Orden APA/718/2007 - Modifica la Orden de 22 de marzo de 1994, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata

13124 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCAYALiMENTACION 6421 ORDEN APAI7181200l, de 15 de marzo, por la que se modifican /05 anexos de /a Orden de 22 de marzo de 1994, relativa a /a lucha contra la necrosis bacteriana de /a oetete. en eoncecton de /a Directiva 931851CEE del Consejo de las Comunidades Europeas. EI organismo nocivo. Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus, es la causa de la enfermedad denominada necrosis bacteriana de la patata y representa una grave amenaza para las producciones de estos tuberculos. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13125 La Dlrectiva 93/85/CEE del Consejo. de 4 de octubre de 1993, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, establece las medidas detalladas a adoptar en e! seno de la Comunidad para la lucha contra este organismo noclvo, y fue incorporada al ordenamiento juridlco espeno! por la Orden de 22 de marzo de 1994. relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata en aplicacion de la Directive 93/85/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas. Dichas medidas tienen como finalidad localizar el organismo y determinar su distribucion, impedir su eoertclon y, en caso de que esta tenga lugar, evitar su propaqacion y combatirlo con el fin de erradicarlo. Teniendo en cuenta que en los ultlrnos enos el conoci miento de esta enfermedad y sus rnetodos de detecclon e identtflcacion han avanzado considerablemente y que la expertencla adquirida en e! seguimiento y lucha contra este organismo aconsejan la revision de determinadas disposiciones tecnicas relacionadas con las medidas de control, se han modificado los anexos de la men cion ada directiva pot la Dlrectiva 2006/56/CE de la comtston. de 12 de junio de 2006, por la que se modifican los anexos de la Directive 93/85/CEE del Consejo, relativa a la lucha contra la necrosis bactertana de la patata. En consecuencia, mediante esta Orden se incorpora al ordenamiento interno la Directive 2006/56/CE de la Comi sron. de 12 de junto de 2006. En la elaboraolon de la presente dlspoalcion han sido consultadas las comunidades autoncmas y las entidades representativas de los sectores afectados. En su virtud, dispongo: Articulo unico. Modificaci6n de los anexos de la Orden de 22 de marzo de 1994, retetive a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata en aplicaci6n de la Directiva 93/85/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas. Los anexos de la Orden de 22 de marzo de 1994, rela tiva a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata en apticecion de la Directive 93/85/CEE del Conse]o de las Comunidades Europeas, se sustituyen par los que figuran como Anexo de la presente Orden. Dispostcion final primera. Titulo competencial. La presente orden se dicta al amparo del articulo 149.1.13." de la Constttuctcn. que atribuye al Estado la competencia exclusiva sobre las bases y coordtnectcn de la planlftcacion general de la actividad econorntce. Dispostcion final segunda. Entrada en vigor. La presente orden entrara en vigor el dia 1 de abril de 2007. Madrid, 15 de marzo de 2007.-La Ministra de Agricul ture, Pesca y Atimentecion, Elena Espinosa Mangana. 13126 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 ANEXO Modificacion de los anexos de la Orden de 22 de marzo de 1994, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata en epucecten de la Directiva 93185/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas "ANEXO I Metodo de dlaqnostlco, detecoion e ldentiflcaoion de la necrosis bacteriana, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff). AMBITO DE APLICACI6N DEL METODO EI metodo expuesto describe dlversos procedimientos relacionados con: i) el diagn6stico de la necrosis bacteriana en tuberoulos y plantas de patata, ii) la detecci6n de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en muestras de tubercufos y plantas de patate. iii) la identificaci6n de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (c. m. subsp. sepedonicus). PRINCIPIOS GENERALES Los eoendices recogen protocolos optimizados para los distintos rnetodos. reactlvos validados y datos relatives a la preparaci6n de los materiales utilizados en las pruebas y de los materiales de control. EI eoencnce 1 Inctuve una Hsta de los laboratories que participaron en la optimizacion y la validaci6n de los protocolos. Dado que los protocolos entranan la detecci6n de un organismo sujeto a cuarentena e incluiran la utilizacion de cultivos vlables de C. m. subsp. sepedonicus como materiales de control, sera necesarto ejecutar los procedimientos en las condiciones de cuarentena apropiadas con las instalaciones necesarias para el desecho de los residuos y contando con los permisos pertlnentes emitidos por las autoridades oficiales responsables de la cuarentena fitosanitaria. Los parametros de prueba deben garantizar la detecci6n coherente y reproducible de los niveles de C. m. subsp. sepedonicus en los limites fijados por los rnetodos seleccionados. Es esencial una preoarecron preclsa de los controles positives. EI hecho de ejecutar las pruebas de acuerdo con los limites exigidos implica tambian la utlllzaclon de los ajustes co-rectos. e! rnantenimiento y la oallbracion del equipo, una cuidadosa manipulacion y conservaci6n de los reactivos, y la aplicacion de todas las medidas destinadas a evitar la contaminaci6n entre las muestres. como. por ejemplo, la separaci6n de los controles positivos de las muestras de prueba. Se deben aplicar normas relatives a! control de la calidad con e! fin de evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente por 10 que se refiere a! etiquetado y la documentacion. Toda aparici6n sospechosa, como la referida en el articulo 4, apartado 2, de esta orden, errtraria un resultado positivo en las pruebas de diaqnostlco 0 de selecci6n realizadas can una muestra tal como se especifica en los diagramas de Hu]o. Si en la primera prueba de seleccion (IF 0 PCR/FISH) se obtiene un resultado positive, puede sospecharse la contamlnacion con C. m. subsp. sepedonicus y se debe etectuar una segunda prueba de selecci6n. Si e! resultado de la segunda prueba de seleccion es poaitivo, la sospecha se confirma (aparici6n sospechosa) y las pruebas deben prosequir de acuerdo con el metodo. En el caso de que el resultado de la segunda prueba de seleccion sea negativo, la muestra no se conaiderara contaminada con C. m. subsp. sepedonicus. Por tanto, los resultados positives de una prueba IF a los que hace referencia e! articulo 4, apartado 2, se definen mediante una lectura positiva en una prueba IF confirrnada por una segunda prueba de selecci6n (peR/FISH). La presencia confirmada a la que se hace referencia en el articulo 5, apartado 1 de esta orden, requiere el aislamiento y la identificaci6n de un cultivo puro de C. m. subsp. sepedonicus con confirmaci6n de su patogenicidad. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13127 1. PRESENTACION EN DIAGRAMAS DE FLUJO 1.1 Metodo de detecci6n para el diagn6stico de la necrosis bacteriana en tuberculos y plantas de oateta que presenten slntomas de necrosis bacteriana Este protocofo de analisis esta destinado a los tuberoulos y plantas de patata que muestran sfntomas tipicos 0 sospechosos de necrosis bacteriana. Incluye una prueba de selecci6n rapids, el aislamiento del pat6geno del tejido vascular infectado en un medio de diagn6stico v, en caso de resultado positive. la identificaci6n del cultivo como C. m. subsp. Sepedonicus. Tuberculors] 0 planta(s) de patata con sintomas sospcchosos de la necrosis bactcriana Iii <> I PRUEBAS DE DlAGNOSTICO RA.PIDO '!l II PRUEBA B.4SICA DE AISLAMIENTO '." I Colonias con morfologia tlpica i4i ?--~ Crn. subsp . .I'cjJei!Ol1iCIIS no detectado Muesrra no Infectada por Cm, subsp. sepedonicus I si I I Purificar mediante cultivo I PRUEBAS DE IDE"IFICACH'" ",'J~ PRUEBA DE PATOGENIDAD l'> I Ambas prucbas confirman culnvo puro como CII!. subsp. sepcdonicus ~ NO ~ Muestra no Intectada por Cm. snbsp. sepedonicus I si I Muestra infectada por Cm. subsp. sepedanicus (1) EI punto 2 recoge una descnpclcn de los srntomes. (2) Se constderan aoecuadas las pruebas siguientes: la prueba IF (punto 4), la oruebe peR Ipunto 51, la prueba FISH Ipunto 61. (3) Aunque el aislamiento de patogeno a partir de material vegetal con sintomas tipicos mediante dilucion de placas es sencillo, el alslarruento puede fallar en estados avanzados de tnteccron. las bactertes saprotttas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar 0 inhibir el patoqeno en el medio de alstamterno. Se recomteooa. per tanto, ututeer medlos selectivos y no seiecnvos. preleriblemente MTNA (punto 8) 0 la prueba de bioensayo (punto 71. (4) EI punto 8 recoge una descripcion de la morfologia tipica de las colonias. (5) Si los resultados de la prueba de erstemtento son negativos, perc los slntornas de la enfermedad son los npicos. debera repetirse el aislamiento. (6) La identilicaci6n liable de un cultivo puro de Cm. subsp.sC'pedonicus se consigue utilizando las pruebas que se enumeran en el punto 9. (7) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad. 13128 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 1.2 Metoda de detecclon e toenuncacron de Ctsvibecter michiganensis ssp. sepedanicus en muestras de tuberculos de patata astntornartcos Principia Este protocolo de anaus!s se destina a la deteccicn de infecciones latentes en tuberculos de patata astntornartcos mediante al menos dos pruebas de setecctcn basad as en distintos principios bioloqicos que, de ser positivas, debe ran complementarse con el aislamiento del patopeno: en caso de aislamiento de colonias tipicas, se procede a continuacion a la identificacion de un cultivo puro como C. m. subsp. sepedonicus. EI hecho de obtener resultados positivos solo en una de las pruebas no es suffciente para constoerer ra muestra sospechosa. Las pruebas de seteccion y stsramtento deben permitir limites de deteccton de 10' a to' celutas por ml de precipitado resuspendido, incluidos como controles positivos en cada serie de pruebas. Muestra de rubcrculos de patata ru I Extraccion y conccntracion del parogcno iei I PRLEBAS BAslCAS DE SELECCION r3l Prucba IF I-li/prueba PtR test '''/prueba FISH 16i I Primera prueba de sejecctcn r3l I 0 em. subsp . .I'cjJei!Ol1iCIIS no detectada Negertve r- Muesrra no infectada por CIIl. suhsp. sepedonicus Positiva [ Segunda prueba de seleccidn 'it I<>-[ f- CIII. subsp. sepedonicus not detectedNegauva sample not infected by CIIl. subsp. sepedonicus Positiva I Aislamiento selecrtvo lii~, bioensayo <Xl I Cclonias con morfologia tipica r", ¢>--{ NO"'" ~ Cm. subsp. sepedonicns no detectadaMuestra no infectada POl' CIII. subsp. .sepedonicus si Purificar mediante culrivo PRLEBA DE IDENTIFICACION II u ~9- PRLEBA DE PATOGENIDAD "" Ambas pruebas eonfinnan cultivo puro como Cm. suhsp. sepedonlcus <> ~ NO ~ Muestra no fnrectada porCm. subsp. sepedonicus I si I I Muestra tnrectada per CIIl. subsp. sepedonicus BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13129 111 EI tarnanc normal de la rnuestre es de 200 tuberculos. aunque el procedimiento puede eoeoterse para muestras con menos tubercurcs en el caso de Que no se disponga de 200. 12) Los metodos de extracci6n y concentraci6n del patogeno se describen en el punto 3.1 13) En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biologicos diferentes proporcionen resultados positivos, habra de oroceoerse al alstarmentc y la corrttrrnaclon. Debe reauzarse como minimo una prueba de sefecclon. Cuanoc el resultado de esta prueba sea negstivo, Is muestra se considerara negstiva. En el ceso de Que el resultado de esta pruebs sea positivo, sera necessrio reslizsr dos 0 mas pruebas de selecci6n basadas en principios biol6gicos dilerentes con el lin de verilicar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba 0 el resto de las pruebas prooorclonan resultados neqattvos. la rnuestre se conslderara negativa y no sera necesano never a cabo mas pruebas. (4) Prueba de Inmunotiucrescenc!a (IF), Para la prueba de selecclcn IF debe utilizarse siempre un anticuerpc ooucrooet los antlcuerpos monoclonales adicionales pueden proporcionsr una mayor especificidad {vease el punto 4), 15) Prueba PCR. Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR convenientemente validados Ivease el punto 61. 16) Prueba FISH. Deben utilizarse reecnvos y protocolos convenientemente validados tvease el punto 61. (71 Aislamiento selective. Con el medio MTNA 0 el medio NCP-SSy una dtluclcn al 11100 del preclpitado reauspendldo. es en rnucbcs casos un metodo adecuado psrs el aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus. Entre 3 y 10dias despues de la siembra selectiva pueden obtenerse colonies tipicas. Posteriormente se puede purificsr e identificar el pat6geno. Para poder aprovechar plenamente e! potencisl de Is prueba, es necesario preparar con cuidado las cufias de la parte basal a lin de evitar que otras bacterias secundarias asociadas al tuberculo de la patata. que compnan con C. m. subsp. sepedonicus en el medto. puedan etecter a! desarrollo del oetoceno. Si la prueba de la siembra setecttva no resulta etecnva. se debere proceder a! aislamiento a partir de las plantas utmzedes para el broensevo {vease el punta 8). (8) La prueba de croensevo se ututee para el aislamiento de C, m. subsp. sepedonicus a partir de precipitedo de extrecto de patatas mediante er enriquecimiento selective de la bacteria en berenjenas ISolanum meiongena), Exige que las condiciones de mcubacton sean optimas, segun se especlftcan en este metodo. Es muy probable que las bactertas inhibidoras de C. m. subsp. sepedonicus en los medlos MTNA 0 NCP-88 no interfieran en este prueba lvease er punto 7). (9) En el punto S se describe la morfologia tipica de las colonias. 1101 Los cultivos 0 bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprolitas 0 a la inhibici6n provocada por las mismas. En el ceso de que se obtengan resultados positives en las oruebes de selecclon perc negativos en las de atsremtento. se deberan repetir las pruebes de alstamlento a partir del mismo orecroneoo 0 utilizando adem as tejldc vascular de la parte basal de tubercutos cortados de ta misma muestra y, si fuese necesario, con otrss muestrss. 1111 La identificacion fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus sa consigue utilizando las pruebas que sa describen en el punto 9. 1121 En e! punto lOse describe la prueba de patcqenfcldad. 