Orden APA/19/2007 - Modifica el Real Decreto Nº 1.644/1999, sobre control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

13152 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 EI organismo nocivo, Ralstania solanacearum (Smith) Yabuuchi et et., conocldo anteriormente por Pseudomo nas solanacearum (Smith) Smith, es causa de las enfer medades de la podredumbre parda en los tuberoulos de petata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata. tomate y otras especies de solanacees. y repre senta una grave amenaza para las producciones de estos cultivos. La Directive 98/57/CE del Conse]o. de 20 de julio de 1998, sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et el., establece las medidas detalladas a adoptar en el seno de la Comunidad para la lucha contra este organismo nocivc, y fue incorporada al ordena miento juridico espano! por e! Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre. sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al. Dichas medidas tienen como finali dad localizar el organismo y determinar su distribuci6n, impedir su aparici6n y, en caso de que esta tenga lugar, evltar su propagaci6n y combatirlo con el fin de erradi carlo. Tenlendo en cuenta que en los ulttrnos aries el conoci miento de esta enfermedad y sus metodos de oeteccton e identiflcacion han avanzado considerablemente y que la expertencla adquirida en el seguimiento y lucha contra este organismo aoonsejan la revision de determinadas disposiciones tecnlcas relacionadas con las medidas de control, ha sido necesario modificar algunos anexos de la mencionada directiva con la aprobacion de la Directive 2006/63/CE de la Comtsicn, de 14 de julio de 2006, por la que se modifican los anexos II a VII de la Directiva 98/57/CE del Consejo sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al. 6422 ORDEN APA1719/200Z de 15 de metro, por la que se modifican los anexos /I a VII del Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sabre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. En consecuencia, mediante esta orden se incorpora al ordenamiento interne la Directiva 2006/63/CE de la Comisi6n, de 14 de julio de 2006, en ejerctcto de la facul tad que la cnspostcron final primera del Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, atribuye al Ministro de Agri cultura, Pesca y Alirnentacion. En la elaboraoion de la presente disposicion han sido consultadas las comunidades aut6nomas y las entidades representativas de los sectores afectados. En su virtud, dispongo: Articulo unlco. Modificacion de los anexos II a VII del Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sabre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Los anexos II a VII del Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et st., se sustituyen por los que figuran como anexo de la presente orden. Dtsooslcton final primera. Incorporaci6n del derecho comunitario al derecho nacional. Mediante esta orden se tncorpora al ordenamiento interno la Directive 2006/63/CE de la Comisi6n, de 14 de julio de 2006, por la que se modifican los anexos II a VII de la Directiva 98/57/CE del Conse]o sobre e! control de Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al. Dtsooslcton final segunda. Entrada en vigor. La presente orden entrara en vigor e! dla 1 de abril de 2007. Madrid, 15 de marzo de 2007.-La Ministra de Agricul tura, Pesca y Alimentaci6n, Elena Espinosa Mangana. BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13153 ANEXO Modificaci6n de los anexos II a VII del Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacea· rum (Smith) Yabuuchi et al. «ANEXO II Metodo de diagn6stico, detecci6n e identificaci6n de Ralstonia so/anacearum (Smith) Yabuuchi et al. AMBITO DE APLICACION DEL METODO EI presente metoda describe los cnversos procedimien tos relacionados con: i) et otaqnosnco de la pcdredumbre parda en los tu berculos de patata y de la rnarchitez bactertana en las plan tas de patata. tomate y otras plantas huesped. Ii) la deteccion de Ra/stonia so/anacearum (R. so/a nacearum) en muestras de fuberculos de patata, plantas de patata, tornate y otras plantas huesped, agua y suero. iii) la identificaci6n de R. sotenscesrum. PRINCIPIOS GENERALES En los epenotces se presentan protocolos optimizados para los diferentes metooos y reactivos validados, asi como informacion detallada para la preparecton de rnatertales de prueba y control. En el apendice 1 se presenta una lista de los laboratorios que se incluyeron en la oplimizaci6n y vali daci6n de los protocclos. Habida cuenta de que los protocolos implican la detec cion de un organismo de cuarentena y de que lnclulran la utilizaci6n de cultivos viables de R. solanacearum como rnatenales de control, sera precise never a cabo los procedi mientos bajo condiciones de cuarentena apropiadas, can mstatactones adecuaoas de elimlnacion de residues y en aplicaci6n de las condiciones de obtenci6n de los permisos apropiados emitidos por las auloridades oficiales de cuaren tena de las plantas. Los parametros de las pruebas deben garantizar una detecci6n coherente y reproducible de niveles de R. sola nacearum en los limites establecidos en los metooos selec cionaoos. Es imprescindible una preparaci6n precisa de los con troles positivos. Asimismo, la realizacion de pruebas con arreglo a los niveles requeridos implica la utilizaci6n de los parametres correctos, el mantenimiento y el calibrado del equipc, una preservaci6n y manipulaci6n cuidadosa de los reactivos y tooas las medidas para evltar la contarnlnacion entre las rnuestras, como por ejernplo la separacion de los controles positivos de las mueslras de ensayo. Deben aplicarse nor mas de control de la calidad para evilar errores administra tivos y de otro tipo, especialmente de etiquetado y docu rnentacion. Una sospecha de brote. tal como se menciona en el ar ticulo 5, apartado 2, de este real decreto, implica la obten cion de un resultado positive de las pruebas de diagn6stico o seieccron efecluadas a una muestra tal como se especifi ca en los siguientes diagramas de flu]o. Un resullado positi vo en la primera prueba de seieccron (prueba IF, PCR/FISH, aislamiento selectivo) debe confirmarse con una segunda prueba de seleccion basada en un principio biolcqico cnterente. Si la primera prueba de seieccron proporciona un resul tado positive, se sospecha enlonces la contaminaci6n con R. solanacearum y debe efectuarse una segunda prueba de seteccton. Si la segunda prueba de selecci6n proporcio na un resultado positive, se confirma entonces ra sospecha (sospecha de presencia) y debe continuer la prueba con arreglo at metooo. Sl la segunda prueba de selecclon pro porciona un resultado negativo, se consfdera entonces que la muestra no esta contaminada con R. solanacearum. Una presencia confirmada, tal como se menciona en el articulo 6. apartado 1. de este real decreto, implica el ars lamiento y la identificaci6n de un cultivo puro de R. solana cearum con confirmaci6n de patogenicidad. SECCION I APLICACION DEL METODO 1 Metodo de deteccion para el diagn6stico de ra po dredumbre parda y ra marchitez bacteriana (R. solanacea rum) en tuberculos de patata y plantas de patata, tomate u otras plantas huespec con stntomas de podredumbre parda o marchitez bacleriana EI procedimiento de anal isis esta destinado a los tuber culos de patata y a las plantas que presentan sintomas tlpicos de la podredumbre parda 0 la marchitez vascular 0 que permiten la sospecha de su presencia. Incluye una prueba de seleccion rapida, el aislamiento del pat6geno del tejido vascular infectado en un medic (selectlvo] y, en caso de resullado posmvo, la identificaci6n del cultivo como R. solanacearum. 13154 Martes 27 rnarzo 2007 Tuberculots) 0 planta(s) de palata, tomate u OtTOS huespedes con snuomas sospechosos de la podredumbre paula 0 la marchitez bacteriana ,L', PRUEBAS DE D1AGNc)STlCO RAPIDO 12l Efcctuar al mcnov una de las siguicntcs prucbas para diagn6stico de prcsuncion: prucba del cxudado bactcriano "" prueba de pol-Il-hidrcxibutirato H' prueba de aglutinacion serologica i5i prueba IF «" i prueba FISH ,71 i prueba ELlSA I~' nrueba peR M PRUEBA BASICA DE AISLA:VIIENTO ,Ir" I r'otomas con morfologia nptca ,I', ~ R. .,ol""an'amm no detectado NO'Ie'r- Mucstra no infcctada por R. solanacearum I si I Purificar mediante subcultivo IPRUEDAS DE IDENTlfICACION,,'}~ PRUEBA DE PATOGE\"ICIDAD '''J I Ambas pruebas confirman cuttivo puro como R, ,mlailacearuiJI ?--c Muestrn no tnfectada porNO f- R. wlunun:'(lrUJII I si I I Mncstra lnfcctada per R. solanaceomm BQE num. 74 (1) Para la descI'ipci6n de los sintomas vease la secci6n 11.1 (2) Las pruebas de d,agn6stico rapido tac,litan el diagn6stico de presunci6n, pero no son esenciales. Un resultado negativo no garantiza en todos los casos la inex,stenc,a del pat6geno. (3) En la secci6n VI,A,1 se describe la prueba de la exudaci6n para elliquido bacleriano del tejido vascular del lallo. (4) En la secci6n VIA2 se describe la prueba de detecci6n de granulos de pol'-iJ-h,drox,butirato en celulas bacterianas, (5) En la secci6n VI.A,3 se describen las pruebas de aglutlllaci6n serol6gica en Iiquido bacteriano 0 extractos de tejido sintomatico. (6) En la secci6n VIAS se describe la prueba IF en liqu,do bacteriano suspendido en agua 0 exlraclos de tejido s,nlomatico. (7) En la seccion VIA7 sa describe la prueba FISH en Ilquido bacleriano suspendido en aqua 0 eXlraCIOS de tejido sinlomalico, (8) En la seccion VI.A,8 sa describe la prueba ELISA en liQuido bacleriano suspendido en aqua 0 eXlraCIOS de tejido sinlomatico, (9) En la seccion VI.A,6 sa describe la prueba peR en liQuido bacleriano suspendido en aqua 0 eXlraClOS de tejido sinlomatico, (10) EI pal6geno suele aislarse con facilidad del material vegetal sintomalico mediante dilucion en placas (secci6n 11,3), (11) La morfologla tipica de la colonia sa describe en la secci6n 1I,3,d, (12) EI aislamienlo puede fallar en estados avanzados de infecci6n debido a la compelencia 0 el enmascaramienlo per bactenas saprofitas. Si los sintomas de la enfermedad son los lipicos, pero el aislamiento es negalivo, debera repelirse el aislamienlo, preferenlemenle valiendose de una siembra en medio se recuvc. (131 La loentificacicn fiabte de cuttivos puros posibles aeraoos de R. solanacearum, se erectce utlllzando las pruebas oescnras en ta seccon VI.B. La carecte ri;:aci6n subespecifica de las cepas es oplat,va, pero se recomienda en cada caso nuevo. (14) La prueba de patogenic'dad se describe en la secci6n VI.C. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13155 2. Metodo de deteccion e identificaci6n de R. solanacearum en muestras asintomaticas de tuberculos de petata Fundamenfo EI prolocolo de anal isis tiene por objelo la detecci6n de infecciones latenles en tubercufos de patata. Un resullado positivo de un minimo de dos pruebas de selecci6n, basadas en diferentes principios biol6gicos, debe complementarse con el aisla miento del pat6geno, seguido, en caso de aislamiento de colonias tlpicas, por la confirmaci6n de un cultivo puro como R. soie nacearum. Un resultado positivo de solamente una de las pruebas de selecci6n no es suficiente para considerar sospechosa la muestra. Las pruebas de selecci6n y las pruebas de aislamiento deben permitir ra detecci6n de 103 a 104 celulas/ml de precipitado resuspendido, incluidas como controles positivos en cada serle de pruebas I Muesna de tnberculos de parata ,l', I Extracciou y concentracion del putogeno m PRCEBAS B,4..SICAS DE SELECCION (1, Prueba IF ,-I, aislamieruo selective ';' prueba peR re" Prueba FISH '7l Prueha auxiliar opcional: ELISA pq I Prhnera prueba de seleccten l" 0 R, solanacearum no detectada :,<egativa f- \Iuestra no tnfectada per R. wl(lnlln!lHIUll Posttlva I Segunda prueba de sejeccuin <J> 0 Jliegativa ~ R. solauaccarum no dctcctada\luestra no infecrada porR. solanaceamm I Posttlva I I Aislamlcntu sctccuvo i5i ylo btocnsayc "" I Colonias con morfclogia npica ,lO, I 0 R. solanacearum no detecrada NO"" r-- Mnestra no lnfectada pOI" R. solanaceamm I sl I I Purificar mediante cuhivo I I PRUEBAS DE IDENTlFICACION ,Ie.~ PRUEBAS DE PATOGENICIDAD ,'-', I I Ambas prucbas confirman cultivo PlII'O I como R. .mlanw.'eomm 0 NO " f- l\1uestra no lufeetada porR. SllluJla~'em'Ull/ I sl I I l\1uestra tnfectada por R. wl(ln(ln:'(lrUJIl 13156 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 (1) EI tamano normal de la muestra es de 200 tuberculos, aunque eL procedimienlo puede utillzarse con muestras mas pequenas si no se dispone de 200 tuberculos. (2) En la secci6n III.1,1 se describen los metodos de exlracci6n y concentraci6n de pat6genos. (3) 5i un minima de dos pruebas basadas en diferentes principios biol6gicos proporcionan resultados positivos, debe elecluarse el aislamienlo y la confirma cion, Elecluese como minima una prueba de seleccion, Cuando eSla prueba de resultados negalivos, sa considerara que la muestra as negaliva, En case de que ta prueba de resultados positivos, cetera eiecfuerse una segunda prueba de seleccion, 0 vanes mils. basadas en ouerentes principios biologicos, con et fin de verfflcar er primer resuttado positive. $i ta segunda prueba 0 las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos. ta muestra se ccnst derara negativa. No sera precise electuar otras pruebas (4) En la secci6n VIAS se describe la prueba IF. (5) En la secci6n VIA4 se describe la prueba de aislamiento selectivo (6) En la secci6n VIA 6 se describen las pruebas PCR, (7) En la secci6n VIA7 se describe la prueba FISH. (8) En la secci6n VIAS se describen las pruebas ELISA, (9) En la seccion VI.A,9 sa describe la prueba del bioensayo. (10) La morfologla tipica de la colonia sa describe en la secci6n II, 3. d, (11) EI erstamentc 0 los moensayos pueden rene- debido a la compelencia 0 la inhibiciim por bactenas saprofitas. $i se cbtlenen resultados posltivos ctaros en las pruebas de selecciim, pero las pruebas de arsrarreentc dan resultados negativos, entcnces deben repetlrse las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado 0 tomando mas teJldovascular cerca de la parte basal de tuberculos cortados de la misma muestra y, en case necesario, anallzar otres muestras, (12) La identificaci6n lIable de cultivos puros aislados posibles de R. solanacearum, se electua utillzando las pruebas descritas en la seccion VLB. (13) La prueba de patogenicldad se describe en la secci6n VI,C. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13157 3. Metodo de detecci6n e identificaci6n de R. solanacearum en muestras asmtornancas de patatas, tomates y otras plan tas hueapec I Mucstra de scgmcntos del tallo III I I I Extraccion y conccntracion del parogcno ," I I PRllEBAS B'\'SICAS DE SELECCION I'J Aislamiento selective i'i/prueba IF Ij'/prueba PCR "vprueba FISH I" Pruehn auxtttar opcmnat ELISA "', bioensayo I'" Colonias con morgologia ripica ,ID, ~ Tndas las pruebas negativasdespues del aislamiento 9 I R, vokmaceannn no detect ada xo'" Mucstra no lnfcctada porI R. solaJ1(I('(j(ll'W" I sl I I I Purificar mediante subcultivo I PReEBAS DE IND",TlfICACION""r}-{ PRllEBA DE PATOGENICIDADi'-'1 I Ambas pruebas confirman cuhivo pure como R. s"/(IIwn:a,."", ~ \"0 H Muesrra no Infectada per R..solanacearum I si I I Muestra lnfectada por R, sotenacearum (1) Vease la secclon 111.2,1 para los lamanos recomendados de las muestras, (2) En la secci6n 111.2,1 se describen los metodos de exlracci6n y concentraclon de pal6genos. (3) Si un minima de dos pruebas basadas en diferentes prlncipios biol6glcos proporcionan resultados posilivos, debe elecluarse el alslamienlo y la confirma CIon, Elecluese como minima una prueba de selecci6n, Cuando esla prueba de resultados negalivos, se considerara que la mueslra es negaliva, En caso de que la prueba de resultados positivos, deber<i efectuarse una segunda prueba de selecci6n, 0 varias mas, basadas en diferentes princlpios biologicos, con el fin de verificar el primer resullado posilivo, Si la segunda prueba 0 las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos. la mueSlra se consi derara negaliva, No sera precise efectuar Olras pruebas, (4) En la seccion VI.A,4 sa describe la prueba de aislamiento seleclivo, (5) En la seccion VI.A,5 sa describe la prueba IF, (6) En la secci6n VI.A,6 se describen las pruebas PCR. (7) En la secci6n VIA7 se describe la prueba FtSH. (8) En la seccion VIA8 se describen las pruebas ELISA (9) En la secci6n VIA9 se describe la prueba del bioensayo. (10) La morfologia tipica de la coloma se describe en la seccion 1I.3.d (11) EI aislamlento 0 los bloensayos pueden fallar debido a la competencia 0 la inhlbiClon por bacterias saprofitas 5i se obtlenen resultados posilivos en las prue bas de sele<;cion,pero las pruebas de alslamiento dan resultados negativos, entonces deben repetlrse las pruebas de aislamlento (12) La idenlificaci6n lIable de cultivos pums posibles aislados de R. solanacearum, se efectua utillzando las pruebas descrilas en la seCClon VLB. (131 La prueba de patogenicidad se describe en ta seccron VI.C. 13158 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 SECCION II METODOS DETALLADOS DE DETECCION DE R. SOLA NACEARUM EN TUBERCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HUESPED CON SiNTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA 0 LA MARCHITEZ BACTERIANA 1. Sintomas (vease el sno web: htlp:flforum.europa.eu.inV Publiclirdsanco/Home/main) 1 1 Sintomas en patata: En planta de patata. La fase inicial de la infecci6n en el campo se reconoce por un rnarchitamiento de las hojas en progresi6n ascendente bacia el extrema superior de 113 plan ta, bajo et etecto de las temperatures diurnas alias, con una recuperaci6n durante 113 noche. En las primeras fases del marchitamiento, las hojas siguen estando verdes, pero poste riormente se desarrolla necrosis parda y amarilleo. Tarntnen se produce epinastia. EI rnarchitamiento de un crete 0 de plantas enteras se hace rapidarnente irreversible y ccastona et colapsc y 113 muerte de 113 planta. EI tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente suele ser pardo, y de 113 superficie del corte brota un exudado mucoso bacteriano 0 este puede extraerse apretando el tano. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares saten hilos vlscosos. En tuberculo de palata. Los tuoerculos de patata deben cortarse fransversatrnente cerca de 113 parte basal (estoI6n) 0 bien longitudinalmente sobre et estolon. Posterlorrnente, 113 decoloraci6n vascular adquiere un tono pardo mas marcado y 113 necrosis puede extenderse 131 tejido parenqulmatico. En las fases avanzadas, 113 infecci6n progresa desde 113 parte basal y los ojos, por las que pueden fluir exudados bacteria nos, 10 que hace que se adhieran parttculas del suelo. Pue den aparecer en 113 piel lesiones Iigeramente hundidas de color paroo rojizo debido 131 cotapso Interne de los tejidos vascufares. En las rases avanzadas de 113 enfermedac es habitual el desarrollo secundario de podredumbres blandas causadas por hongos y bacterias. 1,2 Sintomas en tomate En planta de tomate. EI primer sfntoma visible es el as pecto tlacloo de las hojas mas j6venes. Si se producen con diciones medioambientales favorables para el patoqeno (temperatures del suero de 25 "C; hurnedad saturada), en un plazo de pocos dlas se produce epinastia y marchitamiento de un lade de 113 planta 0 de toda ella, 10 que desemboca en un colapso total de la planta. En condiciones rnenos favora bles (temperatura del suelo por debajo de 21°C), se produce un menor marchitamiento, pero pueden surgir numerosas rakes adventicias del tauo. En ocaslones se observan estrtas humedas desde 113 base del tallo, 10 que oemuestra 113 exls tenets de necrosis en et sistema vascular, AI cortar transversalrnente el teno, los tejidos vasculares que presentan una decofcracion parda exudan gotas de li quido tectenano blanco 0 amanuento. 1.3 Sintomas en otros huespedes Plantas de Solanum dulcamara y S. nigrum. En condicio nes naturales, en pocos casos se observan sintomas de marchitamiento en estos huespedes herbaceos a no ser que la temperatura del suelo supere los 25 cC 0 los niveles de in6culo sean extremadarnente elevados (por ejernplo, para S. nigrum que crezca junto a plantas enfermas de patatas 0 tomates). Cuando se produce el marchitamiento, los sinto mas son como los descritos para el tomate. Las plantas de S. dulcamara, que no se marchitan y que crecen con tanos y ratces en et agua, pueden mosner una decoloraclon interna pardo clare de los tejidos vascufares en una seccion trans versal de 113 base del tallo, 0 de las partes del tallo que se encuentran bajo el agua. Pueden fluir bacterias de los tejidos vasculares cortados, 0 formar hilos vlscosos, si el tallo corta do se coloca verticalmente en el aqua, incluido en caso de inexistencia de sintornas de marctutamlento. 