Arrêté relatif à la lutte contre la Rastonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

Art. 1•. - La Jutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Art. 3. - Toute apparition suspectee ou toute presence confirmee Yabuuchi et al., auparavant connu sous la denomination Pseudomo- de l'organisme doit etre immediatement signalee au directeur regio- nas solanacearum (Smith) Smith (ci-apres denomme « l'orga- nal de !'agriculture et de la foret (service regional de la protection nisme »), sur Jes plantes hates de cct organisme enumerees a des vegetaux) ou au directeur de !'agriculture et de la forct (service !'annexe r, section I. du present arrete (ci-apres denommees « mate- de la protection des vegetaux) pour Jes departernents d 'outre-rner. riel vegetal concerne ») est obligatoire. Elle a pour but : Art. 4. - I. Lorsque des cas d'apparition suspectee ont ete - de le localiser et de determiner sa diffusion ; signales, les tests pour le materiel vegetal concerne sont effectues - de prevenir son apparition et sa propagation ; par Jes laboratoires de la protection des vegetaux ou par Jes labora- - et s'il est detecte, de prevcnir sa propagation et de le combattrc toires places sous son controle, scion la rnethode decrite a !'annexe n en vuc de son eradication. et conformement aux conditions enurnerees a !'annexe lll, point I, du present arrete. afin de confirmer ou d'infirmer ladite apparition.

Art. 2. - I . Les agents charges de la protection des vegetaux Si la presence de l'organisme est confirmee, Jes dispositions de procedent chaque annee a des recherches systematiques visant a !'annexe lll, point 2, du present arrete s'appliquent. detecter l'organisme sur le materiel vegetal conceme provenant du territoire rnetropolitain et des departemcnts d' outre-mer. 2. Dans l'attentc de la confirmation ou de l'infirmation de Afin de determiner les autres sources eventuelles de contamina- !'apparition suspectee visee au paragraphe I, dans chaque cas d'ap- tion mena(,ant la production du materiel vegetal concerne, Jes agents parition suspectee ou. I' on a constate : charges de la protection procedent a une evaluation des risques et. a i) Des symptornes diagnostiques de la presence de la rnala- moins qu'aueun risque de propagation de l'organisme n'ait ete die causee par I' organisme et une reaction positive au(x) test(s) constate a I' issue de I' evaluation, ils procedent, dans Jes zones de de depistage rapide precise(s) a l'annexe n, section r. point l, production du materiel vegetal concerne, a des recherches ciblees et section JI du present arrete, OU visant a detecter l'organisme sur des vegetaux n'appartenant pas au ii) Une reaction positive au(x) test(s) de depistage precise(s) materiel vegetal concerne y compris sur Jes plantes sauvages hates ll !'annexe II, section r. point 2. et section III du present arrete. de la farnille des solanacees, de mcme que dans Jes eaux super- ficielles utilisees pour !'irrigation ou le traitcment par pulverisation Les agents de la protection des vegetaux : du materiel vegetal concerne et dans Jes eaux usees rejetees par Jes a) Interdisent la circulation de vegetaux et de tubercules issus de entreprises de transformation industrielle ou de conditionnement trai- toutes les cultures, lots ou envois sur lesquels les cchantillons ont tan_t du materiel vegetal concerne et utilisees pour !'irrigation ou le ete preleves, sauf sous leur contrale et pour autant qu'il ait ete etabli trmtement par pulverisation du materiel vegetal conccrnc. qu'il n'cxiste aucun risque identifiable de propagation de l'orga- L'ampleur de ces rccherches ciblees est determinee en fonction du nismc: risquc decele. b) Prennent Jes mesures necessaires pour remonter a l'origine de Les agents charges de la protection des vegetaux peuvent egale- I' apparition suspectee ; ment proceder a des recherches visant a detectcr l'organisme sur c) Introduisent, notamment pour la production du materiel vegetal d'autres materiels, tels que le milieu de culture, le sol et Jes dechets concerne et la circulation de lots de pommes de terre de semcnces solides provenant d'entreprises de transformation industrielle ou de autres que ceux vises au point a produits sur le lieu de production conditionnement. sur lequel les echantillons vises au point a ont ete preleves, des 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANQAISE 5373 mesures de precaution supplementaires appropriees, fondees sur le 2. Le materiel vegetal concerne declare probablement contamine degre de risque estime, en vue de prevenir toute propagation de l'or- conformcment a !'article 5, paragraphe I, point a, iii), et point c, ganisme. iii), et comprenant le materiel vegetal conceme pour lequel un risque a ete identifie produit sur Jes lieux de production declares

Art. 5. - Si les resultats des tests officiels realises selon la probablement contamines, conformement a !'article 5, paragraphe I, methode decrite a !'annexe II du present arrete, pour le materiel point a, iii). ne peut pas etre plante. Sous le controle des agents vegetal concerne, ou, dans tous les autres cas, selon toute aulre charges de la protection des vegetaux, ii est utilise ou elimine de la methode officiellement agreee, confirment la presence de I' orga- maniere appropriee precisce a !'annexe VI, point 2, du present nisme dans un echantillon preleve, conformement aux dispositions arrete, de telle sorte que !'absence de risque identifiable de propaga~ du present arrete, les agents charges de la protection des vegetaux, tion de l'organisme soit etablie. compte tenu de principes scientifiques fondes, des caracteristiques biologiques de l'organisme et des systcmes particuliers de produc- 3. Le materiel, Jes vehicules, les recipients, Jes entrep6ts ou des tion, de commercialisation et de transformation des plantes h6tes de parties de ceux-ci, et tout autre objet, y compris Ies emballages, l' organisme : declares contamines conformement a ]'article 5, paragraphe I, point a, ii), ou declares probablement contamines conformement a a) S'agissant du materiel vegetal concerne: !'article 5, paragraphe l, point a, iii) et point c, iii), doivent etre i) Procedent a une enquete afi n de determiner I' etendue et la detruits OU decontamines selon des methodes appropries precisees a ou Jes sources primaires de la contamination, conformement !'annexe VI, point 3, du present arrete. Apres decontamination, ces aux dispositions de !'annexe IV du present arrete et en effec- objets ne sont plus consideres comme contamines. tuant des tests complementaires conformement a !'article 4, 4. Sans prejudice des mesures mises en cruvre en application des paragraphe I, du present arrcte, sur au moins tous Jes stocks de paragraphes I, 2 et 3, diverses mesures, definies a !'annexe VI, pommes de terre de semcnce lies par clonage : points 4.1 et 4.2, du present arrete, ordonnees par Jes agents charges ii) Declarent contamines le materiel vegetal concerne, de la protection des vegetaux doivent etre mises en cruvre dans la l'envoi et/ou le lot d'ou I'echantillon a ete preleve, ainsi que le zone delimitee conformement a !'article 5, paragraphe I, point a, iv) materiel, le vehicule, le recipient, l'entrepot ou des parties de et point c, iii). ceux-ci et tout autre objet, y compris Jes emballages qui ont ete en contact avec le materiel vegetal concerne d' ou I' echantillon Art. 7. - Les pommes de terre de semence doivent satisfaire aux a ete preleve ; declarcnt egalement contamines, le cas echeant, exigences de l'arrete du 2 septembre 1993 modifie susvise et prove- le(s) champ(s), unite(s) de production de cultures protegees et nir en ligne directe d'un materiel qui a ete obtenu dans le cadre lieu(x) de production au le materiel vegetal a ete recolte et d'un programme officicllement approuve et qui a ete declare exempt d' ou I' echantillon a ete preleve ; et, pour les echantillons prele- de l'organisme a la suite des tests officiels au officiellement contro- ves en cours de vegetation, declarent contamines Ie(s) les, selon la methode pertinente decrite a !'annexe II du present champ(s), lieu(x) de production et, le cas echeant, unite(s) de arrete. production de cultures protegees d'ou l'echantillon a cte pre- Les tests susmentionnes sont effectues : leve; a) Dans les cas au la decouverte de l'organisme dans sa propre iii) Determinent, conformement aux dispositions de production de pommes de terre de semence a ete confirmee : I' annexe V, point 1, du present arrete, 1' etendue de la contami- i) Par des tests portant sur les generations anterieures, y nation probable, soil par contact avant au apres la recolte avec compris la selection clonale initiale, et par des tests systema- des elements declares contamines, soit par des liens avec tiques sur Jes clones de pommes de terre de semence de base ; ceux-ci au travers du systeme de production, d'irrigation ou de pulverisation, soit par une relation clonalc ; ii) Ou lorsque !'absence de relation clonale a ete etablie, par une zone sur la base de la declaration de des cssais portant sur tous Jes clones de pommes de terre de iv) Et delimitent semence de base au sur Jes generations anterieures, y compris contamination visee au point ii) ci-dessus, de la determination la selection clonale initiale, et de I' etendue de la contamination probable visee au point iii) et de la propagation possible de l'organisme, conformement aux b) Dans Jes autres cas, soit sur chaque plante de la selection clo- dispositions de l'annexe V, point 2, i), du present arrete. nale initiale, soil sur des echantillons representatifs des pommes de terre de semence de base au des generations anterieures. b) S'agissant des cultures de plantes h6tes autres que celles men- tionnees au _point a, lorsque la production du materiel vcgetal Art. 8. - La detention et la manipulation de l'organisme sont concerne est 1dentifiee comme soumise a un risque, Jes agent~ char- interdites. ges de la protection des vegetaux : Art. 9. - Sans prejudice des dispositions de I' arrete du 2 sep- i) Effectuent une enquete conformement au point a, i) ; tembre 1993 modifie susvisc, des derogations aux articles 6 et 8 du ii) Declarent contaminces Jes plantes h6tes de l'organisme present arrete peuvent elre accordees par le ministre de !'agriculture d' au I' echantillon a ete preleve ; et de Ja peche pour des travaux a des fins d'essai au a des fins i!i). Et determinent l'etendue de la contamination probable et scientifiques au pour des travaux sur Les selections varietales confor- dehmuent une zone conformemenl aux points a, iii), et a, iv), mcment a I'arrete du 10 juin 1998 susvise. respectivement, en ce qui concerne la production du materiel vegetal concerne. Art. 10. - Des mesures complementaires ou plus rigoureuses requises pour la Iutte contre l'organisme ou la prevention de sa pro- c) S'agissant des eaux superficielles (y compris Jes effluents pagation (pour autant qu'elles respectent les dispositions de l'arrete liquides d'enlreprises de transformation industrielle au de condi- du 2 septembre 1993 modifie susvise) peuvent etre prises par arrete tionnement traitant du materiel vegetal concerne) et des plantes du ministre de I' agriculture et de la peche. h6tes sauvages associees appartenant a la famille des solanacees, lorsque la production du materiel vegetal concerne est identifiee Art. 11. - Les dispositions du present arrete entrent en vigueur comme soumis a un risque, que ce soil par irrigation, par pulverisa- le 21 aofit 1999. tion au par submersion par les eaux superficielles, Jes agents de la Art. 12. - L'arrete du 28 mars 1996 fixant les mesures de lutte protection des vegctaux : contre le Burkholderia (ex. P.feudomonas) solanacearum est abroge i) Effectuent une enquete, y compris des recherches a des a compter du 21 aofit 1999. moments opportuns sur des cchantillons d'eaux superficielles et de plantes hotes sauvages de la famille des solanacees even- Art. 13. - La directrice generale de l'alimentation est chargee de tuellement presentes, afin d'etablir l'etendue de la contamina- !'execution du present arrete, qui sera public au Journal officiel de tion; la Republique fran~aise. ii) Declarent contaminees Jes eaux superficielles d'ou le ou Fait a Paris, le 1l fevrier 1999. les echantillons ant ete preleves, sur la base de l'enquete visee Pour le ministre et par delegation : au point i) ci-dessus ; La directrice ginirale de I' alimentation, iii) Et determinent l'etendue de la contamination probable et delimitent une zone sur Ja base de la declaration de la contami- M. GUILL.OU nation visee au point ii) et de la propagation possible de l'orga- msme, en tenant compte des dispositions de !'annexe V, ANNEXE points I et 2, ii), du present arrete.

