Rulebook on implementation of systematic control and measures to prevent the penetration and spreading and to control the potato brown rot and bacterial wilt on potato and tomato caused by bacteria Ralstonia Solanacearum Yabuuchi et al

MINISTARSTVO VANJSKE TRGOVINE I EKONOMSKIH ODNOSA BOSNE I HERCEGOVINE 514 Na osnovu ~lana 9. stav (3) ~lana 10. stav (5), ~lana 12. stav (3) ~lana 41. stav (4) i ~lana 60. stav (5) Zakona o za{titi zdravlja bilja ("Slu`beni glasnik BiH", broj 23/03), Ministarstvo vanjske trgovine i ekonomskih odnosa Bosne i Hercegovine, na prijedlog Uprave Bosne i Hercegovine za za{titu zdravlja bilja, donosi PRAVILNIK O PROVO\ENJU SISTEMSKE KONTROLE I PREDUZIMANJU MJERA U CILJU SPRJE^AVANJA UNO[ENJA, [IRENJA I KONTROLE SME\E TRULE@I KROMPIRA I BAKTERIJSKOG UVENU]A NA KROMPIRU I PARADAJZU PROUZROKOVANIH BAKTERIJOM RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. ^lan 1. (Predmet) Ovim Pravilnikom se propisuje na~in provo|enja sistemske kontrole radi utvr|ivanja prisutnosti i odre|ivanja rasprostranjenosti sme|e trule`i krtola krompira i bakterijskog uvenu}a krompira i paradajza, koju prouzrokuje fitopatogena bakterija Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., ranije poznata pod nazivom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (u daljnjem tekstu: "{tetni organizam"), te, u slu~aju pojave {tetnog organizma, mjere za sprje~avanje {irenja i suzbijanja radi iskorjenjivanja, kao i postupci laboratorijskog testiranja za dijagnosticiranje, detekciju i identifikaciju ovog {tetnog organizma. ^lan 2. (Definicije) Izrazi upotrijebljeni u Zakonu o za{titi zdravlja bilja ("Sl.glasnik BiH", broj 23/03), (u daljnjem tekstu: "Zakon"), upotrebljavaju se i u ovom Pravilniku, a specifi~ni izrazi upotrijebljeni u ovom Pravilniku imaju slijede}e zna~enje: a) prostorije - bilo koje zgrade, zemlji{te, prijevozna sredstva ili drugi objekti koje upotrebljava isti proizvo|a~; b) jedinica za{ti}ene proizvodnje usjeva - odnosi se na rasadnike, staklenike, plastenike, plasti~ne tunele i tople lijehe za biljke; c) mjesto proizvodnje - zna~i polje ili vi{e polja ili jedinica za{ti}ene proizvodnje usjeva koji funkcioniraju kao jedinstvena proizvodna ili poljoprivredna jedinica; d) godina rasta - zna~i period od dvanaest mjeseci koji po~inje kada klimatski uslovi u izvjesnim oblastima dozvoljavaju po~etak proizvodnje krompira; e) sezona proizvodnje - odnosi se na period od sadnje biljaka ili krtola do njihovog skladi{tenja; f) fitosanitarne slu`be - nadle`ni organi u entitetima i Br~ko Distriktu Bosne i Hercegovine; g) ovla{tena laboratorija - laboratorija koja je osposobljena za testiranje ovog {tetnog organizma i koja je dobila ovla{tenje u skladu sa ~lanom 68. stav (1) Zakona; h) stru~no ovla{teno lice - lice koje obavlja poslove po ovla{tenju iz ~lana 68. stav (6) Zakona. ^lan 3. (Sistemska kontrola) (1) Uprava Bosne i Hercegovine za za{titu zdravlja bilja (u daljnjem tekstu: "Uprava"), u saradnji sa nadle`nim organima entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine, propisuje godi{nji program sistemske kontrole za potvr|ivanje odsustva ili prisustva {tetnog organizma na osnovu jasnih nau~nih i statisti~kih principa i biologije {tetnog organizma. Ova sistemska kontrola provodi se nad slijede}im biljkama doma}inima: a) krompirom (Solanum tuberosum L.), uklju~uju}i krtole, isklju~uju}i sjeme u botani~kom smislu; b) paradajzom (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw, isklju~uju}i plodove i sjeme, (u daljnjem tekstu: "glavne biljke doma}ini"). (2) Sistemsku kontrolu iz stava (1) ovog ~lana vr{e fitosanitarne inspekcije entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine i ovla{tene laboratorije. (3) Uprava, u saradnji sa fitosanitarnim slu`bama i ovla{tenim laboratorijama vr{i procjenu rizika na prisustvo {tetnog organizma radi utvr|ivanja drugih mogu}ih izvora zaraze koji prijete proizvodnji glavnih biljaka doma}ina. Ukoliko se procijeni da postoji rizik od {irenja {tetnog organizma, utvr|enog za vrijeme procjene, propisuje u proizvodnim podru~jima glavnih biljaka doma}ina, da se sistemska kontrola na {tetni organizam vr{i i na biljkama koje nisu glavne biljke doma}ini, uklju~uju}i samonikle biljke iz porodice Solanaceae (u daljnjem tekstu: "druge biljke doma}ini"), kao i na povr{inskim vodama koje se upotrebljavaju za navodnjavanje ili prskanje glavnih biljaka doma}ina i na teku}em otpadu od industrijske prerade ili prostorija za pakiranje glavnih biljaka doma}ina koji se upotrebljava za navodnjavanje ili prskanje glavnih biljaka doma}ina. Sistemska kontrola za {tetni organizam mo`e se vr{iti i na razli~itim materijalima, kao {to su supstrati koji se koriste za rast biljaka, zemlji{te i ~vrsti otpad od industrijske prerade ili prostorija za pakiranje glavnih biljaka doma}ina. (4) Inspekcijska kontrola, broj, porijeklo, distribucija i vrijeme uzimanja uzoraka odre|uje se godi{njim programom sistemske kontrole propisanim u stavu (1) ovog ~lana. (5) Godi{njim programom sistemske kontrole odre|uje se finansiranje, na nivou entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine kao i dr`avnom nivou, laboratorijskih uzoraka po zahtjevu fitosanitarnih inspektora bilo da su nalazi pozitivni ili negativni. ^lan 4. (Na~in provo|enja sistemske kontrole) Za vrijeme provo|enja programa godi{nje sistemske kontrole ili u slu~aju sumnje na prisustvo {tetnog organizma, fitosanitarni inspektor: a) u slu~aju krompira: 1) obavlja, u odgovaraju}e vrijeme, vizuelni inspekcijski pregled sjemenskog krompira i krompira koji se ne namjerava saditi (u daljnjem tekstu: "merkantilni krompir") i uzima uzorke tokom vegetacijskog perioda ili iz skladi{ta. Ovi uzorci se podvrgavaju vizuelnoj inspekciji rezanjem krtola; 2) uzorke sjemenskog krompira i merkantilnog krompira dostavlja u ovla{tenu laboratoriju. Testiranje se vr{i u skladu sa metodologijom testiranja koju je propisala Evropska unija (u daljnjem tekstu: "propisana procedura"), a detaljna metodologija obja{njena je u prilozima koji su sastavni dio ovog Pravilnika; b) u slu~aju paradajza obavlja vizuelni inspekcijski pregled, u odgovaraju}e vrijeme, presadnica koje su namijenjene tr`i{noj proizvodnji i, gdje je potrebno, uzima uzorke za testiranje u ovla{tenoj laboratoriji u skladu sa propisanom procedurom; c) u slu~aju drugih biljaka doma}ina, povr{inskih voda uklju~uju}i teku}i otpad, i gdje je potrebno, i drugog materijala, kao {to su supstrati koji se koriste za rast biljaka, zemlji{te i ~vrsti otpad od industrijske prerade ili prostorija za pakiranje glavnih biljaka doma}ina, u skladu sa sistemskom kontrolom koja je propisana u ~lanu 3. stav (3) ovog Pravilnika, uzima uzorke za testiranje u ovla{tenoj laboratoriji u skladu sa propisanom procedurom. ^lan 5. (Evidencije) (1) Uprava vodi evidenciju o pojavi i nalazima o {tetnim organizmima, evidenciju o kontroli u svrhu pru`anja informacija na nivou Bosne i Hercegovine i na me|unarodnom nivou. (2) Nadle`ne institucije entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine vode evidencije u svrhu pru`anja informacija na entitetskom nivou. (3) Godi{nja evidencija o detaljima i rezultatima sistemske kontrole sadr`i slijede}e podatke: a) u slu~aju nadzora krompira: 1) ukupno procijenjeno podru~je na kojem se uzgaja sjemenski i merkantilni krompir u hektarima; 2) raspodjela po sjemenskim kategorijama i proizvodnji, gdje je potrebno, po regionima; 3) broj i vrijeme uzimanja uzoraka za testiranje; 4) broj vizuelnih inspekcijskih pregleda na parceli; 5) broj i veli~ina uzorka za vizuelni inspekcijski pregled krtola; b) u slu~aju kontrole presadnica paradajza namijenjenog za dalju sadnju: 1) procijenjeni ukupni broj biljaka; 2) broj vizuelnih inspekcija; c) u slu~aju sistemske kontrole drugih biljaka doma}ina, uklju~uju}i samonikle biljke iz porodice Solanaceae: 1) vrste biljaka; 2) broj i vrijeme uzimanja uzoraka; 3) podru~je sa kojeg je uzet uzorak ili povr{inska voda; 4) na~in analize; d) u slu~aju sistemske kontole vode i teku}eg otpada usljed industrijske prerade ili prostorija za pakiranje glavnih biljaka doma}ina: 1) broj i vrijeme uzimanja uzoraka; 2) podru~je sa kojeg je uzet uzorak, povr{inske vode, lokacije prostorija; 3) na~in analize. ^lan 6. (Izvje{tavanje u slu~aju zaraze ili sumnje na zarazu) Ukoliko vlasnik ili bilo koje lice koje posumnja na prisustvo {tetnog organizma u uzgojenim usjevima glavnih biljaka doma}ina u ubranim, uskladi{tenim ili krtolama krompira koje su u prometu, na drugim biljkama doma}inima ili samoniklim biljkama iz porodice Solanaceae, obavezni su, bez odlaganja, obavijestiti nadle`nog fitosanitarnog inspektora. ^lan 7. (Sumnja na zarazu) (1) Na zarazu {tetnim organizmom opravdano se sumnja: a) ako su uo~eni simptomi bolesti; b) ako je rezultat brzog skrining testa ili drugih relevantnih metoda pozitivan, u skladu sa propisanim procedurama. (2) Da bi se potvrdila ili opovrgla sumnja na zarazu {tetnim organizmom, fitosanitarni inspektor odmah uzima uzorak i dostavlja ga ovla{tenoj laboratoriji. (3) Do dobijanja kona~nih rezultata laboratorijskog testiranja iz stava (2) ovog ~lana fitosanitarni inspektor rje{enjem nare|uje slijede}e mjere: a) zabranjuje prijevoz/prijenos i promet biljaka i krtola svih proizvoda, koli~ina ili po{iljki odakle su uzeti uzorci. Ukoliko se radi o uvoznoj po{iljci primjenjuju se odredbe Pravilnika o mjerama za sprje~avanje uno{enja, {irenja i suzbijanja {tetnih organizama na bilju, biljnim proizvodima i reguliranim objektima; b) odre|uje druge mjere koje je propisala Uprava u cilju utvr|ivanja porijekla sumnjive pojave; c) odre|uje odgovaraju}e dodatne preventivne mjere koje je propisala Uprava na osnovu nivoa procijenjenog rizika da bi sprije~ila {irenje {tetnog organizma. Ove mjere se posebno primjenjuju kod proizvodnje glavnih biljaka doma}ina i prijevoza koli~ina sjemenskog krompira proizvedenog na mjestu proizvodnje odakle su uzeti