2. Pruebas de selecci6n rapida Las pruebas de selecci6n rapida tacurtan el diaqncstico de presunci6n, pero no son esenclares. Realicese una 0 mas de las slpuientes pruebas vatldadas: 2.1 Prueba de 113 exudaclon del tano (vease 113 secclon VI.A,1.) 2.2 Prueba de la detecci6n de qranulos de pofi-B. hidroxibutirato (PHB) Los qranulos de PHB caractertsrlcos en las ceiulas de R. solanacearum se vrsuanzan ffnendo Irons de exudado bacte riano fijado con calor procedente de tejido infectado en un pcrtaobjetos con azul Nilo A 0 negro Sudan B (vease 113 sec cion VI.A.2). 2.3 Pruebas de aglutinaci6n serol6gica (vease 113 sec ci6n VI.A.3,) 2.4 Otras pruebas Otras pruebas de selecci6n rapida apropiadas incluyen 113 prueba IF (vease ta secci6n VIA5), 113 prueba FISH (vease 113 secci6n VIA?), las pruebas ELISA (vease 113 secci6n VIAS) y las pruebas PCR (vease la secci6n VIA6), 3. Proceso de aislamiento a) Coger exuoaoo 0 secciones de tejido decolorado del anillo vascular del tuberculo 0 de los haces vasculares del tallo de la planta de patata, de tomate 0 de otras plantas huesped en proceso de rnarchitamiento. Poner en suspen sion en un volumen reducido de agua destilada esteril 0 en tampon fosfato 50 mM (apendice 4) y dejar entre cinco y cnez minutes. b) Preparar una sene de onuctones declrneles de 113 suspensi6n. c) Echar 50-1001-11 de 113 suspension y las diluclones en un medic nutritivo general (NA, YPGA 0 SPA; vease et apen dice 2) ylo en un medio de tetrazolio de Kelman {apendice 2) y/o un medio selectivo validado (por ejemplo, SMSA; vease el apendice 2). Extender 0 hacer est-las con una tecntce aoecueoa de onucton en ptacas. Si se consfdera util, preparar un conjunto de placas cnsuntas con un cultivc de una sus pensi6n celular diluida de R. solanacearum biovar 2 como control positive. d) Incubar las placas entre dos y seis dias a 28 "c. En un medio nutritivo general, los atsraoos vhutentos de R. solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos caracteristicos en el centro, Las for mas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butiro sas pequenas, redondas y no f1uidas, que son completamen te blancas. En los medios de tretrazolio de Kelman y SMSA, los verticilos son de color rojo sangre. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas pequenas, re dondas y no f1uidas, que son totalmente de color rojo oscuro, BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13159 4. Pruebas de identificaci6n de R. solanacearum Las pruebas para confirmar la identidad de presuntos aisla dos de R. solanaeearum se muestran en la secclon VI.B. SECCI6N III 1. Metooos detallados de detecclon e icenttncacron de R. solanacearum en muestras asintomattcas de tubercutos de patata 1.1 Preparacion de la muestra Nota: Eltamano normal de ra muestra es de 200 fubercu los. Un muestreo mas intensive requiere mas pruebas en muestras de este tamano. Un mayor numero de tuberculos en la muestra producira inhlbiclon 0 una interpretacion dificil de los resultados, Sin embargo, el procedimiento puede apli carse convenientemente a muestras de menos de 200 tuber culos, cuando se disponga de pocos tuberculcs. La veuoecton de todos los metooos de deteccion descritos a continuacion se basa en la realizaci6n de pruebas a muestras de 200 fuberculos. EI extracto de patata descnto a ccntinuacion pueoe utilizarse tan-bien para la deteccion de la bacteria de la ne crosis bacteriana de la patata, Clavibaeter mich/ganensis subsp. sepedonicus. Pretratamiento opcional previa a la preparacion de la muestra: a) mcubacion de muestras a 25-30 "C, hasta un maxi mo de dos semanas antes de la reeuzacron de la prueba, con el fin de alentar la multiplicacion de cualquier poblacion de R. solanacearum; b) ravar los tuberculos. Utilizer desinfectantes apropia dos (compuestos de c1oro cuando vaya a utilizarse la prueba peR a fin de eumtnsr e! ADN pat6geno) y detergentes entre cada muestra. Secar al arre los tuberculos. Este procedtmlen to de lavado es especialmente utn (pero no obligatorio) para las muestras con exceso de tierra y si debe realizarse una prueba PCR 0 un procedimiento de aislamiento directo. 1.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal (estoton) del tuberculo con un bisturi 0 un cuchillo Hmpio y desinfectaco, de modo que los tejidos vascurares queden a la vista. Extraer con cufdado una cuna cornea pequena de tejido vascular de la parte basal y extraer et mlnimo volumen poslble de tejido no vascular. (vease el sitio web: htlp:llforum.europa,eu.intl Publiclircisanco/Home/main). Nota: Retirar los tubercuros (podridos) que presenten sln tomas sospechosos de "podredumbre parda" y analizarlos por separado. Si durante la extraccion de la cuila de la parte basal se observan slntomas sospechosos de podredumbre parda. debera efectuarse una inspecci6n visual del tuberculo, y cor tarse este cerca de la parte basal. Todo tuberculo cortado con sintomas sospechosos debera guardarse durante un minimo de dos dlas a temperatura ambiente a fin de permitir la sUberizacion y almacenar refrigerado (a 4-10 "C) en condi ciones de cuarentena apropiadas. Todos los tuberculos, in cluidos los que presenten slntomas sospechosos, deberan mantenerse con arreglo a 10 establecido en el anex.o III. 1.1.2 Colocar las cuilas de la parte basal en recipientes desechables no utilizados que puedan cerrarse ylo sellarse (en caso de reutilizacion de los redpientes, deberan limpiarse y destntectarse por complete utilizando compuestos de ere ro). Es conveniente procesar las curtas inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarlas en el reclpiente. sin afiadir ninqun tampon, refrigeradas durante un perlodo maximo de 72 horas 0 de 24 horas a temperatura ambiente. Procesar las cunas por uno de los metooos siguientes: a) bien cubrir las cunee con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampon de extraccton (apenotce 4) y agitaren un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cua tro horas por debajo de 24 "C 0 refrigeradas entre 16 y 24 horas, o bien b) homoqeneizar las cunas con un volumen sufidente (aproximadamente 40 ml) de tamp6n de extraccion (apendice 4) en una trtturaoora (por ejemplo, Waring 0 Ultra Thurax) 0 machacandolas en una bolsa de maceracon desechable se Ilada (por ejemplo, Stomacher 0 Bioreba de politeno de gran calibre, 150 mm x 250 mm; esterilizada por raclacicn) utilizan do un mazo de goma 0 un aparato de trituracion adecuado (por ejemplo. Hornex). Nota: Existe un elevado riesgo de ccntamlnaclon cruzada de muestras cuando se homogenizan las muestras utilizando una tnturadora. Tomar precaucones a fin de evitar la genera cion de aerosores 0 e! vertido durante et proceso de extracclon. Debe asegurarse que se utilizan para cada muestra recipientes y cuchillas de trituradora esterilizados. Si se utiliza la prueba PCR, evitar ta transferencia de ADN en los recipientes 0 el epa rato de trnuracon. AI utilizar PCR. se recomienda machacar el material en bolsas desechables y utilizer tubos desechables. 1.1,3 Se decanta el sobrenaoante. Si es demasiado furbio, clariticerto con una centrifupacion a baja verocloao (no mas de 180 9 durante dlez minutes a una temperatura entre 4-10 'c) 0 mediante tntracron al vacio (40-100 um), lavando el filtro con tampon de extraccron adicional (10 mt). 1.1.4 Concentrar las bacterias por centrifugaci6n a 7.000 9 durante 15 minutes (0 10.000 9 durante dlez minu tos) a una temperatura entre 4-10 "C y descartar e! sobrena dante sin perturbar el sedimento. 1.1,5 Resuspender el precipitado en 1,5 ml de tampon de precipitado (apendice 4). Utilizar 5001-11 para pruebas de R. solanaeearum, 500 ~I para Clav/baeler miehiganensis subsp. sepedonicus y 500 IJI para referenda. Anadir glicerol esteril a ra concentracion final de 10-25 % (vlv) a los 500 IJI de la ancuota de referenda y a la restante ancuota de prue ba, rnezclar y almacenar a una temperatura comprendroa entre -16 a -24"C (semanas) 0 entre -68 a -86 'C (meses). Mantener las alicuotas de prueba a entre 4-10 "C durante la prueba. No se aconseja congelar y descongelar repetidamente. Si debe transportarse el extracto, entreguese en un reci piente frIO en un plazo de 24 a 48 horas. 1.1,6 Es de capital importancia tratar por separado to dos los controles y muestras positivos de R. solanaeearum para evitar la contaminacion, Esto se aplica a los portaobje tos IF y a todas las pruebas, 1.2 Analisis Vease el diagrama de flujo y la descripci6n de las prue bas y los protocolos optimizados en los apendices pertinen tes: Aislamienlo se/eetivo (vease la seccion VIA4) Prueba IF (vease la secd6n VIAS) Pruebas peR (vease la secd6n VIA6) 13160 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 Prueba FISH (vease 113 secci6n VIA7) srueoes ELISA (vease la secci6n VI.A.8) Bioensayo (vease 113 secci6n VI.A.9) 2. Metodos detallados de detecci6n e identificaci6n de R. solanacearum en muestras asintomancas de patatas, to mates y otras plantas huesped 2.1 Preparaci6n de la muestra Nota: Para la detecci6n de poblaciones latentes de R. so lanacearum se aconseja someter a prueba muestras mixtas. EI procedimiento puede apncarse convenlentemente a mues tras rnixtas de basta 200 partes del tano. Cuando se etectuen exarnenes, deberan basarse en una muestra estadtsticamen te represenlativa de 113 pobracron de planlas investigada. 2.1.1 Colocar segmenlos de tauo de 1-2 cm en un reci piente esleril cerrado con arreglo a los siquientes procedi mentes de muestreo: Plantulas de lomale de vivero: con un cuchillo limpio y desinfeclado, cortar un segmento de 1 cm de la base de ca da tallo, juslo por encima del nivel del suelo. Plantas de tamale cultivadas en el campo a en un invemade ro: con un cuchillo limpio y desinfectado, arrancar el brote lateral mas inferior de caoa planta cortando justa par enema de 113 union con e! lalla principal. Cortar un segmento de 1 cm del ex trema inferior de cada brote lateral, Dims huespedes: con un cuchillo limpio y desinfectado 0 con tijeras de podar. cortar un segmenlo de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. En el caso de S. dulcamara 0 de otras plantas huespec que crecen en el aqua, cortar secciones de 1-2 em de los tallos bajo el agua a estolones can raices acuaticas. cueroo se muesfree un lugar especiflco, se recomlenda analizar una muestra estadislicamente representativa de un minimo de diez plantas por punta de muestreo de cada huesped herbaceo polencial. La cetecclon del pat6geno sera mas fiable a finales de primavera, en verano y en otero, aunque las infeccio nes naturales pueden oetectarse durante tcdo el ana en Sola num dulcamara perenne que crece en cursos de agua, Los huespedes conocldos incluyen plantas de palata espontsneas (groundkeepers). Solanum dulcamara, S. nlgrum, Datura stra monium y otros miembros de 113 familia Solanaceae. Otros hues pedes son Pelargonium spp. y Portulaca oleracea. Entre las especies hernaceas europeas que pueden albergar polencial menle poblaciones de R. solanacearum biovar 21raza3 en rakes ylo rizosteras, en condiciones medioambientales especiflcas, se incluyen: Atriplex hastala, Bidens pi/osa, Cerastium glomeralurn. Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parvi flora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S, nutans., Tussilago farfarra y Urtica dioica. Nota: Puede efectuarse en este momento el examen vi sual para detectar stntomas internes (coloracion vascular 0 nqutoo bactenano). Retj-ar tooos los segmentos del 113110 con stntomas y ananzanos par separado (vease 113 seccion II), 2,1,2 Desinfectar brevemente los segmentos del tallo con elanol 131 ?O % y secar inmediatamente con un pai'iuelo de papel. A continuacion, procesar los segmenlos del tallo me diante uno de los procedimientos siguienles: a) cubrtr los segmenlos con un volumen suflciente (aproximadamente 40 ml) de tampon de exfracclon (apendice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cua tro horas por debajo de 24°C 0 refrigerados entre 16 y 24 horas, o bien b) procesar Inrnediatamente rnachacando los seqmentos en una bolsa de maceraci6n resistente (por ejemplo, Stoma cher 0 Bioreba) con un volumen apropiado de tampon de ex naccon (apendice 4) ulilizando un mazo de goma a un apara 10 de triluraci6n adecuado (por ejemplo, Homex). De no ser posible, almacenar los segmentos del lalla reftiqerados duran Ie un maximo de 72 horas a un maximo de 24 horas a lempe ranna amblente. 2.1.3 Desechar e! sobrenadante tras 15 minutos de se dlmentacion. 2.1.4 No susie ser necesaria otra clarificaci6n del ex tracto 0 ta concentracion de 113 traccion bactenana, perc pue de conseguirse por tlltracton ylo cenlrifugaci6n tal como se describe en la secci6n 111.1.1.3 a 1 1.5. 2.1.5 Dividir el extracto de la muestra pura 0 concentra da en dos partes iquales. Mantener una mitad entre 4 y 10°C durante et anallsts y almacenar 113 otra mrtao can glicerol es tern al 10-25 % (vlv) entre - 16 Y- 24°C (semanas) 0 entre 68 y - 86 'C (mes) en caso de que deban efectuarse nuevas pruebas. 2.2 Anansrs veese et diagrama de flujo y la descnpclon de las prue bas y los protocolos optimizados en los apendlces pertinen tes: Aislamienlo selectiva (vease 113 secci6n VIA4) Prueba IF (vease la seccron VIA5) Pruebas peR (vease la seccron VIA6) Prueba FISH (vease la seccton VIA?) Pruebas ELISA (vease la secci6n VIA8) Bloensayo (vease 113 secci6n VI.A.9) BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 SECCI6N IV 13161 Esquema del metcdo de detecci6n e identificaci6n de R. solanacearum en el aqua I Muestra de agua rll I I I Conccntracion del patogcno '" I I PRCE8A 8,4•.sICA DE SELECClO:\ Aislamicnto selective ", Pruebas »usmercs opclonajes. bioensuyo ,41 enriquecimiento Pr.R i5i enriquecimiento ELISA I'" Colonias can mcrfologla tlpica ," , dcspucs del aislamicnto ~ R, sokmaceannn 110 derectada NO'" ~ Muetru no fntectada por R. solanacearum I sl I Purificar mediante subcultivo I I PRUEBAS DE IOENTIFICACIO' ""~ PRUEBA DE PATOGENlnDAD'"'' I Ambas pruebas confirman cultivo pure como R. solanaccanmr ~ NO f Muestra no conramtnada por R..sotanacearum I sl I Mucstra contaminada por R. SOIIlI1Un!Urllll1 (1) Veasa la sacci6n IV.2,1 para los tamalios recomendados de las mueSlras, (2) En la secci6n IV,2,1 se describen los mlolodos de concentraci6n de pat6genos. La concentraci6n incrementa las poblaciones de pal6genos y de bacterias saprofilas competidoras. Y lmicamenle se recomienda si no provoca una inhibici6n de la prueba de aislamienlo, (J) En la secciim VI.A,4 sa describe la prueba de aislamiento seleclivo, (4) En la seccion VI.A,9 sa describe la prueba del bioensayo. (5) En las secciones VIA4,2 y VIA6 se describen los melodos de enriquecimiento peR. (6) En las secciones VIA4,2 y VIA8 sa describen los mlolodos de enriQuecimiento ELISA. (7) La morfologla tipica de la colonia sa describe en la secci6n II,J,d, (8) EI aislamlento puede lallar debido a la competencia 0 la inhibici6n par baclerias saprolltas. Si se sospecha que una elevada poblaci6n sapro/ita afecta a la fiabilidad del aislamiento, repetir entonces las pruebas de aislamiento tras la diluci6n de la muestra en aqua esteril. (9) La identificaci6n lIable de cultivos puros posibles aislados de R. so!anacearum, se electua ulilizando las pruebas descrilas en la secci6n Vt,B, (10) La prueba de patogenicidad se describe en la secci6n VI,C. 13162 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 2. Metocos de detecci6n e identificaci6n de R. so/ana cearum en el agua Principia EI metoda vanoaoo de deteccion que se describe en la presente secclon es aplicable a la detecclon del pat6geno en muestras de aguas superficiales y puede aplicarse est mismo a las muestras para anal isis del proceso de trans formaci6n de la patata 0 de aquas residuales. No obstante, es importante sertarar que la sensibilidad previsible de la detecci6n vartara en funci6n del sustrato. La sensibilidad de la prueba de alslamlento se ve afectada por las pcblaclones de bactertas saprofitas compeuooras, que son general men te muy superiores en el proceso de Iransformaci6n de la patata y las aguas residuales que en las aguas superficia tes. Si bien se espera que el rnetcoo que se describe a con tinuaci6n solamente detecte 103 celulas por litre de aguas superficiales, ra sensibilidad de la deteccion en el proceso de transformaci6n de la patala 0 las aguas residuales sera con toda probabilidad mucho menor. Por esle motivo, se recomienda analizar las aguas residuales oespues de lodo tratamiento de purificaci6n (por ejemplo, sedimentaci6n 0 filtraci6n), durante el cual las poblaciones de bacterias sa profitas se reducen. Deberan tenerse en cuenta las rtmrta crones de sensnantoao del metodo de prueba a la nora de evaluar la flabilldad de cuarqurer resultado negativo obtenl do. Si bien se ha utilizado con exrto este metooo en trabajos de investigaci6n para determinar la presencia 0 ausencia del pat6geno en las aquas superficiales, deberan tenerse en cuenta sus limitaciones cuando se utilice en investiga ciones eirnneree del proceso de transformaci6n de ra patata ode aguas residuates. 2.1 Preparaci6n de la muestra Nota: La detecci6n de R. solanacearum en las aguas su perficiales es mas fiable a finales de primavera, en verano y en otono, cuando la temperatura del agua supera los 15°C. Un muestreo repeuoo en cnterentes mementos du rante los pertooos rnenclonados en puntos de muestreo de signados ncrementara la fiabilidad de la detecci6n al reducir los efectos de la variaci6n clirnatica. 'renqanse en cuenla los efectos de las fuertes preci pitaciones y la geografia del curso de aqua a fin de evitar que se produzcan importantes efectos de diluci6n que puedan ocultar ra presencia del pat6geno. Tomar muestras de agua superficial en las inrnedia clones de plantas huesped sl estos huespeoes estan presen tes. 2.1.1 Recoger muestras de agua en puntos de muestreo seleccionados Ilenando totenas 0 tubes esterues desechables, a una profundidad, st es poelble. par debajo de 30 em y a 2 m de la orilla. Para los efluentes resultantes de la transformaci6n de la patata y las aquas residuales, recoger muestras en el punto de vertido de las aguas residuales. Se recomiendan las muestras de hasta 500 mr por punto de muestreo. Si se prefie ren muestras mas pequerias. se aconseja tomar muestras como minimo en tres ccasrones par punto de muestreo, cada una de las cuales conslsnra en dos submuestras oupnceoas de un ml nimo de 30 mi. Para un trabajo de investigaci6n intensive, se leccione como minima tres puntos de muestreo por 3 km de curso de agua y asegurese de que tambiense toman muestras en los afluentes que desembocan en el curso de agua. 2.1.2 Transportar las muestras en un entomo fresco y oscuro (4-10 "C) Y ananzartas en un plazo de 24 teres. 2.1.3 Si es preciso, podra concenlrarse la fracci6n bac leriana utilizando uno de los metooos siguientes: a) centrifugar 30-50 ml de submuestras de 10.000 9 du rante diez minutos (0 7.000 9 durante 15 minutes), prefen blemente a 4-10 °C. descartar el sobrenadante y resuspen der et precipitado en 1 ml de tampon de prectpitaoo (apendi ce 4): b) filtraci6n por membrana (tamaFio minimo de los poros de 0,45 IJm) y a conlinuaci6n lavado del filtro en 5-10 ml de tamp6n de precipitado y rerenclon de los lavados. Este mete do es adecuado para grandes vommenes de aqua que con tengan bajos niveles de saprofitas. No suele aconsejarse la concentraci6n para muestras del pro ceso de transtorrnacion de la patata 0 de aguas residuales, ya que unas poblaciones mayores de bacterias saprofitas competidoras inhibiran la detecdon de R. solanacearum. 2.2 Anansts veese et diagrama de flujo y la descnpclon de las prue bas en los epenotces pertinentes. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 SECCION V 13163 1. Esquema del metoda de oeteccron e roennncacron de R. solanacearum en el suelo [ Muestra de suelo ,]', I I [ Extraccion del patogcno I I PRUEBA BASICA DE SELECCION Aislamiento selective ,c', Pruehn auxiliar opctonat enriquecimiento Pf'R r,'> bioensayo ", Colonias con rncrfologfa tlpica n ~ Todas Ius prucbas negenvas Idespues del aisfamiento ~ I NO'''' R so!onaccarwJI no dctcctada Muetra no infecrada por R. solanacearum I si I I [ Purificar mediante cultivo I I PRUEDAS DE ID",TlfICAC'ON"'~ PRCERA DE PATOC",'CIDAD'" I Ambas pruebas ccnfirman cultivo puro H NO r- Mncstra no contammeda percomo R. .mlanoceomm R. wlunun:'(lrUJII I I si I I Muestrn contaminada per R..sotanacearum (1) Vease la seCClon V.2,l para los lamaiios recomendados de las muestras (2) En la secci6n VIA4 se descrit>ela prueba de aislamiento selectivo (J) En las seccrones VIA4.2 y VI.A.6 se describen los metcdoa de enriquecimiento peR (4) En la seccion VI.A.9 sa describe la prueba del bioensayo. (5) La morfologla tipica de la colonia sa descrit>een la secci6n II.J.d. (6) EI aislamiento puede lallar debido a la competencia 0 la inhibicion por baclerias saprofitas. Si se sospecha que una elevada poblaclon saprofita alecta a la fiabilidad del aislamienlo. repelir entonces las pruebas de aislamienlo tras la diluci6n de la muestra. (7) La idenlilicaci6n lIable de cullivos puros posibles aislados de R. solanacearum, sa efecllia ulillzando las pruebas descrilas en la sacclon VLB. (8) La prueba de palogenicidad se describe en la secci6n VI.C. 13164 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 2. Metocos de oeteccon e identjflcacicn de R. sa/ana eearum en el suelo Princip/os EI rnetodo validado de detecclon que se describe en la presente seccion es aplicable a la oeteccton del patopeno en mueslras del suelo, pero tarnbren puede utilizarse para anali zar muestras de residuos souoos de la transtorrnacton de la patata 0 de lodos de depuradora. No obstante, debe serratar se que estos merodos no son 10 suficientemente sensibles para asegurar la detecci6n de poblaciones pequenas ylo irregularmente distribuidas de R. so/anacearum que pueden eneontrarse en muestras naturalrnente Intectadas de estos sustralos. Deberan tenerse en cuenla las Iimitaeiones de sensibili dad de este metoda de prueba a la hora de evaluar la fiabili dad de eualquier resultado negativo obtenido, asi coma cuanda se unnce en investigaciones para determinar la pre sencia 0 ausencia del pat6geno en e! suelo 0 los lodes. EI metoda mas fiable para determinar la presencia del pat6geno en el suelo del campo es plantar un posible huesped del mismo y supervisar si se produce infeccicn, pero incluso con este rnetodo no se oetectaran niveles bajos de contarnina cion. 2.1 Preparacion de la muestra 2.1.1 EI muestreo del suelo del campo debora seguir los principios habituales utilizados para el mueslreo de nema todos. Para muestrear 0,3 ha, reeoger muestras de 0,5 a 1 kg de suelo en 60 puntos a una profundidad de 10 a 20 em (0 de una cuacrrcula de 7 " 7 metros). Si se sospecha la presencia del pat6geno, incrementer el oumerc de puntos de recogida a 120 por 0,3 ha. Mantener las muestras a una temperatura comprendida entre 12 y 15 "C antes del anallsts. Tomar mueslras de la transformaei6n de la patata y de lodos de depuradora, recogiendo un tolal de 1 kg de slues que repre senten el volumen total de lodos que se enanzara. Mezclar adecuadamente cada muestra antes del anal isis. 2.1.2 Dispersar submuestras de 10 a 25 g de suelo 0 lodes mediante agitaci6n rotatoria (250 rpm) en 60-150 ml de tampon de extraccion (apendice 4) durante un maximo de dos horas. En caso neceseno, e! artarnoo de 0,02 % de Tween-20 estern y de 10 a 20 g de grava estern puede con tribuir a la dispersion. 2.1.3 Mantener ta suspensi6n a 4 °C durante el anal isis. 2.2 Anansts Vease el diagrama de flujo y la deseripci6n de las prue bas en los apendices pertinentes. SECCION VI PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCION E IDENTIFICACION DE R. so/anacearum A. PRUEBAS DE DIAGNOSTICO Y DETECCION 1 Prueba de la exudacion del tano La presencia de R. sofanaeearum en tallos de patata, to mate u otras plantas huesped marchitas puede observarse mediante ra eencme prueba de presunci6n que se indica a connnuacrcn: cortar e! tano justo por enclma del nivel del suero. Suspender la supertlcie del corte en un tube de agua lim pia. Observar si se produce la caracleristica exudaci6n espontanea de hilos de flujo bacteriano de los haces vescula res cortados unos minutos oeepues. 2. Prueba de la oeteccion de qranulos de poli-I3r.. hidroxibutirato 1. Preparar un frotis de exudado bacteriano procedente del tejido infectado 0 de un cultivo de 48 horas en un medio YPGA 0 SPA (apendice 2) en un portaobjetcs. 2. Preparar trotls de control positivos de una cepa de btovar 2 de R. so/anacearum y, s! se conaldera util. un trot's de control negativo de un PHS sp. negativo conocido. 3. Dejar que se seque al aire y pasar con rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetos para fijar los frotis. 4. Tenir el preparado con azul Nilo A 0 negro Sudan B y observar microsc6picamente tal como se describe a conti nuaclon. Prueba del azul Nila a) Benar cada portaobjetos con una soluci6n acuosa de azul Nilo A al 1 % e lncubar durante otez minutes a 55 "C. b) Escurrir la soluci6n de nncron. Lavar suavemenle al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobranle con un pafiuelo de papel. c) Banar el frotis con acido acenco aeuoso al 8 % e in cubar durante un minuto a temperatura ambiente. d) Lavar suavemente ar grifo durante unos instentes. Eliminar e! agua sobrante con un panuelo de papel. e) Rehumedecer con una gola de agua y tapar con un cubreobjetos. f) Examinar el frolis tinlado con un microscopic epifluo rescenle a 450 nm con gola de aceile de Inmersion.a 600 1000 aumentos, utilizando un objetivo de inmersi6n en aceite o aqua. g) Observar si se produce la fluorescencia naranja bri Ilante de los qranulos de PHS. Observer tamblen con la luz normal transmitida para cerclorarse de que los granulos son intracelulares y de que la morfologia celular es la tlpica de R. solanacearum. Prueba del negro Sudan a) aanar cada portaobjetos con una soiucion acuosa de negro Sudan B at 0,3 % en etanol at 70 % e incubar durante diez minutos a temperatura ambiente. b) Escurrir la soluci6n de linci6n y Iavar suavemente con agua del grifo durante unos instentes. eliminando el agua sobrante con un panuelo de paper. c) Sumergir brevemente los portaobjetos en xilol y se car con un penuerc de papel. iCuidado!: el xi/of es nacivo, deben tomarse las preeaueiones de seguridad neeesar/as y debe trabajarse en una campana extractora de bumos. d) Bariar el trotis can safranina acuosa al 0,5 % (ptv) Y dejar durante dlez minutos a temperatura ambients. jCu/da do!: la safranina es nccive, deben temarse las precauciones de segur/dad neeesarias y debe trabajarse en una campana extraetora de humas. e) Lavar suavemente al grifo durante unos instantes, se car con un penuelo de papel y tapar con un eubreobjetos. f) Examinar los frotis lintados con un microscopic opti co que utilice luz transminda con acette de tnrnersion, a 1000 aumentos, ututzanoo un objetivo de lnmersicn en aceite. g) Observar s! los qranulos de PHS de las ceiuas de R. so/anacearum se urten de negro azulado con un ternoo rosa ceo de las paredes de las celulas. BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13165 3. Pruebas de aglutinaci6n serol6gica La mejor manera de observer la apfutlnacion de celulas de R. so/anacearum en liquido bactenano 0 extractos de tejido stntomatlco es utilizando enucuerpos validados (vease el apendlce 3) etiquelados con marcadores coloreados apro piados tales como cennas rojas de Staphylococcus aureus 0 partloutas coloreadas de latex. Si se utiliza un equipo comer cializado (vease el apendice 3), siga las instrucciones del tabtcante. En caso contrario, aplique el procedimiento si guiente: a) mezclar gotas de una suspension de anticuerpos en quetados y liquido bacteriano (de aproximadamente 5 1-11) en pocillos de portaobjetos de pocillos multiples; b) preparar controles positivos y negativos utilizando suspensiones de R. solanacearum biovar 2 y una cepa hete rolcqa: c) observar s! se produce aglutinaci6n en las muestras positivas tras mezclar suavemenle durante 15 segundos. 4. Aislamiento selectivo 4.1 Siembra en medio selective Nota: Antes de utilizar este metodo por primera vez, etec tue pruebas preliminares a fin de garantizar una oeteccion reproducible de 10 3 a 10 4 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml enaddo a extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos. Utilizar un medio selective validado adecuado tal como SMSA (mcdlflcado por Elphinstone et et.. 1996: veese et epenctce 2). Es preciso diferenciar R. so/anacearum de otras bacle rias que pueden desarrollar colonias en el medio. Ademas, las colonias de R. solanacearum pueden mostrar morfologias atlpicas si las placas estan superpobladas 0 si tam bien con tienen bacterias antagonistas. Cuando se sospeche la exis tenere de efectos de la competencia 0 el antagonismo, debe ra volver a ananzarse la muestra con otro rnetooo. Para lograr la maxima sensibilidad con este metcdo, utili zar extraclos de mueslras recien preparados. Sin embargo, este metcoo tambien puede aplicarse a extraclos que se hayan almacenado con glicerol entre - 68 Y- 86 "C. Como controres positives. preparar diluciones decimates de una suspensionde 106 cfu por ml de una cepa vnulentabiovar2 de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar loda posibilidad de contaminaci6n, preparar controles positivos totalmente separados de las rnues tras que van a enatizarse. Debera examtnarse la adecuaci6n para el crecimiento del pat6geno de cada rote recten preparado de un medic selectivo antes de ulilizarlo para analizar muestras rulina rias. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 rnuesnas. 4.1.1 Aplicar una tecnica de onucton en placas aprcpia da a fin de garantizar la dtluclon de cualquier poblaclon sa proflta tormaoora de colonias que pudiera existir. Extender 50-100 1-11 por placa de extracto de muestra y de cada dilu cion. 4.1.2 Incubar las placas a 28 "C. Leer las placas 48 horas despues y posteriormente a diario hasta un maximo de seis dias. Las colonias Iipicas de R. solanacearum en el medio SMSA son de color blanco lechoso, planas, irregula res y fluidas v, tras tres dlas de incubaci6n, se vuelven de color rosa a rojo sangre en el centro con rayas 0 espirales internas (vease el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Nota: En algunos casos se forman colonias atipicas de R. so/anacearum en este medio. Estas pueden ser pequenas, redondas, compietamente rojas y no fluidas, 0 s610 parcialrnente fluldasy, por tanto, dlflclles de distinguir de las bacterlassaprotl las formadoras de colonias. 4.1.3 Purttlcar las presuntas coloruas de R. soenecee rum tras e! estriado 0 la dilucion en pracesen un meoto nutri livo general a fin de oblener colonias aisladas (vease el apendlce 2). 4.1.4 Almacenar los cultivos a corto plaza en agua este rll (pH 6-8, sin cloro) a temperatura ambiente en la oscuridad, o a largo plazo en un medio crioprotector adecuado entre 68 Y - 86 OC 0 liofilizado. 4.1.5 Idenlificar los presuntos cullivos (vease la secci6n VI. B) Yefectuar una prueba de patogenicidad (vease la sec ci6n VI. C). Interpretacion de los resultados de la siembra en medio selectivo La semora en medio selective es negativa si no se obser van colonies bacterianas al cabo de seis dias ni se encuentran presuntas colonies tipicas de R. solanacearum, slempre que no haya sospechas de inhibici6n producida por la competencia o el anlagonismo de olras baclerias y que en los controles posilivos se encuenlren colonias tlpicas de R. solanacearum. La siembra en medio selectivo es positiva si se atstan presuntas colonias de R. so/anacearum. 4.2 Procedimienlo de enriquecimienlo Utilizar un medio de enriquecimiento validado como el caldo Wi/brink modificado (vease el eperatce 2). Este procedimiento puede utilizarse para incrementar setec tlvamente las pcbiaciones de R. sotanacearum en extractos de muestras e Incrementar la sensibllidad de te oeteccioa. Asimls mo, eete procedlmiento diiuye efectivamente see inhibidores de la reecccn peR (1:100). Sin embargo, debe sefialarse que el enriquecimiento de R. solanacearum puede fallar debido a la competencia 0 el antagonismo de organismos saprof/tas, que en muchos casos se enrlquecen slmulttmeamente. Par este motivo, el aislamiento de R. solanacearum a partir de cultlvos de caidos enrlquecidos puede resultar dlficll. Ademes, debido a que pueden Incrementarse las poblaclones de saprofllos serologl camente af/nes, se recomienda la unnzecon de anticuerpos moncelonales especif/cos en lugar de anticuerpos pollclonales cuando se aplique ia prueba ELiSA. 4.2.1 Para e! enriquecimiento PCR, transtertr 100 1-11 de extracto de muestras a 10 ml de caldo de enriquecimiento (apendice 2) previamente alicuolados en tubos 0 matraces sin ADN. Para el enriquecimienlo ELISA, pueden ulilizarse proporciones mas elevadas de extracto de muestras en el caldo (por ejemplo, 1001-11 en 1,0 ml de caldo de enriqueci miento). 4.2.2 Incubar durante 72 teras entre 27 y 30 "C en un cultivo agitado 0 un cultivo estanco manteniendo eltapon del tubo sin apretar para que haya aireaci6n. 4.2.3 Mezclar adecuadamente antes de utilizar en las pruebas ELISA 0 peR. 13166 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 4.2.4 Tratar el caldo enriquecido de manera loenttca a 113 muestra 0 las muestras de las pruebas anteriormente rnenclonadas. Nota: Si se preve una inhibici6n 0 un enriquecirniento de R. solanacearum debido a las elevadas poblaciones de de terminadas bactenas saprofltas competroores, pueden con seguirse mejores resultados con e! enriquecimiento de ex tractos de muestras antes de cualquier cenfrifuqacion 0 con otras medidas de concentraci6n. 5. Prueba de Inmunotluorescencla (prueba IF) Principia Se recomienda utilizar 113 prueba IF como principal prueba de seiecclon debido a su capacidad demostrada para alcan zar los Iimites requeridos. Cuando se utilice 113 prueba IF como principal prueba de seleccion y su lectura sea positiva, debera erectuerse 113 prueba de aislamiento, PCR 0 FISH como segunda prueba de seleccion. Cuando se utilice 113 prueba IF como segunda prueba de seleccion y su lecture sea positiva, debera efec tuarse una nueva prueba con arreglo 131 diagrama de tlujo para completer et anal isis. Nota:Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. sola nacearum (vease el smo web: htlp:l/forum.europa.eu.inV PublicJirc/sancol Home/main). Se recorsenoa determiner e! titulo para Gada nuevo lote de entlcuerpos. Eltitulo se define como 113 dilucion mas elevada en 113 que se produce una reaccon 6ptima cuando se analiza una suspensi6n que contenga de 10 5 a 10 B celulas por ml de 113 cepa homcloqa de R. soianacearum, utili zando un conjugado de isotiocianato de fiuoresceina (FITC) apropiado, sequn las recomenoaciones del fabncante. Toco e! annsuero pondonet vanoaoo debe presentar un titulo IF de 131 menos 1:2000. Durante el analisis, deberan utilizarse los anti cuerpos en diluciones de trabajo cercanas 0 equivalentes 131 titulo. La prueba deberia efectuarse en extractos de muestras recien preparados. En caso necesario, puede realizarse con exito enextractos almacenados entre - 68 Y- 86 "C en glice rot. EI glicerol puede eumrnarse de 113 muestra s! se anade 1 ml de tampon de precipltado (vease et apenctce 4), se recen trifuga durante 15 minutos a 7,000 9 Y se resuspende en un volumen equivalente de tampon de precipitado. En muchos casos no es necesario efectuar este procedimiento, espe cialmente si las muestras se han fijado en los portaobjetos mediante nemeeoc. Preparar en otro portacbjetos controles positives de 113 cepa homologa 0 de cualquier otra cepa de referencia de R. so/anacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apendice 3, punto B, y opcionalmente en tampon, Cuando sea posible, debera utilizarse tejido naturalmente Intectado (mantenido por fiofilizacion 0 congelaci6n entre 16 Y- 24°C) como control similar en et mismo portaobjetos. Pueden utilizarse como controles negativos ahcuotas de extracto de muestras que hayan dado anteriormente resulta dos negativos de R. solanacearum. En el apendice 3 se enumeran los materiales norrnaliza dos de control positive y negative que pueden utilizarse en esta prueba Utilizar portaobjetos de pocmos multiples, de preteren cia con diez pocillos de 6 mm de orarnetro como minimo. Procesar el material de control de 113 misma manera que 113 muestra 0 muestras. 5.1 Preparar los portaobjetos segun uno de los procedimientos siguientes i) Para precipitados con una cantidad relativamente pequena de sedimento de almidon: Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 ~I es suficiente para pocillos de 6 mm de dtametro: au mentar el volumen si el diametro es mayor) de una ouucton de 1/100 del precipitado de palata resuspendido en el primer pocillo. A continuacion, echar con una pipeta un volumen similar de precipitado sin diluir (111) en los pocillos restantes de 113 fila, La segunda fila pueoe utilizarse como oupucaoo 0 para una segunda muestra, tal como se indica en 113 figura 1. Ii) Para otros precipitados: Preparar dilucones decimales (1110 y 1/100) del precipita do resuspenotoo en tampon de precipiteoo. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 ~I es suficiente para pocillos de 6 mm de dtametro: aumentar el volumen si el diarnetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilucion en una fila de pocillos. La segunda fila puede utilizarse como duplicado 0 para una segunda muestra, tal como se indica en 113 figura 2, 5.2 Secar las gotitas a temperatura ambiente 0 calen tanoolas entre 40 y 45 "C. Fijar las celulas bactertanas 131 portaobjetos calentandolo (15 minutes a 60 "G), flarneandolo con etanol del 95 % 0 con arreglo a las Instrucciones especi ficas de los surnrntstraoores de los anticuerpos. En caso necesario, pueden almacenarse a contrnuacron portaobjetos fijos en un recipiente desecado durante el me nor tiempo que resulte necesario (hasta un maximo de 3 meses) antes de efectuar nuevas pruebas. BQE num. 74 Mertes 27 rnarzo 2007 13167 5,3 Procedimiento IF i) Sl et portaobjetos se ha prepareoo seoun et punta 5.1.i): Preparar un conjunto de onucones a 112. EI primer poeillo debera ccntener 1/2 del titulo (T/2), los otros Y, del titulo (TI4), 1/2 del titulo (T/2), eltitulo (T) y el doble del titulo (2T), Ii) Sl et portaobjetos se ha prepareoo seoun et punta 5.1.ii): Preparar la diluei6n de trabajo (DT) del antieuerpo en el tamp6n IF. La diluei6n de trabajo afeeta a la espeeifieidad. Figura 1 Preparacion del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.i] Y 5.3.i) Oiluciones del precipilado resuspaodido 11100 '" 1/1 '" '" U Diluc,6n del precipitadoresuscenorcc (T = litulo) m '" m r zr u Dilue'ones a 1/2 delanlisuero/anticuerpo Mueslra 1 ., ., ., ., ., Duplicado de muestra 1 0 ., ., ., ·9 ."rnuestra 2 Figura 2. Preparaei6n del portaobjetos can arreglo a los puntas 5.1.ii) y 5.3.ii) Dlluclon de trabajo del anlosuerolantrcuerpo '" 1110 1/100 Nada Nada 0 Diluci60 decimal delpreclpltaoo resuspendlco Muestra 1 ., ., ., ., .; Duplicado de mueslra 1 0 ., ., ., ·9 .'0muestra 2 5.3.1 Colocar los portaobjetos en un panueto de papel humedecldo. Cubnr caoa pocmo compretarnente con la dilu ci6n 0 diluciones de anucuerpos. EI volumen de anticuerpos aplicado en cada pocillo debe ser como mtnrmo equivalente al volumen de extracto aplicado. En caso de que no existan instrucciones especificas de los surnrntstraoores de los anticuerpos debera apncarse et siguiente procedimiento: 5.3.2 Dejar en incubaci6n los portaobjetos en papel humedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 "C), 5.3.3 Sacudir las gotitas de caoa pcrtaobjetos yenjua gar cuidadosamente con tamp6n IF. Lavar por inmersi6n durante cinco minutes en tampon IF-Tween (apendice 4) y posteriormente en tamp6n IF. Evitar la transferencia de aero soles 0 golilas que pudiera provocar contammaciones cruza das. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secan dolo suevemente. 5.3.4 Colocar los portaobjetos en papel humedo. Cubrir los pocillos con la diluci6n del conjugado FITC utilizado para oetermrnar el titulo. EI volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser ioenuco al volumen de anticuerpos aplica do. 5.3.5 Dejar en Incubaclon los portaobjetos en papel hurnedo durante 30 minutos a temperatura ambtente (18-25 'C). 5.3,6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (5.3.3). Eliminar cufdadosarnente e! exceso de humedad. 5.3,7 Echar con una pipeta 5 a 10 fJl de tamp6n fosfato glicerol de 0,1 M (apendice 4) 0 un volumen de solucion co mereta: que proteja la fluorescencia (an/ifading) en cada poci 110 y corocar un cubreobjetos. 5.4 Lectura de la prueba IF 5.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epi fluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitaci6n del FITC, con aceite 0 aqua de inmersi6n y a 500-1 000 aumentos. Recorrer los pocillos a 10 largo de dos otametros perpendiculares entre st y alrededor del perime tro. En e! caso de moestras que presenten un bajo numero de celulas a ninguna, deben observarse como minimo 40 campos mrcroscoprcos. 