13130 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 1.3 Metoda de deteccion e identiflcacion de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de plantas de patata astntornattcas [ Muestra de segmentos del tallo rll I I I Extraccion y concentrocion del patogeno ,J, I PRllEBAS BAslCAS DE SELECCION n, Aislamiento selective '·'iprueba IF ';'iprueba PCR "vprueba FISH '" Prueba auxiliar opcinal: bioensayo ". Colonias con morgologia tipica ,<> despues ~ Todas las pruebas negativesdel aislamiento <?-( Cm, subsp. sepedonlcus no deteetadaNO I " ' Muestra no infectada por Cm. subsp. sepedonlcus I sl I Purificar mediante subcultivo I [ PRUEBAS DE INDENTIFICACION <'""~ PRllEBA DE PATOGENICIDAD ru, ] Ambas prucbas confinnan cultivo puro como Crn. subsp. sepedonicus <¢>--[ NO f- Muestra no Intectada porCm. subsp . sepedonicus si I Muestra infectada por Cm. subsp, sepedonicus (11 Vease el punto 3.2 para obtener informacion sobre los remenos recomendados de la muestre. (2) Los metodos de extreccton V ccncentracton del oetoceno se describen .en el punta 3.2 (3) En el case de que al menos dos de las pruebas baeadas en principles biologicos dlterentes propcrcionen resultados oostttvos. hsbre de procederse sl aislsmiento V la confirmsciOn. Debe realizarse como minimo una prueba de seleccion, Cuando el resultado de la prueba sea negativo, la muestra se considerara negativa. En el case de que el resultado de esta prueba sea positivo, sera necesano reenzer dos 0 mas pruebes de selecclon basades en principios broroctcos dlterenres con el fin de verificar e! primer resultado positive. Si ta segunda prueba 0 er resto de las pruebas proporctonan resultados negativos, ra muestra se considerara negativa y no sera necesario Ilevar a cabo mas pruebas. (4) En e! punto 8 se describe la prueba de aislamiento selective V la morfologia tiplca de las colonias. (51 En e! punto 4 se describe la prueba IF, (61 En el punto 6 se describe la pruebs peR. (71 En el punto 5 se describe la prueba FISH. (81 En e! punto 7 se describe la prueba de broensavo. (9) Los cultivos 0 btoensavos pueden fallar debido a la comoereocte de las bacterlas saprofrtas 0 a la inhibicion orovocecre por las mismas En el case de que se obtengsn resultados positivos en las pruebas de seleccion pero negativos en las de aislsmiento, se deberan repetir las pruebas de aislamiento v, si ruese necesario, efectuar pruebas con otras muestras, (10) La identificacion fisble de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp, sep"donicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9. (11) En el punta 10se describe la prueba de patoqenicidad. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13131 2. EXAMEN VISUAL PARA DETECTAR SfNTOMAS DE NECROSIS BACTERIANA 2.1 Plantas de patata En las condiciones cltmaticas europeas, los sinto mas se presentan rara vez en el campo y con frecuencia solo al final de la temporada. Por otra parte, en numerosos cases. otras enfermedades, la senescencia 0 los dafios mecanicos enmascaran los sintomas 0 se confunden con ellos. Por tanto. puede ser tacit pasar por alto los sintomas en las lnapecciones de campo. Los sintomas de marchitamiento son muy distintos de los de la podredumbre parda; el marchitamiento es normalmente un proceso lento y se limita en prtnctplo a los bordes de las hojas. EI crecirniento de las hojas jovenes infectadas no sue!e detenerse. aunque sea mas lento en las zonas infectadas. Esto hace que las hojas tengan formas extrafias. Las hojas afectadas por el bloqueo de los tejidos vasculares de la parte baja del tallo desarrollan con frecuencia zonas intenerviales crorotrcas amarillas 0 anaranjadas. Los foliolos, hojas e incluso tallos infectados pueden lIegar a morlr. Con frecuencia las hojas y tuberculos muestran simplemente un tamafio reducido. En algunos casos las plantas se atrofian. Se pueden consultar fotografias en color de algunos de estos sfntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int!Public/irc/sanco/Home/main 2.2 Tuberculos de patata Los primeros srntornas consisten en un Iigero aspecto vitreo 0 trestucldo del tejido, sin ablandamiento, en torno al sistema vascular, en especial cerca de la parte basal. La corona vascular de la parte basal puede tener un color ligeramente mas oscuro de 10 normal. EI primer sintoma c1aramente detectable consiste en que la corona vascular adquiere una coloracion amarillenta y al comprimir suavemente el tubercu!o emergen de los vasos unos exudados de aspecto lechoso. Dicho exudado contiene millones de bacterias. Se puede producir el oscurecimiento del tejido vascular y los sintomas que presentan los tuberculos en esta fase son similares a los de la podredumbre parda provocada per Ralstonia solanacearum. AI principle, estos sintornas pueden limitarse a una parte de la corona, no necesariamente cerca de la parte basal, y pueden extenderse posteriormente a la totalidad de la corona. A medida que la lnfeocion proqrese. se produce destruccion de tejido vascular; la zona cortical externa puede separarse de la zona cortical interna. En las fases avanzadas de la lnfeccion, se producen grietas en la superficie del tuberculo. que sue len tener un color pardo rojizo en los bordes. Recientemente se han producido varios casos en Europa en los que la zona cortical central se ha podrido al mismo tiempo que la corona vascular provocando una invasion secundaria con oquedades y necrosis interna. Los srntomas pueden verse enmascarados por una invasion secunda ria funqioa 0 bactertana que puede hacer dificil, 0 incluso Irnpostb!e, diferenclar los sintomas de necrosis bacteriena avanzada de otras necrosis de los tuberculos. Pueden presentarse sintomas etrolcos. Se pueden consultar fotograflas en color de algunos de estos sintomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.intiPubliclircisanco/Home/main 3 PREPARACION DE LA MUESTRA 3.1 Tubercutos de oateta Nota: EI tarnano normal de la muestra es de 200 tuberculos por ensayo. Para reallzar un muestreo mas intensive es precise lIevar a cabo mas pruebas con muestras de este tamafio. EI hecho de disponer de un numero mayor de tuberculos en la muestra puede provocar la inhibioion 0 dificultar la interpretacion de los resultados. No obstante, e! procedimiento puede adaptarse convenientemente a muestras formadas por un nurnero menor de tuberculos en el caso de que no se disponga de 200. La validacion de todos los metodos de oeteccton descritos mas adelante se basa en los ensayos realizados con muestras de 200 tuberculos. EI extracto de patata descrito a continuecion puede emplearse tarnbien para la deteccion de la bacteria de la podredumbre parda de la patata, Ralstonia solanacearum. Pretratamiento opcional previo a la preparacion de la muestra: Lavar los tuberculos. Utilizar desinfectantes (cuando se vava a efectuar la prueba PCR, la oestnteccrcn con compuestos de c1oro puede interferir en la extraccion de ADN del patoqeno] y detergentes adecuados para cada muestra. Secar los tuberculos al alre. Este procedimiento de lavado resulta particularmente uti! (aunque no necesario) en el caso de muestras con exceso de tierra y cuando se vava a efectuar una prueba PCR 0 un procedimiento de aislarnientc dlrecto. 3.1.1 Guitar la epidermis de la parte basal de cada tuberculo con un blstur! 0 un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que el tejido vascular quede a la vista. Extraer cuidadosamente una pequefia cufia de tejido vascular de la parte basal y e! mfnimo volumen posible de tejido no vascular Ivease e! sitio web: http://forum.europa.eu.intiPubliclirc/sanco/Home/main) Nota: Retirar los tuberculos que presenten sintomas sospechosos de necrosis bacteriana y analizarlos separadamente. En el caso de que se observen sintomas sospe chosos de necrosis bacteriana durante la extreccion de la cuna de la parte basal, debera realizarse una Inspeccion visual del tubercu!o una vez cortado a la altura de la parte basal. Todo tuberculo cortado que presente sintomas sospechosos debera suberizarse a temperatura ambiente durante dos dias y almacenarse en cuarentena (a una temperatura de entre 4 y 10°C) haste que concluyan todos los ensayos. Todas las muestras de tubercutos. incluidas las que presenten sintomas sospechosos, deberan conservarse de acuerdo con 10 dispuesto en el anexo II. 3.1.2 Introducir las cunas de la parte basal en rectprentes desechables que no hayan side utilizados previa mente y que puedan cerrarse y/o sellarse (en e! 13132 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 caso de que estos recipientes vayan a volver a utilizarse deberan limpiarse y desinfectarse concienzudamente con compuestos de c1oro). Preferiblemente, las cufias deben procesarse inmediatamente. Si esto no fuese posible. oeberan almacenarse en el recipiente, sin tampon, y conservarse pot un periodo maximo de 72 horas refrigeradas 0 de 24 horas a temperatura ambiente. EI secado y la suberizaoion de las cunas, est como e! crecimiento de seprofltos durante el almacenamiento, pueden dificultar la detecci6n de la bacteria causante de la necrosis bacteriana. 3.1.3 Procesar las cunas basales pot uno de los metodos siguientes: a) bien aiiadir la solucion de tampon de extrecclon (apendice 3) en cantidad suficiente para que cubra las cunas (aproximadamente 40 mil y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante 4 hcras a una temperatura inferior a 24°C 0 durante 16 a 24 horas s! estan refrigeradas; b) 0 bien homogeneizar las cufias con solucion de tampon de extreccion (apendice 3) en cantidad suflciente (aproximadamente 40 ml), ya sea mediante una trituradora (por ejemplo, Waring 0 Ultra Thurax) 0 rnachacanoolas en una bolsa de meceracrcn desechable selleda (por ejemp!o, bolsas reslstentes Stomacher 0 Bioreba de polietileno de 150 mm x 250 rnm. esterilizadas por raotactcn) utilizando un mazo de caucho 0 un aparato triturador adecuado (por ejemplo, Homex). Nota: EI riesgo de contamtnecron cruzada de las muestras es alto cuando estes se homogeneizan mediante una trituradora. Se debe actuar con oreceucton para evitar la qeneracton de aerosoles 0 el vertido durante e! proceso de extraccion. Es preciso asegurarse de que se esterilizan las cuchillas de la trituradora y los recipientes que vayan a utilizarse para cada muestra. Si se va a realizar la prueba PCR, es precise evltar que existan restos de ADN en los recipientes 0 el aparato triturador. Cuando se vaya a efectuar la prueba PCR se recomienda la trituraoion en bolsas desechebfes y la utllizaoion de tubos desechables. 3.1.4 Decantar el sobrenadante. Si presenta un asoecto excesivamente turbio, c1arificarlo centrifu qando!o a baja velocidad (a 180 9 como maximo, durante 10 minutes, a una temperatura entre 4 y 10°C) 0 mediante flltraoion a! vaclo (40-100 I-Im), lavando e! filtro con solucion adtclone! (10 mil de tampon de extraccion (apendice 3). 3.1.5 Concentrar la fraccicn bacteriana mediante centnfucacion a 7.000 9 durante 15 minutos (0 a 10.000 9 durante 10 mlnutos] a una temperatura entre 4 y 10°C Y descartar e! sobrenadente sin perturbar e! prectpltado. 3.1.6 Resuspender el precipitado en un 1,5 ml de tampon de precipitado (eoenofce 3). Utilizar 500 IJI para la prueba de C. m. subsp. sepedonicus, 500 1-11 para Ralstonia solanacearum y 500 IJI a efectos de referencia. Aiiadir glicerol esteru en una concentrecrcn final de 10-25 % (v/v) a los 500 1-11 de la aliouota de referencia y a la alfouota restante de cada prueba, homoqenelzer por aqltaclon y guardar a una temperatura entre - 16 Y - 24°C (semanas) o entre - 68 Y- 86 0 C (meses). Mantener las alicuotas de la prueba a una temperatura comprendida entre 4 y 10°C durante los ensavos. No es recomendable congelar V descongelar el extracto en repetidas ocasrones. Si fuese preciso transportar el extracto. es conveniente asegurarse de que la entrega se efectua en una caja refrigerada en el plazo de 24 a 48 horas. 3.1.7 Es imprescindible que todos los controles y muestras posltlvas de C. m. subsp. sepedonicus se procesen par separado. a fin de evltar la contemrnecron. Esto se aplica a las preparaciones para IFy a todas las pruebas. 3.2 Plantas de patata Nota: Para la detecoion de pobtaclones latentes de C. m. subsp. sepedonicus se recomienda efectuar las pruebas con muestras mlxtas. EI proeedimiento se puede adaptar eonvenientemente para muestras mixtas de hasta 200 partes de tallos (los estucnos deberan basarse en una muestra representativa desde el punto de vista estadfstico de la poblaolon vegetal que se someta a investigaci6n). 3.2.1 Extraer una seccton de 1 a 2 em de la base de eada tallo, justo por eneima del nivel del sueto, utilizando un cuchillo 0 tijeras de podar limpios y desinfectados. Desinfectar Iigeramente las secciones de tallo con etanol al70 % V secar inmediatamente con un panuelc de papel. Introducir las secciones de tallo en un recipiente esteru eerrado de aeuerdo con los siguientes praeedimientos de muestreo: 3.2.2 Procesar las secctones de tallo mediante uno de los metodos siguientes: a) bien anadlr la sorucron de tampon de extraccton teoenorce 3) en cantidad suficiente para que cubra las secclones (aproxtmadarnente 40 ml) y agitar en un agitador rotatorfo (50-100 rpm) durante 4 heres a una temperatura inferior a 24°C 0 durante 16 a 24 horas si estan refrigeradas; b) 0 bien procesar inmediatamente triturando las secctones en una bolsa de maceraclon reststente (p. ej. Stomacher 0 Bloreba] con una cantidad adecuada de tampon de extraccion (apendice 3) utilizando para ello un mazo de caucho 0 un aparato triturador adecuado (p. ej. Homex). Si esto no es posible, almacenar las seeciones de tallo refrigeradas durante 72 horas como maximo 0 a temperatura ambiente durante 24 horas como maximo. 3.2.3 Decanter e! sobrenadente tras haberlo dejado reposar durante 15 minutos. 3.2.4 Normalmente no es neeesario c1arificar mas el extraeto ni la concentrectcn de la fraccicn bectertena, perc esto se puede lograr mediante la fntractcn vto la centrifu qacton, tal como se describe en los puntos 3.1.4 a 3.1.6. 3.2.5 Dividir e! extrecto puro 0 concentredo de la muestra en dos partes iguales. Mantener una de las partes a 4-10 °C durante los ensavos V almaeenar la parte restente. tras haber afladido glicerol estert! al1 0-25 % [v/v}, a una temperatura comprendida entre - 16 Y - 24°C (semanas] 0 entre - 68 y - 86°C tmeses) en e! case de que sea neceser!o realizer nuevas pruebas. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13133 4. PRUEBA IF Principio: La utlllzaclon de la prueba IF como principal prueba de seleccion esta recomendada por su solldez demostrada para alcanzar los limites exigidos. Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de sereccron y esta proporcione resultados positives, oeberen realizarse las pruebas PCR 0 FISH como segunda prueba de seleccion. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de seleccion y esta proporcione resultados positives, sera preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el enansts. Nota: Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de seteccton. debera utilizarse siempre un anticuerpo policlonal. En el caso de resultados IF positives con un anticuerpo policlonal, la seteccton posterior de la muestra con un anticuerpo monoclonal puede proporcioner una mayor especificidad pero ser menos sensible. Conviene utilizar anticuerpos frente a la cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus. Se recomienda determinar e! titulo para cada nuevo lote de anti cuerpos. EI titulo se define como la dllucion superior en la que se produce la reecclon optima cuando se realiza la prueba con una suspension que contlene entre la' y 10" celutas por ml de la cepa homoloqa de C. m. subsp. sepedonicus y se utttlza una dllucion apropiada del conjugado de lsotlocianato de fluoresceina (FITC). sequn las recomen oactones del fabricante. Los anti cuerpos policlonales 0 monoclonales crudos deberfan tener un titulo IF de al menos 1:2000. Durante las pruebas, los anticuerpos deberian utilizarse en diluciones de trabajo (DT) proxirnas 0 iguales al titulo. Utilizar anti cuerpos validados. (vease el sttro web: http://forum.europa.eu.intiPubliclirclsanco/Home/main) La prueba deberia realizarse con extractos de muestras que se acaben de preparar. Si fuese necesarto. puede efectuarse tarnbien con extractos almacenados a una temperatura comprendida entre - 68 Y - 86°C en glicerol. EI glicerol puede separarse de la muestra mediante la acncron de 1 ml de tampon de prectprtaoo teoenorce 4), la recentrtfuqscion durante 15 minutes a 7.000 9 Y la resuspensi6n en e! mismo volumen de tampon de precipitado. Normalmente esto no es neceserto. especialmente si las muestras se fijan al portaobjetos tfameandolas (vease el punta 2.2). Preparar otros portaobjetos con controles positives de la cepa homotoqa 0 de cuetquler otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendlda en extrecto de patata. tal como se especlflca en el eoenofce 2 v, opcionalmente, en tampon. De ser posible, deberan utilizarse tejtoos infectados de forma natural (conservaoos mediante liofilizaoion 0 con qelacion a temperaturas comprendidas entre -16 y - 24 QC) como control similar, en e! mlsmo portaobjetos. Como controles neqativos, utilizer alicuotas de extractos de muestra que previamente hayan proporcionado resultados negativos en la prueba. Utilizar portaobjetos de pocillos multiples, de preferencia con 10 pocillos de 6 mm de cnemetro como minimo. Procesar e! material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. 4.1 Preparar los portaobjetos sequn uno de los procedimientos siguientes: i) Para precipitados con una cantidad retatlvamente pequena de sedimento de etmtoon: Verter con una pipeta un volumen determinado (15 1-11 es suficiente para pocillos de 6 mm de dtametro: aumentar el volumen si el dlarnetro es mayor) de una dlluoion al 1/100 del precipitado de oateta resuspendido en el primer pocillo. Postertorrnente. verter un volumen similar de precipitadc sin diluir (1/1) en los dernas pocillos de la fila. La otra fila puede utilizarse como duplicado 0 para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1. ii] Para otros precipitados: Preparar diluciones decimales (lila y 11100) del precipitado resuspendido en el tampon de precipitado. Verter con una ptpeta un volumen determinado (15 IJI es suficiente para pocillos de 6 mm de ctarnetro: aurnentar e! volurnen si e! diametro es mayor) del prectpttado resuspendido y de cada diluci6n en una de las filas de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado 0 para una segunda rnuestre. tal como se indica en la figura 2. 4.2 Dejar secar las gotitas a temperatura ambiente 0 calentandolas a una temperatura comprendida entre 40 y45 "C. Fijar las celulas bacterianas al portaobjetos eaten tandolo (15 minutos a 60°C), ftameandolo. mediante etanol al 95 %, 0 de acuerdo con las instrucciones especificas de los proveedores de los anticuerpos. De ser neceserto. los portaobjetos fijados pueden almacenarse congelados en una caja seca durante e! minima tiempo posible (hasta un maximo de tres meses) antes de realizar nuevas pruebas. 4.3 Procedimierrto IF: i) si el portaobjetos se ha preparado sequn el inciso i] del punto a.t: Preparar un conjunto de diluciones a 1/2 del entlcuerpo en el tampon IF. EI primer pocillo debera tener 1/2 del titulo (T/2) y e! resto 1/4 del titulo (T/4), 112 del titulo (T12), e! titulo (T) y dos veces e! titulo (2T), ii) si el portaobjetos se ha preparado sepun el inciso ii) del ounto a.t: Preparar la dlluoion de trabajo (DT) del anticuerpo en tampon IF. La dilucion de trabajo atecta a la especificidad. 13134 Martes 27 rnarzo 2007 Figura 1. Preparaci6n del portacbjeros de acuerdo con el punta 4.1. tncrso l). y e! punto 4.3, inciso i) Oiluciones del precipitado resuspencroo 11100 '" '" '" ", 0 Duuclon del precipitadoresuspencioc (T" titulo) m '" TI2 T 2T 0 nnucones a 1/2 delannsuero'anncuerpo Mueslra 1 ., ·2 ·3 ., •5 Duphcadc de rnuestra 1 0 ., ·7 ·8 ·9 ·'0rnuesira2 Figura 2. Preparaci6n del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1. inciso iii, y el punto 4.3, inciso ii) Duucon de trabejc del annsueroranticuerpo 1/1 1/10 1/100 Nada Nada 0 Dilucion decimal del crcconeoo resuspenoroo Mcestra 1 ., ·2 ·3 ., •5 Duplicado de rnuestra 1 0 ., ./ ·8 ·9 ·10muestra 2 BQE num. 74 4.3.1 Colocar los oorteoojetos en papel humedecido. Cubrir completamente cada pocillo con la cmucton 0 diluciones del enttcuerpo. EI volumen del anticuerpo aplicado en cada pocil!o debe ser equivalente a! rnenos a! del extracto aplicado. A falta de instrucciones especificas de los proveedores de anticuerpos, oebera seguirse el procedimiento siguiente: 4.3.2 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25°C). 4.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampon IF. Lavar por lnmersion durante 5 minutos en tampon IF-Tween (apendice 3) y repetir la operacion durante 5 minutos en tampon IF. Deben evitarse los aerosoles 0 la transferencia de gotitas que puedan provocar la contamtnacion cruzada. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secanooros Iigeramente. 4.3.4 Colocar los portaobjetos en papel humedecido. Cubrir los pocillos con la dlluoion del conjugado FITC utilizado para determinar el titulo. EI volumen de conjugado eplicado en los pocillos debe ser identico al volumen de anticuerpo aplicado. 4.3.5 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). 4.3.6 Sacudir las qotltas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (punto 4.3.3). Retirar con cuidado el exceso de humedad. 4.3.7 Verter con una plpeta de 5 a 10 ~I de tampon fosfato glicerol de 0,1 M (vease e! ependice 3) 0 una sofucion comercial similar que oroteja la fluorescencia (anti-fading) en cada poctno y tapar. 4.4 Lectura de la prueba IF: 4.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopic epifluorescente con filtros adecuados para que se produzoa la excltaclon del FITC, con aceite 0 agua de inrnerslon y a 500-1.000 aumentos. Recorrer los pocillos a 10 largo de dos diametros perpendiculares entre si y alrededor del perimetro. En el caso de muestras que no presenten celulas 0 solo un pequerio nurnero de elias es precise observar como minimo 40 campos mtcroscoptcos. En primer lugar, comprobar e! control positive. Las celulas deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente tefiidas al titulo de anticuerpos determinado 0 la dilucion de trabajo. La prueba IF (punto 4) debe repetirse si la tincion no es correcta. 4.4.2 Comprobar si hay celulas fluorescentes brillantes con la morfologia caracterfstlca de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (vease el sitio web: http://forum.europa.eu.intiPublidirdsanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencla debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo a la misma diluoion del anticuerpo 0 mejor que este. Debe-an descartarse las celulas que presenten una tin cion incompleta 0 cuya fluorescencia sea escasa. En el caso que se sospeche cualquier posible contemtnacton. debera repettrse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los portaobjetos de un lote presenten celulas positivas debido ala oontamf naoion del tampon 0 cuando se encuentren cetutas positives (fuera de los pocillos) en la superficie del portaobjetos. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13135 4.4.3 Existen varios problemas tnherentes a la espaoificidad de la prueba de inrnunofluorescencia. En los precipitados de cufias basales y secclones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de celulas fluorescentes de morfologia atipica y bacterias saprofltas con reaccton cruzada cuyo tamano y morfologia sean similares a los de C. m. subsp sepedonicus. 4.4.4 Solo deben conslderarse las celulas fluorescentes con tamano y morfologia trptcos. al titulo 0 la dilucion de trabajo de los anticuerpos, al igual que en el punto 4.3. 4.4.5 Interpretacion de los resultados de la prueba IF: i} st ss encuentran celulas fluorescentes brillantes con morfologia ceractenstrce. calcular el numero medio de oelulas tfptcas por campo rnicroscopico y e! numero de oelulas tlpicas por ml de prectpttado resuspendido (apendice 4). La prueba IF es positiva para las muestras que presenten al menos 5 x 10' cetutas tipicas por ml de precipitado resuspendido. La muestra se considera potencialmente contaminada y es necesario realizer nuevas pruebas, ii] la prueba IF es negativa para las rnuestras que presenten menos de 5 x 103 celutas por ml de precipitado resuspendido y la muestra se considera negativa. No es necesario realizar nuevas pruebas. 5. PRUEBA FISH Principio: Cuando se utilice la prueba FISH como prtrnera prueba de seleccion y esta proporcione resultados positives, debora realizarse la prueba IF como segunda prueba obligato ria de seteccton. Cuando se uti lice la prueba FISH como segunda prueba de sereccron y esta orooorctone resultados positivos, sera precise realizar las pruebss establecidas en e! diagrama de flujo para completar el diaqrtostico. Nota: Utilizar oligosondas especificas para C. m. subsp. sepedonicus validadas tapendice 7). Las pruebas prellrninares realizadas con este metoda deberan permitir la deteccion reproducible de al menos 103-104 celulas de C. m. subsp. sepedonicus por ml anadidas a los extractos de muestras que previa mente proporcionaron resultados negativos. EI procedimiento siguiente debe ria lIevarse a cabo, a ser posible, con extracto de muestra que se acabe de preparar, pero tambien puede realizarse con extracto de muestra que se have almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre - 16 Y- 24°C 0 entre - 68 y - 86°C. Como controles neqatlvos. deben utilizarse atfcuotas de extrecto de muestra que prevtamente haya arrojado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus. Como controles positives. deben prepararse suspenstones que contengan de 105 a 106 celulas por ml de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemp!o, la cepa NCPPS 4053. 0 PO 406) en tampon fosfato de concentracron 0,01 M de un cultivo de 3 a 5 dias (para la preparacion vease e! ependice 2). Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa hornoloqa 0 de cuelquler otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendida en extrecto de patata, tal como se especifica en e! apendice 2. EI uso de una oligosonda eubacteriana marcada con FITC ofrece un control para el proceso de titbrtoacton. ya que tenira todas las eubacterias que esten presentes en la muestra. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. 5.1 Fijacion del extracto de patata EI protocolo siguiente se basa en Wullings et et. (1998): 5.1.1 Preparar la solucicn de ffjacion (veaseel apendice 7), 5.1,2 Verter 100 IJI de cada extracto de muestra en un tubo eopendort y centrifugar durante 8 minutes a 7 000 g. 5.1.3 Guitar e! sobrenadante y disolver e! precipitado en 500 IJI de solucion fijadora preparada con menos de 24 horas de antelacion. Agitar e incubar de un dia para otro a 4°C. EI etanol al 96 % constituye una soructon fijadora alternativa. Para utilizarlo, disolver el preclpttado a partir del paso 5.1.2. en 50 IJI de tampon fosfato de concentractcn 0,01 M y 50 IJI de etanol al 96 %. Agitar la mezcia e incubar a 4 °C durante 30 a 60 mlnutos. 5,1.4 Centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g, quitar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 IJI de tampon fosfato de oonoentraoion 0,01 M (vease e! apendice 3). 5.1.5 Colocar 161J1 de las suspensiones fijadas en un portaobjetos multiple limpio, tal como muestra la figura 3. Aplicar 2 muestras diferentes por portaobjetos sin dllulr y utilizar 10 IJI para reaflzar una diluclon all:l00 (en tampon fosfato de concenuaclcn 0,01 M). La solucion de la muestra restante (49 IJI) puede almacenarse a - 20°C tras la adicion de 1 voturnen de etano! a! 96 %. En e! caso de que sea necesarlo repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifuqacion y afiadir un volumen equivalente de tampon fosfato de concentraclon 0,01 M (mezclar mediante aqitaoion}. 13136 Martes 27 rnarzo 2007 Figura 3 Distribuclon del ponaobjetos para la prueba FISH Muestra 1 Nada Naoa Naoa Muestra 2 0 0 0 0 0 poclno 1 pocuc 2 pccuo3 pocluo 4 oocmc 5 Muestra 1 Nada Nada Naca Muestra 2 0 0 0 0 0 pocillo 6 pocillo 7 poc,lIo 8 pocitlo 9 pocillo 10 BQE num. 74 Cubreobjetos 1 5.1.6 Secar los portaobjetos al aire (0 con secador de portaobjetos a 37 QC) Y fijarlos Hameanooros. EI procedimiento puede interrumpirse en esta tase. pudlendose proseguir con la hibrfdaclon al dfa siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente. 5.2 Prehlbrtdacion e hibrldacion 5.2.1 Preparar una solucion de lisozima que contenga 10 mg de lisczlma (Sigma L-6876) en 10 ml de tampon (100 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8,0). Esta sorucrcn puede almacenarse pero solo debe congelarse y descongelarse una vez. Cubrir todas las muestras bien con aproximadamente 50 ~I de soluoion de lisozima e lncubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sumergir los portaobjetos en agua desmineralizada una (mica vez y secar con papel de filtro. Alternativamente, en lugar de lisozima, anadtr 50 ~I de 40-400 ~g m!" de proteinasa K en tampon (20 mM Tris-HCI,2 mM CaCb, pH 7,4) en cad a pocillo e incubar a 37°C durante 30 mlnutos. 5.2.2 Deshidratar las celulas en series de etanol escalonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante 1 minuto cada una. Secar las prepareclones en un portaobjetos. 5.2.3 Preparar una camera de lncubaoion humada recubriendo el fondo de una caja herrnettca con un panuelo de papel 0 papel de flltro empapado en 1x hybmix (apend ice 7). Preincubar la caja en el horne de hibridacion a 55 °C durante 10 minutos como minimo. 