Art. 6. - L Le materiel vegetal concerne declare contamine Section I conformement a I' article 5, paragraphe l, point a, ii), du present Liste des plantcs Mtcs de Ralstonia solanmearum (Smith) arrete ne peut pas etre plante. Sous le contr61e et avec I'autorisalion Yabuuchi et aL visees a l'anicle 1~ des agents charges de la protection des vegetaux, ii est soumis a l'une des dispositions de !'annexe VI, point 1, du present arrete, de Ycgctaux (y compris les tubercules), a !'exception des semences telle sorte que !'absence de risque identifiable de propagation de proprement dites de l'espece Solanum tuberosum L. : pomme de l'organisme soil garantie. terre. 5374 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANQAISE 11 avril 1999 Vegetaux, a I' exception des semenccs et des fruits de l' espece - le nornbre d' echantillons preleves et la date de preleve- Lycopersicon lycopersicum L. Karsten ex Farw : tomate. ment; - la zone ou le cours d'eau oii a ete effectue le preleve- Section II ment d'echantillons, selon le cas; - la methode d'analyse; Recherches iv) Dans le cas des recherches sur l'eau et Jes effluents I. Les recherches officielles visees a 1' article 2, paragraphe 2, liquides rejetes par Jes installations industrielles de trai- point a, sont fondees sur Jes caracteristiques biologiques de l'orga- tement ou de conditionnement : nisme et des systemes particuliers de production dans l'Etat membre - le nornbre d'echantillons et la date de prelevement; concerne et comprennent : - la zone ou le cours d'eau ou !'emplacement des installa- i) Dans le cas de la pomme de terre : tions ou a etc effectue le prelevement d'echantillons, - a des moments opportuns, une inspection visuelle de la selon le cas ; culture en phase de croissance et/ou un prelevement - la methode d'analyse. d'echantillons de pommes de terre de semence et d'autres pommes de terre, en cours de vegetation ou ANNEXE II stockees ; ces echantillons sont soumis a une inspection visuelle, officielle ou officiellement contr6lee, sur tuber- PROCEDURE DE TEST POUR DIAGNOSTIQUER, DETECTER cules coupes, et ET IDENTIFIER RALSTON/A S01.ANACEARUM (SMITH) YABUUCHI - dans le cas des pommes de terre de semence et, le cas ET AL. echeant, des autres pommcs de terre, des tests en labora- toire officiels ou officiellement contr6les, suivant la methode decrire a I' annexe l l ; Domaine d'application de la procedure ii) Dans le cas de la tomate : La procedure prcsentee ci-dessous decrit Jes differentes etapes a - une inspection visuelle, a des moments opportuns, au suivre pour: mains de la culture en phase de croissance de plants i) Diagnostiquer le fletrissement bacterien sur Jes tubercules destines a etre replantes pour un usage professionnel. de pomme de terre ou sur Jes plantes de pornmes de terre 2. La notification des recherches officielles visecs a l'article 2, et de tornate ; paragraphe 3, comprend: ii) Detecter Ralstonia solanacearum dans des echantillons de i) Dans le cas des recherches sur les pommes de terre : tubercules de pomme de terre ; - l' estimation de la superficie totale cultivee, en hectares, iii) Identifier Ralston/a solanacearum, des pommes de terre de semence et autres pommes de terre ; On trou vera en appendice des indications detaillees concernant la preparation du materiel necessaire aux tests (milieux de culture, - la stratification par categoric de semence et pommes de tampons, solutions et reactifs). terre de consommation et, le cas echeant, par region ; - le nombre et le calendrier de prelevement des echantil- lons pour Jes tests ; Secrion - le nombre des inspections visuelles sur le terrain ; Application de la procedure de test - le nombre (et la taille de l'echantillon) des inspections visuelles sur tu bercules ; l. Diagnostic du jletrissement bacterien sur Jes tubercules ii) Dans le cas des recherches sur, au moins, la culture en de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre phase de croissance des plants de tomates destines a etre et de tomate rep! antes pour un usage professionnel : La procedure de test concerne Jes tubercules de pomrne de terre et - !'estimation du nombre total de plants: Jes plantes de pomme de terre et de tornate presentant des syrnp- - le nombre d'inspections visuelles ; t6mes typiques du fletrissement bacterien ou permettant de soup- iii) Dans le cas des recherches sur des plantes holes autres c;onner sa presence. Elle comporte un test rapide de depistage, l'iso- que Jes pommes de terre et Jes tornates, y compris les lement de l'organisme pathogene a partir du tissu vasculaire infecte plantes h6tes sau vages de 1a fam ilie des solanacees : sur des milieux de diagnostic et, en cas de resultat positif, !'identifi- - l'espcce; cation de Ja culture comme etant Ralstonia solanacearum. 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL OE LA REPUBLIOUE FRAN~AISE 5375 Presentation du diagramme foncriannel Planres de pomme de rerre ou de tomace ou tubercules de pomme de terre presemam des sympr6mes (1 ) Tests rapides de depisrage (') ISOLEMENT t Colonies ayanr une morpholog1e caractenmque ' I ' NONl'l I ' TESTS DE CONF!R,\1ATION ldennfJCation (') d'une culture pure comme eranr R.ilstonta snl.inacearum er resr de pathogemc1re I') lr our ' NON Planres et/ou tu bercules non infectes p;r Ra/stoma solunacearum I t Planres et/ou rubercules infectes par Ralstom.i so/an.ice.irum Renvoi.< du diagramme fonctwnnd (I) La description des symplomes figure ~ la section ll.l. (2) Des tests rapides de tri facilitent le diagnos(ic; presomp(if. Les tests appropri es sont : - test de punilence des tissus vascuiaires caulinaires (section II.2) ; - test de mise en evidence des granules de poly-/3-hydro~ybutyrate (section 11.2) ; - test d'immunofluorescence (section III.2) : - test ELISA (section 111.3) ; - test PCR (section 111.4). (3) Bien que l'isolcment de !'agent pathogene par dilution et etalement sur milieu de culture soit une t:lche simple. la mise en culture risqut d'echouer a partir des stades d'infection avances. Les hactcries saprophytes qui se developpent sur un tissu malade risquent de se developper heaucoup plus rapidement que !'agent pathogcne au d'inhibcr sa croissance sur le milieu d'isolemenl. Lorsquc le test d'isolement est negatif en depit de symptomes caracteristique.s de la presence de la malac!ie, l'isolement doi1 i;rre reitere. de preference par un test de dilution et etalement sur un milieu selectif. (4) L'identificacion liable d'une culture pure de Ral,tnnia .mlanacearam necessite au minimum l'un des tests dom la liste figure~ la section 11.4. 1. realise conjoinrement avcc un test de pouvoir pathogene (section ll.4.3). La caractcrisalion de la souche est facultative mais rccommandee pour chaque cas nouveau. 5376 JOURNAL OFFIC!EL DE LA REPUBLIQUE FRANyAISE 11 avnl 1999 2. Detection et identification de Ralstonia solanacearum sur des echanti!lons de tubercuies de pomme de terre La procedure de test vise a detecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre au moyen d'un test de tri ou, mieux. encore. de plusieurs tests de ce type, dont les resultats, s'ils sont positifs, sont confirmes par l'isolement de !'agent pathogene. En cas d'isolement de colonies caracteristiques, on procede a !'identification d'une culture pure comrne etant Ralstonia .mlanacearum. Diagramme fonctionnel Echanri!lon de tubercules de pommes de terre (') t TEST(S) DE DEPISTAGE (') ' Tesr d'immunotluorescence {') et/ou d'ensemencemenr sur milieu selectif (') avec tests complemenra1res facultatifs; Te,r ELISA (1 ) Testis) PCR i'l Test d'ennch1ssemem 1') Echancillon non au moms un [OUS les testsre3lises mfecre par rest pos1t1f negarifs i---- R.ilstoni..i so/.inacearum TEST1Si D'ISOLE:V1ENT Ensemence- et/ou rest b10- menr re~r ,ur log1que I') milieu ,elcct1f Colonies de morpholog,e caractenstique B Echanrillon non mfecte par Ol!I R..ilstonia solanaceamm t TEST(SI DE CONFIRMATION ldenc1ficmon de la culture en tam que.cu!ture Je Rc1lstoma solanacearHm·er tesr de pouvo1r pathogene ("I t ' OU! NON Echamillon non infern~ par Rc1fstonia solanacearum t Echannllon mfecte par Ro1/ston1u solanaaarnm 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA AEPUBLIQUE FAAN(;AISE 5377 Renvois du diafiratnme fonctionnel plante h6te et peut etre effectue sur des plants de tomates ou d' aubergines. I1 exige des conditions optimales d' incubation confonnes aux spec1ficat1ons (I) Taille de l 'echantillon. de cette procedure. Les bacteries ayant un effel inhibiteur sur Ralstonia La taille de l'echantillon standard est de 200 tubercules. Cependant, la so/anacearum en presence d'un milieu nutritif SMSA ne risquent guere de procedure peut etre appliquee h des echantil!ons de moins de 200 tuber- gener le deroulement de ce test. cules. (9) Test(s) de confirmation. (2) Test(s) de tri. II est possible d'identi!ier de maniere fiable une culture pure de Ralstonia La sensibilite ou la fiabilite d'un seul test n'est pas toujours suffisante solanacearum en utilisant au mains l'un des tests enumeres a la sec- pour detecter la presence de Ralstonia soianacearnm dans un echantillon. II tion 11.4. I, associe a un test de pouvoir pathogene (section 11.4.3). La carac- est done recommande de proceder h plusieurs tests. Dans la mesure du pos- terisation de la souche est facultative, mais conseillee en presence d'un cas sible, ces tests doivent etre bases sur des principes biologiques differents. nouveau. (3) Test d'immunofluorescence. Le test d'immunofluorescence est un test de tri bien connu. C'est un Section II avantage par rapport h d'autres types de tests qui ne sont pas encore par- Diagnostic du llettissement bacterien su.r Jes tubercules de pomme faitement mis au point, ou valides. Ce test est utilise pour d'autres bacteries de quarantaine, comme Clavibacter michi1;anensis subsp. sepedonicus. de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomate Compte tenu des parametres de lecture specifies dans cette methode, ii s'agit d'un test sensible (seuil de sensibilite 10'-104 cellules/ml de l'extrait I. Symptc'imes final de pomme de terre). 1.1. Symptomes sur Jes pommes de terre. Le facteur decisif pour la fiabilite des resultats du test est la qualite de \'antiserum. Seu! un antiserum ayant un titre eleve (au minimum 2 000 pour ?lame de pomme de terre. Le premier stade de !'infection se !'antiserum brut) est acceptable et tous les tests doivent etre realises au titre traduit par un fletrissement des feuilles du haut de la plante a de !'antiserum ou a une dilution en dessous. La methode indirecte est utili- temperature elevee pendant la journee et un retour a I' aspect see de preference. La methode directe est applicable lorsque la sensibilite et nonnal pendant la nuit. Le fletrissement devie11t rapidement la specificite du test sont equivalentes a celles de la methode indirecte. irreversible et se traduit par la mort de la plante. On peut Le test d'immunofluorescence presente l'avantage d'offrir une inter- observer un brunissement du tissu vasculalre des tiges de pretation subjective quant ii la morphologie et a l'intensite de la fluores- plantes fletries coupees transversalement. et un exsudat laiteux cence des cellules qui foumissent des indications sur la specificite de la reaction. II est frequent de constater des reactions croisees avec des bacte- a apparait la surface de la coupe ou peut en etre extrait facile- ries serologiquement proches, du sol ou associees a des tissus de pomme de ment en pin~ant la tige. Lorsqu'une tige coupee est placee dans terre, presentant une morphologie cellulaire de Ralstonia solanacearurn. Le l'eau verticalement, des filets de productions bacteriennes test d'immunolluorescence peut faire office de test de tri unique, mais, s'ecoulent des faisceaux vasculaires. lorsque la presence de reactions croisees est suspectee, ii convient de reali- Tubercule de pomme de terre, Les tubercules de pommc de ser un autre test de tri base sur un principe biologique different. Dans de terre doiYent ctre coupes transversalement, pres du talon. Le tels cas, l'isolcment sur milieu selectif est le test le plus approprie. premier stade d'infection se traduit par une coloration jaune (4) Etalement sur milieu sele<:tif. vitreux a brun clair de l'an11eau vasculaire, d'oii emerge un Lorsqu'on utilise le milieu selectif modifie SMSA et la methodologie suintement cremeux pale. soit spontanement apres quelques specifiee, on dispose d' un test sensible et selcctif permettant de detecter minutes, soit lorsqu'on applique une legere pression des doigts Ralston/a soianacearurn. Le resultat est disponible dans un delai de trois a a proximite de la coupe, sur l'epidenne du tubercule. Par la six jours apres la preparatjon de l'echantillon. L'agent pathogene est obtenu suite, la decoloration vasculaire devient plus nettement brune et directement sous forme de culture et peut etre facilement identilie. Pour mettre pleinement a profit Jes possibilltes offertes par ce test, ii faut prepa- la necrose s'etend parfois au tissu parenchymateux. Aux