13168 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 En primer lugar, cornprobar e! control posinvo Las ceru las deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente tertoas en el mula de anticuerpos 0 la onucton de traba]o delerminados. La prueba IF (seccton VIAS) debe repetirse si ra tinci6n no es ccrrecte. 5.4.2 Comprobar s! hay celulas ftuorescentes brillantes con morfoloqia caractenstlca de R. so/anacearum en los pocuos de los portaobjetos (vease el sitio web: http://forum,europa.eu.intlPubliclirclsanco/Home/main).Lain tensidad de la ftuorescencia debe ser equivalents a la de ta cepa de control posltlvo en la rnlsrna dilucion de antlcuerpos. Deberan descartarse las cetulas que presenten una tinci6n in completa 0 cuya fiuorescencia sea escasa. Debera repetirse la prueba s! se sospecha que se ha producido cualquier posible contamnacron. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren celu las positlvas debido a la contaminaci6n del tampon 0 si se encuentran cennas posilivas (fuera de los pocillos de los por taobjetos) en la superficie. 5.4.3 Existen varios problemas inherentes a las ceracterts ticas especrncas de la prueba de lnrnunoftuorescencla. En los precipitados de cunas basales de patata y los precipilados de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de celulas ftuorescentes de morfoloqla atipica y tectertas saprofitas con reacclon cruzada cuyo tamaro y mortoroq!a sean similares a los de R. soereceerum. 5.4.4 Tener solamente en cuenta las celurasnuorescen tes con tamaro y morfologla tlpicos en el titulo 0 la diluci6n de trabejo de los anticuerpos, tal como se describe en 5.3. 5.4.5 Interpretacion de la lectura de la prueba IF: i) si se encuentran celuras fluorescentes brillantes con rnortoropra caractensuca. esumar et numero medic de celulas tlpicas par campo microscopico y calcular el nurnero de celu las tipicas por mr de precipitado resuspendido (apendice 5). La lectura IF es posiliva en las muestras con un minimo de 5 x 103 celulas tipicas por ml de precipitado resuspendido. Se considera entonces que la mueslra puede estar conlaminada y deben efectuarse otras pruebas, Ii) la lecture IF es negativa en las muestras con menos de 5 x 10 3 cennas por ml de precipitado resuspendido, y se considera negativa la muestra. No es precise efectuar mas pruebas. 6. Prueba de reacci6n en cadena de la polimerasa (prueba PCR) Princlpios Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de seleccton y de resultados positives. debera efectuarse la prueba de aislamiento 0 la IF como segunda prueba obligato ria de seiecclon Cuando se utilice ra PCR como segunda prueba de selecclon y de resultados posmvos, deberan erec tuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar e! diagn6stico. La aplicacion de este metodo como principal metooo de sereccton s610 se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mlsrno. Nota: Las pruebas preliminares realizadas can este rnetodo deberian permitir la detecci6n reproducible de 10 3 a 10 4 celulas de R. solanacearum por mr anadidas a los extractos de mues tras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesarlo never a cabo experimentos de optimiza cion para lograr nivelesmaomos de sensibilidad y esoecmcoec en lodos los laboratorios. Utilizar reactlvos y protocoros PCR validadcs (vease e! apendice 6). Seleccicnar prefertblemente un metodo con conlrol interno. Tomar las precauciones adecuadas para evitar la conta minaci6n de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR debe ser efectuada por tecncos experimentados, en labora torios especializados en biologia molecular, con el fin de reducir al maximo la posibilidad de contarrmacton con el ADN buscado. Como muestras finales del procedimiento slempre deben efectuarse controles negativos (para la exneccron de ADN y los procedimientos PCR) que dejen constancia de si se ha producido arrastre de ADN. En la prueba PCR deben incluirse los siguientes centro ies negativos: extraclo de la muestra que previamente haya propor cionado resultados negativos para R. solanacearum, controles de los tampones utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra, mezcla para la reaccton PCR. Deben lnctutrse los siguientes controles positivos: ancuotasde precrpttaoos resuspendidos a los que se ha afiadido R. solanacearum (para la preparacion vease el apendice 3, punta B), una suspension de 106 celuras por ml de R. solana cearum en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; veese et apendice 3, punto Bj, siempre que sea posible, utilizar asimismo ADN ex lraido de las muestras de conlrol positivas en la prueba PCR. Para evitar toda posible contammacion, preparar los con lroles positivos en un entomo distinto al de las muestras que vayan a analizarse. Los extractos de muestras deben contener la cantidad mi nima de tierra posible. En determinados casos puede ser re comendable preparar los extractos a partir de patatas lavadas cuando vayan a utuaerse protocolos PCR. En e! aperdrce 3 se enurneran los rnatertales norrnahza dos de control positive y negativo que pueden utilizarse en esta prueba. 6.1 Metodos de purrncacon del ADN Utilizar muestras de control positivas y negativas como se indica mas arriba (vease el apencice 3). Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. Existen diterentes metodos para purlficar e! ADN busca do a partir de sustratos de muestras complejas, separando de esta manera los inhibidores de PCR y otras reacciones enzmances y concentrando el ADN buscado en el extracto de la muestra. Se ha optimizado el metcdo siguiente para su utilizaci6n con los metocos PCR validados mostrados en el apendice 6. a) Metodo de Pastrik (2000) BOE num. 74 Mertes 27 rnarzo 2007 13169 1) verter con una pipeta 220 1-11 de tampon de lisis [100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0),1 mM EDTA (pH 8,0)] en un tuba eppendort de 1,5 ml; 2) anadlr 100 IJI de extracto de muestra y colocar en un cafentador 0 at bane maria a 95°C durante diez minutes: 3) colocar el tubo en hielo durante cinco minutos; 4) anadir 80 1.11 de soluclon estancar de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCI, pH 8,0) e incubar a 37 "C durante 30 minutos; 5) anadir 220 1.11 de solucion A Easy DNA® (Invitrogen), rnezclar adecuadamente por agitaci6n e Incubar a 65 "C durante 30 minutos; 6) afiadir 100 IJI de solucion B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente visco sa; 7) anadir 500 IJI de clorotorrno y agitar hasta que dismi nuya ta viscosidac y la mszcta sea homoqenea: 8) centrifugar a 15,000 9 durante 20 minutos a 4"C pa ra separar las rases y formar la interfase: 9) transferir la fase superior a un tubo Eppendoli sin uti uzar: 10) anadir 1 ml de etanol al100 % (- 20 'C), agitar bre vemente e incubar en hielo durante diez minutes: 11) centrifugar a 15.000 9 durante 20 minutes a 4"C Y retirar el etanol del preciprtedo: 12) afiadlr 500 IJI de etanol al 80 % (- 20 'C) Ymezclar invirtiendo el tubo: 13) centrifugar a 15.000 9 durante diez minutos a 4 'C. guardar el precipitado y retirar el etanct: 14) dejar que el precipitado se seque al arre 0 en un Speed vee de ADN; 15) resuspenoer e! precipitado en 100 IJI de agua ultra pura ester! y dejar a temperatura ambiente durante un mini mo de 20 mlnutos: 16) almacenar a - 20 'C haste que se necesite para la prueba PCR; 17) centrifugar todo precipitado blanco y utilizar 5 IJI del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR. b) Otros metooos Pueden aplicarse otros metocos de extracci6n del ADN, como por ejernplo Qiagen DNeasy Plant Kit, srernpre que se haya demostrado que son igual de encaces en la purificaclon del ADN a partir de muestras de control que contengan de 10 3 a 10 4 celutas patoqenas por mi. 6.2 PCR 6.2.1 Preparar plantillas de ensayo y de control para la prueba PCR con arreglo a los protocolos validados (secclon VIA6). Preparar una dilucion decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura). 6.2.2 Preparar la mezcla de reacci6n PCR apropiada en un entomo sin contaminaci6n de acuerdo con los protocolos publicados (apendice 6), Cuando sea posible, se recomienda utilizar un protocolo PCR multiplex que incorpore asimismo un control interno de la prueba PCR. 6.2.3 Anadir de 2 a 5 1-11 de extracto de ADN por 251.11 de reacci6n PCR en tubos peR esteriles con arreglo a los pro tocolos PCR (vease el ap€mdice 6). 6.2,4 Incorporar una muestra de control negativo que contenga s610 mezcla de reaccion PCR y anadir la misma fuente de aqua ultrapure utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra. 6.2,5 Corocar los tubos en el mismo termociclador utili zaoo en las pruebas prenrmnares y apncar et programa PCR optimizado aoecuaoo (apendice 6). 6.3 Anaflsls del prooucto de la PCR 6.3.1 Resolver los arnpncones PCR mediante electro foresis en gel de agarosa. Aplicar como minimo 12 1.11 de mezcla de reaccrcn de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 1-11 de tampon de carqa (apendice 6) en 2,0 % (w/v) de geles de agarosa en un tampon de tns-acetato EDTA (TAE) (apencice 6) a 5-8 V por cm. Utilizer un mar caoor de ADN adecuedo, por ejemplo, 100 pb ladder, 6.3,2 Reveler las bandas de ADN tinendclas con bro muro de etidio (0,5 mg/l) durante 30 a 60 minutes, tornanoo las precauciones adecuadas para el manejo de este mutsqe co. 6.3,3 Observer el gel tenido mediante transiluminaci6n en UV de onda corta (il = 302 nm) para proouctos de la PCR arnpunceoos del tamano esperado (aperorce 6) y anotar los resultados. 6.3.4 En relacion con todos los nuevos descubrimientos o casos, para verificar la autenticidad del ampucon PCR efec tuar un anal isis de la enzima de resmcclon en una muestra del ADN restante amplificado incubando a la temperatura 6ptima y durante el tiempo recesano con una enzima y un tamp6n aproptaoos (vease e! apendice 6). Resolver los fragmentos digeridos mediante electrotoresis en gel de agarosa, al igual que antes, y observar el patron caracteristico del fragmento de restrrccicn con transilurnlnacion UV una vez teruoc con bromu ro de etidio y comparar con el control positive no digerido y digerido. Interpretacion de los resultados de la prueba peR La prueba PCR es neqativa si el ampucon PCR especifi co de R. solanacearum del tarnano esperado no se detecta en 113 muestra en cuestion pero s! se detecta en todas las muestras de controles positives (en caso de PCR multiplex con cebadores de control interne especificos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuesnon un segundo pro ducto PCR del tamano esperado). La prueba peR es positive si se detecta el ampucon PCR especifico de R. solanacearum del tamano y patron de resmc cion esperado (cuando se exija), siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de control negativo. La confirmaci6n flable de un resultado positive puede obtenerse tambien repitiendo la prueba con un segundo conjunto de ce badores de la PCR (apendice 6). Nota: Puede sospecharse la mtubrcion de la PCR s! el ampucon esperado se obtiene a partir de la muestra de con trol positivo que contiene R. so/anacearum en agua, pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con R. solanacearum en extracto de patata, En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibici6n de la reac cion se indica cuando no se obtiene ninguno de los dos am plicones, Puede sospecharse la existencia de contaminaci6n si el amplic6n esperado se obtiene a partir de uno 0 varios de los controles negativos. 13170 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 7. Prueba de hibridaci6n f1uorescente in situ (prueba FISH) Principia Cuando se uti lice la prueba FISH como primera prueba de seleccion y esta proporcione resultados posinvos, debera erectuarse la prueba de alslamlento 0 la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selecci6n. Cuando se unuce la prueba FISH como segunda prueba de selecci6n y de resul tados positives, deberan efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de f1ujopara completar el diagn6stico. Nota: Utilizar oligosondas especificas para R. solanacea rum validadas (vease el aperdlce 7). Las pruebas preliminares realizadas con este metcoo deberian permitir la detecci6n reproducible de at menos 103 a 104 ceiuas de R. solanacea rum por ml areooas a los extractos de muestras que hayan dado antenormente resultados neqanvos. EI proceormtento siguiente deberia etectuarse, a ser po sible, con extracto de muestra recien preparado, pero tam bien puede realizarse con extto con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura compren dida entre - 16 Y- 24 "C 0 entre - 68 Y- 86 "C. Utilizar como controles negativos alicuotas de extracto de muestras que hayan dado previa mente resultados negativos para R. solanacearum. Como controles positives. preparar suspensiones que contengan de 105 a 106 celufas por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo la cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vease el apencnce 3) en tamp6n de fosfato de 0,01 M de un cultivo de tres a cinco dias. Preparar en otro portaobjetos controles positives de la cepa hom61oga 0 de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, sus pendida en ext-acto de pateta, tal como se especifica en el epenctce 3, punto S. EI uso de una oligosonda eubacteriana con etiqueta FITC ofrece un control para el proceso de hibridaci6n, ya que teni ra todas las eubactertaspresentee en la rnuestra En el apenctce 3, punto A, se enumeran los materiales normauzados de control positive y negativo que pueden utili zarse en esta prueba. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra 0 muestras. 7.1 Fijaci6n del extracto de patata EI protocolo aiquiente se basa en Wullings er el. (1998). 7.1.1 Preparar la soluci6n de fijaci6n (veese el apendice 7) 7.1.2 Verter 100 1-11 de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante siete minutes a 7 000 g. 7.1.3 Separar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 1-11 de soluci6n fijadora preparada con menos de 24 horas de anteracron. Agitar e incubar durante una hora en el refrigerador. 7.1.4 Centrifugar durante sfete minutos a 7 000 g, sepa rar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 1-11 de tamp6n de fosfato de concentraci6n 0,01 M (vease el apendi ce 7). 7.1.5 Colocar 16 1-11 de las suspensiones fijadas en un portaobjetos multiple Hrnpic, tal como muestra la figura 7.1 Aplicar dos muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 1-11 para realizar una diluci6n a 1:100 (en tamp6n de fosfato de corcent-acron 0,01 M). La soiucron de la muestra restante (49 1-11) puede almacenarse a - 20 'C tras ra adici6n de 1 volumen de etanol al 96 %. En caso de que sea necesa rio repetir la prueba FISH, separar et etanol mediante centn fugaci6n y anadir un volumen equivalente de tampon de fos fato de concentracion 0,01 M (mezclar mediante agitaci6n). Figura 7.1. Distribucion del portaobjetos para la prueba FISH. Distnbue,on del portaobjetos para la prueba FISH Muestra 1 Naoa naua rcaoa Mueslfa2 0 0 0 0 nU poeillo 1 pocillo 2 pocilio 3 poe,llo 4 pocillo 5 Muestra 1 Nada Nada Nada MueSlra2 0 0 0 " 0U pocillo 6 pocillo 7 pocillo 8 pocillo 9 pocillo 10 Cubreobjelos 1 Cubreobjelos 2 BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13171 7.1.6 Secar los portaobjetos al aire (0 con secador de portaobjetos a 37 "C) y fijarlos ftameandolos. EI procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pu cnenoose proseguir con la tuonoacion al dia siguiente. Los portaobjetos deben elrnacenarse secos y sin polvo a tempe ratura ambiente. 7.2 Hibridaci6n 7.2.1 Deshidratar las celulas en series de etanot esca lonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante un minute cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos. 7.2.2 Preparar una camera de incubaci6n humeda re cubriendo el fonda de una caja nerrnence con papel de seda ode ftltro empapado en 1x hybmix (apendice 7), Preincubar la caja en e! homo de hibrldaclon a 45°C durante un minimo de cnez mmutos. 7,2.3 Aplicar 10 IJI de solucion de hibridacion (apendice 7) a echo pocmos (pocillos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10; vease la figura 7.1) de cada portaobjetos dejando vacios los dos poci 1I0scentrales (3 y 8), 7.2.4 Aplicar cubreobjetos (24 x 24 mm) at primer y a los cuatro umrnos pocillos evitando la entrada de aire. Colo car los portaobjetos en la camera humeoa precalentada y dejar que se produzca la hlbndacion durante cinco horas a 45 °C en la oscuridad. 7.2.5 Preparar tres vasos de precipitado que contengan 1 I de agua Milli Q (grado molecular), 1 I de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml aqua Milli 0) y 1 I de 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix y 958 ml agua Milli 0), Preincubarlos al bane maria a 45°C, 7.2.6 Quitar los cubreobjetos de las preparaciones y colocar estas en un portaobjetos. 7.2.7 Lavar el exceso de sonda mediante incubaci6n durante 15 minutes en el vasa de precipitado con 1x hybmix a 45 "C, 7.2.8 Transtertr et portaobjetos a una solucion de lava do de hybmix a 1/8 e incubar durante otros 15 mrnutos. 7.2.9 Sumergir las prepareciones brevemente en agua Milli Q Y colocarfas en papel de tutro. Eliminar e! exceso de humedad cubnenoo la superflcle con cutoeoo con papel de filtro. Verter de 5 a 10 IJI de solucion de montaje protectora de la fluorescencia (por ejemplo Vectashield, Vecta Laborato ries. CA. USA, 0 equivalente) en cada pocillo y aphcar un cubreobjetos grande (24 x 60 mm) sobre la totalidad de la preparaci6n. 7.3 Lectura de la prueba FISH 7.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediata mente utilizando un microscopic epifluorescente a 630 0 1,000 aumentos con aceite de inmersi6n. Con un filtro ade cuado para isotiocianato de f1uoresceina (FITC), las celulas eubacterianas (incluida la mayoria de las celulas gramnegati vas) de la muestra aparecen tenidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las celulas de R. solanacearum marcadas con Cy3 aparecen tenidas de rojo f1uorescente. Comparar la moriologia de las celulas con la de los controles positivos. Las celulas deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente tenidas. La prueba FISH (secci6n VIA7) debe repetirse si la tinci6n es aberrante. Recorrer los pocillos a 10 largo de dos diame tros perpendiculares entre si y alrededor del peri metro. En el caso de muestras que presenten un bajo numero de celulas o ninguna, deben observarse como mlnimo 40 campos mi croscoplcos. 7.3,2 Comprobar s! hay cetulas nuorescentes brillantes con la morfolcgia caractertsnca de R. so/anacearum en los pocillos de los portaobjetos (vease el sitio web: htlp:/lforum.europa,eu,intiPublicfircfsancol Home/main), La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalents 0 mejor que la de la cepa de control positive. Deberan descartarse las celuras que presenten una tinci6n incomplete 0 cuya tluorescencia sea escasa. 7.3,3 Debera repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contarninacion. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote mues tren celulas positivas debido a la contaminaci6n del tampon 0 sl se ercuentran celufas positivas (fuera de los pccmos de los portaobjetos) en la superncre. 7.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especifi cidad de la prueba FISH. En los precipitados de cures basa les de patata y de segmentos del tallo pueden aparecer po blaciones de base de cennas nuorescentes de morfologla atipica y bacterias saprofitas con reacci6n cruzada cuyo ta mana y morfologia sean slrnnares a los de R. solanacearum, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF. 7.3,5 Tenqanse en cuenta unicamente las cennas fluo rescentes de tamano y morfologia tlpicos. 7.3,6 Interpretacion de los resultados de la prueba FISH i) Se obtendran resultados vauoos en la prueba FISH siempre que en todos los comroles positives y en ninguno de los connotes negativos se observen celulas teruoas de verde ftuorescente bruente. cuyo tamaro y rnortologia sean los tipi cos de las de R. solanacearum, cuanoo se utillce et filtro FITC, y celulas teFiidas de rojo nuorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encueruren celulas nuoresceotes brillantes con morfologia caracterlstica, estimar el numero medic de celulas tipicas por campo rmcroscopco y calcular e! nurnero de celufas tlplcas por ml de precipltado resuspendido (apendice 4). Las muestras que presenten al menos 5 x 103 celulas tipicas por ml de precipitado resuspendido se conside ran potencialmente contaminadas. Es precise efectuar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 x 103 celu las tlpicas por ml de precipitado resuspendido se consideran negativas. Ii) Los resultados de la prueba FISH seran negativos cuando no se observen celulas tei'iidas de rajo fluorescente brillante con un tamai'io y morfologia tipicos de R. solanacea rum utilizando el filtro de rodamina, siempre que se observen celulas teFiidas de rojo fluorescente brillante tipicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de radamina. 