5.2.4 Preparar la sofucion de hibndaclon (apend ice 7) con 45 ~I por portaobjeto, y preincubar durante 5 minutos a 55 °C. 5.2.5 Colocar los portaobjetos en una placa caliente a 45 °C y aplicar 10 ~I de solucton de hibridacion en cada uno de los 4 pocillos del (0 de los) portaobjetos. 5.2.6 Aplicar 2 cubreobjetos (24 x 24 mm) a cada portaobjeto evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la camara humeda precafentads y dejar que se produzca la hlbrldaclon de un dla para otro a 55 °C en la oscuridad. 5.2.7 Preparar 3 vasos de precipitado que contengan 1 I de agua ultrapure. 1 I de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml de agua ultrapura) y 1 I de 1/2x hybmix (167 ml Cubrenbjetos 2 ax hybmix y 833 ml de agua ultrapura). Preincubarlos al bane maria a 55 QC. 5.2.8 Guitar los cubreobjetos de los portaobjetos y colocar los portaobjetos en un soporte. 5.2.9 Lavar el exceso de sonda mediante lncubaclon durante 15 minutes en el vasa de precipitado con tx hybmix a 55 QC. 5.2.10 Transferir el portaobjetos a una sorucron de lavado de hybmix al1/2 e lncubar durante otros 15 minutos. 5.2.11 Sumergir las preparaciones brevernente en agua ultrapura y colocarlas en papel de flltro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 ~I de soluci6n de montaje protectora de la fluorescencia (p. ej. vectastuero. vecta Laboratories, CA, USA 0 equivalents] en cada pocil!o y aplicar un cubreobjetos grande (24 x 60 mm) sobre la totalidad de los portaobjetos. 5.3 Lectura de la prueba FISH: 5.3.1 Los portaobjetos deben examinarse in media tamente utilizando un microscopic epifluorescente a 630 0 1.000 aumentos con aceite de Inrnersion. Con un filtro adecuado para lsotlocianato de fluoresceina (FITC) las cefulas eubacterianas (incluidas la mavcna de las cetulas gramnegativas) de la muestra aparecen tenidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina b-isctiocianato, las celulas de C. m. subsp. sepedonicus marcadas con Cy3 aparecen tenldas de rojo fluorescente. Ccmparar la morfologia de las cetulas con la de los controles positives. Las celulas deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente tefiidas. Debe repetirse la prueba FISH (punto 9.4) si la tinci6n es aberrante. Recorrer los pocillos a 10 largo de dos diarnetros perpendiculares entre sf y alrededor del perimetro. En el caso de muestras que no presenten oelulas 0 solo un pequeno nurnero de elias es precise observar como minimo 40 campos microsc6picos. 5.3.2 Comprobar s! hay celulas fluorescentes brillantes con la morfologia caracterfstlca de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos Ivease e! sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser mejor que la de la cepa de control positive 0 equivalente a la misma. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13137 Deberan descartarse las celulas que presenten una tlncion incompleta 0 cuya Huorescencia sea escesa. 5.3.3 En el caso que se sospeche cualquier posible contamtnaclcn. debera repetirse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los oorteoojetos de un lote presenten celutas positivas debido ala contemtnacron del tampon 0 cuando se encuentren celulas positivas (fuera de los pocillos) en la supertlc!e del porteobjetos. 5.3.4 Exlsten varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de curies basales y secclones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de cetutas fluorescentes de morfologia atipica y bacterias saprofitas con reaocion cruzada cuyo tarnano y morfologia sean similares a los de C. m. subsp. sepedonicus, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF. 5.3.5 Deben tenerse en cuenta untcarnente las oelulas fluorescentes de tarnario y morfologia tipicos Ivease el punta 5.3.2). 5.3.6 Interpretacion de los resultados de la prueba FISH: i) se obtenoren resultados vanoos en la prueba FISH slempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen celulas tefiidas de verde fluorescente brillante, cuyo temano y morfologia sean los tloicos de las de C. m. subsp. sepedonicus, cuando se utilice e! filtro FITC, y celulas tefiidas de ro]o fluorescente brillante cuando se uti lice el filtro de rodamina. Si se encuentran celulas fluorescentes brillantes con morfologia ceractenstrca. calcular el numero medio de cefulas tipicas por campo mtcroscoptco y el numerc de oelulas tipicas por ml de precipitado resuspendido (apend ice 4). Las muestras que presenten al menos 5 x 103 celulas tipicas por ml de precipitado resuspendido se considereren potencialmente contaminadas y sera preciso realizar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 x 103 cefutas trotcas por ml de precipitado resuspendldo se oonslderaran negativas, ii) los resultados de la prueba FISH seran negativos cuando, utilizando el filtro de rodamina, no se observen celulas tentdas de ro]o fluorescente brillante con un tamafio y morfologia tipicos de C. m. subsp. sepedonicus. siempre que se observen cetutas tefiidas de rojo fluorescente brillante tfpicas en las preparaciones de control positive cuando se utilice el filtro de rodamina. 6. PRUEBA PCR Principio: Cuando se uti lice la prueba PCR como principal prueba de sereccrcn y este proporctone resultados positives. oebere realizarse la prueba IF como segunda prueba obligato ria de seleocion. Cuando se uti lice la prueba PCR como segunda prueba de seleccion y esta proporcione resultados positives, sera preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el cnacnostrco. La plena explotacicn de este metoda como principal rnerodo de seleccion solo se recomienda en e! caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo. Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este metoda deberan permitir la oetecclon reproducible de 103 a 10" celulas de C. m. subsp. sepedonicus par ml afiadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesarlo lIevar a cabo experimentos de optlmizacion para lograr niveles mexlmos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios. Deben utilizarse reectivcs y protocolos PCR validados. Seleccioner preferiblemente un metodo con control intemo. Tomar las precauciones necesarlas para evitar la contarnlnacton de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR deben lIevaria a cabo tecnicos experimentados en taboratcrtos especializados en biologia molecular. con el fin de reducir al maximo la posibilidad de contaminaclon con e! ADN buscado. Como prueba final del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (extracci6n de ADN y PCR) que dejen constancia de que no se ha producido arrastre de ADN. En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controfes negativos: extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus, controles de tampon utilizados para extraer la bacteria y e! ADN de la rnuestre. mezcla para la reaccion PCR. Deben incluirse los siguientes controles positives: ahcuotas de los precipitados resuspendidos a los que se haya anadido C. m. subsp. sepedonicus (para la preperecion. vease e! apendice 2), una suspension de 106 celulas por ml de C. m. subsp. sepedonicus en agua de un aislado virulento (por ejernplc, NCPPB 2140 0 NCPPB 4053), siempre que sea posible, utilizer tambien ADN extraido de las muestras de control positives en la prueba peR. Para evitar toda posible contsmmscicn, preparar los controles positivos en un entomo distinto al de las muestras que se vayan a someter a prueba. Los extractos de muestras deben ester. en la medida de 10 posible, fibres de tierra. En determinados casos puede ser recornendab!e preparer las extracciones a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR. 6.1 Metooos de purtficacion del ADN Utilizar muestras de control positives y negativas, como se indica mas arriba. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. Para la puriflcaclon del ADN buscado a partir de sustretos de muestras cornplejas, extsten cnversos metodos que eliminan los lnhlbtdores de PCR y otras reacciones enztrnatlcas y concentran el ADN buscado en el extracto de la muestra. 13138 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 EI siguiente metooo ha side optimizado para su utllizaoion con e! metodo PCR validado que figura en e! apendice 6. 6.1.a} Metodo de Pastrik (2000): 1. Verter con una pipeta 220 ~I de tampon de lisis (100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0J) en un tuba eppendorf de 1,5 ml. 2. Anadir 100 IJI de extracto de muestra y colocar en un calentador 0 al bane maria a 95 °C durante 10 minutos. 3. Colocar e! tubo en hielo durante 5 minutos. 4. Anadlr 80 ~I de solucion madre de lisozlrna (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCI, pH 8,0) e lncubar a 37°C durante 30 minutos. 5. Ariedir 220 IJI de solucion A Easy DNA@ (Invitrogen). mezclar adecuadamente por aqltacion e incubar a 65 "C durante 30 minutes. 6. Anadlr 100 ~I de soluoion B Easy DNA@ (Invitrogen) y agitar vigorosamente haste que e! precipitado se mueva libremente en el tuba y la muestra sea uniformemente viscosa. 7. Anadlr 500 ~I de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homoqenee. 8. Centrifugar a 15.000 9 durante 20 minutos a 4 "C para separar las fases y formar la interfase. 9. Transferir la fase superior a un tuba eppendorf sin utilizar. 10. Anadlr 1 ml de etanol al 100 % (- 20 "C}, agitar brevemente e incubar en hielo durante 10 minutos. 11. Centrifugar a 15.000 9 durante 20 minutos a 40 C y retirar e! etanol del precipitado. 12. Anadlr 500 IJI de etanol al 80 % (- 20 °C) y mezclar invirtiendo el tubo. 13. Centrifugar a 15.000 9 durante 10 minutos a 40 C. guardar el precipitado y retirar el etanol. 14. Dejar que e! preclpttado se seque al aire 0 en un Speed Vac de ADN. 15. Resuspender el precipitado en 100 ~I de agua ultrapura estert! y dejar a temperatura ambiente durante un minimo de 20 minutos. 16. Almacenar a - 20°C hasta que se necesite para PCR. 17. Decanter todo precipitado blanco mediante cerrtrifupacion. y utilizer 5 ~I del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR. 6.1.b} Otros metodos Se pueden aplicar otros rnetodos de extraocion de ADN (como p. ej. Qiagen DNeasy Plant Kit) slernpre que hayan demostrado ser igual de eficaces para purificar el ADN de muestras de control que contengan de 10' a 104 celulas oatoaenes por ml. 6.2 PCR 6.2.1 Preparar los ensayos controles de PCR de acuerdo con el protocolo validado teoenorce 6). Preparar una cmucton decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapure]. 6.2.2 Preparar la mezcla de reaccron PCR adecuada en un entorno libre de contamlnacion de acuerdo con e! protocolo publicado teoendtce 6). EI protocolo PCR validado es una reaccron «multiplex" que tambten Incorpora un protocofo PCR interne. 6.2.3 Anedtr 5 IJI de extracto de ADN por 25 IJI de reaccion PCRen tubos PCR esteriles. 6.2.4 Incorporar una muestra de control negativa que contenga solo mezcla de reacclcn PCR y anadlr la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCRen lugar de la muestra. 6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termoclclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado Iaoendtce 6). 6.3 Anellsis del producto de la PCR 6.3.1 Confirmar los amplicones PCR mediante erectrotorests en gel de agarosa. Corter al menos 12 ~I de mezcla de reacolon de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 IJI de tampon de carga teoencnce 6) en un gel de agarosa a! 2,0 % (p/v) en tampon tris-acetato-EDTA (TAE) (apendice 6) a 5-8 V por ern. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemp!o, 100 bp ladder. 6.3.2 Revelar las band as de ADN mediante la ttnclon con bromuro de etidio (0,5 mg por I) durante 30 a 45 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el rnanejo de este mutaqeno. 6.3.3 En el caso de los productos PCR amplificados del ternano esperado (apend ice 6), visualizar el gel teriido mediante transllurnlnacion UV de onda corta (por ejemplo, == 302 nm) y anotar los resultados. 6.3.4 Para todos los resultados 0 casos nuevos. verificar la autenticidad del amplicon de PCR realizando un analis!s con enzima de restrtccion en una muestra del ADN amplificado restante mediante la incubacion a la temperatura optima y durante el tiempo neceserto con una enzima y tampon adecuados Ivease el apendice 6). Confirmar los fragmentos digeridos mediante erectrotorests en gel de aqerose. siguiendo e! metodo indicado anteriormente, y observar el patron caracterfstico del fragmento de restrtccicn con transiluminacion UV una vez tenldo con bromuro de etrcno y comparar con el control positive no digerido y digerido. Interpretacion de los resultados de la prueba PCR La prueba PCR es negativa s! e! amplicon PCR especifico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamario esoeraoo no se detecta en la muestra en cuestron pero sf en todas las muestras de los controles positivos (en e! caso de PCR «multiplex» con cebadores de control lntemo especificos de la olanta. se debe amplificar con la muestra en cuestlon un segundo producto PCR del temeno esperado}. La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicon PCR especifico de la C. m. subsp. sepedonicus del tarnano y patron de restrlccion (cuando sea necesario) esoeraoos. siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de los controles negativos. La conflrrnacion fiable de un resultado positive puede obtenerse tambien repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores PCR (punto 9.3). BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13139 Nota: Se puede soapechar la lnhibicion de la peR s! e! amplicon esperado se obtiene de la muestra de ontrol posltfva que contiene C. m. subsp. sepedonicus en agua pero se obtienen resultados negativos de los controles positives con e. m. subsp. sepedonicus en extrecto de patata. En protocotos PCR "multiplex» con controles PCR tntemos. la inhibicion de la teeccion aparece indicada cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones. Se puede soapechar la existencia de contamtnaoion s! el amplic6n esperado se obtiene a partir de uno 0 varies de los controles negativos. 7. PRUEBA DE BIOENSAYO Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este metoda deberan permitir la deteccton reproducible de 103 a 104 unidades de forrnaoion de colonias de C. m. subsp. sepedonfcue por ml anadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparacion vease el apendice 2). La maxima sensibilidad de detecci6n se alcanaara cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las optirnas. No obstante, este metoda puede epficarse tarnbien con exito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre -68 y - 86 "C. Algunas variedades de berenjena constituyen un medio de enriquecimiento selectivo excelente para la profiferacion de C. m. subsp. sepedonicus, incluso en eusencta de sintomas, y facilitan tam bien una prueba contlrmatorla de huesped excelente. Las condiciones de cultivo deben ser optimas para reducir el riesgo de obtener falsos resultados negativos en las pruebas. Para mas detalles sobre e! cultivc. vease e! apendice 8. 