uzorci iz ta~ke a) ovog stava. ^lan 8. (^uvanje dokaznog materijala) U slu~aju sumnje na pojavu {tetnog organizma za koji je dobijen pozitivan rezultat skrining testa, a dok se ne zavr{i laboratorijsko testiranje, ovla{tena laboratorija ~uva i konzervira na odgovaraju}i na~in: a) sve uzorkovane krtole, i kada je to mogu}e, sve uzorkovane biljke; b) bilo koji ostatak ekstrakta i dodatno pripremljeni materijal za skrining test ili za druge metode testiranja, npr. imunoflourescentni slajdovi ili bilo koji odgovaraju}i materijal koji se upotrebljava u laboratorijskim testiranjima; c) svu odgovaraju}u dokumentaciju. ^lan 9. (Postupak u slu~aju potvr|ene zaraze) Ako se laboratorijskim testiranjem iz ~lana 7. stav (2) ovog Pravilnika potvrdi prisustvo {tetnog organizma u uzorku glavnih biljaka doma}ina Uprava, u saradnji sa fitosanitarnim slu`bama, ima obavezu, na osnovu jasnih nau~nih principa i biologije {tetnog organizma: a) provesti istra`ivanje u skladu sa ~lanom 10. ovog Pravilnika da bi se utvrdio obim, te jedan ili vi{e primarnih izvora zaraze; b) ozna~iti kao zara`ene: 1) glavne biljke doma}ine, po{iljku ili partiju iz koje je uzet uzorak; 2) ma{ine, opremu, prijevozna sredstva, skladi{ta ili njihove dijelove, i sve druge objekte i predmete, uklju~uju}i materijal za pakiranje, koji su bili u dodiru sa glavnim biljkama doma}inima od kojih je uzet uzorak; 3) mjesta proizvodnje, polja i, kada je to primjereno, za{ti}ene prostore namijenjene proizvodnji bilja, bilo da je uzorak uzet u vrijeme uzgoja ili nakon va|enja ili berbe glavnih biljaka doma}ina; c) odrediti obim mogu}e zaraze; d) na osnovu obima potvr|ene zaraze, obima mogu}e zaraze i podru~ja mogu}eg {irenja organizma, po hitnom postupku, odrediti posebno regulirano podru~je u kojem se provode mjere propisane ovim Pravilnikom. ^lan 10. (Obim i primarni izvor zaraze glavnih biljaka doma}ina) Uprava, u saradnji sa fitosanitarnim slu`bama, ima obavezu da nalo`i provo|enje istra`ivanja iz ~lana 9. ovog Pravilnika da bi se utvrdio obim, te jedan ili vi{e primarnih izvora zaraze glavnih biljaka doma}ina uzimaju}i u obzir: a) mjesta proizvodnje: 1) na kojima se proizvodi ili je bio proizveden krompir, koji je klonski srodan sa krompirom na kojem je utvr|ena zaraza {tetnim organizmom; 2) na kojima se proizvodi ili je bio proizveden paradajz koji poti~e iz istog izvora kao i paradajz za koji je ustanovljeno da je zara`en {tetnim organizmom; 3) na kojima se proizvodi ili je bio proizveden krompir ili paradajz koji je bio pod kontrolom fitosanitarnog inspektora zbog sumnje na prisustvo {tetnim organizmom; 4) na kojima se proizvodi ili je bio proizveden krompir koji poti~e od klonski srodnog krompira koji je uzgajan na mjestu proizvodnje za koje je utvr|eno da je zara`eno {tetnim organizmom; 5) na kojima se proizvodi ili je bio proizveden krompir ili paradajz na parcelama u susjedstvu zara`enog mjesta proizvodnje, uklju~uju}i i ona mjesta proizvodnje koja dijele proizvodnu opremu i prostorije; 6) na kojima se koriste upotrebljavanje povr{inske vode za navodnjavanje i prskanje iz bilo kojeg izvora za koji je potvr|eno ili za koji se sumnja da je zara`en {tetnim organizmom; 7) koja su poplavljena ili su nekada bila poplavljena povr{inskom vodom za koju je potvr|eno ili postoji sumnja da je zara`ena {tetnim organizmom; b) povr{inske vode koje se upotrebljavaju za navodnjavanje ili prskanje ili koje su poplavile polje(a) ili mjesto(a) proizvodnje za koje je potvr|eno da je zara`eno {tetnim organizmom. ^lan 11. (Obim mogu}e zaraze glavnih biljaka doma}ina) Fitosanitarni inspektor odre|uje za glavne biljke doma}ine obim mogu}e zaraze iz ~lana 7. stav (3) ta~ka c) ovog Pravilnika, na osnovu mogu}ih doticaja prije, poslije i tokom proizvodnje, navodnjavanja ili prskanja ili na osnovu klonske srodnosti sa biljkama ili krtolama koje su ozna~ene kao zara`ene, uzimaju}i u obzir: a) glavne biljke doma}ine uzgojene na mjestu proizvodnje koje je ozna~eno kao zara`eno; b) mjesto ili mjesta proizvodnje koja su u bilo kakvoj vezi sa proizvodnjom glavnih biljaka doma}ina koje su ozna~ene kao zara`ene, uklju~uju}i i ona na kojima su se koristili ista oprema za proizvodnju i objekti; c) glavne biljke doma}ine koje su proizvedene na mjestima proizvodnje iz stava (2) ovog ~lana ili su se nalazile na tim mjestima proizvodnje u vrijeme dok su glavne biljke doma}ini koje su ozna~ene kao zara`ene u skladu sa ~lanom 7. stav (3) ta~ka a) ovog Pravilnika bile prisutne na mjestima proizvodnje iz ta~ke a) ovog ~lana; d) posjede na kojima se nalaze ili dora|uju glavne biljke doma}ini koje poti~u sa mjesta proizvodnje navedenim u t~. a), b) i c) ovoga ~lana; e) svaku ma{inu, prijevozno sredstvo, skladi{te, ili njihov dio, te druge objekte ili predmete, uklju~uju}i i materijal za pakiranje, koji su mogli do}i u dodir sa glavnim biljkama doma}inima koje su ozna~ene kao zara`ene u skladu sa ~lanom 9. ta~ka b) alineja 2) ovog Pravilnika; f) sve glavne biljke doma}ine koje su bile uskladi{tene ili u dodiru sa nekim od objekata ili predmeta iz ta~ke e) ovog ~lana prije njihovog ~i{}enja i dezinfekcije; g) biljke paradajza koje poti~u iz istih izvora kao i paradajz koji je ozna~en kao zara`en, odnosno krtole ili biljke krompira koji su sestrinski ili roditeljski klonski povezani sa krtolama i/ili biljkama krompira koji je ozna~en kao zara`en {tetnim organizmom, i koji se, iako su rezultati testiranja provedenih u skladu sa propisanim procedurama negativni, smatraju vjerovatno zara`enima radi klonske srodnosti sa krompirom ozna~enim kao zara`enim, a kod paradajza, radi istog izvora kao i paradajz ozna~en kao zara`en. Kada je potrebno, mo`e se provesti i test sortnosti da bi se provjerio identitet zara`enih i klonski srodnih krtola ili biljaka krompira; h) mjesta proizvodnje glavnih biljaka doma}ina navedenih u ta~ki g) ovog ~lana; i) mjesta proizvodnje glavnih biljaka doma}ina na kojima se za navodnjavanje ili prskanje upotrebljava voda koja je ozna~ena kao zara`ena; j) glavne biljke doma}ine proizvedene na poljima koja su bila poplavljena povr{inskom vodom za koju je utvr|eno da je zara`ena {tetnim organizmom. ^lan 12. (Posebno regulirano podru~je) (1) Posebno regulirano podru~je za glavne biljke doma}ine, iz ~lana 9. ta~ka d) ovog Pravilnika odre|uje se na osnovu obima i izvora primarne zaraze, obima mogu}e zaraze i mogu}eg {irenja {tetnog organizma. (2) Mogu}e {irenje {tetnog organizma iz stava (1) ovog ~lana odre|uje se uzimaju}i u obzir: a) blizinu drugih mjesta proizvodnje glavnih biljaka doma}ina; b) zajedni~ku proizvodnju i upotrebu zaliha sjemenskog krompira; c) mjesta proizvodnje koja koriste povr{insku vodu za navodnjavanje ili prskanje glavnih biljaka doma}ina u slu~ajevima gdje ima ili je postojao rizik da povr{inska voda iste~e, odnosno poplavi sa mjesta proizvodnje koja se smatraju zara`enim. (3) Na osnovu odre|enog posebno reguliranog podru~ja za glavne biljke doma}ine iz stava(1) ovog ~lana fitosanitarni inspektor ozna~ava mjesto zaraze. ^lan 13. (Postupak u slu~aju zaraze drugih biljaka doma}ina) Ako se laboratorijskim testiranjem provedenim u skladu sa propisanim procedurama potvrdi zaraza {tetnim organizmom u usjevu drugih biljaka doma}ina, u podru~jima gdje je ugro`ena proizvodnja glavnih biljaka doma}ina, fitosanitarni inspektor treba: a) provesti istra`ivanje u/na glavnim biljkama doma}inima u skladu sa ~lanom 10. ovog Pravilnika; b) ozna~iti kao zara`ene biljke doma}ine iz kojih je uzet uzorak; c) ozna~iti mogu}u zarazu i posebno regulirano podru~je u skladu sa ~l. 11. i 12. ovog Pravilnika. ^lan 14. (Postupak u slu~aju zaraze povr{inskih voda) (1) Ako se laboratorijskim testiranjem provedenim u skladu sa propisanim procedurama potvrdi prisutnost {tetnog organizma u povr{inskoj vodi (uklju~uju}i i teku}i otpad koji nastaje u industrijskoj preradi glavnih biljaka doma}ina ili u pogonima za njihovo pakiranje) ili u samoniklom bilju iz porodice Solanaceae koje u njoj raste, a proizvodnja glavnih biljaka doma}ina je ugro`ena zbog kori{tenja te vode za navodnjavanje, prskanje ili zbog plavljenja, fitosanitarni inspektor ima obavezu: a) uzeti uzorak povr{inskih voda i prisutnih samoniklih biljaka iz porodice Solanaceae, u odgovaraju}im vremenskim periodima, radi utvr|ivanja obima zaraze; b) ozna~iti, u dovoljno velikom obimu, kao zara`enu povr{insku vodu iz koje je uzet uzorak, na osnovu provedene analize iz ta~ke a) ovog stava; c) ozna~iti mogu}u zarazu i posebno regulirano podru~je na osnovu ozna~ene zaraze iz ta~ke b) ovoga stava i mogu}eg {irenja {tetnog organizma uzimaju}i u obzir odredbe iz ~lana 11. ovog Pravilnika. (2) Mogu}e {irenje {tetnog organizma iz stava (1) ta~ka c) ovoga ~lana odre|uje se uzimaju}i u obzir: a) mjesta proizvodnje glavnih biljaka doma}ina koja su ugro`ena plavljenjem ili grani~e sa povr{inskom vodom koja je ozna~ena kao zara`ena; b) svako zasebno podru~je navodnjavanja koje je vezano za povr{insku vodu koja je ozna~ena kao zara`ena; c) vodene tokove povezane sa povr{inskom vodom koja je ozna~ena kao zara`ena, uzimaju}i u obzir: 1) smjer i brzinu toka vode ozna~ene kao zara`ene; 2) prisutnost samoniklih biljaka doma}ina iz porodice Solanaceae. ^lan 15. (Vo|enje evidencije) Uprava vodi evidenciju koja uklju~uje dokumentirane dokaze o obimu potvr|ene zaraze, obimu mogu}e zaraze i o podru~ju mogu}eg {irenja {tetnog organizama na glavne biljke doma}ine i povr{insku vodu, sa slijede}im informacijama: a) datum kada je zaraza potvr|ena; b) opis elemenata koji su doveli do odluke da se proglasi zaraza i podru~je mogu}eg {irenja {tetnog organizma, uklju~uju}i i podatke o uzimanju uzoraka i o laboratorijskom nalazu; c) za bilo koju koli~inu ili po{iljku krompira i paradajza i/ili drugih doma}ina ozna~enu kao zara`enu, podatke o fitosanitarnom certifikatu, uvjerenje o zdravstvenom stanju u slu~aju doma}e proizvodnje krompira, i kada je mogu}e podatke o biljnom paso{u, registarskom broju