8. Pruebas de ensayo de inmunoabsorci6n enzimatica (ELISA) Principio Las pruebas ELISA solamente pueden utilizarse como prueba opcional ademas de las pruebas IF, PCR 0 FISH, debi do a la sensibilidad relativamente baja de esta prueba. Cuando se utilice ELlSA-DASI, es obligatorio efectuar un enriquecimien to y utilizar anticuerpos monoclonales (vease el sitio web: http://forum.europa.eu,int'Public/irclsanco/ Home/main). Puede resultar de utilidad efeetuar un enriqueci miento de las muestras antes de utilizar la prueba 13172 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 ELISA, a fin de incrernentar la sensibilidad de la prueba, pero puede tracasar debido a la competencia de otros orga nismos en la muesne. Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. sola nacearum (vease el sjtio web: http://forum.europa.eu.intl PubliclirclsancoIHomelmain). Se recomienda determinar el titulo para cada nuevo lote de anticuerpos. EI tttuio se define como 113 dlluclon mas elevada en la que se produce una re accion optima cuando se analiza una suspension que con tenga de 105 a 106 cennas por ml de la cepa homoloqa de R. so!anacearum, utilizando conjugados de anticuerpos secun darios apropiados, sequn las recomendaciones del fabrican teo Durante el anausis. deben utilizarse los anticuerpos en dilucicnes de trabajo cercanas 0 equivalentes a 113 formula cion comercla! Determmar e! titulo de los antlcuerpos en una suspension de 105 a 10" cennas por ml de 113 cepa homoloqa de R. sola nacearum. Inclutr una muestra de ext-acto que haya dado previa mente resultados negativos para R. solanacearum y una suspension de una bacteria que no tenga reaccton cruzada en tampon fosfato satmo (PBS) como connotes negatives. Como control positivo utilizar alicuotas de extracto de muestra que haya dado previamente resultados negativos, mezcladas con 10 3 a 10 4 celutas por ml de R. solanacearum cover 2 (por ejemplc, cepa NCPPB 4156" PO 2762" CFBP 3857; vease el apendice 3, puntos A y B). Para ra com para cion de los resultados de caoa placa utilizar una suspension norrnaltzada de 105 a 106 celulas por ml en PBS de R. sola nacearum. Debe asegurarse que los controles positives es ten bien separados en 113 placa de microtitulaci6n de 113 mues tra 0 las muestras analizadas. En el apendice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positive y negativo que pueden utili zarse en esta prueba. Procesar e! material de control de la misma manera que 113 muestra 0 muestras. Se han validado dos protocolos ELISA: a) ELISA indirecto (Robinson Smith et ai" 1995): 1) utilizar de 100 a 200 1-11 de alicuotas de extracto de muestra. (Si se calienta a 100°C durante cuatro minutos at bane maria 0 un calentador pueden reducirse en algunos casos los resultados no especificos.); 2) anadir un volumen igual de tampon de taplzado de doble concentracion (apendice 4) y agitar; 3) aplicar 100 1-11 de alicuotas en 131 menos dos pocillos de una placa de rnicrontulaclon (por ejemplo, Nunc-Polysorp o equivalente) e incubar durante una hora a 37°C 0 durante una noche a 4°C; 4) quitar los extractos de los pocmos. Laver estos tres veces con PBS-Tween [apendice 4), dejando en euos 113 ulti ma soluclon de lavado durante 131 menos cinco minutos; 5) preparar 113 diluci6n adecuada de anucuerpos contra R. solanacearum en tampon de bloqueo (apendice 4). Para anticuerpos comerciales validados, utilizar las diluciones recomendadas (normalmente una concentraci6n que dupli que el titulo); 6) anadir 100 1-11 a cada pocillo e incubar durante una hora a 37°C; 7) quitar 113 solucion de anticuerpos de los pocillos y 113 var como se describe en el punto 4; 8) preparar 113 diluci6n adecuada de conjugado de fosfa tasa alcalina de anucuerpos secundarios en tampon de blo queo. Anadir 100 1-11 a cada pocillo e incubar durante una hora a 37 'C; 9) quitar los anticuerpos conjugados de los pocillos y lavar como se describe en et punto 4; 10) anadir 100 1-11 de soluclon de sustrato de tostatasa alcalina (apendice 4) a Gada pocillo. Incubar en 113 oscuridad a temperatura ambiente y leer 113 absorbencia a 405 nm a intervalos regula res durante 90 mtnutos. b) ELlSA-DASI (doble sandwich de anticuerpos indirec to): 1) preparar la diluci6n adecuada de inmunoglobulinas polklonales contra R. so!anacearum en tampon de bloqueo de pH 9,6 (apendice 4), Ariadir 200 1-11 a caoa pocillo. Incubar 1337 "C de cuatro a cinco horas 0 a 4 "C durante 16 bores; 2) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apen dice 4). Ariadfr 190 1-11 de ext-acto de muestra en al menos dos pocillos. Anadir asimismo controles positivos y negativos en dos pocillos de Gada placa. Incubar durante 16 horas a 4 "C; 3) lavar tres veces los pocmos con PBS-Tween (apen dice 4); 4) preparar una diluci6n apropiada de anticuerpos mo ncclonates especlflcos de R. solanacearum en PBS (apendi ce 4) que contenga asimismo 0,5 % de seroalburnina bovina (BSA) y anadir 190 1-11 a cada pocillo. lncubar a 37°C durante dos horas; 5) lavar tres veces los pocmos con PBS-Tween (apen dice 4); 6) preparar una diluci6n apropiada de inmunoglobulinas anti-raton conjugadas con fosfatasa alcalina en PBS, Afiadir 1901-11 a Gada pocillo. lncubar a 37°C durante dos heres: 7) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apen dice 4); 8) preparar una solucion de sustrato de fosfatasa elceli na que contenga 1 mg de p-nitrofenll fosfato por ml de tam pon de substrate (apendice 4). Afiadir 2001-11 a cada pocmo. Incubar en 113 oscuridad a temperatura ambiente y leer 113 absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 ml nutos. Interpretacion de los resultados de 113 prueba ELISA La prueba ELISA es negativa si 113 lectura media de la densidad 6ptica (DO) de los pocillos de cada muestra dupli cada es < 2 veces 113 DO del pocillo de control del extracto de muestra neqativa, srernpre y cuando todas las DO de los controles positives sean superiores a 1,0 (tras 90 minutes de incubaci6n con el substrato) y sean mas de dos veces supe rtores a 113 DO obtenida a partir de extractos de muestra ne qativa. La prueba ELISA es positiva s! las lecturas medias de 113 DO de los pocillos de Gada muestra duplicada es > 2 veces 113 DO en et pocuo del extractc de muestra negativa, siempre y cuando las lecturas de DO en todos los pocillos de control negativo sean < 2 veces las de los pocillos de control positi ". Las lecturas ELISA negativas en pocillos de control posi tivo indican que no se ha efectuado correctamente la prueba o que ha estado inhibida, Las lecturas ELISA positivas en pocillos de control negative indican que se ha producido con taminacion cruzada 0 union de anticuerpos no especificos. BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13173 B. PRUEBAS DE IDENTIFICACI6N Identificar cultivos puros de aislados de presunta R. sola nacearum utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios bioloqicos diferentes. Cuando prcceca incluir cepas de reterencla conocidas pa ra cada prueba efectuada (vease el apendice 3). Pruebas de identificaclon nutncional y enzlrnatica Determinar las propiedades fenotipicas siguientes que esten universalmente presentes 0 ausentes en R. solanacea rum, de acuerdo con los metooos de Lelliotl y Slead (1987), Klement el a/. (1990) y Schaad (2001). la fertilizaci6n, el riego, la inspeccron y cualquier olra manipu laci6n deben extremarse las precauciones para evitar la con taminaci6n cruzaoa. Es esencial mantener los invernaderos y las camaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmrttr la bacteria de una muestra a otra. Comprobar s! se eprectan stntomas de rnarchttemlento, epinastia. clorosis y/o crecrmrento reducldo. 9.5 Aislarlas de las plantas infectadas (secclon 11.3) e identificar cultivos purificados de presunta R. solanacearum (secci6n VI. B), 9.6 Si no se observan sintomas despues de tres serna nas, efectuar una prueba IFIPCR/Aislamiento en una muestra mlxta de seccones de 1 cm del tallo de caoa planta analiza da, tomaoas por enclma del punto de Inocufaclon. Si la prue ba es positiva, efectuar una diluci6n en placas (secclon 4.1). 9.7 Identificar cualquier cullivo purificado de presunta R. solanacearum (secci6n VI. B). Interpretaci6n de los resultados de ta prueba del bioensayo Se obtienen resultados vanoos de ra prueba del bioensa yo cuando las plantas del control positive muestran stntomas upicos, pueoen realsfarse las bactertas de estas plantas y no se encuenlran sintomas en los controles negativos. La prueba del bioensayo es negativa si las plantas anali zadas no estan infectadas por R. solanacearum, siempre que se detecte R. solanacearum en los controles positivos. La prueba del bioensayo es posit iva s! las plantas eneu zadas estan infectadas por R. solanacearum. 9. Prueba de bioensayo Nota: Las pruebas preliminares realizadas can este me todo deberlan permitir la oeteccron reproducible de 10J a 10· unidades formadoras de colonias de R. so/anacearum por ml ai'iadidas a los extractos de muestras que previa mente pro porcicnaron resultados negativos (para la preparaci6n vease el apendice 3), Se puede arcanzar la maxima sensibilidad de detecclon cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cullivo sean las 6pli mas, No obstante, este metcoo puede aplicarse tarnblen con exrto a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre - 68 y - 86 "C, EI protocolo siguiente se basa en Janse (1988): 9,1 Utilizar diez plantas de prueba de un cultivar de tomate sensible (por ejernplo. Moneymaker 0 cultivar con sensibilidad equivalente determinado por ellaboratorio de analisls] en la fase de la lercera hoja verdadera para cada muestra. Para mas deta lies de cultivo, vease el apendice 8. Otra alternative es utilizar berenjenas (por ejemplo, cultivar Black Beauty 0 cultivares con sensibilidad equivalente), urucarnente plantas en fase de hoja 2 3 hasta la plena expansion de la tercera hoja verdadera. Se ha observado que los stntomas son menos graves y que se des arrollan mas ientemente en la berenjena. Por tanto, cuanoo sea posible se recomienda utilizar planfulas de lomate. 9.2 Distribuir 100 ~I de extracto de muestra entre las plantas analizadas. 9.2.1 rnocutacton con jeringa Inocurar los tallos de las patatas [usto por encima de los comeoones con una jeringa provlsta de una aguja hipcderml ca (no menos de 23G). Distribulr la rnuestra entre las plantas ananzadas. 9.2.2 Inoculaci6n en est-las Sostenlenoo la planta entre des dedos, apnquese con una plpeta una gota (de unos 5-10 IJI)del precrpneoo en sus pension en el tallo situado enlre los coliledones y la primera hoja. Con un bisturi estern practicar una incision diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 213 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado. Sellar el corte con vaselina esteril utilizando una jerirqa. 9.3 Inocular con la misma tecnlca cinco plantones con una suspension acuosa de 105 a 106 celulas por ml preparada a partir de un cullivo de 48 horas de una cepa biovar 2 virulen ta de R. solanacearum como control posilivo y con tampon de precipitado (apendice 4) como control neqativo. Separar las plantas de control positive y neqativo de las otras para evitar la contaminaci6n cruzada. 9.4 Cultivar las plantas de prueba en instalaciones de cuarentena hasta un maximo de cuatro semanas entre 25 y 30°C con erevaoa humedad relative. reqarootas aoecuaoa mente para evitar que se aneguen 0 se marchiten por defl ciencia hidnca. Para evitar la contaminaci6n se deben incu bar las plantas de control positivo y negativo en bancos cla ramente separados en un invernadero 0 camera de cultivo: en el caso de que se disponga de un espacio reducido, qa rantizar ra esmcta separaci6n entre tratamientos. En el caso de que deban lncubarse juntas plantas para cnsuntas mues tras, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante Pruebas Produccion de pigmento fluorescente . incrusrones de polf-g-hloroxtbutlrato Prueba de la oxidaci6nlfermentaci6n . (OIF) Actividad catalasa . Prueba de oxidasa de Kovac. Reduccion de nitratos . Utilizaci6n de citratos , . Crecimiento a 40 "C . crecimtentc en NaCI at 1 % . Crecimiento en NaCI al 2 % . Actividad de dihidrolasa de arqinina .. Licuefacci6n de la gelatina Hidr61isis del almid6n , Resultado espe rado O+/F • • • • 13174 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 6. Perfiles de acidos grasos (Fatty acid profiling 0 FAP) Hidrollsls de la esculina " , , , , " , , 1 Produccion de levano " 1 4. Prueba PCR 4.1 Preparar una suspension de aproximadamente 106 celulas por mr en agua esteril de grado molecular. 4.2 Calentar 100 ~I de la suspension celular en tubos cerrados en un calentador 0 ar bane maria a 100 "C durante cuatro minutos. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de - 16 a - 24°C haste que sea necesa rio. 5, Prueba FISH 5.1 Preparar una suspension de aproximadamente 106 cennas por ml en agua ultrapura. 5.2 Aplicar el procedimiento FISH (secci6n VIA7) con al menos des oligosondas especntces para R. so/anacea rum(apendice 7). 5.3 La prueba FISH sera positiva st se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo. R. solanacearum se separa en blovares en funcion de la capacidad para utilizar ylo oxidar nee disacaridos y nee hexosas alcoholicas (Hayward, 1964 y Hayward at el. 1990). Los medios nutritivos para la prueba del biovar se describen en el apendice 2. Esta prueba puede efectuarse con exrto inoculando los medics por perforaci6n con cultivos puros de atstaoos de R. so/anacearum e incubando a 28 "C. Sl los medios se distribuyen en placas estenes de cultivo de ceiu las de 96 pocillos (200 1-11 por pocillo) puede observarse en un prezc de 72 horas un cambio de color, del verde oliva at ama rillo, 10 que indica un resultado positivo de la prueba. 7.1 Determinacion de los biovares 6.1 Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Ox.oide) durante 48 horas a 28 "C. 6.2 Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991: Stead, 1992). 6.3 La prueba FAP sera positiva si el perfil del presunto cultivo es identico al del control posifivo. Los acidos grasos cuya presencia es caracteristica son 14:0 30H, 16:0 20H, 16:1 20H y 18:1 20H, y ra ausencia de 16:0 30H es alta mente indicativa de Ralstonia sp. 7. Metccos de caracterfzacton de las cepas Se recomfenda erectuar la caractenzaclon de las cepas con uno de los metooos siguientes para cada nuevo caso de atsramrento de R. soeneceotum. Cuando precede, Inclulr cepas de reterencia conocldas pa ra cada prueba efectuada (vease el apendice 3). EI blovar 2 se otterencta en subtenoupos mediante prue bas adicionales I Biovar ~ (1) Vease Lelliott y Stead (1987) 7.2 Obtenclon de la huella oactnar gen6mica La diterenciacion molecular de las cepas en el complejo de R. so/anacearum puede conseguirse mediante olterentes tecntces. entre las que se Incluyen: , , , , Utilizaci6n de: Mattosa . - • • - • Lactosa - • • - • D (+) Celoblosa. - • • - • Manitol. - - • • • Sorbitol .. - - • • Dulcitol. - - • • Biovar 2A Biovar2A B,ovar 2T (distribuci6n (en Chile y (en areas mundial) Colombia) tropicales) Utilizaci6n de trehalosa . - • • Utilization de meso-inositol , • - • Utilizaci6n de D (-) ribosa. - - • Actividad pectolitica .. baja baja alta Resultado esoe racePruebas I 2, Prueba IF 2.1 Preparar una suspension de aproximadamente 106 celulas por ml en tampon IF (apendice 4). 2.2 Preparar una serte de onuctones a 1/2 de un anti suero adecuado (vease el sitio web: hllp:!/forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). 2,3 Aplicar el procedimiento IF (secclon VIAS). 2.4 La prueba IF sera positiva s! el titulo IF del cultivo es equivalente al del control positive. 3, Prueba ELISA Nota: Si solamente se etectoen dos pruebas de identifi cacron, no debe utilizarse ninguna otra prueba seroloqica edemas de este metodo. 3.1 Preparar una suspension de aproximadamente 10 8 celulas por ml en 1X PBS (apendice 4). 3.2 L1evar a cabo un procedimiento ELISA adecuado con un anticuerpo monoclonal especifico de R. solanacea rum, 3,3 La prueba ELISA sera positiva si la lectura ELISA obtenida del cultivo es como minima la mitad de la obtenida para el control positivo. 4.3 Aplicar los procedimientos peR adecuados para amplificar los amplicones especfficos de R. solanacearum [por ejemplo, Seal et a/. (1993): Pastrik y Males (2000): Pas trik et al. (2002): Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997): Weller er al. (1999)], 4.4 Se loqrara la idennncacion positiva de R. solanacea rum si los amplicones de la PCR son del mismo tamano y tienen los mismos polimorfismos de la longitud del fragmento de resmccron que los de la cepa de control positivo. BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13175 7.2.1 Anafisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restriccion (RFLP) (Cook el 131.,1989). 7.2.2 PCR de secuencla repetitiva utilizando cebadores REP, BOX Y ERIC (Louws eta/., 1995; Smith eta/., 1995), 7.2.3 Anausls de los polimorfismos de 113 longitud del fragmento amplificado (AFLP) (Van der Wolf et 131., 1998). 7,3 Metodos PCR Pueden utilizarse cebadores especificos de peR (Pastrik et 131. 2002; vease el apendice 6) para diferenciar cepas que pertenezcan a 113 division 1 (biovares 3, 4 Y 5) Y 113 division 2 (biovares 1. 2A Y 2T) de R. solanacearum. tal como se define originalmente con el analisis RFLP (Cook et 131.. 1989) Y la secuenctacion de 16S rADN (Taghavi et el. 1996), C. PRUEBA DE CONFIRMAC/6N DE PATOGENIC/ DAD Como ccnnrrnacion final del dlaqnosfico de R. solanacea rum y para la evaluaci6n de la virulencia de cultivos identifi cados como R. so/anacearum debe realizarse 113 prueba de patogenicidad: 1) preparar un lnoculo de aproximadamente 10 6 celulas por ml de cultivos de 24 a 48 horas a partir del aislado que se vaya a someter a prueba y una cepa de control positivo ade cuada de R. solanacearum (por ejemplo. NCPPB 4156 == PO 2762 == CFBP 3857; vease el apendice 3); 2) inocurar entre cinco y cnez tauos de plantulas de to mate 0 berenjena sensibles en la fase de la tercera hoja ver dadera (vease la seccion VIA9); 3) incubar durante un maximo de dos semanas a una temperatura de 25 a 28 "C. con humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el estres provocado por 113 sequia. Con los cultivos puros debe ra obtenerse el marchitamiento tipico en el plazo de 15 oras. Si despues de este periodo no se presentan los stntomas. no podra confirmarse que et cultivo es una forma pat6gena de R. solanacearum; 4) comprobar si se aprecian sintomas de marchitamien to y/o epinastia, clorosis y crecimiento reducido; 5) aislar las plantas slntomaucas separando una sec cion de tallo que este 2 cm por encima del punto de inocula cion. Dilacerar y suspender en un pequerc volurnen de agua destilada estern 0 en tampon fosfato 50 mM {apendice 4). Aislar de 113 suspension mediante dnucion, extendiendo 0 haciendo esmas en un medio adecuado, preferentemente en un medio selectivo (aoerotce 2). incubar entre 48 y 72 horas a 28°C Y examinar la tormaclon de colonies tipicas de R. sotereceensn. Aptmdlce 1 Laboratorios que han participado en 113 optimizacion y 113 validacion de los protocolos Laboretono (1) Agentur fOrGesundheit und Ernahrunqssicherhelt.. DeparternentGewasbescherming Plantedirektoratet,. Central Science Laboratory . Scottish Agricultural Science Agency, Laboratoi-e National de 113 Protectiondes Veqetaux, Unite Bacteriolcqie.."' Laboratoi-e National de 113 Protectiondes Vepetaux, Station de ouarenteme de la Pomme de Terre. Biologische Bundesanstalt . Pflanzenschutzamt Hannover, State Laboratory . Dipartimentodi Scienze e Tecnologie Agroambientali. Regione Veneto Unta Periferlca per i Servizi Fitosanitari ."' NedertandseAigemene Keuringsdienst . Plantenziektenkundige Dienst Direccac-Gerat de Proteccao das Culturas . Centro de Diagn6stico de Aldearrubia ." Institute Valenciano de Investigaciones Agrarias . Swedish University of Agricultural Sciences" (1) Cientificos de contacto: vease el sitio web http://forum.europa.eu.intlPublic/irclsancoIHomelmam. cneeo Vena y Linz Merelbeke Lyngby York Edimburgo Angers Le Rheu Kleinmachnow Hannover Dublin Bolonia Verona Emmeloord Wageningen Lisboa Salamanca Valencia Uppsala Pais Austria Belqica Dinamarca Inglaterra Escocia Francia Francia A1emania Alemania Irtanda ltalia ltalla Palses Bajos Parses Bajos Portugal Espana Espana Suecia 23,0 9 1,0 I Apendlce 2 Medios para el aislamiento y el cultivo de R. solanacearum a) Medios de cultivo en general Agar nutritivo (NA) Agar nutritivo (Difco) Agua oestuaoa Dtsolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutes. Agar de levadura, glucosa,peptona (YPGA) Extracto de levadura (Difco) 5,0 g Bacte-peptona (Difco) 5,0 9 D(+)-glucosa (monohidrato) 10.0 9 Baoto-aqar (Diko) 15,0 9 13176 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 'C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C Yanacir una solucion de c1oruro de 2,3,5 mtenu tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtraci6n, para con seguir una concentracion final de 50 mgll. b) Medios de cultivo selective validados Medio SMSA (Englebrecht, 1994, modiflcado por Elphlns tone er el. 1996) Medio de base casarnlnoacrdos (Difco] 1,0 9 Baoto-peptona (Diko) 10,0 g Glicerol 5,0 ml Bacto-agar (Difco) (vease la nota 2) 15,0 9 Agua destilada 1,0 I Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutos. Enfriar a 50 "C Yartarnr soluciones eetanoar acuosas, esterilizadas por filtraci6n, de los siguientes ingredientes, a fin de obtener las concentraciones finales especificadas: 5mgporl (Sigma P-1004) 600.000 U (aproximadamente 100 mg) pori 1 250 U (aproxim. 