò íôïìÜôáò Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al óå óõììüñöùóç ðñïò ôçí Ïäçãßá 98/57/ÅÊ ôïõ Óõìâïõëßïõ. O ÐÑÏÅÄÑÏÓ ÔÇÓ ÅËËÇÍÉÊÇÓ ÄÇÌÏÊÑÁÔÉÁÓ ¸÷ïíôáò õðüøç: 1. Ôéò äéáôÜîåéò: á. ôïõ Üñèñïõ 4 ôïõ Í.2147/52 "ðåñß ðñïëÞøåùò êáé êá ôáóôïëÞò ôùí áóèåíåéþí êáé å÷èñþí ôùí öõôþí êáé ðåñß ïñãáíþóåùò ôçò öõôïðáèïëïãéêÞò Õðçñåóßáò" (ÖÅÊ/155/ô.Á/5-6-1952). â. ôïõ Ð.Ä. 332/ÖÅÊ 178/ô.Á/29-8-95 Üñèñïõ 19 "ÌÝôñá ðñïóôáóßáò êáôÜ ôçí åéóáãùãÞ óôç ÷þñá Þ ìÝóù áõôÞò óå Üëëï êñÜôïò ìÝëïò ôçò ÅõñùðáúêÞò ¸íùóçò ïñãáíé óìþí åðéâëáâþí ãéá ôá öõôÜ Þ ôá öõôéêÜ ðñïúüíôá êáé êá ôÜ ôçò åîÜðëùóÞò ôïõò óôï åóùôåñéêü ôçò, óå óõììüñ öùóç ðñïò ôçí ïäçãßá 77/93/ÅÏÊ ôïõ Óõìâïõëßïõ". ã. ôïõ Üñèñïõ 1 ðáñ. 1 êáé 3 ôïõ Í. 1338/83 "åöáñìïãÞ ôïõ Êïéíïôéêïý äéêáßïõ" (ÖÅÊ 34/ô.Á/3-3-83) üðùò ôñïðï ðïéÞèçêå áðü ôï Üñèñï 6 ôïõ Í.1440/84 "Óõììåôï÷Þ ôçò ÅëëÜäïò óôï ÊåöÜëáéï, óôá áðïèåìáôéêÜ êáé óôéò ðñï âëÝøåéò ôçò ÅõñùðáúêÞò Êïéíüôçôáò ¢íèñáêïò êáé ×Üëõ âïò êáé ôïõ Ïñãáíéóìïý Åöïäéáóìïý ÅÕÑÁÔÏÌ" (ÖÅÊ 70/ô.Á/21-5-1984). ã. Ôïõ Üñèñïõ 29Á ôïõ Í. 1558/1985 "ÊõâÝñíçóç êáé ÊõâåñíçôéêÜ ´Ïñãáíá" (Á137) üðùò ôï Üñèñï áõôü ðñï óôÝèçêå ìå ôï Üñèñï 27 ôïõ Í. 2081/1992 (Á 154) êáé á íôéêáôáóôÜèçêå áðü ôï Üñèñï 1 ðáñ. 2á ôïõ Í. 2469/1997 (Á 38) êáé ôïõ ãåãïíüôïò üôé áðü ôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñü íôïò Ð. äéáôÜãìáôïò ðñïêáëåßôáé äáðÜíç óå âÜñïò ôïõ Ðñïûðïëïãéóìïý ôïõ Íïìéêïý ðñïóþðïõ "Êåíôñéêü Ôá ìåßï Ãåùñãßáò, Êôçíïôñïößáò êáé Äáóþí (Ê.Ô.Ã.Ê. êáé Äá óþí)" ýøïõò 15.000.000 äñ÷. ðåñßðïõ ãéá ôï ôñÝ÷ïí Ïéêï íïìéêü Ýôïò êáé 30.000.000 äñ÷. ðåñßðïõ ãéá êáèÝíá áðü ôá åðüìåíá ïéêïíïìéêÜ Ýôç. Ãéá ôçí áíùôÝñù äáðÜíç Ý÷åé åããñáöåß ðßóôùóç óôïí Ðñïûðïëïãéóìü ôïõ Íïìéêïý áõ ôïý ðñïóþðïõ ýøïõò 15.000.000 äñá÷ìþí ìå ôá óôïé÷åßá öïñÝáò 110 êáé ÊÁÅ 5184. 2. Ôçí 353001/2000 (ÖÅÊ 556/2000) êïéíÞ áðüöáóç ôïõ Ðñùèõðïõñãïý êáé ôïõ Õðïõñãïý Ãåùñãßáò ãéá "ÁíÜèå óç áñìïäéïôÞôùí óôïõò Õöõðïõñãïýò Ãåùñãßáò ÅõÜã ãåëï Áñãýñç êáé Öþôç ×áôæçìé÷Üëç". 3. Ôçí õð' áñéè. 269/2000 Ãíùìïäüôçóç ôïõ Óõìâïõëß ïõ ôçò Åðéêñáôåßáò ìå ðñüôáóç ôïõ Õöõðïõñãïý ÅèíéêÞò Ïéêïíïìßáò êáé ôïõ Õöõðïõñãïý Ãåùñãßáò, áðïöáóßæïõ ìå: ¢ñèñï 1 (¢ñèñï 1 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ïñßæïõìå, óå óõììüñöùóç ðñïò ôçí ïäçãßá 98/57/ÅÊ ôçò 20çò Éïõëßïõ 1998 (Å.Å.L 235/21-8-98), ôçí åöáñìïãÞ ó' ïëüêëçñç ôç ×þñá ôùí ìÝôñùí êáôÜ ôïõ Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., ðáëáéüôåñá ãíù óôïý ùò Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (å öåîÞò êáëïýìåíï "ï ïñãáíéóìüò") óå ó÷Ýóç ìå ôïõò îåíé óôÝò ôïõ ïñãáíéóìïý ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï ðáñÜñôçìá É ôìÞìá 1 (åöåîÞò êáëïýìåíïé "êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëé êü"), ãéá: á) ôïí åíôïðéóìü ôïõ êáé ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò äéáóðï ñÜò ôïõ· â) ôçí ðñüëçøç ôçò åìöÜíéóçò êáé ôçò ìåôÜäïóÞò ôïõ· ã) óå ðåñßðôùóç äéáðßóôùóÞò ôïõ, ôçí ðñüëçøç ôçò ìå ôÜäïóçò êáé ôçí êáôáðïëÝìçóÞ ôïõ ìå óêïðü ôçí åîÜëåé øÞ ôïõ. ¢ñèñï 2 (¢ñèñï 2 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) 1. Ç Äéåýèõíóç Ðñïóôáóßáò ÖõôéêÞò ÐáñáãùãÞò ç ï ðïßá óôï åîÞò è' áðïêáëåßôáé áñìüäéá áñ÷Þ ðñáãìáôï ðïéåß åôÞóéåò óõóôçìáôéêÝò åðßóçìåò ìåëÝôåò ãéá ôïí ïñ ãáíéóìü óôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ ðñïÝñ÷åôáé áðü ôçí åðéêñÜôåéá ôçò ×þñáò. ÐñïêåéìÝíïõ íá ðñïóäéï ñéóôïýí ïé Üëëåò ðéèáíÝò åóôßåò ìüëõíóçò ðïõ áðåéëïýí ôçí ðáñáãùãÞ ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ç áñ ìüäéá áñ÷Þ ðñáãìáôïðïéåß áîéïëüãçóç ôïõ êéíäýíïõ êáé, åêôüò áðü ôçí ðåñßðôùóç êáôÜ ôçí ïðïßá ï ïñãáíéóìüò Ý ÷åé áíáãíùñéóôåß êáôÜ ôçí áîéïëüãçóç, äéåîÜãåé, óôéò ðå ñéï÷Ýò ðáñáãùãÞò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý, óôï÷ïèåôçìÝíåò åðßóçìåò ìåëÝôåò ãéá ôïí ïñãáíéóìü óå öõôÜ Üëëá áðü ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, óõìðåñé ëáìâáíïìÝíùí ôùí Üãñéùí îåíéóôþí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí, êáèþò êáé óôï åðéöáíåéáêü íåñü ðïõ ÷ñçóé ìïðïéåßôáé ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý êáé óôá õãñÜ áðüâëçôá ðïõ áðïññßðôï íôáé áðü åãêáôáóôÜóåéò âéïìç÷áíéêÞò ìåôáðïßçóçò Þ óõ óêåõáóßáò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý êáé ðïõ 3285 11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 01002140610000024 ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü ôïõ êáôá÷ù ñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý. Ç Ýêôáóç áõôþí ôùí óôï÷ïèå ôçìÝíùí ìåëåôþí êáèïñßæåôáé áíÜëïãá ìå ôïí äéáðéóôù ìÝíï êßíäõíï. Ç áñìüäéá áñ÷Þ ìðïñåß åðßóçò íá äéåîÜãåé åðßóçìåò ìåëÝôåò ãéá ôïí ïñãáíéóìü óå Üëëï õëéêü, üðùò õðüóôñùìá âëÜóôçóçò, ÷þìá êáé óôåñåÜ áðüâëçôá áðü åãêáôáóôÜóåéò âéïìç÷áíéêÞò ìåôáðïßçóçò Þ óõóêåõá óßáò. 2. Ïé åðßóçìåò ìåëÝôåò ðïõ ðñïâëÝðïíôáé óôçí ðáñÜ ãñáöï 1 äéåíåñãïýíôáé: á) ãéá ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, óýìöùíá ìå ôéò ëåðôïìÝñåéåò ðïõ ðñïâëÝðïíôáé óôï óçìåßï 1 ôïõ ôìÞìá ôïò ÉÉ ôïõ ðáñáñôÞìáôïò É· â) ãéá îåíéóôÝò Üëëïõò áðü ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õ ëéêü, êáé ãéá ôï íåñü, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí õãñþí áðïâëÞôùí, óýìöùíá ìå ôéò êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò êáé êáôÜ ðåñßðôùóç, ôá äåßãìáôá ëáìâÜíïíôáé êáé õðïâÜëëï íôáé óå åðßóçìç Þ õðü åðßóçìç åðïðôåßá åñãáóôçñéáêÞ äïêéìÞ· ã) êáôÜ ðåñßðôùóç ãéá Üëëï õëéêü, óýìöùíá ìå ôéò êá ôÜëëçëåò ìåèüäïõò. Ãéá ôéò ìåëÝôåò áõôÝò, ïé ðåñáéôÝñù ëåðôïìÝñåéåò ôùí äéáäéêáóéþí åðïðôåßáò êáé ï áñéèìüò, ç ðñïÝëåõóç, ç äéá óôñùìÜôùóç êáé ï ÷ñüíïò ëÞøçò ôùí äåéãìÜôùí, êáèïñß æïíôáé ìå áðüöáóç ôçò áñìüäéáò áñ÷Þò êáôÜ ôçí Ýííïéá ôïõ Ð.Ä. 332/29-8-95/178Á âÜóåé ïñèþí åðéóôçìïíéêþí êáé óôáôéóôéêþí áñ÷þí êáé ôçò âéïëïãßáò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáé ëáìâáíïìÝíïõ õðüøç ôïõ óõãêåêñéìÝíïõ óõóôÞìá ôïò ðáñáãùãÞò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, Üëëùí öõôþí îåíéóôþí. 3. Ïé ëåðôïìÝñåéåò êáé ôá áðïôåëÝóìáôá ôùí åðßóçìùí ìåëåôþí ðïõ ðñïâëÝðïíôáé óôçí ðáñÜãñáöï 1, ãíùóôï ðïéïýíôáé êÜèå ÷ñüíï óôéò áñìüäéåò áñ÷Ýò ôùí Üëëùí êñáôþí ìåëþí êáé ôçí ÅðéôñïðÞ óýìöùíá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ óçìåßïõ 2 ôïõ ôìÞìáôïò ÉÉ ðáñáñôÞìáôïò É. Ïé ãíù óôïðïéÞóåéò áõôÝò õðïâÜëëïíôáé Ýùò ôçí 1ç Éïõíßïõ, å êôüò áðü åêåßíåò ãéá ôï ðáôáôüóðïñï ðïõ äéáôçñåßôáé óôï áãñüêôçìá, ïé ïðïßåò õðïâÜëëïíôáé Ýùò ôçí 1ç Óå ðôåìâñßïõ. Ïé ëåðôïìÝñåéåò êáé ôá áðïôåëÝóìáôá üóïí á öïñÜ ôéò êáëëéÝñãåéåò áöïñïýí ôçí ðáñáãùãÞ ôïõ ðñïç ãïýìåíïõ Ýôïõò. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôùí ãíùóôïðïéÞóåùí áõôþí õðïâÜëëïíôáé óôçí åðéôñïðÞ. ¢ñèñï 3 (¢ñèñï 3 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ç áñìüäéá áñ÷Þ ìåñéìíÜ þóôå êÜèå ðéèáíïëïãïýìåíç åìöÜíéóç Þ äéáðéóôùìÝíç ðáñïõóßá ôïõ ïñãáíéóìïý óôç ×þñá íá áíáêïéíþíåôáé óôéò óõíáñìüäéåò Õðçñåóßåò ôçò ×þñáò. ¢ñèñï 4 (¢ñèñï 4 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) 1. Óå êÜèå ðåñßðôùóç ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò, ç áñìüäéá áñ÷Þ åîáóöáëßæåé ôç äéåîáãùãÞ åðßóçìçò Þ õðü åðßóçìç åðïðôåßá åñãáóôçñéáêÞò äïêéìÞò, åßôå, ãéá ôï êá ôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, ìå ôç ó÷åôéêÞ ìÝèïäï ôïõ ðá ñáñôÞìáôïò ÉÉ êáé óýìöùíá ìå ôïõò üñïõò ôïõ ðáñáñôÞ ìáôïò ÉÉÉ, óçìåßï 1, åßôå, óôéò Üëëåò ðåñéðôþóåéò, ìå ïðïéá äÞðïôå Üëëç åðéóÞìùò åãêåêñéìÝíç ìÝèïäï, ðñïêåéìÝíïõ íá åðéâåâáéùèåß Þ íá äéáøåõóèåß ç ðéèáíïëïãïýìåíç åì öÜíéóç. Óå ðåñßðôùóç åðéâåâáßùóçò, åöáñìüæïíôáé ïé á ðáéôÞóåéò ôïõ ðáñáñôÞìáôïò ÉÉÉ, óçìåßï 2. 2. ÌÝ÷ñéò üôïõ åðéâåâáéùèåß Þ äéáøåõóèåß ç ðéèáíïëï ãïýìåíç åìöÜíéóç óýìöùíá ìå ôçí ðáñÜãñáöï 1, óôéò ðåñéðôþóåéò ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò êáôÜ ôéò ï ðïßåò, åßôå: i) ðáñáôçñÞèçêáí äéáãíùóôéêÜ óõìðôþìáôá ôùí áóèå íåéþí ðïõ ðñïêáëïýíôáé áðü ôïí ïñãáíéóìü êáé åëÞöèç èåôéêü áðïôÝëåóìá áðü ôç äïêéìÞ ôá÷åßáò äéáëïãÞò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï ðáñÜñôçìá ÉÉ, ôìÞìá É, óçìåßï 1 êáé ôìÞ ìá ÉÉ, åßôå ii) åëÞöèç èåôéêü áðïôÝëåóìá áðü äïêéìÞ Þ äïêéìÝò äéá ëïãÞò, üðùò ïñßæåôáé óôï ðáñÜñôçìá ÉÉ, ôìÞìá É, óçìåßï 2 êáé ôìÞìá ÉÉÉ, á) áðáãïñåýåôáé ç äéáêßíçóç üëùí ôùí öõôþí êáé êïí äýëùí áðü üëåò ôéò êáëëéÝñãåéåò, ðáñôßäåò Þ áðïóôïëÝò áðü ôéò ïðïßåò Ý÷ïõí ëçöèåß ôá äåßãìáôá, åêôüò åÜí äéá êéíïýíôáé õðü ôïí Ýëåã÷ü ôïõò êáé ìå ôçí ðñïûðüèåóç ü ôé Ý÷åé äéáðéóôùèåß üôé äåí åíÝ÷ïõí åìöáíÞ êßíäõíï ìåôÜ äïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý· â) ëáìâÜíïíôáé ìÝôñá ðñïò åîáêñßâùóç ôçò ðñïÝëåõ óçò ôçò ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò· ã) ëáìâÜíïíôáé êáôÜëëçëá ðñüóèåôá ðñïëçðôéêÜ ìÝ ôñá, âÜóåé ôïõ åðéðÝäïõ ôïõ åêôéìþìåíïõ êéíäýíïõ, éäßùò óå ó÷Ýóç ìå ôçí ðáñáãùãÞ ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý êáé ôç äéáêßíçóç ðáñôßäùí ðáôáôüóðïñïõ äéáöï ñåôéêþí áðü åêåßíåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï óôïé÷åßï á êáé ðïõ ðáñÜãïíôáé óôïí ôüðï ðáñáãùãÞò áðü ôïí ïðïßï Ý ÷ïõí ëçöèåß ôá äåßãìáôá ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï óôïé÷åßï á, ãéá ôçí ðñüëçøç ôçò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý. 3. Óôéò ðåñéðôþóåéò ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò êáôÜ ôéò ïðïßåò õðÜñ÷åé êßíäõíïò ìüëõíóçò ôïõ êáôá÷ùñçìÝ íïõ öõôéêïý õëéêïý Þ ôïõ åðéöáíåéáêïý íåñïý áðü Þ óå Üëëï êñÜôïò ìÝëïò, ç áñìüäéá áñ÷Þ ãíùóôïðïéåß áìÝ óùò, áíÜëïãá ìå ôçí Ýêôáóç ôïõ êéíäýíïõ, ôéò ëåðôïìÝ ñåéåò ôçò ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò óôï Üëëï ïéêåßï êñÜôïò ìÝëïò êáé óõíåñãÜæåôáé êáôÜëëçëá. ÅÜí ç áñìü äéá áñ÷Þ ëÜâåé ó÷åôéêÞ ôÝôïéá ãíùóôïðïßçóç áðü Üëëï ÊñÜôïò ìÝëïò, ëáìâÜíåé ðñïëçðôéêÜ ìÝôñá óýìöùíá ìå ôçí ðáñÜãñáöï 2, óçìåßï ii óôïé÷åßï ã êáé, áíÜëïãá ìå ôçí ðåñßðôùóç, áíáëáìâÜíåé êÜèå ðåñáéôÝñù äñÜóç, óýì öùíá ìå ôéò ðáñáãñÜöïõò 1 êáé 2. ¢ñèñï 5 (¢ñèñï 5 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) 1. ÅÜí áðü ôçí åðßóçìç Þ õðü åðßóçìç åðïðôåßá åñãá óôçñéáêÞ äïêéìÞ, åßôå, ãéá ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, ìå ôç ó÷åôéêÞ ìÝèïäï ôïõ ðáñáñôÞìáôïò ÉÉ, åßôå, óôéò Üë ëåò ðåñéðôþóåéò, ìå Üëëç åðéóÞìùò åãêåêñéìÝíç ìÝèïäï, åðéâåâáéùèåß ç ðáñïõóßá ôïõ ïñãáíéóìïý óå äåßãìá ëç öèÝí óýìöùíá ìå ôï ðáñþí ÄéÜôáãìá, ç áñìüäéá áñ÷Þ á öïý ëÜâåé õðüøç ôéò ïñèÝò åðéóôçìïíéêÝò áñ÷Ýò, ôç âéï ëïãßá ôïõ ïñãáíéóìïý êáé ôï óõãêåêñéìÝíï óýóôçìá ðá ñáãùãÞò, åìðïñßáò êáé ìåôáðïßçóçò ôùí îåíéóôþí ôïõ ïñãáíéóìïý: á) ãéá ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü: i) äéåíåñãåß åëÝã÷ïõò ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôçò Ýêôá óçò êáé ôçò Þ ôùí ðñùôïãåíþí åóôéþí ìüëõíóçò óýìöù íá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñáñôÞìáôïò IV, êáé äéåíåñãåß ðñüóèåôåò äïêéìÝò óýìöùíá ìå ôï Üñèñï 4 ðáñÜãñáöïò 1, ôïõëÜ÷éóôïí óå üëá ôá êëùíéêþò ó÷åôéæüìåíá áðïèÝ ìáôá ðáôáôüóðïñïõ êáé ii) ÷áñáêôçñßæåé ùò ìïëõóìÝíï ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôé êü õëéêü, ôéò áðïóôïëÝò êáé /Þ ôéò ðáñôßäåò áðü ôéò ïðïßåò 3286 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) ëÞöèçêå ôï äåßãìá, êáèþò êáé ôá ìç÷áíÞìáôá, ôá ï÷Þìá ôá, ôïõò ðåñéÝêôåò, ôéò áðïèÞêåò Þ ôá ôìÞìáôá áõôþí êáé êÜèå Üëëï áíôéêåßìåíï, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí õëé êþí óõóêåõáóßáò ðïõ ÷ñçóéìïðïéÞèçêáí ãéá ôï êáôá÷ù ñçìÝíï öõôéêü õëéêü áðü ôï ïðïßï Ý÷åé ëçöèåß ôï äåßãìá· åðßóçò, ÷áñáêôçñßæåé ùò ìïëõóìÝíïõò, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôïõò áãñïýò, ôéò ìïíÜäåò ðñïóôáôåõüìåíçò öõôéêÞò ðá ñáãùãÞò êáé ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò áðü ôïõò ïðïßïõò óõãêïìßóôçêå ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü êáé Ý÷åé ëç öèåß ôï äåßãìá· ãéá ôá äåßãìáôá ðïõ ëÞöèçêáí êáôÜ ôç âëáóôéêÞ ðåñßïäï, ðñÝðåé íá ÷áñáêôçñßæïíôáé ùò ìïëõ óìÝíïé ïé áãñïß, ïé ôüðïé ðáñáãùãÞò êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ïé ìïíÜäåò ðñïóôáôåõüìåíçò öõôéêÞò ðáñáãùãÞò áðü ôéò ïðïßåò ëÞöèçêå ôï äåßãìá êáé iii) ðñïóäéïñßæåé, óýìöùíá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñáñ ôÞìáôïò V, óçìåßï 1, ôçí Ýêôáóç ôçò ðéèáíÞò ìüëõíóçò äéá åðáöÞò ðñéí Þ ìåôÜ ôçí óõãêïìéäÞ Þ ìÝóù ó÷Ýóçò ôçò äéáäéêáóßáò ðáñáãùãÞò, Üñäåõóçò Þ øåêáóìïý Þ ìÝóù êëùíéêÞò ó÷Ýóçò ìå ôç óõãêåêñéìÝíç ìüëõíóç êáé iv) ïñéïèåôåß ìßá æþíç âÜóåé ôïõ ÷áñáêôçñéóìïý ôçò ìü ëõíóçò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï óçìåßï ii, ôïõ ðñïóäéïñéóìïý ôçò Ýêôáóçò ôçò ðéèáíÞò ìüëõíóçò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï óçìåßï iii, êáé ôçò ðéèáíÞò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, óýìöùíá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ óçìåßïõ 2, óôïé÷åßï i ôïõ ðá ñáñôÞìáôïò V· â) ãéá êáëëéÝñãåéåò îåíéóôþí Üëëùí áðü åêåßíïõò ðïõ á íáöÝñïíôáé óôï óôïé÷åßï á êáôÜ ôéò ïðïßåò ç ðáñáãùãÞ ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý äéáôñÝ÷åé êßíäõíï: i) äéåíåñãåß åëÝã÷ïõò óýìöùíá ìå ôï óôïé÷åßï á, óçìåßï i êáé ii) ÷áñáêôçñßæåé ùò ìïëõóìÝíïõò ôïõò îåíéóôÝò ôïõ ïñ ãáíéóìïý áðü ôïõò ïðïßïõò Ý÷åé ëçöèåß ôï äåßãìá êáé iii) ðñïóäéïñßæåé ôçí Ýêôáóç ôçò ðéèáíÞò ìüëõíóçò êáé ïñéïèåôåß ìßá æþíç óýìöùíá ìå ôï åäÜöéï á, óçìåßá iii êáé iv áíôßóôïé÷á, óå ó÷Ýóç ìå ôçí ðáñáãùãÞ ôïõ êáôá÷ùñç ìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý· ã) ãéá ôï åðéöáíåéáêü íåñü (óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí áðïññßøåùí õãñþí áðïâëÞôùí áðü ÷þñïõò âéïìç÷áíé êÞò ìåôáðïßçóçò Þ óõóêåõáóßáò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõ ôéêïý õëéêïý) êáé ãéá ôá Üãñéá öõôÜ ôçò ïéêïãåíåßáò ôùí óïëáíùäþí, áðü ôá ïðïßá ç ðáñáãùãÞ ôïõ êáôá÷ùñçìÝ íïõ öõôéêïý õëéêïý äéáôñÝ÷åé êßíäõíï ìÝóù ôçò Üñäåõ óçò Þ ôïõ øåêáóìïý ìå ôá åðéöáíåéáêÜ ýäáôá Þ ëüãù ðëçììýñáò áðü ôï åðéöáíåéáêü íåñü: i) äéåíåñãåß åëÝã÷ïõò, óõìðåñéëáìâáíïìÝíçò ôçò åðß óçìçò ìåëÝôçò, óå êáôÜëëçëåò óôéãìÝò, äåéãìÜôùí áðü å ðéöáíåéáêü íåñü êáé, åöüóïí õðÜñ÷ïõí, áðü Üãñéá öõôÜ ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí ðñïêåéìÝíïõ íá ðñïó äéïñéóôåß Þ Ýêôáóç ôçò ìüëõíóçò êáé ii) ÷áñáêôçñßæåé ùò ìïëõóìÝíï ôï åðéöáíåéáêü íåñü áðü ôï ïðïßï Ý÷åé ëçöèåß ôï Þ ôá äåßãìáôá ëáìâÜíïíôáò õðü øç ôçí Ýêôáóç ôçò ìüëõíóçò êáé ôïõò åëÝã÷ïõò ðïõ äéå îÜãïíôáé óýìöùíá ìå ôï óçìåßï i êáé iii) ðñïóäéïñßæåé ôçí Ýêôáóç ôçò ðéèáíÞò ìüëõíóçò êáé ïñéïèåôåß ìéá æþíç âÜóåé ôïõ ÷áñáêôçñéóìïý ôçò ìüëõí óçò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï óçìåßï ii, êáé ôçò ðéèáíÞò äéÜäï óçò ôïõ ïñãáíéóìïý, ëáìâÜíïíôáò õðüøç ôéò äéáôÜîåéò ôïõ óçìåßïõ 1 êáé ôïõ óçìåßïõ 2, óôïé÷åßï ii ôïõ ðáñáñôÞ ìáôïò V. 2. Ç áñìüäéá áñ÷Þ ãíùóôïðïéåß áìÝóùò, óýìöùíá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñáñôÞìáôïò V, óçìåßï 3, óôéò áñìü äéåò áñ÷Ýò ôùí Üëëùí êñáôþí ìåëþí êáé ôçí ÅðéôñïðÞ êÜ èå ìüëõíóç ðïõ ðñïóäéïñßæåôáé âÜóåé ôçò ðáñáãñÜöïõ 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii êáé ôçò ðáñáãñÜöïõ 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï ii, êáèþò êáé ôéò ëåðôïìÝñåéåò ôçò ïñéïèÝôçóçò æþíçò âÜóåé ôçò ðáñáãñÜöïõ 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iv êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôçò ðáñáãñÜöïõ 1 óôïé÷åßï ã, óçìåßï i ii. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ãíùóôïðïßçóçò äõíÜìåé ôçò ðá ñïýóáò ðáñáãñÜöïõ õðïâÜëëïíôáé óôçí åðéôñïðÞ. Ôáõôü÷ñïíá, ç áñìüäéá áñ÷Þ õðïâÜëëåé óôçí åðéôñïðÞ ôçí ðñüóèåôç ãíùóôïðïßçóç ðïõ ðñïâëÝðåôáé óôï óç ìåßï 4 ôïõ ðáñáñôÞìáôïò V. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ãíù óôïðïßçóçò äõíÜìåé ôïõ ðáñüíôïò åäáößïõ õðïâÜëëï íôáé áìÝóùò óôá ìÝëç ôçò åðéôñïðÞò. 3. ÂÜóåé ôçò ãíùóôïðïßçóçò óýìöùíá ìå ôçí ðáñÜ ãñáöï 2 êáé ôùí ãíùóôïðïéçìÝíùí óôïé÷åßùí, ïé áñìü äéåò áñ÷Ýò ôùí Üëëùí êñáôþí ìåëþí ðïõ áíáöÝñïíôáé óôçí ãíùóôïðïßçóç äéåíåñãïýí Ýëåã÷ï óýìöùíá ìå ôçí ðáñÜãñáöï 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï i êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôçí ðáñÜãñáöï 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï i êáé áíáëáìâÜíïõí åíäå÷ïìÝíùò ðåñáéôÝñù äñÜóç, óýìöùíá ìå ôéò ðáñá ãñÜöïõò 1 êáé 2. ¢ñèñï 6 (¢ñèñï 6 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) 1. Ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ Ý÷åé ÷áñáêôçñé óôåß ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, äåí ìðïñåß íá öõôåýåôáé êáé ðñÝðåé, õðü ôïí Ýëåã÷ï êáé ôçí Ýãêñéóç ôçò áñìüäéáò áñ÷Þò, íá õ ðüêåéôáé óå ìéá áðü ôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñáñôÞìáôïò VI, óçìåßï 1 êáôÜ ôñüðï þóôå íá åîáóöáëßæåôáé üôé äåí õ ðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý. 2. Áðáãïñåýåôáé ç öýôåõóç ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôé êïý õëéêïý ðïõ Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß ùò ðéèáíþò ìïëõóìÝ íï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5, ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iii, êáé óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, óõìðåñéëáìâáíïìÝíïõ ôïõ êá ôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ãéá ôï ïðïßï Ý÷åé åíôïðéóôåß êßíäõíïò êáé ôï ïðïßï Ý÷åé ðáñá÷èåß óå ôüðïõò ðáñáãù ãÞò ðïõ Ý÷ïõí ÷áñáêôçñéóôåß ùò ðéèáíþò ìïëõóìÝíïé óýìöùíá ìå ôï Üñèñï 5, ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óç ìåßï iii, êáé ðñÝðåé õðü ôïí Ýëåã÷ï ôçò áñìüäéáò áñ÷Þò, íá ÷ñçóéìïðïéåßôáé Þ íá äéáôßèåôáé êáôáëëÞëùò, üðùò ïñßæå ôáé óôï ðáñÜñôçìá VI, óçìåßï 2, êáôÜ ôñüðï þóôå íá äéá óöáëßæåôáé üôé äåí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý. 3. Ôá ìç÷áíÞìáôá, ôá ï÷Þìáôá, ïé ðåñéÝêôåò, ïé áðïèÞ êåò Þ ôá ôìÞìáôá áõôþí, êáé êÜèå Üëëï áíôéêåßìåíï, óõ ìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí õëéêþí óõóêåõáóßáò, ðïõ Ý÷ïõí ÷áñáêôçñéóèåß ìïëõóìÝíá âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñá öïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii Þ ðïõ Ý÷ïõí ÷áñáêôçñéóèåß ùò ðéèáíþò ìïëõóìÝíá âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5, ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iii êáé óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, ðñÝðåé íá êáôáóôñÝöïíôáé Þ íá áðïëõìáßíïíôáé ìå êáôÜëëçëåò ìå èüäïõò üðùò ïñßæåôáé óôï ðáñÜñôçìá VI, óçìåßï 3. ÌåôÜ ôçí áðïëýìáíóç, ôá áíôéêåßìåíá áõôÜ ðáýïõí íá èåù ñïýíôáé ìïëõóìÝíá. 4. Ìå ôçí åðéöýëáîç ôùí ìÝôñùí ðïõ åöáñìüæïíôáé óýìöùíá ìå ôéò ðáñáãñÜöïõò 1, 2 êáé 3, ãéá ôç æþíç ðïõ ïñéïèåôåßôáé âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á óçìåßï iv êáé óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, åöáñìüæïíôáé ïñé óìÝíá ìÝôñá, üðùò êáèïñßæåôáé óôï ðáñÜñôçìá VI, óç ìåßá 4.1. êáé 4.2. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôùí ìÝôñùí áõôþí ãíù óôïðïéïýíôáé åôçóßùò óôá Üëëá êñÜôç ìÝëç êáé ôçí Åðé ôñïðÞ. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ãíùóôïðïßçóçò áõôÞò õðïâÜëëïíôáé óôçí åðéôñïðÞ. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3287 ¢ñèñï 7 (¢ñèñï 7 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ï ðáôáôüóðïñïò ðñÝðåé íá ðëçñåß ôéò áðáéôÞóåéò ôïõ Ð.Ä. 332 /29-8-1995 (178Á) êáé íá ðñïÝñ÷åôáé áðåõèåßáò áðü õëéêü ðáôÜôáò ôï ïðïßï ðáñÜãåôáé óôï ðëáßóéï åðé óÞìùò åãêåêñéìÝíïõ ðñïãñÜììáôïò êáé ôï ïðïßï Ý÷åé êñé èåß áðáëëáãìÝíï áðü ôïí ïñãáíéóìü ìåôÜ áðü åðßóçìç Þ õðü åðßóçìç åðïðôåßá äïêéìÞ ìå ôç ó÷åôéêÞ ìÝèïäï ôïõ ðáñáñôÞìáôïò ÉÉ. Ç ðñïáíáöåñüìåíç äïêéìÞ ðñáãìáôïðïéåßôáé: á) óôéò ðåñéðôþóåéò ðïõ Ý÷ïõí åðéâåâáéùèåß åõñÞìáôá ôïõ ïñãáíéóìïý óôçí ðáñáãùãÞ ðáôáôüóðïñïõ, i) ìå äïêéìÞ ôùí ðñïçãïõìÝíùí ãåíåþí, óõìðåñéëáìâá íïìÝíçò ôçò áñ÷éêÞò êëùíéêÞò åðéëïãÞò, êáé ìå óõóôçìá ôéêÞ äïêéìÞ ôùí âáóéêþí êëþíùí ðáôáôüóðïñïõ, Þ ii) óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò Ý÷åé áðïäåé÷èåß üôé äåí õðÜñ÷åé êëùíéêÞ ó÷Ýóç, ìå äïêéìÞ üëùí ôùí âáóéêþí êëþíùí ðáôáôüóðïñïõ Þ ðñïçãïýìåíùí ãåíåþí, óõìðå ñéëáìâáíïìÝíçò ôçò áñ÷éêÞò êëùíéêÞò åðéëïãÞò· â) óôéò ëïéðÝò ðåñéðôþóåéò, åßôå óå êÜèå öõôü ôçò áñ÷é êÞò êëùíéêÞò åðéëïãÞò, Þ óå áíôéðñïóùðåõôéêÜ äåßãìáôá ôïõ âáóéêïý ðáôáôüóðïñïõ Þ ôùí ðñïçãïõìÝíùí ãåíå þí. ¢ñèñï 8 (¢ñèñï 8 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Áðáãïñåýåôáé ç êáôï÷Þ êáé ç äéáêßíçóç ôïõ ïñãáíé óìïý. ¢ñèñï 9 (¢ñèñï 9 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ìå ôçí åðéöýëáîç ôùí äéáôÜîåùí ôïõ Ð.Ä. 332/29-8-95 (178Á), ç áñìüäéá áñ÷Þ åðéôñÝðåé ðáñåêêëßóåéò áðü ôá ìÝôñá ðïõ áíáöÝñïíôáé óôá Üñèñá 6 êáé 8 ôïõ ðáñüíôïò ÄéáôÜãìáôïò, óýìöùíá ìå ôéò äéáôÜîåéò ôïõ Ð.Ä. 141/22 5-98 (108Á) ãéá ðåéñáìáôéêïýò Þ åðéóôçìïíéêïýò óêï ðïýò, êáèþò êáé ãéá åñãáóßåò åðéëïãÞò ðïéêéëéþí. ¢ñèñï 10 (¢ñèñï 10 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ç áñìüäéá áñ÷Þ ëáìâÜíåé, üóïí áöïñÜ ôç ðáñáãùãÞ, ðñüóèåôá Þ áõóôçñüôåñá ìÝôñá ðïõ áðáéôïýíôáé ãéá ôçí êáôáðïëÝìçóç ôïõ ïñãáíéóìïý Þ ãéá ôçí ðñüëçøç ôçò ìåôÜäïóÞò ôïõ, õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé ôá ìÝôñá áõôÜ åßíáé óýìöùíá ìå ôï Ð.Ä. 332/29-8-95 (178Á). Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôùí ìÝôñùí áõôþí ãíùóôïðïéïýíôáé óôá Üëëá êñÜôç ìÝëç êáé ôçí ÅðéôñïðÞ. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ãíùóôïðïßçóçò áõôÞò õðïâÜëëïíôáé óôçí ÅðéôñïðÞ. ¢ñèñï 11 ÐáñáñôÞìáôá ÊáôùôÝñù ðáñáôßèåíôáé ôá ÐáñáñôÞìáôá É, ÉÉ, ÉÉÉ, IV, V, VI êáé VII ðïõ áðïôåëïýí áíáðüóðáóôï ìÝñïò ôïõ ðáñü íôïò êáé Ý÷ïõí ùò åîÞò: ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ É ÔÌÇÌÁ É ÊáôÜëïãïò îåíéóôþí ôïõ Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. üðùò ïñßæïíôáé óôï Üñèñï 1. ÖõôÜ, (óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí êïíäýëùí) åêôüò á ðü ôïí ðñáãìáôéêü óðüñï ôïõ Solanum tuberosum L. ðáôÜôá ÖõôÜ, åêôüò ôùí êáñðþí êáé ôùí óðüñùí ôïõ Lycoper sicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. ôïìÜôá ÔÌÇÌÁ ÉÉ ÌåëÝôåò 1. Ïé åðßóçìåò ìåëÝôåò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï Üñèñï 2 ðáñÜãñáöïò 2, óôïé÷åßï á), äéåîÜãïíôáé âÜóåé ôçò âéïëï ãßáò ôïõ ïñãáíéóìïý êáé ôùí óõãêåêñéìÝíùí óõóôçìÜôùí ðáñáãùãÞò êáé ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíïõí: i) üóïí áöïñÜ ôçí ðáôÜôá, óå êáôÜëëçëåò ðåñéüäïõò, ìáêñïóêïðéêÞ åðéèåþñçóç ôùí êáëëéåñãïýìåíùí öõôþí, Þ/êáé äåéãìáôïëçøßá áðü ôïõò óðüñïõò êáé Üëëåò ðáôÜôåò êáôÜ ôç âëáóôéêÞ ðå ñßïäï Þ óôçí áðïèÞêç. Ôá äåßãìáôá áõôÜ õðïâÜëëïíôáé óå åðßóçìï Þ õðü åðßóçìç åðïðôåßá ìáêñïóêïðéêü Ýëåã ÷ï êïììÝíùí êïíäýëùí, êáé óôçí ðåñßðôùóç ôïõ ðáôáôüóðïñïõ êáé, êáôÜ ðåñß ðôùóç, ãéá Üëëåò ðáôÜôåò, åðßóçìåò Þ õðü åðßóçìç åðï ðôåßá åñãáóôçñéáêÝò äïêéìÝò ìå ôç ìÝèïäï ôïõ ðáñáñ ôÞìáôïò ÉÉ, ii) üóïí áöïñÜ ôçí ôïìÜôá, ìáêñïóêïðéêÞ åðéèåþñçóç, óå êáôÜëëçëåò ðåñéü äïõò, ôïõëÜ÷éóôïí ôùí êáëëéåñãïýìåíùí öõôþí ðïõ ðñïïñßæïíôáé ãéá ìåôáöýôåõóç ãéá åðáããåëìáôéêÞ ÷ñÞ óç. 2. Ç ãíùóôïðïßçóç ôùí åðßóçìùí åðéèåùñÞóåùí ðïõ á íáöÝñïíôáé óôï Üñèñï 2, ðáñÜãñáöïò 3, ðñÝðåé íá ðåñé ëáìâÜíåé: i) óôçí ðåñßðôùóç ôùí åðéèåùñÞóåùí ãéá ôçí ðáôÜôá, ôçí åêôéìþìåíç óõíïëéêÞ êáëëéåñãïýìåíç Ýêôáóç, óå óôñÝììáôá, ðáôáôüóðïñïõ êáé Üëëçò ðáôÜôáò, ôç äéáóôñùìÜôùóç áíÜ êáôçãïñßá ðáôáôïóðüñïõ êáé ðáôÜôáò åìðïñßïõ, êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, áíÜ ðåñéï÷Þ, ôïí áñéèìü êáé ôï ÷ñüíï ëÞøçò ôùí äåéãìÜôùí, ôïí áñéèìü ìáêñïóêïðéêþí åëÝã÷ùí óôïí áãñü, ôïí áñéèìü (êáé ôï ìÝãåèïò ôïõ äåßãìáôïò) ôùí ìáêñï óêïðéêþí åëÝã÷ùí êïíäýëùí, ii) óôçí ðåñßðôùóç ôùí åðéèåùñÞóåùí, ôïõëÜ÷éóôïí, ãéá ôá êáëëéåñãïýìåíá öõôÜ ôïìÜôáò ðïõ ðñïïñßæïíôáé ãéá ìåôáöýôåõóç ãéá åðáããåëìáôéêÞ ÷ñÞóç, ôïí åêôéìþìåíï óõíïëéêü áñéèìü öõôþí, ôïí áñéèìü ôùí ìáêñïóêïðéêþí åëÝã÷ùí, iii) óôçí ðåñßðôùóç ôùí åðéèåùñÞóåùí ðïõ áöïñïýí îå íéóôÝò Üëëïõò áðü ôçí ðáôÜôá êáé ôçí ôïìÜôá, óõìðåñé ëáìâáíïìÝíùí ôùí Üãñéùí öõôþí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí, ôï åßäïò, ôïí áñéèìü êáé ôï ÷ñüíï ëÞøçò ôùí äåéãìÜôùí, ôçí ðåñéï÷Þ/ðïôÜìé äåéãìáôïëçøßáò, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôç ìÝèïäï áíÜëõóçò, iv) óôçí ðåñßðôùóç ôùí åðéèåùñÞóåùí ó÷åôéêÜ ìå ôï íå ñü êáé ôéò áðïññßøåéò õãñþí áðïâëÞôùí áðü åãêáôáóôÜ óåéò âéïìç÷áíéêÞò ìåôáðïßçóçò Þ óõóêåõáóßáò, ôïí áñéèìü êáé ôï ÷ñüíï ëÞøçò ôùí äåéãìÜôùí, ôçí ðåñéï÷Þ/ôï ðïôÜìé/ôçí ôïðïèåóßá ôùí åãêáôáóôÜ óåùí äåéãìáôïëçøßáò, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôç ìÝèïäï áíÜëõóçò. 3288 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ ÉÉ Ó×ÇÌÁ ÄÏÊÉÌÙÍ ÃÉÁ ÔÇ ÄÉÁÃÍÙÓÇ, ÔÇÍ ÁÍÉ×ÍÅÕÓÇ ÊÁÉ ÔÁÕÔÏÐÏÉÇÓÇ ÔÏÕ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. ÓÊÏÐÏÓ ÔÏÕ Ó×ÇÌÁÔÏÓ ÄÏÊÉÌÙÍ Óôï ðáñüí ó÷Þìá ðåñéãñÜöïíôáé ïé äéÜöïñåò äéáäéêá óßåò ãéá: i) ôç äéÜãíùóç ôçò êáóôáíÞò óÞøçò óå êïíäýëïõò ðá ôÜôáò êáé ôçò âáêôçñéáêÞò ìÜñáíóçò óå öõôÜ ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò, ii) ôçí áíß÷íåõóç ôïõ Ralstonia solanacearum óå äåßã ìáôá êïíäýëùí ðáôÜôáò, iii) ôçí áíáãíþñéóç ôïõ Ralstonia solanacearum. Óôá ðñïóáñôÞìáôá ðáñÝ÷ïíôáé ëåðôïìÝñåéåò ãéá ôçí ðáñáóêåõÞ ôùí ÷ñçóéìïðïéïõìÝíùí ãéá ôéò äïêéìÝò õëé êþí, äçëáäÞ èñåðôéêþí õðïóôñùìÜôùí, ñõèìéóôéêþí äéáëõìÜôùí, äéáëõìÜôùí, áíôéäñáóôçñßùí. ÐÅÑÉÅ×ÏÌÅÍÁ ÔÌÇÌÁ É: ÅöáñìïãÞ ôïõ ó÷Þìáôïò äïêéìþí 12 1. ÄéÜãíùóç ôçò êáóôáíÞò óÞøçò óå êïíäýëïõò ðá ôÜôáò êáé ôçò âáêôçñéáêÞò ìÜñáíóçò óå öõôÜ ðá ôÜôáò êáé ôïìÜôáò................................................... 12 2. Áíß÷íåõóç êáé ôáõôïðïßçóç ôïõ Ralstonia solanacearum óå äåßãìáôá êïíäýëùí ðáôÜôáò ..... 14 ÔÌÇÌÁ ÉÉ ÄéÜãíùóç ôçò êáóôáíÞò óÞøçò óå êïíäý ëïõò ðáôÜôáò êáé ôçò âáêôçñéáêÞò ìÜñáíóçò óå öõôÜ ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò ..................................... 17 1. Óõìðôþìáôá ............................................................. 17 2. ÄïêéìÞ/Ýò ôá÷åßáò äéáëïãÞò .................................... 17 3. Äéáäéêáóßá áðïìüíùóçò.......................................... 19 4. ÄïêéìÞ/Ýò åðéâåâáßùóçò .......................................... 20 ÔÌÇÌÁ ÉÉÉ: Áíß÷íåõóç êáé ôáõôïðïßçóç ôïõ Ralstonia solanacearum óå äåßãìáôá êïíäýëùí ðáôÜôáò ..... 24 1. Ðñïåôïéìáóßá ôïõ äåßãìáôïò ãéá ôç äïêéìÞ ............ 24 2. ÄïêéìÞ áíïóïöèïñéóìïý (ÉF)................................... 25 3. ÄïêéìÞ åíæõìáôéêÞò áíïóïááðïññüöçóçò (ÅLISA). 29 4. ÄïêéìÞ áëõóéäùôÞò áíôßäñáóçò ðïëõìåñÜóçò (PCRÔÌ) .................................................................... 30 5. ÄïêéìÞ åðéëåêôéêÞò áðïìüíùóçò åðß óôåñåïý õðï óôñþìáôïò.............................................................. 33 6. ÂéïäïêéìÞ ................................................................. 33 7. ÄïêéìÝò åìðëïõôéóìïý............................................. 34 8. ÄïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò................................................. 34 ÐñïóÜñôçìá 1: ÈñåðôéêÜ õëéêÜ ãéá ôçí áðïìüíùóç êáé êáëëéÝñãåéá ôïõ Ralstonia solanacearum ........ 35 ÐñïóÜñôçìá 2: ÕëéêÜ ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôïõ äåßã ìáôïò äïêéìÞò......................................................... 36 ÐñïóÜñôçìá 3: ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ ÉF ........................ 37 ÐñïóÜñôçìá 4: Ðñïóäéïñéóìüò ôïõ âáèìïý ìüëõí óçò óôç äïêéìÞ IF.................................................... 38 ÐñïóÜñôçìá 5: ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ ELISA ................. 39 ÐñïóÜñôçìá 6: ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ PCR .................... 40 ÐñïóÜñôçìá 7: ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ åðéëåêôéêÞò áðï ìüíùóçò åðß óôåñåïý èñåðôéêïý õðïóôñþìáôïò êáé äïêéìÝò åìðëïõôéóìïý ..................................... 40 Âéâëéïãñáößá................................................................ 41 ÔÌÇÌÁ É ÅÖÁÑÌÏÃÇ ÔÏÕ Ó×ÇÌÁÔÏÓ ÄÏÊÉÌÙÍ 1. ÄéÜãíùóç ôçò êáóôáíÞò óÞøçò óå êïíäýëïõò ðáôÜ ôáò êáé ôçò âáêôçñéáêÞò ìÜñáíóçò óå öõôÜ ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò Ç ðåñéãñáöüìåíç äéáäéêáóßá åîÝôáóçò ðñïïñßæåôáé ãéá êïíäýëïõò ðáôÜôáò ðïõ ðáñïõóéÜæïõí ôõðéêÜ óõìðôþ ìáôá Þ ãåííïýí õðüíïéåò ãéá ýðáñîç êáóôáíÞò óÞøçò êáé ãéá öõôÜ ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò ðïõ ðáñïõóéÜæïõí ôõðéêÜ óõìðôþìáôá Þ ãåííïýí õðüíïéåò ãéá ýðáñîç âáêôçñéá êÞò ìÜñáíóçò. Ç äéáäéêáóßá ðåñéëáìâÜíåé ìßá äïêéìÞ ôá ÷åßáò äéáëïãÞò, áðïìüíùóç ôïõ ðáèïãüíïõ áéôßïõ áðü ìïëõóìÝíï áããåéþäç éóôü óå äéáãíùóôéêÜ õëéêÜ êáé, óå ðåñßðôùóç èåôéêïý áðïôåëÝóìáôïò, áíáãíþñéóç ôçò êáëëéÝñãåéáò ùò Ralstonia solanacearum. ÄéÜãñáììá ñïÞò ôçò äéáäéêáóßáò ÐáñáðïìðÝò äéáãñÜììáôïò: (1) ÐåñéãñáöÞ ôùí óõìðôùìÜôùí äßäåôáé óôï ôìÞìá ÉÉ.1. (2) Ïé äïêéìÝò ôá÷åßáò äéáëïãÞò äéåõêïëýíïõí ôçí ðñï êáôáñêôéêÞ äéÜãíùóç. ÊáôÜëëçëåò äïêéìÝò åßíáé: ç äïêéìÞ åêêñßóåùí ôïõ áããåéþäïõò éóôïý ôïõ óôå ëÝ÷ïõò (ôìÞìá ÉÉ. 2), ç äïêéìÞ ãéá ðïëý -â-õäñïîõâïõôõñéêÜ êïêêßá (ôìÞ ìá ÉÉ.2), ç äïêéìÞ ÉF (ôìÞìá ÉÉÉ.2), ç äïêéìÞ ELISA (ôìÞìá ÉÉÉ.3), ç äïêéìÞ PCR (ôìÞìá ÉÉÉ. 4). (3) Áí êáé ç áðïìüíùóç ôïõ ðáèïãüíïõ áéôßïõ ìå ôç äéá äéêáóßá äéáäï÷éêþí áñáéþóåùí åðß óôåñåïý õðïóôñþìá ôïò áðü éóôïýò ìå ôõðéêÜ óõìðôþìáôá åßíáé Üìåóç, ç êáë ëéÝñãåéá ìðïñåß íá áðïôý÷åé áí âñéóêüìáóôå óå ðñïêå ÷ùñçìÝíá óôÜäéá ìïëýíóåùò. ÓáðñïöõôéêÜ âáêôÞñéá ðïõ áíáðôýóóïíôáé óå ðñïóâåâëçìÝíï éóôü ìðïñåß íá å ðéêáëýøïõí Þ íá åìðïäßóïõí ôçí áíÜðôõîç ôïõ ðáèïãü ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3289 ÖõôÜ ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò Þ êüíäõëïé ðáôÜôáò ìå óõ ìðôþìáôá (1) ÄïêéìÞ ôá÷åßáò äéáëïãÞò (2) ÁÐÏÌÏÍÙÓÇ Áðïéêßåò ìå ôõðéêÞ ìïñöïëïãßá ÍÁÉ ÍÁÉ Ï×É (3) Ï×É ÄÏÊÉÌÇ (-ÅÓ) ÅÐÉÂÅÂÁÉÙÓÇÓ Áíáãíþñéóç (4) êáèáñÞò êáëëéÝñ ãåéáò ùò Ralstonia solanacearum êáé äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (4) ÖõôÜ Þ êáé êüíäõëïé ìç ðñïóâåâëçìÝíïé áðü Ralstonia solanacearum ÖõôÜ Þ êáé êüíäõëïé ðñï óâåâëçìÝíïé áðü Ralstonia solanacearum t t t t t I + íïõ óôï õëéêü áðïìüíùóçò. ÅÜí ç äïêéìÞ áðïìüíùóçò åß íáé áñíçôéêÞ, áëëÜ õðÜñ÷ïõí ôá ôõðéêÜ óõìðôþìáôá ôçò áóèÝíåéáò, ôüôå ç äéáäéêáóßá áðïìüíùóçò ðñÝðåé íá å ðáíáëçöèåß, êáôÜ ðñïôßìçóç ìå åêëåêôéêÞ áðïìüíùóç å ðß óôåñåïý õðïóôñþìáôïò. (4) Áîéüðéóôç ôáõôïðïßçóç ìßáò êáèáñÞò êáëëéÝñãåéáò Ralstonia solanacearum åðéôõã÷Üíåôáé ìå ìßá ôïõëÜ÷é óôïí áðü ôéò äïêéìÝò ðïõ ðáñáôßèåíôáé óôï ôìÞìá ÉÉ.4.1. óå óõíäõáóìü ìå ìßá äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (ôìÞìá ÉÉ.4.3.). Ï ðñïóäéïñéóìüò ôïõ óôåëÝ÷ïõò åßíáé ðñïáéñåôéêüò, óõ íéóôÜôáé üìùò íá ãßíåôáé óå êÜèå íÝï ðåñéóôáôéêü. 2. Áíß÷íåõóç êáé ôáõôïðïßçóç ôïõ Rálstonia solanacearum óå äåßãìáôá êïíäýëùí ðáôÜôáò. Ç äéáäéêáóßá áðïóêïðåß óôçí áíß÷íåõóç ìïëýíóåùí óå ëáíèÜíïõóá ìïñöÞ óå êïíäýëïõò ðáôÜôáò ìå ìßá Þ, êáôÜ ðñïôßìçóç ðåñéóóüôåñåò äïêéìÝò äéáëïãÞò ïé ïðïßåò, å öüóïí åßíáé èåôéêÝò åðéâåâáéþíïíôáé ìå ôçí áðïìüíùóç ôïõ ðáèïãüíïõ ïñãáíéóìïý, áêïëïõèåß äå, óôçí ðåñß ðôùóç áðïìüíùóçò ôõðéêþí áðïéêéþí, ôáõôïðïßçóç ìéáò êáèáñÞò êáëëéÝñãåéáò ùò êáëëéÝñãåéáò Ralstonia solanacearum. ÄéÜãñáììá ñïÞò ôçò äéáäéêáóßáò ÐáñáðïìðÝò äéáãñÜììáôïò: (1) Ì Ý ã å è ï ò ä å ß ã ì á ô ï ò Ôï êáíïíéêü ìÝãåèïò äåßãìáôïò åßíáé 200 êüíäõëïé. Ç äïêéìáóßá üìùò ìðïñåß íá åöáñìïóèåß êáé ãéá äåßãìáôá ìéêñüôåñá ôùí 200 êïíäýëùí. (2) Ä ï ê é ì Þ (Ýò) á í ß ÷ í å õ ó ç ò Ãéá ôçí áíß÷íåõóç ôïõ Ralstonia solanacearum ìðïñåß íá ìçí áñêåß áðü ðëåõñÜò åõáéóèçóßáò Þ áîéïðéóôßáò ðñáãìáôïðïßçóç ìßáò ìüíïí äïêéìÞò óå Ýíá äåßãìá. Óõ íåðþò, óõíéóôÜôáé íá ðñáãìáôïðïéïýíôáé ðåñéóóüôåñåò áðü ìßá äïêéìÝò, ïé ïðïßåò èá ðñÝðåé íá âáóßæïíôáé êáôÜ ðñïôßìçóç óå äéáöïñåôéêÝò âéïëïãéêÝò áñ÷Ýò. (3) Ä ï ê é ì Þ á í ï ó ï ö è ï ñ é ó ì ï ý (IF) Ç äïêéìÞ áíïóïöèïñéóìïý åßíáé ìßá êáëÜ êáèéåñùìÝíç äïêéìÞ äéáëïãÞò. Ôï ãåãïíüò áõôü óõíéóôÜ ðëåïíÝêôçìá óå ó÷Ýóç ìå Üëëåò äïêéìÝò ðïõ äåí Ý÷ïõí áêüìç áíáðôõ ÷èåß ðëÞñùò Þ äåí Ý÷åé áêüìç åðéâåâáéùèåß ç åãêõñüôçôÜ ôïõò. Ç äïêéìÞ áõôÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ðïëëÜ Üëëá êá èïñéóìÝíá âáêôÞñéá, üðùò ôï Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.