proizvo|a~a, zbirnim skladi{tima i dispe~erskim centrima; d) informacije o identificiranim ili mogu}im izvorima zaraze; e) pojedinosti o obimu ozna~ene zaraze, uklju~uju}i broj mjesta proizvodnje i broj partija sa nazivom sorte, a kada se radi o sjemenskom krompiru, i o njegovoj kategoriji, kao i za biljke paradajza naziv sorte ili hibrida i partiju; f) pojedinosti o posebno reguliranom podru~ju, uklju~uju}i broj mjesta proizvodnje koja nisu ozna~ena kao zara`ena, ali su uklju~ena u posebno regulirano podru~je; g) pojedinosti o zara`enoj vodi, uklju~uju}i naziv i lokaciju vode i podru~je u kojem se zabranjuje navodnjavanje; h) svaku drugu informaciju o potvr|enoj iznenadnoj pojavi {tetnog organizma. ^lan 16. (Mjere i postupci sa zara`enim glavnim biljkama doma}inima) (1) Sadnja glavnih biljaka doma}ina koje su ozna~ene kao zara`ene u skladu sa ~lanom 9. stav (1) ta~ka b) alineja 1) ovog Pravilnika nije dopu{tena, ve} se one moraju pod nadzorom fitosanitarnog inspektora: a) upotrijebiti kao hrana za `ivotinje nakon odgovaraju}e toplotne obrade, koja ne ostavlja nikakvu mogu}nost pre`ivljavanja {tetnog organizma ili; b) odlo`iti na slu`beno odobrenom mjestu za zbrinjavanje otpada, za koje je utvr|eno da ne postoji opasnost od nekontroliranog {irenja {tetnog organizma u okoli{, na primjer cije|enjem kroz pore tla do poljoprivrednog zemlji{ta ili dodirom sa vodom koja bi mogla da se upotrijebi za navodnjavanje poljoprivrednog zemlji{ta ili; c) spaliti ili; d) industrijski preraditi, pod uslovom da se direktno i odmah dopreme do mjesta prerade, na kojem mora postojati slu`beno odobrena oprema za zbrinjavanje otpada, ~ijim je kori{tenjem otklonjena opasnost od {irenja {tetnog organizma, i na kojem postoji sistem za ~i{}enje i dezinfekciju barem onih prijevoznih sredstava koja napu{taju mjesto prerade ili; e) podvrgnuti drugim mjerama, pod uslovom da nema opasnosti od {irenja {tetnog organizma. O takvim mjerama i njihovoj opravdanosti, Uprava je obavezna da izvijesti nadle`nu evropsku organizaciju za za{titu zdravlja bilja. (2) Sav preostali otpad koji je nastao kao rezultat provedenih mjera iz stava (1) ovog ~lana, mora biti zbrinut u skladu sa slu`beno odobrenim postupkom u skladu sa ~lanom 19. ovog Pravilnika. ^lan 17. (Mjere i postupci sa mogu}e zara`enim glavnim biljkama doma}inima) Sadnja glavnih biljaka doma}ina koje se smatraju mogu}e zara`enim {tetnim organizmom u skladu sa ~lanom 11. i ~lanom 14. stav (1) ta~ka c) ovog Pravilnika, uklju~uju}i i glavne biljke doma}ine gajene na mjestima proizvodnje koje se smatraju mogu}e zara`enim u skladu sa ~lanom 11. ovog Pravilnika nije dopu{tena, ve} se one moraju, pod nadzorom fitosanitarnog inspektora: a) kad se radi o krtolama krompira: 1) upotrijebiti kao merkantilni krompir namijenjen ishrani, pri ~emu mora biti pakiran na mjestima koja raspola`u odgovaraju}om opremom za zbrinjavanje otpada, i koji je spreman za neposrednu dostavu i upotrebu bez naknadnog prepakiranja. Sa sjemenskim krompirom dozvoljeno je rukovati u tim istim mjestima samo ako se radi odvojeno ili nakon ~i{}enja i dezinfekcije ili; 2) upotrijebiti kao merkantilni krompir namijenjen industrijskoj preradi, uz direktnu i brzu dostavu do pogona za preradu, koji mora raspolagati odgovaraju}om opremom za zbrinjavanje otpada i sistemom za ~i{}enje i dezinfekciju barem onih prijevoznih sredstava koji napu{taju mjesto prerade ili; 3) upotrijebiti ili zbrinuti na neki drugi slu`beno odobreni na~in, pod uslovom da nema opasnosti od {irenja {tetnog organizma. b) kada se radi o ostalim dijelovima glavnih biljaka doma}ina, uklju~uju}i ostatke stabljika i li{}a: 1) uni{titi ili; 2) upotrijebiti ili zbrinuti na neki drugi slu`beno odobreni na~in, pod uslovom da nema opasnosti od {irenja {tetnog organizma. ^lan 18. (^i{}enje i dezinfekcija) (1) Fitosanitarni inspektor }e narediti da se ma{ine, prijevozna sredstva, skladi{ta i njihovi dijelovi, ili drugi objekti i predmeti, uklju~uju}i materijal za pakiranje, koji su ozna~eni kao zara`eni u skladu sa ~lanom 9. stav (1) ta~ka b) alineja 2) ovog Pravilnika ili se smatraju mogu}e zara`enima u skladu sa ~lanom 11. i ~lanom 14. stav (1) ta~ka c) ovog Pravilnika, ili uni{te ili o~iste i, kada je to primjereno, dezinficiraju primjenom odgovaraju}ih postupaka kojima se otklanja opasnost od {irenja {tetnog organizma. (2) Nakon dezinfekcije, objekti i predmeti iz stava (1) ovog ~lana vi{e se ne smatraju zara`enim. ^lan 19. (Procedura zbrinjavanja otpada) (1) Slu`beno odobreni postupak zbrinjavanja otpada nastalog u procesu industrijske prerade iz ~lana 14. ovog Pravilnika, mora se izvr{iti tako da se izbjegne svaka opasnost od {irenja {tetnog organizma: a) otpaci krompira i paradajza (uklju~uju}i odba~eni krompir, koru i paradjz) i svi drugi kruti otpaci koji su vezani za krompir i paradajzrajcic (uklju~uju}i tlo, kamenje i druge ostatke), moraju se odstraniti na slijede}i na~in: 1) odlo`iti na za to slu`beno odobrenom mjestu, na kojem ne postoji opasnost od nekontroliranog {irenja {tetnog organizma u okoli{, na primjer cije|enjem kroz pore tla do poljoprivrednog zemlji{ta ili dodirom sa vodom koja bi mogla da se upotrijebi za navodnjavanje poljoprivrednog zemlji{ta. Otpaci se prevoze direktno do odre|enog mjesta, u zatvorenom prijevoznom sredstvu, tako da ne postoji opasnost od gubitka otpada ili; 2) spaliti ili; 3) primijeniti neke druge mjere za koje je utvr|eno da ne postoji opasnost od {irenja {tetnog organizma. b) teku}i otpad nastao u preradi, a koji sadr`i raspr{ene krute ~estice, mora se prije uklanjanja filtrirati ili obraditi postupkom sedimentacije radi odstranjivanja krutih ~estica. Krute ~estice se nakon toga uklanjaju na na~in naveden u stavu (1) ovoga ~lana. Teku}i dio otpada mora se: 1) u cijelosti prije odstranjivanja zagrijati na temperaturu od najmanje 60 °C u trajanju najmanje 30 minuta ili; 2) odstraniti pod slu`benim nadzorom na neki drugi slu`beno odobreni na~in koji onemogu}ava da otpaci do|u, na bilo koji na~in, u dodir sa poljoprivrednim zemlji{tem ili vodom koja se mo`e upotrijebiti za navodnjavanje poljoprivrednog zemlji{ta. (2) Postupci propisani u stavu (1) ovog ~lana primijenjuju se i na otpad koji nastaje tokom rukovanja, odstranjivanja i prerade zara`enih partija. ^lan 20. (Mjere u posebno reguliranom podru~ju) U posebno reguliranom podru~ju odre|enom u skladu sa ~lanom 12. i ~lanom 14. stav (1) ta~ka c) ovog Pravilnika, fitosanitarni inspektor }e narediti mjere navedene u Prilogu I koji je sastavni dio ovog Pravilnika. ^lan 21. (Postupak sa sjemenskim krompirom) (1) Sjemenski krompir mora voditi porijeklo direktno od materijala dobijenog u skladu sa slu`beno odobrenom procedurom kontrole i za koji je slu`benim laboratorijskim testiranjem, provedenim u skladu sa propisanim procedurama, utvr|eno da nije zara`en {tetnim organizmom. (2) Laboratorijsko testiranje iz stava (1) ovog ~lana provodi se: a) u slu~ajevima kada je zaraza bila potvr|ena u vlastitoj proizvodnji sjemenskog krompira testiranjem ranijih generacija u lancu vegetativnog razmno`avanja, uklju~uju}i po~etnu fazu klonske selekcije i sistematsko testiranje klonova osnovnog sjemena; b) u slu~ajevima kada je utvr|eno da ne postoji klonska srodnost, testiranjem svih klonova osnovnog sjemena ili ranijih generacija u lancu vegetativnog razmno`avanja, uklju~uju}i biljke iz po~etne faze klonske selekcije i; c) u drugim slu~ajevima, ili na svakoj biljci koja se nalazi u po~etnoj fazi klonske selekcije, ili na reprezentativnim uzorcima osnovnog sjemena ili ranije generacije u lancu vegetativnog razmno`avanja. ^lan 22. (Zabrana posjedovanja i kori{tenja {tetnog organizma) Zabranjeno je posjedovanje i bilo kakvo kori{tenje {tetnog organizma. ^lan 23. (Izuzeci od propisanih mjera) Uprava mo`e odobriti izuzetke od mjera propisanih u ~l. 16., 17., 18., 20. i 22. ovog Pravilnika, za ogledne, nau~ne ili selekcijske namjene, pod uslovom da se time osigura nadzor nad {tetnim organizmom i da nema opasnosti od njegovog {irenja. ^lan 24. (Dodatne i stro`ije mjere) Uprava mo`e propisati dodatne ili stro`ije mjere koje su potrebne u cilju borbe protiv {tetnog organizma ili sprje~avanja njegovog {irenja. ^lan 25. (Nadle`ni inspektori) Do uspostave fitosanitarnog inspektora posao fitosanitarnog inspektora u Republici Srpskoj obavljaju republi~ki poljoprivredni inspektori a u Federaciji Bosne i Hercegovine posao fitosanitarnog inspektora obavljaju poljoprivredni inspektori. ^lan 26. (Stupanje na snagu) Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Slu`benom glasniku BiH", a primjenjuje se od 01. januara 2010. godine. Broj 07-01-02-7174-1 /09 21. septembra 2009. godine Sarajevo PRILOG I Mjere koje nareĊuje fitosanitarni inspektor i koje se provode u posebno regulirano podruĉje uspostavljeno u skladu sa ĉlanom 12. i ĉlanom 14. stav (1) taĉka c) ovog Pravilnika su slijedeće: I. NA MJESTIMA PROIZVODNJE KOJA SU OZNAĈENA KAO ZARAŢENA: 1. na polju ili u zaštićenom prostoru namijenjenom proizvodnji bilja koji je oznaĉen kao zaraţen: 1.1.1. u iduće, najmanje ĉetiri vegetacijske godine nakon godine u kojoj je utvrĊena zaraza: – obavezno je uklanjanje samoniklih biljaka krompira i paradajza te drugih samoniklih biljaka domaćina štetnog organizma, ukljuĉujući korove iz porodice Solanaceae, i – zabranjena je: – sadnja krtola ili biljaka krompira te sjetva sjemena u botaniĉkom smislu, – sadnja biljaka i sjetva sjemena paradajza, – uzimajući u obzir biologiju štetnog organizma, – sadnja drugih biljaka domaćina, – sadnja onih biljnih vrsta iz roda Brassica za koje je utvrĊeno da omogućavaju preţivljavanje štetnog organizma, – sadnja biljaka za koje je utvrĊeno da omogućavaju širenje štetnog organizma; 1.1.2. u prvoj sezoni proizvodnje krompira ili paradajza koja slijedi nakon perioda iz podtaĉke 1.1.1., pod uslovom da na polju najmanje dvije uzastopne vegetacijske godine prije sadnje tokom provoĊenja sistemskog istraţivanja nisu naĊene samonikle