25 mg) por I 5mgporl 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por I 50 mg por I 20,0 9 5,0 9 0,5 9 0,25 9 15,0 9 1,0 I 1,0 9 10,0 9 5,0 9 15,0 9 1,0 I 1,0 I Medio de tetrazoiio de Kelman Casarninoacidos (Difco] Bacto-peptona (Difco) Dextrosa Bacto-agar (Diko) Agua destilada Cristal violeta (Sigma) Polimixina-B-Sulfato Bacttracina (Sigma B-0125) Cloranfenicol (Sigma C-3175) Penicilina-G (Sigma P-3032) Cloruro de z.a.s-mtenu tetrazono (Sigma) Agua destilada Agar de sacarosa y peptona (SPA) Sacarosa Bacto-peptona (Difco) K2HP0 4 MgS04.7H20 Bacto-agar (Difco) Agua oestuaoa pH 7,2-7,4 Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutes. Nota: 1. La utilizaci6n de reactivos diferentes de los especifi cados arriba puede afectar al crecimiento de R. so/anacea rum, 2. Puede utilizarse Agar oxolde #1 en lugar de Bacto agar (Difco}. En este caso, et crecimlento de R. so/anacea rum sera mas lento, aunque tarnbren puede reducirse el ere cimiento de saprofitas competidoras. Las colonias tipicas de R. solanacearum pueden necesitar de uno ados dias mas para formarse y la coloraci6n rojiza puede ser mas ligera y oltusa que en Bacto-agar. 3. Si se incrementa la concentraclon de bacltractna a 2 500 U por I pueden reducirse las poblaciones de bacterlas compenooras sin que se vea atectaoo et creclmiento de R. solanacearum, A1macenar lasmediasy las solucionesestarder de antibi6ticos a 4 OC en la oscuridady utilizaren e! plaza de un meso Las piacas deberan carecer de condensacton de auperfl cle antes de su uunzacron. Evitar un secado excesrvo de las placas. Debera efectuarse un control de calidad tras la prepara ci6n de cada nuevo lote de medio mediante siembra de una suspension de un cultivo de referencia de R. so/anacearum (vease el apendice 3) y observaci6n de la formaci6n de colo ntas tipicas despues de mcubacron a 28 "C de dos a cinco cnes. c) Medias de enriquecimiento validados Calda SMSA (Elphinstone et al., 1996) Preparar como para meoto de agar selective SMSA pero omitir Bacto-agar y cloruro de 2,3,5-tetrazolio. Calda Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002) Sacarosa 10 g Peptone proteosa 5 9 KzHP04 0,5 g MgS04 0,25 9 NaNO) 0,25 9 Agua destilada 1 I Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos y enfriar a 50 "C. Anadtr sonctones estanoar de anubtoncos como para e! caldo SMSA. Apendice 3 A. Material de control normalizado comerclatmente dis ponible a) Ais/adas bacterianos Se recomiendan los siguientes alsraoos bacterianos para su uuuzacon como material normalizado de referencia, bien como controles positives (cuadro 1) 0 durante la optlmizacion de las pruebas para evitar reacciones cruzadas (cuadro 2). Todas las cepas estan comercializadas por: 1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria {NCPPBj, Central Science Laboratory, York, Reino umoo. 2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Paises Bajos. 3, Collection Francaise de Bacteries Ptrytopathoqenes (CFBP) -INRA Station Phytobacterioloqie, Angers, Francia, BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 Cuadro 1. Panel de referencia SMT de aislados de R. solanacearum 13177 C6digo NCPPB SMT# ouoe ccocos Pais de origen Bicvar NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egipto 2 NCPPB 4154 10 CFBP 4585,550, EURS21 Turquia 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Inglaterra 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Chipre 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Suecia 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601,502, EURS55 Belqica 2 NCPPB 4156 (*) 71(') PD 2762, CFBP 3857 Palses Bajos 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Francia 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066 Portugal 2 NCPPB 4160 69 IVIA-1632-2 Espana 2 NCPPB 4161 76 B3B Alemania 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 Estados Unidos 1 NCPPB 3967 42 CFBP4610, R285, GONg7 Costa Rica 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R3031571, CIP310, SEQ205 Colombia 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brasil 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R2761355, CIP72, SEQ225 Peru 3 NCPPB 3997 47 CFBP4614, R2801363, CIP49, HAY0131a Australia 3 NCPPB 4029 48 CFBP4615, R2971349, CIP121, CMlb2861 Sri Lanka 4 NCPPB 4005 49 CFBP4616, R470 Filipinas 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 China 5 (') Ullllzar como cepa normallzada de referencla de R. solanacearum b,ovar 2 (raza 3). Nota: La autenticidad de las cepas mencionadas solamente puede garantizarse Cuadra 2. Panel de referencia SMT de bacterias seroroqica 0 penencarnente relacionadas para su unuzacion en la optimizaci6n de las pruebas de detecci6n COdigo NCPPB NCPPB 4162 NCPPB 4163 NCPPB 4164 NCPPB 4165 NCPPB 4166 NCPPB 4167 NCPPB 1127 NCPPB 353 NCPPB 945 NCPPB 3708 NCPPB 3590 NCPPB 3726 NCPPB 4168 NCPPB 4169 NCPPB 4170 NCPPB 4171 SMT# 01ro c6digo Idenlificaci6n 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa (1) 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. Marginalis (1) CFBP 2227 Burkholderia cececse (2) CFBP 2459 Ralstonia pickettii (2) 58 CFBP 3567 Ralstonia pickettii (1) CSL Pr1150 60 CFBP 4618 Raistonia sp. (1) PD 2778 53 CFBP 3575 Burkholderia andrapogonis (1) 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli (1) 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1) 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1) 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1) 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) 61 CFBP 4619 Enterobacter sp. (1) IPO S339 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1) 63 CFBP 4621 ccnrocectrum anthropi (1) (2) IPO S306 64 CFBP 4622 Curtobacterium sp. (1) (2) IPQ 1693 13178 Martes 27 rnarzo 2007 C6dlgo NCPPB SMT# Otro c6digo Identificaci6n NCPPB 4172 65 IPO 1 696 a Pseudomonas sp. (1) NCPPB 4173 - PO 2318 Aureobaclerium sp. (2) NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. (1) (2) BOE num. 74 (1) Cepa que puede presentar reacci6n cruzada en pruebas serol6glcas (IF ylo ELISA) con antisueros policlonales (2) Cepa de la que puede amplificarse el producto de la PCR en algunos laboratorios de un tamano simIlar al esperado utilizando cebadores especificos OLl 1 Y Y-2 (vease el apEmdice 6), (3) Probablemente tendril reacciones cruzadas en la mayor parte de las pruebas, pero solamente se conoce su aparici6n en bananas en Indonesia, 4,26 9 2,72 9 1,00 I b) Material de control nonnaiizado comercialmente disponible EI siguiente material de control normalizado puede obtenerse a partir de un cultivo NCPPB: Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubercuros de patata sanos como control negativo para todas las pruebas. Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tuoerculos de patata sanos que contengan de 103 a 10· y 10· a 10b cetulas de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo. cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controles positives para pruebas serol6gicas y PCR. Teniendo en cuenta que 113 viabilidad de las celulas se ve afectada durante la criodesecaci6n, no son adecuados como controles normalizados para pruebas de aislamiento 0 de bioensayo. Utilizar suspenslones fijadas con formalina de R. solanacearum biovar 2 (cepa NCPPB 4156 = PO 2762 = CFBP 3857) de 10 6 ceiuas por ml como controles positivos para pruebas serol6gicas. B, Preparaci6n de controles positivos y negativos Preparar un cultivo de 48 horas de una cepa virulenta de R. solanacearum raza 3/biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PO 2762 " CFBP 3857) en medio base SMSA y suspender en tamp6n fosfato 10 mM para obtener una densidad celular de aproxlmadarnente 2 x 103 cfu por ml. Esto se obtlene norrnatmente mediante una suspension ligeramente turbia equivalente a una densidad 6ptica de 0,15 a 600 nm. Separar las cunas basales de 200 fuberculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de R. scleneceetum, Procesar las curtas basales como es habitual y resuspender et precipitado en 10 mi. Preparar diez microviales esternes de 1,5 ml con 900 u! del precipitado resuspendido. Transterir 100 fJl de la suspension de R. solanacearum al primer rnicrovial. Homogeneizar por aqitacion. Establecer niveles decimales de contaminaci6n reauzanoo nuevas ouuctones en los cinco rmcrovlales siguientes. Los sets mlcroviales contaminados se unnzaran como controles positives. Los cuatro microviales no contaminados se utillzaran como connotes neqativos. Etiquetar los microviales como corresponda. Preparar alfcuotas de 100 fJl en microviales esteriles de 1,5 ml para obtener de este modo nueve replicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de - 16 a 24 'C hasta que se vayan a utilizar. La presencia y ra cuantificaci6n de R. solanacearum en las muestras de control debera confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF. Para 113 prueba PCR, extraer AON de las muestras de control positivas y negativas para cada sene de muestras de ensayo. Para las pruebas IF y FISH, realizer ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada sene de muestras de ensayo. En las pruebas IF, FISH Y PCR, debe detectarse R. solanacearum en al menos 106 y 10 4 cetulasrrnl de los connotes positives y en ninguno de los connotes negativos. Apendice 4 Tampones para procedimientos de ensayo GENERAL: Los tampones esterilizados que no se hayan abierto pueden almacenarse hasta un eno. 1 Tampones para el procedimiento de extraccton 1.1 Tampon de exfracclon (tampon fosfato 50 mM, pH 7,0) Este tamp6n se utiliza para la extracci6n de la bacteria del tejido de las plantas mediante la homogeneizaci6n 0 la agitaci6n. NazHP04 (anhidro) KH2P0 4 Agua destilada Oisolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 "C durante 15 minutos. Los siguientes componentes adicionales pueden resunar utnes: Copos de Lubrol Compuesto DC smcona antiespumante Pirofosfato tetras6dico . Polivinilpirrolidona-40000 (PVP-40) ." n Para su util,zac,on en el metodo de extracclon por homogenelzaclon, Fin"lid"d Defloculante (0).. Antiespumante (0)" Antioxidante . Unir los inhibidores PCR ceotooa (por I) 0,5 9 1,0 ml 1,0 9 50 9 BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13179 1.2 Tamp6n de precipitado (tamp6n fosfato 10 mM, pH 7,2) Tween 20 al 10 % Agua destilada 5 ml 895ml 100 ml donee: 3.5 Sclucion de susfrato rosratasa alcetlna, pH 9,8 Dlsclver los ingredientes y comprobar e! pH. 50 ml 5 ml 950ml 100 ml 900ml 1,59 9 2,93 9 1000ml 97 mt 800ml 10,Oml 2,0 9 0,5ml 0,5 9 100ml Dietanolamina Agua destilada Na2CO J NaHGO] Agua destilada 4.3 PBS-Tween 10X PBS Tween 20 at 10 % Agua destilada 4.4 Tamp6n de sustrato. pH 9,8 Dletanolarntna Agua destilada 4.2 Tampon fosfato salina (PBS), 10X pH 7,2-7,4 NaCI 80,0 9 NaH2P04.2HzO 4,0 9 Na2HP04.12H 20 27,0 9 Agua destilada 1000 ml Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCI concentrado. Ap{mdice 5 Determinaci6n del nivel de contemmaclon en las pruebas IF y FISH 1. Gontar el oumerc medio de celulas fluorescentes 11 picas por campo de vision (e). 2. Cafcular et numero de celufas tluorescentes tipicas por pocillo del portaobjetos del microscopio (C): C=cxS/s 3.4 Tamp6n de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momenta de su utilizaci6n) PBS 10X Polivinil pirrolidona-44000 (PVP-44) Tween 20 al 10 % Leche en polvo Agua destilada completar haste Mezclar y ajustar et pH a 9,8 con HCI concentrado. Completar haste 1 Iitro con agua destilada. At'iadir 0,2 9 de MgCI2· Disolver dos pastil las de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de soluci6n. 4 Tampones para la prueba ELlSA-DASI 4.1 Tampon de tapizado. pH 9,6 3.2 Tamp6n fosfato salina (PBS), 10X pH 7,4 NaCI 80,0 9 KH2P04 2,0 9 Na2HP04.12H20 29,0 9 KGI 2,Og Agua oestuaoa 1,0 I 3.3 PBS-Tween PBS 10X Este tamp6n se utiliza para la resuspensi6n y la diluci6n de extractos de cunas basales de tuoerculos de patata tras la concentracion en un preeipitado mediante centrifugaci6n. Na2HP04.12HzO 2,7 9 NaHzP04.2H20 0,4 9 Agua destilada 1,0 I Dlsolver los ingredientes, verificar e! pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 mrnutos. 2. Tampones para la prueba IF 2.1 Tamp6n IF [tamp6n fosfato salina (PBS) 10 mM, pH 7,2] Este tamp6n se utilize para la diluci6n de anticuerpos. Na2HP04.12H20 2,7 9 NaH2P04.2H20 0,4 9 NaCI 8,0 9 Agua destilada 1,0 I Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 mrnutos. 2.2 Tampon IF-Tween Este tampon se utiliza para tavar los portaobjetos. Afiadir 0,1 % de Tween 20 al tampon IF. 2.3 Soluci6n de plicerol con tamp6n de fosfato, pH 7,6 Este tampon se utiliza como fluido de montaje en los po cillos de los portaobjetos de IF para aumentar la nuorescen cia. Na2HP04.12H20 3,2 9 NaH2P04.2H20 0,15 9 oucercr 50 ml Agua oestuaoa 100 ml En el mercado pueden eneontrarse soluciones de montaje que protegen la tluorescencia. como, por ejemplo. Vectas hield® (Vector Laboratories) 0 Gitifluor® (Leica). 3 Tampones para la prueba ELlSA-indirecto 3.1 Tampon fuerza doble para tapizado, pH 9,6 Na2COJ 6,36 9 NaHC03 11,72 9 Agua destilada 1,00 I Disolver los ingredientes, verificar e! pH y esteruraar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Puede aFiadirse como antioxidante sulfito de sodio (0,2 %) si es necesario para evitar la acumulaci6n de compuestos aromancos oxidados. 13180 Martes 27 rnarzo 2007 BOE num. 74 S <superticie del cocmc del portaobjetos multiple s " superficie del campo del objetivo s " TTi2/4G2K2 donde: i " coeficiente de campo (varia de 8 a 24 dependiendo del tipo ocular) K" coeficiente del tuba (1 0 1,25) G" aumentos del objetivo (100x, 40>:., etc.) 3. Calcular el numero de celuras fluorescentes tlpicas por ml de precipitado resuspendido (N): N"C x1000/yxF donde: y" volumen de precipitado resuspendido en cadapocillo F "factor de diluci6n del precipitado resuspendido Apfmdice 6 Prctocotos y reacnvos PCR validados Nota: Las pruebas preliminares deberan permitir la de tecci6n reproducible de al menos 103 a 104 celufas de R. solanacearum por ml de extracto de mueslra. Por otra parte, las pruebas preliminares no deben pro porcronar resultados positives tarsos con respecto a un con junto de cepas baelerianas seleeeionadas (vease el epenorce 3). 1. Protocolo PGR de Seal er el. (1993) 1.1 Cebadores del ollqonucleotido Cebador directo OLl-1 5'-GGG GGT AGC TTG CTA GCT GCG-3' Cebaoor reverse Y-2 5'-GCG AGT GCT GGC TGC GGT AGG AGT-3' Tamano esperado del amplic6n de los moldes de ADN de R. soteneceemm « 288 pb. 1.2 Mezera para la reaccion PCR Reactivo Cant,dad por reacci6n Concentraci6n final Agua ultrapura estern . 17,651-11 10x tamp6n PGR C) (15 mM MgCI,) 2,51-11 1x (1,5 mM MgCI2) Mezcla dNTP (20 mM) . 0,251-11 0,2mM Cebador OLl-1 (20 I-IM). 1,251-11 1,M Cebador Y-2 (20 I-IM) . 1,251-11 1,M Poumerasa Taq (5 UII-II) (') ." 0,1 1-11 0,5 U Volumen de muestra .. 2,01-11 Volumen total .. 251-11 (1) EI metodo se valld6 ulillzando pollmerasa Taq de Perkin Elmer (AmpIITaq) y Gibco BRL 1.3 Condiciones de reacclon PCR Aplicar el siguiente programa: 1 clclo de: i) 2 minutos a 96 "C (desnaluralizaci6n del molde de ADN) 35 ciclos de: Ii) 20 segundos a 94 "C (desnaturalizaci6n del molde de ADN) iii) 20 segundos a 68°C (hibridacion de los cebadores) lv] 30 segundos a 72 "C (extension de la ccpia] 1 cicio de: v) 10 minutes a 72°C (extension final) vi) mantener a 4 "G. Nota: Este programa se optimlzo para utilizarlo con un termoctcraoor Perkin Elmer 9600. Puede ser precrso modifi 2.2 Mezera para la reaccion PCR car la duracion de los cielos ii), iii) y IV) para su utilizaci6n con otros modelos. 1.4 Anansrs de la enzima de restrtccrcn del amplicon Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produeen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restriccion ceractertstico con ra enzima Ava II fras ra incubacion a 37 'C. 2 Protocolo PCR de Pastrik y Maiss (2000) 2.1 Cebadores del onqonucreouoo Cebador direelo Ps-1 5'- agl ega aeg gea geg ggg g 3' Cebador reverse Ps-2 5'- ggg gat IIc aca tcg gte IIg ca -3' remere esperado del amplic6n de los moroes de ADN de R. soteneceetum » 553 pb. Reactivo Agua ultrapura esteru.. 1Oxtamp6n PCR C) , Cantidad por reacci6n 16,0251-11 2,51-11 Concentraci6n final BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13181 eeecuvo ceonoec per reaccon Ccncentraclon final BSA (fracci6n V) (10 %)., 0,25 f.l1 I 0,1 % Mezerad-nTP (20 mM) 0,125 f.l1 0,1 mM Cebador Ps-1 (10 f.lM) 0,5 f.l1 0,2 f.lM Cebador Ps-2 (10 IJM) 0,5 IJI 0,21JM Polimerasa Taq (5 U/f.lI) (1) 0,11J1 0,5 U Volumen de muestra . 5,0 f.l1 vorumen total. 25,0 IJI (1) Los metooos se vauoercn uuezenoo polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL. Nota: Originatmente optimizado para termociclador MJ Research PTe 200 con polimerasa Gibco Taq. Tamb,en pueden utilizarse Perkin Elmer AmpliTaq y tampon con las mismas concentraciones. 2.3 Condiciones de reacci6n PCR Aplicar el slquiente programa: 1 cicio de: i] 5 minutos a 95°C (desnaturalizaci6n del molde de ADN) 35 clclos de: ii) 30 segundos a 95 "C (desnaturahzacion del molde de ADN) iii) 30 segundos a 68°C (hibridaci6n de los cebadores) iv) 45 segundos a 72°C (extension de la copia) 1 ciclo de: v) 5 minutos a 72°C (extension final) vi) mantener a 4°C. Nota: Este programa esta oplimizado para utilizarlo con un lermociclador MJ Research PTC 200, Puede ser preciso monncar la duraclon de los ciclos il), iii) Y lv] para su unnza ci6n con otros mooeros. 2.4 Ananers de la enzima de restnccion del amplic6n Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restncclon caractenstlco con la enzima Taq I fras ra incubaci6n a 65°C durante 30 mmutos. Los fragmen tos de restriccion obtenicos a partir del fragmento especifico de R. solanacearum tienen un tarnano de 457 pb Y 96 pb. 3. Protocolo PCR multiplex con control PCR Interne (Pastrik et et.. 2002) 3.1 Cebadores del oliqonucleotido Cebador directo RS-1-F 5'- ACT MC GM GCA GAG ATG CAT TA -3' Cebador reverse RS-1-R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3' Cebador directo NS-5-F 5'- MC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3' Cebador reverse NS-6-R 5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3' Tamarto esperado del amplic6n de los moroes de ADN de R. so/anacearum == 718 pb (conjunto de cebadores RS). Tamarto esperado del amplic6n de control PCR Interne 18S rARN == 310 pb (conjunto de cebadcres NS). 32 Mezera para la reacci6n PCR Reactivo Cantidad por reaccion Concentracion final Agua ultrapure esteril ... 12,625 IJI 10x tampon PCR (1) (15 mM MgCI2) 2,5 IJI 1x (1,5 mM MgCI2) BSA (fraccion V) (10 %)" 0,251J1 0,1 % Mezcla d-nTP (20 mM) 0,125 IJI 0,1 mM Cebador RS-1-F (10 f.lM) . 2,0 f.l1 0,8 f.lM Cebador RS-1-R (10 IJM). 2,0 IJI O,8IJM Cebador NS-5-F (10 IJM) e) 0,15 IJI 0,061JM Cebador NS-6-R (10 IJM) (2)." 0,15 IJI 0,061JM Polimerasa Taq (5 U/f.lI) (1) 0,2 f.l1 1,0 U Volumen de muestra . 5,0 f.l1 vorumen total 25,0 IJI (1) Los mlolodos se vatidaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmptiTaq) y Gibco BRL, (2) La concentraclon de los cebaoores NS-5-F y NS-6-R se optimize para ta extracccn de cotes basales de patara utihzando et metoco de homogeneizacion y purificacien del ADN de acuerdo con Pastnk (2000) (vease la secci6n VLA.6.1.a). Sera necesano proceder a la reopt,mizaci6n de las concentraciones de reactivos si se utilizan la extracci6n par ag,taci6n u otros metodos de aislamientodet ADN. 13182 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 3.3 Condiciones de reaccon PCR Aplicar el siguiente programa: 1 ciclo de: i) 5 minutos a 95°C (oesnaturanzacron del molde de ADN) 35 clcros de: Ii) 30 segundos a 95°C [desnafurallzaclon del molde de ADN) iii) 30 segundos a 58"C (hlbridacion de los cebadores) IV) 45 segundos a 72°C (extension de la copia) 1 cicio de: v) 5 minutos a 72 °C (extension final) vi) mantener a 4°C. Nota: Este programa esta optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200, Puede ser preciso modificar la duraci6n de los ciclos ii), iii) Y Iv) para su utiliza cion con otros mooeros. 