ÂÜóåé ôùí êáèïñéóìÝíùí ðáñáìÝ ôñùí áíÜãíùóçò ôçò ìåèüäïõ, áõôÞ åßíáé ìßá åõáßóèçôç äïêéìÞ {üñéï åõáéóèçóßáò 10 3 10 4 êýôôáñá áíÜ ml åê÷õ ëßóìáôïò éæÞìáôïò ðáôÜôáò}. Ç ðïéüôçôá ôïõ áíôéïñïý áðïôåëåß êñßóéìï ðáñÜãïíôá ãéá ôçí áîéïðéóôßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò äïêéìÞò. Áðï äåêôïß åßíáé ìüíïí áíôéïñïß ìå õøçëü ôßôëï (êáô' åëÜ÷é óôïí 2000 ãéá ôïí áñ÷éêü áíôéïñü), üëåò äå ïé äïêéìÝò ðñÝðåé íá ðñáãìáôïðïéïýíôáé ìå ôïí ôßôëï ôïõ áíôéïñïý Þ ìßá áñáßùóç êÜôù ôïõ ôßôëïõ. ÐñïôéìÜôáé ç Ýììåóç ìÝ èïäïò. Ç Üìåóç ìÝèïäïò ìðïñåß íá åöáñìïóôåß åÜí ôï å ðßðåäï åõáéóèçóßáò êáé åîåéäßêåõóçò ôçò äïêéìÞò åßíáé é óïäýíáìï ìå åêåßíï ôçò Ýììåóçò ìåèüäïõ. Ç äïêéìÞ IF Ý÷åé ôï ðëåïíÝêôçìá ôçò õðïêåéìåíéêÞò åñ ìçíåßáò ôçò ìïñöïëïãßáò ÷ñþóåùò ôùí êõôôÜñùí êáé ôçò Ýíôáóçò ôïõ öèïñéóìïý, ÷áñáêôçñéóôéêÜ ðïõ ðáñÝ÷ïõí óôïé÷åßá ó÷åôéêÜ ìå ôçí åîåéäßêåõóç ôçò áíôßäñáóçò. Á ðïôåëåß óýíçèåò öáéíüìåíï ç åìöÜíéóç åéäéêÞò èåôéêÞò á íôßäñáóçò (cross-reaction) ïñïëïãéêÜ ó÷åôéæïìÝíùí âá êôçñßùí, ðïõ ðñïÝñ÷ïíôáé áðü ôï Ýäáöïò Þ ó÷åôßæïíôáé ìå éóôïýò ðáôÜôáò êáé Ý÷ïõí ìïñöïëïãßá êõôôÜñùí åêåß íç ôïõ Ralstonia solanacearum. H äïêéìÞ IF ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò ç áðïêëåéóôéêÞ äïêéìÞ äéáëïãÞò, áí êáé óå ðåñéðôþóåéò õðïøßáò åêëåêôéêþí áíôéäñÜóåùí ìðïñåß íá ãßíåé ìéá åðéðñüóèåôç äïêéìÞ äéáëïãÞò ðïõ âá óßæåôáé óå äéáöïñåôéêÞ âéïëïãéêÞ áñ÷Þ. Ó' áõôÝò ôéò ðåñé ðôþóåéò ç ðéï êáôÜëëçëç äïêéìÞ åßíáé ç åêëåêôéêÞ áðïìü íùóç åðß óôåñåïý èñåðôéêïý õðïóôñþìáôïò. (4) Å ê ë å ê ô é ê Þ á ð ï ì ü í ù ó ç å ð ß ó ô å ñ å ï ý õ ð ï ó ô ñ þ ì á ô ï ò. Ìå ôï ôñïðïðïéçìÝíï õëéêü SMSA êáé ôç ìåèïäïëïãßá åîÝôáóçò ðïõ åîåéäéêåýåôáé ó' áõôÞ ôç ìÝèïäï, áõôÞ óõ íéóôÜ ìßá åõáßóèçôç êáé åêëåêôéêÞ äïêéìÞ ãéá ôï Ralstonia solanacearum. Ôï áðïôÝëåóìá ëáìâÜíåôáé 3-6 çìÝñåò ìåôÜ ôçí ðñïåôïéìáóßá ôïõ äåßãìáôïò. Ôï ðáèïãüíï ëáì âÜíåôáé áð åõèåßáò óôçí êáëëéÝñãåéá êáé ìðïñåß íá ôáõ ôïðïéçèåß åýêïëá. Ãéá ôçí ðëÞñç åêìåôÜëëåõóç ôùí äõ íáôïôÞôùí ôçò, ç äïêéìÞ áðáéôåß íá ãßíåôáé ðñïóåêôéêÞ ðñïåôïéìáóßá ôùí ôåìá÷ßùí éóôïý ëáìâáíïìÝíùí áðü ôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ ãéá ôçí áðïöõãÞ äåõ ôåñïãåíþí âáêôçñßùí ó÷åôéæïìÝíùí ìå ôïõò êïíäýëïõò ðáôÜôáò ðïõ åßíáé áíôáãùíéóôÝò ôïõ Ralstonia solanacearum óôï èñåðôéêü õðüóôñùìá êáé ìðïñïýí íá 3290ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) Äåßãìá êïíäýëùí ðáôÜôáò (1) ÄÏÊÉÌÅÓ ÄÉÁËÏÃÇÓ (2) ÄïêéìÞ IF (3) Þ/êáé åêëåêôéêÞ áðïìüíùóç åðß Ó.Õ. (4) ìå ðñïáé ñåôéêÝò åðéðñüóèåôåò äïêéìÝò: ÄïêéìÞ ELISA (5) ÄïêéìÞ PCR (6) ÄïêéìÞ (-Ýò) åìðëïõôéóìïý (7) ôïõëÜ÷éóôïí ìßá äïêéìÞ èåôéêÞ üëåò ïé äïêéìÝò áñíçôéêÝò Äåßãìá ìç ðñï óâåâëçìÝíï áðü Ralstonia solanacearum ÄÏÊÉÌÇ (-ÅÓ) ÁÐÏÌÏÍÙÓÇÓ ÅêëåêôéêÞ Þ/êáé âéïäïêéìÞ ( 8) áðï ìüíùóç åðß Ó.Õ. Áðïéêßåò ìå ôõðéêÞ ìïñöïëïãßá ÍÁÉ ÍÁÉ Ï×É Ï×É ÄÏÊÉÌÅÓ (-ÅÓ) ÅÐÉÂÅÂÁÉÙÓÇÓ Ôáõôïðïßçóç (9) ôçò êáëëéÝñãåé áò ùò Ralstonia solanacearum êáé äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (9) Äåßãìá ìç ðñïóâåâëç ìÝíï áðü Ralstonia solanacearum Äåßãìá ìç ðñïóâåâëç ìÝíï áðü Ralstonia solanacearum Äåßãìá ðñïóâåâëçìÝíï á ðü Ralstonia solanacearum k= åðçñåÜæïõí ôçí áíÜðôõîç ôïõ ðáèïãüíïõ ìéêñïïñãáíé óìïý. ÏñéóìÝíá âáêôçñéáêÜ óôåëÝ÷ç ìðïñåß íá áíáðôõ÷èïýí ðïëý ëßãï êáèþò ôá óõóôáôéêÜ ôïõ õðïóôñþìáôïò ìðïñåß íá åðçñåÜóïõí ôï ïñãáíéóìü-óôü÷ï. ×ñåéÜæåôáé åðßóçò ðñïóï÷Þ þóôå ôï Ralstonia solanacearum íá äéáöïñï ðïéåßôáé áðü ôõ÷üí Üëëá âáêôÞñéá ðïõ ìðïñåß íá áíáðôõ ÷èïýí óôï èñåðôéêü õðüóôñùìá. Ç åêëåêôéêÞ áðïìüíùóç ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò áðïêëåéóôéêÞ äïêéìÞ äéáëï ãÞò ìå ôçí ðñïûðüèåóç üôé óå ðåñßðôùóç ðïõ õðÜñ÷åé õ ðïøßá ðáñåìðüäéóçò ôçò áíÜðôõîçò ôïõ Ralstonia solanacearum áðü Üëëá âáêôÞñéá åðß ôùí ôñõâëßùí, êáé ðñïêýðôåé áñíçôéêü áðïôÝëåóìá, ôï äåßãìá åðáíåîåôÜæå ôáé ÷ñçóéìïðïéþíôáò äéáöïñåôéêÞ äïêéìÞ ãéá ôçí åðéêý ñùóç Þ áðüññéøç ôçò äéÜãíùóçò. Óôéò ðåñéðôþóåéò áõ ôÝò, ç äïêéìÞ IF åßíáé ç êáôáëëçëüôåñç. (5) Ä ï ê é ì Þ ELISA Ç äïêéìÞ ÅLISA åßíáé åí ãÝíåé ëéãüôåñï åõáßóèçôç áðü ôç äïêéìÞ IF (üñéï åõáéóèçóßáò 104-105 êýôôáñá áíÜ ml åê ÷õëßóìáôïò éæÞìáôïò ðáôÜôáò). Ç äïêéìÞ åßíáé öèçíÞ êáé ãñÞãïñç, åßíáé üìùò åí ãÝíåé ðéï åðéññåðÞò óôçí åìöÜíé óç åóöáëìÝíùí èåôéêþí (ìç åéäéêþí èåôéêþí áíôéäñÜóå ùí) áðïôåëåóìÜôùí êáé åóöáëìÝíùí áñíçôéêþí (ðáñå ìðüäéóç áðü öáéíïëéêÜ ìüñéá óôï åê÷ýëéóìá ðáôÜôáò) á ðïôåëåóìÜôùí. Ïé áðáéôÞóåéò áðü ðëåõñÜò åîåéäßêåõóçò ôïõ áíôéïñïý åßíáé åîáéñåôéêÜ ìåãÜëåò. Ç äïêéìÞ ÅLISA äåí ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò áðïêëåéóôéêÞ äïêéìÞ å îÝôáóçò. (6) Ä ï ê é ì Þ ÑCR (á ë õ ó é ä ù ô Þ á í ô ß ä ñ á ó ç ð ï ë õ ì å ñ Ü ó ç ò). Ç áíß÷íåõóç ìå PCR åßíáé ðïëý åõáßóèçôç. Áí êáé óå Ý íá äåßãìá åßíáé äõíáôüí íá áíé÷íåõèåß áêüìç êáé Ýíá ìå ìïíùìÝíï ìüñéï DNA, ç äïêéìÞ ðáñåìðïäßæåôáé åýêïëá áðü äéÜöïñá óõóôáôéêÜ ôïõ åê÷õëßóìáôïò ôïõ öõôïý Þ ôïõ êïíäýëïõ ðïõ ïäçãïýí óå åóöáëìÝíï áñíçôéêü áðï ôÝëåóìá. ÏñéóìÝíåò êáëëéåñãïýìåíåò ðïéêéëßåò ðáôÜôáò ðåñéÝ÷ïõí ðåñéóóüôåñïõò ðáñåìðïäéóôÝò áðü Üëëåò. ×ñåéÜæåôáé åðïìÝíùò ïé ðáñåìðïäéóôÝò áõôïß íá áðïìá êñýíïíôáé. Ç ðáñåìðüäéóç ìðïñåß íá ìåéùèåß ìå áñáßùóç áëëÜ Ýôóé áñáéþíïíôáé êáé ïé ðëçèõóìïß ôïõ Ralstonia solanacearum. Éäéáßôåñç ðñïóï÷Þ ðñÝðåé íá äßíåôáé óå ü ëá ôá óôÜäéá ðñïåôïéìáóßáò ôïõ äåßãìáôïò êáé ôçò äïêé ìÞò ãéá íá áðïêëåßåôáé ôõ÷üí ìüëõíóç ðïõ èá ìðïñïýóå íá ïäçãÞóåé óå åóöáëìÝíá èåôéêÜ áðïôåëÝóìáôá. Ãé' áõ ôü ç äïêéìÞ PCR äåí ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò ç áðï êëåéóôéêÞ äïêéìÞ åîÝôáóçò. (7) Ä ï ê é ì Þ å ì ð ë ï õ ô é ó ì ï ý ÅðùÜæïíôáò äåßãìáôá åê÷õëßóìáôïò éæÞìáôïò ðáôÜôáò óå Ýíá çìéåêëåêôéêü èñåðôéêü æùìü, üðùò ï ôñïðïðïéç ìÝíïò SMSA, ìðïñïýìå íá åðéôý÷ïõìå ôïí ðïëëáðëáóéá óìü ôïõ Ralstonia solanacearum. Ôï óçìáíôéêüôåñï ßóùò óôçí ðåñßðôùóç áõôÞ åßíáé üôé Ýôóé áñáéþíïíôáé êáé ïé åí äõíÜìåé ðáñåìðïäéóôÝò óôéò äïêéìÝò ELISA Þ PCR. Eôóé, ôï Ralstonia solanacearum óå åìðëïõôéóìÝíï æùìü ìðï ñåß íá áíé÷íåõèåß ìå ôéò ìåèüäïõò IF, ELISA êáé PCR. Óõ íéóôïýìå íá ìç ãßíåôáé Üìåóç áðïìüíùóç åðß óôåñåïý õ ðïóôñþìáôïò áðü ôïõò åìðëïõôéóìÝíïõò æùìïýò. Ïé ìÝ èïäïé áõôÝò åìðëïõôéóìïý äåí Ý÷ïõí äïêéìáóôåß åðéóôáìÝíùò. ÐåñéëáìâÜíïíôáé óôï ðáñüí ãéáôß Ý÷ïõí êáëÝò ðñïïðôéêÝò. Åíôïýôïéò, ëüãù ôçò ó÷åôéêÞò Ýëëåé øçò åìðåéñéþí, äåí ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ùò á ðïêëåéóôéêÝò ìÝèïäïé áíß÷íåõóçò. (8)  é ï ä ï ê é ì Þ Ç âéïäïêéìÞ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôçí áðïìüíùóç ôïõ Ralstonia solanacearum áðü éæÞìáôá åê÷õëéóìÜôùí ðáôÜ ôáò êáôüðéí åêëåêôéêïý åìðëïõôéóìïý óå Ýíá öõôü îåíé óôÞ êáé ìðïñåß íá ãßíåé óå öõôÜ ôïìÜôáò Þ ìåëéôæÜíáò. Ç äïêéìÞ áðáéôåß Üñéóôåò óõíèÞêåò åðùÜóåùò üðùò êáèï ñßæïíôáé óôç ìÝèïäï áõôÞ, êáôÜ ðÜóá ðéèáíüôçôá, ôõ÷üí âáêôÞñéá ðïõ äñïõí ðáñåìðïäéóôéêÜ Ýíáíôé ôïõ Ralstonia solanacearum óå SMSA äåí äñïõí ðáñåìâáôéêÜ óôç äï êéìÞ áõôÞ. (9) Ä ï ê é ì Þ (-Ýò) å ð é â å â á ß ù ó ç ò Áîéüðéóôç ôáõôïðïßçóç êáèáñÞò êáëëéÝñãåéáò Ralsto nia solanacearum åðéôõã÷Üíåôáé ìå ìßá ôïõëÜ÷éóôïí áðü ôéò äïêéìÝò ðïõ ðáñáôßèåíôáé óôï ôìÞìá ÉÉ.4.1 óå óõíäõá óìü ìå ìßá äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (ôìÞìá ÉÉ.4.3) Ï ÷áñáêôç ñéóìüò ôïõ óôåëÝ÷ïõò åßíáé ðñïáéñåôéêüò, áëëÜ óõóôÞíå ôáé ãéá êÜèå íÝá ðåñßðôùóç. . ÔÌÇÌÁ ÉÉ ÄÉÁÃÍÙÓÇ ÔÇÓ ÊÁÓÔÁÍÇÓ ÓÇØÇÓ ÓÅ ÊÏÍÄÕËÏÕÓ ÐÁÔÁÔÁÓ ÊÁÉ ÔÇÓ ÂÁÊÔÇÑÉÁÊÇÓ ÌÁÑÁÍÓÇÓ ÓÅ ÖÕ ÔÁ ÐÁÔÁÔÁÓ ÊÁÉ ÔÏÌÁÔÁÓ 1. Óõìðôþìáôá 1.1. Ó õ ì ð ô þ ì á ô á ó ô ç í ð á ô Ü ô á Óôï öõôü ôçò ðáôÜôáò: Óôï áñ÷éêü óôÜäéï ôçò áóèÝíåé áò åìöáíßæåôáé ìáñáóìüò ôùí öýëëùí ðñïò ôçí êïñõöÞ ôïõ öõôïý óå õøçëÝò èåñìïêñáóßåò êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò çìÝñáò ìå áíÜëçøç êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò íý÷ôáò. Óýíôï ìá ï ìáñáóìüò êáèßóôáôáé ìç áíáóôñÝøéìïò êáé ïäçãåß óôï èÜíáôï ôïõ öõôïý. Ï áããåéþäçò éóôüò óå åãêáñóßùò êïììÝíá óôåëÝ÷ç áðü ìáñáìÝíá öõôÜ ìðïñåß íá ãßíåé êá óôáíüò, áðü äå ôçí êïììÝíç åðéöÜíåéá åêñÝåé, Þ ìðïñåß íá åîÝëèåé åýêïëá óõìðéÝæïíôÜò ôçí, Ýíá ãáëáêôþäåò åîß äñùìá. ¼ôáí Ýíá êïììÝíï óôÝëå÷ïò ôïðïèåôçèåß êáôá êüñõöá ìÝóá óå íåñü, áðü ôéò áããåéþäåéò äÝóìåò åêñÝ ïõí êëùóôÝò ãëïéþäïõò õãñïý. Óôïí êüíäõëï ôçò ðáôÜôáò: Ïé êüíäõëïé ðñÝðåé íá êü âïíôáé åãêáñóßùò êïíôÜ óôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôï ëïíßïõ. Óôï áñ÷éêü óôÜäéï ôçò áóèÝíåéáò åìöáíßæåôáé Ý íáò õáëþäïõò üøåùò, êßôñéíïò ðñïò áíïéêôü êáóôáíü, ìåôá÷ñùìáôéóìüò ôïõ áããåéþäïõò äáêôõëßïõ áðü ôïí ï ðïßï åêñÝåé ôáõôü÷ñïíá ìåôÜ ëßãá ëåðôÜ Þ ìåôÜ áðü åëá öñÜ ðßåóç ìå ôïõò áíôß÷åéñåò óôï öëïéü êïíôÜ óôçí êïì ìÝíç åðéöÜíåéá, Ýíá õðüëåõêï åîßäñùìá. Áñãüôåñá, ï áã ãåéáêüò ìåôá÷ñùìáôéóìüò êáèßóôáôáé åíôïíüôåñá êáóôáíüò êáé ç íÝêñùóç ìðïñåß íá åðåêôáèåß óôïí ðá ñåã÷õìáôþäç éóôü. Óå ðñïêå÷ùñçìÝíá óôÜäéá ôçò áóèÝ íåéáò, ç ìüëõíóç åêäçëþíåôáé åîùôåñéêÜ áðü ôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ êáé ôïõò ïöèáëìïýò êáé åì öáíßæïíôáé óôçí åðéäåñìßäá åñõèñïêÜóôáíåò, åëáöñþò âáèïõëùìÝíåò êçëßäåò áðü ôéò ïðïßåò ìðïñåß íá åêñÝåé âáêôçñéáêü åîßäñùìá ðñïêáëþíôáò ôçí ðñïóêüëëçóç óùìáôéäßùí ôïõ åäÜöïõò. 1.2. Ó õ ì ð ô þ ì á ô á ó ô ç í ô ï ì Ü ô á Óôï öõôü ôçò ôïìÜôáò: Ôï ðñþôï ïñáôü óýìðôùìá åß íáé ç Ýëëåéøç óðáñãÞò óôá íåáñÜ öýëëá. Õðü ðåñéâáëëï íôéêÝò óõíèÞêåò ðïõ åßíáé åõíïúêÝò ãéá ôï ðáèïãüíï (èåñ ìïêñáóßá åäÜöïõò 250C, áôìüóöáéñá êïñåóìÝíç óå õ ãñáóßá), ìÝóá óå ëßãåò ìÝñåò åìöáíßæåôáé åðéíáóôßá êáé ìáñáóìüò ôçò ìéáò ðëåõñÜò Þ êáé ïëüêëçñïõ ôïõ öõôïý, óôç óõíÝ÷åéá äå ðëÞñçò êáôÜññåõóç ôïõ öõôïý. Óå ëéãü ôåñï åõíïúêÝò óõíèÞêåò (èåñìïêñáóßá åäÜöïõò êÜôù ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3291 ôùí 210C), áíáðôýóóåôáé ìåãÜëïò áñéèìüò ôõ÷áßùí ñéæþí åðß ôïõ óôåëÝ÷ïõò. Åíßïôå, êáôÜ ìÞêïò ôïõ óôåëÝ÷ïõò, åì öáíßæåôáé ëéðïåéäÝò íÞìá ðïõ áðïôåëåß Ýíäåéîç ôçò íÝ êñùóçò ôïõ áããåéáêïý óõóôÞìáôïò. Óå åãêÜñóéåò ôïìÝò ôïõ óôåëÝ÷ïõò, áðü ôïõò êáóôáíü÷ñùìá ìåôá÷ñùìáôé óìÝíïõò áããåéáêïýò éóôïýò åêñÝïõí óôáãüíåò ëåõêïý Þ õðïêßôñéíïõ âáêôçñéáêïý åîéäñþìáôïò. 2. ÄïêéìÝò ôá÷åßáò äéáëïãÞò Ïé äïêéìÝò ôá÷åßáò äéáëïãÞò äéåõêïëýíïõí ôçí ðñïêá ôáñêôéêÞ äéÜãíùóç. Ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ìßá Þ ðå ñéóóüôåñåò áðü ôéò áêüëïõèåò äïêéìÝò: ÄïêéìÞ åêêñßóåùí áðü ôï óôÝëå÷ïò Ç ðáñïõóßá ôïõ Ralstonia solanacearum óå ìáñáìÝíá óôåëÝ÷ç ðáôÜôáò ìðïñåß íá åêôéìçèåß ìå ôçí áêüëïõèç á ðëÞ ðñïêáôáñêôéêÞ äïêéìÞ: Êüâïõìå ôï óôÝëå÷ïò ðÜíù áêñéâþò áðü ôï Ýäáöïò. Ôïðïèåôïýìå ôçí êïììÝíç åðéöÜíåéá óå ðïôÞñé æÝóåùò ìå íåñü. Ëßãï ìåôÜ, áðü ôéò áããåéþäåéò äåóìßäåò áñ÷ßæåé íá ôñÝ÷åé ôáõôü÷ñïíá ìå ìïñöÞ êëùóôþí Ýíá âáêôçñéá êü ãëïéþäåò Ýêêñéìá. ÊáíÝíá áðü ôá âáêôÞñéá ðïõ ðñï êáëïýí áäñïâáêôçñßùóç óå öõôÜ ôçò ðáôÜôáò, äåí åì öáíßæåé ôï öáéíüìåíï áõôü. Áíß÷íåõóç ðïëý-â-õäñïîõâïõôõñéêþí (PHB) êïêêßùí Ôá êïêêßá PHB óôá êýôôáñá ôïõ Ralstonia solanacearum êáèßóôáíôáé ïñáôÜ äéá ÷ñþóåùò ìå Nile Blue A Þ ìå Sudan Black B. ÐáñáóêåõÜæïõìå åðß÷ñéóìá ôïõ åîéäñþìáôïò Þ ôïõ áé ùñÞìáôïò ôïõ éóôïý óå áíôéêåéìåíïöüñï ðëÜêá ìéêñï óêïðßïõ Þ åðß÷ñéóìá 48ùñçò êáëëéÝñãåéáò óå YPGA, Þ S PA (ðñïóÜñôçìá 1 ôìÞìá ÉÉÉ). ÐáñáóêåõÜæïõìå åðßóçò å ðé÷ñßóìáôá óôåëÝ÷ïõò âéïðïéêéëßáò 2, öõëÞò 3, ùò èåôéêïýò ìÜñôõñåò, êáé áí èåùñçèåß ÷ñÞóéìï Ýíá åðß÷ñé óìá åôåñïëüãïõ óôåëÝ÷ïõò, ùò áñíçôéêü ìÜñôõñá. ÁöÞíïõìå íá îçñáíèïýí. ÐåñíÜìå ìåñéêÝò öïñÝò ãñÞ ãïñá ôçí êÜôù ðëåõñÜ ôçò áíôéêåéìåíïöüñïõ ðëÜêáò ìÝ óá áðü öëüãá ìÝ÷ñé íá ðñïóçëùèåß ôï åðß÷ñéóìá. Ä ï ê é ì Þ N i l e B l u e 1. Ðåñéëïýæïõìå ôï ðñïóçëùìÝíï åðß÷ñéóìá ìå 1% õ äáôéêü äéÜëõìá Nile Blue A êáé ôï áöÞíïõìå ãéá åðþáóç åðß 10 ëåðôÜ óôïõò 550C. 2. Áðïóôñáããßæïõìå ôï äéÜëõìá ÷ñþóåùò, ðëÝíïõìå ôçí ðëÜêá ãéá ëßãï ðñïóåêôéêÜ ìå ñÝïí íåñü ôçò âñýóçò êáé áðïìáêñýíïõìå ôçí ðåñßóóåéá ôïõ íåñïý ìå áðïññï öçôéêü ÷áñôß. 3. Ðåñéëïýæïõìå ôï åðß÷ñéóìá ìå 8% õäáôéêü äéÜëõìá ï îéêïý ïîÝïò êáé ôï áöÞíïõìå ãéá åðþáóç åðß 1 ëåðôü óå èåñìïêñáóßá åñãáóôçñßïõ. 4. ÎåðëÝíïõìå åëáöñÜ ìå ñÝïí íåñü ôçò âñýóçò êáé ôï óôåãíþíïõìå ìå áðïññïöçôéêü ÷áñôß. 5. Îáíáñß÷íïõìå ìßá óôáãüíá íåñü êáé ôïðïèåôïýìå ìßá êáëõðôñßäá. 6. ÅîåôÜæïõìå ôï ÷ñùóìÝíï åðß÷ñéóìá óå ìéêñïóêüðéï åðéöèïñéóìïý óôá 450 nm ìå åëáéïêáôáäõôéêü öáêü óå ìåãÝèõíóç 1000x. Åöüóïí õðÜñ÷ïõí êïêêßá PHB áõôÜ öèïñßæïõí ìå ëá ìðñü ðïñôïêáëß ÷ñþìá. Ôá êïêêßá ðáñáôçñïýíôáé åðßóçò êáé óå êáíïíéêü öùò ãéá íá åëåã÷èåß áí åßíáé åíäïêõôôá ñéêÜ êáé áí ç êõôôáñéêÞ ìïñöïëïãßá åßíáé ç ôõðéêÞ ìïñ öïëïãßá ôïõ Ralstonia solanacearum. Ä ï ê é ì Þ S u d a n B l a c k. 1. Ðåñéëïýæïõìå ôï ðñïóçëùìÝíï åðß÷ñéóìá ìå äéÜëõ ìá 0,3% Sudan Black B óå 70% áéèáíüëç êáé ôï áöÞíïõ ìå ãéá åðþáóç åðß 10 ëåðôÜ óå èåñìïêñáóßá åñãáóôçñß ïõ. 2. Áðïóôñáããßæïõìå ôï äéÜëõìá ÷ñþóåùò, îåðëÝíïõìå ãéá ëßãï ìå íåñü ôçò âñýóçò êáé áðïìáêñýíïõìå ôçí ðå ñßóóåéá ôïõ íåñïý ìå áðïññïöçôéêü ÷áñôß. 3. Âõèßæïõìå ôï åðß÷ñéóìá ãéá ìéêñü ÷ñïíéêü äéÜóôçìá óå îõëüëç êáé ôï óôåãíþíïõìå ìå áðïññïöçôéêü ÷áñôß. Ðñïóï÷Þ! Ç îõëüëç åßíáé åðéâëáâÞò ãé' áõôü ðñÝðåé íá åñãáæüìáóôå óå áðáãùãü åóôßá. 4. Ðåñéëïýæïõìå ôï åðß÷ñéóìá ìå 0,5% (â/ï) õäáôéêü äéÜëõìá óáöñáíßíçò êáé ôï áöÞíïõìå ãéá 10 äåõôåñüëå ðôá óå èåñìïêñáóßá åñãáóôçñßïõ. Ðñïóï÷Þ! Ç óáöñáíßíç åßíáé åðéâëáâÞò, ãé' áõôü ðñÝðåé íá åñãáæüìáóôå óå áðáãùãü åóôßá. 5. ÎåðëÝíïõìå Þðéá ìå ñÝïí íåñü ôçò âñýóçò, óôåãíþ íïõìå ìå áðïññïöçôéêü ÷áñôß êáé ôïðïèåôïýìå ìßá êáëõ ðôñßäá. 6. ÅîåôÜæïõìå ôï ÷ñùóìÝíï åðß÷ñéóìá óå öùôïìéêñï óêüðéï ìå åëáéïêáôáäõôéêü öáêü êáé ìå êëßìáêá ìåãÝèõí óçò 1000 x. Ôá êïêêßá PHB óôá êýôôáñá ôïõ Ralstonia solanacearum åìöáíßæïíôáé ÷ñùóìÝíá ìðëå-ìáýñá. Ôï êõôôáñéêü ôïß÷ùìá åìöáíßæåôáé ìå ñïæ ÷ñþóç. ´Á ë ë å ò ä ï ê é ì Ý ò ¢ëëåò êáôÜëëçëåò äïêéìÝò äéáëïãÞò åßíáé ç äïêéìÞ IF (ôìÞìá ÉÉÉ.2), ç äïêéìÞ ELISA (ôìÞìá ÉÉÉ.3) êáé ç äïêéìÞ PCR (ôìÞìá ÉÉÉ 4). 3. Äéáäéêáóßá áðïìüíùóçò 3.1. ËáìâÜíåôáé åîßäñùìá Þ ôìÞìáôá ìåôá÷ñùìáôéóìÝ íïõ éóôïý áðü ôïí áããåéþäç äáêôýëéï ôïõ êïíäýëïõ ðá ôÜôáò Þ ôéò áããåéþäåéò äÝóìåò ôïõ óôåëÝ÷ïõò ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò. ÐáñáóêåõÜæåôáé áéþñçìá ôùí áíùôÝñù óå ìé êñü üãêï áðïóôåéñùìÝíïõ áðåóôáãìÝíïõ íåñïý Þ óå 50 mM öùóöïñéêïý ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò. Ôï áéþñçìá áöÞíåôáé ãéá 5-10 ëåðôÜ ðÜíù óôïí ðÜãêï. 3.2. ÐáñáóêåõÜæïíôáé óåéñÝò äåêáðëþí áñáéþóåùí ôïõ áéùñÞìáôïò ð.÷. 1/10 êáé 1/100 Þ ðåñéóóüôåñåò áí èå ùñçèåß áðáñáßôçôï. 3.3. ÓõãêåêñéìÝíç ðïóüôçôá ôïõ áéùñÞìáôïò êáé ôùí á ñáéþóåùí ìåôáöÝñåôáé óå ãåíéêÞò ÷ñÞóçò èñåðôéêü õðü óôñùìá (ÍÁ, YPGA êáé SPA, ôìÞìá ÉÉÉ ðñïóÜñôçìá 1) Þ/êáé óå õðüóôñùìá ôïõ Kelman ìå tetrazolium (ôìÞìá ÉÉÉ ðñïóÜñôçìá 1) Þ/êáé óå åêëåêôéêü õðüóôñùìá SMSA (ôìÞìá ÉÉÉ ðñïóÜñôçìá 7) êáé áðëþíåôáé Þ åîáðëþíåôáé ãñáììùôÜ ìå êáôÜëëçëç ôå÷íéêÞ áñáéþóåùò åðß ôïõ õðï óôñþìáôïò. Áí èåùñçèåß ÷ñÞóéìï, ðñïåôïéìÜæïíôáé îå ÷ùñéóôÜ ôñõâëßá áðü êÜèå õðüóôñùìá ìå áñáéùìÝíï áé þñçìá êáëëéÝñãåéáò ðáèïãüíïõ óôåëÝ÷ïõò Ralstonia solanacearum âéïðïéêéëßáò 2, öõëÞò 3 ðïõ ÷ñçóéìïðïéåß ôáé ùò èåôéêüò ìÜñôõñáò. 