biljke krompira i paradajza te druge biljke domaćini, ukljuĉujući korove iz porodice Solanaceae, – u sluĉaju proizvodnje krompira, dopušta se proizvodnja iskljuĉivo merkantilnog krompira, – proizvedene krtole krompira ili biljke paradajza, kada je to potrebno, testiraju se u skladu sa propisanim procedurama; 1.1.3. u sezoni proizvodnje krompira ili paradajza koja slijedi nakon one iz podtaĉke 1.1.2., uz odgovarajući plodored, koji mora biti najmanje dvogodišnji ako se ţeli proizvoditi sjemenski krompir, provodi se sistemsko istraţivanje u skladu sa ĉlanom 3. ovoga Pravilnika; ili 1.2.1. u idućih, najmanje pet vegetacijskih godina nakon godine kada je utvrĊena zaraza: – provode se mjere uklanjanja samoniklih biljaka krompira i paradajza te drugih biljaka domaćina štetnog organizma, ukljuĉujući korove iz porodice Solanaceae, i – polje se prve tri godine odrţava na ugaru ili kao trajni pašnjak sa intenzivnom ispašom ili ĉestom niskom košnjom, ili se siju ţitarice, ovisno od procjene opasnosti od štetnog organizma, ili se koristi za proizvodnju sjemenskih trava; u slijedeće dvije uzastopne godine dopuštena je proizvodnja biljaka koje nisu domaćini štetnog organizma i za koje je poznato da ne omogućavaju preţivljavanje ili širenje štetnog organizma, 1.2.2. u prvoj sezoni proizvodnje krompira ili paradajza, koja slijedi nakon perioda iz podtaĉke 1.2.1., pod uslovom da tokom provoĊenja sistemskog istraţivanja u najmanje dvije uzastopne vegetacijske godine prije sadnje na polju nisu naĊene samonikle biljke krompira i paradajza te drugih biljaka domaćina, ukljuĉujući korove iz porodice Solanaceae, – u sluĉaju proizvodnje krompira, dopušta se proizvodnja sjemenskog i merkantilnog krompira, – proizvedene krtole krompira ili biljke paradajza kada je to potrebno, testiraju se u skladu sa propisanim procedurama. 2. Na svim ostalim poljima unutar zaraţenog mjesta proizvodnje, pod uslovom da je fitosanitarni inspektor utvrdio da je otklonjena opasnost od samoniklih biljaka krompira i paradajza te drugih biljaka domaćina štetnog organizma, ukljuĉujući korove iz porodice Solanaceae: 2.1. u vegetacijskoj godini koja slijedi nakon godine u kojoj je utvrĊena zaraza: – zabranjuje se sadnja krtola ili biljaka krompira i sjetva sjemena krompira u botaniĉkom smislu, te sjetva ili sadnja drugih biljaka domaćina štetnog organizma, ili – u sluĉaju proizvodnje krompira, dopušta se sadnja certificiranog sjemenskog krompira namijenjenog iskljuĉivo proizvodnji merkantilnog krompira, ili – u sluĉaju proizvodnje paradajza, dopušta se sadnja biljaka paradajza uzgojenih iz sjemena koje udovoljava zahtjevima iz Pravilnika o mjerama za sprjeĉavanje unošenja i širenja organizama štetnih za bilje, biljne proizvode i druge nadzirane predmete i mjerama suzbijanja tih organizama, iskljuĉivo za proizvodnju plodova; 2.2. u drugoj vegetacijskoj godini koja slijedi nakon godine u kojoj je utvrĊena zaraza: – u sluĉaju proizvodnje krompira, dopušta se sadnja samo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira za koji je sluţbenim testiranjem potvrĊeno da nije zaraţen štetnim organizmom i da je proizveden pod struĉnim nadzorom na mjestima proizvodnje koja nisu oznaĉena kao zaraţena, za sjemensku ili merkantilnu proizvodnju, – u sluĉaju proizvodnje paradajza, dopušta se sadnja samo onih biljaka paradajza koje su uzgojene iz sjemena koje udovoljava zahtjevima iz Pravilnika o mjerama za sprjeĉavanje unošenja i širenja organizama štetnih za bilje, biljne proizvode i druge nadzirane pred mete i mjerama suzbijanja tih organizama, ili iz biljaka dobijenih vegetativnim razmnoţavanjem biljaka paradajza proizvedenih iz takvog sjemena i uzgojenih pod struĉnim nadzorom na mjestima proizvodnje koja nisu oznaĉena kao zaraţena, za proizvodnju rasada ili plodova; 2.3. najmanje još u trećoj vegetacijskoj godini koja slijedi nakon utvrĊene zaraze: – u sluĉaju proizvodnje krompira, dopušta se sadnja samo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira proizvedenog pod struĉnim nadzorom iz certificiranog sjemenskog krompira, za sjemensku ili merkantilnu proizvodnju, – u sluĉaju proizvodnje paradajza, dopušta se sadnja samo onih biljaka paradajza koje su uzgojene iz sjemena koje udovoljava zahtjevima iz Pravilnika o mjerama za sprjeĉavanje unošenja i širenja organizama štetnih za bilje, biljne proizvode i druge nadzirane predmete i mjerama suzbijanja tih organizama, ili iz biljaka paradajza uzgojenih pod struĉnim nadzorom iz takvih biljaka, za proizvodnju rasada ili plodova; 2.4. u svakoj vegetacijskoj godini iz podtaĉke 2.1, 2.2. i 2.3. preduzimaju se mjere uklanjanja samoniklih biljaka krompira i drugih biljaka domaćina štetnog organizma ako su prisutni, i provodi se sluţbeni pregled usjeva tokom uzgoja u odgovarajućim vremenskim periodima, svih polja na kojima se uzgaja krompir; proizvedeni krompir sa svakog polja mora biti testiran u skladu sa propisanim procedurama. 3. Odmah nakon utvrĊivanja zaraze štetnim organizmom i nakon prve iduće vegetacijske godine: – sve mašine, oprema i skladišni prostori na mjestu proizvodnje koji su se koristili u proizvodnji krompira ili paradajza moraju se oĉistiti i, kada je to potrebno, dezinficirati u skladu sa ĉlanom 18. ovoga Pravilnika, – fitosanitarni inspektor nadzire provoĊenje programa navodnjavanja i prskanja, koji moţe zabraniti, kada je to potrebno, radi sprjeĉavanja širenja štetnog organizma. 4. U zaštićenom prostoru namijenjenom proizvodnji bilja koji je oznaĉen kao zaraţen, gdje je moguća potpuna zamjena supstrata za uzgoj: – zabranjuje se sadnja krtola ili biljaka krompira i sjetva sjemena krompira u botaniĉkom smislu, te sjetva ili sadnja drugih biljaka domaćina štetnog organizma, ukljuĉujući biljke i sjeme paradajza, sve dok se u tom zaštićenom prostoru, pod nadzorom fitosanitarnog inspektora, ne provedu mjere uništavanja štetnog organizma i uklone sve biljke domaćini i njihovi dijelovi, pri ĉemu se, kao minimalna mjera, obavezno provodi potpuna zamjena supstrata za uzgoj te ĉišćenje i dezinfekcija tog zaštićenog prostora i cjelokupne opreme, i sve dok fitosanitarni inspektor nakon provoĊenja tih mjera ne odobri proizvodnju krompira i paradajza, – dopušta se proizvodnja krompira iz certificiranog sjemenskog krompira proizvedenog pod struĉnim nadzorom ili mini-krtola ili mikro-biljaka dobijenih iz kulture biljnog tkiva koje potiĉu iz testiranih izvora, – dopušta se proizvodnja paradajza iz sjemena koje udovoljava zahtjevima iz Pravilnika o mjerama za sprjeĉavanje unošenja i širenja organizama štetnih za bilje, biljne proizvode i druge nadzirane predmete i mjerama suzbijanja tih organizama, ili iz biljaka dobijenih vegetativnim razmnoţavanjem biljaka paradajza uzgojenih iz takvog sjemena pod struĉnim nadzorom, – fitosanitarni inspektor nadzire provoĊenje programa navodnjavanja i prskanja, kojeg moţe zabraniti, kada je to potrebno, radi sprjeĉavanja širenja štetnog organizma. II. U ĈITAVOM POSEBNO REGULIRANOM PODRUĈJU, PORED MJERA OPISANIH U GLAVI I. OVOGA PRILOGA: 1. Odmah nakon utvrĊivanja zaraze fitosanitarni inspektor nareĊuje, prema potrebi, ĉišćenje i dezinfekciju svih mašina, opreme i skladišnih prostora na posjedima na kojima su se koristili u proizvodnji krompira ili paradajza primjenom odgovarajućih postupaka, kao što je navedeno u glavi I. stav 3. taĉka 1 ovog Priloga. 2. Fitosanitarni inspektor odmah i tokom najmanje tri vegetacijske godine koje slijede iza one u kojoj je utvrĊena zaraza: a) u posebno reguliranom podruĉju odreĊenom u skladu sa ĉlanom 12. ovog Pravilnika: – nadzire posjede na kojima se uzgajaju, skladište, nalaze ili doraĊuju krtole krompira ili paradajza, ukljuĉujući i posjede na kojima se koriste iste mašine za obavljanje radnji vezanih za nabrojene djelatnosti, – nareĊuje sadnju samo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira proizvedenog pod struĉnim nadzorom unutar cijelog posebno reguliranog podruĉja i testiranje sjemenskog krompira nakon vaĊenja, proizvedenog na mjestima proizvodnje koja se smatraju moguće zaraţenima, u skladu sa ĉlanom 11. ovog Pravilnika, – nareĊuje da se na svim posjedima unutar tog podruĉja sa proizvedenim sjemenskim krompirom postupa odvojeno od merkantilnog krompira, ili da se obavi ĉišćenje i, prema potrebi, dezinfekcija izmeĊu postupanja sa sjemenskim i merkantilnim krompirom, – nareĊuje sadnju samo onih biljaka paradajza uzgojenih iz sjemena koje udovoljavaju zahtjevima iz provedbenog propisa o mjerama za sprjeĉavanje unošenja i širenja organizama štetnih za bilje, biljne proizvode i druge regulirane predmete i mjerama suzbijanja tih štetnih or ganizama, ili iz biljaka dobijenih vegetativnim razmnoţavanjem biljaka paradajza proizvedenih iz takvog sjemena i uzgajanih pod struĉnim nadzorom, u svim usjevima paradajza unutar sigurnosnog podruĉja, – provodi sistemsko istraţivanje iz ĉlana 3. ovog Pravilnika; b) za površinsku vodu koja je bila oznaĉena kao zaraţena u skladu sa ĉlanom 14. stav (1) taĉka b) ovog Pravilnika ili predstavlja jedan od faktora, iz ĉlana 12. stava (2) taĉka c) i ĉlana 14. stav (2) ovog Pravilnika, koji utiĉu na moguće širenje štetnog organizma: – obavlja sistemsko istraţivanje iz ĉlana 3. stav (2) ovog Pravilnika u skladu sa godišnjim programom u odgovarajućim vremenskim periodima te uzima uzorke površinske vode i, kada je to potrebno, biljaka domaćina štetnog organizma iz porodice Solanaceae, iz odgovarajućih izvora vode, radi testiranja. Testiranje glavnih biljaka domaćina i svih drugih uzetih uzoraka mora biti provedeno u skladu sa propisanim procedurama, – nadzire provoĊenje programa navodnjavanja i prskanja te moţe zabraniti upotrebu vode koja je oznaĉena kao zaraţena za navodnjavanje i prskanje glavnih biljaka domaćina i, gdje je potrebno, drugih biljaka domaćina radi sprjeĉavanja širenja štetnog organizma. Fitosanitarni inspektor moţe opozvati tu zabranu, ako je na osnovu rezultata provedenog sistemskog istraţivanja iz ĉlana 3. stava (2) ovog Pravilnika u skladu sa godišnjim programom utvrdio da površinska voda više nije zaraţena. Korištenje vode za navodnjavanje i prskanje biljaka domaćina ĉija je upotreba zabranjena moţe se dopustiti pod sluţbenim nadzorom, primjenom sluţbeno odobrenih postupaka kojima se odstranjuje štetni organizam i sprjeĉava njegovo širenje, – u sluĉaju kada je tekući otpad zaraţen, zbrinjavanje krutog ili tekućeg otpada koji nastaje pri industrijskoj preradi ili pakiranju glavnih biljaka domaćina obavlja se pod nadzorom fitosanitarnog inspektora. 