stades rer soigneusement les talons de pommes de terre afi n de reduire Jes conta- avances, !'infection se propage a partir du talon et des yeux, et minations par les bacteries secondaires liees au tubercule; ces bacteries sont l'epidermc des tubercules presente alors des lesions brun rou- des organismes concurrents de Ralstonia .wianacearum sur le milieu de geatre legerement concaves : de ces lesions peut suinter un culture, qui sont susceptibles d' affecter le developpement de r agent patho- liquide bacterien provoquant I' adherence des particules de sol. gene. Certaines souches risquent en outre de se developper insuffisamment 1.2. Symptomes sur les tomates. dans la mesure ou. les composants du milieu pcuvent egalement affecter l'organisme cible. II faut veiller egalement ii differcncier Ralston/a solam1- Plante de tomate. Le premier sympt6me visible c:st la flacci- cearurn des autres bacteries susceptibles de se developper sur le milieu de dite des plus jeunes feuilles. Dans des conditions favorables a culture. L'etalement sur milieu selectif peut t'galement servir de test de !'agent pathogene (temperature du sol d'environ 25 "C. humi- depistage unique; toutefois, lorsqu'on obtient un resultat negatif et qu'un dite saturce), l'epinastie et le fletrissement d'un cote de la effet inhibiteur d'autres bacteries sur la croissance de Ralstrmia .w,Janacea- plante ou de !'ensemble de la plante surviennent en quelques rum est suspecte, ii convient d'effectuer un dcuxierne test de depistage. En jours et provoquent l'effondreme11t complet de la plante. Dans pareille circonstance, le test d'immunofluorescence est le plus indiqut'. des conditions moins favorables (temperature du sol inferieure (5) Test ELISA, a 21 "C), un grand nombre de racines adventices peuvent se Le test ELISA est generalement mains sensible que le test d'immuno- developper sur la tige. On peut observer le long de la tige un fluorescence (seuil de detection de 10'-10' cellules/ml d'extrait final de cordon graisseux qui temoig11e de la necrose du systeme vas- pomme de terre). Ce test est bon marche et rapide, mais generalement plus culaire. Lorsque la tige est coupec transversalement, des gouttes sensible au risque de resultats errones positifs (reactions croisees) ou nega- d'exsudat bacterien blanc, ou jaunatre s'ecoulent du tissu vas- tifs (inhibition sous l'effet des molecules phenoliques des extraits de pomme de terre). Les exigences de speci!icitc d'antiserum sont extrememcnt rigou- culaire brun dccolore de la tige. reuses. Le test ELISA ne peut servir de test de depistage unique. (6) Test PCR. 2. Tests rapides de dipfaiage Le test PCR est potentiellement tres sensible, bien que le test soit facile- Des tests rapides de depistage facilitent le diagnostic presomptif. ment inhibe par des composants de plants ou d'extraits de tubercules abou- Utilisez un ou plusieurs des tests suivants : tissant ii un resultat negatif errone. Certains cultivars de pomme de terre contiennent davantage d'inhibiteurs que d'autres. II est done necessaire de Test d'exsudation des tiges: les eliminer. La dilution reduit les inhibitions, mais les populations de Rals- La presence de Ralstonia so/anacearum dans des tiges de tonia solanucearum sont al ors egalement di Iuees. II faut proceder a,,-ec le pommes de terre ou de tomates fletries peut etre mise en evidence plus grand soin ii toutes les etapes de la preparation de l't'chantillon et du en proce<lant au test de presomption sui vant : test pour eviter toute contamination susceptible de produire des resultats Sectionner Ja tige juste au-dcssus du sol. Placer l'extremite de la positifs errones. Des resultats faussement positifs peuvent survenir A cause tige section11ee dans un becher rempli d'eau. Peu de temps apres, d'homologies de sequences avec d'autres organismes. Pour ces raisons, !'utilisation directe du test PCR commc scul test de depistage n'est pas JXlS- des filets de productions bacterie11nes s' ecouleront spontaneme11t des sible. faisceaux vasculaires. Aucune autre bacterie responsable de !'infec- (7) Test d'enrichissement en bouillon nutritif. tion vasculaire des plants de pommes de terre ou de tomates ne fora L'incubation d'extrait final de pomme de terre dans un milieu nutritif apparaitre ce phenomcnc. liquide semi-st'lectif, tel que le bouillon nutritif modilie SMSA, pennet la Mise en evidence des granules de poly-/3-hydroxybutyrate multiplication de Ralston/a solanacearum et, ce qui est peut-etre plus (PHB): important encore, la dilution des inhibiteurs potentiels des tests ELISA et La coloration au bleu du Nil A ou au noir du Soudan B permet PCR. Le test d'immunol1uorescence, le test ELISA et le test PCR per- de Yisualiser les granules de PHB presents dans les cellules de Rals- mettent done de detecter la presence de Ru!stonia so/.anacearum dans un tonia solanacearum. milieu nutritif liquide d'enrichissement. Nous ne conseillons pas de proce- der a un etalement direct A partir de milieux nutritifs cnrichis. Ces mcthodcs Preparer sur une lame de microscope un frottis a partir de l'cxsu- d'enrichissement n'ont pas ete completemcnt cxpfomentees et testfrs; clles dat ou du tissu place en suspension ou prcparer un frottis d'une sont mentionnfrs ici en raison des possibilites interessantes qu'elles offrent. culture de quarantc-huit heures sur gelose avec levure, pcptone et Mais, faute d'une experience suffisante, il n'est pas possible de Jes utiliser glucose (YPGA) au sur gelose avec peptone (SPA) (appendicc I). comme seules methodes de depistage. Preparer un temoin positif obtenu avec une souche de biovar 2 de la (8) Test biologique. race 3. Laisser secher. Passer rapidement a plusieurs reprises le cote Le test biologique est utilise pour l'isolement de Ralsrm,ia solanace<1rurn inferieur de la lame dans une tlamme jusqu'h ce que le frottis soit a partir des extraits de pommes de tcrrc par cnrichisscment sclcctif dans unc fixe. 5378 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLlQUE FRAN<;AISE 11 avril 1999 Test au bleu du Nil : 3.5. Purifier les colonies de morphologie caracteristique par repi- I. Recouvrir le frottis fixe dans une solution aqucuse a I % de quage sur un milieu nutritif de type general. Eviter Jes repi- bleu du Nil A. lncuber JO minutes a 55 °C. quages successifs susceptibles de provoquer une pcrte de viru- 2. Eliminer la solution colorante. Laver rapidement sous un filet lence. d'eau courante. Enlever l'eau excedcntaire avcc du papicr absorbant. 3. Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse d'acide acetique 4. Test(s) de confirmation a 8 %. lncuber I minute a la temperature du \aboratoire. 4.1. Identification de Ralstonia so/anacearum. 4. Laver sous un filet d'eau courante et secher sur du papier Identifier des cultures pures de Ralstonia solanaceamm en absorbant. utilisant au moins l'une des procedures suivantes : 5. Rehumecter en deposant une goutte d'eau. Recouvrir d'une Tests nutritionnels et enzymatiques : lamelle. Nota. - Jnclure les t~moins appropries dans chacun des tests utilises. 6. Examiner le frottis colore au microscope a epifluorescence Les caracteristiques phenotypiques de Ralsronia solanacea- sous un film d'huile de 450 nm, a un grossissement de I 000. rum listees ci-apres sont systematiquement presentes ou Observer la fluorescence orange vif des granules de PHB. Faire absentes. egalement des observations en lumicrc normale afin de verifier le Pigment fluorescent ........................................................... . caractere intracellulaire des granules. verifier que la morphologie des cellules est caracteristique de Ralstonia solanacearum. Inclusions de granules de PHB ........................................ + Test de metabolisme oxydatif-fennentatif (O/F) ............. 0 + IF - Test au noir du Soudan : Catalase ............................................................................... + 1. Recouvrir le frottis fixc dans unc solution de noir du Soudan B Oxydase de Kovacs ........................................................... + a 0,3 % dans de !'ethanol a 70 %. Incuber I 0 minutes a la tempera- Reduction des nitrates........................................................ + ture du laboratoire. 2. Egoutter la solution colorante. Laver rapidement sous un filet Utilisation de citrate .......................................................... . + d'eau courante. Enlever la quantile d'eau excedentaire au papier Croissance a 40 °C ........................................................... . absorbant. 3. Plonger rapidement le frottis dans du xylol. Seeber au papier absorbant. Croissance dans une solution a 1 % de NaCl .............. .. + Croissance dans une solution a 2 % de NaCl ............... . Attention, le xylol est un produit dangereux. Travailler sous une Arginine dihydrolase ......................................................... . hotte de chimiste. Liquefaction de gelatine ................................................... . 4. Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse de safranine Hydrolyse de l'amidon ..................................................... . a 0,5 % et incuber JO secondes a la temperature du laboratoire. Hydrolyse de l'esculine .................................................... . Attention, la safranine est un produit dangereux. Operer sous unc Production de levane ........................................................ . hotte de chirniste. 5. Laver sous un filet d'eau courantc. Secher au papier absorbant Les milieux et les techniques sont donnees dans Lelliott et Stead et recouvrir d'une lamelle. (1987). 6. Examiner le frottis colore au microscope a immersion sous un Test d 'immunofluorescence : film d'huile, a un grossissement de I 000, sous lumiere transmise Preparer une suspension de ID6 cellule,/ml au moyen de la culture nonnale. realisee et d'une souche ternoin positive. Preparer une serie de dilu- Les granules de PHB presents dans les cellules de Ralstonia sola- tions au demi de !'antiserum. Suivre la procedure du test d'immuno- nacearum presentent une coloration bleu noir. Les parois des eel- fluorescence (section lll.2). Le titre obtenu avec la culture en immu- Jules sont colorees en rose. nofluorescence doit etre identique a celui obtenu avec la souche temoin. Autres tests : Test ELISA: Les autres tests de tri appropries sont I' immu notl uorescence (sec- tion 111.2), !'ELISA (section 111.3) et la PCR (section IIl.4). Preparer une suspension contenant plus de HY' cellules/ml de la culture bacterienne et d'une souche temoin positive. Appliquer la procedure du test ELISA (section 111.3). Les valeurs obtenues en 3. Procedure d'isolement ELISA avec la culture doivent etre equivalentes a celles obtenues avec la souche temoin. 3.1. Prelever de l'exsudat ou des morceaux de tissu decolore, soil a Test de PCR: partir de l'anneau vasculaire du tubercule, soit a partir des vais- Preparer une suspension contenant ID6 cellules/ml au moyen de la seaux de la tige. Mettre en suspension dans un petit volume culture bacterienne et d'une souche temoin positive. Appliquer la d'eau distillee sterile ou dans un tampon au phosphate 50 mM. procedure du test de PCR (section IIl.4). Le produit PCR de la Laisser reposer 5 a 10 minutes sur la paillasse. culture doit avoir la meme taille et le meme profil de restric- 3.2. Preparer une serie de dilutions, par exemple au 1/10 et au 1/100 tion (REA) que ceux obtenus avec la souche temoin positive. de la suspension, ou plus si cela est juge necessaire. Hybridation fluorescente in situ (FISH-Fluorescent in situ 3.3. Transferer un volume standard de la suspension et des dilutions hybridisation) : sur un milieu de culture general (NA, YPGA et SPA, appen- Preparer une suspension de I 06 cellules/ml au moyen de Ja culture dice I) et/ou sur le milieu tetrazolium de Kelman (appendice I), bacterienne et d'une souche temoin positive. Appliquer la procedure et/ou sur le milieu semi-selectif SMSA (appendice 7). Etaler a du test FISH (van Beuningen et al., 1995), avec l'amorcc PCR !'aide d'une technique d'etalement en nappe ou a l'anse sterile. OLl-1 (Seal et al., 1993). La culture doit presenter une reaction Si cela est juge utile, preparer des boites de Petri avec chaque identique a celle de la souche temoin positive. milieu, ensemence avec une suspension bacterienne virulentc Profil proteique : appartenant au biovar 2, race 3 de Ralswnia solanacearum, pour temoin positif. Les proteines totales de la bacterie sont separees par electropho- rese sur gel de polyacrylamide (PAGE) en conditions denaturantes 3.4. lncuber les boites pendant 3 jours a 28 "C. L'incubation peut (Stead, 1992 a). etre prolongee jusqu'a 6 jours si la croissance est lente, mais Test de profil des acides gras (FAP, fatty acid profiling) : les colonies sur milieu SMSA deviennent atypiques et meurent. Sur milieu nutritif general, les isolats virulents de Ralstonia Cultivcr la culture bacterienne et ce!le d'une souche temoin posi- tive pendant 48 heures a 28 °C sur des boites gelosees de trypticase sulanacearum fonnent des colonies tluides, a bard irregulier, plates, blanchatres et presentant frequemment des verticilles soja, puis appliquer la procedure du test FAP (Janse, 1991 ; Stead, caracteristiq ues. 1992a; Stead, 1992b). Le profit de la culture doit etrc identique a cclui du temoin positif. Dans Jes conditions specifiees, les acides Sur milieu « tetrazolium de Kelman », les colonies virulentes gras caracteristiques sont les suivants : 14:0 30H. 16:0 20H, 16: I typiques de Rafawnia solanacearum sont de couleur creme, 20H et 18:1 20H. plates, a bord irregulier, tluides, avec un centre de couleur rouge sang. Les fonnes avirulentes de Ralstonia solanacearum 4.2. Caractcrisation de la souche. donnent des colonies butyreuses, de couleur rouge sombre. La caracterisation de la souche est facultative mais conseillee Sur milieu nutritif SMSA, les isolats virulents de Ralstonia en presence d'un cas nouveau. Utilisez au mains l'un des tests solanacearum forment des colonies blanc laiteux, plates, suivants: fluides, a bord irregulicr et avcc un centre rouge a violac6. Determination du biovar : Les isolats non virulcnts de Ralstonia solanacearum forment On distingue differents biovars de Ralstonia so/anacearwn en des colonies moins fluides de couleur uniforme rose a rouge fonction de leur aptitude a utiliser et/ou a oxydcr trois hexoses sur le milieu nutritif SMSA. alcools et trois sucres (Hayward, I 964 & 1994): 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANyAISE 5379 - rcduire et dilacerer dans un petit volume d'eau sterile BIOVAR ou de tampon phosphates 50 mM. Puis etaler sur des boites, incuber, et rechercher l'apparition des colonies 2 3 4 5 typiques de Ralstonia solanacearum. Section III Utilisation de : - maltose .............................. .. + + + Detection et identification de Ralstonia solanacearum - lactose ................................ .. + + + sur des echantillons de tubercules de pomme de terre - eel lobiose .......................... .. + t t Noia. - La taille de l'echantillon standard est de 200 tubercules. Cepen- - ma11nitol.............................. . t + + dant, la procedure peut etre appliquee a des echantillons de moins de - sorbitol ................................ . + + 200 tubercules, - dulcitol ................................. + + I. Preparation de l'echantillon pour le test Des tests supplementaires differencient le biovar 2 en trois pheno- Nora. - L'extrait concentre de pomme de terre obtenu suivant cette prn- types secondaires (Hayward, 1994): cedure pe.ut servir egalement ll la detection de Clavibacter michig,mensis subsp. sepedonicus. BIOVAR 2 BIOVAR 2-A BIOVAR 2-T Operations prealables eventuellement utiles : i) Incuber l'echantillon a une temperature de 25 a 30 ''C pen- dant une periode pouvant atteindre 2 semaines afin de faciliter Utilisation du trehalose ... - t t la multiplication des faibles populations de Ralstonia solana- Utilisation de l'inositol.. ... + - + cearum; Utilisation du D-ribose ..... - - + ii) Laver les tubercules a l'eau courante en utilisant des Activite pectolytiq ue ......... Faible Faible Forte desinfectants et des detergents appropries. Secher les tubercules a !'air. Determination de la race : 1.1. Enlever la peau du tubercule au niveau du talon au moyen d'un La race (Buddenhagen et al., 1962) est determinee sur la base du scalpel ou d'un couteau a legumes propre et desinfecte. de resultat d'un test de pouvoir pathogene effectue sur des plants de fai;:on a faire apparaitre Jes tissus vasculaires. Decouper soi- tomates ou d'aubergines et sur des plants de tabac grace a un test de gneusement un petit cone de tissu vasculaire (de 3 a 5 mm de reaction d'hypersensibilite (HR) sur des feuilles de tabac (Lozano et diametre) au niveau du talon de chaque tubercule. Prelever Sequeira, l 970) : aussi peu que possible de tissu non vasculaire. Proceder ainsi pour chacun des tubercules de l'echantillon. Nora. - JI est possible a ce stade de proceder ll un examen visuel RACE I*} des tubercules (section JL l ), Mettre de cclte les tubercules presentant des sympt6mes et Jes tester a part (section II). 1 2 3 1.2. Rassembler Jes talons dans un recipient ferme. II est preferable de trailer immediatement Jes talons. Sinon, ii est possible de Jes entreposer pour une periode de moins de 24 heures ou de Reaction su r : moins de 72 heures. a 4 °C. - plantes de 1.3. Trailer Jes talons en suivant l'une des procedures ci-dessous : tomates/auber- gines ....................... Fletrisse ment Pas de reaction Fletrissement i) Placer Jes talons dans un recipient approprie : - plantes de tabac. Fletrissement Pas de reaction Pas de reaction Ajouter un volume suffisant de tampon de maceration - feuilles de tabac. Necrose Hyper- Chlorose (appendice 2) de fa,;on a recouvrir les talons. (48 heures) et sensibilite (2-8 jours) Reduire Jes talons dans un mixeur de type Waring Blender fletrissement (12-24 heures) ou dans un mixeur de type Ultra Thurrax jusqu'a homogeneisa- {7-8 joursl tion complete. Eviter une homogeneisation excessive. Laisser le maccrat reposer pendant 15 a 30 minutes. (*) La race 4 (pathogene du 3,ingembre et de quelques autres ii) Placer les talons dans un recipient approprie. hotes) et la race 5 (pathogene u murier seulemenU ne sont pas Ajouter un volume suffisant de tampon de maceration pour incluses. couvrir lcs talons. Placer les cones sur un agitateur rotatif. La caracterisation de la race par le test du pouvoir pathogene ou a lncuber a une vitesse de 50 100 tours par minute pendant par le test d'hypersensibilite sur tabac peut n'etre pas tres repetable, 4 heures a une temperature de 20 a 22 oe:: ou pendant 16 a aussi la race peut-elle etre deduitc du biovar et de l'hote nature] a 24 heures une temperature de 4 °C. d'origine. iii) Placer Jes talons dans un sac de maceration jetable resis- La caracterisation de la culture peut etre completee comme suit : tant (par exemple sac Stomacher de 105 mm x 150 mm, steri- Empreinte genomique : lise par radiations ionisantes). Les procedes suivants permettent de realiser une differenciation Broyer Jes talons soigneusement au moyen d' un outil appro- moleculaire des souches a l'interieur du complexe Ralstonia solana- prie, par exemplc un marteau, jusqu'a homogeneisation juste cearum: complete. Analyse du polymorphisme de longueur de fragments de restric- Ajouter une quantile suffisante de tampon de maceration de tion (RFLP) (Cook et al., 1989) ; fa~on a recouvrir Jes talons broyes. PCR sur des sequences repetitives (rep-PCR) [REP-, ERIC- & Laisser le macerat decanter de 15 a 30 minutes. BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995)]. I .4. Extraire les bacteries des cones provenant des talons par l'une 4.3. Test du pouvoir pathogene. des methodes suivantes: Ce test est realise pour la confirmation des diagnostics de i) Transferer doucement le macerat dans un tube de centrifu- Ralstonia solanacearum et pour confirmer la virulence des gation en laissant Jes debris dans le recipient ou dans le sac. Si cultures identifiees en tant que Ralstonia solanacearum. le macerat decante reste trouble, le centrifuger a 180 g au Preparer un inoculum de l O' ccllules/ml partir de la culture a maximum pendant 10 minutes, a une temperature inferieure a et d'une souche temoin positive. Inoculer 5 a 10 plantes de IO"C. tomates ou d'aubergines au stade, de preference, de la troisieme Centrifuger le macerat decante, ou le liquide sumageant issu vraie feuille ou plus (section lll.6). lncuber pendant une pe- de la premiere phase de centrifugation, a une vitesse de 7 000 g riode pouvant atteindre 2 semalnes a une temperature de 22 a pendant 15 minutes ou a 10 000 g pendant 10 minutes a une 28 "C a raison d'un arrosagc quotidien, en maintenant une temperature inferieure a IO C. 0 humidite relative elevee. Observer !'apparition de symptomes Jeter le liquidc surnageant sans deranger le culot. de fletrissement et/ou d'cpinastie, de chlorose et de rabou- ii) Filtrer le macerat dans un dispositif filtrant (pores de dia- grissement. metre 40-100 µm). Accelerer la filtration a !'aide d'une pompe lsolement a partir des plantes symptomatiqucs, commc suit : a vide. - prelever un morceau de tige a 2 cm du point d'inocula- Recueillir le filtrat dans un tube de centrifugation. tion; Laver le filtrc au moyen du tampon de maceration. 5380 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBUOUE FRANt;AISE 11 avnl 1999 Centrifuger le filtrat il une vitesse de 7 000 g pendant Figure 2 15 minutes ou a une vitesse.de IO 000 g pendant 10 minutes a une temperature inferieure il I O"C. Preparation de la lame de teSI confonniment Jeter le liquide sumageant sans deranger le culot. mu: indications foumies en 2.1 ii) et 2.3 ii) 1.5. Remettre en suspension le culot dans un tampon de 1 ml (appendice 2). I1rnn 111 f)(Kl ~ D.lunr,n ,l..,.-,r11.1fr cJ.r Le diviser en deux partie5 egales et placer chacune dans un l'f~C,~r! ~" ,ui>""M,,,~ ., . microtuhe. ; tc,~mill,~n t Uti!iser l'un des microtuhes pour cffectuer le test. Pendant ce I temps, conserver la partie restante de cct extrait a une tempera- D,11i;-,I~ cl,:- ture de 4 "C. 1 I ~, ti.;in111f, ,ri 1 1 {Ju ..,_i',:iN,ilr"n ;'._ ,, Ajouter de I O a 25 % (en volume) de glycerol sterile a l'autre microtube. Vortexer et conserver a une temperature de - 18 "C (plusieurs semaines) ou de - 70 ·'C (plusieurs mois). 2.3.1. Disposer Ies tames sur du papier absorbant. Couvrir les puits de lame de test avec des dilutions d' antise- 2. Test d'immunofluorescence rum. Appliquer le tampon PBS sur Jes puits FITC. La quantite d'antiserum appliquee doit etre equivalente :l. la quantite d'ex- Utiliser un antiserum anti-Ralsronia solanaceamm de preference trait conccntre. dirigc contre la race 3/biovar 2. Detcrn1iner le titre requis sur une 2.3.2. lncuber sous un couvercle pendant 30 minutes a la tempera- suspension contenant I O" cellules/ml de la souche homologue de ture ambiante. Ral.rtonia so/anacearum, au moyen d'une dilution appropriec de !'antiserum conjugue a l'isoth1ocyanatc de tluoresceine (FITC), 2.3.3. Eliminer Jes gouttclcttes d'antiserum et rincer soigneuscment confonnement aux recommandations du fabricant. L'antiserum brut Jes James dans une solution tampon pour immunof1uorcsccncc. devrait avoir un titre d'immunot1uorcsccncc d'au mains I : 2 (XJO. Laver 5 minutes dans une solutrnn tampon IF-Tween et aprcs Utiliser des tames a plusieurs puits pour microscope comportant !aver 5 minutes dans une solution tampon IF (appenct·1ce 3), de preference l O fenetres d'au moins 6 mm de diametre. Elimmer avec soin le tampon excedentaire. Placer sur chaque lame un tcmoin conJugue FlTC. Il convient de 2.3.4. Poser Jes James sur du papier absorbant humide. repeter le test avec une preparation tcmoin PBS en cas d'occurrence Couvrir !es puits correspondant a l 'echantillon et ceux du de cellules positives sur la preparation temom conjugue FITC. puits tcmoin FJTC avec du con1ugue FlTC a la dilution utilisce Preparer des lames temoins positives distinctes avec une suspen- !ors du titrage. La quantile de conjugue appliquee aux puits sion contenant I 06 ccllu!es/ml d' une souche de raceJbiovar apprn- doit etre identique a la quantile d':rntiscrum ut1lisce, price de Ralstonia solanaceamm. Prcvo1r une lame de ce type pour 2.J.5. Laisser incuher 30 minutes sous un couvercle a la tempera- chaque scrie de tests. ture amb1anle. 2.1. Prcparer les lames en utilisant l'une des methodes suivantes : 2.3.6. Eliminer les gouttes de conJuguc. Rineer et laver comme indi- i) E;,;traits finals contenant rc!at1 vemcm peu d'arnidon : quc ci-dcssus (2.3.3.). Deposer a la pipette sur une rangee de fcn~tres un volume En lever soigneusement l' humtditc excedcnraire. standard ( 15 µI est une quantile suffisantc pour un diami:trc de 2.3.7. Deposer :l. lJ pipette 5 a 10 µl d'un tampon phosrhate 0.1 /vl fcnetre de 6 mm - choisir une quantite plus importante pour les avcc glycerol (appendicc 3) ou un support similaire, sur chaque puits de plus grand diametre) de la suspension d'exlrait final. pu1ts: rccouvrir d'une lamelle. La r:ingee su1vante peut scrvir de douhle ou servir :1 un deu;,;ieme echanl!llon, comme indiquc :\ l;i figure l. 2.4. Lecture du test d' immunotluorescence, ii) Dans le cas des autres cxtra1ts : Examiner les l:.imes de lest avec un microscope equip6 <.l'une source lumineuse ep1fluorcsccnte et de filtres adaptes pour tra- Preparer des dilutions decimales (1/10, l/100 et 1/1 000) de vailler avec l'isothiocyanate de fluorcsceine, sous hu1le a un l'extraJt final dans la solution tampon. Deposer a la pipette sur grossissement de 500 :'i. I 000. Examiner les puits scion une ran gee de fenetres un volume standard ( 15 µ.I est une quan- drux d1amctres perpendiculaires et en suivant le pourtour. tite suffisante pour un diamctre de fenetre de 6 mm - cho1sir une quantite plus importante pour Jes puits de plus grand dia- Commencer par contr61er la lame temoin positif. Les cellu les metre) de la suspension