3.4. Ôá ôñõâëßá åðùÜæïíôáé 3 çìÝñåò óôïõò 280 C. Ç å ðþáóç ìðïñåß íá ðáñáôáèåß óôéò 6 çìÝñåò, áí ç áíÜðôõ îç åßíáé áñãÞ, áëëÜ ïé áðïéêßåò åðß SMSA óõ÷íÜ ãßíïíôáé ìç ôõðéêÝò êáé íåêñþíïíôáé. Óôá ãåíéêÞò ÷ñÞóåùò èñåðôéêÜ õðïóôñþìáôá ïé ðáèï ãüíåò áðïìïíþóåéò Ralstonia solanacearum áíáðôýó óïõí ìáñãáñéôþäïõò ÷ñïéÜò ëåõêÝò, åðßðåäåò, áêáíüíé óôåò êáé ñåõóôþäåéò áðïéêßåò ðïõ åìöáíßæïõí óõ÷íÜ ÷á ñáêôçñéóôéêÝò óðåßñåò. Óå õðüóôñùìá Kelman ìå tetrazolium, ôõðéêÝò áðïéêßåò ðáèïãüíùí áðïìïíþóåùí ôïõ Ralstonia solanacearum åßíáé êñåìþäåéò, åðßðåäåò, ìå áêáíüíéóôï ðåñéèþñéï êáé õäáñåßò ìå áéìáôÝñõèñåò åëéêþóåéò óôï êÝíôñï. Ìç ðá 3292 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) èïãüíåò áðïìïíþóåéò ôïõ Ralstonia solanacearum áíá ðôýóóïõí âïõôõñþäåéò Ýíôïíá åñõèñÝò áðïéêßåò. Óôï SMSA, ôõðéêÝò áðïéêßåò ðáèïãüíùí áðïìïíþóåùí ôïõ Ralstonia solanacearum áíáðôýóóïõí ãáëáêôþäïõò ÷ñïéÜò ëåõêÝò, åðßðåäåò, áêáíüíéóôåò óôï ðåñéèþñéï êáé ñåõóôþäåéò áðïéêßåò ìå áéìáôÝñõèñá êÝíôñá. Ïé ìç ðáèïãüíåò ìïñöÝò Ralstonia solanacearum áíá ðôýóóïõí ëéãüôåñï ñåõóôþäåéò áðïéêßåò, ïé ïðïßåò óôï SMSA åìöáíßæïíôáé ôåëåßùò ñïæ ðñïò åñõèñÝò. 3.5. Ïé áðïéêßåò ìå ÷áñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá êáèïñß æïíôáé ìå åê íÝïõ êáëëéÝñãåéá óå ãåíéêÞò ÷ñÞóåùò èñå ðôéêü õðüóôñùìá. ÐñÝðåé íá áðïöåýãïíôáé åðáíåéëçì ìÝíåò åê íÝïõ êáëëéÝñãåéåò ãéáôß áõôü ìðïñåß íá ïäçãÞ óåé óå ìåßùóç ôçò ðáèïãÝíåéáò. 4. ÄïêéìÞ (-Ýò) åðéâåâáßùóçò 4.1. Ôáõôïðïßçóç ôïõ Ralstonia solanacearum Ç ôáõôïðïßçóç êáèáñþí êáëëéåñãåéþí ôïõ Ralstonia solanacearum ãßíåôáé ìå ìßá áðü ôéò áêüëïõèåò äéáäéêá óßåò: È ñ å ð ô é ê Ý ò ê á é å í æ õ ì á ô é ê Ý ò ä ï ê é ì Ý ò Óçìåßùóç:Íá ðåñéëáìâÜíïíôáé êáôÜëëçëá óôåëÝ÷ç ùò ìÜñôõñåò óå êÜèå äïêéìÞ. Ôï Ralstonia solanacearum ðáñïõóéÜæåé Þ ü÷é åí ãÝíåé ôéò áêüëïõèåò öáéíïôõðéêÝò éäéüôçôåò: Öèïñßæïõóá ÷ñùóôéêÞ ¸ãêëåéóôá PHB + ÄïêéìÞ ïîåßäùóçò/æýìùóçò (O/F) Ï+/F ÊáôáëÜóç + ÏîåéäÜóç Kovac's + AíáãùãÞ íéôñéêþí + ×ñçóéìïðïßçóç êéôñéêþí + ÁíÜðôõîç óå 400C ÁíÜðôõîç óå 1% ÍaCl + ÁíÜðôõîç óå 2% NaCl ÄéõäñïëÜóç áñãéíßíçò Ñåõóôïðïßçóç æåëáôßíçò Õäñüëõóç áìýëïõ Õäñüëõóç áéóêïõëßíçò ÐáñáãùãÞ levan ÕëéêÜ êáé ìÝèïäïé ðáñÝ÷ïíôáé óôçí åñãáóßá ôùí Lelliott êáé Stead (1987). Ä ï ê é ì Þ IF ÐáñáóêåõÜæïõìå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá èåôéêü ìÜñôõñá. ÐáñáóêåõÜæïõ ìå åðßóçò ìßá óåéñÜ áñáéþóåùí ôïõ áíôéïñïý óôï äéðëÜ óéï. Åöáñìüæïõìå ôç äéáäéêáóßá IF (ôìÞìá ÉÉÉ.2). Ï ôßôëïò IF ôçò êáëëéÝñãåéáò ðñÝðåé íá åßíáé éóïäýíáìïò ìå åêåßíïí ôïõ èåôéêïý ìÜñôõñá. Ä ï ê é ì Þ E L I S A ÐáñáóêåõÜæïõìå áéþñçìá >106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá èåôéêü ìÜñôõñá. Åöáñìüæïõìå ôç äéáäéêáóßá ELISA (ôìÞìá ÉÉÉ.3). Ï ôßôëïò ELISA ôçò êáë ëéÝñãåéáò ðñÝðåé íá åßíáé éóïäýíáìïò ìå åêåßíïí ôïõ èåôé êïý ìÜñôõñá. Ä ï ê é ì Þ PCR ÐáñáóêåõÜæïõìå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá èåôéêü ìÜñôõñá. Åöáñìüæïõìå ôç äéáäéêáóßá PCR - (ôìÞìá ÉÉÉ.4) Ôï ðñïúüí PCR ôçò êáë ëéÝñãåéáò ðñÝðåé íá Ý÷åé ôï ßäéï ìÝãåèïò êáé ìïñöÞ RÅÁ ìå åêåßíá ôïõ èåôéêïý ìÜñôõñá. Ö è ï ñ ß æ ù í i n s i t u õ â ñ é ä é ó ì ü ò (F I S H) ÐáñáóêåõÜæïõìå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí ml áðü ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá èåôéêü ìÜñôõñá. Åöáñìüæïõìå ôç äéáäéêáóßá FISH (van Beuningen et al., 1995) ÷ñçóéìïðïé þíôáò ôïí åêêéíçôÞ (primer) PCR OLI-1 (Seal et al., 1993) Ç êáëëéÝñãåéá ðñÝðåé íá åìöáíßæåé ôçí ßäéá áíôßäñáóç ìå ôï èåôéêü ìÜñôõñá. Ð ñ ï ö ß ë ð ñ ù ô å ú í þ í Ïé ìåôïõóéùìÝíåò ïëïêõôôáñéêÝò ðñùôåÀíåò äéá÷ùñß æïíôáé ìå çëåêôñïöüñçóç óå ðçêôÞ ðïëõáêñõëáìßäéïõ PAGE (Stead, 1992a). Ð ñ ï ö ß ë óå ë é ð á ñ Ü ï î Ý á (FAP). Áíáðôýóóïõìå ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá óôÝëå÷ïò èåôé êïý ìÜñôõñá ãéá 48 þñåò óôïõò 280C óå trypticase soy a gar êáé åöáñìüæïõìå ôç äéáäéêáóßá FAP (Jance,1991, Stead, 1992a, Stead, 1992b). To ðñïößë ëéðáñþí ïîÝùí ôçò êáëëéÝñãåéáò ðñÝðåé íá åßíáé ßäéï ìå åêåßíï ôïõ èåôé êïý ìÜñôõñá. Óôéò êáèïñéóìÝíåò óõíèÞêåò, ôá ÷áñáêôç ñéóôéêÜ ëéðáñÜ ïîÝá åßíáé 14:0 3ÏÇ, 16:0 2ÏÇ, 16:1 2ÏÇ êáé 18:1 2ÏÇ. 4.2. ×áñáêôçñéóìüò óôåëÝ÷ïõò Ï ÷áñáêôçñéóìüò ôïõ óôåëÝ÷ïõò åßíáé ðñïáéñåôéêü áë ëÜ óõóôÞíåôáé ãéá êÜèå íÝá ðåñßðôùóç, ÷ñçóéìïðïéþíôáò ôïõëÜ÷éóôïí ìßá áðü ôéò áêüëïõèåò äéáäéêáóßåò: × á ñ á ê ô ç ñ é ó ì ü ò â é ï ð ï é ê é ë ß á ò To Ralstonia solanacearum äéá÷ùñßæåôáé óå âéïðïéêé ëßåò âÜóåé ôçò éêáíüôçôÜò ôïõ íá ðáñÜãåé ïîý áðü ôñåéò åîïæïáëêïüëåò êáé ôñßá óÜê÷áñá (Çayward, 1964 êáé 1994). Âéïðïéêéëßá 1 2 3 4 5 ×ñÞóç ìáëôüæçò - + + - + ëáêôüæçò - + + - + êåëëïâéüæçò - + + - + ìáííéôüëçò - - + + + óïñâéôüëçò - - + + äïõëêéôüëçò - - + + Ìå ðñüóèåôåò äïêéìÝò, ç âéïðïéêéëßá 2 ìðïñåß íá äéá öïñïðïéçèåß óå õðïöáéíïôýðïõò (Hayward, 1994): Âéïðïéêéëßá 2 âéïðïéêéëßá 2-Á Âéïðïéêéëßá 2-Ô ×ñÞóç ôñåáëüæçò - + + ×ñÞóç éíïóéôüëçò + - + ×ñÞóç D-ñéâüæçò - - + ÐçêôéíïëõôéêÞ äñÜóç ìéêñÞ ÌéêñÞ ìåãÜëç Ð ñ ï ó ä é ï ñ é ó ì ü ò ö õ ë Þ ò Ç öõëÞ (Buddenhagen et al., 1962) ìðïñåß íá ðñïóäéï ñéóèåß ìå âÜóç ìßá äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò óå öõôÜ ôïìÜôáò ÖÅÊ 214 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3293 Þ ìåëéôæÜíáò êáé óå öõôÜ êáðíïý êáé ìå ìßá áíôßäñáóç õ ðåñåõáéóèçóßáò (ÇR) óå öýëëá êáðíïý (Lozano êáé Se queira, 1970): ÖõëÞ (*) 1 2 3 Áíôßäñáóç óå: öõôÜ ôïìÜôáò /ìåëéôæÜíáò ìáñáóìüò ìç áíôßäñáóç ìáñáóìüò öõôÜ êáðíïý ìáñáóìüò ìç áíôßäñáóç ìç áíôßäñáóç öýëëá êáðíïý íÝêñùóç (48 HP (12-24 ÷ëþñùóç (2-8 þñåò) êáé þñåò) çìÝñåò) ìáñáóìüò (7-8 çì.) (*) H öõëÞ 4 (ðáèïãüíïò óôï ginger êáé ìåñéêïýò Üë ëïõò îåíéóôÝò) êáé ç öõëÞ 5 (ðáèïãüíïò óôç ìïõñéÜ ìü íï) äåí ðåñéëáìâÜíïíôáé. Ï ÷áñáêôçñéóìüò ôçò öõëÞò ìå ôéò äïêéìÝò ðáèïãÝíåé áò Þ õðåñåõáéóèçóßáò óå êáðíü, äåí åßíáé ßóùò ðïëý á îéüðéóôïò êáé áíô' áõôþí ìðïñåß íá ðñïêýøåé áðü ôç âéï ðïéêéëßá êáé ôï öõôü îåíéóôÞ ðñïÝëåõóçò. Ôï ãåíùìéêü áðïôýðùìá Ç ìïñéáêÞ äéáöïñïðïßçóç ôùí óôåëå÷þí óôï óýìðëï êï Ralstonia solanacearum ìðïñåß íá ãßíåé ìå: ÁíÜëõóç RFLP (Cook et al.,1989) EðáíáëçðôéêÞ áëëçëïõ÷ßá PCR [REP-, ERIC- êáé BOX PCR (Louws et al., 1995 Smith et al., 1995)] 4.3. ÄïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò Ç äïêéìÞ áõôÞ áðïóêïðåß óôçí åðéâåâáßùóç ôçò äéÜ ãíùóçò ôïõ Ralstonia solanacearum êáé ôçí åêôßìçóç ôçò ðáèïãÝíåéáò ôùí êáëëéåñãåéþí ðïõ ôáõôïðïéïýíôáé ùò Ralstonia solanacearum. ÐáñáóêåõÜæïõìå ìüëõóìá ìå 106 êýôôáñá áíÜ ml áðü ôçí êáëëéÝñãåéá êáé Ýíá èåôéêü óôÝëå÷ïò ìÜñôõñá. Ìïëý íïõìå 5-10 öõôÜ ôïìÜôáò Þ ìåëéôæÜíáò óôï ôñßôï êáôÜ ðñïôßìçóç ðñáãìáôéêü óôÜäéï öõëëïöïñßáò (ôìÞìá ÉÉÉ.6). ÁöÞíïõìå ãéá åðþáóç ìÝ÷ñé 2 åâäïìÜäåò óå èåñìïêñá óßá 22-280 C êáé õøçëÞ ó÷åôéêÞ õãñáóßá ìå êáèçìåñéíü ðüôéóìá. Ðáñáôçñïýìå áí åìöáíßæïíôáé óõìðôþìáôá ìá ñáóìïý Þ/êáé åðéíáóôßá, ÷ëþñùóç Þ íáíéóìüò. Áðïìïíþíïõìå áðü öõôÜ ðïõ ðáñïõóéÜæïõí óõìðôþ ìáôá, ùò áêïëïýèùò: áöáéñïýìå Ýíá ìÝñïò éóôïý áðü ôï óôÝëå÷ïò, 2 cm ðÜ íù áðü ôï óçìåßï ìüëõíóçò, ôåìá÷ßæïõìå ôïõò éóôïýò êáé ðáñáóêåõÜæïõìå áéþñç ìá óå Ýíá ìéêñü üãêï áðïóôåéñùìÝíïõ, áðïóôáãìÝíïõ íåñïý Þ óå 50 mM öùóöïñéêïý ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò. Áêïëïýèùò ãßíåôáé åîÜðëùóç åðß óôåñåïý èñåðôéêïý õ ðïóôñþìáôïò, åðþáóç êáé Ýëåã÷ïò ðáñïõóßáò ôõðéêþí áðïéêéþí ôïõ Ralstonia solanacearum. ÔÌÇÌÁ ÉÉÉ ÁÍÉ×ÍÅÕÓÇ ÊÁÉ ÔÁÕÔÏÐÏÉÇÓÇ ÔÏÕ RALSTONIA SOLANACEARUM ÓÅ ÄÅÉÃÌÁÔÁ ÊÏÍÄÕËÙÍ ÐÁÔÁÔÁÓ Óçìåßùóç: Ôï êáíïíéêü ìÝãåèïò äåßãìáôïò åßíáé 200 êüíäõëïé. Ç äïêéìáóßá üìùò ìðïñåß íá åöáñìïóôåß êáé ãéá äåßãìáôá ìéêñüôåñá ôùí 200 êïíäýëùí. 1. Ðñïåôïéìáóßá ôïõ äåßãìáôïò ãéá äïêéìÞ. Óçìåßùóç:Ôï åê÷õëéóìÝíï ßæçìá ðáôÜôáò ðïõ ëáìâÜíå ôáé ìå ôç äéáäéêáóßá áõôÞ ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß êáé ãéá ôçí áíß÷íåõóç ôïõ Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Eöüóïí êñéèåß óêüðéìï, ìðïñïýí íá ãßíïõí êáé ïé åîÞò ðñïêáôáñêôéêÝò åñãáóßåò: i) ôï äåßãìá åðùÜæåôáé óôïõò 25-300C ãéá äéÜóôçìá ìÝ ÷ñé 2 åâäïìÜäåò ãéá ôçí åíèÜññõíóç ðïëëáðëáóéáóìïý ôõ÷üí ÷áìçëþí ðëçèõóìþí Ralstonia solanacearum. ii) ïé êüíäõëïé ðëÝíïíôáé êÜôù áðü ñÝïí íåñü ôçò âñý óçò ìå êáôÜëëçëá áðïëõìáíôéêÜ êáé áðïññõðáíôéêÜ. Ïé êüíäõëïé óôåãíþíïõí óôïí áÝñá. 1.1. Ìå Ýíá êáèáñü êáé áðïëõìáóìÝíï íõóôÝñé Þ åéäéêü ìá÷áßñé ëá÷áíéêþí áöáéñåßôáé ç åðéäåñìßäá ãýñù áðü ôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ ôïõ êïíäýëïõ Ýôóé þ óôå íá öáíïýí ðñþôá ïé áããåéþäåéò éóôïß. Áðïêüðôïõìå ìå ðñïóï÷Þ Ýíá ìéêñü êþíï (äéÜìåôñïò 3-5 mm) áããåéþ äïõò éóôïý áðü ôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ êÜ èå êïíäýëïõ. Ðñïóï÷Þ þóôå ç áöáéñïýìåíç ðïóüôçôá ìç áããåéþäïõò éóôïý áðü ôï óçìåßï ðñüóöõóçò ôïõ óôï ëïíßïõ êÜèå êïíäýëïõ íá åßíáé ç åëÜ÷éóôç äõíáôÞ. ÓõíÝ ÷éóç ôçò äéáäéêáóßáò ãéá êÜèå êüíäõëï ôïõ äåßãìáôïò. Óçìåßùóç:Óôï óôÜäéï áõôü ïé êüíäõëïé ìðïñïýí íá å îåôáóôïýí ìáêñïóêïðéêÜ (ôìÞìá ÉÉ.1). ÊÜèå êüíäõëïò ìå óõìðôþìáôá Þ Ýíôïíç óÞøç áöÞíåôáé ðáñÜìåñá êáé åîå ôÜæåôáé ÷ùñéóôÜ (ôìÞìá ÉÉ). 1.2. Ïé êþíïé éóôþí óõëëÝãïíôáé ìÝóá óå Ýíá êëåéóôü äï ÷åßï. ÊáôÜ ðñïôßìçóç, ïé êþíïé áðü ôá óçìåßá ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ ðñÝðåé íá õðïâÜëëïíôáé óå êáôåñãáóßá á ìÝóùò. ÅÜí áõôü äåí åßíáé äõíáôüí, áðïèçêåýïíôáé ãéá ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ü÷é ìåãáëýôåñï áðü 24 þñåò, Þ óôïõò 40C ãéá ÷ñïíéêü äéÜóôçìá ü÷é ìåãáëýôåñï áðü 72 þñåò. 1.3 Ïé êþíïé áðü ôá óçìåßá ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ õðïâÜëëïíôáé óå êáôåñãáóßá ìå ìßá áðü ôéò áêüëïõèåò äéáäéêáóßåò: i) Oé êþíïé ìåôáöÝñïíôáé óå êáôÜëëçëï äï÷åßï. Ðñïóôßèåôáé éêáíÞ ðïóüôçôá ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò äéáâñï÷Þò (ðñïóÜñôçìá 2) þóôå íá êáëõöèïýí ïé êþíïé. Ïé êþíïé èñõììáôßæïíôáé óå Ýíá Waring-Blender (ìßîåñ) Þ ìå Ultra Turrax ìÝ÷ñé ðëÞñïõò ïìïéïãåíïðïéÞóåùò. ÐñÝðåé íá áðïöåýãåôáé ç õðåñâïëéêÞ ïìïéïãåíïðïßçóç. ÁöÞíïõìå ôï ðñïúüí íá äéáâñá÷åß ãéá 15-30 ëåðôÜ. éé) Ïé êþíïé ìåôáöÝñïíôáé óå êáôÜëëçëï äï÷åßï. Ðñïóôßèåôáé éêáíÞ ðïóüôçôá ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò äéáâñï÷Þò þóôå íá êáëõöèïýí ïé êþíïé. Ôï äï÷åßï ôïðïèåôåßôáé óå ðåñéóôñïöéêü áíáäåõôÞñá. Ôï ðåñéå÷üìåíï áöÞíåôáé íá åðùáóôåß óå 50-100 rpm ãéá 4 þñåò óôïõò 20-220C Þ ãéá 16-24 þñåò óôïõò 40C. iii) Oé êþíïé ìåôáöÝñïíôáé óå Ýíá áíèåêôéêü óÜêï äéá âñï÷Þò ìßáò ÷ñÞóçò (ð.÷. óÜêï Stomacher ìå äéáóôÜóåéò 105 mm x 150 mm, áðïóôåéñùìÝíï ìå áêôéíïâïëßá). Ïé êþíïé óõíèëßâïíôáé ðñïóåêôéêÜ ìå Ýíá êáôÜëëçëï åñ ãáëåßï, ð.÷. óöõñß, ìÝ÷ñé ðëÞñïõò ïìïéïãåíïðïéÞóåùò. Ðñïóôßèåôáé éêáíÞ ðïóüôçôá ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò äéáâñï÷Þò ãéá ôçí åðéêÜëõøç ôùí óõíèëéììÝíùí êþíùí êáé ôï õãñü äéáâñï÷Þò áöÞíåôáé íá êáôáêáèßóåé ãéá 15-30 ëåðôÜ ôçò þñáò. 1.4. Tá âáêôÞñéá åîÜãïíôáé áðü êáôåñãáóìÝíïõò êþ íïõò ìå ìßá áðü ôéò áêüëïõèåò äéáäéêáóßåò: i) Ôï õãñü äéáâñï÷Þò ìåôáããßæåôáé áðáëÜ ìÝóá óå óù ëÞíá öõãïêÝíôñçóçò áöÞíïíôáò ôõ÷üí õðïëåßììáôá é óôïý ìÝóá óôï äï÷åßï Þ ôïí óÜêï. Åöüóïí ôï ìåôáããéæü ìåíï õãñü äéáâñï÷Þò åìöáíßæåôáé èïëü öõãïêåíôñåßôáé ìå ôá÷ýôçôá ü÷é ìåãáëýôåñç áðü 180 xg ãéá 10 ëåðôÜ óå èåñìïêñáóßá êÜôù áðü ôïõò 100 C. Ôï ìåôáããéóèÝí õãñü äéáâñï÷Þò Þ ôï õðåñêåßìåíï õãñü áðü ôï ðñþôï óôÜäéï öõãïêÝíôñçóçò öõãïêåíôñåßôáé ìå ôá÷ýôçôá 7000 xg ãéá 15 ëåðôÜ Þ ìå ôá÷ýôçôá 10.000 xg ãéá 10 ëåðôÜ óå èåñìïêñáóßá ìéêñüôåñç áðü ôïõò 100C. 3294 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) Ôï õðåñêåßìåíï õãñü áðïññßðôåôáé ðñïóÝ÷ïíôáò íá ìç äéáôáñá÷èåß ôï ßæçìá. ii) Ôï õãñü äéáâñï÷Þò äéçèåßôáé ìÝóù ößëôñïõ ìå ìÝãå èïò ðüñùí 40-100 ìm. Ç äéÞèçóç åíéó÷ýåôáé ìå áíôëßá êå íïý. Ôï äéÞèçìá óõëëÝãåôáé óå Ýíá óùëÞíá öõãïêÝíôñçóçò. Ôï ößëôñï ðëÝíåôáé ìå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá äéáâñï÷Þò. Ôï äéÞèçìá öõãïêåíôñåßôáé ìå ôá÷ýôçôá 7.000 xg ãéá 15 ëåðôÜ Þ ìå ôá÷ýôçôá 10.000 xg ãéá 10 ëåðôÜ óå èåñìï êñáóßá ìéêñüôåñç áðü ôïõò 100C. Ôï õðåñêåßìåíï õãñü áðïññßðôåôáé ðñïóÝ÷ïíôáò íá ìç äéáôáñá÷èåß ôï ßæçìá. 1.5. Ôï ßæçìá áíáäéáëýåôáé óå 1 ml ñõèìéóôéêïý äéáëý ìáôïò ôïõ éæÞìáôïò (ðñïóÜñôçìá 2). Ôï áéþñçìá äéáéñåßôáé óå äýï ßóá ìÝñç êáé êÜèå ìÝñïò ìåôáöÝñåôáé óå Ýíá ìéêñïöéáëßäéï. Ôï Ýíá ìéêñïöéáëßäéï ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôç äïêéìÞ. Ôï õðüëïéðï áðü ôï åê÷ýëéóìá áõôü äéáôçñåßôáé êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò äïêéìÞò óôïõò 40C. Óôï Üëëï ìéêñïöéáëßäéï ðñïóôßèåôáé áðïóôåéñùìÝíç ãëõêåñßíç óå ôåëéêÞ óõãêÝíôñùóç 10-25% (V/V). Áíáêá ôåýåôáé ìå óôñïâéëéóìü (vortex). Áðïèçêåýåôáé óôïõò -180 C (ãéá åâäïìÜäåò) Þ óôïõò -700C (ãéá ìÞíåò). 2. ÄïêéìÞ áíïóïöèïñéóìïý (IF) ×ñçóéìïðïéåßôáé áíôéïñüò ãéá Ralstonia solanacearum, êáôÜ ðñïôßìçóç ãéá öõëÞ 3, âéïðïéêéëßá 2. Ï ôßôëïò ðñïó äéïñßæåôáé óå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ôï ïìü ëïãï óôÝëå÷ïò Ralstonia solanacearum ìå êáôÜëëçëç á ñáßùóç óõìðëüêïõ éóïèåéïêõáíéêÞò öèïñåúóßíçò (FITC), óýìöùíá ìå ôéò ïäçãßåò ôïõ êáôáóêåõáóôÞ. Ï ðñùôïãå íÞò áíôéïñüò ðñÝðåé íá Ý÷åé ôßôëï IF ôïõëÜ÷éóôïí 1:2.000. ×ñçóéìïðïéïýíôáé ðïëõöáôíéáêÝò áíôéêåéìåíïöüñïé ðëÜêåò ìéêñïóêïðßïõ ìå 10 êáôÜ ðñïôßìçóç öáôíßá äéá ìÝôñïõ ôïõëÜ÷éóôïí 6 mm. Óå êÜèå áíôéêåéìåíïöüñï ðåñéëáìâÜíåôáé ìÜñôõñáò óõìðëüêïõ FITC. Áí ôõ÷üí óôï ìÜñôõñá FITC ðáñáôçñç èïýí èåôéêÜ êýôôáñá ç äïêéìÞ èá ðñÝðåé íá åðáíáëáìâÜ íåôáé óõìðåñéëáìâÜíïíôáò êáé ôï ìÜñôõñá PBS. ÐáñáóêåõÜæïíôáé îå÷ùñéóôÜ ùò èåôéêïß ìÜñôõñåò á íôéêåéìåíïöüñïé ìå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü óôÝëå÷ïò Ralstonia solanacearum êáôÜëëçëçò öõëÞò/âéïðïéêéëßáò (ð.÷. öõëÞò 3, âéïðïéêéëßáò 2). Óå êÜèå óåéñÜ äïêéìþí ÷ñçóéìïðïéåßôáé ìßá áíôéêåéìåíïöüñïò. 2.1. Ïé ðñïò äïêéìÞ áíôéêåéìåíïöüñïé åôïéìÜæïíôáé ìå ìßá áðü ôéò áêüëïõèåò äéáäéêáóßåò: i) Óå ðåñßðôùóç éæçìÜôùí ìå ìéêñÞ ó÷åôéêÜ ðïóüôçôá á ìýëïõ: Óå ìßá óåéñÜ öáôíßùí, öÝñåôáé ìåôñçìÝíïò ìå óéöþíéï óõãêåêñéìÝíïò üãêïò (15ìl åßíáé áñêåôüò ãéá öáôíßá ìå äéÜìåôñï 6 mm - ï üãêïò êëéìáêþíåôáé ðñïò ôá Üíù ãéá ìåãáëýôåñá öáôíßá) ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò. Ç Üë ëç óåéñÜ ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò äåßãìá åéò äéðëïýí Þ ãéá Ýíá äåýôåñï äåßãìá üðùò öáßíåôáé óôçí åéêüíá 1. ii) Óå ðåñßðôùóç Üëëùí éæçìÜôùí: ÐáñáóêåõÜæïíôáé äåêáðëÝò áñáéþóåéò, äçëáäÞ 1/10, 1/100 êáé 1/1000 ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò óå ñõèìé óôéêü äéÜëõìá éæÞìáôïò. Óå ìßá óåéñÜ öáôíßùí, öÝñåôáé ìåôñçìÝíïò ìå óéöþíéï óõãêåêñéìÝíïò üãêïò (15 ìl åßíáé áñêåôüò ãéá öáôíßá ìå äéÜìåôñï 6 mm - ï üãêïò êëéìáêþ íåôáé ðñïò ôá Üíù ãéá ìåãáëýôåñá öáôíßá) ôïõ áéùñÞìá ôïò ôïõ éæÞìáôïò áðü êÜèå áñáßùóç. Ç Üëëç óåéñÜ ìðïñåß íá ÷ñçóéìïðïéçèåß ùò äåßãìá åéò äéðëïýí Þ ãéá Ýíá äåýôå ñï äåßãìá üðùò öáßíåôáé óôçí åéêüíá 2. 2.2. Ôï ðåñéå÷üìåíï ôùí öáôíßùí áöÞíåôáé íá îçñáèåß. Ôá âáêôçñéáêÜ êýôôáñá óôçí áíôéêåéìåíïöüñï ðñïóçëþ íïíôáé ìå èÝñìáíóç, ìå öëüãá Þ ìå 95% áéèáíüëç. 2.3. Äéáäéêáóßá IF i) Óýìöùíá ìå ôçí åôïéìáóßá ôçò áíôéêåéìåíïöüñïõ óôï óçìåßï 2.1.i: ÐáñáóêåõÜæåôáé ìßá óåéñÜ áñáéþóåùí ôïõ áíôéïñïý óôï äéðëÜóéï óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ãéá IF (ðñïóÜñôçìá 3): 1/4 ôïõ ôßôëïõ (Ô/4), ½ ôïõ ôßôëïõ (Ô/2), ï ôßôëïò (Ô) êáé ôï äéðëÜóéï ôïõ ôßôëïõ (2Ô). ii) Óýìöùíá ìå ôçí åôïéìáóßá ôçò áíôéêåéìåíïöüñïõ óôï óçìåßï 2.1.ii: ÐáñáóêåõÜæåôáé ç áñáßùóç åñãáóßáò (WD) ôïõ áíôéï ñïý óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ãéá IF. Áñáßùóç åñãáóßáò åß íáé ç áñáßùóç ôïõ áíôéïñïý ðïõ åìöáíßæåé ôçí êáëýôåñç åîåéäßêåõóç êáé åßíáé óõíÞèùò ôï ìéóü ôïõ ôßôëïõ. Åéêüíá 1 Åôïéìáóßá ôçò áíôéêåéìåíïöüñïõ äïêéìÞò óýìöùíá ìå ôá óçìåßá 2.1.i. êáé 2.3.i. ÊáèïñéóìÝíç áñáßùóç áéùñÞìáôïò éæÞìáôïò (Ô= ôßôëïò) FITC T/4 Ô/2 Ô 2Ô ðÁñáéþóåéò áíôéïñïý Äåßãìá 1 �1 �2 �3 �4 �5 Äåßãìá 1 åéò äéðëïýí Þ äåßãìá 2 �6 �7 �8 �9 �10 Åéêüíá 2 Åôïéìáóßá ôçò áíôéêåéìåíïöüñïõ äïêéìÞò óýìöùíá ìå ôá óçìåßá 2.1.ii. êáé 2.3.ii. FITC ÊáèïñéóìÝíç áñáßùóç áíôéïñïý Ìç Ìç áñáéùìÝíï áñáéùìÝíï 1/10 1/100 1/1000 ðÄåêáäéêÞ áñáßùóç éæÞìáôïò Äåßãìá 1 �1 �2 �3 �4 �5 Äåßãìá 1 åéò äéðëïýí Þ äåßãìá 2 �6 �7 �8 �9 �10 2.3.1. Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé ôïðïèåôïýíôáé ðÜíù óå Ýíõ ãñï áðïññïöçôéêü ÷áñôß. Ôá öáôíßá äïêéìÞò êáëýðôïíôáé ìå ôçí Þ ôéò áñáéþóåéò ôïõ áíôéïñïý. Óôá öáôíßá FITC öÝñåôáé PBS. Ï üãêïò ôïõ ÷ñçóéìïðïéïýìåíïõ óôá öáôíßá áíôéïñïý ðñÝðåé íá åßíáé éóïäýíáìïò ìå ôïí üãêï ôïõ ÷ñçóéìïðïéïýìåíïõ åê÷õëß óìáôïò. 2.3.2. Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé ôïðïèåôïýíôáé êÜôù áðü Ýíá êÜëõììá êáé åðùÜæïíôáé ãéá 30 ëåðôÜ óå èåñìïêñáóßá ðå ñéâÜëëïíôïò. 2.3.3. Ôá óôáãïíßäéá ôïõ áíôéïñïý áðïìáêñýíïíôáé ìå Ýíá åëáöñü ôßíáãìá áðü ôçí áíôéêåéìåíïöüñï êáé ïé áíôé êåéìåíïöüñïé îåðëÝíïíôáé ðñïóåêôéêÜ ìå ñõèìéóôéêü äéÜ ëõìá IF. Ðëýóç åðß 5 ëåðôÜ óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá-Tween IG êáé áêïëïýèùò åðß 5 ëåðôÜ óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá IF (ðñïóÜñôçìá 3). Ç ðåñßóóåéá ôïõ õãñïý áðïìáêñýíåôáé ðñïóåêôéêÜ. 2.3.4. Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé ôïðïèåôïýíôáé ðÜíù óå Ýíõ ãñï áðïññïöçôéêü ÷áñôß. ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3295 Ôá öáôíßá äïêéìÞò êáé ôï öáôíßï ôïõ FITC êáëýðôïíôáé ìå ôçí áñáßùóç ôïõ óõìðëüêïõ FITC ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí ðñïóäéïñéóìü ôïõ ôßôëïõ. Ï üãêïò ôïõ ÷ñçóéìï ðïéïýìåíïõ óôá öáôíßá óõìðëüêïõ ðñÝðåé íá åßíáé ßäéïò ìå ôïí üãêï ôïõ ÷ñçóéìïðïéïýìåíïõ áíôéïñïý. 2.3.5. Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé ôïðïèåôïýíôáé êÜôù áðü Ýíá êÜëõììá êáé åðùÜæïíôáé ãéá 30 ëåðôÜ óå èåñìïêñáóßá ðå ñéâÜëëïíôïò. 2.3.6. Ôá óôáãïíßäéá ôïõ óõìðëüêïõ ôéíÜæïíôáé ìáêñéÜ áðü ôçí áíôéêåéìåíïöüñï êáé ïé áíôéêåéìåíïöüñïé îåðëÝ íïíôáé êáé ðëÝíïíôáé üðùò ðñïçãïõìÝíùò (2.3.3.). Ç ðå ñßóóåéá ôïõ íåñïý áðïìáêñýíåôáé ðñïóåêôéêÜ. 2.3.7. Óå êÜèå öáôíßï öÝñïíôáé ìå óéöþíéï 5-10 ìl öù óöïñéêïý ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò ãëõêåñßíçò 0,1Ì (ðñïóÜñôçìá 3) Þ ðáñïìïßïõ ñåõóôïý êáé ôá öáôíßá êá ëýðôïíôáé ìå ìßá êáëõðôñßäá. 2.4. ÁíÜãíùóç ôçò äïêéìÞò IF Ïé áíôéêåéìåíïöüñïé äïêéìÞò åîåôÜæïíôáé óå ìéêñïóêü ðéï åðéöèïñéóìïý ìå ößëôñá êáôÜëëçëá ãéá ôçí äéÝãåñóç ôïõ FITC, ìå åëáéïêáôáäõôéêü öáêü êáé ìå ìåãÝèõíóç 50 1000. Ôá öáôíßá åîåôÜæïíôáé êáôÜ ìÞêïò äýï êáèÝôùí äéáìÝôñùí êáé êáôÜ ôçí ðåñßìåôñü ôïõò. Ðñþôá åëÝã÷åôáé ç áíôéêåéìåíïöüñïò ôïõ èåôéêïý ìÜñôõñá. Ôá êýôôáñá ðñÝðåé íá åßíáé ðëÞñùò ÷ñùóìÝíá ìå ëáìðñü öèïñéóìü. Óçìåßùóç: Óå ðåñßðôùóç áðïôõ÷ßáò, ç äïêéìÞ åðáíá ëáìâÜíåôáé. Ãßíåôáé áíÜãíùóç áíôéêåéìåíïöüñùí äïêéìÞò. ÅëÝã÷åôáé êáô' áñ÷Üò üôé äåí õðÜñ÷ïõí öèïñßæïíôá êýôôáñá óôá öáôíßá ôùí ìáñôýñùí FITC. Áí õðÜñ÷ïõí öèïñßæïíôá êýôôáñá óôï öáôíßï FITC áõôü äåß÷íåé ìç åé äéêÞ óýæåõîç ôïõ óõìðëüêïõ, áõôïöèïñéóìü Þ åðéìüëõí óç. Óçìåßùóç: Óôéò ðåñéðôþóåéò áõôÝò, ç äïêéìÞ åðáíá ëáìâÜíåôáé. ÅîåôÜæåôáé áí õðÜñ÷ïõí öèïñßæïíôá êýôôáñá ìå ôç ÷á ñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá ôïõ Ralstonia solanacearum óôá öáôíßá äïêéìÞò. Ç Ýíôáóç ôïõ öèïñéóìïý ðñÝðåé íá åßíáé ßäéá ìå åêåßíç ôïõ èåôéêïý ìÜñôõñá ìå ßäéá áñáßùóç áíôéïñïý. Êýôôáñá ìå áôåëÞ ÷ñþóç Þ ìå áóèåíÞ öèïñé óìü äåí ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðüøç, åêôüò êé áí õðÜñ ÷ïõí ðïëëÜ ôÝôïéá êýôôáñá (âëÝðå åñìçíåßá áðïôåëå óìÜôùí ôçò äïêéìÞò IF). Åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò äïêéìÞò IF i) Åöüóïí óå Ýíá äåßãìá äåí áíåõñßóêïíôáé ëáìðñþò öèïñßæïíôá êýôôáñá ìå ÷áñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá, ç äïêéìÞ IF åßíáé áñíçôéêÞ. ii) Åöüóïí óå Ýíá äåßãìá âñßóêïíôáé ëáìðñþò öèïñßæï íôá êýôôáñá ìå ÷áñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá, ðñïóäéïñß æåôáé ï ìÝóïò áñéèìüò êõôôÜñùí áíÜ ðåäßï ìéêñïóêïðßïõ êáé õðïëïãßæåôáé ï áñéèìüò ôùí êõôôÜñùí (Í) áíÜ ml ôïõ áíáäéáëõìÝíïõ éæÞìáôïò (ðñïóÜñôçìá 4). ¸íáò ðëçèõóìüò 103 ðåñßðïõ áíÜ ml áíáäéáëõìÝíïõ é æÞìáôïò, èåùñåßôáé ôï üñéï áíß÷íåõóçò ôçò äïêéìÞò IF: óå äåßãìáôá ìå Í>103 êýôôáñá áíÜ ml áíáäéáëõìÝíïõ éæÞìáôïò, ç äïêéìÞ IF èåùñåßôáé èåôéêÞ, óå äåßãìáôá ìå Í<103 êýôôáñá áíÜ ml áíáäéáëõìÝíïõ éæÞìáôïò, ç äïêéìÞ IF ìðïñåß íá èåùñçèåß èåôéêÞ. iii) Aí ðáñáôçñçèïýí ìåãÜëïé áñéèìïß (Í>105 êýôôáñá áíÜ ml) êõôôÜñùí ìå áôåëÞ Þ áóèåíÞ öèïñéóìü, ìå ôïí ôßô ëï ôïõ áíôéïñïý, ðñÝðåé íá ðñáãìáôïðïéåßôáé ìßá äåýôå ñç äïêéìÞ: åßôå ìßá äïêéìÞ âáóéóìÝíç óå ìßá äéáöïñåôéêÞ âéïëïãé êÞ áñ÷Þ, Þ åðáíÜëçøç ôçò äïêéìÞò IF, ìå Ýíá äåýôåñï áíôéïñü Þ ìå 10 öïñÝò áñáéùìÝíï ßæçìá. 3. ÄïêéìÞ ELISA (âáóßæåôáé óôçí åñãáóßá ôùí Robinson-Smith et al., 1995) Xñçóéìïðïéåßôáé áíôéïñüò ãéá Ralstonia solanacearum, êáôÜ ðñïôßìçóç Ýíáíôé öõëÞò 3, âéïðïéêéëßáò 2. Ï ôßôëïò ðñïóäéïñßæåôáé óå áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ôï ïìüëïãï óôÝëå÷ïò Ralstonia solanacearum. ÓõíéóôÜôáé ç ÷ñÞóç ìéêñüôéôëùí ðëáêþí NUNC Polysorp. ÐåñéëáìâÜíåôáé Ýíáò áñíçôéêüò ìÜñôõñáò åê÷õëßóìá ôïò ðáôÜôáò êáé Ýíáò ìÜñôõñáò áðü ñõèìéóôéêü öùóöï ñéêü äéÜëõìá áëáôéïý (PBS). Ùò èåôéêüò ìÜñôõñáò ÷ñçóéìïðïéåßôáé áéþñçìá > 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü óôÝëå÷ïò Ralstonia solanacearum êáôÜëëçëçò öõëÞò/âéïðïéêéëßáò. Ç äïêéìÞ ãßíåôáé ìå ôáõ ôüóçìï ôñüðï ìå åêåßíç ôïõ Þ ôùí äåéãìÜôùí áëëÜ äéá ÷ùñßæåôáé óáöþò áðü ôá äåßãìáôá óôç ðëÜêá. 3.1. 100-200 ìl ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò öÝñïíôáé ìå óéöþíéï óå Ýíá ìéêñïöéáëßäéï êáé èåñìáßíïíôáé ãéá 4 ëåðôÜ óôïõò 1000C. Êáôüðéí ôï ìéêñïöéáëßäéï ôïðïèåôåß ôáé óå ðÜãï. 3.2. Ðñïóôßèåôáé ßóïò üãêïò áíèñáêéêïý ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò åðéêÜëõøçò äéðëÞò éïíôéêÞò éó÷ýïò (ðñïóÜñ ôçìá 5) êáé ôï ðåñéå÷üìåíï áíáêáôåýåôáé óå óõóêåõÞ vortex. 3.3. Óå äýï ôïõëÜ÷éóôïí öáôíßá ôçò ìéêñüôéôëçò ðëÜêáò öÝñïíôáé áðü 100 ìl ôïõ áíùôÝñù äéáëýìáôïò êáé åðùÜ æïíôáé ãéá 1 þñá óôïõò 370C Þ üëç ôç íýêôá óôïõò 40C. 3.4. Ç ðëÜêá ôéíÜæåôáé åëáöñÜ ãéá íá áðïìáêñõíèïýí ôá åê÷õëßóìáôá áðü ôá öáôíßá. Ôá öáôíßá ðëÝíïíôáé ôñåéò öïñÝò ìå PBS-Tween (ðñïóÜñôçìá 5), áöÞíïíôáò ôï ôå ëåõôáßï äéÜëõìá ðëõóßìáôïò óôá öáôíßá ãéá 5 ëåðôÜ ôïõ ëÜ÷éóôïí. 3.5. ÐáñáóêåõÜæåôáé ç êáôÜëëçëç áñáßùóç áíôéïñïý Ralstonia solanacearum óå ñõèìéóôéêü ðñïóôáôåõôéêü äéÜëõìá (blocking buffer) (ðñïóÜñôçìá 5). Óôá öáôíßá öÝ ñïíôáé 100 ìl áñáßùóçò áíôéïñïý. ÅðùÜæïíôáé ãéá 1 þñá óôïõò 370C. 3.6. Ç ðëÜêá ôéíÜæåôáé åëáöñÜ ãéá íá áðïìáêñõíèåß ï á íôéïñüò áðü ôá öáôíßá êáé ôá öáôíßá ðëÝíïíôáé üðùò êáé ðñïçãïõìÝíùò (óçìåßï 3.4). 3.7. ÐáñáóêåõÜæåôáé ç êáôÜëëçëç áñáßùóç óõìðëüêïõ áëêáëéêÞò öùóöáôÜóçò óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá äåóìåý óåùò. ÖÝñïíôáé óôá öáôíßá 100 ìl áðü áõôÞ êáé åðùÜæï íôáé ãéá 1 þñá óôïõò 370C. 3.8. Ç ðëÜêá ôéíÜæåôáé åëáöñÜ ãéá íá áðïìáêñõíèïýí ôá õðïëåßììáôá ôïõ óõìðëüêïõ áðü ôá öáôíßá êáé ôá öáô íßá ðëÝíïíôáé üðùò êáé ðñïçãïõìÝíùò (óçìåßï 3.4 êáé 3.6). 3.9. ÐáñáóêåõÜæåôáé äéÜëõìá õðïóôñþìáôïò áëêáëé êÞò öùóöáôÜóçò (ðñïóÜñôçìá 5). ÖÝñïíôáé óôá öáôíßá 100 ìl áðü áõôü êáé áêïëïõèåß åðþáóç ãéá 30 ëåðôÜ Ýùò 1 þñá óôï óêïôÜäé óå èåñìïêñáóßá åñãáóôçñßïõ. 3.10. ÄéáâÜæåôáé ç áðïññüöçóç óôá 409 nm. Åñìçíåßá ôçò äïêéìÞò ÅLISA Ç äïêéìÞ ELISA åßíáé áñíçôéêÞ åÜí ç ïðôéêÞ ðõêíüôçôá (Ï.D.) ôïõ äåßãìáôïò åßíáé < 2xO.D. ôïõ áñíçôéêïý ìÜñ ôõñá. Ç äïêéìÞ ELISA åßíáé èåôéêÞ åÜí ç ïðôéêÞ ðõêíüôçôá (Ï.D.) ôïõ äåßãìáôïò åßíáé > 2x O.D. ôïõ áñíçôéêïý ìÜñ ôõñá. 3296 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 4. ÄïêéìÞ PCR (âáóßæåôáé óôçí åñãáóßá ôùí Seal et al., 1993). Óçìåßùóç: ÊáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò ðáñáóêåõÞò ôïõ äåßã ìáôïò êáèþò êáé ôùí õðüëïéðùí åñãáóéþí ãéá ôç äïêéìÞ PCR, ðñÝðåé íá ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ïãêïìåôñéêÜ áêñïóôü ìéá (pipette tips) ìå ößëôñï. ÐáñáóêåõÜæåôáé áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü óôÝëå÷ïò Ralstonia solanacearum öõëÞò 3, âéïðïéêéëßáò 2 ùò èåôéêüò ìÜñôõñáò. Ç äïêéìÞ ãßíåôáé ìå ôáõôüóçìï ôñüðï ìå åêåßíç ôïõ Þ ôùí äåéãìÜôùí. 4.1. 100 ìl ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò öÝñïíôáé ìå óé öþíéï óå Ýíá ìéêñïöéáëßäéï. ÅíáëëáêôéêÜ 90 ìl ôïõ áéùñÞìáôïò ìåôáöÝñïíôáé óå ìé êñïöéáëßäéï ðåñéÝ÷ïí 10 ìl NaOH 0,5M. Ôï ðåñéå÷üìåíï ôïõ öéáëéäßïõ áíáêáôåýåôáé áíáðïäïãõñßæïíôáò åðáíåé ëçììÝíá ðÜíù êÜôù ôï ìéêñïöéáëßäéï. 4.2. Ôï öéáëßäéï èåñìáßíåôáé ãéá 4 ëåðôÜ óôïõò 1000 C êáé êáôüðéí áðïìáêñýíåôáé áìÝóùò ðÜíù óå ðÜãï. 4.3. ÐáñáóêåõÜæïíôáé äýï ôïõëÜ÷éóôïí äåêáäéêÝò á ñáéþóåéò ð.÷. 1/10 êáé 1/100, Þ ðåñéóóüôåñåò áí èåùñçèåß áðáñáßôçôï, óå áðïóôåéñùìÝíï áðåóôáãìÝíï Þ õðÝñ êá èáñü íåñü (UPW). 4.4. ÐáñáóêåõÜæåôáé ôï ìåßãìá áíôßäñáóçò PCR (ðñï óÜñôçìá 6) ðñïóèÝôïíôáò óå áðïóôåéñùìÝíï öéáëßäéï ôá ðáñáêÜôù óõóôáôéêÜ ìå ôçí áêüëïõèç óåéñÜ: Ãéá üãêï áíôßäñáóçò 50 ìl Óõóôáôéêü Ðïóüôçôá ÔåëéêÞ óõãêÝíôñùóç ÁðïóôåéñùìÝíï áðåóôáãìÝíï Þ UPW 30,8 ìl-33,8 ìl 10x ñõèìéóôéêü äéÜëõìá PCR 5,0 ìl 1x d-ATP 1,0 ìl 0,2 mM d-CTP 1,0 ìl 0,2 mM d-GTP 1,0 ìl 0,2 mM d-ÔÔP 1,0 ìl 0,2 mM EêêéíçôÞò ÏLI-1 (20 ìÌ) 2,5 ìl 1 ìM ÅêêéíçôÞò Õ-2 (20 ìÌ) 2,5 ìl 1 ìÌ Taq ðïëõìåñÜóç (5U/ìl) 0,2 ìl 1,0 U Óõíïëéêüò üãêïò 45 ìl - 48 ìl Ãéá ðåñéóóüôåñåò áíôéäñÜóåéò Õðïëïãßæåôáé ç ðïóüôçôá êÜèå óõóôáôéêïý ãéá ôïí á ðáéôïýìåíï áñéèìü áíôéäñÜóåùí. Ôá óõóôáôéêÜ áíáìåéãíýïíôáé êáé 45 ìl-48 ìl ôïõ ìåßã ìáôïò ìåôáöÝñïíôáé óå áðïóôåéñùìÝíá öéáëßäéá PCR. Ôá öéáëßäéá ìå ôï ìåßãìá áíôßäñáóçò PCR äéáôçñïýíôáé óå ðÜãï. Ãéá üãêï 25 ml H ðïóüôçôá ôùí óõóôáôéêþí ìåéþíåôáé áíáëïãéêÜ. 4.5. Óýíèåóç PCR 4.5.1. Ðñïáéñåôéêü! Ôá öéáëßäéá ìå ôï âñáóìÝíï äåßãìá êáé ôïí èåôéêü ìÜñôõñá õðïâÜëëïíôáé óå ðáëìéêÞ öõãï êÝíôñçóç. Ðñïóôßèåíôáé, ìå ôçí êáèïñéæüìåíç óåéñÜ, 2-5 ìl ôïõ Þ ôùí äåéãìÜôùí, õäáôéêïý ìÜñôõñá êáé èåôéêïý ìÜñôõñá óôá öéáëßäéá ìå ôï ìåßãìá áíôßäñáóçò PCR.Ôá öéáëßäéá ôïðïèåôïýíôáé óôï èåñìéêü ìðëïê óôç ìïíÜäá èÝñìáí óçò ôïõ èåñìéêïý êõêëïðïéçôÞ DNA. 4.5.2. Áêïëïõèåßôáé ôï åîÞò ðñüãñáììá: 1 êýêëïò áðü: i) 2 ëåðôÜ óôïõò 960 C: ìåôïõóßùóç ôïõ áñ÷éêïý DNA 50 êýêëïé áðü: ii) 20 äåõôåñüëåðôá óôïõò 940 C: ìåôïõóßùóç iii) 20 äåõôåñüëåðôá óôïõò 680 C: ðñïóêüëëçóç åêêéíç ôþí iv) 30 äåõôåñüëåðôá óôïõò 720 C: åðÝêôáóç áíôéãñÜöïõ 1 êýêëïò áðü: v) 10 ëåðôÜ óôïõò 720C: ðåñáéôÝñù åðÝêôáóç 1 êýêëïò óõíéóôÜìåíïò óå: vi) äéáôÞñçóç óôïõò 40C Óçìåßùóç: Ïé ðáñÜìåôñïé áõôÝò éó÷ýïõí ãéá èåñìéêü êõêëïðïéçôÞ DNA Perkin Elmer 9600. ¢ëëïé èåñìéêïß êõ êëïðïéçôÝò ìðïñåß íá áðáéôïýí åðßóôñùóç ïñõêôåëáßïõ óôá öéáëßäéá PCR Þ/êáé ôñïðïðïßçóç ôçò äéÜñêåéáò ôùí óôáäßùí ii), iii) êáé iv) óôï ðñüãñáììá óýíèåóçò. 4.5.3. Ôá öéáëßäéá áðïìáêñýíïíôáé áðü ôïí èåñìéêü êõ êëïðïéçôÞ. Ôï ðñïúüí PCR áíáëýåôáé. ÅÜí áõôü äåí ãßíåé áìÝóùò, ôá öéáëßäéá áðïèçêåýïíôáé óôïõò 40 Cãéá ÷ñÞóç ôçí ßäéá ìÝñá Þ óôïõò -180 C ãéá áñãüôåñá. 4.6. ÁíÜëõóç ôïõ ðñïúüíôïò PCR Ôá ÔìÞìáôá DNA PCR áíé÷íåýïíôáé ìå çëåêôñïöüñçóç óå ðçêôÞ áãáñüæçò êáé ÷ñþóç ìå âñùìéïý÷ï áéèßäéï 4.6.1 ÐáñáóêåõÜæåôáé êáôÜëëçëç ðçêôÞ áãáñüæçò âñÜæïíôáò Þðéá ðïóüôçôá áãáñüæçò óå tris-ïîéêü ñõèìé óôéêü äéÜëõìá çëåêôñïöüñçóçò (ÔÁÅ). 4.6.2. Ç ôçãìÝíç áãáñüæç øý÷åôáé óôïõò 50-600 C, ÷ý íåôáé óôï êáëïýðé ôçò ìïíÜäáò çëåêôñïöüñçóçò êáé åé óÜãåôáé ç ÷ôÝíá. Ç ðçêôÞ áöÞíåôáé íá óôåñåïðïéçèåß. 4.6.3. Áðïìáêñýíåôáé ç ÷ôÝíá. Ç ðçêôÞ âõèßæåôáé óå ÔÁÅ Ýôóé þóôå ßóá-ßóá íá êáëýðôåôáé (2-3 mm) áðü ôï ñõèìé óôéêü äéÜëõìá. 4.6.4. 3 ìl ñõèìéóôéêïý äéáëýìáôïò öüñôùóçò öÝñïíôáé ðÜíù óå ðáñáößëì. Ðñïóôßèåíôáé 12 ìl ôïõ ðñïúüíôïò PCR áðü ôá äåßãìáôá, ôï èåôéêü ìÜñôõñá Þ ôïí õäáôéêü ìÜñôõñá êáé áíáìåéãíýïíôáé ìå åëáöñÜ áíáññüöçóç óôï ïãêïìåôñéêü áêñïóôüìéï ðñéí áðü ôçí öüñôùóç óôçí ðç êôÞ. Ïé áíáöåñüìåíïé üãêïé ìðïñïýí íá ôñïðïðïéçèïýí ðñïêåéìÝíïõ íá ðñïóáñìïóôïýí óôç ÷ùñçôéêüôçôá ôùí öáôíßùí óôçí ðçêôÞ áãáñüæçò. 4.6.5. Ç öüñôùóç ãßíåôáé ìå ðñïóï÷Þ óôá öáôíßá ôçò ðçêôÞò. Óå Ýíá ôïõëÜ÷éóôïí öáôíßï öÝñåôáé ãéá ëüãïõò á íáöïñÜò êáôÜëëçëïò é÷íçèÝôçò DNA. 4.6.6. ÓõíäÝïíôáé ôá êáëþäéá óôç óõóêåõÞ çëåêôñïöü ñçóçò êáé ôçí ðçãÞ ôñïöïäïóßáò. Åöáñìüæåôáé ôÜóç 5-8 V/cm ìÝ÷ñéò üðïõ ôï ìÝôùðï ôïõ é÷íçëÜôç äåßêôç öèÜóåé óôï 1 cm áðü ôï Üêñï ôçò ðçêôÞò. 4.6.7. Äéáêüðôåôáé ç ôñïöïäïóßá ñåýìáôïò. Ôá êáëþäéá áðïóõíäÝïíôáé áðü ôç ìïíÜäá çëåêôñïöüñçóçò, áðïìá êñýíåôáé ìå ðñïóï÷Þ ç ðçêôÞ êáé åìâáðôßæåôáé óå âñùìé ïý÷ï áéèßäéï ãéá 30-45 ëåðôÜ. Óçìåßùóç:¼ôáí ÷ñçóéìïðïéïýìå âñùìéïý÷ï áéèßäéï, ðñÝðåé íá öïñïýìå ðÜíôïôå ãÜíôéá ãéáôß åßíáé éó÷õñü ìå ôáëëáîéïãüíï. 4.6.8. Áêïëïõèåß áðï÷ñùìáôéóìüò óå áðåóôáãìÝíï íå ñü ãéá 10-15 ëåðôÜ. 4.6.9. Ôï Þ ôá óõíôåèåéìÝíá ôìÞìáôá DNA åìöáíßæïíôáé ìå õðåñéþäç áêôéíïâïëßá. Ôï ðñïúüí PCR ôïõ Ralstonia solanacearum ìå åêêéíçôÝò OLI-1 êáé Õ-2 Ý÷åé ìÞêïò 288 bp. Óõãêñßíåôáé óå ó÷Ýóç ìå ôïí é÷íçèÝôç DNA êáé ôïí èå ôéêü ìÜñôõñá. Óçìåßùóç: Ï õäáôéêüò ìÜñôõñáò ðñÝðåé óå êÜèå ðåñß ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3297 ðôùóç íá åßíáé áñíçôéêüò. ÅÜí åßíáé èåôéêüò, ç äïêéìÞ å ðáíáëáìâÜíåôáé. 4.6.10. Ç ðçêôÞ, åöüóïí ÷ñåéÜæåôáé ãéá ôï áñ÷åßï, öù ôïãñáößæåôáé. 4.6.11. Ç áõèåíôéêüôçôá ôïõ óõíôåèåéìÝíïõ ôìÞìáôïò DNA åðéâåâáéþíåôáé ìå áíÜëõóç ìå Ýíæõìï ðåñéïñéóìïý (REA). 4.7. ÁíÜëõóç ìå ðåñéïñéóôéêü Ýíæõìï (REA). 4.7.1. 8,5 ìl áðü ôï ðñïúüí PCR (óçìåßï 4.5.3.) ìåôáöÝ ñïíôáé óå íÝï ìéêñïöéáëßäéï. Ðñïóôßèåôáé 1 ìl 10 x ñõèìé óôéêïý äéáëýìáôïò ôïõ åíæýìïõ êáé 0,5 ìl Ýíæõìï ðåñéïñé óìïý Avall. 4.7.2. Aíáìåéãíýïíôáé ìå Þðéá áíáññüöçóç óôï áêñï óôüìéï. ÅÜí óôá ôïé÷þìáôá ôïõ öéáëéäßïõ ðáñáìåßíïõí óôáãüíåò, öõãïêåíôñåßôáé óå ðáëìéêÞ ìéêñïöõãüêåíôñï. Áêïëïõèåß åðþáóç ãéá 1 þñá óôïõò 370C. 4.7.3. Ôï ÔìÞìá DNA ðïõ õðÝóôç ðÝøç áíáëýåôáé ìå ç ëåêôñïöüñçóç óå ðçêôÞ áãáñüæçò üðùò ðñïçãïõìÝíùò (óçìåßï 4.6.). Åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò äïêéìÞò PCR Ç äïêéìÞ PCR åßíáé áñíçôéêÞ åöüóïí äåí áíé÷íåýåôáé ôï ÷áñáêôçñéóôéêü ôìÞìá 288 bp êáé ôï ôìÞìá áíé÷íåýåôáé óôï èåôéêü ìÜñôõñá Ralstonia solanacearum. H äïêéìÞ PCR åßíáé èåôéêÞ åÜí ôï ôìÞìá 288 bp áíé÷íåý åôáé êáé ç áíÜëõóç REA ôïõ óõíôåèåéìÝíïõ ôìÞìáôïò åß íáé ßäéá ìå åêåßíç ôïõ èåôéêïý ìÜñôõñá Ralstonia solanacearum. 5. ÅêëåêôéêÞ áðïìüíùóç åðß óôåñåïý õðïóôñþìáôïò. (âáóßæåôáé óôçí åñãáóßá ôùí Elphinstone et al., 1996) 5.1. H äïêéìÞ ðñáãìáôïðïéåßôáé ìå êáôÜëëçëç ôå÷íéêÞ áñáéþóåùí åðß óôåñåïý õðïóôñþìáôïò ð.÷.: i) ÐáñáóêåõÜæïíôáé äýï ôïõëÜ÷éóôïí äåêáäéêÝò áñáéþ óåéò, óõãêåêñéìÝíá 1/10 êáé 1/100 Þ ðåñéóóüôåñåò áí èå ùñçèåß ÷ñÞóéìï, ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò óå ñõèìé óôéêü äéÜëõìá éæÞìáôïò. ÓõãêåêñéìÝíïò üãêïò (50-100 ìl) ôïõ áéùñÞìáôïò êáé êÜèå áñáßùóçò ìåôñçìÝíïò ìå óéöþ íéï öÝñåôáé óå ôñïðïðïéçìÝíï åêëåêôéêü õðüóôñùìá SM SA (ðñïóÜñôçìá 7) êáé áðëþíåôáé ìå ìßá ãõÜëéíç ñÜâäï óå üëç ôçí åðéöÜíåéá ôïõ õðïóôñþìáôïò. Eöüóïí êñßíåôáé óêüðéìï, ðñáãìáôïðïéåßôáé ãñáììéêÞ åîÜðëùóç áñáßùóçò, 10 ìl áíáäéáëõìÝíïõ éæÞìáôïò ðåñ íþíôáò êÜèå öïñÜ ôç âåëüíá áðü öëüãá. ii) ÓõãêåêñéìÝíïò üãêïò (50-100ìl) ôïõ áéùñÞìáôïò ìå ôñçìÝíïò ìå óéöþíéï ìåôáöÝñåôáé óå ôñïðïðïéçìÝíï å êëåêôéêü õðüóôñùìá SMSA êáé áðëþíåôáé ìå ìßá ãõÜëéíç ñÜâäï óå üëç ôçí åðéöÜíåéá ôïõ õðïóôñþìáôïò. Ç ñÜ âäïò óýñåôáé ãñáììùôÜ óå äýï áêüìç ôñïðïðïéçìÝíá ôñõâëßá SMSA ÷ùñßò íá ôçí ðåñÜóïõìå áðü öëüãá. 