3. U sluĉaju potrebe, Uprava moţe narediti zamjenu svih zaliha sjemenskog krompira u odgovarajućem vremenskom periodu. PRILOG II. ŠEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. PODRUĈJE PRIMJENE ŠEME TESTIRANJA Prikazana šema testiranja opisuje razliĉite postupke za: (i) dijagnosticiranje smeĊe truleţi krtola krompira i bakterijskog venuća krompira, paradajza i drugih biljaka domaćina; (ii) detekciju bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima krtola krompira, biljaka krompira, paradajza i drugih biljaka domaćina te u vodi i tlu; (iii) identifikaciju bakterije Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). OPĆA NAĈELA Optimalni protokoli za pojedine metode, validirani reagensi i pojedinosti za pripremu materijala za testiranje i kontrolnih materijala navedeni su u Dodacima. Popis laboratorija koje su uĉestvovale u optimizaciji i validaciji protokola nalazi se u Dodatku 1. Obzirom da protokoli ukljuĉuju detekciju karantinskog organizma i ukljuĉivat će upotrebu vijabilnih kultura R. solanacearum kao kontrolnih materijala, procedura će se morati izvoditi u primjerenim karantinskim uslovima sa odgovarajućom opremom za zbrinjavanje otpada te prema uslovima dozvola koje izdaju nadleţna tijela za biljnu karantinu. Parametri testiranja moraju osigurati dosljednu i ponovljivu detekciju onih nivoa R. solanacearum prema propisanim pragovima detekcije za pojedine metode. Precizna priprema pozitivnih kontrola je nuţna. Testiranje u skladu sa potrebnim pragovima detekcije podrazumijeva pravilno postavljanje, odrţavanje i kalibraciju opreme, paţljivo pohranjivanje i rukovanje reagenasima te preduzimanje mjera za sprjeĉavanje kontaminacije meĊu uzorcima, npr. razdvajanje pozitivnih kontrola od uzoraka za testiranje. Moraju se primijeniti standardi kontrole kvalitete kako bi se izbjegle administrativne i druge pogreške, posebno pri oznaĉavanju uzoraka i voĊenju dokumentacije. Sumnja na zarazu, kao što je navedeno u ĉlanu 6. Pravilnika o provoĊenju sistemskog istraţivanja i mjera za sprjeĉavanje širenja i suzbijanje smeĊe truleţi krtola krompira i bakterijskog venuća krompira i paradajza, koju prouzrokuje bakterija R. solanacearum (u daljnjem tekstu: Pravilnik), podrazumijeva pozitivan rezultat testa za dijagnosticiranje ili brzog testa provjere provedenog na uzorku kao što je prikazano u dijagramima toka. Pozitivan rezultat dobijen u prvom brzom testu provjere (IF test, PCR/FISH, selektivna izolacija) mora se potvrditi drugim testom provjere koji se zasniva na drugom biološkom naĉelu. Ako je rezultat prvog testa provjere pozitivan, tada se sumnja na zarazu bakterijom R. solanacearum i mora se provesti drugi test provjere. Ako je rezultat drugog testa provjere pozitivan, tada je sumnja potvrĊena i testiranje se mora nastaviti prema šemi testiranja. Ako je rezultat drugog testa provjere negativan, tada se smatra da uzorak nije zaraţen bakterijom R. solanacearum. PotvrĊena zaraza, kao što je navedeno u ĉlanu 9. Pravilnika, podrazumijeva izolaciju i identifikaciju ĉiste kulture R. solanacearum te potvrdu patogenosti. ODJELJAK I. PRIMJENA ŠEME TESTIRANJA 1. Šema za detekciju i dijagnosticiranje uzroĉnika smeĊe truleţi i bakterijskog venuća (R. solanacearum) u krtolama krompira te biljkama krompira, paradajza ili drugim biljkama domaćinima sa simptomima smeĊe truleţi ili bakterijskog venuća. Postupak testiranja je namijenjen za krtole i biljke krompira sa simptomima tipiĉnim za ili koji upućuju na smeĊu truleţ ili bakterijsko venuće. Postupak ukljuĉuje brzi test provjere, izolaciju patogena iz zaraţenog provodnog tkiva na (selektivnu) hranjivu podlogu i, u sluĉaju pozitivnog rezultata, identifikaciju ĉiste kulture kao bakterije R. solanacearum. BRZI DIJAGNOSTIČKI TESTOVI( 2 ) Provesti najmanje jedan od slijededih testova za postavljanje vjerovatne dijagnoze test bakterijskog iscjedka iz stabljike( 3 ) poli-β-hidroksibutirat test ( 4 ) serološki test aglutinacije ( 5 ) IF test( 6 )/ FISH test( 7 )/ ELISA test( 8 )/ PCR test( 9 ) OSNOVNA IZOLACIJA ( 10 ) Kolonije tipične morfologije ( 11 ) R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 12 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 13 ) TEST PATOGENOSTI ( (14 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao R. solanacearum NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak je zaražen bakterijom R. solanacearum Krtola(i) krompira ili biljaka(e) krompira, paradajza ili drugih domadina sa simptomima za koje se sumnja da su uzročnici smeđa trulež ili bakterijsko uvenude ( 1 ) (1) Opis simptoma naveden je u Odjeljku II.1. (2) Brzi dijagnostiĉki testovi olakšavaju postavljanje vjerovatne dijagnoze, ali nisu nuţni. Negativan rezultat ne garantira uvijek odsutnost patogena. (3) Test bakterijskog iscjetka iz provodnog tkiva stabljike opisan je u Odjeljku VI.A.1. (4) Test za detekciju zrnaca poli-β-hidroksibutirata u bakterijskim ćelijama opisan je u Odjeljku VI.A.2. (5) Serološki testovi aglutinacije na bakterijskom iscjetku ili ekstraktu iz simptomatskog tkiva opisani su u Odjeljku VI.A.3. (6) IF test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.5. (7) FISH test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.7. (8) ELISA test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.8. (9) PCR test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.6. (10) Patogen se obiĉno moţe lako izolirati iz simptomatskog biljnog materijala metodom razrjeĊivanja i nasaĊivanja na hranjivu podlogu (Odjeljak II.3.) (11) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d. (12) Uzgoj bakterijske kulture moţe biti neuspješan u naprednom stadiju infekcije zbog kompeticije ili pretjeranog razmnoţavanja saprofitnih bakterija. Ako su simptomi bolesti tipiĉni, a test izolacije negativan, test izolacije se mora ponoviti, najbolje na selektivnoj hranjivoj podlozi. (13) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B. Nespecifiĉna karakterizacija je neobavezna ali se preporuĉuje za svaki novi sluĉaj. (14) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C. 2. Šema detekcije i identifikacije bakterije R. solanacearum u uzorcima krtola krompira bez simptoma Naĉelo: Postupak testiranja namijenjen je za detekciju skrivene zaraze u krtolama krompira. Pozitivan rezultat iz najmanje dva testa provjere (3), koji se zasniva na razliĉitim biološkim naĉelima, mora se dopuniti izolacijom patogena nakon ĉega slijedi, u sluĉaju izolacije tipiĉnih kolonija, potvrda ĉiste kulture kao R. solanacearum. Pozitivan rezultat dobijen na bazi samo jednog od testova provjere nije dovoljan da bi se uzorak smatrao zaraţenim. Testovi provjere i izolacija moraju omogućiti prag detekcije 10 3 do 10 4 ćelija/ml resuspendiranog taloga ukljuĉenog kao pozitivna kontrola u svakoj seriji testova. GLAVNI TESTOVI PROVJERE ( 3 ) IF test( 4 ) / selektivna izolacija ( 5 ) / PCR test ( 6 ) / FISH test( 7 )/ neobavezan pomoćni test: ELISA test( 8 ), Kolonije tipične morfologije ( 10 ) R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 11 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 12 ) TEST PATOGENOSTI ( 13 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao R. solanacearum NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak je zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak krtola ( 1 ) Ekstrakcija i koncentriranje patogena ( 2 ) Prvi test provjere ( 3 ) Negativno Pozitivno R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum SELEKTIVNA IZOLACIJA ( 5 ) i/ili biotest ( 9 ) Drugi test provjere ( 3 ) Negativno Pozitivno R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum (1) Standardna veliĉina uzoraka je 200 krtola, iako se postupak moţe provesti i na manjim uzorcima ako nije na raspolaganju 200 krtola. (2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku III.1.1. (3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj uzorak negativan. U sluĉaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni. (4) IF test opisan je u Odjeljku VI.A.5. (5) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4. (6) PCR testovi opisani su u Odjeljku VI.A.6. (7) FISH test opisan je u Odjeljku VI.A.7. (8) ELISA testovi opisani su u Odjeljku VI.A.8. (9) Biotest opisan je u Odjeljku VI.A.9. (10) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d. (11) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije iz istog resuspendiranog taloga ili ponovite uzimanje provodnog tkiva iz pupka krtola iz istog uzorka te, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke. (12) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B. (13) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C. 3. Šema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u uzorcima biljaka krompira, paradajza ili drugih biljaka domaćina bez simptoma GLAVNI TESTOVI PROVJERE ( 3 ) selektivna izolacija ( 4 ) / IF test( 5 ) / PCR test ( 6 ) / FISH test( 7 )/ neobavezan pomoćni test: ELISA test( 8 ), biotest ( 9 ) Svi testovi dali negativan rezultat Kolonije tipične morfologije ( 10 ) nakon izolacije R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 11 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 12 ) TEST PATOGENOSTI ( (13 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao R. solanacearum NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak je zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak dijelova stabljike ( 1 ) Ekstrakcija i