d'extrait pur et de chaque dilution. La doivcnt presenter une fluorescence vivc, surtout leur pourtour. ,"iota, - Le test doit etre recommence si la coloration n'est pas rangee suivante peut servir de double ou servir a un dcuxieme tx,nnc. echantillon. commc indique a la figure 2. Cnntr6ler tout d' abord l' absence de cellules lluorescentes 2.2. Laisser sechcr les gouttes. Fixer les cellules bacteriennes sur la dans Jes puits lemoins FITC. La presence de cellules tluores- lame en chauffant, en passant a la flamme, ou avec de 1' ethanol ccntcs dans le temoin FITC indique une liaison non specifique a 95°. du conjugue ou la presence de cell uks autotluorcsccnte, ou de 2.3- Procedure du test d'immunofluorescencc. ccllulcs contaminantes. i) Conforn1cment a la mcthodc de preparation des James de Now. - Dans ce ea.,, le lest doit etre recommence, test indiquee en 2.1 i) : Ree here her la presence de cellules presentant une tl uorcs- Preparer une serie de dilutions au demi de !'antiserum dans ccnce vivc, ayant unc morphologie caracteristique de Ralstonia un tampon d'immunotluorescence (appendice 3) : l/4 du titre so/anaceamm dans lcs puits cchantillons. L'intensite de fluo- (T/4), 1/2 du titre (T/2), titre (T) et deux fois le titre (2T}. a rescence doit etre equivalente celle de la souche temoin posi- ii) Conforn1ement a la mcthode de preparation des lames de tive pour une dilution d'antiserum identique. Les cellulcs dont test indiquee en 2. l ii) : la coloration est incomplete ou dont la t1uorescence est foible Preparer la dilution de travail de !'antiserum dans un tampon nc doivent pas etrc prises en consideration a mains qu'clles ne d'immunofluorescence. La dilution de travail est la dilution de so1ent particulicremcnt nomhreuses (voir l'interpretation du !'antiserum offrant la specificitc optimale et egale habituellc- test !F). ment a la moitic du titre. lnte111retation du test d'immunolluorescence •. i) Le test d'immunofluorescence est negatif pour tout cchan- tillon nc contenant aucune cellule presentant une fluorescence Figure 1 vive et une morphologie caracteristique. ii) Si l'echantillon contient des cellules avec une fluores- Preparation de la lame de test conformimenr cence vive et une morphologie caracteristique, determiner le aux indications foumies en 2.1 i) et 2.3 i) nombrc moyen de cellules par champ microscopique et calculer le nombrc de cellulcs (N)/ml d'extrait conccntre remis en sus- Dilution standard de l'extrait concentre en suspension pension (appcndicc 4). rT ~ trl~t>J Une population d'approximativcment 10' cellules/ml d'extrait conccnlre rcmis en suspension est considcrce comme etant la n FITC "' T,S -, fl1j,,c.,1l'I, ,],.,1,hln d~ 1· .l"!"~''"T'I limite de detection pour le test IF : - pour des echantillons contcnant N > 1O' cellules/ml, le ., ., ., • E,,;-hannllon 1 Doubi~ de, t·bc:~.1.-.~~Jlor, I OU- n:h.Jnullon 2 •• •- •• •• .,, 5 e,o_J l test d' immunolluorescence est considcre posit if; pour des echanlillons contenant N < )(}1 cellulcs/ml. le test d' ·1mmunotluoresccnce peut etre considfrc cnmme posit1f. 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FAANyAISE 5381 iii) Si un grand nombre (N > 10' cellules par ml) de cell~les 4.4. Preparer le melange destine a la PCR (appendice .6) dans un incompletement ou faiblement t1uorescentes est observe au lltre microtube sterile, en ajoutant Jes composants suJVants dans de I' antiserum, un second test doit etre realise : I' ordrc indique ci-dessous : - soit un test base sur un autre principe biologique ; Pour un volume de reaction de 50 µI. - soit un test JF prepare avec un autre antiserum ou avec une dilution au dixieme du culot. CON CE NTRA TIO N COMPOSANT OUANTITE finale 3. Test EUSA Eau distille sterile ou ultra epuree .. 30,8 µ.1-33,8 µI (d'apres Robinson-Smith et al., 1995) 10 x Tampon PCR .................................. 5,0 µI 1X Utiliser un antiserum anti-Ralstonia so!anacearum dirige de pre- d-ATP ......................................................... 1,0 µI 0,2 mM ference contre la race 3/biovar 2. Determiner le titre avec une sus- d-CTP ......................................................... 1,0 µI 0,2 mM pension contenant l06 cellules/ml preparee avec la souche homo- d-GTP ......................................................... 1,0 µ.I 0,2 mM logue de Ralstonia solanacearum. d-TTP ......................................................... 1,0 µ.I 0,2 mM II est conseille d'utiliser les plaques de microtitration NUNC- Amorce OLl-1 {20 µ.M) ........................ . 2,5 µI 1 µM Polysorp. Amorce Y•2 {20 µ.M} ............................ 2,5 µI 1 µ.M Utiliser comme temoin negatif un extrait de pomme de terre saine Pa lymerase taq {SU/,d) ........................ 0,2 µI 1,0 U et un temoin PBS. Utiliser une suspension contenant plus de 10" cellules/ml d'une Volume total ................................ 45 µ1-48 µI souche appropriee (race/biovar) de Ralstonia solanacearum il. titre de temoin positif. Tester de la meme fa;on que les echantillons, mais en Jes separant soigneusement sur la plaque de microtitration. Pour un nombre plus important de reactions : Calculer la quantile de chaque composant necessaire au 3.1. Pipetter 100 a 200 µI de l'extrait final et le deposer dans un nombre requis de reactions. rnicrotube. Melanger Jes composants et verser de 45 a 48 µl du melange Chauffer 4 minutes a I 00 ''C. Plonger le microtubc dans la dans des microtubes steriles de test de PCR_ glacc. Conserver sur glace les microtubes contenant le melange 3.2. Ajouter un volume identique de tampon carbonate concentre reactionnel destine a la PCR. 2 fois (appendice 5). Homogeneiser au vortex. Pour des volumes de reaction de 25 µI : 3.3. Deposer des aliquots de 100 µI sur au moins deux puits de la Reduire proportionnellement Jes quantites de chaque compo- plaque de microtitration. Incuber une heure a 37 "C ou une nuit sant. a 4°c. 4.5. Amplification par PCR. 3.4. Eliminer Jes extraits concentres des puits. Laver ces demiers a 4.5.1. Facultatif. Centrifuger pendant quelques instants Jes micro- trois reprises. Utiliser PBS-Tween (appendice 5), en laissant la tubes contenant Jes echantillons bouillis et le temoin posit.if. demiere solution de lavage dans Jes puits pendant au moins 5 minutes. Ajouter dans l'ordre prescrit de 2 a 5 µI des echantillons. du temoin eau et du temoin positif aux differents microtubes 3.5. Preparer la dilution appropriee d'antiserum anti-Ralstonia sola- contenant le melange de PCR. Placer les microtubes dans le nacearum dans la solution tampon de saturation (appendice 5). bloc chauffant du cycleur. Deposer 100 f.Ll de dilution antiserum dans Jes puits. 4.5.2. Executer le programme suivant : lncuber 1 heure a 37 °C. I cycle de: 3.6. Eliminer !'antiserum contenu dans les puits. Laver les puits i) 2 minutes a 96 "C: denaturation de la matrice. comme indique ci-dessus (3.4). 50 cycles de : 3.7. Preparer la dilution appropriee de !'antiserum conjugue a la ii) 20 secondes a 94 °C : denaturation : phosphatase alcaline dans le tampon de saturation. Deposer 100 µI de la dilution conjuguee dans les puits. iii) 20 secondes a 68 °C : hybridation avec les amorces ; iv) 30 secondes a 72 "C: extension de l'ADN complemen- lncuber une heure a 37 °C. tairc. 3.8. Eliminer le conjugue verse dans les puits. Laver ces derniers I cycle de: comme indique ci-dessus (3.4 et 3.6). v) 10 minutes a 72 •,C : extension finale. 3.9. Preparer la solution du substrat de la phosphatase alcaline (appendice 5). Deposer 100 f.Ll dans Jes puits. Incuber l cycle de: 30 minutes a une heure a l'obscuritc, a la temperature du labo- vi) maintien a 4 °C. ratoire. Nora. - Ces parametres correspondent a un appareil Perkin 3.10. Mesurer l'absorbance a 409 nm. Elmer 9600. D'autres types de cycleur thennique peuvent ex.iger la presence d'une goutte d'huile minerale dans les microtubes ou une Interpretation du test ELISA : modification de la duree des etapes ii), iii) et iv) du profil d'amplifica- Le test ELISA est negatif si la densite optique de l'echantil- tion. lon est inferieure au double de celle du temoin negatif. 4.5.3. Retirer Jes microtubes du cycleur thermique. Analyser le pro- Le test ELISA est positif si la densite optique de l'echantil- duit de la PCR. Si !'analyse n'est pas faite immediatement, les lon est superieure au double de cellc du temoin negatif. microtubes doivent etre conserves a 4 "C en vue d'une utilisa- tion le jour meme ou a - 18 ''C en vue d'une utilisation ulte- 4. Test PCR rieure. 4.6. Analyse du produit de reaction PCR. (d'apres Seal et al .. 1993) Les produits d'amplification par PCR sont detectes par elec Nota. - II faut utiliser des cones de pipettes a filtre pour toutes les etapes trophorese en gel d'agarose et par coloration au bromure d'ethi de la preparation des echantillons et pour les autres manipulations concer- dium. nant la PCR. 4.6.1. Preparer un gel d'agarose approprie en amenant doucemcnt a Preparer une suspension de I Cl" cellules/ml de la race 3/biovar 2 ebullition l'agarose dans une solution tampon d'electrophorese de Ralstonia solanacearum a titre de tcmoin positif. Tester de la Iris-acetate. merne fa-;:on que l'echantillon. 4.6.2. Refroidir l'agarose fondu a une temperature de 50 a 60 "C 4.1. Deposer a la pipette 100 µI de l'extrait concentre en suspension Verser dans le moule du bloc d'electrophorese et introduire le dans un microtube. peigne. Laisser la solution se solidifier. II est egalement possible de deposer 90 f.Ll de I' cxtrait 4.6.3. Retirer le peigne. Recouvrir le gel de tampon tris-acetate jus concentre remis en suspension dans un microtube contenant qu'a ce qu'il soit a peine recouvert (2-3 mm) par la solution 10 µI d'une solution a 0,5 M de NaOH. Melanger en retour- tampon. nant le microtube a plusieurs reprises. 4.6.4. Deposer des gouttes de 3 µl du tampon de lest sur du para 4.2. Chauffer pendant 4 minutes a 100 "C. Transferer immediate- film. Ajouter 12 µI du produit de PCR provenant des echantil ment le microtube sur la glace. Ions, du temoin positif ou du temoin eau et melanger en asp1 4.3. Preparer au moins deux dilutions au dixieme (par exemple au rant doucement avec l'extremite de la pipette avant de depose 1/10 et au 1/100 ou plus si necessaire), dans de l'eau distillee dans le gel. Les volumes indiques peuvent etre modifies afin de sterile ou dans de l'eau ultrapure. les a·uster a la capacite des puits du gel d'agarose. 5382 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FAANyAISE 11 avril 1999 4.6.5. Remplir soigneusement les puits du gel. Introduire pour refe- 5.5. Identifier Jes cultures pures (section Jl.4.1) et confirmer la pre- rence dans l'un des puits au moins un marqueur de poids mole- sence de cultures positives au moyen d'un test de pouvoir cul aire approprie. pathogene (section II.4.3). 4.6.6. Raccorder le generateur et la cuve d'electrophorese. Mettre le Interpretation du resultat du test de dilution-eta!ement : gel sous une tension de 5 a 8 V/cm jusqu'a ce que le front de Le test de dilution-etalement est negatif si aucune colonie l'indicateur de suivi se trouve a moins de I cm de l'extremite bacterienne n'est apparue au bcut de six jours, ou si aucune du gel. colonie caracteristique de Raistonia solanacearum n'est isolee, 4.6.7. Couper l'alimentation. Debrancher les fils de la cuve d'elec- sous reserve qu'aucune co!onie d'autres bacteries n'ait ete sus- trophorese. ceptible d'inhiber leur developpement et que Ralstonia solana- Retirer soigneusement le gel. Le tremper pendant 30 cearum est iso!e a partir des temoins positifs. a 45 minutes dans une solution de bromure d'ethidium. Le test de dilution-etalement est positif si l'on peut isoler des Nota. - II faut porter des gants jetables pour rnanipuler le brornure colonies caracteristiques de Ralstonia solanacearum. d'ethidiurn qui est un agent rnutagene puissant. 4.6.8. Decolorer dans l'eau distillee pendant lO a 15 minutes. 6. Test biologique 4.6.9. Visualiser les fragments d' AON amplifies sous lumiere ultra- (d'apres Janse, 1988) violette. Le produit de PCR de Ralstonia solanacearwn en pre- sence des amorces OLI-1 et Y-2 a une longueur de 288 bp. 6. !. Utiliser 10 plantes tests des plantules sensibles de tomates ou Verifier a nouveau par rapport au marqueur d' ADN et par rap- d'aubergines, au stade de la troisieme vraie feuille. S'abstenir port au temoin positif. d'arroser Jes plantes tests durant Jes 24 heures precedant \'ino- Now. - Le ternoin eau doit etre negatif dans tous Jes cas. Sinon le culation. test est i\ recommencer. 6.2. Repartir JOO µI d'extrait concentre entre Jes differentes plantes 4.6.10. Photographicr le gel si l'obtcntion d'un enregistrement per- tests. Inoculer dans la tige entre Jes cotyledons et en plusieurs manent est necessaire. autres endroits. 