5.2. Áéþñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ðáèïãüíï óôÝ ëå÷ïò Ralstonia solanacearum öõëÞò 3, âéïðïéêéëßáò 2 ðïõ ðáßæåé ñüëï èåôéêïý ìÜñôõñá åîáðëïýôáé, ìå ôçí ßäéá ôå÷íéêÞ, óå ìßá óåéñÜ îå÷ùñéóôþí ôñõâëßùí ôñïðïðïéçìÝ íùí SMSA. 5.3. Ôá ôñõâëßá åðùÜæïíôáé óôïõò 280 C. ÌåôÜ 3 çìÝñåò îåêéíÜ ç áíÜãíùóç ôùí ôñõâëßùí. ÅÜí ôï áðïôÝëåóìá åß íáé áñíçôéêü, áöÞíïíôáé íá åðùáóôïýí áêüìç ìÝ÷ñé 6 ç ìÝñåò. Ïé ðáèïãüíåò áðïìïíþóåéò ôïõ Ralstonia solanacearum áíáðôýóóïõí ãáëáêôþäïõò ÷ñïéÜò ëåõ êÝò, åðßðåäåò, áêáíüíéóôåò êáé ñåõóôþäåéò áðïéêßåò ìå äéáêñéôÜ åñõèñÜ ðñïò ôï ðïñöõñïýí êÝíôñá ðïõ åìöáíß æïõí åóùôåñéêÝò ñáâäþóåéò Þ åëéêþóåéò. 5.4. Ïé áðïéêßåò ìå ÷áñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá êáèá ñßæïíôáé ìå åê íÝïõ êáëëéÝñãåéá óå èñåðôéêü õðüóôñùìá ãåíéêÞò ÷ñÞóåùò (ðñïóÜñôçìá 1). 5.5. Ïé êáèáñÝò êáëëéÝñãåéåò ôáõôïðïéïýíôáé (ôìÞìá ÉÉ.4.1.) êáé ïé êáëëéÝñãåéåò ôïõ Ralstonia solanacearum å ðéâåâáéþíïíôáé ìå ìßá äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (ôìÞìá ÉÉ.4.3). Åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò äïêéìÞò (åêëåêôéêÞò áðïìüíùóçò åðß óôåñåïý õðïóôñþìáôïò) Ç äïêéìÞ åßíáé áñíçôéêÞ åÜí äåí áðïìïíùèïýí áðïéêßåò âáêôçñßùí ìåôÜ 6 çìÝñåò Þ åÜí äåí áðïìïíùèïýí ÷áñá êôçñéóôéêÝò áðïéêßåò Ralstonia solanacearum õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé äåí õðÜñ÷ïõí õðüíïéåò ãéá ðáñåìðüäé óç áðü áðïéêßåò Üëëùí âáêôçñßùí êáé ÷áñáêôçñéóôéêÝò á ðïéêßåò ôïõ Ralstonia solanacearum áðïìïíþíïíôáé áðü ôïõò èåôéêïýò ìÜñôõñåò. Ç äïêéìÞ åßíáé èåôéêÞ åÜí áðïìïíùèïýí ÷áñáêôçñéóôé êÝò áðïéêßåò Ralstonia solanacearum. 6. BéïäïêéìÞ (âáóßæåôáé óôçí åñãáóßá ôïõ Janse, 1988) 6.1. ×ñçóéìïðïéïýíôáé 10 ðñïò äïêéìÞ åõáßóèçôá óðï ñüöõôá ôïìÜôáò Þ ìåëéôæÜíáò åõñéóêüìåíá óôï óôÜäéï ôïõ 3ïõ ðñáãìáôéêïý öýëëïõ ãéá êÜèå äåßãìá. Ôá öõôÜ äåí ðïôßæïíôáé ãéá 24 þñåò ðñéí áðü ôç ìüëõíóç. 6.2. 100 ìl ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò êáôáíÝìïíôáé ìåôáîý ôùí ðåéñáìáôïöýôùí. Ôá óôåëÝ÷ç ìïëýíïíôáé ìå ôáîý ôùí êïôõëçäüíùí êáé óå Ýíá Þ ðåñéóóüôåñá Üëëá óçìåßá. 6.3. 10 óðïñüöõôá ìïëýíïíôáé ìå ôçí ßäéá ôå÷íéêÞ ìå áé þñçìá 106 êõôôÜñùí áíÜ ml áðü ðáèïãüíï óôÝëå÷ïò ôïõ Ralstonia solanacearum öõëÞò 3, âéïðïéêéëßáò 2 ãéá íá ÷ñçóéìåýóïõí ùò èåôéêüò ìÜñôõñáò êáé ìå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá éæÞìáôïò ãéá íá ÷ñçóéìåýóïõí ùò áñíçôéêüò ìÜñôõñáò. Ôá öõôÜ èåôéêïß ìÜñôõñåò, äéá÷ùñßæïíôáé áðü ôá Üëëá öõôÜ ðñïò áðïöõãÞ åðéìïëýíóåùí. 6.4. Ôá óðïñüöõôá áöÞíïíôáé íá áíáðôõ÷èïýí ãéá 4 å âäïìÜäåò óå èåñìïêñáóßá 22-280C ìå êáèçìåñéíü ðüôé óìá êáé õøçëÞ ó÷åôéêÞ õãñáóßá. Ðáñáôçñïýìå áí èá ðá ñïõóéáóôïýí óõìðôþìáôá ìáñáóìïý, åðéíáóôßáò, ÷ëþ ñùóçò Þ/êáé íáíéóìïý. 6.5. Áðü ôá ðñïóâåâëçìÝíá öõôÜ ãßíåôáé áðïìüíùóç (ôìÞìá ÉÉ). Ôáõôïðïéïýíôáé ïé êáèáñÝò êáëëéÝñãåéåò ìå ÷áñáêôçñéóôéêÞ ìïñöïëïãßá (ôìÞìá ÉÉ.4.1) êáé ïé êáëëéÝñ ãåéåò ôïõ Ralstonia solanacearum åðéâåâáéþíïíôáé ìå äï êéìÞ ðáèïãÝíåéáò (ôìÞìá ÉÉ.4.3). 6.6. Áí èåùñçèåß ÷ñÞóéìï, åëÝã÷åôáé ç áðïõóßá ìüëõí óçò óå ðáñôßäåò ðåéñáìáôïöýôùí ðïõ äåí ðáñïõóéÜæïõí Ýíäåéîç ìüëõíóçò. Áðü êÜèå öõôü áöáéñåßôáé ôìÞìá ôïõ óôåëÝ÷ïõò ìÞêïõò 1 cm áðü óçìåßï åõñéóêüìåíï óå áðü óôáóç 2 cm ðÜíù áðü ôï óçìåßï ìüëõíóçò. Ïé éóôïß ïìïé ïãåíïðïéïýíôáé óå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá äéáâñï÷Þò. Åêôå ëåßôáé äïêéìÞ áðïìüíùóçò ìå ôçí ôå÷íéêÞ ôùí áñáéþóåùí óå óôåñåü õðüóôñùìá (ôìÞìá ÉÉÉ.5.1). ÅÜí ç äïêéìÞ áðï äåé÷èåß èåôéêÞ, ïé êáèáñÝò êáëëéÝñãåéåò ìå ÷áñáêôçñéóôé êÞ ìïñöïëïãßá ôáõôïðïéïýíôáé (ôìÞìá ÉÉ.4.1) êáé ïé êáë ëéÝñãåéåò ôïõ Ralstonia solanacearum åðéâåâáéþíïíôáé ìå äïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò (ôìÞìá ÉÉ.4.3). Åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôçò âéïäïêéìÞò Ç âéïäïêéìÞ åßíáé áñíçôéêÞ áí ôá öõôÜ äïêéìÞò äåí åß íáé ðñïóâåâëçìÝíá áðü ôï Ralstonia solanacearum õðü ôïí üñï üôé ôï Ralstonia solanacearum áíé÷íåýåôáé óôïõò èåôéêïýò ìÜñôõñåò. Ç âéïäïêéìÞ åßíáé èåôéêÞ áí ôá öõôÜ äïêéìÞò åßíáé ðñï óâåâëçìÝíá áðü ôï Ralstonia solanacearum. 7. ÄïêéìÞ åìðëïõôéóìïý (âáóßæåôáé óôçí åñãáóßá ôùí Elphinstone et. al., 1996) 3298 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 7.1. 100 ìl ôïõ áéùñÞìáôïò ôïõ éæÞìáôïò ìåôáöÝñïíôáé óå 3 ml ôñïðïðïéçìÝíïõ æùìïý SMSA (ðñïóÜñôçìá 7). 7.2. ÅðùÜæïíôáé ãéá 48 þñåò, åí ðÜóç äå ðåñéðôþóåé ü ÷é ðåñéóóüôåñï áðü 72 þñåò, óôïõò 280C äéáôçñþíôáò ôï êáðÜêé ôïõ óùëÞíá ðñïóáñìïóìÝíï ÷áëáñÜ ãéá íá áåñß æïíôáé. 7.3. Ôï êáðÜêé óößããåôáé êáé áêïëïõèåß áíÜäåõóç óå óõóêåõÞ vortex. ËáìâÜíåôáé êáôÜëëçëç ðïóüôçôá ãéá ôç äïêéìÞ ÉF (ôìÞìá ÉÉÉ.2), ôç äïêéìÞ ELISA (ôìÞìá ÉÉÉ.3) Þ/êáé ôç äïêéìÞ PCR (ôìÞìá ÉÉÉ.4). 8. ÄïêéìÞ ðáèïãÝíåéáò ÁíáöÝñåôáé óôï ôìÞìá ÉÉ.4.3. ÐñïóÜñôçìá 1 ÈñåðôéêÜ õëéêÜ ãéá ôçí áðïìüíùóç êáé êáëëéÝñãåéá ôïõ Ralstonia solanacearum Nutrient Agar (NA) Nutrient Agar (Difco) 23 g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï ÐáñáóêåõÜæïíôáé ðïóüôçôåò ½ ëßôñïõ áðü ôï èñåðôé êü õëéêü óå öéÜëåò 1 ëßôñïõ. Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ. Ôï õëéêü áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áêïëïõèåß øýîç ìÝ÷ñé ôïõò 500C êáé êáôáíÝìåôáé óå ôñõâëßá. Y e a s t - P e p t o n e - G l u c o s e - A g a r (YPGA) Yeast Extraict (Difco) 5g Bacto Peptone (Difco) 5g D (+) ãëõêüæç (ìïíïûäñéêÞ) 10g Bacto Agar (Difco) 15g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï ÐáñáóêåõÜæïíôáé ðïóüôçôåò ½ ëßôñïõ áðü ôï èñåðôé êü õëéêü óå öéÜëåò 1 ëßôñïõ. Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ. Ôï õëéêü áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áêïëïõèåß øýîç ìÝ÷ñé ôïõò 500C êáé êáôáíÝìåôáé óå ôñõâëßá. S u c r o s e P e p t o n e A g a r (SPA) Óáê÷áñüæç 20g Ðåðôüíç 5g Ê2HPO4 0,5g ÌgSO47H2O 0,25g Bacto Agar (Difco) 15g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï ÐáñáóêåõÜæïíôáé ðïóüôçôåò ½ ëßôñïõ áðü ôï èñåðôé êü õëéêü óå öéÜëåò 1 ëßôñïõ. Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé ñõèìßæåôáé ôï pH óå ìßá ôé ìÞ áðü 7,2 Ýùò 7,4 áí åßíáé áðáñáßôçôï. Ôï õëéêü áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áêïëïõèåß øýîç ìÝ÷ñé ôïõò 500C êáé êáôáíÝìåôáé óå ôñõâëßá. È ñ å ð ô é ê ü õ ë é ê ü K e l m a n's t e t r a z o l i u m Casamino acids (Difco) 1g Bacto Peptone (Difco) 10g Äåîôñüæç 5g Bacto Agar (Difco) 15g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï ÐáñáóêåõÜæïíôáé ðïóüôçôåò ½ ëßôñïõ áðü ôï èñåðôé êü õëéêü óå öéÜëåò 1 ëßôñïõ. Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ. Ôï õëéêü áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áêïëïõèåß øýîç ìÝ÷ñé ôïõò 500C. Ðñïóôßèåôáé õäáôéêü äéÜëõìá ÷ëùñéïý÷ïõ ôñéöáéíõëï ôåôñáæïëßïõ (Sigma), ôï ïðïßï Ý÷åé áðïóôåéñùèåß ìå äéÞ èçóç áðü ößëôñï, þóôå íá ëçöèåß ôåëéêÞ óõãêÝíôñùóç 50 mg áíÜ ëßôñï. Ôï óýíïëï êáôáíÝìåôáé óå ôñõâëßá. ÐñïóÜñôçìá 2 ÕëéêÜ ãéá ôçí ðñïåôïéìáóßá ôïõ äåßãìáôïò äïêéìÞò Ñ õ è ì é ó ô é ê ü ä é Ü ë õ ì á ä é á â ñ ï ÷ Þ ò: Ñõèìéóôé êü äéÜëõìá öùóöïñéêþí éüíôùí 50mÌ, pH 7,0. To åí ëüãù ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôç äéáâñï÷Þ éóôþí. Na2 HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g AðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. KáôáíÝìïíôáé êáôÜëëçëåò ðïóüôçôåò áíÜëïãá ìå ôéò á íÜãêåò. Ôï äéÜëõìá áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. ÊáôÜ ôç äéåîáãùãÞ ôçò äïêéìÞò PCR óõíéóôÜôáé ç ðñï óèÞêç äéáëýìáôïò poly vinyl pyrrolidone-40.000 (PVP-40) 5% ðñïêåéìÝíïõ íá ðåñéïñéóôåß ç ðáñåìðüäéóç ôçò óýí èåóçò DNA ëüãù ôçò ðáñïõóßáò áñùìáôéêþí ìïñßùí óôï åê÷ýëéóìá. Ãéá ôç äéáâñï÷Þ ôùí ôåìá÷ßùí ôùí éóôþí ôùí ãåùìÞ ëùí, óõíéóôÜôáé ç ðñïóèÞêç áíôéêñïêéäùôéêïý, áíôéáöñé óôéêïý ðáñÜãïíôá Þ áíôéïîåéäùôéêïý ìå ôçí åöáñìïãÞ ôçò äéáäéêáóßáò ïìïãåíïðïßçóçò Waring Blender Þ Ultra Turrax. Lubrol flakes 0,5 g áíÜ ëßôñï DC silicone antifoam 1,0 ml áíÜ ëßôñï Ðõñïöùóöïñéêü ôåôñáíÜôñéï 1,0 g áíÜ ëßôñï Ôï õëéêü áõôü áðïóôåéñþíåôáé îå÷ùñéóôÜ óå áõôüêáõ óôï. Áêïëïõèåß ðñïóèÞêç (óôï õëéêü äéáâñï÷Þò), Ýùò ü ôïõ ëçöèåß ç åðéèõìçôÞ óõãêÝíôñùóç. Ñ õ è ì é ó ô é ê ü ä é Ü ë õ ìá é æ Þ ì á ô ï ò: Ñõèìéóôéêü äéÜëõìá öùóöïñéêþí éüíôùí 10mM, pH 7,2. To åí ëüãù ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôïí åðáíáó÷çìáôéóìü áéùñÞìáôïò êáé ôçí áñáßùóç ôùí éæç ìÜôùí ôùí êþíùí ôïõ óçìåßïõ ðñüóöõóçò ôïõ óôïëïíßïõ ôùí ãåùìÞëùí. Na2HPO4×12H2O 2,7 g NaH2PO4×2H2O 0,4 g AðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. ÊáôáíÝìïíôáé êáôÜëëçëåò ðïóüôçôåò áíÜëïãá ìå ôéò á íÜãêåò. Ôï äéÜëõìá áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. ÐñïóÜñôçìá 3 ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ IF Ñõèìéóôéêü äéÜëõìá IF: öõóéïëïãéêüò ïñüò ìå ñõèìé óôéêü äéÜëõìá öùóöïñéêþí éüíôùí 10mM (PBS), pH 7,2. Ôï åí ëüãù ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôçí ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3299 áñáßùóç ôùí áíôéïñþí. Na2HPO4×12H2O 2,7 g NaH2PO4×2H2O 0,4 g NaCI 8,0 g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. ÊáôáíÝìïíôáé êáôÜëëçëåò ðïóüôçôåò áíÜëïãá ìå ôéò á íÜãêåò. Ôï äéÜëõìá áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Ñõèìéóôéêü äéÜëõìá IF - Tween Ôï åí ëüãù ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá ôï ðëýóéìï ôùí ðëáêþí. Ðñïóôßèåôáé 0,1% Tween 20 óôï ñõèìéóôéêü äéÜëõìá IF. 0,1 Ì öùóöïñéêü ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ãëõêåñßíçò, pH 7,6 Áõôü ôï ñõèìéóôéêü äéÜëõìá ÷ñçóéìïðïéåßôáé ùò ñåõ óôü ðñïóÞëùóçò óôá öáôíßá ôçò ðëÜêáò ôçò ÉF ãéá ôçí å íßó÷õóç ôïõ öèïñéóìïý. Ía2HPO4×12H2O 3,2 g NaH2PO4×2H2O 0,15 g Ãëõêåñßíç 50 ml ÁðïóôáãìÝíï íåñü 100 ml ÐñïóÜñôçìá 4 Ðñïóäéïñéóìüò ôïõ âáèìïý ìüëõíóçò óôç äïêéìÞ ÉF Åìâáäüí (S) ôïõ öáôíßïõ ìéáò ðïëõöáôíéáêÞò áíôéêåé ìåíïöüñïõ: üðïõ D=äéÜìåôñïò ôïõ öáôíßïõ (1) Åìâáäüí (s) ôïõ ïðôéêïý ðåäßïõ ôïõ áíôéêåéìåíéêïý: üðïõ d= äéÜìåôñïò ôïõ ïðôéêïý ðåäßïõ. (2) Ôï d õðïëïãßæåôáé åßôå ìå áðåõèåßáò ìÝôñçóç åßôå ìå ôïõò áêüëïõèïõò ôýðïõò: (3) üðïõ i = óõíôåëåóôÞò ðåäßïõ (åîáñôÜôáé áðü ôïí ôýðï ðñïóïöèáëìßïõ êáé êõìáßíåôáé ìåôáîý 8 êáé 24), Ê=óõíôåëåóôÞò óùëÞíá (1 Þ 1,25), G=ìåãåèõíôéêÞ éó÷ýò ôïõ áíôéêåéìÝíïõ (100x, 40x ê.ë.ð.) áðü ôïí (2) (4) áðü ôïí (3) MåôñÜôáé ï áñéèìüò ôùí ôõðéêþí öèïñéæüíôùí êõôôÜ ñùí áíÜ ðåäßï (c). Yðïëïãßæåôáé ï áñéèìüò ôùí ôõðéêþí öèïñéæüíôùí êõô ôÜñùí áíÜ öáôíßï (C). Yðïëïãßæåôáé ï áñéèìüò ôõðéêþí öèïñéæüíôùí êõôôÜ ñùí áíÜ ml éæÞìáôïò (Í) üðïõ y=üãêïò éæÞìáôïò óôï öáôíßï F=óõíôåëåóôÞò áñáßùóçò ôïõ éæÞìáôïò. ÐñïóÜñôçìá 5 ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ ÅLISA Aíèñáêéêü ñõèìéóôéêü äéÜëõìá åðéêÜëõøçò, äéðëÞò é ó÷ýïò, pH 9,6 Na2CO3 6,36 g NaHCO3 11,72 g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. ÊáôáíÝìïíôáé êáôÜëëçëåò ðïóüôçôåò áíÜëïãá ìå ôéò á íÜãêåò. Ôï äéÜëõìá áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áí ôï åã÷ýëéóìá ðåñéÝ÷åé ìåãüëï ðïóïóôü áñùìáôéêþí ìïñßùí, ìðïñåß íá ðñïóôåèåß, ùò áíôéïîåéäùôéêü, èåéþäåò íÜôñéï óå ôåëéêÞ óõãêÝíôñùóç 0,2%. Öõóéïëïãéêüò ïñüò ìå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá öùóöïñé êþí éüíôùí10 x (PBS), pH 7,4 NaCI 80 g KH2PO4 2 g Na2HPO4 ×12H2O 29 g KCI 2 g ÁðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. Ká ôáíÝìïíôáé êáôÜëëçëåò ðïóüôçôåò áíÜëïãá ìå ôéò áíÜãêåò. Ôï äéÜëõìá áðïóôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. 3300 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 4 2D S π = 4 2d s π = 422 2 xKG i s π = π s d 4 = GK ixKG i x d == π π 4 4 22 2 s S cC = xF y CxN 1000 = F Öõóéïëïãéêüò ïñüò ìå ñõèìéóôéêü äéÜëõìá öùóöïñé êþí éüíôùí - Ôween (PBS-T) 10 x PBS 100 ml 10% Tween 20 5 ml AðïóôáãìÝíï íåñü 895 ml Ñõèìéóôéêü ðñïóôáôåõôéêü äéÜëõìá (áíôéóùìÜôùí) (ðñÝðåé íá Ý÷åé ðáñáóêåõáóôåß ðñüóöáôá) 10 x PBS 10ml Polyvinylpyrrolidone-44000 MWT (PVP-44) 2 g 10% Tween 20 0,5 g ÃÜëá óå óêüíç 0,5 g ÁðïóôáãìÝíï íåñü Ýùò 100 ml ÄéÜëõìá õðïóôñþìáôïò áëêáëéêÞò öùóöáôÜóçò, pH 9,8 Äéáéèáíïëáìßíç 97 ml ÁðïóôáãìÝíï íåñü 800 ml Áíáìåéãíýïíôáé êáé ñõèìßæåôáé ç ôéìÞ ôïõ pH 9,8 ìå ðõ êíü ÇCI. Óõìðëçñþíåôáé áðïóôáãìÝíï íåñü ìÝ÷ñé ôåëéêïý ü ãêïõ 1 ëßôñïõ. Ðñïóôßèåíôáé 0,2 g ÌgCI2. Äéáëýïíôáé 2 äéóêßá õðïóôñþìáôïò öùóöáôÜóçò ôùí 5 mg (Sigma) áíÜ 15 ml äéáëýìáôïò. ÐñïóÜñôçìá 6 ÕëéêÜ ãéá ôç äïêéìÞ PCR Aêïëïõèßá ïëéãïíïõêëåïôéäßùí åêêéíçôþí: ÅêêéíçôÞò OLI -1 5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3´ ÅêêéíçôÞò Õ-2 5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT 3´ Ãéá ôá õëéêÜ âëÝðå ôçí åñãáóßá ôùí Seal et. al. (1993). ÐñïóÜñôçìá 7 ÕëéêÜ ãéá ôçí åêëåêôéêÞ áðïìüíùóç åðß óôåñåïý èñåðôéêïý õðïóôñþìáôïò êáé äïêéìÝò åìðëïõôéóìïý Åêëåêôéêü èñåðôéêü õëéêü SMSA (Ångelbrecht 1994, ü ðùò ôñïðïðïéÞèçêå áðü ôïí Elphinstone et al., 1996) Báóéêü èñåðôéêü õëéêü Casamino acids (Difco) 1 g Bacto peptone (Difco) 10 g Ãëõêåñßíç 5 ml ¢ãáñ (Difco) 15 g AðïóôáãìÝíï íåñü 1 ëßôñï ÐáñáóêåõÜæïíôáé ðïóüôçôåò ½ ëßôñïõ áðü ôï èñåðôé êü õëéêü óå öéÜëåò 1 ëßôñïõ. Äéáëýïíôáé ôá óõóôáôéêÜ êáé åëÝã÷åôáé ç ôéìÞ ôïõ pH. Ðñéí áðü ôçí áðïóôåßñùóç óå áõôüêáõóôï ñõèìßæåôáé ôï pH óôçí ôéìÞ 6,5, áí êñßíåôáé áðáñáßôçôï. Ôï Ralstonia solanacearum äåí áíáðôýóóåôáé óùóôÜ óôï èñåðôéêü õ ëéêü, áí ôï pH åßíáé ìåãáëýôåñï ôïõ 7,0. Ôï õëéêü áðï óôåéñþíåôáé óå áõôüêáõóôï óôïõò 1210C åðß 15 ëåðôÜ. Áêïëïõèåß øýîç ìÝ÷ñé ôïõò 500C. Ðñïóôßèåíôáé ôá áêüëïõèá óõóôáôéêÜ (üëá ôçò Sigma) þóôå íá ëçöèïýí ïé ðñïäéáãåãñáììÝíåò ôåëéêÝò óõãêå íôñþóåéò. Crystal violet 5 mg áíÜ ëßôñï ÈåééêÞ ðïëõìéîßíç  100 mg áíÜ ëßôñï (ðåñßðïõ 600.000 ìïíÜäåò) Sigma P-1004 Báêéôñáêßíç (*) 25 mg áíÜ ëßôñï (ðåñßðïõ 1250 ìïíÜäåò) Sigma P-0125 ×ëùñáìöåíéêüëç 5 mg áíÜ ëßôñï Sig ma C-3175 Ðåíéêéëßíç - G 0,5 mg áíÜ ëßôñï (ðåñßðïõ 825 ìïíÜäåò) Sigma P-3032 ¢ëáôá ôåôñáæïëßïõ 50 mg áíÜ ëßôñï Ôá óõóôáôéêÜ äéáëýïíôáé óå áéèáíüëç 70% ìÝ÷ñé íá ëç öèïýí ïé ôåëéêÝò óõãêåíôþóåéò ãéá ôïí üãêï ôïõ èñåðôé êïý õëéêïý ðïõ ðñüêåéôáé íá ðáñáóêåõáóèåß. ÏñéóìÝíá óõóôáôéêÜ, üðùò ç ðïëõìéîßíç  êáé ç ÷ëùñáìöåíéêüëç á ðáéôïýí åëáöñÜ èÝñìáíóç êáé áíÜäåõóç. Æùìüò SMSA (Elphinstone et. al., 1996) ÐáñáóêåõÜæåôáé üðùò êáé ôï SMSA åêëåêôéêü õëéêü, áëëÜ ðáñáëåßðåôáé ôï Üãáñ. ÊáôáíÝìåôáé óå ðïóüôçôåò ôùí 3ml óå óùëÞíåò Univer sal ìéÜò ÷ñÞóçò ôùí 30 ml. (*) Áí ÷ñåéÜæåôáé, åßíáé äõíáôü, áõîÜíïíôáò ôç óõãêÝíôñùóç ôçò âáêéôñáêßíçò óå 300 ppm, íá ðåñéïñéóèåß ç åðéìüëõíóç áðü óáðñï öõôéêÜ âáêôçñßäéá ÷ùñßò íá ìåéùèåß ç áíÜêôçóç ôïõ Ralstonia solanacearum. Béâëéïãñáößá Buddenhagen, I.W; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic di versity of Pseudomonas solanacearum: detection of re striction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molec ular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clav ibacter-michiganensis subsp. sepedonicus from compos ite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Elphinstone, J.G.; Hennessy, J. ; Wilson. J. and Stead, D. E. 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selec tive medium for the isolation and quantification of Pseu domonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum.Journal of Applied Bacteriology 27, 265 277. Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt:the disease and its causative agent, Pseu domonas solanacearum (eds, A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135. Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J.D., 1991. Infra-and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345. Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695. Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diag nosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 p. ÖÅÊ 214 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3301 Louws, F.J; Fulbright, D.W; Stephens, C.T. and De Brui jn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicaroria. Phytopathology 85, 528-536. Lozano, J.C. and Sequeira, L. 1970.Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique, Phytopathology 60, 838. Mirza, M.S; Rademaker, J.W.L;, Janse, J.D. and Akker mans, A.D.L., 1993, Specific 16S ribosomal RNA targered oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian journal of Microbiology 39, 1029-1034. Robinson-Smith, A.; Jones, P.Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseu domonas solanacearum, the causative of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P.picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by poly merase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268. Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identi fying plant pathogenic bacteria.In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L.Tor rance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111. Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. De tection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonuckeotide probe. Zuchtugsforschung 2, 266-269. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ ÉÉÉ 1. Ãéá êÜèå ðéèáíïëïãïýìåíç åìöÜíéóç ãéá ôçí ïðïßá õ ðÜñ÷åé èåôéêü áðïôÝëåóìá áðü ôçí Þ ôéò ìáæéêÝò äïêéìÝò ãéá ìåí ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ìå ôç ìÝèïäï ôïõ ðáñáñôÞìáôïò ÉÉ, ãéá äå üëåò ôéò Üëëåò ðåñéðôþóåéò ìå ï ðïéáäÞðïôå Üëëç åðéóÞìùò åãêåêñéìÝíç ìÝèïäï, êáé ãéá ôçí ïðïßá áíáìÝíåôáé åðéâåâáßùóç Þ äéÜøåõóç ìå ôçí åí ëüãù ìÝèïäï, ðáñáêñáôïýíôáé êáé öõëÜóóïíôáé êáôáë ëÞëùò: óôï ìÝôñï ôïõ äõíáôïý, ç ðáñôßäá, Þ ìÝñïò ôçò ðáñôß äáò (áðü ôçí ïðïßá Ý÷åé ëçöèåß ôï äåßãìá) óôçí áñ÷éêÞ ôçò óõóêåõáóßá ìå ôçí åôéêÝôá, óôï ìÝôñï ôïõ äõíáôïý, êÜèå åíáðïìÝíïí ôìÞìá ôùí äåéãìÜôùí, êÜèå åíáðïìÝíïí åê÷ýëéóìá êáé õëéêü ðïõ ÷ñçóéìï ðïéÞèçêå ãéá ôçí Þ ôéò ìáæéêÝò äïêéìÝò ð.÷. áíôéêåéìåíï öüñïé áíïóïöèïñéóìïý êáé üëç ç ó÷åôéêÞ ôåêìçñßùóç, ìÝ÷ñé ôçí ïëïêëÞñùóç ôçò åí ëüãù ìåèüäïõ. 2. Óå ðåñßðôùóç åðéâåâáßùóçò ôçò ðáñïõóßáò ôïõ ïñ ãáíéóìïý, ðáñáêñáôåßôáé êáé öõëÜóóåôáé êáôáëëÞëùò: ôï õëéêü ðïõ áíáöÝñåôáé óôçí ðáñÜãñáöï 1 êáé Ýíá äåßãìá ôïõ ìïëõóìÝíïõ õëéêïý ôïìÜôáò Þ ìåëéôæÜ íáò ôï ïðïßï Ý÷åé åìâïëéáóôåß ìå åê÷ýëéóìá êïíäýëïõ Þ öõôïý, êáôÜ ðåñßðôùóç êáé ç áðïìåìïíùìÝíç êáëëéÝñãåéá ôïõ ïñãáíéóìïý, ãéá ôïõëÜ÷éóôïí Ýíá ìÞíá ìåôÜ ôç äéáäéêáóßá ãíùóôï ðïßçóçò âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 2. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ IV Ôá óôïé÷åßá ôùí åëÝã÷ùí ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï Üñèñï 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á), óçìåßï i), ðåñéëáìâÜíïõí êá ôÜ ðåñßðôùóç: i) ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò, üðïõ êáëëéåñãïýíôáé Þ Ý÷ïõí êáëëéåñãçèåß ðáôÜôåò ðïõ Ý÷ïõí êëùíéêÞ ó÷Ýóç ìå ôéò ìïëõóìÝíåò áðü ôïí ïñ ãáíéóìü ðáôÜôåò, üðïõ êáëëéåñãïýíôáé Þ Ý÷ïõí êáëëéåñãçèåß ôïìÜôåò ðïõ Ý÷ïõí ôçí ßäéá ðñïÝëåõóç ìå ôéò ìïëõóìÝíåò áðü ôïí ïñãáíéóìü ôïìÜôåò, üðïõ êáëëéåñãïýíôáé Þ Ý÷ïõí êáëëéåñãçèåß ðáôÜôåò Þ ôïìÜôåò ïé ïðïßåò õðüêåéíôáé óå åðßóçìï Ýëåã÷ï ëüãù ôçò ðéèáíïëïãïýìåíçò åìöÜíéóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, üðïõ êáëëéåñãïýíôáé Þ Ý÷ïõí êáëëéåñãçèåß ðáôÜôåò ðïõ Ý÷ïõí êëùíéêÞ ó÷Ýóç ìå ðáôÜôåò ðïõ êáëëéåñãïýíôáé óå ìïëõóìÝíïõò áðü ôïí ïñãáíéóìü ôüðïõò, -üðïõ êáëëéåñãïýíôáé ðáôÜôåò Þ ôïìÜôåò ðïõ ãåéôíéÜ æïõí ìå ìïëõóìÝíïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò, óõìðåñéëáì âáíïìÝíùí åêåßíùí ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýí ôïí ßäéï åîïðëé óìü êáé åãêáôáóôÜóåéò ðáñáãùãÞò áðåõèåßáò Þ ìÝóù êïéíïý áíáäü÷ïõ, ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýí åðéöáíåéáêü íåñü ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü áðü ðçãÝò ãéá ôéò ïðïßåò Ý÷åé åðéâåâáéùèåß Þ ðé èáíïëïãåßôáé üôé Ý÷ïõí ìïëõíèåß áðü ôïí ïñãáíéóìü, ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýí åðéöáíåéáêü íåñü ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü áðü ðçãÝò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé áðü êïéíïý ìå ôüðïõò ðáñáãùãÞò ãéá ôéò ïðïßåò Ý÷åé åðéâåâáéùèåß Þ ðé èáíïëïãåßôáé üôé Ý÷ïõí ìïëõíèåß áðü ôïí ïñãáíéóìü, ðïõ ðëçììõñßæïõí Þ Ý÷ïõí ðëçììõñßóåé ìå åðéöáíåéá êü íåñü ãéá ôï ïðïßï Ý÷åé åðéâåâáéùèåß Þ ðéèáíïëïãåßôáé üôé Ý÷åé ìïëõíèåß áðü ôïí ïñãáíéóìü êáé ii) ôï åðéöáíåéáêü íåñü ôï ïðïßï ÷ñçóéìïðïéÞèçêå ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü óôïí Þ ôïõò áãñïýò Þ óôïí Þ ôïõò ôü ðïõò ðáñáãùãÞò ãéá ôïõò ïðïßïõò Ý÷åé åðéâåâáéùèåß üôé åßíáé ìïëõóìÝíïé áðü ôïí ïñãáíéóìü Þ ôï ïðïßï ðëçììý ñéóå ôïõò åí ëüãù áãñïýò Þ ôüðïõò ðáñáãùãÞò. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ V 1. Ôá óôïé÷åßá ôïõ ðñïóäéïñéóìïý ôçò Ýêôáóçò ôçò ðé èáíÞò ìüëõíóçò âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iii êáé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, ðåñéëáìâÜíïõí, êáôÜ ðåñßðôùóç: ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ ðáñÜãåôáé óå ôü ðï ðáñáãùãÞò ÷áñáêôçñéóìÝíï ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1 óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, ôïí Þ ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ðïõ óõíäÝïíôáé ìå ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1 óôïé÷åßï 3302 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) á, óçìåßï ii, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí åêåßíùí ðïõ ÷ñçóéìï ðïéïýí ôïí ßäéï åîïðëéóìü êáé åãêáôáóôÜóåéò ðáñáãùãÞò áðåõèåßáò Þ ìÝóù êïéíïý áíáäü÷ïõ, ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ ðáñÜãåôáé óôïí Þ ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ðïõ áíáöÝñïíôáé óôçí ðñïç ãïýìåíç ðåñßðôùóç, Þ ðïõ õðÞñ÷å óôïí Þ óôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò êáôÜ ôçí ßäéá ðåñßïäï êáôÜ ôçí ïðïßá ôï êá ôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ ÷áñáêôçñßóôçêå ùò ìïëõ óìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óç ìåßï ii, õðÞñ÷å óôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò, ðïõ áíáöÝñï íôáé óôçí ðñþôç ðåñßðôùóç, ôéò áðïèÞêåò ðïõ äéáêéíïýí ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðñïÝëåõóçò ôùí áíùôÝñù ôüðùí ðáñáãùãÞò, êÜèå ìç÷Üíçìá, ü÷çìá, ðåñéÝêôç, áðïèÞêç Þ ìïíÜäá áõôþí êáé êÜèå Üëëï áíôéêåßìåíï, óõìðåñéëáìâáíüìåíùí ôùí õëéêþí óõóêåõáóßáò, ðïõ åíäÝ÷åôáé íá Ý÷ïõí Ýëèåé óå åðáöÞ ìå ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ÷áñáêôçñé óìÝíï ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, êÜèå êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ Ý÷åé áðïèçêåõ ôåß Þ Þëèå óå åðáöÞ, ìå ïðïéáäÞðïôå êáôáóêåõÞ Þ áíôé êåßìåíï ðïõ áðáñéèìåßôáé óôçí ðñïçãïýìåíç ðåñßðôùóç ðñéí áðü ôïí êáèïñéóìü êáé ôçí áðïëýìáíóç áõôþí ôùí êáôáóêåõþí êáé áíôéêåéìÝíùí, âÜóåé ôùí áðïôåëåóìÜôùí ôùí åëÝã÷ùí êáé ôùí äïêé ìþí ðïõ äéåíåñãïýíôáé óýìöùíá ìå ôï Üñèñï 5 ðáñÜ ãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï i, ãéá ôéò ðáôÜôåò, ôïõò êïí äýëïõò Þ öõôÜ ìå áäåëöéêÞ Þ ãïíéêÞ êëùíéêÞ ó÷Ýóç, êáé, ãéá ôéò ôïìÜôåò, ôá öõôÜ ôçò ßäéáò ðñïÝëåõóçò, ìå ôï êá ôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ ÷áñáêôçñßóôçêå ùò ìïëõ óìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óç ìåßï ii, êáé ôá ïðïßá, ìïëïíüôé åíäÝ÷åôáé íá Ýäùóáí áñíç ôéêÜ áðïôåëÝóìáôá êáôÜ ôéò äïêéìÝò áíß÷íåõóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, êñßíåôáé ðéèáíüí íá åßíáé ìïëõóìÝíá ëüãù êëùíéêÞò ó÷Ýóçò, ôïí Þ ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ðïõ áíáöÝñåôáé óôçí ðñïçãïýìåíç ðåñß ðôùóç, ôïí Þ ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýí íåñü ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü ôï ïðïßï Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíï âÜ óåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü ðïõ Ý÷åé ðáñá÷èåß óå áãñïýò ïé ïðïßïé Ý÷ïõí ðëçììõñßóåé ìå åðéöáíåéáêü íåñü ãéá ôï ïðïßï Ý÷åé åðéâåâáéùèåß üôé Ý÷åé ìïëõíèåß áðü ôïí ïñãáíéóìü. 2. Ï ðñïóäéïñéóìüò ôçò ðéèáíÞò ìåôÜäïóçò ðïõ áíá öÝñåôáé óôï Üñèñï 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iv êáé ôï Üñèñï 5, ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, ðå ñéëáìâÜíåé: i) óôéò ðåñéðôþóåéò âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á óçìåßï iv, ôá áêüëïõèá óôïé÷åßá ðïõ ðñÝðåé íá ëáìâÜíïíôáé õðüøç: ôç ãåéôíßáóç Üëëùí ôüðùí ðáñáãùãÞò üðïõ êáëëéåñ ãåßôáé ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, ôç óõíÞèç ðáñáãùãÞ êáé ÷ñçóéìïðïßçóç ôïõ óõãêå êñéìÝíïõ áðïèÝìáôïò ðáôáôüóðïñïõ, ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýí åðéöá íåéáêü íåñü ãéá Üñäåõóç Þ øåêáóìü ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý óå ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò õðÜñ÷åé Þ õðÞñîå êßíäõíïò áðïññïþí åðéöáíåéáêïý íåñïý áðü êáëëéåñãÞóéìá åäÜöç ðïõ Ý÷ïõí ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìï ëõóìÝíá âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á), óçìåßï ii), Þ ðëçììýñáò ôùí åäáöþí áõôþí áðü åðéöáíåé áêü íåñü. ii) óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò ôï åðéöáíåéáêü íå ñü ÷áñáêôçñßóôçêå ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï ii: ôïí Þ ôïõò ôüðïõò ðáñáãùãÞò ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ðïõ ãåéôíéÜæïõí Þ ðïõ õðÜñ÷åé êßíäõíïò íá ðëçììõñßóïõí ìå åðéöáíåéáêü íåñü ÷áñáêôçñéóìÝíï ùò ìïëõóìÝíï, ïðïéáäÞðïôå ìç óõññÝïõóá áñäåõôéêÞ ëåêÜíç ðïõ óõíäÝåôáé ìå ôï åðéöáíåéáêü íåñü ðïõ Ý÷åé ÷áñáêôçñé óèåß ùò ìïëõóìÝíï. 3. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ãíùóôïðïßçóçò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï Üñèñï 5 ðáñÜãñáöïò 2, ðñþôï åäÜöéï, ðåñéëáìâÜ íïõí: ôçí çìåñïìçíßá ãíùóôïðïßçóçò ôçò ðéèáíïëïãïýìå íçò åìöÜíéóçò âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 4 êáé ôéò çìåñïìçíßåò ôùí äåéãìáôïëçøéþí êáé ôçò åðéâåâáßùóçò ôçò ðáñïõ óßáò ôïõ ïñãáíéóìïý âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5, êáôÜ ðåñßðôù óç, ðåñéãñáöÞ ôùí óôïé÷åßùí ôçò ðñïóäéïñéóèåßóáò ìü ëõíóçò êáé ôçò ïñéïèÝôçóçò ôçò æþíçò. 4. Ïé ëåðôïìÝñåéåò ôçò ðñüóèåôçò ãíùóôïðïßçóçò ðïõ áíáöÝñåôáé óôï Üñèñï 5 ðáñÜãñáöïò 2, äåýôåñï åäÜ öéï, ðåñéëáìâÜíïõí: ãéá êÜèå áðïóôïëÞ Þ ðáñôßäá ðáôÜôáò ðïõ Ý÷åé ÷áñá êôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíç, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôá ðéóôïðïéç ôéêÜ ðïõ ïñßæïíôáé óôá Üñèñá 7 êáé 8 ôïõ Ð.Ä. 332/1995 (178Á), ôïí áñéèìü äéáâáôçñßïõ Þ ôïí áñéèìü ìçôñþïõ ôïõ ðáôáôïðáñáãùãïý, ôçò óõíåôáéñéóôéêÞò áðïèÞêçò êáé ôïõ êÝíôñïõ áðïóôïëÞò, ãéá êÜèå áðïóôïëÞ Þ ðáñôßäá ôïìÜôáò ðïõ Ý÷åé ÷áñá êôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíç, ôá ðéóôïðïéçôéêÜ ðïõ ïñßæïíôáé óôá Üñèñá 7 Þ 8 ôïõ Ð.Ä. 332/1995 (178Á) êáé ôïí áñéèìü äéáâáôçñßïõ, óýìöùíá ìå ôïí êáôÜëïãï ôïõ ðáñáñôÞìá ôïò V, ìÝñïò Á, ôìÞìá É óçìåßï 2.2 ôïõ Ð.Ä. 332/1995 (178Á). ôçí ïíïìáóßá êáé ôçí êáôçãïñßá ôçò ðïéêéëßáò ãéá ôá á ðïèÝìáôá ðáôáôüóðïñïõ êáé, üðïõ åßíáé äõíáôü, ãéá üëåò ôéò Üëëåò ðåñéðôþóåéò, ïðïéáäÞðïôå Üëëç ðëçñïöïñßá ãéá ôï åðéâåâáéùèÝí êñïýóìá ôçí ïðïßá áðáéôåß ç åðéôñïðÞ. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ VI 1. ́Ïóïí áöïñÜ ôï Üñèñï 6 ðáñÜãñáöïò 1, ïé äéáôÜîåéò åßíáé ïé åîÞò: êáýóç Þ ÷ñÞóç ùò æùïôñïöÞ ìåôÜ áðü èåñìéêÞ åðåîåñãáóßá þóôå íá ìçí õðÜñ÷åé êßíäõíïò åðéâßùóçò ôïõ ïñãáíéóìïý Þ ìå åéò âÜèïò ôáöÞ óå ôïðïèåóßá äéÜèåóçò óôçí ïðïßá äåí õðÜñ÷åé êßíäõíïò äéÞèçóçò óå ãåùñãéêÜ åäÜöç Þ å ðáöÞò ìå ðçãÝò íåñïý ðïõ ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé ãéá Üñäåõóç ãåùñãéêþí åäáöþí Þ âéïìç÷áíéêÞ ìåôáðïßçóç ìÝóù áðåõèåßáò êáé Üìåóç ðáñÜäïóç óå ìåôáðïéçôéêÞ ìïíÜäá ìå åðéóÞìùò åãêåêñé ìÝíåò åãêáôáóôÜóåéò äéÜèåóçò áðïâëÞôùí ïé ïðïßåò á íôáðïêñßíïíôáé óôéò äéáôÜîåéò ôïõ ðáñáñôÞìáôïò VII ôçò ðáñïýóçò ïäçãßáò Þ Üëëá ìÝôñá, ìå ôçí ðñïûðüèåóç üôé Ý÷åé äéáðéóôùèåß üôé äåí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãá ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3303 íéóìïý? ôá ìÝôñá áõôÜ ðñÝðåé íá ãíùóôïðïéïýíôáé áìÝ óùò óôçí åðéôñïðÞ. êáé ôá Üëëá êñÜôç ìÝëç. 2. Ç êáôÜëëçëç ÷ñÞóç Þ äéÜèåóç ôïõ êáôá÷ùñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý ðïõ áíáöÝñåôáé óôï Üñèñï 6 ðáñÜãñá öïò 2, õðü ôïí Ýëåã÷ï ôçò áñìüäéáò áñ÷Þò, ìå ôçí êá ôÜëëçëç óõíåñãáóßá ìåôáîý ôùí áñìüäéùí åðßóçìùí öï ñÝùí þóôå íá åîáóöáëßæåôáé ðÜíôïôå ï Ýëåã÷ïò áõôüò êáé ìå ôçí ÝãêñéóÞ ôçò üóïí áöïñÜ ôéò åãêáôáóôÜóåéò äéÜèå óçò áðïâëÞôùí üðïõ óõóêåõÜæïíôáé Þ ìåôáðïéïýíôáé ðá ôÜôåò åßíáé ç áêüëïõèç: i) ãéá ôïõò êïíäýëïõò ðáôÜôáò, ÷ñÞóç ùò ðáôÜôåò åìðïñßïõ ãéá êáôáíÜëùóç êáé óõ óêåõáóìÝíåò óå ÷þñïõò ìå êáôÜëëçëåò åãêáôáóôÜóåéò äéÜèåóçò áðïâëÞôùí, Ýôïéìåò ãéá Üìåóç ðáñÜäïóç êáé ÷ñÞóç ÷ùñßò íÝá óõóêåõáóßá, êáé ðïõ ðñïïñßæïíôáé ãéá ôÝôïéïõ åßäïõò Üìåóç ðáñÜäïóç êáé ÷ñÞóç Þ ÷ñÞóç ùò ðáôÜôåò åìðïñßïõ ãéá âéïìç÷áíéêÞ ìåôáðïß çóç, ðïõ ðñïïñßæïíôáé ãéá áðåõèåßáò êáé Üìåóç ðáñÜäï óç óå ìåôáðïéçôéêÞ ìïíÜäá ìå êáôÜëëçëåò åãêáôáóôÜ óåéò äéÜèåóçò áðïâëÞôùí Þ Üëëç ÷ñÞóç Þ äéÜèåóç, ìå ôçí ðñïûðüèåóç üôé Ý÷åé äéá ðéóôùèåß üôé äåí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáé åöüóïí Ý÷åé ÷ïñçãçèåß Ýãêñéóç. Ôá ìÝôñá áõôÜ ãíùóôïðïéïýíôáé áìÝóùò óôçí åðéôñïðÞ. êáé ôá ëïéðÜ êñÜôç ìÝëç, ii) ãéá Üëëá ìÝñç ôùí öõôþí, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí õðïëåéììÜôùí âëáóôþí êáé öõëëþìáôïò, êáôáóôñïöÞ Þ Üëëç ÷ñÞóç Þ äéÜèåóç, ìå ôçí ðñïûðüèåóç üôé Ý÷åé äéá ðéóôùèåß üôé äåí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý? ôá ìÝôñá áõôÜ ðñÝðåé íá ãíùóôïðïéïý íôáé óôçí åðéôñïðÞ êáé ôá Üëëá êñÜôç ìÝëç. 3. Ïé êáôÜëëçëåò ìÝèïäïé áðïëýìáíóçò ôùí áíôéêåéìÝ íùí ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï Üñèñï 6 ðáñÜãñáöïò 3 ðñÝðåé íá åßíáé ï êáèïñéóìüò êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ç áðïëýìáí óç, Ýôóé þóôå íá ìçí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò ìåôÜäï óçò ôïõ ïñãáíéóìïý êáé ðñÝðåé íá åöáñìüæïíôáé õðü ôçí åðïðôåßá ôçò áñìüäéáò áñ÷Þò. 4. Ç óåéñÜ ìÝôñùí ðïõ åöáñìüæïíôáé óôçí Þ ôéò æþíåò ðïõ ïñéïèåôïýíôáé âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iv êáé óôïé÷åßï ã, óçìåßï iii, êáé áíáöÝ ñïíôáé óôï Üñèñï 6 ðáñÜãñáöïò 4, ðåñéëáìâÜíåé: 4.1. Óå ôüðïõò ðáñáãùãÞò ðïõ ÷áñáêôçñßæïíôáé ùò ìï ëõóìÝíïé âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii: á) óå áãñü Þ ìïíÜäá ìå ðñïóôáôåõìÝíåò êáëëéÝñãåéåò ðïõ ÷áñáêôçñßæïíôáé ùò ìïëõóìÝíåò âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, åßôå i) êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôïõëÜ÷éóôïí ôåóóÜñùí êáëëéåñãçôé êþí åôþí ìåôÜ ôï Ýôïò ôçò ðñïóäéïñéóèåßóáò ìüëõíóçò, ëáìâÜíïíôáé ìÝôñá ãéá ôçí åîÜëåéøç ôùí áõôïöõþí öõôþí ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò êáé Üëëùí îåíéóôþí ôïõ ïñ ãáíéóìïý óõìðåñéëáìâáíüìåíùí ôùí æéæáíßùí ôçò ïéêï ãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí êáé äåí öõôåýïíôáé: êüíäõëïé Þ öõôÜ ðáôÜôáò, öõôÜ êáé óðüñïé ôïìÜôáò, áíÜëïãá ìå ôç âéïëïãßá ôïõ ïñãáíéóìïý, Üëëïé îåíéóôÝò, öõôÜ ôïõ åßäïõò Brassica, óôá ïðïßá õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò åðéâßùóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáëëéÝñãåéåò óôéò ïðïßåò õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò å îÜðëùóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáôÜ ôçí ðñþôç êáëëéåñãçôéêÞ ðåñßïäï ðáôÜôáò Þ ôï ìÜôáò ìåôÜ ôçí ðåñßïäï ðïõ êáèïñßæåôáé óôçí ðñïçãïý ìåíç ðåñßðôùóç, êáé õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé ï áãñüò åß íáé áðáëëáãìÝíïò áðü áõôïöõÞ öõôÜ ôïìÜôáò êáé ðáôÜ ôáò êáé Üëëá öõôÜ îåíéóôÝò óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí æéæáíßùí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí, ðñÝðåé ãéá äýï ôïõëÜ÷éóôïí óõíáðôÜ êáëëéåñãçôéêÜ Ýôç ðñéí ôç öýôåõ óç, óôçí ðåñßðôùóç ôçò ðáôÜôáò, íá öõôåýåôáé åðéóÞìùò ðéóôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò ìüíï ãéá ðáñáãùãÞ ðá ôÜôáò åìðïñßïõ êáé, íá äéåîÜãåôáé åðßóçìç Ýñåõíá óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí äïêéìþí, üðùò ðñïâëÝðåôáé óôï Üñèñï 2 ðáñÜãñá öïò 1, êáôÜ ôçí êáëëéåñãçôéêÞ ðåñßïäï ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò ìåôÜ ôçí ðåñßïäï ðïõ êáèïñßæåôáé óôçí ðñïçãïýìåíç ðå ñßðôùóç êáé óýìöùíá ìå Ýíá êáôÜëëçëï óýóôçìá áìåéøé óðïñÜò, öõôåýåôáé, óôçí ðåñßðôùóç ôçò ðáôÜôáò, åðéóÞ ìùò ðéóôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò ãéá ðáñáãùãÞ åßôå ðáôáôüóðïñïõ åßôå ðáôÜôáò åìðïñßïõ êáé, óôçí ðåñßðôù óç ôçò ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò, ðñáãìáôïðïéåßôáé åðßóçìïò Ýëåã÷ïò üðùò êáèïñßæåôáé óôï Üñèñï 2 ðáñÜãñáöïò 1 Þ ii) êáôÜ ôá ðÝíôå êáëëéåñãçôéêÜ Ýôç ìåôÜ ôçí ðåñßïäï ôçò ðñïóäéïñéóèåßóáò ìüëõíóçò, ëáìâÜíïíôáé ìÝôñá ãéá ôçí åîÜëåéøç ôùí áõôïöõþí öõôþí ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò êáé Üëëùí îåíéóôþí ôïõ ïñ ãáíéóìïý, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí æéæáíßùí ôçò ïéêï ãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí êáé ï áãñüò äéáôçñåßôáé, êáôÜ ôá ðñþôá ôñßá Ýôç, åßôå ÷Ýñ óïò åßôå ìå óéôçñÜ áíÜëïãá ìå ôïí ðñïóäéïñéóèÝíôá êßí äõíï, åßôå ùò ìüíéìïò âïóêüôïðïò óôïí ïðïßï ç âëÜóôç óç êüâåôáé óõ÷íÜ êáé ÷áìçëÜ Þ ï ïðïßïò ÷ñçóéìïðïéåßôáé ãéá åíôáôéêÞ âüóêçóç Þ ùò ÷ïñôïíïìÞ ãéá ðáñáãùãÞ óðüñùí? ç öýôåõóç êáôÜ ôá áêüëïõèá äýï Ýôç ðñáãìá ôïðïéåßôáé ìå öõôÜ ðïõ äåí åßíáé îåíéóôÝò ôïõ ïñãáíéóìïý ãéá ôá ïðïßá äåí õðÜñ÷åé åìöáíÞò êßíäõíïò åðéâßùóçò Þ äéÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáôÜ ôçí ðñþôç êáëëéåñãçôéêÞ ðåñßïäï ðáôÜôáò Þ ôï ìÜôáò ìåôÜ ôçí ðåñßïäï ðïõ êáèïñßæåôáé óôçí ðñïçãïý ìåíç ðåñßðôùóç, óôçí ðåñßðôùóç ôçò ðáôÜôáò, öõôåýåôáé åðéóÞìùò ðé óôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò ãéá ðáñáãùãÞ åßôå ðáôáôü óðïñïõ åßôå ðáôÜôáò åìðïñßïõ, êáé äéåîÜãåôáé åðßóçìç ìåëÝôç, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí äïêéìþí, üðùò êáèïñßæåôáé óôï Üñèñï 2 ðáñÜãñáöïò 1. â) óå Üëëïõò áãñïýò: êáôÜ ôï êáëëéåñãçôéêü Ýôïò ìåôÜ ôçí ðñïóäéïñéóèåßóá ìüëõíóç: åßôå äåí öõôåýïíôáé êüíäõëïé Þ öõôÜ ðáôÜôáò, Þ Üëëá öõôÜ îåíéóôÝò ôïõ ïñãáíéóìïý, êáé ëáìâÜíïíôáé ìÝôñá ãéá ôçí åîÜëåéøç ôùí áõôïöõþí öõôþí ðáôÜôáò êáé ôïìÜ ôáò êáé Üëëùí îåíéóôþí, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí æéæá íßùí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí Þ óôçí ðåñßðôùóç ôùí êïíäýëùí ðáôÜôáò, öõôåýåôáé å ðéóÞìùò ðéóôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò ãéá ðáñáãùãÞ ðáôÜôáò åìðïñßïõ ìüíï, õðü ôçí ðñïûðüèåóç üôé ç áñ ìüäéá áñ÷Þ êñßíåé üôé Ý÷åé åîáëåéöèåß ï êßíäõíïò ìåôÜäï óçò ôïõ ïñãáíéóìïý áðü áõôïöõÞ öõôÜ ðáôÜôáò êáé ôï ìÜôáò Þ Üëëïõò îåíéóôÝò ôïõ ïñãáíéóìïý, óõìðåñéëáì âáíïìÝíùí ôùí æéæáíßùí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí. Ôá êáëëéåñãïýìåíá öõôÜ åðéèåùñïýíôáé ôçí êáôÜëëçëç óôéãìÞ, ôá äå ôõ÷üí áõôïöõÞ öõôÜ ðáôÜôáò õðïâÜëëï 3304 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) íôáé óå äïêéìÞ ãéá ôçí áíß÷íåõóç ôïõ ïñãáíéóìïý? åðé ðëÝïí, ãéá ôéò ðáôÜôåò ðñÝðåé íá åëÝã÷ïíôáé ïé óõãêïìé æüìåíïé êüíäõëïé, êáôÜ ôï ðñþôï êáëëéåñãçôéêü Ýôïò ìåôÜ ôï êáèïñéæü ìåíï óôçí ðñïçãïýìåíç ðåñßðôùóç, óôçí ðåñßðôùóç ôçò ðáôÜôáò, öõôåýåôáé ìüíïí åðéóÞ ìùò ðéóôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò ãéá ðáñáãùãÞ åßôå ðáôáôüóðïñïõ åßôå ðáôÜôáò åìðïñßïõ, ôïõëÜ÷éóôïí ãéá ôï äåýôåñï êáëëéåñãçôéêü Ýôïò ìåôÜ ôï êáèïñéæüìåíï óôçí ðñþôç ðåñßðôùóç, óôçí ðåñßðôùóç ôçò ðáôÜôáò, öõôåýåôáé ìüíïí åðéóÞ ìùò ðéóôïðïéçìÝíïò ðáôáôüóðïñïò Þ ðáôáôüóðïñïò ðïõ Ý÷åé ðáñá÷èåß õðü åðßóçìï Ýëåã÷ï ìå åðéóÞìùò ðé óôïðïéçìÝíï ðáôáôüóðïñï ãéá ðáñáãùãÞ åßôå ðáôáôü óðïñïõ åßôå ðáôÜôáò åìðïñßïõ, ãéá êÜèå êáëëéåñãçôéêü Ýôïò ðïõ áíáöÝñåôáé óôéò ðñïçãïýìåíåò ðåñéðôþóåéò, ëáìâÜíïíôáé ìÝôñá ãéá ôçí åîÜëåéøç ôùí áõôïöõþí öõôþí ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò êáé Üëëùí îåíéóôþí ôïõ ïñãáíéóìïý, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí æéæáíßùí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí, êáé ðñáã ìáôïðïéåßôáé åðßóçìç ìåëÝôç üðùò êáèïñßæåôáé óôï Üñ èñï 2 ðáñÜãñáöïò 1, êáé äéåîÜãåôáé Ýëåã÷ïò ôùí êïíäý ëùí óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò ï ðáôáôüóðïñïò öõôåýåôáé ãéá ôçí ðáñáãùãÞ ðáôáôüóðïñïõ· ã) áìÝóùò ìåôÜ ôï ÷áñáêôçñéóìü ìïëõóìÝíùí áíôéêåé ìÝíùí óýìöùíá ìå ôï Üñèñï 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á), óçìåßï ii, êáé ãéá êÜèå åðüìåíï êáëëéåñãçôéêü Ýôïò, ìÝ ÷ñé êáé ôçí ðñþôç åðéôñåðüìåíç êáëëéåñãçôéêÞ ðåñßïäï ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò óôïí Þ ôïõò áãñïýò ðïõ Ý÷ïõí ÷áñá êôçñéóèåß ìïëõóìÝíïé, üðùò ðåñéãñÜöåôáé óôï óôïé÷åßï á): êáèáñßæïíôáé êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, áðïëõìáßíïíôáé êáôÜëëçëá üëá ôá ìç÷áíÞìáôá êáé ïé áðïèçêåõôéêïß ÷þ ñïé ôïõ ôüðïõ ðáñáãùãÞò ðïõ Ý÷ïõí ó÷Ýóç ìå ôçí ðáñá ãùãÞ ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò, ìå ôéò êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò, üðùò ïñßæåôáé óôï óçìåßï 3, åöáñìüæïíôáé êáôÜëëçëïé åðßóçìïé Ýëåã÷ïé ôùí ðñï ãñáììÜôùí Üñäåõóçò êáé øåêáóìïý, óõìðåñéëáìâáíï ìÝíçò ôçò áðáãüñåõóçò áõôþí, ðñïêåéìÝíïõ íá áðïöåõ ÷èåß ç äéÜäïóç ôïõ ïñãáíéóìïý· ä) óôéò ìïíÜäåò ðñïóôáôåõüìåíçò ðáñáãùãÞò ðïõ Ý ÷ïõí ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíåò, âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï ii, üðïõ åßíáé äõíáôÞ ç ðëÞñçò áíôéêáôÜóôáóç ôïõ õðïóôñþìáôïò âëÜóôçóçò, äåí öõôåýïíôáé êüíäõëïé Þ öõôÜ, Þ îåíéóôÝò ôïõ ïñãá íéóìïý, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí ôùí öõôþí êáé óðüñùí ôïìÜôáò, ðáñÜ ìüíï åÜí óôç ìïíÜäá ðáñáãùãÞò åöáñ ìüæïíôáé åðéóÞìùò åðïðôåõüìåíá ìÝôñá ãéá ôçí åîÜëåé øç ôïõ ïñãáíéóìïý êáé ôçí áðïìÜêñõíóç üëùí ôùí îåíé óôþí, óõìðåñéëáìâáíïìÝíùí, ôïõëÜ÷éóôïí, ôçò ðëÞñïõò áíôéêáôÜóôáóçò ôïõ õðïóôñþìáôïò âëÜóôçóçò êáé ôïõ êáèïñéóìïý êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ôçò áðïëýìáíóçò ôçò ìïíÜäáò ðáñáãùãÞò êáé üëïõ ôïõ åîïðëéóìïý, êáé, óôç óõíÝ÷åéá Ý÷åé ÷ïñçãçèåß Üäåéá ãéá ðáñáãùãÞ ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò áðü ôïõò áñìüäéïõò åðßóçìïõò öïñåßò êáé ç ðáñáãùãÞ ðáôÜôáò ãßíåôáé áðü åðéóÞìùò ðéóôïðïé çìÝíï ðáôáôüóðïñï Þ áðü ìéêñïêïíäýëïõò Þ ìéêñïöõôÜ ðïõ ðñïÝñ÷ïíôáé áðü åëåãìÝíåò ðçãÝò, åöáñìüæïíôáé êáôÜëëçëïé åðßóçìïé Ýëåã÷ïé ôùí ðñï ãñáììÜôùí Üñäåõóçò êáé øåêáóìïý, óõìðåñéëáìâáíï ìÝíçò ôçò áðáãüñåõóçò áõôþí, ðñïêåéìÝíïõ íá áðïöåõ ÷èåß ç äéÜäïóç ôïõ ïñãáíéóìïý. 4.2. Åíôüò ôçò ïñéïèåôçìÝíçò æþíçò, ìå ôçí åðéöýëáîç ôùí ìÝôñùí ðïõ ðåñéãñÜöïíôáé óôï óçìåßï 4.1., ç áñìü äéá áñ÷Þ: á) áìÝóùò, êáé ãéá ôñßá ôïõëÜ÷éóôïí êáëëéåñãçôéêÜ Ýôç ìåôÜ ôçí ðñïóäéïñéóèåßóá ìüëõíóç: áá) óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò ç ïñéïèåôçìÝíç æþíç Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñá öïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iv, åîáóöáëßæåé, ôçí åðïðôåßá ôùí ÷þñùí üðïõ êáëëéåñ ãïýíôáé, áðïèçêåýïíôáé Þ äéáêéíïýíôáé êüíäõëïé ðáôÜôáò Þ ôïìÜôåò, êáèþò êáé ôùí ÷þñùí óôïõò ïðïßïõò ëåéôïõñ ãïýí, âÜóåé óýìâáóçò, ìç÷áíÞìáôá ãéá ôçí ðáñáãùãÞ ðáôÜôáò Þ ôïìÜôáò, áðáéôåß, êáôÜ ðåñßðôùóç, êáèáñéóìü êáé áðïëýìáíóç ôùí ìç÷áíçìÜôùí êáé ôùí áðïèçêþí ôùí ÷þñùí áõôþí ìå ôéò êáôÜëëçëåò ìåèüäïõò, üðùò ïñßæåôáé óôï óçìåßï 3, áðáéôåß ôç öýôåõóç áðïêëåéóôéêÜ ðéóôïðïéçìÝíïõ óðüñïõ Þ óðüñïõ ðïõ Ý÷åé ðáñá÷èåß õðü åðßóçìï Ýëåã÷ï ãéá üëåò ôéò êáëëéÝñãåéåò ðáôÜôáò ôçò æþíçò áõôÞò, êáé äïêéìÞ, ìåôÜ ôç óõãêïìéäÞ, ôïõ ðáôáôüóðïñïõ ðïõ ðá ñÜãåôáé óå ôüðïõò ðáñáãùãÞò ðïõ Ý÷ïõí ÷áñáêôçñéóôåß ùò ðéèáíþò ìïëõóìÝíïé, óýìöùíá ìå ôï Üñèñï 5 ðáñÜ ãñáöïò 1, óôïé÷åßï á, óçìåßï iii, áðáéôåß ôç ÷ùñéóôÞ äéáêßíçóç ôùí áðïèåìÜôùí óõãêï ìéóèÝíôïò ðáôáôüóðïñïõ êáé ðáôÜôáò åìðïñßïõ ãéá üëåò ôéò åãêáôáóôÜóåéò ôçò æþíçò, äéåíåñãåß åðßóçìç ìåëÝôç, üðùò ðåñéãñÜöåôáé óôï Üñ èñï 2 ðáñÜãñáöïò 1, áâ) óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò ôï åðéöáíåéáêü íå ñü Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíï âÜóåé ôïõ Üñèñïõ 5 ðáñÜãñáöïò 1, óôïé÷åßï ã, óçìåßï ii, Þ ðåñéëáìâÜíåôáé óôá óôïé÷åßá ãéá ðéèáíÞ äéÜäïóç ôïõ ïñãáíéóìïý, óýì öùíá ìå ôï ðáñÜñôçìá V, óçìåßï 2, äéåíåñãåß åôÞóéá ìåëÝôç ôçí êáôÜëëçëç óôéãìÞ, óõ ìðåñéëáìâáíïìÝíçò ôçò äåéãìáôïëçøßáò ôïõ åðéöáíåéá êïý íåñïý êáé ôùí êáôÜëëçëùí îåíéóôþí ôçò ïéêïãÝíåéáò ôùí óïëáíùäþí óôéò ó÷åôéêÝò ðçãÝò åðéöáíåéáêïý íåñïý êáé äéåîÜãåé äïêéìÝò ãéá ôï êáôá÷ùñçìÝíï öõôéêü õëéêü, ìå ôç ó÷åôéêÞ ìÝ èïäï ôïõ ðáñáñôÞìáôïò ÉÉ Þ óôéò ëïéðÝò ðåñéðôþóåéò, ìå Üëëç åðßóçìá åãêåêñéìÝ íç ìÝèïäï, åöáñìüæåé åðßóçìïõò åëÝã÷ïõò ôùí ðñïãñáììÜôùí Üñäåõóçò êáé øåêáóìïý, óõìðåñéëáìâáíïìÝíçò ôçò áðá ãüñåõóçò ÷ñÞóçò ôïõ íåñïý ðïõ Ý÷åé ÷áñáêôçñéóèåß ùò ìïëõóìÝíï ãéá ôçí Üñäåõóç êáé ôï øåêáóìü ôïõ êáôá÷ù ñçìÝíïõ öõôéêïý õëéêïý, êáé, êáôÜ ðåñßðôùóç, Üëëùí îå íéóôþí ðñïêåéìÝíïõ íá áðïöåõ÷èåß ç äéÜäïóç ôïõ ïñãá íéóìïý. Ç áðáãüñåõóç áõôÞ åðáíåîåôÜæåôáé âÜóåé ôùí á ðïôåëåóìÜôùí ôçò ðñïáíáöåñüìåíçò åôÞóéáò Ýñåõíáò, óôéò ðåñéðôþóåéò êáôÜ ôéò ïðïßåò ïé áðïññßøåéò õãñþí áðïâëÞôùí åßíáé ìïëõóìÝíåò, åöáñìüæåé åðßóçìïõò å ëÝã÷ïõò ãéá ôç äéÜèåóç ôùí áðïâëÞôùí áðü ÷þñïõò âéï ìç÷áíéêÞò ìåôáðïßçóçò Þ óõóêåõáóßáò ôïõ êáôá÷ùñçìÝ íïõ öõóéêïý õëéêïý. â) êáôáñôßæåé, êáôÜ ðåñßðôùóç, ðñïãñÜììáôá áíôéêáôÜ óôáóçò üëùí ôùí áðïèåìÜôùí ðáôáôïóðüñïõ óå åýèåôï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá. ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ VII Oé åðéóÞìùò åãêåêñéìÝíåò åãêáôáóôÜóåéò äéÜèåóçò á ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3305 ðïâëÞôùí ðïõ áíáöÝñïíôáé óôï ðáñÜñôçìá VI, ðáñÜ ãñáöïò 1, ôÝôáñôï åäÜöéï, óõììïñöþíïíôáé ìå ôéò áêü ëïõèåò äéáôÜîåéò ðñïêåéìÝíïõ íá áðïöåõ÷èåß ï êßíäõíïò äéÜäïóçò ôïõ ïñãáíéóìïý: i) áðüâëçôá áðü ôçí åðåîåñãáóßá ðáôÜôáò êáé ôïìÜôáò (óõìðåñéëáìâáíüìåíùí ôùí áðïññßøåùí ðáôáôþí, öëïé ïý ðáôÜôáò êáé ôïìáôþí) êáé ïðïéïäÞðïôå Üëëï óôåñåü á ðüâëçôï ðïõ ðñïÝñ÷åôáé áðü ðáôÜôåò êáé ôïìÜôåò ðñÝ ðåé íá áðïìáêñýíåôáé, åßôå ìå åéò âÜèïò ôáöÞ óå ôïðïèåóßá äéÜèåóçò, óôçí ïðïßá äåí õðÜñ÷åé êßíäõíïò äéÞèçóçò óå ãåùñãéêÜ åäÜöç Þ å ðáöÞò ìå ðçãÝò íåñïý ðïõ ìðïñïýí íá ÷ñçóéìïðïéïý íôáé ãéá Üñäåõóç ãåùñãéêþí åäáöþí. Ôá áðüâëçôá ìåôá öÝñïíôáé áðåõèåßáò óôçí ôïðïèåóßá õðü óõíèÞêåò ðå ñéïñéóìïý, þóôå íá ìçí õðÜñ÷åé êßíäõíïò áðþëåéáò ôùí áðïâëÞôùí Þ ìå êáýóç, ii) õãñÜ áðüâëçôá åðåîåñãáóßáò: ðñéí áðü ôç äéÜèåóÞ ôïõò, ôá õãñÜ áðüâëçôá ðïõ ðåñéëáìâÜíïõí áéùñïýìåíá óôåñåÜ óôïé÷åßá õðïâÜëëïíôáé óå äéáäéêáóßåò äéÞèçóçò Þ êáèßæçóçò ãéá ôçí áðïìÜêñõíóç áõôþí ôùí óôåñåþí óôïé÷åßùí. Ç äéÜèåóç ôùí óôåñåþí áõôþí óôïé÷åßùí ãßíå ôáé ìå ôïõò ôñüðïõò ðïõ ðñïâëÝðïíôáé óôï óçìåßï i. Tá õãñÜ áðüâëçôá ðñÝðåé åßôå: íá èåñìáßíïíôáé ôïõëÜ÷éóôïí óå 700C åðß ôïõëÜ÷éóôïí 30 ëåðôÜ ðñéí áðü ôç äéÜèåóÞ ôïõò Þ íá äéáôßèåíôáé ìå Üëëï ôñüðï ðïõ Ý÷åé åãêñéèåß åðéóÞ ìùò êáé õðü åðßóçìï Ýëåã÷ï, þóôå íá ìçí õðÜñ÷åé êßíäõ íïò åðáöÞò ôùí áðïâëÞôùí ìå ãåùñãéêÜ åäÜöç Þ ðçãÝò íåñïý ðïõ èá ìðïñïýóáí íá ÷ñçóéìïðïéçèïýí ãéá Üñ äåõóç ãåùñãéêþí åäáöþí. Ïé ëåðôïìÝñåéåò áõôÝò ðñÝ ðåé íá êïéíïðïéïýíôáé óôá Üëëá êñÜôç ìÝëç êáé ôçí Åðé ôñïðÞ. ¢ñèñï 12 (¢ñèñï 12 Ïäçãßáò 98/57/ÅÊ) Ôï ðáñüí äéÜôáãìá éó÷ýåé áðü ôéò 21 Áõãïýóôïõ 1999. Óôïí Õöõðïõñãü Ãåùñãßáò áíáèÝôïõìå ôç äçìïóßåõóç êáé åêôÝëåóç ôïõ ðáñüíôïò äéáôÜãìáôïò. ÁèÞíá, 22 Óåðôåìâñßïõ 2000 Ï ÐÑÏÅÄÑÏÓ ÔÇÓ ÄÇÌÏÊÑÁÔÉÁÓ ÊÙÍÓÔÁÍÔÉÍÏÓ ÓÔÅÖÁÍÏÐÏÕËÏÓ ÏÉ ÕÐÏÕÑÃÏÉ ÅÈÍÉÊÇÓ ÏÉÊÏÍÏÌÉÁÓ ÊÁÉ ÏÉÊÏÍÏÌÉÊÙÍ ÕÖÕÐÏÕÑÃÏÓ ÃÅÙÑÃÉÁÓ Ã. ÐÁÐÁÍÔÙÍÉÏÕ Å. ÁÑÃÕÑÇÓ 3306 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) 3307 3308 ÅÖÇÌÅÑÉÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ (ÔÅÕ×ÏÓ ÐÑÙÔÏ) ÅÈÍÉÊÏ ÔÕÐÏÃÑÁÖÅÉÏ ÅÖÇÌÅÑÉÄÁ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ ÊÁÐÏÄÉÓÔÑÉÏÕ 34 * ÁÈÇÍÁ 104 32 * TELEX 223211 YPET GR * FAX 52 34 312 ÇËÅÊÔÑÏÍÉÊÇ ÄÉÅÕÈÕÍÓÇ: http: www.et.gr e-mail: webmaster @ et.gr ÕÐÇÑÅÓÉÅÓ ÅÎÕÐÇÑÅÔÇÓÇÓ ÐÏËÉÔÙÍ ÊÅÍÔÑÉÊÇ ÕÐÇÑÅÓÉÁ ÐÅÑÉÖÅÑÅÉÁÊÁ ÃÑÁÖÅÉÁ Óïëùìïý 51 ÐÙËÇÓÇÓ Ö.Å.Ê. Ðëçñïöïñßåò äçìïóéåõìÜôùí Á.Å. - Å.Ð.Å. 5225 761 - 5230 841 ÈÅÓÓÁËÏÍÉÊÇ - Âáó. ¼ëãáò 227 - Ô.Ê. 54100 (031) 423 956 Ðëçñïöïñßåò äçìïóéåõìÜôùí ëïéðþí Ö.Å.Ê. 5225 713 - 5249 547 ÐÅÉÑÁÉÁÓ - ÍéêÞôá 6-8 Ô.Ê. 185 31 4135 228 Ðþëçóç Ö.Å.Ê. 5239 762 ÐÁÔÑÁ - Êïñßíèïõ 327 - Ô.Ê. 262 23 (061) 6381 100 Öùôïáíôßãñáöá ðáëáéþí Ö.Å.Ê. 5248 141 ÂéâëéïèÞêç ðáëáéþí Ö.Å.Ê. 5248 188 ÉÙÁÍÍÉÍÁ - ÄéïéêçôÞñéï Ô.Ê. 450 44 (0651) 87215 Ïäçãßåò ãéá äçìïóéåýìáôá Á.Å. - Å.Ð.Å. 5248 785 ÊÏÌÏÔÇÍÇ - Äçìïêñáôßáò 1 Ô.Ê. 691 00 (0531) 22 858 ÅããñáöÞ Óõíäñïìçôþí Ö.Å.Ê. êáé ËÁÑÉÓÁ - ÄéïéêçôÞñéï Ô.Ê. 411 10 (041) 597449 áðïóôïëÞ Ö.Å.Ê. 5248 320 ÊÅÑÊÕÑÁ - ÓáìáñÜ 13 Ô.Ê. 491 00 (0661) 89 127 / 89 120 ÇÑÁÊËÅÉÏ - Ðë. Åëåõèåñßáò 1, Ô.Ê. 711 10 (081) 396 223 ËÅÓÂÏÓ - Ðë. Êùíóôáíôéíïõðüëåùò Ô.Ê. 811 00 MõôéëÞíç (0251) 46 888 / 47 533 ÔÉÌÇ ÐÙËÇÓÇÓ ÖÕËËÙÍ ÅÖÇÌÅÑÉÄÏÓ ÔÇÓ ÊÕÂÅÑÍÇÓÅÙÓ � Ãéá ôá ÖÅÊ áðü 1 ìÝ÷ñé 8 óåëßäåò 200 äñ÷. � Ãéá ôá ÖÅÊ áðü 8 óåëßäåò êáé ðÜíù ç ôéìÞ ðþëçóçò êÜèå öýëëïõ (8óÝëéäïõ Þ ìÝñïõò áõôïý) ðñïóáõîÜíåôáé êáôÜ 100 äñ÷. á íÜ 8óÝëéäï Þ ìÝñïò áõôïý. � Ãéá ôá ÖÅÊ ôïõ Ôåý÷ïõò Ðñïêçñýîåùí Á.Ó.Å.Ð. áíåîáñôÞôùò áñéèìïý óåëßäùí äñ÷. 100. (Óå ðåñßðôùóç ÐáíåëëÞíéïõ Äéáãù íéóìïý ç ôéìÞ èá ðñïóáõîÜíåôáé êáôÜ äñ÷. 100 áíÜ 8óÝëéäï Þ ìÝñïò áõôïý). * Ïé óõíäñïìÝò ôïõ åóùôåñéêïý ðñïðëçñþíïíôáé óôá Äçìüóéá Ôáìåßá ðïõ äßíïõí áðïäåéêôéêü åßóðñáîçò (äéðëüôõðï) ôï ïðïßï ìå ôç öñïíôßäá ôïõ åíäéáöåñïìÝíïõ ðñÝðåé íá óôÝëíåôáé óôçí Õðçñåóßá ôïõ Åèíéêïý Ôõðïãñáöåßïõ. * Ïé óõíäñïìÝò ôïõ åîùôåñéêïý åðéâáñýíïíôáé ìå ôï äéðëÜóéï ôùí áíùôÝñù ôéìþí. * Ç ðëçñùìÞ ôïõ õðÝñ ÔÁÐÅÔ ðïóïóôïý ðïõ áíôéóôïé÷åß óå óõíäñïìÝò, åéóðñÜôôåôáé áðü ôá Äçìüóéá Ôáìåßá. * Ïé óõíäñïìçôÝò ôïõ åîùôåñéêïý ìðïñïýí íá óôÝëíïõí ôï ðïóü ôïõ ÔÁÐÅÔ ìáæß ìå ôï ðïóü ôçò óõíäñïìÞò. * Ïé Íïìáñ÷éáêÝò ÁõôïäéïéêÞóåéò, ïé ÄÞìïé, ïé Êïéíüôçôåò ùò êáé ïé åðé÷åéñÞóåéò áõôþí ðëçñþíïõí ôï ìéóü ÷ñçìáôéêü ðïóü ôçò óõíäñïìÞò êáé ïëüêëçñï ôï ðïóü õðÝñ ôïõ ÔÁÐÅÔ. * Ç óõíäñïìÞ éó÷ýåé ãéá Ýíá ÷ñüíï, ðïõ áñ÷ßæåé ôçí 1ç Éáíïõáñßïõ êáé ëÞãåé ôçí 31ç Äåêåìâñßïõ ôïõ ßäéïõ ÷ñüíïõ. Äåí åããñÜöïíôáé óõíäñïìçôÝò ãéá ìéêñüôåñï ÷ñïíéêü äéÜóôçìá. * Ç åããñáöÞ Þ áíáíÝùóç ôçò óõíäñïìÞò ðñáãìáôïðïéåßôáé ôï áñãüôåñï ìÝ÷ñé ôïí ÌÜñôéï êÜèå Ýôïõò. * Áíôßãñáöá äéðëïôýðùí, ôá÷õäñïìéêÝò åðéôáãÝò êáé ÷ñçìáôéêÜ ãñáììÜôéá äåí ãßíïíôáé äåêôÜ. Ïé õðçñåóßåò åîõðçñÝôçóçò ôùí ðïëéôþí ëåéôïõñãïýí êáèçìåñéíÜ áðü 08.00~ Ýùò 13.00~ ÁÐÏ ÔÏ ÅÈÍÉÊÏ ÔÕÐÏÃÑÁÖÅÉÏ ÅÔÇÓÉÅÓ ÓÕÍÄÑÏÌÅÓ Ö.Å.Ê. Ôåý÷ïò Ê.Á.Å. Ðñïûðïëïãéóìïý Ê.Á.Å. åóüäïõ õðÝñ 2531 ÔÁÐÅÔ 3512 Á~ (Íüìïé, Ð.Ä., ÓõìâÜóåéò ê.ëð.) 60.000 äñ÷. 3.000 äñ÷. Â~ (ÕðïõñãéêÝò áðïöÜóåéò ê.ëð.) 70.000 » 3.500 » Ã~ (Äéïñéóìïß, áðïëýóåéò ê.ëð. Äçì. ÕðáëëÞëùí) 15.000 » 750 » Ä~ (Áðáëëïôñéþóåéò, ðïëåïäïìßá ê.ëð.) 70.000 » 3.500 » Áíáðôõîéáêþí ÐñÜîåùí (Ô.Á.Ð.Ó.) 30.000 » 1.500 » Í.Ð.Ä.Ä. (Äéïñéóìïß ê.ëð. ðñïóùðéêïý Í.Ð.Ä.Ä.) 15.000 » 750 » ÐáñÜñôçìá (Ðñïêçñýîåéò èÝóåùí ÄÅÐ ê.ôë.) 5.000 » 250 » Äåëôßï Âéïìç÷áíéêÞò Éäéïêôçóßáò (Ä.Å.Â.É.) 10.000 » 500 » ÁíùôÜôïõ Åéäéêïý Äéêáóôçñßïõ (Á.Å.Ä.) 3.000 » 150 » Ðñïêçñýîåùí Á.Ó.Å.Ð. 10.000 » 500 » Áíùíýìùí Åôáéñåéþí & Å.Ð.Å. 300.000 » 15.000 » Äéáêçñýîåùí Äçìïóßùí ÓõìâÜóåùí (Ä.Ä.Ó.) 50.000 » 2.500 » ÃÉÁ ÏËÁ ÔÁ ÔÅÕ×Ç ÅÊÔÏÓ Á.Å. & Å.Ð.Å. 300.000 » 15.000 »