7.1 Distribuir la totalidad de la alicuota de prueba sobrante del precipitado resuspendido de los puntos 3.1.6.03.2.5. entre las berenjenas, siguiendo uno de los metodos que se exponen a contrnuecron (7.3. 0 7.4.). Utilizar exclusivamente plantas que se encuentren en la fase foliar 2 - 3 y hasta la plena expansion de la tercera hcja verdadera. A fin de garantizar la uttllzacion completa del precipitado resuspendido, asi como la inoculacion efectiva, se reouertran entre 15 y 25 berenjenas por muestra para los procedimientos que se esbozan a conttnuacrcn. 7.2 Las berenjenas no deben regarse de uno ados dfas antes de la inoculaci6n para reducir la presion de turgencia. 7.3 Inoculacion en estrres. 7.3.1 Sosteniendo la planta entre dos dedos apliquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 IJI) del precipitado en suspension en el tallo situ ado entre los cotiledones y la primera hoja. 7.3.2 Con un bisturi estert! practicar una incision diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallc, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado. 7.3.3 Sellar el corte con vaselina esterll con una jeringa. 7.4 tnocutecton con jeringa. lnoculense los tallos de la berenjena Justo por encima de los cotiledones utilizando una jeringa proviste de aguja btpodermica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las berenjenas. 7.5 Como controles positivos, inocular 5 plantas con una suspension acuosa de 10' a 106 celulas por ml de un cultivo conocido de C. m. subsp. sepedonicus y, slempre que sea posible, con tejido de tuberculo infectado de forma natural (vease el punto 4) mediante el mismo metodo de inoculacion (7.3. 0 7.4.). 7.6 Como control negativo, inocular 5 plantas con tampon de precipitado estern mediante el mismo metoda de inoculacion (7.3. 0 7.4.). 7.7 Incubar las plantas en instalaciones adecuadas para la cuarentena durante un maximo de 4 semanas a una temperatura de 18 a 24 "C. Incubar las plantas can suficiente luz y un elevado nivel de humedad (70 a 80 'Yo) y agua, evltando que el agua se estanque y que las plantas se marchiten par falta de agua. Las celutas de C. m. subsp sepedonicus rnueren a temperatures superiores a 30°C Y la temperatura optima es 21°C. Para evttar la contamlnacion se deben lncubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente seoaraoos en un invernadero 0 oamara de cultivo: en e! caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separacion entre ttatamlentos. En el caso de que plantas para distintas muestras deban incubarse juntas, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertlllzacion, el rfeqo. la rnspeccrcn y cualquier otra manipulaci6n deben extrernarse las precauclones para evitar la contaminaci6n cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cameras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra. 7.8 Transcurrida una semana, examinar con regularidad a fin de detectar los sintomas. Contar e! numero de plantas que muestren sintomas. C. m. subsp. sepedonicus provoca e! marchitamientc de las hcjas en las berenjenas, que puede iniciarse con Hacidez internervial 0 de los bordes. EI tejido marchito puede aparecer al principio de color verde oscuro 0 moteado, pero se vuelve mas palido antes de necrosarse. Las zonas de marchitamiento internerviales suelen tener un aspecto graso 0 hurnedo como empapados en agua. EI tejido necrosado presenta a veces un borde amarillo brillante. Las plantas no estan necesariamente muertas; cuanto mas tardan en aparecer los sintomas, tanto mayor es la posibilidad de supervivencia. Las plantas pueden superar la tnfecclon. Las berenjenas jovenes son mucho mas sensibles a las pobtaclones bajas de C. m. subsp. sepedonicus que las plantas de mas edad, por 10 que es necesario utilizer plantas en el estadlo foliar 3, 0 inmediatamente antes del mismo. EI marcnltarnlento puede estar inducido tarnbien por pobteclones de otras bacterlas u hongos presentes en el precipitadc de tejido tuberose. Entre estos se incluyen Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, asi como 13140 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 grandes poblaciones de bactertas seprotttes. En particular, Erwinia chrvsanthemi puede provocar sintomas y marchitamiento en las hojas muy parecidos a los de C. m. subsp sepedonicus. La unfca diferencia en el caso de las infecciones causadas por Erwinia chrysanthemi es e! ennegrecimiento de los tallos. Dichos marchitamientos se pueden distinguir de los causados por C. m. subsp. sepedonicus. porque se marchitan rapidamente hojas 0 plantas enteras. Tambien puede prepararse una tincicn de Gram, esta prueba dtterenctera a C. m. subsp. sepedonicus de Erwinia ssp. 7.9 Tan pronto como se observen sintomas en las berenjenas debora procederse al reaislamiento, utilizando secclones de tejido foliar 0 del tallo de las plantas marchitas (vease el punto 3.1.3 para la mecerecton del tejido). Destnfectar la superficie de las hojas y tallos de berenjena trotandotos con etanol al 70 %. Realizar una pruebs IF 0 PCR con la savia de la planta de berenjena y aislar en medlos (selectivos) adecuados (vease e! punta 8). Tambien puede prepararse una tlncion de Gram taoendtce 9). Identificar los cultivos purificados de presunta C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (veanse las secclones 9 y 10). 7.10 En determinadas circunstancias, en particular cuando las condiciones de cultivo no sean cottrnes. puede ocurrir que C. m. subsp. sepedonicus este presente de forma latente en las berenjenas, inciuso despues de periodos de lncubacton de hasta 4 seman as. En el caso de que, transcurridas 4 semanes. no se observen srntomas. realizar una prueba IF/PCR con una muestra mixta de secciones de tallo de 1 ern de cada planta tom adas por encima de la seccion de rnocutacron. Si los resultados de la prueba son positives, debora procederse al reaislarnlento en medios (selectivos) adecuados de acuerdo con el procedimiento oescrtto en e! punto 8. Identificar los cultivos purificados de posible C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (secciones 9 y 10). Interpretacion de los resultados de la prueba del bioensayo Se obtendran resultados validos en la prueba del bioensayo cuando las plantas de control positive muestren sintomas tipicos. se puedan reaislar las bacterias de dichas plantas y no se detecten sintomas en los controles negativos. Los resultados de la prueba del bioensayo seran negativos si las plantas sometidas a la prueba no estan Intectadas por C. m. subsp. sepedonicus y slempre que se detecte la C. m. subsp. sepedonicus en los controles positives. Los resultados de la prueba del bioensayo saran positives cuando las plantas sometidas a la prueba esten lnfectadas por C. m. subsp. sepedonicus. 8. AISLAMIENTO DE C. m. subsp. sepedonicus Nota: EI cnacnostrco solo estara completo cuando se haya aislado e identificado Ivease e! punto 9) C. m. subsp. sepedonicus, y posteriormente confirmado mediante una prueba de patogenicidad (punto 10). Aunque C. m. subsp sepedonicus es un organismo delicado, puede etsterse a partir de tejido sintomatlco. No obstante, puede verse inhibida por las bacterlas saprofitas que profiferan repidarnente v. por tanto. los aislamientos directos a partir del precipitadc de tejido tuberoso 0 del tallo (punto 3.1.6. 0 3.2.5.) son diflciles. EI aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus se puede realizer con un medic selective y la dllucion adecuada del precipitado resuspendido de las cunas basales 0 tallos de patatas. Los aislamientos se realtaaran con todos los tuberculos 0 secciones de tallo de patata slntomatlcos y con las berenjenas en las no se observen sintomas pete con las que la prueba IF/PCR realizada a partir de la muestra rnixta haya arrojado resultados positivos Ivease el punta 7.10.). Cuando sea necesario, la maceracion de los tallos de berenjena debora reallzarse siguiendo el procedimiento descrlto en el punta 3.1.3. Como controles positives preparar diluciones decimales a partir de una suspension de 10" cfu por ml de C. m. subsp. sepedonicus (p. ej. NCPPB 4053 0 PO 406). Para evitar cualquier posibilidad de contamtnecton. preparar los controles positives separadamente de las muestras que se vayan a someter a prueba. Cada lote de medic selective que se prepare debera scmeterse a prueba a fin de deterrninar su idoneidad para el cultivo del patoqeno con anterioridad a su utilizacion en pruebas con muestras rutinarias. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. 8.1 Siembra en medio selective 8.1.1 A partir de una atfcuota de 100 ~I de una muestra de precipitadc de patata resuspendido 0 de savla de herenjena, realizer diluciones decimates en tampon de precipitado (apendice 3). 8.1.2 EI aislamiento a partir de precipitado de patata sin diluir no suele funcionar debido a la lentltud de crecimiento de C. m. subsp sepedonicus y a la competencia de saprofitas. Dado que en los tejidos infectados suele haber poblaciones elevadas de la bacteria, las seprofltas se diluyen normalmente, mientras que el oetoueno oerstste. Se recomienda, por tanto, recurrir a la tecnlca de la extension en placa y extender. con ayuda de un asa de extension {epalos de hockey"). 100 I-JI de cada una de las rnuestres. en dlluciones de 1/100 hasta 1110 000, en medio MTNA 0 NCP-88 taoendtce 5) (si se utilizan placas de Petri de 90 mm de diametro, se debera ajustar el volumen para ternanos alternativos de placa). Nota: Otra estrategia alternatlva constste en extender la ahcuota inicial de 100 ~I de preclpttado de patata en una primera placa de agar con ayuda de un aplicador y posteriormente extender, en estrtas. todos los residuos que queden en el aplicador en una segunda placa de agar. Hepetlr por ultimo con una tercera place. logrando est mediante el aplioador. el efecto de diluoion en las pia cas. 8.1.3 Incubar las pia cas en la oscuridad a una temperatura de 21 a 23°C. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13141 8.1.4 Las observaciones iniciales de las pia cas. incluidos los recuentos de colonies tipicas de la C. m. subsp. sepedonicus en rerecron con las pia cas de control, se realizan 3 dias despues. con recuentos posteriores transcurridos 5, 7 v, finalmente, 10 dias. 8.2 Purificacion de las colonlas sospechosas Nota: EI subcultivo de colonias de aspecto similar a C. m. subsp. sepedonicus debe realizarse en medios YMG para la rnocutecron de berenjenas y/o la posterior toentrtrcecron. Esto debe realizarse antes de que las pia cas crezcan demaslado. es decir, preterlblernente transcurridos de 3 a 5 dias. 8.2.1 Practicar una stembre en estrras de colonias de aspecto similar a la C. m. subsp. sepedonicus en la superficie de uno de los siguientes medios (apendice 5): agar de dextrosa nutritivo (NAD) (para su utilizacidn exclusiva en el subcultivo}, agar de levadura, paptona. glucosa (YPGA), agar de extracto de levadura, sales rninerales (YGM). Incubar a 21-24 "C durante 10 dias como maximo. C. m, subsp. sepedonicus crece lentamente y suele pro vocar unas colonias punteaoas. de color creme. de forma abovedada, en e! plazo de diez dias. [Fotos de colonies tipicas de C. m. subsp. sepedonicus tvease el sitlo web: http://forum.europa.eu.intiPubliclircJsanco/Home/main)]. 8.2.2 Volver a sembrar en estrfas para obtener cultivos puros. EI ritmo de crecimlento mejora con subcultivos. Las colonias trolces son de color blanco crema 0 marfil, amarillas en ocastones. reoonoeaoas. nsas. abultadas, abovedadas en forma convexa, mucoso-tluidas, con bordes intactcs y normalmente de un diametro de 1 a 3 mm. Una simple tlncion de Gram (apendice 9) puede resultar uti I para seleccionar colonias para pruebas posteriores. 8.2.3 Identificar los supuestos cuttlvos (vease el punta 9) y realizer una prueba de patogenicidad Ivease e! punto 10). 9. IDENTIFICACION ldentificar cultlvos puros de posibles aislados de C. m. subsp. Sepedonicus, utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios bioloqlcos diferentes. Cuando oroceoa. incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba etectuada, como controles positivos. 9.1 Pruebas de identificacion nutricional v enzimatica Determinar las propiedades fenotfplcas siguientes que esten universalmente presentes 0 ausentes en la C. m. subsp. sepedonicus, de acuerdo con los metodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), Anontmo (1987). Incubar todos los medios a 21°C Y examinar transcurridos 6 dias. Si no se ha producido creclmtento, incubar 20 dias. En todas las pruebas debera lnctulrse un control conocido de C. m. subsp. sepedonicus. Las pruebas fistoloqicas y nutricionales deberan reallzarse utilizando inoculaciones de subcultivos en agar nutritivo. Las comparaciones morfoloqicas deberan reatlzarse a partir de cultivos de agar de dextrosa nutritivos. Pruebas Resultado esperado Prueba de la cxldaclontermeruac. (O/F) Inerte 0 ligeramente oxidante Actividad oxidasa Crecirruento a 37 "C Actividad ureasa Hldrotists de ra esculina + Hldrotists del alrrudon - 0 debil lolerancia de NaCI al7 % Prooucclon de indol Actividad catalasa + Prooucclon de HlS Utihzeclon de citrato Licuefaccion de la gelatina Procucclon de acido de glicerol Procucclon de acido de lactosa - 0 oecu Procucclon de acido de ramnosa Procucclon de acido de salicina Tincion de Gram (apendice 9) + 9.2 Prueba IF a} Preparar una suspension de aproximadamente 106 celulas por ml en tampon IF teoenorce 3). b] Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado. c} Aplicar el procedimiento IF (punto 4). d} La prueba IF sera positiva si el titulo IF del cultivo es equivalente al del control positivo. 9.3 Prueba PCR a} Preparar una suspension de aproximadamente 106 celulas por ml en agua ultrapura. b) Calentar 100 ~I de la suspension celular en tubos cerrados en un calentador 0 a! bafro maria a 100 "C durante 4 minutos. Si fuese necesario, la adicion de NaOH recien preparado a una concentrecion final de 0,05 M puede ayudar a la lisls celular. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de -16 a - 24 "C hasta que sea necesario. c} Aplicar los procedimientos peR adecuados para amplificar los amplicones especificos de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemp!o, Pastrik, 2000; vease el apendice 4; Li y de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik y Rainey, 1999; Schaad et al., 1999). d} Se loqrara la identificacton positiva de C. rn. subsp. sepedonicus s! los amplicones de PCR son del mismo temeno y presentan polimorfismos del fragmento de restrtccton con la mlsma longitud que los de la cepa de control positivo. 