3.4 Ananers de la enzima de restnccion del ampncon Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de ra longitud del fragmento de restncclon caractertsnco con la enzima 8sm I 0 un Isoschizomere (por ejernplo, Mva 1269 I) tras la Incuba cion a 65 'C durante 30 minutos. 4. Protocolo PCR especifico del biovar de R. solana cearum (Pastrik et ai, 2001) 4.1 Gebadores del oligonucleotido Cebador directo Rs-1-F 5'- ACT MC GM GCA GAG ATG CAT TA -3' Gebador reverse Rs-1-R 5'- GCG AGT CAC GGC AGA GAC T -3' Cebador reverse Rs-3-R 5'- HC ACG GCA AGA lCG CTC -3' Tamarto esperado del amplicon de los moldes de ADN de R. solanacearum: con Rs-1-FfRs-1-R == 718 pb con Rs-1-FfRs-3-R = 716 pb. 4.2 Mezera para la reaccton PCR a) Biovar 1/2 especifico PCR Reactlvo Cantldad por reaccion Concentraci6n final Agua ultrapure esteril ... 12,9251J1 10X tampon PCR (1) 2,51J1 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (fraccion V) (10 %) .. 0,251J1 0,1 % Mezda d-NTP (20 mM) . 0,1251-11 0,1 mM Cebador Rs-1-F (10 IJM). 2,1 0,81JM Cebador Rs-1-R (10 IJM) . 2,1 0,81JM Polimerasa Taq (5 U/IJI) (') . 0,21J1 1 U Volumen de muestra .. 5,0 IJI vorumen total. 25,01-11 (1) Los melodos se validaron utilizando polimerase Teq de Perkin Elmer (AmpliTeqj y Gibeo BRL, b) Biovar 3/4/5 especifico PCR Reactlvo Cantldad por reacci6n Concentracion final Agua ultrapura esteri!.. 14,9251-11 10X tampon PCR (1) 2,51J1 1x (1,5 mM MgCI 2 ) BSA (trsccron V) (10 %) .. 0,251J1 0,1 % Mezera dNTP (20 mM) , . 0,1251J1 0,1 mM Cebador Rs-1-F (10 IJM). 1 " O,4I-1 M Cebador Rs-3-R (10 IJM) 1 " 0,41JM Polimerasa Taq (5 U/I-II) (1) 0,21J1 1 U Volumen de muestra .. 5,0 IJI vorumen totat ... 25,01-11 (1) Los metooos se vauoercn uuezenoo polimerase Taq de Perkin Elmer (AmpliTeql y once BRL, BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13183 0,01 % 30% 5 ngliJl 5 ng/iJi 4.3 Condiciones de reacclon PCR Aplicar el siguiente programa a las reacciones especlfi cas de biovar 112 y biovar 314/5: 1 clclo de: i) 5 rmnutos a 95 "C (desnaturahzacion del molde de AON) 35 ciclos de: Ii) 30 segundos a 95 "C (oesnaturahzaclon del molde de AON) iii) 30 segundos a 58°C (hibridacion de los cebadores) Iv) 45 segundos a 72 "C (extensi6n de la copia) 1 cicio de: v) 5 minutes a 72 "C (extensi6n final) vi) mantener a 4°C. Nota: Este programa se optimize para utilizarlo con un termoctcreoor MJ Research PTC 200, Puede ser precrso modlflcar la duraclon de los clclos ii}, iii) Y iv) para su utiliza cion con otros mooeros. 4.4 Anansrs de la enzima de restrlcclon del arnpucon Los prcouctos PCR amplificados a partir de ADN de R. solaneceerum utilizando cebadores Rs-1-F y Rs-1-R produ cen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restric cion caracterrsuco con ra enzima Bsm I 0 un /soschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubaci6n a 65"C durante 30 mrnutos. Los productosPCR arnpuuceoos a partir de ADN de R. so/anacearum utlflzando los cebadores Rs-1-F y Rs-3 R no poseen sitios de restricci6n. 5. Preparacion deltampon de carga 5.1 Azul de bromofenol (soluci6n eetanoar al10 %) Azul de bromofenol 5 g Agua bidestilada 50 ml 5.2 Tampon de carga Glicerol (86 %) 3,5 ml Azul de bromofenol (5,1) 300 iJl Agua bidestilada 6,2 ml 6. lOX tampon de tris acetato EOTA (TAE), pH 8,0 Tampon tris 48,40 9 Acido acetico glacial 11,42 ml EDTA (sal dlsodica] 3,72 g Agua destilada 1,00 I Oiluir a 1X antes de unnzano. Se encuentra tamblen disponible en et mercaoo (por ejemplo. Invitrogen 0 equivalente}. Aceratce 7 Reactlvos validados para la prueba FISH 1. Oligosondas Sonda especmce para R. solanacearum OLl-1-CY3: 5'- GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3' Sonda eubacteriana no especlfica EUB-338-FITC: 5'- GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3' 2. Soluclon fijadora jAOVERTENC/AI LA SOLUC/ON F/JAOORA CONT/ENE PARAFORMALDEHioo QUE ES TaX/CO. UTlLlZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOM/ENOA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES, i] Calentar 9 ml de agua de grado molecular, por ejem pro agua ultrapure. a 60 "C aproximadamente y arecnr 0,4 g de paraformaldehido. EI paraformaldehido se disuelve cuan do se anaden 5 gotas de IN NaOH y se remueve con un agitador maqnetico. ii] Ajustar el pH a 7,0 mediante la adicion de 1 mt de tampon de fosfato de concentraclon 0,01 My 5 gotas de 1N HCI. vermcar e! pH con bandas lndlcadoras y ejustar s! fuese necesano con HCI 0 NaOH. jADVERTENC/AI NO UTlLlZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLVC/ONES QUE CONTEN GAN PARAFORMALDEHfDO. iii) Filtrar la soluci6n con un filtro de membrana de 0,22 IJmy mantener Hbre de polvo a 4"C hasta nueva uunzecton. 3. 3X Hybrnix NaCI 2,7 M Tris-HCI 60 mM (pH 7,4) EOTA (filtro esterilizado con autoclave) 15 mM Diluir a 1X como se precisa. 4. Solucion de tubridacion 1X Hybmix Dodecilsultato s6dico (SOS) Formamida Sonda EUB 338 Sonda OLl-1 0 OLl-2 Preparar las canuoaoes de solucion de tubrldacion de acueroo con los calculos de la tabla 1. Para cada portaobje tos (que contenga dos muestras distintas por duplicado) se precisan 90 1-11 de sciucton de hibrldacion. IMPORTANTE: DEBE TENERSE EN CVENTA QUE LA FORMAM/DA ES MUY TOX/CA, POR La QUE DEBEN UT/LiZARSE GUAN TES Y TOMARSE LAS PRECAUC/ONES DE SEGUR/DAD NECESARIAS, Tabla 1: Cantidades sugeridas para la preparecron de la rnezcta de hibridaclon Numero de portaobJetos , , e e io Agua uttrapura estern .. 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0 3X hybmix . 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0 SOSaI1%. 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0 Formamida ... 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0 Sonda EUB 338 (100 ngllJl) . 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 13184 Numero de portaobietos Martes 27 rnarzo 2007 , BOE num. 74 Sanda OLl-1 u OLl-2 (100 n9/1.11) Volumen total (1-11) 4,5 90,0 18,0 360,0 27,0 540,0 36,0 720,0 45.0 900,0 Nola; Almacenar todas las soluclones que contengan oligosondas fotosenslbles en la oscuridad a 20 °c, Proteger de la luz del solo eleclrica direcla durante su ulilizaci6n. Apendice 8 Condiciones de cultivo para el tomate y la berenjena Sembrar semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) a berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semmes. Trasplantar las plantulas con los cotiledones compretarnente ablertos (10 a 14 dias) en compost pasteuri zaoo de tlesto. Las berenjenas 0 tomates deben cultivarse en un inver nadero que cumpla las siguientes condiciones medioambien tales antes de la inoculaci6n: Duraci6n diurna: 14 horas 0 ora natural si es de mayor duraci6n Temperatura: diurna: 21 a 24 "C nocturna:14 a 18°C Variedad de tomate sensible: 'Moneymaker' Variedad de berenjena sensible:'Black Beauty' Proveedores: vease el sno web: htIp:llforum.europa.eu.int/ PubliclirdsancolHome/main, REFERENCIAS 1 Amann, R.I., L Krumholz and D.A, Stahl. 1990. Fluo rescent-oligonucleotide probing of whole cells for determina tive, phylogenetic and environmental studies in microbiology, J, Bacterial. 172: 762-770. 2. Anon, 1998, Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ra/stonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et a/. Official Journal of the European Communities L235, 1-39, 3. Boudazin, G., A.C, Le Raux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralsto nia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. 4, Caruso, P" corns. M.T., Cambra, M., Palomo, J.L, Collar, J and Lopez, M.M, 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive De tection of Raistonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers, Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634 3638. 5, Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L 1989. Genetic diversity of Pseudomonas so/anacearum: detection of restric tion fragment length polymorph isms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121 5, Tampon fosfato 0,1 M, pH 7,0 Na2HPO. KH2P04 Agua destilada Disolver los ingredientes, verificar el autoclave a 121°C durante 15 minutos. 8,52 g 5,44g 1,00 I pH Y esterilizar en 6. Elphinstone. J.G., Hennessy, J., Wilson, J-K. and Stead, DE 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia so lanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663 678. 7, Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi selective medium for the isolation and quantification of Pseu domonas soianacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricul tural Research, Canberra, Australia, 8. Hayward, AC. 1964. Characteristics of Pseudomo nas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265 277. 9. Hayward, A.C., EI-Nashaar, H.M" Nydegger, U. and De Lindo, L 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriol ogy 69; 269-280. 10, Ito, S" Y. 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A novel method for development of species and strain-specific DNA BOE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13185 probes and PCR primers for identifying Burkholderia solana cearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Bioi. Biotechnol. 5; 19-33. 20, Pastrik, K.H. and Maiss, E, 2000. Detection of R. so lanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. 21 Pastrik, K.H" Elphinstone, J,G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralston!a so/anacearum by multiplex peR amplification of 16S-23S ribosomal inter genic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. 22, Robinson-Smith, A" Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudo monassolanacearum, the causative agent of bacterial wilt. 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En cada caso de foco sospechoso para el que se haya realizado una 0 varias pruebas de selecclon con resul tados positives de acuerdo con los rnetodos establecidos en et anexo II para e! material vegetal enumerado y para todos los otros casos, y se espere recibir confirmaci6n 0 retutacton por aptloaclon de los citados rnetoocs, se debora proceder a la retenci6n y adecuada conservaci6n, hasta completar los metooos mencionados, de: todos los tuberculos de los que se hayan obtenido muestras y, siempre que sea posible, todas las plantas de las que se hayan obtenido rnuestras, cualquier extracto sobrante y cualquier material adi cional que se haya preparado para la prueba 0 pruebas de selecci6n, como por ejemplo placas de inmunofluorescencia, y toda la documentaclon pertinente. La retencion de los tuberculos permitira que se puedan llevar a cabo pruebas de variedades cuando se estime opor tcno. 2. En el caso de confirmaci6n de la presencia del orga nismo, se procedera a la retenci6n y adecuada conservaci6n haste un mes oespues, como minimo, en virtud del procedi mlento establecido en et articulo 6, apartado 2: del material especificado en el punto 1, Y de una muestra de las berenjenas 0 los tomates in fectados inoculados con extracto de fubercuto 0 de planta, cuando sea adecuado, y del cultivo aislado del orpanismo. ANEXO IV Elementos que deben tenerse en cuenta para la determi naci6n de la probable contaminaci6n Los elementos de ra investigaci6n que dispone el articulo 6, apartado 1, tetra a), incise i}, seran, cuando proceda, los stqutentes: i) lugares de producci6n: en los que se esten cultivando 0 se hayan cultivado patatas que esten relacionadas cl6nicamente con aquellas en las que se haya comprobado la infecci6n por el organismo, en los que se esten cultivando 0 se hayan cultivado tomates que procedan de las mismas fuentes que aquellos en los que se haya comprobado la infecci6n por el organis m'. en los que se esten cultivando 0 se hayan cultivado patatas 0 tomates que se hayan puesto bajo control oficial por sospecharse la presencia del organismo, en los que se esten cultivando 0 se hayan cultivado patatas que esten relaclonadas clcnicamente con las que hayan sido cultivadas en lugares de producci6n de los que se sospeche la infecci6n por el organismo, en los que se cultiven patatas 0 tomates y que esten localizados en las proximidades de los lugares de producci6n infectados, incluidos aquellos en los que se compartan equi pos e instatactones de produccion directamente 0 por inter venci6n de un contransta cornun. en los que se utilicen para las labores de riego 0 ro ciamiento aguas de superficie de cualquier fuente en la que se haya confirmado 0 de la que se sospecbe la infecci6n por el organismo, 13186 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 en los que se uuucen para las rabores de riego 0 ro ciamiento aguas de superficie de una fuente explotada en comun con lugares de proouccton en los que se haya confir mado 0 de los que se sospecbe la lnteccion por et organis mo, que esten 0 hayan side anegados con aguas de su perficie en las que se haya confirmado 0 de las que se sos peche la infecci6n por el organismo, y Ii) las aquas de superficie que se utilicen para el riego 0 rociamiento, 0 para la aneqacion, de un campo 0 campos 0 de un lugar 0 lugares de producclon en los que se haya con firmado la infecci6n ANEXQ V Medidas bajo control oficial 1 AI determinar, con arreglo al articulo 6, apartaoo 1, letra a), inciso iii), y al articulo 6, apartado 1, tetra c), Incise iii), el alcance de la contamlnacron probable, se incluiran los elementos siguientes: et material vegetal indicado obtenido en un lugar de producclon que haya sido decfarado contaminaoo en virtud del articulo 6, eparteoo 1, tetra a), lnclso Ii), el lugar 0 lugares de producci6n que tengan una re lacion de produocion con el material vegetal indicado que haya sido declarado contaminado en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), incise Ii), incluidos aquellos lugares que compartan equipos e lnstaraclones de procuccion directa mente 0 par mtervenclon de un contransta cornun. et material vegetal indicado que se haya producldc en ellugar 0 lugares de producclcn contemplados en el guion anterior 0 que estuviera presente en tales lugares durante el tiempo en que el material vegetal indicado declarado conta minado en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), inciso Ii), se hanara presente en elluqar de produccicn mencionado en el primer guion, las mstataciones que hayan mernpuraoo et material vegetal indicado procedente de los lugares de prooucclon a los que se refieren los guiones anteriores, cualquier maquinaria, vehiculo, buque, amacen 0 unidades de estos y cualesquiera otros objetos. incluido el material de embalaje, que puedan haber estado en contacto con el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del articulo 6, apartado 1, tetra a), lnclso Ii), cualquier material vegetal indicado que haya sldo almacenado 0 haya estaoo en contacto con cualquiera de las estructuras y los objetos mencionados en el guion anterior antes de la limpieza y desinteccicn de estos, como resultado de la investigaci6n y de los analisis contemplados en et articulo 6, apartado 1, tetra a), lnclso i), en e! caso de las patatas. equeuos tuberculos 0 plantas que tengan una relacion clonal fratema 0 parental y, en e! caso del tomate, aquellas plantas que procedan de las mismas fuentes que el material vegetal indicado declarado contami nado en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), inciso Ii), y para las cuales, aunque las pruebas de detecci6n del orga nismo hayan side negativas, parezca probable la contamina cion a traves de un vinculo clonal. Puede erectuarse una prueba de variedades para verificar la identidad de los tuber culos 0 plantas contaminados que eaten relacionados cl6ni camente, el lugar 0 lugares de producci6n del material vegetal indicado a que se refiere el guion anterior, el lugar 0 lugares de procuccion del material vegetal indicado en los que se utilicen para las labores de riego 0 rociamiento aquas que hayan side declaradas contaminadas en virtud del articulo 6, eparteoo 1, tetra c), Inclso Ii), el material vegetal indicado producido en campos anegados con aguas de superficie en las que se haya con firmado la contaminaci6n. 2. Para la determinacion de la posible propagaci6n a la que se refieren el articulo 6, apartado 1, tetra a), inciso Iv), y el articulo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), oeberan tenerse en cuenta los elementos siguientes: i) en los casos previstos en el articulo 6, apartedo 1, letra a), inciso Iv): la proximidad de otros lugares de producci6n en los que se cultive el material vegetal indicado, la proouccron y utilizaci6n comunes de existencias de patatas de siernbra, los lugares de proouccron en los que se utilicen aguas de superficie para e! riego 0 roclamfento del material vegetal indicado cuando exista 0 haya existido el riesgo de escorrentra, 0 de anegamiento, de aguas superflciales pro cedentes de un lugar 0 lugares de produccion que hayan side decfarados contaminados en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), inciso Ii). Ii) en los casos en que se hayan declarado contaminadas aguas de superficie en virtud del articulo 6, apartado 1, letra c), inciso Ii): el tuqar 0 lugares productores del material vegetal lndicado contiguos a las aguas superflciales oectaraoas con taminadas, 0 que corran el riesgo de ser anegados por estes aguas, cualquier fuente de riego separada que se comuni que de alguna forma con las aguas superflciales declaradas contaminadas, masas de agua conectadas con et agua superficial declarada contaminada, teniendo en cuenta: • la direcci6n y el nivel de flujo del agua declarada con taminada, • la presencia de scranaceas silvestres huesped. 3. La notificaci6n a la que se refiere el articulo 6, apar tado 2, oebera efectuarse de manera inmediata una vez que la pre sencia del arganismo haya sloe confirmada por las pruebas de laboratorlo con arreglo a los metodos expuestos en e! anexo II, y debera recoger, como minimo: • para las patatas: a) et nornbre de la variedad deltote, b) el tipo (de consumo, de siembra, etc.) y, en su caso, la categoria de siembra, • para las tomateras: el nombre de la variedad del lote y, en su caso, la categoria, BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13187 sin perjuicio de los requisites de notificaci6n de la sospecha de la presencia del organismo prevlstos en et arti culo 5, apartado 3: • la Comunidad Aut6noma en ra que se haya contir made la presencia del organismo, cuando exlsta un riesgo de contamlnacion del material vegetal indicado bacia otra u otras Comunidades Autonomas, transrrutlra Inrnedlatamente a las Comunidades Aut6nomas afectadas la informaci6n necesarla para cumplir el articulo 6, apartado 3, que incluye: a) el nombre de la variedad del lote de patatas 0 torna tes. b) el nombre y la direcci6n del expedidor y del destina teno. c) la fecha de entrega dellole de patalas 0 tomates, d) el tamaro dellote de patatas 0 tomates enlregado, e) una copra del pasaporte fitosanilario 0, como rnlnlmo, de su numero, cuando sea apropiado 0, en su caso, el none ro de registro del productor 0 comerciante y una copia del aviso de entrega. Cuando se sumimstre dicha informacion, la Comunidad Aut6noma mtormera de euo Inmediatamente at Mimsterlo de Agricultura, Pesca y Ahmentacion. • la Comunidad Autonoma en ra que se haya contir made ra presencia del orpanismc, cuando exista el riesgo de contamlnacion del material vegetal indicado bacia otro u otros Estados Miernbros. transrnltlra Inrnedlatamente al Mi nisterio de Agricultura, Pesca y Alimentaci6n y este a su vez, a naves del cauce correspondienle a los Estados Miembros afectados la informaci6n necesaria para, cumplir el articulo 6, apartado 3, que incluye: a) el nombre de la variedad del lote de palatas 0 loma tes. b) el nombre y la direcci6n del expedidor y del destina terlo, c) la techa de entrega dellote de patatas 0 tornates, d) e! tamaro dellote de patatas 0 tomates entregado, e) una copra del pasaporte fttosanltano 0, como mtnlrno, de su numero, cuando sea apropiado 0, en su case, el nume ro de registro del productor 0 comerciante y una copia del aviso de entrega. Cuando se suminislre dicha informaci6n, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci6n inforrnara de ello inmedia tamente a la Comisi6n. • cuando exista el riesgo de contaminaci6n del material vegetal indicado procedentes de otro u otros Estados Miern bros a rarz de la correspondiente notificacion 0 notificaciones de los mismos, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimen taci6n comunicara la informaci6n recibida a las Comunidades Aut6nomas interesadas para, cumplir el articulo 6, apartado 3. 