4.6.11. Confirmer l'authenticite du fragment amplifie par analyse de 6.3. Inoculer par la meme technique I O plantules avec une suspen- restriction enzymatique (REA - Restriction enzyme analysis). sion de ]()" cellules/ml d'une souche de race 3/biovar 2 de 4.7. Analyse de restriction enzymatique. Ralstonia .wlanacearum a titre de temoin positif et 10 autres 4.7.1. Transferer 8,5 µ1 du produit de PCR (4.5.3) dans un autre avec le tampon de reprise des culots, a titre de temoin negatif. microtube. Ajouter I µI d'une solution tampon enzymatique Separer Jes plantes du temoin positif des autres plantes pour concentree (10 x et 0,5 µl d'enzyme de restriction Ava II). eviter des contaminations croisees. 4.7.2. Melanger en aspirant doucement avec l'extremite de la 6.4. Poursuivre la culture des plantules jusqu'a 4 semaines a unc pipette. Si des gounelettes subsistent sur les parois du micro- temperature de 22 a 28 °C et avec un arrosage quotidien et une tube, le passer a la centrifugeuse a impulsions. Incuber pendant humidite relative elevee, Separer Jes plantes temoins positives une heure a 37 "C. des autres plantes, en evitant toute contamination. Observer !'apparition des symptomes du fletrissement: epinastie, chlo- 4.7.3. Analyser le fragment de PCR digere par electrophorese en gel rnse et/ou atrophie. d'agarose comme indique au point 4.6. Interpretation du resultat du test PCR : 6.5. Isoler la bacterie a partir des plantules des plantes infectees (section 11). Indentifier les cultures pures d'apres leur morpho- Le test PCR est negatif si le fragment caracteristique logie caracteristique (section 11.4.1) et confirmer la presence de de 288 bp n'est pas detecte et si le fragment est detecte pour la cultures de Ralstonia solanacearum au moyen d'un test de pou- souche tcmoin positive de Ralstonia .rnlanacearwn. voir pathogene (section Il.4.3). Le test PCR est positif si le fragment caracteristique de 288 bp est detecte et si !'analyse d'enzyme de restriction du 6.6. Si cela est juge necessaire, verifier 1' absence d'infection sur des fragment amplifie est identique a cclle de la souche temoin lots de plantes tests ne presentant aucun symptome d'infection. positive de Ralstonia solanacearum. Prelever sur chaque plante echantillon, 2 cm au-dessus du point d'inoculation, une section de tige de I cm. Homogeneiser Jes tissus en Jes pla9ant dans une solution tampon de maceration. 5. Test d'etalement sur milieu silectif Proceder a un test d'ensemencement par dilution (sec- (d'apres Elphinstone et al., 1996) tion Ill.5.1). Si le test est positif, indentifier les cultures d'apres !cur morphologie caracteristique (section ll.4.1) et confirmer la 5.1. Effectuer le test en utilisant une technique appropriee d'ense- presence de cultures de Ralstonia solanacearum au moycn d'un mencement par dilution, par exemplc en procedant comme test de pouvoir pathogene (section 11.4.3). suit: Interpretation des resultats du test biologique : i) Preparer au moins deux dilutions au dixieme, par cxcmple Le test biologique est negatif si les plantes tests ne sont pas au 1/10 et au 1/100, de l'extrait concentre mis en suspension infectees par Ralstonia solanacearum sous reserve que les dans la solution tampon. Deposer a la pipette un volume stan- plantes temoins inoculees soient infectees par Ralstonia .rnlana- dard (par exemple de 50 a 100 µI) de l'extrait concentre mis en cearum. suspension et de chacune des dilutions sur un milieu nutritif Le test biologique est positif si Jes plantes echantillons sont selectif SMSA (appendice 7) et etaler sur une boi'te, sur toute la infectees par Ra/stonia solanacearum. surface du support. Si ccla est juge necessaire, realiser egalement un etalcment 7. Test d'enrichissement en stries avec une anse platinee de 10 µI. Flamber l'anse entre chaque serie de stries. (d'apres J. G. Elphinstone et al., 1996) ii) Verser un volume standard (50-100 µl) de l'extrait concentre sur un milieu selectif nutritif modifie SMSA, puis 7.1. Verser 100 µl d'extrait dans 3 ml de milieu nutritif modi- l'etaler au moyen d'une tige de verre sur toute la surface du fie SMSA (appendice 7). milieu nutritif. Ensemencer au moins deux boites de 7.2 Incuber pendant au moins 48 heures sans toutefois depasscr milieu SMSA modifie sans flamber la tige entre deux etalements 72 heures a une temperature de 28 °C, sans refermer herme- du meme echantillonnage. tiquement le bouchon du tube. pour permettre son aeration, 5.2. Au moyen de la meme technique d'ensemencement par dilu- 7.3. Fermer hermetiquement le bouchon et vortexer. Preparer des tion, appliquer une suspension de 1()6 cellules/ml d'une souche aliquots pour le test d'immunofluorescence (section II 1.2), le de race 3/biovar 2 de Ralstonia .rnlanacearum a titre de temoin test ELISA (section 111.3) et/ou le test PCR (section 111.4). positif sur une autrc serie de boites de milieu nutritif SMSA modifie. 8. Test du pouvoir pathogene 5.3. Incuber les boi'tes a 28 "C. Commencer le releve des observa- tions apres trois jours. En cas de resultats negatifs, prolonger Voir section II.4.3 !'incubation jusqu'a six jours. Les souches virulentes de Ralsto- nia solanacearum forment des colonies de couleur blanc lai- Appendice 1 t~ux, planes, irregulieres et fluides avec des centres rouges a MILIEUX NUTRITIFS D'ISOLEMENT ET DE CULTIJRE violaces nettcment apparents, prescntant des strics interncs ou DE RALSTON/A SOl.ANACEA.RUM des vcrticilles. 5.4. Purifier les colonies presentant une morphologie caracteristique Gelose nutritive (NA) : e~ les repiquant sur un milieu nutritif de type general (appen- Gelose nutritive (Difeo): 23 g; d1ce I). Eau distillee : 1 litre; 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANyAISE 5383 Preparer le milieu par volumes d'un demi-litre dans des flacons Appendice 3 d'un litre; MATERIEL NECESSAIRE AU TEST D'IMMUNOFLUORESCENCE Dissoudre Jes ingredients ; Steriliser a !'autoclave a 121 °C pendant quinze minutes; Tampon IF: PBS 10 mM a pH 7,2 : Refroidir a 50 °C. Verser dans les bottes. Ce tampon est utilise pour la dilution des antiserums : Gelose a base de levure-peptone-glucose (YPGA) : Na,HPO.I2H,0: 2,7 g; Ex trait de levure (Difeo) : 5 g ; NaH,P0,2H,O: 0,4 g; Bacio peptone (Difeo) : 5 g; NaCl: 8 g; D(+)-glucose (monohydrate): 10 g; Eau distillee : I litre ; Bacto agar (Difeo) : 15 g ; Dissoudre les ingredients et controler le pH. Diviser en parties Eau distillee : l litre ; aliquotes, selon Jes besoins ; Preparer des milieux d'un demi-litre dans des flacons d'un litre ; Steriliser a !'autoclave a 121 •C pendant quinze minutes. Dissoudre les ingredients; Tampon IF-Tween : Steriliser a !'autoclave a 121 °C pendant quinze minutes; Ce tampon est utilise pour le lavage des lames. Ajouter 0,1 % de Refroidir a 50 "C. Verser dans les bo1'tes. Tween 20 au tampon IF. Gelose a base de saccharose-peptone (SPA): Glycerine tampon nee au phosphate 0, 1 M a pH 7,6 ; Ce tampon est utilise comme fluide de support sur Jes puits de la Saccharose : 20 g ; lame IF pour renforcer la fluorescence : Peptone : 5 g ; Na,HP0,12H,0: 3,2 g; K2HP04 : 0,5 g ; NaH,P0,2H,O: 0,15 g; MgSO47H,0: 0,25 g; Glycerol : 50 ml ; Bacto agar (Difeo) : 15 g ; Eau distillce: 100 ml. Eau distillee : I litre ; Preparer des milieux d'un demi-litre dans des flacons d'un litre; Appendice 4 Dissoudre Jes ingredients. Ajuster le pH a 7,2-7,4, si necessaire; Steriliser a l'autoclave a 121 "C pendant 15 minutes; DETERMINATION DU DEGRE DE CONTAMINATION Refroidir a 50 "C. Verser dans Jes bo1tes. LORS DU TEST D' IMMUNOFLUORESCENCE Milieu tetrazolium de Kelman : Superficie (S) d'un puits d'une lame multipuits: Acides casaminiques (Difeo) : I g ; 1t D' Bacio Peptone (Difeo) : 10 g ; (I) Dextrose : 5 g ; 4 Bacto agar (Difeo) : 15 g ; 011 D = diametre du puits. Eau distillee : I litre ; Superficie( s) du champ de I' objectif : Preparer des milieux d'un demi-litre dans des flacons d'un litre; n d' Dissoudre les ingredients ; (2) Steriliser a !'autoclave a 121 °C pendant quinze minutes ; 4 Refroidir a 50 °C ; 011 d = diametre du champ. Ajouter une solution aqueuse de chlorure de triphenyltetrazolium Calculer le diametre du champ (d) par mesure directe ou en appli- (Sigma), sterilisee par filtration, pour obtenir une concentration quant les formules suivantes : finale de 50 mg par litre ; ni' Verser dan s Jes holies. s = ---- (3) G' K2 x 4 Appendice 2 011 i = coefficient du champ (depend du type d'oculaire et varie de 8 a 24) ; MATERIEL NECESSAIRE A LA PREPARATION DE L'ECHANTILLON ou K = coefficient du tube (I ou 1,25) ; ou G = grossissement (100 x, 40 x, etc.) de l'objectif. Tampon de maceration : tampon au phosphate 50 mM a pH 7,0: Ce tampon est utilise pour la maceration des tissus : De (2), on tire : d = V/45 -;- Na,HP04 : 4,26 g ; KH2P04 : 2,72 g ; Eau distillee : I litre ; 1tF Dissoudre les ingredients et controler le pH. Di viser en parties 4 x---- (4) aliquotes, selon les besoins ; De (3), on tire: d = G2 K2 X 4 Steriliser a l'autoclave a 121 °C pendant quinze minutes; -------= 7t GK L'ajout de 5 % de polyvinyl pyrrolidone-40000 MWT (PVP-40) est recommande en cas d'application du test de PCR direct pour Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par reduire !'incidence de !'inhibition de !'amplification par les mole- champ (c). cules aromatiq ues de I' ex trait. Calculer le nombre de cellules fluorescentes typiques par L'ajout d'un defloculant, d'un agent antimousse ou d'un anti- puits (C). oxydant est recommande dans les cas 011 lcs procedures d'homoge- neisation Waring Blender ou Ultra Turrax sont utilisces pour la s C = C - maceration des cones de tissu de pommes de terre. s Flocons de Lubrol : 0,5 g par litre ; DC silicone antimousse : I ml par litre ; Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par milli- Pyrophosphate tetrasodique : I g par litre ; litre d'extrait concentre (N): Passer a !'autoclave separement. Ajouter jusqu'a obtention de la I 000 concentration souhaitee. N=Cx--xF y Tampon de reprise du culot : tampon au phosphate 10 mM a pH 7,2: 011y = volume d' extrait concentre sur le puits ; Ce tampon est utilise pour la resuspension et la dilution des culots ou F = facteur de dilution de I' ex trait concentre. de talons de pommes de terre : Na,HP0,12H2O: 2,7 g; NaH 2 P042H,0 : 0,4 g ; Appendice 5 Eau distillee: 1 litre ; MATERIEL NECESSAIRE AU TEST ELISA Dissoudre Jes ingredients et controlcr le pH. Diviser en parties aliquotes, selon Jes besoi ns ; Tampon carbonate double concentration a pH 9,6 : Steriliser a !'autoclave a 121 "C pendant quinze minutes. Na,CO, : 6,36 g; 5384 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRAN<;AISE 11 avril 1999 NaHCO,: 11,72 g; P e n i c i I . 0,5 mg par I (approximativement Sigma Eau di stillee : I I ; line-G : 825 unites) P-3032 Dissoudre Jes ingredients et controler le pH. Diviser en parties S e I s d e 50 mg par I aliquotes, selon Jes besoins ; tetrazo- Steriliser a !'autoclave a 121 °C pendant 15 minutes; lium: Du sulfite de sodium a une concentration finale de 0,2 % peut Dissoudre Jes ingredients dans de I' ethanol a 70 % aux concentra- etre ajoute comme antioxydant si l'extrait contient une fraction ele- tions donnees pour le volume de milieu prepare. Certains ingredients vee de molecules aromatiques. (polymixine B et chloramphenicol) doivent ftre legerement chaufles 10 x PBS a pH 7,4: et agites. NaCl: 80 g; Bouillon SMSA (Elphinstone et aL, 1996). KH,PO,: 2 g; Effectuer la mfme preparation que pour le milieu selectif, mais Na,HP0 4-l2H,0: 29 g; supprimer la gelose ou Jes sels de tetrazolium. Repartir dans des KC!: 2 g; tubes Universal de 30 ml a usage unique, a raison de 3 ml par tube. Eau distillee : I I ; Dissoudre Jes ingredients et controler le pH. Diviser en parties (*) Si jugee necessaire, une augmentation de la concentration de bacitra- aliquotes, selon Jes besoins ; cine a 300 ppm peut r&luire la contamination par bacteries saprophytes sans Steriliser a !'autoclave a 121 °C pendant 15 minutes. reduire la recuperation de Ralston/a solanacearum. PBS-Tween (PBS-T) : 10 x PBS: 100 ml; REFERENCES JO% de Tween 20 : 5 ml ; Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Eau distillee : 895 ml. Description of races in Pseudomonas solanacearwn. Phytopathology Tampon de blocage (anticorps) (doit etre fraichement pre- 52, 726. pare): Cook, D., Elizabeth, B. and Sequeira, L., 1989, Genetic diversity 10 x PBS : 10 ml ; of Pseudomonas solanacearwn : detection of restriction fragment Polyvinyle pyrrolidone-44 000 MWT (PVP-44): 2 g; length polymorphism with DNA probes that specify virulence and JO % de Tween 20 : 0,5 g ; hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, Poudre de lait : 0,5 g ; 113-121. 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Phyto- Preparer le milieu par volumes d'un demi-litre dans des flacons pathology 60, 838. d'un litre ; Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J.D. and Akkerrnans, Dissoudre les ingredients et contr6lcr le pH. Si necessaire, ajuster A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide le pH a 6,5 avant l'autoclavage. Ralslonia solanacearum ne se deve- probe against Clavibacter minchiganensis subsp. sepedonicu.s. Cana- loppera pas bien sur le milieu a pH > 7,0; dian Journal of Microbiology 39, I 029- l 034. Steriliser a !'autoclave a 121 "C pendant 15 minutes; Rohinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, Rcfroidir a 50 "C ; S. M. D., 1995. Production of antibodies to P.