9.4 Prueba FISH a} Preparar una suspension de aproximadamente 106 celulas por ml en agua ultrapura. b] Aplicar e! procedimiento FISH (punto 5). c) La prueba FISH sera positiva s! se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo. 13142 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 9.5 Perfiles de acldos grasos (Fatty acid profiling 0 FAP) a) Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoid) durante 72 horas a 21°C (+!- t"}. b) Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992). c) La prueba FAP sera positiva si e! perfil del supuesto cultivo es identico al del control positive. Los acidcs grasos cuva presencia es caracteristica son 15:1 Anteiso A, 15:0 lso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 y 17:0. EI Anteiso es altamente indicative de C. m. subsp sepedonicus. Otros qeneros tales como Cwtobacterium, Arthrobacter y Micrococcus cuentan tam bien con algunos de estos aoidos. No obstante, e! 15:1 Anteiso A es un acido raro en estas bacterias que, sin embargo, esta presente en todas las spp. Clavibacteren una proporcion que oscila entre e! 1 y e! 5 %. En C. m. subsp sepedonicus el valor se sltua normalmente en tome al 5 %. 9.6 BOX-peR a) Preparar una suspension de aproximadamente 106 celutas por ml en agua ultrapura. b) Aplicar la prueba con arreglo al procedimiento (Smith et st., 2001). 10 PRUEBA DE CONFIRMACION DE PATOGENCIDAD Como conttrrnecton final del diagn6stico de C. m. subsp. sepedonicus y para la evaluacion de la virulencia de cultivos identificados como C. m. subsp. sepedonicus debe realizarse la prueba de patogenicidad. 10.1 Preparar un tnoculo de aproximadamente 106 oelulas por ml de cultivos de 3 dias del aislado que se vaya a someter a prueba y de una cepa de control positive adecuada de C. m. subsp. sepedonicus. 10.2 Inocular entre 5 y 10 tallos de ptantutas de berenjena en la fase de la tercere hoja (punto 7.3. 0 7.4.). 10.3 lncubar a una temperatura de 18 a 24°C, con luz suflciente, humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el est res provocado por la sequla (punto 7.7) Con los cultivos puros oebere obtenerse el marchitamiento tipico en el plaza de dos seman as. Transcurrido este ptazo, las plantas que no muestren sfntorna alguno Ivease el punta 7.8.) deberan incubarse durante un maximo de 3 semanas a temperaturas que favorezcan su crecimiento pero que no superen los 25°C taoenotce 8). Si oesoues de 3 semanas no se presentan los srntomas. no podra confirmarse que el cultivo es una forma patoqena de C. m. subsp. sepedonicus. 10.4 Aislar de las plantas slntomatlcas separando una secci6n de tallo que este 2 cm por encima de la seccron de tnocutecton. Dilacerar y suspender en un pequeno volurnen de agua destilada estrin! 0 en tampon fosfato 50 mM [apendice 3). Aislar de la suspension mediante dilucion, extendiendo 0 aplicando en estrfas en MTNA e YPGA (apend ice 5), incubar entre 3 y 5 dias a una temperatura de 21 a 23°C Y examinar la tormecton de colonias tipicas de C. m. subsp. sepedonicus. Apimdice 1 Laboratorios dedicados a la optimizacion y la validacion de los protocolos Laboratorio (11 Agentur tur Gesundheit und Ernah rungssicherheit Departement Gewasbescherming Pianted irekto ratet Central Science Laboratory Scottish Agricultural Science Agency Laboratoire National de la Protection des veqetaux. Unite Bacterioloqie Labcratcire National de la Protection des Veqetaux. Station de Ouarantalne de la Pomme de Terre Biologische Bundesanstalt Pflanzenschutzamt Hannover State Laboratory Plantenziektenkundige Dienst Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Direccao-Gera! de Proteccao das Culturas Nacionalni institut za biologijo Centro de Dlaqnostico de Aldearrubia Ciudad Pais Viena y Linz Austria Merelbeke Belqica Lyngby Dinamarca York lnqlaterra Edimburgo Escocia Angers Francia Le Rheu Francia Kleinmachnow Alemania Hannover Alemania Irlanda Dublin Wageningen Paises Bajos A" Noruega Lisboa Portugal Liubliana Eslovenia Salamanca Espana (1) Cientificos de contacto: vease el stnc web http://fo rum.e uropa.eu. intfPubl ic/irc/sanco/Home/m ain. BQE num. 74 Mertes 27 rnarzo 2007 13143 Apimdice 2 Preparacicn de controles positivos y negativos para las pruebas de selecclon baaloas PCR/IF y FISH Preparar un cultivo de 72 horas de una cepa vlrulenta de C. m. subsp. sepedonicus [NCPPS 4053 0 PO 406] en medio base MTNA y suspender en tampon fosfato 10 mM para obtener una concentrecion de aproximadamente 1 a 2 x 108 cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspension Iigeramente turbia equivalente a una densidad optlca de 0,20 a 600 nm. Separar las cunas basales de 200 tubercutos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de C. m. subsp. sepedonicus. Procesar las cufias basales como siempre y resuspender el precipitado en 10 mi. Preparar 10 microviales esteriles de 1,5 ml con 900 ~I del precipitado resuspendido. Transferir 100 ~I de la suspension de C. m. subsp. sepedonicus al primer mtcrovlal. Homogeneizar por aqltaclon. Establecer niveles decirnales de contarntnaoion reali zando nuevas dlluciones en los 5 mlcroviales siguientes. Los 6 mlcrovlales conterntnados se utilizaran como controles positives. Los 4 microviales no contaminados se ututzaran como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda. Preparar alfcuotas de 100 ~I en microviales esteriles de 1,5 ml para obtener de este modo 9 replicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de -16 a - 24°C hasta su uso. La presencia y la cuantifloaclon de C. m. subsp. sepedonicus en las muestras de control oebera confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF. Para la prueba PCR, extraer ADN de las muestras de control positives y negativas para cada serie de muestras de ensayo. Para las pruebas IF y FISH, reatlzar ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensavo. En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse C. m. subsp. sepedonicus en a! menos 106 y 104 oelulas/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos. Apimdice 3 Tampones para los metodos de prueba GENERAL: Los tampones esterilizados pueden almace narse sin abrir hasta un ano. 1. Tampones para el procecnmtento de extreccrcn 1.1 Tampon de extracci6n (tampon fosfato 50 mM, pH 7,0) Este tampon se utilize para la extreccion de la bacteria del tejido de las plantas mediante homopeneizacion 0 eqitecion. Na2HPO. (anhidro) 4,26 9 KH2P0 4 2,72 9 Agua destilada 1,00 I Disolver los ingredientes, verlticar el pH y esterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutos. Los siguientes componentes adicionales pueden resultar utiles: Finalidad Cantidad tpor I) Copos de Lubrol Defloculante (*) Compuesto DC silicona antiespumante Antiespumante (*) Pirofosfato tetrasodico Antioxidante Polivinilpirrolidona -40 000 (PVP-40l Unir los inhibidores PCR 0,5 9 1,0 ml 1,0 9 50 9 (*) Para su uttflzaclcn en el metodo de extraccton por homoqenefzaclon. Tampones para la prueba IF Tampon IF {tampon fosfato sa/ina (PBS) 10 mM, 3,2 9 0,15 9 50 ml 100 ml Na2HPO•.12H20 NaH2P04.2H20 Glicerol Agua destilada Disolver los ingredientes, verificar el pH yesterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutos. En e! mercado se pueden encontrar soluciones de monta]e que protegen la tluorescencta. como p. e]., Vectashield® (Vector Laboratories) 0 Citifluor® {Leica}. 2.2 Tampon IF-Tween Este tampon se utiliza para lavar los portaobjetos. Anadir Tween 20 al 0,1 % al tampon IF. 2.3 Sotucion de glicero/ can tampon fosfato, pH 7,6 Este tampon se utiliza como fluido de monta]e en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia. 2,7 9 OAg 8,0 9 1,00 I NazHP0 4.12H20 NaH2P04.2H20 NaCI Agua destilada 1.2 Tampon de extreccion (tampon fosfato 10 mM, pH 7,2) Este tampon se utiliza para la resuspension y la dilucion de extractos de cunas basales de tuberculos de patata tras la concentracion en un precipttado mediante centrifuqacion. Na2HP04.12H20 2,7 9 NaH2P04.2H20 0,4 g Agua destilada 1,00 I Disolver los lnqredientes, verlticar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutes. 2. 2.1 pH 7,2] Este tampon se utiliza para la ouucton de anti cuerpos. 13144 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 Disclver los ingredientes y esterilizar vohimenes de medic litre de este medic en autoclave a 115 "Cdurante 20 minutes. Apendice 4 Determinacion del nivel de contamtnacion en las pruebas IF y FISH 1. Contar el numero de celulas fluorescentes tipicas por campo de vision (c). 2. Calcular el numero de celulas fluorescentes tlpicas por pocillo del portaobjetos del mlcroscoplo (C). C=cxSfs MgS04.7H20 MnS04.H 20 NaCI FeS04.7H 20 Sacto-agar (Difeo) Agua destilada 0,1 9 0,015 9 0,05 9 0,005 9 18 9 1.00 I Apendice 5 Medics para el aislarnientc y cultivc de C.m. subsp. sepedonicus a} Medics de cultivo generales: Donde y = volumen de preclpttado resuspendido en cada pocillo y F = factor de dilucion del precipitado resuspendido. donde S = superficie del pocillo del portaobjetos multiple y s = superficie del campo del objetivo s = ni2/4G2K2 donde i = coeficiente de campo (varia de 8 a 24 dependiendo del tlpo ocular) K = coeficiente del tubo (101,25) G = aumentos del objetivo (100x, 40x, etc.) 3. Calcular el numero de celufas fluorescentes tfpicas por ml de precipitado resuspendido (N). N = C x 1.000fy x F b) Medios de cultivo selective valid ados: MediaMTNA A menos que se especifique de otra manera, todos los componentes de los medios son de SDH. Extracto de levadura (Difeo) 2,0 9 Manitol 2,5 9 K2HP04 0,25 9 KHzP04 0,25 9 NaCI 0.05g MgS04.7H20 0,1 9 MnS04.H 20 0,015 9 FeS04.7H 20 0,005 9 Agar (Oxoid no 1) 16,0 9 Agua destilada 1,0 I Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7.2. Tras esterttlzer en autoclave (a 121 °C durante 15 minutos) y enfriar a 50 "c. anadtr los siqulentes antlbiotlcos: 0,06 9 de trimetoprim, 0,002 9 de acldc nalidixico y 0,01 9 de anfotertclna B. Soluciones antibioticas estandar: trimetoprim (Sigma) y acido nalidfxico (Sigma) (en ambos casos a 5 mgfml), en metanol al 96 %, anfotericina B (Sigma) (1 mg/ml) en dimetil sulfoxide. Las soluciones estandar se estertllzan por filtracion. Nota: La durabilidad del medio base es de 3 meses. Una vez ariadidos los antrbrctlcos. la durabilidad es de 1 mes siempre que se mantengan refrigerados. 23,0 9 1,00 I Agar nutritivo (NA) Agar nutritive (Difco) Agua destilada Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar de dextrosa nutritivo (NDA) Agar nutritive de Difeo Bacto con un 1 % de D(+) glucosa (rnonohtdrato]. Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 20 minutes. Agar de levadura, peptone, glucosa (YPGA) Extracto de levadura (Difeo) 5,0 9 Bacto-peptona (Difco) 5,0 9 D(+)-glucosa (monohidrato) 10,0 9 Sacto-agar (Difeo) 15,0 9 Agua destilada 1.00 I Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutes. Medio de sales minerales, extracto de levadura (YGM) Bacto-extrecto de levadura (Difco) 2,0 9 D(+)-glucosa (monohidrato) 2,5 9 K2HP04 0,25 9 KH2P04 0,25 9 Media NCP-88 Agar nutritive (Difco) 23 9 Extracto de levadura (Difeo) 2 9 D-manitol 5 9 K2HP04 2 9 KHzP04 0,5 9 MgS04.7H20 0,25 9 Agua destilada 1,0 I Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7,2. Tras esterilizar en autoclave y enfriar a 50 °C, anadir los siguientes antibloticos: 0,003 g de sulfato de polimixina B (Sigma), 0,008 9 de acroo nalidixico (Sigma) y 0.2 9 de ciclohexirnida (Sigma). Disolver los anttbiottcos en las siguientes soluciones estandar: el acido nalidixico en NaOH 0,01 M, la cicloheximida en etanol al 50 % y el sulfato de polimixina B en agua destilada. Las soluciones estanoar se esterttlzen por Hltracion. Nota: La durabilidad del medio base es de 3 meses. Una vez anadidos los antlbloticos, la durabilidad es de 1 mes siempre que se mantengan refrigerados. BQE num. 74 Mertes 27 rnarzo 2007 13145 Apimdice 6 Reactivos y protocolo PCR validados Nota: Las pruebas preliminares debe-an permitir la oeteccton reproducible de al menos 103 a 104 celulas de C. m. subso sepedcnlcue por ml de extracto de muestra. Cebador directo PSA-1 Cebador reverse PSA -R Cebador directo NS-7-F Cebador reverse NS-8-R Por otra parte. las pruebas preliminares no deben proporcionar resultados falsos positives con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleecionadas. 1. Protocolo PCR «multiplex" con control PCR interno (Pastrik, 2000) 1.1 Cebadores ouoonucteouaos 5'- etc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3' 5'- tac tga gat gtt tea ctt ccc e -3' 5'- gag gca ata aea ggt ctg tga tgc -3' 5'- tee gea ggt tea cet acg ga -3' Tamafio esperado del ampficon de ADN de C. m. subsp. sepedonicus= 502 pb (conjunto de cebadores PSA). Tamano esperado del emoncon del control PCR interne de ARNr 185 = 377 pb (conjunto de cebadores NS). 1.2 Mezcla para la resccion PCR Reactivo Cantidad para II' reacci6n COllcentraci6n finai Agua ultrapura estertt 15,725 IJI 10x tampon PCR (1) (15 mM MgClzl 2,5 IJI 1x (1,5 mM MgCI2) BSA (traccron V) (10 %) 0,251J1 0,1 0/0 Mezcla d-nTP (20 mM) 0,125 IJI 0,1 mM Cebador PSA-1 (10IJM) 0,5 IJI 0,21JM Cebador PSA-R (1OIJM) 0,5 IJI 0,21JM Cebador NS-7-F (10IJM) (2) 0,1 IJI 0,041JM Cebador NS-8-R (10IJM) (2) 0,1 IJI 0,041JM Polimerasa Taq (5UflJl) (1) 0,2 IJI 1,0 U Volumen de muestra 5,0 IJI Volumen total: 25,0 IJI III Los metodos se vahdaron utllizandc oonmerase Taq de Perkin Elmer IAmphTaq 0 Goldl y Glbco BRL. 121 La concentradon de los cebadores NS-7 F y NS·8·R sa optimizo para la eXlraccion de cunas basales de palata ulilizando el metodo de hornoqenenaclon y purificacion del ADN de acuerdo con Pestrtk (2000) (veanse los puntos 6.1,a\ y 6,2). Sera necesar!o proceder a ra reoptimizaci6n de las concentraciones de reactivos si se utiliza el metodo de extrscci6n por agitaci6n u otros metodos de aislamiento del ADN, 59 50 ml 1.3 Condiciones de reeccion PCR Aplicar e! siguiente programa: 1 cicto de: i) 3 minutos a 95 "C (desnaturalizacion de ADN) 10 ciclos de: ii) 1 minuto a 95 "C (desnaturaftzaoion de ADN) iii) 1 minuto a 64 "C (anillamiento de los oebadores} iv] 1 minuto a 72 "C (extension de la copia) 25 ciclos de: v] 30 segundos a 95 °C (desnaturalizacion de ADN) vi) 30 segundos a 62 °C (anillamiento de los cebadores) vii) 1 minuto a 72 "C (extension de la copia} 1 cicto de: viii) 5 minutes a 72 "C (extension final) ix] mantener a 4 °C Nota: Este programa se ha optimizado para utilizarlo con un terrnociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duracion de los ciclos Ii), iii) iv], vl, vi) y vii) para su uttltaacion con otros modelos. 