koncentriranje patogena ( 2 ) (1) Za preporuĉene veliĉine uzoraka vidi Odjeljak III.2.1. (2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku III.2.1. (3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj uzorak negativan. U sluĉaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni. (4) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4. (5) IF test opisan je u Odjeljku VI.A.5. (6) PCR testovi opisani su u Odjeljku VI.A.6. (7) FISH test opisan je u Odjeljku VI.A.7. (8) ELISA test opisani su u Odjeljku VI.A.8. (9) Biotest opisan je u Odjeljku VI.A.9. (10) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d. (11) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije. (12) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B. (13) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C. ODJELJAK II. DETALJNE METODE ZA DETEKCIJU BAKTERIJE R. SOLANACEARUM U KRTOLAMA KROMPIRA, TE BILJKAMA KROMPIRA, PARADAJZA ILI DRUGIM BILJKAMA DOMAĆINIMA SA SIMPTOMIMA SMEĐE TRULEŢI ODNOSNO BAKTERIJSKOG VENUĆA 1. Simptomi 1.1. Simptomi na krompiru Biljka krompira Poĉetna faza infekcije u polju prepoznaje se po venuću lišća pri vrhu biljke na visokim temperaturama tokom dana, ali koje se oporavlja tokom noći. U ranim fazama venuća lišće ostaje zeleno ali kasnije poĉinje ţutiti i razvija se smeĊa nekroza. Dolazi i do epinastije. Ubrzo dolazi do nepovratnog venuća izdanka ili cijele biljke što dovodi do propadanja i odumiranja. Provodno tkivo poprijeĉno prerezane stabljike uvenule biljke obiĉno je smeĊe boje, a iz prereza izlazi ili se lako moţe gnjeĉenjem istisnuti mlijeĉni bakterijski iscjedak. Kad se prerezana stabljika stavi uspravno u vodu, niti sluzi će izlaziti iz provodnih snopova. Krtola krompira Krtole krompira treba prerezati poprijeĉno ili uzduţno u blizini pupka krtola. Poĉetna faza infekcije prepoznaje se po promjeni boje provodnog prstena od staklasto-ţute do svijetlosmeĊe iz kojeg se spontano, nakon nekoliko minuta, pojavljuje blijedi kremasti bakterijski iscjedak. Kasnije, provodno tkivo postaje izrazitije smeĊe i nekroza se moţe proširiti na parenhimsko tkivo. U uznapredovalim fazama infekcija izbija prema van od kraja pupka krtola i okaca iz kojih moţe curiti bakterijska sluz na koju se lijepe ĉestice tla. Na kori se mogu pojaviti crvenkasto smeĊa ulegnuća zbog propadanja provodnog tkiva iznutra. U uznapredovalim fazama bolesti uobiĉajen je i sekundarni razvoj gljiviĉne i bakterijske meke truleţi. 1.2. Simptomi na paradajzu Biljka paradajza Prvi vidljivi simptom je povenulost najmlaĊih listova. U uslovima koji su povoljni za patogen (temperatura tla oko 25 °C; zasićenost vlagom) u roku od nekoliko dana dolazi do epinastije i venuća samo jedne strane ili cijele biljke što dovodi do potpunog propadanja. U manje povoljnim uslovima (temperatura tla manja od 21 °C) venuće se rjeĊe pojavljuje, ali se na stabljici moţe razviti veliki broj adventivnog korijenja. Moguće je uoĉiti kao vodom natopljene pruge koje se proteţu duţ stabljike, od njene baze, koje su trag nekroze u provodnom sistemu. Ako se stabljika unakrsno prereţe, iz provodnog tkiva ĉija je boja promijenjena u smeĊu, curi bijeli ili ţućkasti bakterijski iscjedak. 1.3. Simptomi na drugim biljkama domaćinima Biljke Solanum dulcamara i S. Nigrum U prirodnim uslovima rijetko se uoĉavaju simptomi venuća kod ovih biljaka domaćina, osim ako temperatura tla prelazi 25 °C ili ako su nivoi inokuluma izuzetno visoki (npr. S. nigrum koji raste blizu oboljele biljke krompira ili paradajza). Ako doĊe do venuća, simptomi su isti kao i kod paradajza. Biljke S. dulcamara rastu sa stabljikama i korijenjem u vodi i na njima nije vidljivo venuće, ali je na poprijeĉnom prerezu baze stabljike ili dijelovima stabljike koji su pod vodom vidljiva svijetlosmeĊa obojenost provodnog tkiva. Bakterije mogu izlaziti iz prerezanog provodnog tkiva, u obliku sluzavog iscjetka ili niti, ako prerezanu stabljiku stavimo uspravno u vodu, ĉak i ako nema simptoma venuća. 2. Brzi testovi provjere Brzi testovi provjere olakšavaju postavljanje vjerovatne dijagnoze, ali nisu presudni. Primijenite jedan ili više slijedećih validiranih testova: 2.1. Test iscjetka iz stabljike(vidi Odjeljak VI.A.1.) 2.2. Detekcija zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB) Karakteristiĉna zrnca PHB-a u ćelijama R. solanacearum postaju vidljiva pri bojenju termiĉki fiksiranog razmaza bakterijskog iscjetka iz zaraţenog tkiva na mikroskopskom stakalcu nilskim plavilom A i sudanskim crnilom B. (vidi Odjeljak VI.A.2.). 2.3. Serološki testovi aglutinacije(vidi Odjeljak VI.A.3.) 2.4. Ostali testovi U ostale prikladne brze testove provjere spadaju IF test (vidi Odjeljak VI.A.5.), FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.), ELISA testovi (vidi Odjeljak VI.A.8.) i PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.). 3. Postupak izolacije (1) Uzmite bakterijski iscjedak ili dijelove tkiva promijenjene boje iz provodnog prstena krtola krompira ili iz provodnih snopova stabljike krompira, paradajza ili drugih venućih biljaka domaćina. Suspendirajte u manjoj koliĉini sterilne destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 4) te ostavite 5 do 10 minuta. (2) Pripremite niz decimalnih razrjeĊenja suspenzije. (3) Prenesite 50-100 µl suspenzije i razrjeĊenja na uobiĉajenu hranjivu podlogu (NA, YPGA ili SPA; vidi Dodatak 2.) i/ili na Kelmanovu tetrazolij-podlogu (Dodatak 2.) i/ili na validiranu selektivnu podlogu (npr. SMSA; vidi Dodatak 2.). Razmaţite primjenjujući odgovarajuću tehniku nanošenja razrjeĊenja na podlogu. Ako se smatra korisnim, pripremite odvojene podloge s razrijeĊenom ćelijskom suspenzijom bakterije R. solanacearum biovar 2 za pozitivnu kontrolu. (4) Inkubirajte podloge od dva do šest dana na 28 °C. a. Na uobiĉajenoj hranjivoj podlozi virulentni izolati bakterije R. solanacearum stvaraju pljosnate, nepravilne i tekuće kolonije biserne kremasto-bijele boje, ĉesto s karakteristiĉnim spiralama u sredini. Nevirulentni oblici bakterije R. solanacearum stvaraju male, okrugle, netekuće, maslaste kolonije koje su u cijelosti kremasto-bijele boje. – Na Kelmanovoj tetrazolij-podlozi i na SMSA podlozi spirale su krvavo crvene boje. Nevirulentni oblici bakterije R. solanacearum stvaraju male, okrugle, netekuće, maslaste kolonije koje su u cijelosti tamno crvene boje. 4. Identifikacijski testovi za bakteriju R. solanacearum Testovi za potvrdu identifikacije vjerovatnih izolata R. solanacearum navedeni su u Odjeljku VI.B. ODJELJAK III. 1. Detaljne metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u uzorcima krtola krompira bez simptoma 1.1. Priprema uzorka Napomena: – standardna veliĉina uzorka je 200 krtola po testu. Intenzivnije uzorkovanje zahtijeva više testova na uzorcima ove veliĉine. Veći broj krtola u uzorku dovest će do inhibicije ili će oteţati tumaĉenje rezultata. MeĊutim, postupak se moţe prikladno primijeniti za uzorke sa manje od 200 krtola, kada je na raspolaganju manje krtola; – validacija svih metoda za detekciju, koje su opisane u daljnjem tekstu, zasniva se na testiranju uzoraka od 200 krtola; – ekstrakt krompira koji je opisan u daljnjem tekstu moţe se koristiti i za detekciju bakterije Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus koja uzrokuje prstenastu truleţ krtola krompira. Neobavezna obrada prije pripreme uzorka: (a) Inkubirajte uzorak na 25-30 °C u periodu do dvije sedmice prije provoĊenja testova, kako bi se podstaklo umnoţavanje populacija bakterije R. solanacearum. (b) Operite krtole. Upotrijebite prikladna dezinfekcijska sredstva (spojeve hlora kada će se provesti PCR test kako bi se uklonila moguća DNK patogena) i deterdţente izmeĊu svakog uzorka. Osušite krtole na zraku. Postupak pranja je posebno koristan (ali ne obavezan) za uzorke sa previše tla i ako će se provesti PCR test ili direktna izolacija. 1.1.1. Ĉistim i dezinficiranim skalpelom ili noţem za povrće uklonite koru na pupku krtola tako da provodno tkivo bude vidljivo. Paţljivo izreţite malu jezgru provodnog tkiva iz pupka krtola pazeći da zahvatite što manje okolnog, neprovodnog tkiva. Napomena: Odvojite sve (trule) krtole sa mogućim simptomima smeĊe truleţi i testirajte ih posebno. Ako se pri izrezivanju jezgre pupka uoĉe mogući simptomi smeĊe truleţi, ta se krtola mora vizuelno pregledati i prerezati blizu pupka. Svaku prerezanu krtolu sa sumnjivim simptomima treba drţati najmanje dva dana na sobnoj temperaturi kako bi suberizirao, te ĉuvati u hladnjaku (na temperaturi od 4 do 10 °C) u odgovarajućim karantinskim uslovima. Sve se krtole, ukljuĉujući i one sa sumnjivim simptomima, trebaju ĉuvati u skladu sa ĉlanom 7. Pravilnika. 1.1.2. Stavite jezgre pupaka u neupotrijebljene posude za jednokratnu upotrebu koje se mogu zatvoriti i/ili hermetiĉki zatvoriti (ako su posude već upotrebljavane, moraju se temeljno oĉistiti i dezinficirati spojevima hlora). Poţeljno ih je odmah obraditi. Ako to nije moguće, ĉuvajte ih u posudi bez dodatka pufera, najduţe 72 sata u hladnjaku ili najduţe 24 sata na sobnoj temperaturi. Obradite jezgre pupaka jednim od slijedećih postupaka: a) dodajte dovoljnu koliĉinu (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) da pokrije jezgre pupaka i tresite na rotacijskoj tresilici (50-100 okretaja/min) 4 sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlaĊenje,ili b) homogenizirajte jezgre pupaka sa dovoljnom koliĉinom (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4), bilo u mješalici (npr. Waring ili Ultra Thurax) ili drobljenjem u dobro zatvorenoj vrećici za maceraciju za jednokratnu upotrebu (npr. vrećice Stomacher ili Bioreba od ĉvrstog politena, 150 mm x 250 mm, sterilizirane zraĉenjem) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Napomena: Ako se uzorci homogeniziraju u mješalici, postoji velika opasnost od njihove unakrsne kontaminacije. Preduzmite mjere opreza kako biste sprijeĉili nastajanje aerosola ili razlijevanje tokom postupka ekstrakcije. Pobrinite se da za svaki uzorak upotrijebite svjeţe sterilizirane noţiće i posude mješalice. Ako će se provesti PCR test, sprijeĉite prijenos DNK na spremnike ili drobilicu. Za PCR test preporuĉuje se drobljenje u vrećicama za jednokratnu upotrebu i korištenje epruveta za jednokratnu upotrebu. 