~eudomonas solanacearwn, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agri- Ajouter Jes ingredients suivants (tous de Sigma) pour obtenir les cultural Immunology 7, 67-79. concentrations finales specifiees : Seal, S. E.; Jackson, L. A.; Yong, J. P. W. and Daniels, M. J., Violet cris- 5 mg par I 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, tallise : P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA Sulfate de 100 mg par I (approximativement Sigma sequencing ; construction of oligonucleotide primers for sensitive p o I y - 600000 unites) P-1004 detection by polymerase chain reaction. Journal of General Micro- mixine B: biology 139, 1587-1594. B a c i I r a - 25 mg par I (approximativement Sigma Smith, J. J. ; Offord, L.C. ; Holderness, M. and Saddler, G.S., cine (*) : I 250 unites) B-0125 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Chloramphe- 5 mg par J Sigma Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environ- nicol: C-3175 memal Microbiology 61, 4262-4268. 11 avril 1999 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE FRANyAISE 5385 Stead, D.E. 1992a. Techniques for detecting and identifying plant ANNEXE V pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific 1. La determination de l'etendue de la contamination probable Publications, Oxford, 76-111. visee a !'article 5, point a. iii) et point c, iii). comprend Jes elements Stead, D. E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other suivants, lorsqu'ils sont pertinents : Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International - le materiel vegetal enumere cultive en un lieu de production Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. declare contamine conformement a !'article 5, point a, ii): Yan Beuningen, A. ; Derks, H. and Janse, J.D., 1995. Detection - le(s) lieu(x) de production ayant. dans le systerne de produc- and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tion, un lien avec le materiel vegetal enumere qui a ete declare with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) contamine conformement a !'article 5, point a, ii), y compris using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Ziichtungs- ceux partageant l'equipcment et les installations de production forschung 2, 266-269. soit directernent, soit par l'intermediaire d'un entrepreneur commun; - le materiel vegetal enumere produit dans le(s) lieu(x) de pro- ANNEXE lll duction vise(s) au tiret precedent, ou present dans !edit (lesdits) lieu(x) pendant la periode ou le materiel vegetal enumere qui a I. Dans tous les cas d'apparition suspectee pour lesquels on a ete declare contamine conformement a !'article 5, point a, ii). constate, lors du ou des test(s) de depistage pratique(s) selon la etait present dans Jes lieux de production vises au premier methode decrite a !'annexe II pour le materiel vegetal enumere ou, tiret ; dans tous Jes autres cas, selon toute autre methode officiellement - Jes entrepots oil le materiel vegetal enumere provenant des agreee, une reaction positive a confirmer ou infirmer par cette lieux de production vises ci-dessus est manipule ; methode, ii convient de garder et de conserver dans des conditions appropriees : - tout materiel, vehicule, recipient, entrepot ou partie de ceux-ci, ainsi que tout autre objet, y compris l'emballage, qui peut avoir - dans la mesure du possible, le lot, ou une partie de celui-ci ete en contact avec le materiel vegetal enumere qui a ete (d'ou l'echantillon a ete preleve) dans son emballage d'origine declare contamine conformement a !'article 5, point a. ii); avec etiquette ; - tout materiel vegetal enumere entrepose dans des structures ou - dans la mesure du possible, la partie restante des echantillons ; objets vises au tiret precedent ou en contact avec eux, avant - tout extrait residue! et materiel supplementaire prepare pour le !cur nettoyage ou leur desinfection ; ou Jes test(s) de depistage, tels que les James preparees en vue de tests d'immunofluorescence, et - a la suite de l'enquete et des essais vises a !'article 5, point a, i), dans le cas de la pomme de terre, les tubercules ou les - toute documentation pertinente, plants ayant un lien de parente ascendant ou collateral, par clo- et ce, jusqu'a l'achevement de ladite methode. nage, et, dans le cas de la tomate, une source commune avec le materiel vegetal cnumere qui a ete declare contamine confor- 2. En cas de confirmation de la presence de l'organisme, ii mement a !'article 5, point a, ii), et pour lequel, bien que les convient de garder et de conserver dans des conditions appropriees : resultats des tests concernant la presence de l'organisme aient - le materiel vise au point 1 ; ete negatifs, il apparait que la contamination est probable par le - un echantillon de la tomate contaminee ou un echantillon d'au- biais d'un lien clonal; bergine infecte par I' inoculation d 'ex trait de tubercule ou de - lc(s) lieu(x) de production du materiel vegetal enumere vise au plante, le cas ccheant, et tiret precedent ; - la culture isolee de l'organisme, - le(s) licu(x) de production du materiel vegetal enumere utili- et ce, pendant au moins un mois apres la procedure de notification. sant, pour )'irrigation ou le traitement par pulverisation, de l'eau declaree contaminee conformement a !'article 5, point c. ii) ;

ANNEXE IV - le materiel vegetal enumere produit dans des champs sub- merges par des eaux superficielles dont la contamination par Les elements sur lesquels porte l'enquete visee a !'article 5, l'organisme est confim1ee. point a, i), son! les suivants, lorsqu'ils sont pertinents: 2. La determination de la propagation possible visee a !'article 5, i) Lieux de production : point a, iv), et point c, iii), comprend : - culture, actuelle ou passce, de pommes de terre qui sont i) Dans les cas vises 11 !'article 5, point a, iv), la prise en liees par clonage a des pommes de terre declarees consideration des elements suivants : contaminees par l'organisme: - la proximite d'autres lieux de production ou le materiel - culture, actuelle ou passee, de tomates provenant de la vegetal enumere est cultive ; meme source que Jes tomates dcclarees contaminees par I' organisme ; - la production et !'utilisation communes des stocks de pommes de terre de semence : - culture, actuelle ou passee, de pommes de terre ou de tomates placees sous controle officiel en raison de la - Jes lieux de production utilisant, pour I' irrigation ou le presence suspcctee de I' organisme ; traitement par pulverisation de materiel vegetal enu- mere, des eaux supcrficielles dans Jes cas ou ii existe ou - culture, actuelle ou passee, de pommes de terre qui sont existait un risque d'ecoulement d'eaux superficielles a liees par clonage a des pommes de terre qui ont ete partir des lieux de production declares contamines cultivees dans des lieux de production declares contami- conformement a !'article 5, point a. ii). ou un risque de nes par l'organisme; submersion de ceux-ci ; - culture de pommes de terre ou de tomates situces 11 proximite de lieux de production contamines, et notam- ii) Dans les cas ou des eaux superficielles ont ete declarees ment des lieux de production partageant du materiel et contaminees conformement a !'article 5, point c, ii): des installations de production soit directement, soit par - le(s) lieu(x) de production produisant du materiel vcge- l'intermediaire d'un entrepreneur commun ; tal enumere adjacents aux eaux superficielles declarees - utilisation, pour I' irrigation ou le traitement par pul vcri- contaminees ou risquant d'etre submerges par ces eaux; sation, d'eaux superficielles provenant d'une source - tout bassin d'irrigation discrete associe aux eaux super- dont la contamination par l'organisme est confirmee ou ficielles declarees contaminecs. suspcctee; 3. Le detail de la notification comprend : - utilisation, pour I' irrigation ou le traitement par pulveri- sation, d' eaux superficielles provenant d' une source uti- - la date du signalement de !'apparition suspectee, conformement li see en commun avec des lieux de production dont la a !'article 4, et Jes dates du prelevement d'echantillons et de la contamination par l'organismc est confirmee ou suspcc- confirmation de la presence de l'organisme conformement a tee: !'article 5, selon le cas; - submersion actuelle ou passee par des eaux supcr- - une description des elements de la contamination declaree et de ficielles dont la contamination par l'organisme est la zone delimitee. confirmee ou suspectee, et 4. Le detail de la notification supplementaire comprend : ii) Eaux superficielles utilisees pour !'irrigation ou le traite- - pour tout envoi ou lot de pommes de terre declare contaminc, ment par pulverisation d'un ou plusicurs champs ou lieux de les cert.ificats phytosanitaires. le numero de passeport ou production dont la contamination par l'organisme est confirmee d'enregistremcnt des producteurs de pommes de terre, entrepots ou qui ont submerge ceux-ci. collectifs et centres d'expedition, selon le cas; JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBUOUE FRANCAISE 11 avril 1999 5386 pour tout envoi ou Jot de plants de tomates declare contamine, - des mesures sont prises en vue d'eliminer les plants les certificats phytosanitaires et le numero de passeport, confor- spontanes de pommes de terre et de tomates et les mement a Ja lisle de !'annexe V, partie A, chapitre (••, point autres plantes h6tes de I' organisme, y compris les 2.2, de la directive 77/93/CEE ; plantes adventices de la famille des solanacees, et - la denomination varietale et la categorie pour Jes stocks de - ne peuvent etre plantes: pommes de terre de semence et, si possible, dans tous Jes - ni tubercule ni plant de pornmes de terre ; autres cas ; ni plant ni semence de tornates ; - toutes Jes autres informations que la Commission pourrait sou- - en prenant en consideration Jes caracteristiques biolo- haiter en ce qui concerne le foyer declare. giques de l'organisme; - ni d'autres plantes holes;

ANNEXE VI ni des plantes de l'espece Brassica pour lesquelles ii existe un risque identifie de survie de !'orga- I. Les dispositions visees a !'article 6, paragraphe I, sont les sui- nisme; vantes; - ni culture pour laquelle ii existe un risque identifie - incineration, ou de propagation de l'organisme ; - utilisation comme aliment destine aux animaux apres un traite- durant la premiere campagne de rccolte des pornmes de ment thermique de telle sorte qu'i\ n'y ait aucun risque de sur- terre ou des tomates suivant la periode indiquee au tiret vie de l'organisme, ou precedent et a la condition que le champ ait ete declare - enfouissement profond dans un site d'elimination ne presentant exempt de plants spontanes de pommes de terre et de aucun risque d'ecoulement sur des terres agricoles ou de tomates et d'autres plantes hotes, y compris des plantes contact avec des sources d •eau susceptibles d'etre utilisees pour adventices de la famille des solanacees, pendant deux I' irrigation de terres agricolcs, ou campagnes eonsecutives au moins avant Ja plantation : - transformation industrielle par livraison directe et immediate a - dans le cas des pommes de terre, des pommes de une entreprise de transformation disposant d' installations d' eli- terre de semence officiellement certifiees sont plan- mination des dechets officicllement agreees qui sont en confor- tees exclusivement en vue de la production de mite avec Jes dispositions de !'annexe VII, ou pommes de terre de conservation. et - d'autres mesures, pour qu'i\ soil etabli qu'elles ne presentent - des recherches officielles cornportant des essais sont pas de risque identifiable de propagation de l'organisme; ces effectuees eonformement a I' article 2, paragraphe I ; mesures sont immediatemcnt notifiees a Ja Commission et aux - durant Ja campagne de recolte des pommes de terre autres Etats membres. ou des tomates suivant celle visee au tiret precedent et apres un cycle approprie de rotation, dans le cas 2. L'utilisation ou !'elimination appropriees du materiel vegetal des pommes de terre, des pommes de terre de enumere vise a \'article 6, paragraphe 2, sous le controle des orga- semence officiellement certifiees sont plantees pour la nismes officiels competents de l'Etat membre ou des Etats membres production de semence ou de pommes de terre de concerne(s) et moyennant une communication adequate entre Jes conservation et, dans le cas des pommes de terre et organismes officiels competents de maniere a garantir ce controle a des tornates, des recherches officielles sont effectuees tout moment ainsi que l'agrement de l'organisme officiel competent conformement a !'article 2, paragraphe I, soil: de l'Etat membre ou Jes pommes de terre doivent etre conditionnces ou transformees quant aux installations d'elimination des dechets