1.4 Analisis de la enzima de restnccion del smpticon Los productos PCR amplificados a partir de ADN de C. m. subsp. sepedonicus producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restrtcclcn caracteristico con la enzima Bgi II tras la lncubaclon a 37 °C durante 30 minutos. Los tarnanos de los fragmentos de restrlcoion obtenidos a partir del fragmento especifico de C. m. subsp. sepedonicus son de 282 pb y 220 pb. 2. Preparacion del tampon de carga 2.1 Azul de bromofenol isotucion estenoer al 10 %) Azul de bromofenol Agua bidestilada 2.2 Tampon de carga Glicerol (86 %) 3,5 ml Azul de bromofenol (2.1.) 300 IJI Agua bidestilada 6,2 ml 3. 10X tampon de tris ecetato EDTA (TAE), pH 8,0 Tampon trls 48,4 g Acido ecetlco glacial 11,42 ml EDTA (sal cnsocncal 3,72 g Agua destilada 1,00 I 13146 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 0,01 % 5 ng/IJI 5 ng/IJI 8.52 9 5,44g 1,00 I Diluir a lX antes de utilizarlo. Se encuentra tarnbien disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen 0 equivalente). Apendice 7 Reactivos validados para la prueba FISH 1. Oligosondas Sonda especifica para Cms CMS-CY3-01: 5'- ttg cgg ggc gca cat etc tgc acg -3' Sonda eubacteriana no especifica EUS-338-FITC: 5'- gct gcc tee cgt agg agt-3' 2. Solucion fijadora !AOVERTENCIA: LA SOLuc/6N FIJADORA CONT/ENE PARAFORMALOEHfoo QUE ES ronco. UT/LIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENOA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES,! i} Calentar 9 ml de agua de grade molecular (p. ej. agua ultrapura) a 60°C aproximadamente y anadir 0,4 9 de paraformaldehido. EI paraformaldehido se disuelve cuando se anaden 5 gotas de NaOH 1N Y se rernueve con un agitador maqnetico. ii} Ajustar el pH a 7,0 mediante la adicion de 1 ml de tampon fosfato de concentraci6n 0,1 M (pH 7,0) Y 5 gotas de HCI IN. Verificar el pH con band as indicadoras y ajustar si fuese neceserto con HCI 0 NaOH. !AOVERTENC/A: NO UT/LiZAR UN MEO/OOR DE PH EN SOLUC/ONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEHfoo.r iii) Filtrar la soluci6n con un filtro de membrana de 0,22 IJm y mantener libre de polvo a 4 "C hasta nueva utilizad6n. IV) Nota: Sotucton fijadora alternativa: etanol al 96 0/0. 3. 3X Hvbmix NaCI 2,7 M Tris-HCI 60 mM (pH 7,4) EDTA (esterilizado por filtracion y autoclave] 15 mM Diluir a 1X cuando se precise. 4. Sotucton de hibridacion 1X Hybmix Dodecilsulfato sodico (SDS) sonda EUS 338 sonda CMSCY301 Preparar las cantidades de sclucion de hibrldacion de acuerdo con los catcutos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga 2 muestras distintas por duplicado) se prectsen 90 IJI de solucion de hibridaclon. 2 8 oonaoojetos oonaoojetos 1 % SDS 0,9 3,6 Sanda EUB 338 (100 ng/IJI) 4,5 18,0 Sonda CMSCY301 (100 ng/1J1l 4,5 18,0 Volumen total (IJI) 90,0 360,0 NB. Almacenar todas las soluciones que contengan oligosondas fotosensibles en la oscuridad a - 20 QC. Proteger de la luz directa ya sea del solo electrlca durante su utihzacion. 5. Tampon fosfato 0,1 M, pH 7,0 NazHP04 KH2P04 Agua destilada Disolver los ingredientes, verificar e! pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutes. Apendice 8 Cultivo de berenjenas Sembrar semillas de berenjena (So/anum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las plantulas con los cotiledones completamente abiertos (1 a 14 dias) en compost pasteurizado de tiesto. Las berenjenas deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones ambientales: Duracion diurna: 14 horas 0 dia natural si es de mayor duracion. Temperatura: diurna: de 21 a 24 "C nocturna: 15QC Variedades de berenjena sensibles: 'Slack Beauty', 'Long Tom', 'Rima', 'Balsas'. Proveedores: vease el sltio web: http://forum.europa.eu.int/Publielirc/sanco/Home/main Aoenatce 9 Procedimiento de la trncton de Gram [modificacion de Hucker) (Doetsch, 1981) (1) So/uci6n de crista/ via/eta Disolver 2 9 de cristal vloteta en 20 ml de etanol al 95 %. Disolver 0,8 9 de oxalate am6nico en 80 ml de agua destilada. Mezctar las des soluciones. Tabla 1: Cantidades sugeridas para la preparacion de la mezcla de hibridacion 2 8 portaobjetos portaobjetos Triturar conjuntamente los solidos en un mortero. Afiadir a! agua y remover haste su dlsolucion en un recipiente cerra do. Agua ultrapura estert! 3x hybmix 50,1 30,0 200,4 120,0 So/uci6n de Lugo/ Yodo Yoduro de potasio Agua destilada 1 9 29 300 ml BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13147 Mezclar y conservar. Dlluir all :10 para conseguir una soluclon de trabajo. Procedimiento de tlncion 1. Preparar los frotis, secar al eire y fijar por calor. 2. Sumergir el portaobjetos en la sorucron de crista! violeta durante un minute. 3. Lavar brevemente con agua corriente. 4. Sumergir en soluclon de Lugol durante un minuto. 5. Lavar con agua corriente y secar. 6. Decolorar con etanol al 95 %, anadidc gota a gota hasta que va no se produzca ninqun cambio de color, 0 sumergir agitando suavemente durante 30 segundos. 7. Lavar con agua corriente y secar. 8. Sumergir en la soluoion de safranina durante 10 segundos. 9. Lavar con agua corriente y secar. Las bacterias Gram. positives se trnen de vtoleta-ezu! y las Gram. negativas de rosa-rojo. (1) Tambien pueden utllizarse otras soluctones y kits de tlncion disponibles en el mercado. BIBLIOGRAFIA 1. Anontmo. 1987, «Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers". Comision de las Comunidades Europeas, Luxemburgo. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp. 2. Bradbury, J. F., 1970, "Isolation and preliminary study of bacteria from plants», Rev. PI. Path., 49, pp. 213-218. 3. utnesen. I. G., 1984, "The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers», EPPO Bull. 14 (2), pp. 147-152. 4. Doetsch, R. N., 1981, «Determinative methods of light microscopy», Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology. Washington, pp. 21-23. 5. Hugh, R. F. Lettson. 1953, «The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria», J. Bact., 66, pp. 24-26. 6. Janse, J. D., 1991, «Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid analisia», Systematic and Applied Microbiology 14, pp. 335-345. 7. Janse, J. D. y J. Van Vaerenbergh, «The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato». EPPO Bull., 17, 1987, pp.l-l0. 8. Jansing, H. y K. Rudolph, 1998, "Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium», Journal of Plant Diseases and Protection, 105, pp.590-601. Sotucion de contraste de safranina Sotuclon estandar: SafraninaO Etanol al 95 % 2,5 g 100 ml 9. Klement Z.; Rudolph, K y D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akademiai Klado, Budapest, 568 pp. 10..Kovacs, N., 1956, "Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction», Nature, Londres, 178, pp. 703 11. Lelliott, R. A., 1966, "The plant pathogenic coryneform bacteria», J. appl. Bact., 29, pp. 114-118. 12. Lelliott, R. A., E. Billing y A. C. Hayward, 1966, «A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads », J. appl. Bact., 29, pp. 470-489. 13. Lelliott, R. A. Y P. W. Sellar, 1976, «The detection of latent ring rot [Corynebacterium sepedonicum {Splek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.)] in potato stocks", EPPO Bull., 6 (2), pp.l0l-l06. 14. Lelllctt, RA and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. 15. Li, X. y S.H. de Boer, 1995, "Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus», Phytopathology, 85, pp.837-842. 16. Mills, D., Russell, B., W. y J., W. Hanus, 1997, "Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization», Phytopathology, 87, 8, pp. 853-861. 17. Pastrik, K. -H. y A.A. Rainey. 1999, «Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques», J. Phytopathology 147; pp. 687-693. 18. Pastrik, K.-H., 2000, «Detection of Clsvibecter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA", European Journal of Plant Pathology, 106, pp. 155-165. 19. Ramamurthi, C. S., 1959, «Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacterial), Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp. 20. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. y Knorr, D. (1999), «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system», Plant Disease 83; pp. 1095-1100. 21. Schaad, W. 2001, "Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria», Schaad [Hrsq.L 3a. ed.; St. Paul, Minnesota, 373 pp, 22. Skerman, V. B. D., 1967, A guide to the identification of the genera of bacteria. Segunda edtcicn. Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1967. 23. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001, «Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. eepedonicus», European Journal of Plant Pathology, 107 (7), pp. 739-748. 24. Sneath, P. H. A. y V. G. Collins, 1974, "A study in test reproductibility between laboratories: report of 13148 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 ANEXQ III del cultivo aislado del organismo, hasta un mes oesoues. como rnfnimo. en virtud del procedimiento establecido en el articulo 5, apartado 2. produccion de los hace referencia en el lugares de a los que se 3. La notntcecron a que se hace referencia en el articulo 5, apartado 2, se ajustara a 10 siguiente: se efectuara de manera inmediata una vez que la presencia haya side confirm ada por las pruebas de laboratorio con arreglo a los metooos expuestos en el anexo I, y debera recoger, como mtntmo: • el nombre de la variedad dellote de patatas. • el tlpo (de consume. de siembra. etc.I v. en su case, la cateqorfa de pateta de siernbra, el lugar 0 tuberculos 0 plantas guion anterior. 2. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinacion de la posible propeqacion con arreglo al articulo 5, apartado 1, letra c), lncluiran: la proximidad de otros lugares de produccion en los que se cultiven patatas u otras plantas huespedes, y la produccion en comun y el uso comun de existencias de patates de slembre. el lugar 0 lugares de produccicn relacionados en alguna medida con la producclon de los tuberculos 0 plantas declarados contaminados en virtud del articulo 5, apartado 1, letra a), incluido el material y las lnstalaciones de produccicn compartidos directamente 0 a naves de un contratista comun: los tuberculos 0 plantas producidos en ellugar 0 los lugares de produccton contemplados en e! guion anterior, 0 presentes en tal(es) lugar(es) de produccion durante el periodo en el que los tuberculos 0 plantas declarados contaminados sequn el articulo 5, apartado 1, letra al. se encontraban en el lugar de proouccion citado en e! primer guion; los locales que manipulen patatas procedentes de los lugares de produccion mencionados en los guiones anteriores; cualquier maquinaria. vehiculc. buque, almacen o unidades de estos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embetaje. que puedan haber estado en contacto con los tuberculos 0 plantas declarados contamlnados en virtud del articulo 5. apartado 1, letra a); todos los tuberculos 0 plantas almacenados 0 que hayan estado en contacto con cualquiera de las estructuras u objetos enumerados en el guion anterior antes de la lirnpieza y oesrnteccton de los mtsmos: como resultado de las pruebss contempladas en el articulo 6, aquellos tuberculos 0 plantas que tengan una relacicn clonal fraterna 0 paternal con los tuberculos o plantas declarados contaminados en vlrtud del articulo 5, apartado 1, letra a), y con respecto a los cuales parezca probable la contaminacion a traves de un vinculo clonal. aunque las pruebss de detecolon del organismo haven arrojado resultados negativos; pueden lIevarse a cabo pruebas de variedades para verlficar la identidad de los tuberculos 0 plantas contaminados y clonal mente relacionados, y hasta arriba pertinente, metooos la documentacion apncecron de los toda completar la rnencionados. La retencion de los tuberculos permitira que se puedan lIevar a cabo pruebas de variedades cuando se estime oportuno. ccneervecten de las pruebas analiticas en caso de epertcten de un brote sospechoso 1. En cada caso de foco sospechoso para e! que se have realizado una 0 vanes pruebas de seleccion con resultados positives de acuerdo con los metodos establecidos en el anexo I, y se espere recibir conflrrnacion 0 retutaclon por eplicacion de los cltados metodos, se debera proceder a la retenclcn y adecuada conservacron de: todos los tuberculos v, siempre que sea posible, las plantas de los que se haven obtenido muestras, cuetquler extracto sobrante y cualquier material adicional que se haya preparado para la prueba 0 pruebas de seleccicn (por ejernplc, las pia cas de inmunofluorescencia), y Pseudomonas working party», Antonie van Leeuwenhoek, 40, pp. 481-527. 25. Stead, D.E., 1992, «Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles», International Journal of Systematic Bacteriology 42; pp. 281-295. 26. Wullings. B. A.; van Beuningen, A. R.; Jense. J. D. Y A. O. L. Akkermans, 1998, «Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes», Appl. Environ. Microbiol, 64. pp. 4546-4554. ANEXO II 2. En el caso de conftrmacton de la presencia del organismo, se procedera a la retenoion y adecuada conservacron: del material especificado en el punto 1. de una muestra de las berenjenas infectadas inoculadas con extracto de tubercu!o 0 de planta, y Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinacion de la poblacion contaminante 1. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinacion de la extension de la probable contamtnacion con arreglo al articulo 5, apartado 1, letra b), incluiran: los tuberoulos 0 plantas cultivados en un lugar de produccton declarado contaminado en virtud del articulo 5, apartado 1, letra a); BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13149 cuando exista e! riesgo de contamlnaolon de patatas procedentes de otra u otras Comunidades Autcnornas. la Comunidad Autonoma en que se haya confirmado el brote notificara inmediatamente a las Comunidades Autonomas interesadas la informacion necesarta para. en su caso, declarar la contemtnacron. determinar la extension de la probable oontamf nacion y delimitar una zona de conformidad con las tetras a), b), y c) del apartado 1 del articulo 5, inciuyendo: • el nombre de la variedad dellote de patatas, • el nombre y la dtrecclon del proveedor y del oesttnaterto. • la fecha de entrega dellote de patatas. • el tarnano dellote de patatas entregado, • una copia del pasaporte fitosanitario 0 al menos el numero de dicho pasaporte. en su caso, 0 el numero de registro del cultivador 0 del comerciante, en su caso, y una copia del aviso de entrega. Cuando se surninistre dicha informacion, la Comunidad Autonoma lnforrnara de ello inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alirnentacion. cuando exista e! riesgo de contamlnaolon de patatas destinadas a otro u otros Estados Miembros, la Comunidad Autonoma en que se haya confirm ado el brote notlficara inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Anmentacron y este a su vez, a treves del cauce correspondiente a los Estados Miembros Interesados, la informacion necesaria para, en su ceso, declarar la contaminaci6n y delimiter una zona de conformidad con las letras a), b), y c) del apartado 1 del articulo 5, inciuyendo: • el nombre de la variedad dellote de patatas, • e! nombre y la dlreccion del proveedor y del destlnatar!o, • la fecha de entrega dellote de patatas, • el ternano dellote de patatas entregado, • una copia del pasaporte fitosanitario 0 al menos e! mimero de dicho pasaporte. en su case, 0 e! numero de registro del cultivador 0 del comerciante, en su ceso. y una copia del aviso de entrega. Cuando se sumlnistre dicha informacion, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Aumenteclon lnforrnara de ello inmediatamente a la comtston. cuando exlsta el riesgo de contaminacion de patatas procedentes de otro u otros Estados Miembros a rafz de la correspondiente notfflcacton 0 notrttcectones de los mtsmos. el Ministerio de Agricultura, Pesca y Allrnentacion cornunicara la informacion recibida a las Comunidades Autonornas interesadas para, en su caso, declarar la contamtnactcn. determinar la extension de la probable contaminacicn y delimitar una zona de acuerdo con las letras a), b), y c) del apartado 1 del articulo 5. Una vez que todas las investigaciones hayan concluido, las Comunidades Autoncrnas tectntaran. para cada caso: • la fecha en la que se confirm6 la contaminaci6n, • una breve oescrlpcion de la lnvestlqaclon lIevada a cabo para identificar la fuente y la posible propaqecion de la contarntnaclcn, inciuido el alcance del muestreo efectuado, • informacion sobre la fuente 0 fuentes de contaminacion determinadas 0 presuntas, • detalles relatives a la extension de la oontaminaclon declarada, inciuido el nurnero de lugares de produccion y el numero de lotes, con la indicacton de la variedad v, en el caso de la patatas de siembra, la categoria, • detalles relatives a la dalimitaoion de la zona, incluido e! numero de !ugares de producclon no declarados contaminados pero inciuidos en la zona, • cualesquiera otros datos que requiera e! Ministerio de Agricultura, Pesce y Alirnentacion 0, en su ceso, la Comtsion relatlvos al brote 0 brotes confirmados. ANEXO IV Medidas bajo control oficial 1. Las medidas bajo control oficial contempladas en e! articulo 7, tetra a), saran las siguientes: la utilizacion como piensos tras un tratamiento termtco adecuado que garantice que no hay riesgo alguno de supervivencia del organismo, o bien la elirninacion en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del patoqeno al medio ambiente, por ejemplo, mediante la tutracrcn a tierras de cultivo. o bien la rnctneractcn. o bien la tranetormecron industrial mediante entrega directa e inmediata a una planta de transformacion dotada de instalaciones de ellrntnaclon de residues autorizadas oficialmente, con respecto a las cuales se haya excluido cualquier riesgo identificable de propaqacion del organismo, y de un sistema de limpieza y oestnteccton de los vehiculos de transporte, al menos, o bien otras medidas, slempre que se have descartado e! posible riesgo de propeqecion del orqanlsmo, las cuales deberen notltlcarse al Ministerio de Agricultura, Pesca y Altmentacton y este a su vez, a traves del cauce correspondiente, a la comtslon y a los demas Estados miembros acompenadas de su justtttcecton. Todo residue restante asociado y derivado de 10 anterior debera efiminarse mediante metodos autorizados oficialmente conforme a 10 dispuesto en el anexo V de la presente orden. 2. La ututzacion 0 la enmtnecton eprootaoae de los tuherculos 0 plantas deciaradas probabtemente contaminadas de conformidad con e! articulo 5, apartado 1, letra b), a las que se hace referencia en el articulo 7, letra b), oeberan efectuarse bajo el control de los organismos oficiales responsables interesados, est como con la oportuna comuntcecton entre estos 13150 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 organismos para garantizar en todo momenta dicho control, y con la aprobacion del organismo oficial responsable de la Comunidad Aut6noma donde vayan a envasarse 0 transformarse las patatas, en 10 que se refiere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo. y conststtran en 10 siguiente: la utllizacion como patatas de consumo destinadas al consumo, envasadas para su distribuci6n y vente sin cambio de envase. en un lugar dotado de tnsteractones de eliminaci6n de residuos adecuadas; las patatas destinadas ala siembra solo pueden manipularse en el mismo lugar si esto se realiza separadamente 0 tras la limpieza y desinfecci6n, o su uso como petates de con sumo para la transtormecton industrial y destinadas a la entrega directa e inmediata a una planta de tranetormacron dotada de instalaciones adecuadas de ellrntnaclon de residuos y de un sistema de limpieza y desinfecci6n de, at rnenos. los vehiculos de transporte, o elqun otro tlpo de uso 0 elirnlnacion, siempre que se excluya todo riesgo identificable de propacacion del organismo, y previa aprobaolon de los citados organismos oftcletes responsables. 3. Los rnetodos apropiados de limpieza y oestntecclon de todos los objetos contemplados en el articulo 7, letra c), seran aquellos para los que se haya excluido cualquier riesgo identificable de propaqacion del orqanlsmo, y se epjcaran bajo e! control de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Aut6nomas. 4. La serie de medidas que deben adoptar las Comunidades Aut6nomas en la zona delimitada de conformidad con el articulo 5. apartado 1. letra cl. a la que se hace reterencla en e! articulo 7, tetra d). lncluira las rnedidas siguientes: 4.1 En los lugares de produccion que se declaren contaminados en virtud del articulo 5, apartado 1, tetra a): a} en los campos que se declaren contaminados sequn el articulo 5, apartado 1, letra a], 0 bien, i} - al menos durante los tres anos de cultivo siguientes al de declaraclon de la contarninaoion: • se edcptaran medidas para eliminar las plantas de pateta espontenees y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, y • no se plantaran tuberculos, plantas nl semi lias de patate propiamente dichas, ni ninguna otra planta que pueda contener natural mente e! organismo, nl ninqun cultivo que presente un riesgo cierto de propapacion del organismo, en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al periodo indicado en el guion anterior v, slempre que en las rnsoecctones oficiales se haya comprobado que, durante al menos los dos enos de veqetacion inmediatarnente enterfores a la ptantacion, e! campo estuvo libre de plantas de patata esponteneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, s610 se permitire la oroduccton de patatas de consumo y los tubercufos recolectados se someteran a prueba conforme al procedtmlento detallado en e! anexo I, en la temporada de cultivo de patatas siguiente a la mencionada en el guion anterior y tras un ciclo de rotaci6n adecuado, cuya duraci6n minima sera de dos enos cuando vayan a cultivarse patatas de siembra, se podran plantar patatas de siembra 0 de consumo y se realizara una encuesta oficial tal como se dispone e! articulo 2, apartado 1, 0 bien, ii} - durante los cuatro enos de cultivo siguientes al de oecraracron de la contemtnecton: • se adoptaran medidas para eliminar las plantas de patata esoontanees y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, • y • se dejara y mentendra e! campo, 0 bien en barbecho complete. 0 bien en pasto permanents con siega 0 pastoreo intenso 0 frecuente, en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al periodo indicado en el gui6n anterior v, siempre que en las inspecciones oficiales se haya comprobado que, durante a! menos los dos enos de vegetaci6n inmediatamente anterlores a la plantaci6n, el campo estuvo fibre de plantas de patata esoontanees y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, se permitlra la producci6n de patatas de siembra 0 consume y los tuberculos recolectados se someteran a prueba conforme al procedimiento detallado en el anexo I; b) en el resto de los campos del lugar de produccion contaminado, y a concncron de que los organismos oficiales competentes tengan la certeza de que se ha eliminado e! riesgo de plantas de patata espontaneas y de cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo: durante e! ano de cultivo siguiente al de declaraci6n de contamlnacion 0 bien no se plantaran tuberculos, plantas nl semillas propiamente dlchas de patata. ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, 0 se pod ran plantar patatas de siembra certificadas. pero solo para la produccton de patatas de consumo, y durante e! segundo afro de cultivo siguiente al de declaraci6n de contamtnacion solo se pod ran plantar patatas de siembra certificadas 0 patatas de siembra que hayan side sometidas a pruebas oficiales para determinar la ausencia de necrosis bacteriana y cultivadas bajo control oficial en lugares de proouccion cnstrntos a los mencionados en e! punto 4.1, ya sea para la proouccton de siembra 0 de consume, durante el tercer aiio de cultivo siqulente al de declaraci6n de contaminaci6n, al menos. s610 se pod ran plantar patatas de slembra certificadas 0 patatas de siembra cultivadas bajo control oficial a partir de patatas de siembra certificadas, ya sea para la proouccton de siembra 0 de consumo, en cada uno de los enos de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tomeran BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13151 medidas para eliminar las plantas de patata espontaneas y cuatquler otra planta que pueda contener naturalmente el organismo en caso de advertirse su presencia, y se realizaran pruebas oficiales de las patatas recolectadas conforme al procedimiento detallado en el anexo I en tooos los campos de oetetas: c) inrnediatarnente oespues de la dec lara cion de contamtnacion en virtud del articulo 5, apartado 1, letra a], y tree el primer ana de cultivo siguiente, todas las mequtnas e instalaciones de almacenamiento que se encuentren en ellugar de producci6n e intervengan en la producclon de patates seran limpiadas y desinfectadas como resulte adecuado con los metodos apropiados, sequn 10dispuesto en el punta 3; d) en el caso de las unidades de oroduccton de cultivos protegidos en las que sea posible una sustttuclon total de los medlos de cultivo, no se plantar-an tuberculos, plantas ni semillas propiamente dichas hasta que la unidad de producci6n no haya sido sometida a medidas bajo control oficial destinadas a eliminar el organismo y a retirar todo el material vegetal que pueda ser huesped del misrno. Inctutda, como minimo. la sustituoion total del medic de cultivo y la limpieza y destnfecclon de la unidad de produccion y de todos los equipos, y los organismos oficlafes responsables no hayan concedido la subsiguiente autcrtzacton para la produccion de patata. y la produccion de patata procedera de patatas de siembra certificadas 0 de mtnituberculos 0 micro-plantas oerlvadas de fuentes probadas. 4.2 Dentro de la zona defimitada, sin perjuicio de 10 dispuesto en el punta 4.1, las Comunidades Autonornas aplicaran las siguientes medidas: a) inrnediatarnente oespues de la declaraclon de oontamtnaclon. velaran por que toda la rnaqutnar!e e lnstalaciones de almacenamiento de la explotaclon que haven intervenido en la produccion de patatas se limpien y desinfecten como resulte adecuado y con los rnetodos apropiados, sequn 10dispuesto en el punta 3, b) inmediatamente y durante al menos tres temporadas de cultivo oespues de la declaracion de contaminecion: controteran a traves de sus organismos cflciales responsables las explotaciones que cultiven, almacenen o manipulen tuberculos de oateta. edemas de las explotaclones que contreten rnaqulnas para este cultivo, requeriran que, para todos los cultivos de patata dentro de la zona delimitada, se planten exclusivamente semllfas certificadas 0 semlllas cultivadas bajo control oflclal, y se efectue un enausts despues de recolectar los cultivos de patatas de siembra en lugares de producclon declarados probablernente contaminados sequn e! articulo 5, apartado 1, letra b), exiqlran que se manipulen por separado las extstenclas de patatas de siembra y de patatas de consumo recolectadas en todas las explotaciones de la zona, 0 que se establezca un sistema de limpieza y oesrnteccron entre el manejo de las existencias de patatas de siembra y e! de las de consume. Hevaran a cabo una encuesta oficial sequn 10 dispuesto en el articulo 2, apartado 1; c) estabreceran un programa, secun corresponds. para la sustitucion de todas las existencias de patatas de siembra por un periodo de tiempo convenienta. ANEXO V Metodos oficialmente autorizados para la eliminaci6n de residuos Los rnetodos oficialmente autorizados para la ehrntnacton de residuos mencionados en e! punto 1 del anexo IV se ajustaren a las dtsposlclones siguientes, de tal forma que se excluya todo riesgo identlficable de propaqacicn del organismo: i) Los residues de patata (tncrutoas las patatas descartadas y las mondaduras) y cualquier otro residue solido asociado a las patatas (incluida la tierra, las piedras y otros restos) se eltmtnaran de una de las siguientes maneras: en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del organismo al medic ambiente, cor ejemp!o, mediante la filtracidn a tierras de cultivo; los residuos se trasrederen directamente al vertedero en unas condiciones de confinamiento que impidan todo riesgo de perdlda de los mismos. se incineraran, o se someteran a otras medtdes. siempre que se descarte el poslb!e riesgo de propaqacion del organismo; dichas medidas deben notificarse inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesce y Alirnentacion y este a su vez, a traves del cauce correspondiente, a la Corntsion ya los oernas Estados miembros. ii] Los residuos liquidos que contengan elementos sofidos en suspension se filtraran 0 se someteran a procesos de sedlmentaoion para la separacion de dichos elementos; estos se ellmtneran de la forma dispuesta en e! inciso i}. A conttnueclcn. los residuos Hquidos se someteran a alguna de las medidas siguientes: se calentaran a un minima de 60 "C en todo su volumen durante 30 minutos por 10 men os antes de la efiminacion, o se elirninaran par otro sistema que, aprobado oficialmente y aplicado bajo control oficial, descarte todo riesgo identificable de contacto de los residuos con tierras de cultlvo. Las caracteristicas de tal sistema seran notlflcadas al Ministerio de Agr1cultura, Pesca y Allmentacion y este a su vez, a traves del cauce correspondiente, a los demas Estados miembros y a la Ccrnlslon. Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residues asociados a la manipulacion. la elimfnacion y el tratamiento de lotes contaminados."