4, Cuando hayan finalizado todas las investigaciones, y al objeto de posibilitar la notificaci6n adicional (complementa ria), las comunidades aut6nomas facilitarfln, para cada caso: a) la fecha en la que se confirm61a contaminaci6n; b) una breve descripci6n de la invesligaci6n Ilevada a cabo para identificar la fuente y posible propagaci6n de la contaminaci6n, incluido el nivel de muestreo efecluado; c) informacion score la fuente 0 tuentes de contamina cion determinadas 0 presuntas; d) oetaues relatives al alcance de la contaminaclon de cterada, lnctutdo et numero de lugares de producclon y, en e! caso de las patatas, el nurnero de lotes, con la indicaci6n de la variedad y, en el caso de las patatas de siembra, la cate qona: e) detalles relativos a la delimitaci6n de la zona, incluido el oumerc de lugares de produccicn no declarados contami nados perc incluidos en ra zona; f) oetaues relatives a la designaci6n del aqua, incluido et nombre y la ublcaclon de la masa de agua y e! afcance de la prohibici6n de riego/designaci6n; g) en el caso de cualquier partida 0 lote de tomateras declarado como contaminado, los certificados prescritos en el articulo 10, apartado 1, letra a), del Real Decreto 58/2005, de 21 de enero, por el que se adoptan mecncas de proteccion contra la mtrocucclon y ditusion en et terrttorlo naclonal y de la Comunidad Eurnpea de organismos nocivos para los vege tales 0 productos vegetales, asi como para la exportaci6n y transite hacia paises terceros, y el nornero de pasaporte, de acuerdo con la lista que se recoge en el anexo V, parte A, seccion I, punto 2.2, del Real Decreto 5812005, de 21 de enero h) cualesquiera otros datos que requlera et Ministerio de Agricullura, Pesca y Alimenlaci6n 0, en su caso, la Comisi6n relativos al brote 0 los broles confirm ados. ANEXQ VI Metodos oficialmente autorizados para la eliminaci6n de residues 1. Las disposiciones mencionadas en el articulo 7, apertaoo 1, seran las siguientes: la unuzaclon como pienscs. previo tratamiento termi co adecuado, de forma que no haya riesgo alguno de super vivencia del orqantsrno, o la eliminaci6n en un verledero de eliminaci6n de re siduos autorizado oficialmente en donde no exisla ninqun riesgo identificable de escape del organismo al medic am biente, por ejemplo. a traves de filtraci6n a tlerras agricolas ni de contacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para et riego de dichas uerras. o la incineraci6n. la transtormaclon industrial mediante entrega dlrecta e inmediata a una planta de transtormacion dotada de insta laclones de eliminaci6n de reslduos autorizadas otlclalrnente, para las que se establezca la ausencia de riesgos detecta bles de propagaci6n del organismo, y de un sistema de lim pieza y desinfecci6n de los vehiculos de transporte, al me nos, c otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagacion del organismo; dichas medidas y su justificaci6n se notificaran inmedialamenle al Ministerio de Agricullura, Pesca y Alimentaci6n y esle a su vez, a traves del cauce correspondiente, a la Comisi6n y a los demas Es tados miembros. 13188 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 Cualquier residuo restante asociado con las opciones an teriores y derivado de elias se eliminara con metooos autori zados oficialrnente de conformidad can el anexo VII de este real oecreto. 2, EI uso adecuado 0 la eltmlnaclon del material vegetal indicado dispuestos en el articulo 7, apartado 2, deberan erectuarse bajo el control de los organismos oficiales respon sables interesados, as! como con la oportuna comunicaci6n entre estos organismos para garantizar en todo momento dicho control, y con la aprobacion del orqanismo oficial res ponsable de la Comunidad Aut6noma donee vayan a enva sarse 0 transtormarse las patatas, en 10 que se renere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo, y con sisttran en 10 siguiente: i) en el caso de los tuoerculos de patata: la ulilizaci6n como patatas de consumo destlnadas al consume, envasadas para su distribuci6n y venta directa sin cambio de envase, en un lugar dotado de instalaciones de eliminaci6n de residuos adecuadas. Las patatas destina das a la siembra s610 pueden manipularse en el mismo lugar s! esto se realiza separadamente 0 tras ra limpieza y desin tecclon, o su usa como patatas de consumo para la transfor macron industrial y destinadas a la entrega directa e inmedia ta a una planta de transfcrmacion dotada de instalaciones de eummaclon de residuos adecuadas y de un sistema de lim pieza y desinfecci6n de los vehiculos de transports. at me nos, o alqun otro tipo de usc 0 eltmmaclon, srernpre que se establezca que no existe mrqun riesgo identificable de pro pagaci6n del organismo, y previa aprcoacon de los citados organismos oficiales responsables, ii) en el caso de las otras partes de las plantas, incluidos los oetrttos del tallo y de las hojas, la destrucci6n, o cualquier otro usa 0 eliminaci6n, a condici6n de que se garantice que no existe riesgo identificable de dispersar el organismo, y previa aprobacion de los citados organismos oficiales responsables. 3. Los metooos adecuados para la oescontarmnacion de los objetos a los que se refiere el articulo 7, apartado 3, ccnsistiran en una limpieza y, en su caso, una desinteccion que permitan descartar todo riesgo identiflcable de propaga cion del organismo; estes operactones se erectueran bajo la supervision de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autonomas. 4. La serie de medidas mencionadas en el articulo 7, apartado 4, que oeberan aplicar las Comunidades Aut6no mas dentro de la zona 0 zonas delimitadas que se hayan establecido en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), inciso IV), y del articulo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), seran las siguientes: 4.1 En los casos en que, en virtud del articulo 6, apar tado 1, letra a), inciso Ii), se hayan declarado contaminados lugares de produccion, las medidas consistiran en 10 siguien te: a) en los campos 0 unidades de producci6n de culti vos protegidos que se hayan declarado contaminados en virtud de esa misma disposicion: i) durante al menos los cuatro anos de cultivo siguientes ala declaraci6n de la contaminaci6n: se adoptaran medidas para eumtnsr las patatas y to materas espcntanees asi como otras plantas que puedan ser huesped del organismo, incluidas las malas hierbas solana ceas, y no se plantaran: • tuberculos, plantas ni semillas propiamente dichas de petata. • tomateras y semillas de tomateras. • teniendo en cuenta la biologia del organismo: • otras plantas huesped. • plantas de especies de Brassica para las que extsta un riesgo ldentlficado de aupervlvencia del organismo, • otros cultivos para los que exista un riesgo identifica do de propagaci6n del orpanismc, en la primera temporada de cultivo de patatas 0 10 males siqulente al perfodo lndlcado en e! gui6n anterior, y sternpre que se haya comprobado que, durante at menos los dos atios de veqetacion inmediatamente, anteriores a la plan tacion, el campo estuvo libre de patatas y tomateras espon taneas y de otras plantas huesped del organismo, incluidas las malas hierbas sotanaceas: • en el caso de las patatas, ecremente se autorlzara la producci6n de patatas de consumo, • en el caso de las patatas y los tomates, los noercu los de palata cosechados, 0 las tomateras. segun correapcn da, seran anehzados de conformidad con e! procedimiento detallado en el anexo II, en la temporada de cultivo de patatas 0 tomates si guiente a la indicada en el guion anterior y tras un crclo de roracron adecuado, que sera de un rntnimo de dos artos si se cultivan petatas de siembra, se etectuara un examen oflcial tal como se dispone el articulo 3, apartado 1, o Ii) durante los cinco anos de cultivo siguientes al de la declaracion de la conrammaclcn se adoptaran medidas para eliminar las patatas y to materas espontaneas asi como otras plantas que puedan contener natural mente el organismo, incluidas las mares hierbas solanaceas, y durante los tres primeros enos. se dejara y manten ura el campo, bien en barbecho completo, bien para el cultivo de cereares, con arreglo at riesgo que se haya determinado, bien como peste permanents, can siega intense y frecuente 0 pestoreo tntensivo, 0 bien como pastlzal para la proouccton de semillas y, a continuacion, en los dos anos subsiguientes, se plantaran plantas que no sean huesped del organismo para las que no exista ningun riesgo identificado de supervi vencia 0 propagacion de este, en la primera temporada de cultivo de patatas 0 to mates siguiente al perlodo indicado en el gui6n anterior y, siempre que se haya comprobado que, duranle al menos los dos anos de vegelaci6n inmediatamente anteriores a la plan laci6n, el campo esluvo libre de palatas y lomateras espon BQE num. 74 Mertes 27 marzo 2007 13189 taneas y de otras plantas huesped del organismo, incluidas las malas hierbas solanaceas: • en e! caso de las patatas, se autortzara la producclon de patatas de sfembra y de consume. • los fuberculos de patata cosecnecos. 0 las tomate ras, sequn corresponda, seran analizados de conformidad con el procedimienlo detallado en el anexo II; b) en et resto de los campos del lugar de proouccron contaminado y a comncron de que los organismos oficiales competentes tengan la certeza de que se ha eliminado ade cuadamente el riesgo de plantas de patata y de tomate es pontaneas y de cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, incluidas las malas hierbas sola naceas: durante et ano de cullivo siguiente al de oectaracron de contemmacion. o bien no se plantaran tuberculos, plantas ni semi lias propiamente dichas de palata, ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, o en e! caso de los fuberculos de palata, se podra plantar palata de siembra oficialmente certificada, pero solo para la producci6n de patata de consumo, en el caso de las tomateras, solamente se plantaran tomateras obtenidas de semillas que cum plan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE del Consejc, de 8 de mayo de 2000, relative a las medidas de proteccion contra la lntroduc cion en la Comunidad de organismos nocivos para los vege tales 0 productos vegetales y contra su propapacion en el interior de la Comunidad, para la producclon de frulo, durante el segundo ana de cullivo siguienle al de declaraci6n de contarninacion. en el caso de las patatas, solarnente se plantaran, pa ra la producci6n de patatas de siembra 0 de consumo, patatas de semora certificadas 0 patatas de siembra enanzaoas para determinar la mexlstencla de podredumbre parda y cultivadas bajo control oficial en lugares de proouccon diferentes de los mencionados en el punto 4.1, en el caso de los tomates, sola mente se plantaran tomateras obtenidas de semillas que cum plan los requisitos de la Dtrecuva 20001291CE 0, sr se han propagado vegetati vamente, de tomateras producidas a partir de esas semillas y cullivadas bajo control oficlal en lugares de prcduccion dife rentes de los menclonados en et punto q.f , para la proouc cion de planlas 0 de fruto, durante al menos los Ires enos de cultivo siguientes a ra declaracion de la contaminaclco: en el caso de las patatas, se plantaran para la pro duccion de patatas de slernbra 0 de consume exctusfvamente patatas de slernbra certificadas 0 patatas de stembra que se hayan cultivado bajo conlrol oficial a partir de patalas de siembra certificadas. en el caso de los tomates, sola mente se plantaran tomateras obtenidas de semillas que cum plan los requisitos de la Dtrecuva 20001291CE 0 tomateras cultivadas bajo con trol oflcial a partir de estas plantas, para la prcduccion de plantas 0 de fruto, en cada uno de los aries de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tornaran medidas para eliminar las plantas de patata esponteneae y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, si existen, y se efectua ra una Inspecclon oficial del cullivo en crecimlento en los mementos pertinentes y, en caoa campo de patatas. se etec toaran pruebas oficiales de las patatas cosechadas con arre glo al procedimiento detallado en el anexo II; c) Inmediatamente despues de la declaracion de con tammacron prevista en el articulo 6, apartado 1, letra a), inci so Ii), y tras el primer ano de cultivo siguiente: toda la maquinaria e instalaciones de almacenamien to dellugar de producci6n que se utilicen en la produccion de patatas 0 tomates se lirnpiaran y, en su case, oesmtectaran utilizando metodos adecuados de la forma que se dispone en et punto 3, con el fin de impedir la propapacion del organismo, se efectuaran controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibiran los mismos; d) en el caso de las unidades de producclon de cultivos protegidos que hayan sloe oeclaraoas contaminadas en vir tud del articulo 6, apartedo 1, tetra a), inciso ii), y en las que sea poslble una sustituclon total de los rnedlos de cuttlvo: no se plantaran tuberculos, plantas ni semmes pro piamente dichas de palata, ni otras plantas que puedan ser huesped del organismo, inciuidas tomateras y semillas de tomateras, a menos que, por una parte, la unidad de produc cion se haya someuoo a mecnoas oficialmente supervisadas que, temenoo por objeto la enminacton del organismo y la retirada de todo el material vegetal huespeo, incluyan, como mlnimo, un cambio completo de los medios de cultivo y una limpieza y, en su caso, una desinfecci6n de tales unidades y de todo el equipo y que, por otra parte, los organismos oficia les responsables hayan dado subsiguientemenle su autoriza cion para la producci6n de petatas 0 tomates. y aoemas, la producci6n procedera, en el caso de la patata, de patatas de siembra certificadas 0 de mnutubercu los 0 microplantas obtenidos de fuentes analizadas, en cuanto a la producci6n de tomates. la produocion debera proceder de semillas que cum plan los requisites de la Directiva 2000/29/CE 0, sr se han propagado vegetativamen te. de tomateras producidas a partir de estas semillas y cultl vadas bajo control oflcial. con el fin de impedir la propapacion del organismo, se efectuaran controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibiran los mismos. 4.2 Dentro de la zona delimilada, y sin perjuicio de las medidas dispuestas en el punto 4,1, las Comunidades Auto nomas: a) Inmediatarnente despues de la declaraci6n de con tan-inaclon, qarantizaran que se limpie y desintecte tcda la maquinaria e inslalaciones de almacenamiento de la explota cion que se hayan ulilizado para la producci6n de palatas y tomates. como resulte adecuado y con los metooos apropia dos, sequn 10 dispuesto en el punto 3; b) inmediatarnente y durante at menos tres anos de cut livo oespues de la oectaracron de contarnmaclcn: ba) en los casos en que la dellmltaclon de la zona se haya efectuado en virtud del articulo 6, apartado 1, letra a), inciso Iv): caranttzaran que sus organismos oficiales responsa ores supervisen las instalaciones que cultiven, almacenen 0 manipulen tuberculos de patata 0 tomates, asi como aquellas 13190 Martes 27 rnarzo 2007 BQE num. 74 otras instalaciones que utilicen en el marco de un contrato maquinaria para la producci6n de patatas 0 tomates. requertran que, para todos los cultivos de patata de ntro de la zona delimitada, se planten exclusivarnente semi lias certlflcadas 0 semillas cultivadas bajo control otlclaf, y se etectue un analisis oespues de cosechar los cuttlvos de pata tas de siembra en lugares de proouccron determinados como probablemente contaminados sepnn el articulo 6, apartado 1, letra a), incise iii), exiqiran que se manipulen por separado las exlsten etas de patatas de siernbra y de patatas de consumo recolec tadas en todas las explotaciones de la zona 0, cuando sea eoecuaoo, que se etectue una desmtecclon entre la manipu lacion de las exislencias de patatas de siembra y de palatas de consumo, eXigirfln que, para todos los cultivos de tomale de la zona, solamente se planten tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requlsftos de la Directiva 2000/29/CE 0, s! se han propagado veqetatlvarnente, de tomateras producldas a partir de estas semmes y cultivadas bajo control oficial, etectuaran el examen oficial que dispone el articulo 3, apartado 1; bb] en los casos en que, en virtud del articulo 6, aparta do 1, letra c), incise ii), se hayan declarado ccntaminadas aguas de auperflcie 0 en que, de contorrnidac con e! anexo V, punto 2, se hayan Inclufdo dichas aguas entre los tactores de la poslble propagaci6n del organismo: reanzeran un examen anual, en los momentos opor tunos, con una toma de muestras de las aguas de superficie y, cuando sea oportuno, de las plantas huesped sclanaceas en las fuentes hidricas pertinentes, as! como analisis con arreglo a los metooos pertinentes establecidos en el anexo II para et material vegetal Indlcado y para otros casos, con et fin de impedir la propagaci6n del organismo, estabreceran controles oficiales de los planes de riego y ro ciarniento, asf como una prohiblcion del uso de las aguas declaradas contaminadas para el riego y rociamiento del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas huesped. Esta prohibici6n podra reexaminarse en funci6n de los resultados obtenidos en el examen anual mencionado, y podran revocarse las declaraclones cuenoo los organismos onctaies responsables tengan la certeza de que las aguas superficiales ya no estan conlaminadas. Poura autorizarse el uso del agua sometida a prohiblcion, bajo control oficial, para el riego y el rociamiento de las plantas huesped, cuando se utilicen tecnicas aprobadas oficialmente que eliminen el or ganismo y eviten su propagaci6n, en los casos en que se hayan conlaminado vertidos de residuos I1quidos, estableceran controles oficiales de la elimina cion de los residuos s61idos 0 liquidos procedentes de las insta laciones industriales de transformaci6n 0 envasado que manipu len el material vegetal indicado; c) estableceran, cuando sea pertinente, un programa para la sustitucion en un plaza adecuado de todas las exis tencias de patatas de siembra. ANEXO VII Disposiciones que se deben cumplir para ra enmmacicn de los resrcucs Los metocos de eliminaci6n de residuos autorizados ofi ctarmente mencronaoos en et anexo VI, punto 1, deberan cumplir las disposiciones que se indican a contlnuaclon con el fin de evitar todo riesgo identificable de propaqaclon del organismo: i) los residuos de patatas y tomates (incluidas las pata tas, mondaduras y tomates descartados) y cualquier otro residuo solido asociado con las patatas y los tomates (inclui do e! suelo, las piedras y otros restos) se eurnrnaran de una de las siguientes maneras: en un vertedero de eliminaci6n de residuos autorr zado oficialmente en donde no exista ninqun riesgo identifi cable de escape del organismo al medio ambiente, por ejernplo. a traves de filtraci6n a uerras agricolas nl de con lacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego de dichas nerras. Los residuos se conductran direcla mente al verledero en unas condiciones de confinamienlo que impidan todo riesgo de perdida de los mismos. o mediante incineracion. o a naves de otras medidas, slempre que se oescarte et posible riesgo de propagaci6n del organismo. Dlchas me didas se ncnnceran inmediatamente al Ministerio de Agricul tura, Pesca y Alimentaci6n y este a su vez, a traves del cau ce correspondiente, a la Comisi6n y a los oemas Estados miembros, Ii) residues liquidos: antes de la eumrnacron. los rest duos liquidos que contengan s61idos en suspension se someteran a procesos de filtraci6n 0 sernrnentacon para eliminar dichos sonoos. Estos sonoos se eumrnaran tal como se establece en el incise i). A contmuacion. los residues lfquidos: se carentaran a un minimo de 60 "C en tooo su VD lumen durante un minima de 30 minutes antes de la eununa cion. o se elirninaran, previa autorfzacion oflcial y bajo con trol oficial, de manera que no exlsta ninqun riesgo identifica ble de que los residuos puedan entrar en contacto con tierras agricDlas ni fuentes de agua que pudieran utilizarse para la irrigaci6n de tierras agricolas. Los delalles de estas medidas se notificaran al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimenta cion y este a su vez, a traves del cauce correspondiente, a los demas Estados miembros y a la Comisi6n. Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulacion, la eli minaci6n y el tratamiento de lotes contaminados.!>