1.1.3. Odlijte supernatant. Ako je previše mutan, razbistrite ga sporim centrifugiranjem (na najviše 180 g 10 minuta na temperaturi od 4 do 10 °C) ili vakuumskom filtracijom (40 do 100 µm), i dodatno isperite filter ekstrakcijskim puferom (oko 10 ml). 1.1.4. Koncentrirajte bakterijsku frakciju centrifugiranjem na 7000 g 15 minuta (ili 10000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10 °C te odlijte supernatant pazeći pri tom da se ne pomiješa talog. 1.1.5. Resuspendirajte talog u 1.5 ml pufera za talog (Dodatak 4). Upotrijebite 500 µl za testiranje na R. solanacearum, 500 µl za Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus i 500 µl kao referentni materijal. U referentni alikvot od 500 µl i u preostale alikvote koji se testiraju dodajte sterilni glicerol do konaĉne koncentracije od 10 do 25 % (v/v), snaţno promiješajte u vrtloţnoj mješalici te pohranite na temperaturi od –16 do –24 °C (sedmicama) ili od –68 do –86 °C (mjesecima). Tokom testiranja, alikvote koji se koriste ĉuvajte na temperaturi od 4 do 10 °C. Ne preporuĉuje se višekratno zamrzavanje i odmrzavanje. Ako je potreban transport ekstrakta, osigurajte dostavu u prijenosnom hladnjaku u roku od 24 do 48 sati. 1.1.6. Sve pozitivne kontrole i uzorci R. solanacearum moraju se odvojeno pripremiti i obraditi kako bi se izbjegla kontaminacija. To vrijedi za stakalca za imunofluorescenciju kao i za sve ostale testove. 1.2. Testiranje Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima: Selektivna izolacija (vidi Odjeljak VI.A.4.) IF test (vidi Odjeljak VI.A.5.) PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.) FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.) ELISA testovi (vidi Odjeljak VI.A.8.) Biotest (vidi Odjeljak VI.A.9.) 2. Detaljne metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u uzorcima biljaka krompira, paradajza ili drugih biljaka domaćina bez simptoma 2.1. Priprema uzorka Napomena: Za detekciju latentnih populacija bakterije R. solanacearum preporuĉuje se testiranje sastavljenih uzoraka. Postupak se moţe prikladno primijeniti na sastavljene uzorke s najviše 200 dijelova stabljika. Ako se provode sistemska istraţivanja, ona se moraju zasnivati na statistiĉki reprezentativnom uzorku biljne populacije koja se ispituje. 2.1.1. Stavite dijelove stabljika veliĉine 1 do 2 cm u zatvorenu sterilnu posudu prema slijedećim postupcima uzorkovanja: Presadnice paradajza iz rasadnika. Ĉistim dezinficiranim noţem odreţite dio veliĉine 1 cm sa donjeg dijela svake stabljike, neposredno iznad nivoa tla. Biljke paradajza iz polja ili staklenika. Ĉistim, dezinficiranim noţem odreţite najniţi postrani izdanak na svakoj biljci reţući tik iznad spoja sa stabljikom. Sa svakog boĉnog izdanka odreţite donji dio veliĉine 1 cm. Ostale biljke domaćini. Ĉistim, dezinficiranim noţem ili vrtlarskim makazama odreţite dio veliĉine 1 cm sa donjeg dijela svake stabljike, neposredno iznad nivoa tla. Ako se uzorkuje S. dulcamara ili druge biljke domaćini koje rastu u vodi, odreţite dio veliĉine 1-2 cm sa podvodnog dijela stabljike ili sa stolona sa vodenim korijenjem. Pri uzorkovanju na odreĊenoj lokaciji, preporuĉuje se testirati statistiĉki reprezentativni uzorak od najmanje 10 biljaka po mjestu uzorkovanja za svaku vrstu samoniklog bilja koje je potencijalni domaćin. Detekcija patogena najpouzdanija je krajem proljeća te tokom ljeta i jeseni, iako se prirodne infekcije mogu otkriti tokom cijele godine kod višegodišnje biljke Solanum dulcamara koja raste u tekućicama. Poznati domaćini su samonikle biljke krompira (krtole ostale u tlu), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i druge vrste porodice Solanaceae. Ostale biljke domaćini su Pelargonium spp. i Portulaca oleracea. Evropske vrste samoniklog bilja koje u specifiĉnim uslovima okoliša mogu biti potencijalni domaćini populacija R. solanacearum biovar 2 / rasa 3 u korijenju i/ili rizosferi su Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra i Urtica dioica. Napomena: U ovoj fazi moţe se obaviti vizuelni pregled biljaka (obojenost ţila ili bakterijski iscjedak). Odvojite sve dijelove stabljika sa simptomima i testirajte ih posebno. (vidi Odjeljak II.) 2.1.2. Kratko dezinficirajte dijelove stabljika 70 %-tnim etanolom i odmah posušite papirnatim ruĉnikom. Dijelove stabljika potom obradite jednim od slijedećih postupaka: a) prekrijte ih dovoljnom koliĉinom (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) i tresite na rotacijskoj tresilici (50-100 okretaja/min) ĉetiri sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlaĊenje,ili b) odmah obradite drobljenjem u ĉvrstoj vrećici za maceraciju (npr. Stomacher ili Bioreba) sa odgovarajućom koliĉinom ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Ako to nije moguće, dijelove stabljika ĉuvajte u hladnjaku najduţe 72 sata ili na sobnoj temperaturi najduţe 24 sata. 2.1.3. Nakon 15 minuta taloţenja, izlijte supernatant. 2.1.4. Dodatno bistrenje ekstrakta ili koncentriranje bakterijske frakcije obiĉno nije potrebno, ali se moţe postići filtriranjem i/ili centrifugiranjem kako je opisano u Odjeljku III.1.1.3. – 1.1.5. 2.1.5. Podijelite ĉisti ili koncentrirani ekstrakt uzorka na dva jednaka dijela. Jednu polovinu ĉuvajte na temperaturi od 4 do 10 °C tokom testiranja, a drugu polovinu pohranite sa 10-25 % (v/v) sterilnog glicerola na temperaturi od –16 do – 25 °C (sedmicama) ili od – 68 do – 86 °C (mjesecima) u sluĉaju da je potrebno daljnje testiranje. 2.2. Testiranje Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima: Selektivna izolacija (vidi Odjeljak VI.A.4.) IF test (vidi Odjeljak VI.A.5.) PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.) FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.) ELISA testovi (vidi Odjeljak VI.A.8.) Biotest (vidi Odjeljak VI.A.9.) ODJELJAK IV. 1. Šema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u vodi Kolonije tipične morfologije ( 7 ) nakon izolacije R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 8 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 9 ) TEST PATOGENOSTI ( 10 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao R. solanacearum NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak je zaražen bakterijom R. solanacearum GLAVNI TESTOVI PROVJERE selektivna izolacija ( 3 ) neobavezni pomoćni testovi: biotest ( 4 )/ PCR test sa obogadenjem ( 5 ) ELISA test sa obogadenjem ( 6 ), Uzorak vode ( 1 ) Koncentriranje patogena ( 2 ) (1) Za preporuĉene postupke uzorkovanja vidi Odjeljak IV.2.1. (2) Metode koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku IV.2.1. Koncentriranjem se povećavaju populacije i patogena i konkurentnih saprofitnih bakterija te se taj postupak preporuĉuje jedino ako neće inhibirati izolaciju. (3) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4. (4) Biotest je opisan u Odjeljku VI.A.9. (5) Metode obogaćivanja za PCR test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku VI.A.6. (6) Metode obogaćivanja za ELISA test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku VI.A.8. (7) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d. (8) Uzgoj bakterijske kulture moţe biti neuspješan zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterija. Ako se sumnja da će velike populacije saprofitnih bakterija uticati na pouzdanost izolacije, ponovite izolaciju nakon što uzorak razrijedite u sterilnoj vodi. (9) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B. (10) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C. 2. Metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u vodi Naĉelo Validirani postupak opisan u ovom odjeljku moţe se primijeniti za detekciju patogena u uzorcima površinske vode kao i za ispitivanje uzoraka tekućeg otpada nastalog pri preradi krompira ili otpadnih voda. MeĊutim, vaţno je napomenuti da će oĉekivana osjetljivost detekcije ovisiti o supstratu. Na osjetljivost izolacije utiĉu populacije konkurentnih saprofitnih bakterija koje su uopćeno veće u otpadnim vodama nastalim pri preradi i obradi krompira nego u površinskim vodama. Dok se moţe oĉekivati da će se dalje opisanim postupkom detektirati tek 10 3 ćelija po litru površinske vode, osjetljivost detekcije u tekućem otpadu nastalom pri preradi krompira i u otpadnim vodama bit će vjerovatno znatno niţa. Zbog toga se preporuĉuje da se testiraju otpadne vode poslije svakog postupka proĉišćavanja (npr. sedimentacije ili filtriranja) tokom kojega se smanjuju populacije saprofitnih bakterija. Kada ocjenjujemo pouzdanost dobijenih negativnih rezultata, treba uzeti u obzir ograniĉenja u osjetljivosti postupka testiranja. Iako se ovaj postupak uspješno primjenjuje u istraţivanjima ĉiji je cilj utvrditi prisutnost ili odsutnost patogena u površinskim vodama, treba biti svjestan njegovog ograniĉenja ako se koristi u sliĉnim istraţivanjima tekućeg otpada nastalog pri preradi krompira ili otpadnih voda. 2.1. Priprema uzorka Napomena: – Detekcija bakterije R. solanacearum u površinskim vodama najpouzdanija je u kasno proljeće te tokom ljeta i jeseni kada je temperatura vode iznad 15 °C. – Ponovljena uzorkovanja u razliĉito vrijeme tokom gore navedenih perioda na odreĊenim mjestima uzorkovanja povećat će pouzdanost detekcije jer će se smanjiti uĉinci vremenskih promjena. – Treba uzeti u obzir uĉinke obilnih padavina te geografska obiljeţja tekućice kako bi se izbjegao znaĉajni uticaj razrjeĊenja koji moţe prikriti prisutnost patogena. – Uzorke površinske vode treba uzeti blizu biljaka domaćina ako one postoje. 