ii) Pendant les cinq campagnes suivant cclle de la contami- visees aux premier et deuxieme tirets, comportent ; nation declaree ; - des mesures sont prises en vue d'eliminer Jes plants i) Pour les turbercules de pomme de terre : spontanes de pommcs de terre et de tomates et Jes - leur utilisation en tant que pommes de terre de conser- autres plantes hotes de l'organisme, y compris Jes vation destinees a Ja consommation et leur conditionne- plantes adventices de la famille des solanacees, et ment, dans des sites disposant d'installations appropriees - le champ est mis et rnaintenu, durant Jes trois premieres d'elimination des dechets, en emballages prevus pour annees, soit en jachere nue, soit en cereales selon le une livraison et une utilisation directes sans reemballage risque identifie, soil en piiturage permanent. auquel cas et destines a une tclle livraison et utilisation directes, ou ii est frequemment fauche ras ou mis en paturage inten- - Jeur utilisation en tant que pommes de terre de conser- sif, soil enherbe pour la production de semence, puis, vation destinees a la transformation industrielle apres pendant les deux annees suivantes, plante de plantes non livraison directe et immediate a une entreprise de trans- hates de J'organisrne pour lesquelles ii n'y a pas de formation disposant d'installations appropriees d'elimi- risque identifie de survie ou de propagation de J'orga- nation des dechets, ou nisme; - une autre utilisation ou elimination, pour autant qu 'ii - durant la premiere campagne de recolte de pommes de soit etabli qu'il n'y a pas de risque identifiable de pro- terre ou de tomates suivant la periode visee au tire! pre- pagation de I' organisme et sous reserve de I' agrement cedent: desdits organismes officiels competents. Ces mesures sont immediatement notifices a Ja Commission et aux - dans le cas des pommes de terre, des pommes de autres Etats membres ; terre de semence officiellement certifiees sont plan- tees pour la production de semence ou de pommes de ii) Pour d 'autres parties de plantes comprenant la tige et les terre de conservation, debris de feuill age : et des recherches officielles comportant des tests sont - Jcur destruction, ou effectuees conformement a I' article 2, paragraphe 1 ; - une autre utilisation ou elimination, pour autant qu'il b) Dans les autres champs ; soit etabli qu'il n'y a pas de risque identifiable de pro- pagation de l'organisme ; ces mesures sont notifiees a la - au cours de Ja campagne suivant la contamination declaree : Commission et aux autres Etats mcmbres. - aucun tubercule ou plant de pomme de terre ni aucune autre plante hote de J'organisme n'est plante(e), et des mesures 3. Les methodes appropriees de decontamination des objets vises sont prises en vue d'eliminer Jes plants spontanes de pommes a !'article 6, paragraphe 3, sont le nettoyage et, le cas echeant, la de terre et de tomates ainsi que les autres plantes h6tes, y desinfection, de telle sorte qu'il n'y ait aucun risque identifiable de compris Jes plantes adventices de la famille des solanacees, propagation de l'organisme; elles sont appliquees sous la surveil- selon le cas, ou lance des organismes officiels compctents des Etats membres. - dans le cas des tubercules de pommes de terre, des pommes 4. Les diverses mesures a mettre en ceuvre par les Etats membres de terre de semence officiellement certifiees peuvent etre dans la zone delimitee etablie conformement a l'article 5, point a, plantees exclusivement en vue de la production de pommes iv), et point c, iii), auxquelles ii est fait reference a !'article 6, para- de terre de conservation a condition que Jes organismes offi- graphe 4, sont Jes suivantes : ciels competents acquierent la certitude que le risque consti- 4.1. Dans Jes cas ou des lieux de production ont ete declares conta- tuc par les plants spontanes de pommes de terre et de mines conformement a !'article 5, point a, iii): tomates et autres plantes holes de l'organisme, y compris les plantes adventices de la famille des solanacees, a ete elimine. a) dans un champ ou une unite de production en culture pro- La recolte sur pied est inspectee a des moments opportuns, et tegee declare(e) contamine(e) conformement a !'article 5, des plants spontanes de pommes de terre sont soumis a des point a, iii), soit : essais visant a detecter la presence de l'organisme; en outre, i) Pendant au moins les quatre campagnes suivant la conta- dans le cas des pommes de terre, Jes tubercules recoltes sont mination dcclarcc : inspectes ; 11 avril 1999 JOURNAL OFFIC1EL DE LA REPUBLIQUE FRANCAISE 5387 - pendant la premiere campagnc suivant cclle visee au premier ab) Dans les cas ou des eaux superficielles ont ete declarees tirct: contaminees conformement a !'article 5, point c, ii), ou - dans le cas des pommes de terre, seules des pommes de terrc incluses parmi Jes elements de propagation possible de de sernence officiellement certifiees sont plantees, en vue de l'organisme conformemcnt a !'annexe V, point 2: la production de pommes de terre de semence ou de conser- - procedent a une enquete annuelle li. des moments oppor- vation: tuns, y compris au prelevement d'echantillons d'eaux - pendant au moins la deuxieme campagnc suivant celle visee au superficielles et de plantes h6tes appropriees de la premier tiret : famille. des solanacees dans Jes sources appropriees ainsi - dans le cas des pommes de terre, seules des pommes de terre qu'a des tests effectues: de semence officiellement certifiees ou des pommes de terre - pour le materiel vegetal enumere, selon la methode de semence cultivees sous contr6le officiel a partir de pertinente decrite a !'annexe II, ou pommes de terre de semence officiellement certifiees sont - dans les autres cas, scion toute autre methode offi- plantees en vue de la production de pommes de terre de ciellement agreee ; semence ou de conservation ; - mettent en place des contr61es officiels des programmes - pendant chacune des campagnes visees aux tirets precedents, d'inigation et de traitement par pulverisation, y compris des mesures sont prises pour eliminer les plants spontanes de !'interdiction de !'utilisation de l'cau declarec contami- pommes de terre et de tomates et Jes autres plantes h6tcs de nee pour \'irrigation et le traiternent par pulverisation du I' organisme, y compris Jes plantes adventices de la farnille des materiel vegetal enumere et, le cas echeant, d'autres solanacees, et des recherches officielles telles que prevues li. plantes h6tes, pour prevenir la propagation de l'orga- !'article 2, paragraphe I. sont effectuees ; dans Jes cas ou les nisme : cette interdiction peut etre reexaminee sur la pommes de terre de semence sont plantees en vue de la produc- base des resultats obtenus au cours de \adite enquete tion de semence, des tests sont effectues sur Jes tubercules ; annuelle; c) Immediatement apres la declaration de contamination confor- - Jans Jes cas ou des effluents liquides sont conlamines, mement a !'article 5, point a, ii), et pendant chacune des campagnes mettent en place des contr6les officiels de !'elimination suivantes jusqu'a, et y compris, la premiere campagne pour laquelle des dechets d'entreprises de transformation industrielle la recolte de pommes de terre ou de tomates dans le(s) champ(s) ou de conditionnement traitant du materiel vegetal enu- declare(s) contamine(s) est autorisee, comme indique au point a: mere; - toutes les machines et installations de stockage sur le lieu de b) Etablissent, en tant que de besoin, un programme de remplace- production servant li. la production des pommes de terre ou des ment de tous les stocks de pommes de terre de semence sur unc pe- tomates sont nettoyees et, si necessaire, desinfectees selon des riode appropriee. methodes appropriees au point 3 ; - des contr6les officiels des programmes d' irrigation ou de traite- ANNEXE VII ment par pulverisation, y compris !'interdiction de ces pro- Les installations d'elimination des dechets officiellement agreees grammes, sont mis en place en tant que de besoin pour preve- et visees a !'annexe VI, point 1, quatrieme tiret, respectent Jes dis- nir la propagation de l 'organisme ; positions suivantes, de maniere a prevenir le risque de propagation d) Dans une unite de production en culture protegee declarce de I' organisme : contaminee conformement a !'article 5, point a, ii), perrnettant le i) Les dechets de transformation de pommes de terre et de remplacement total du milieu de culture : tomatcs (y compris Jes epluchures de pommes de terre ainsi - aucun tubercule ou plant de pomme de terre ni aucune autre quc les pommes de terre et tomates eliminees) et tous autres plante hate de l'organisme, y compris les plants et sernences de dechets solides de pommes de terre et de tomates sont elimi- tomate, n'est plante(e), sauf si ladite unite a ete soumise a des nes; mesures sous contr61e officiel visant a !'elimination de l'orga- - par enfouissement profond dans un site d'elimination ne pre- nisme et de tout materiel vegetal h6te, y compris, au moins, le sentant aucun risque d'ecoulement sur des terres agricoles ou remplacement complet du milieu de culture et du materiel asso- de contact avec des sources d'cau susceptibles d'etre utilisees cie ainsi que le nettoyage et, le cas echeant, la desinfection de pour !'irrigation de terres agricoles. Les dechets sont achcmi- ladite unite et de tout l'equipement, et si, par la suite, elle a ete nes directement vers le site dans des conditions d'isolement agreee pour la production de pommes de terre ou de tomates prevenant tout risque de perte des dechets, ou par les organismes officiels competents, et - par incineration ; - la production de pommes de terre est issue de pommes de terre ii) Effluents liquides de transformation : avant leur elimina- de sernence officiellemcnt certifiees ou de minitubercules ou de tion, Jes effluents liquides contenant des solides en suspension microplantes provenant de sources testees ; sont soumis a un procede de filtration ou de decantation afin - des contr6Ies officiels des programmes d'irrigation et de traite- d'eliminer ces solides. Ces derniers sont elimincs ainsi qu'il est ment par pulverisation, y compris l'interdiction de tels pro- precise au point i ). grammes, sont mis en place en tant quc de besoin pour preve- Les effluents liquides sont ensuite : nir la propagation de l'organisme. - chauffes a une temperature minimale de 70 "C pendant au 4.2. A l'interieur de la zone delimitee, sans prejudice des mesurcs mains 30 minutes, avant leur elimination, ou enumerees au point 4.1, Jes Etats membres: - elimines d'une autre maniere sous reserve d'agrement offi- a) Immediatement apres la contamination declaree et pendant au ciel et sous controle officiel, de telle sorte qu'il n •y ait moins trois campagnes : aucun risque de contact des dechets avec des terres agri- aa) Dans les cas oil la zone delimitee a ete detcrrninee conforrne- colcs ou des sources d'eau qui pourraienl ctre utilisees ment a !'article 5, point a, iv): pour I' irrigation des terres agricoles ; ks modalites en sont notifiees aux autres Etats membres ainsi qu' a la commis- - font surveiller par leurs organismes officiels competents Ies installations pratiquant la culture, le stockage et la sion. manutention de tubercules de pommes de terre ou de tomates, ainsi que Jes locaux des entreprises exploitant Arretii du 12 mars 1999 relatif aux conditions d'attribution sous contrat du materiel utilise pour la production de de !'aide a !'amelioration de l'encepagement pommes de terre ou de tomates ; d'exploitations viticoles dans la region delimitee - exigent le nettoyage et, en tant que de besoin, la desinfec- «Cognac» pour la campagne 1998-1999 tion du materiel et des entrepots de ces installations par Jes NOR: AGRP9900590A methodes appropriees visees au point 3 : - exigent que seules des semences certifiees ou des Le ministre de l'economie, des finances, et de l'industrie et le semences cultivees sous contr61e officiel soient plantees rninistre de l'agriculture et de la peche, pour toutes les cultures de pommes de terre dans ladite Vu l'arrcte du 27 mars 1996 modifie portant decision d'instaurer zone, et que soient soumises a des tests Jes pommes de une aide a !'amelioration de l'encepagemcnt d"exploitations viti- terre de semence recoltecs sur des lieux de production coles; dont ii a ete ctabli qu'ils sont probablement contamines en Vu l'avis du conseil de direction de !'Office national intcr- vertu de !'article 5, point a, iii); professionnel des vins en date du 20 janvier 1999, - exigent, dans toutes Jes entrcprises de la mne, la manutcn- tion separee des pommes de terre de semence et des Arretent: pommes de terre de conservation ; Art. 1.... - Les plantations ou surgreffages destines a produirc des - procedent a des recherches officicllcs conformement a vins de table, realises dans la region delimitee « Cognac » des I' article 2, paragraphe 1 ; departements de la Charente, de la Charente-Maritime, de la Dor-