2.1.1. Na odabranim mjestima uzorkovanja uzmite uzorke vode u sterilne epruvete ili boce za jednokratnu upotrebu, po mogućnosti na dubini većoj od 30 cm i na udaljenosti od najviše 2 m od obale. U sluĉaju tekućeg otpada nastalog pri preradi krompira i otpadnih voda, uzorke uzmite na mjestu njihovog ispusta. Preporuĉena veliĉina uzorka je 500 ml po mjestu uzorkovanja. Ako se ţele manji uzorci, preporuĉuje se uzimanje uzoraka najmanje tri puta na svakom mjestu uzorkovanja, pri ĉemu se svaki uzorak sastoji od dva poduzorka od najmanje 30 ml. Za intenzivno istraţivanje odaberite najmanje tri mjesta uzorkovanja na 3 km tekućice te osigurajte uzimanje uzoraka i iz pritoka te tekućice. 2.1.2. Uzorke prevozite u tami i pri niskim temperaturama (4 do 10 °C) i testirajte ih u roku od 24 sata. 2.1.3. Bakterijska frakcija moţe se, po potrebi, koncentrirati pomoću jedne od slijedećih metoda: (a) centrifugirajte 30 do 50 ml poduzorka na 10 000 g 10 minuta (ili 7 000 g 15 minuta) po mogućnosti na temperaturi od 4 do 10 °C, uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 1 ml pufera za talog (Dodatak 4.); (b) membranskom filtracijom (najmanja veliĉina pora 0,45 µm) nakon koje se filter ispira u 5 do 10 ml pufera za talog, koji se sakuplja. Ova je metoda prikladna za veće koliĉine vode koja sadrţi mali broj saprofita. Koncentriranje se obiĉno ne preporuĉuje za uzorke tekućeg otpada nastalog pri preradi krompira ili uzorke otpadnih voda jer će veće populacije konkurentnih saprofitnih bakterija sprijeĉiti detekciju bakterije R. solanacearum. 2.2. Testiranje Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima. ODJELJAK V. 1. Šema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u tlu GLAVNI TESTOVI PROVJERE selektivna izolacija ( 2 ) neobavezan pomoćni test: PCR test ( 3 ) / biotest ( 4 ) Svi testovi dali negativan rezultat Kolonije tipične morfologije ( 5 ) nakon izolacije R. solanacearum nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 6 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 7 ) TEST PATOGENOSTI ( 8 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao R. solanacearum NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak je zaražen bakterijom R. solanacearum Uzorak tla ( 1 ) Ekstrakcija patogena (1) Za preporuĉene postupke uzorkovanja vidi Odjeljak IV.2.1. (2) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4. (3) Metode obogaćivanja za PCR test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku VI.A.6. (4) Biotest je opisan u Odjeljku VI.A.9. (5) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d. (6) Uzgoj bakterijske kulture moţe biti neuspješan zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnih bakterija. Ako se sumnja da će velike populacije saprofitnih bakterija uticati na pouzdanost izolacije, ponovite izolaciju nakon što uzorak dodatno razrijedite. (7) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum postiţe se primjenom testova opisanih u Odjeljku VI.B. (8) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.2. Metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u tlu Naĉela: Validirani postupak opisan u ovom odjeljku moţe se primijeniti za detekciju patogena u uzorcima tla kao i za ispitivanje uzoraka krutog otpada nastalog pri preradi krompira ili uzoraka kanalizacijskog mulja. MeĊutim, vaţno je napomenuti da ove metode nisu dovoljno osjetljive da bi garantirale detekciju manjih i/ili neravnomjerno rasporeĊenih populacija bakterije R. solanacearum koje mogu biti prirodno prisutne u uzorcima tih supstrata. Treba uzeti u obzir ograniĉenja u osjetljivosti ovog postupka testiranja pri ocjenjivanju pouzdanosti dobijenih negativnih rezultata kao i kada ovaj postupak primjenjujemo u istraţivanjima ĉiji je cilj da se utvrdi prisutnost ili odsutnost patogena u tlu ili mulju. Najpouzdaniji naĉin utvrĊivanja prisutnosti patogena u tlu na polju je taj da posadimo biljku domaćina koja je osjetljiva na taj patogen te pratimo hoće li doći do infekcije, ali ĉak ni ovom metodom neće se otkriti niski nivoi kontaminacije. 2.1. Priprema uzorka 2.1.1. Uzorkovanje tla u polju treba obavljati u skladu sa osnovnim naĉelima koja se primjenjuju kod uzorkovanja za ispitivanje nematoda. Sa 60 mjesta na svaka 0,3 ha uzmite 0,5 do 1 kg tla po uzorku, sa dubine od 10 do 20 cm (ili na mreţi od 7 x 7 metara). Ako se sumnja na prisutnost patogena, povećajte broj mjesta uzorkovanja na 120 na svakih 0,3 ha. Prije testiranja uzorke ĉuvajte na temperaturi od 12 do 15 °C. Uzorkovanje krutog otpada nastalog pri preradi krompira ili uzorkovanje kanalizacijskog mulja obavite tako što ćete uzeti ukupno 1 kg na mjestima koja predstavljaju ukupnu koliĉinu mulja koju treba testirati. Svaki uzorak dobro promiješajte prije testiranja. 2.1.2. Rastresite poduzorke od 10 do 25 g tla ili mulja na rotacijskoj tresilici (250 o/min) u 60 do 150 ml ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) najduţe dva sata. Dodavanje 0,02 %-tnog sterilnog Tween -20 i 10 do 20 g sterilnog pijeska moţe, po potrebi, pridonijeti rastresanju. 2.1.3. Suspenziju odrţavajte na temperaturi od 4 °C tokom testiranja. 2.2. Testiranje Vidi dijagram i opis testova u odgovarajućim dodacima. ODJELJAK VI. OPTIMALIZIRANI PROTOKOLI ZA DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE R. SOLANACEARUM A. DIJAGNOSTIĈKI TESTOVI I TESTOVI ZA DETEKCIJU B. 1. Test iscjetka iz stabljike Vjerovatna prisutnost bakterije R. solanacearum u stabljikama uvelih biljaka krompira, paradajza ili drugih biljaka domaćina moţe se utvrditi slijedećim jednostavnim testom: odreţite stabljiku neposredno iznad nivoa tla. Odrezani kraj stavite u epruvetu sa ĉistom vodom. Pratite hoće li nakon nekoliko minuta iz prerezanih provodnih snopova poĉeti spontano izlaziti karakteristiĉne niti bakterijske sluzi. 2. Detekcija zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB) 1. Na mikroskopskom stakalcu pripremite razmaz bakterijskog iscjetka iz zaraţenog tkiva ili iz 48-satne kulture sa hranjive podloge YPGA ili SPA (vidi Dodatak 2). 2. Za pozitivnu kontrolu pripremite razmaze biovara 2, bakterije R. solanacearum i, ako smatrate korisnim, za negativnu kontrolu razmaz bakterijske vrste za koju je poznato da je negativna na PHB. 3. Razmaze ostavite da se osuše na zraku i donju stranu svakog stakalca brzo povucite iznad plamena da se razmazi fiksiraju. 4. Obojite preparat ili Nilskim plavilom ili Sudanskim crnilom te promatrajte pod mikroskopom kako je opisano u daljnjem tekstu: Nilsko plavilo test: a) Prelijte svako stakalce s 1 %-tnom vodenom otopinom Nilskog plavila A i inkubirajte 10 minuta na 55 °C. b) Ocijedite rastvor boje. Isperite kratko pod blagim mlazom vode iz slavine. Višak vode uklonite upijajućim papirom. c) Prelijte razmaz 8 %-tnim vodenim rastvorom sirćetne kiseline i inkubirajte jednu minutu na sobnoj temperaturi. d) Isperite kratko pod blagim mlazom vode iz slavine. Višak vode uklonite upijajućim papirom. e) Ponovo navlaţite kapljicom vode i pokrijte pokrovnim stakalcem. f) Pregledajte obojeni razmaz epifluorescentnim mikroskopom na 450 nm, imerzijskim objektivom povećanja od 600 do 1000 x (uljna ili vodena imerzija). g) Pregledajte da li je prisutna svijetlonaranĉasta fluorescencija zrnaca PHB-a. TakoĊer pregledajte pod normalnim svjetlom kako biste se uvjerili da su zrnca unutarćelijska i da je ćelijska morfologija tipiĉna za bakteriju R. solanacearum. Sudansko crnilo test: (a) Prelijte svako stakalce 0,3 %-tnom otopinom Sudanskog crnila B u 70 %-tnom etanolu i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.\ (b) Ocijedite otopinu boje, kratko isperite pod mlazom vode iz slavine i višak vode uklonite upijajućim papirom. (c) Stakalca nakratko umoĉite u ksilol te ih osušite na upijajućem papiru. Oprez! Ksilol je opasan za zdravlje. Preduzmite potrebne sigurnosne mjere i radite u digestoru. (d) Prelijte stakalca 0,5 %-tnom (w/v) vodenom otopinom safranina i ostavite 10 sekundi na sobnoj temperaturi. Oprez! Safranin je opasan za zdravlje. Preduzmite potrebne sigurnosne mjere i radite u digestoru. (e) Isperite pod blagim mlazom vode iz slavine, osušite na upijajućem papiru te pokrijte pokrovnim stakalcem. (f) Pregledajte obojene razmaze pod mikroskopom koji koristi prolazno svjetlo, uljnim imerzijskim objektivom povećanja od 1000 x. (g) Pregledajte uoĉavaju li se plavo-crno obojena zrnca PHB-a u stanicama R. solanacearum sa ruţiĉasto obojenim ćelijskim stjenkama. 3. Serološki test aglutinacije Aglutinacija ćelija bakterije R. solanacearum u bakterijskom iscjetku ili ekstraktima simptomatskih tkiva najbolje se opaţa korištenjem validiranih antitijela (vidi Dodatak 3) obiljeţenih odgovarajućim obojenim oznakama kao što su crvene ćelije Staphylococcus aureus ili obojene ĉestice lateksa. Ako koristite komplet koji je dostupan na trţištu (vidi Dodatak 3), slijedite upute proizvoĊaĉa. U protivnom, primijenite slijedeći postupak: (a) pomiješajte kapljice suspenzije obiljeţenog antitijela i bakterijskog iscjetka (oko 5 µl svakog) na predmetnim stakalcima sa više otvora; (b) pripremite pozitivne i negativne kontrole koristeći suspenzije R. solanacearum biovar 2 i heterolognog soja; (c) posmatrajte hoće li doći do aglutinacije u pozitivnim uzorcima nakon 15 sekundi laganog miješanja. 4. Selektivna izolacija 4.1. Nasađivanje na selektivnu podlogu Napomena: Prije nego ovu metodu prvi put primijenite, obavite prethodne testove kako biste osigurali ponovljivu detekciju 10 3 do 10 4 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije R. solanacearum po ml, a koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su prema ranijim testiranjima negativni. Koristite primjereno validiranu selektivnu hranjivu podlogu kao što je SMSA (prilagoĊenu prema Elphinstone i sur., 1996; vidi Dodatak 2).Trebate dobro paziti da razlikujete R. solanacearum od drugih bakterija ĉije kolonije mogu rasti na toj hranjivoj podlozi. Nadalje, kolonije R. solanacearum mogu biti netipiĉne morfologije ako su podloge prenatrpane ili ako su prisutne antagonistiĉke bakterije. Ako se sumnja na uĉinke kompeticije ili antagonizma, uzorak treba ponovo testirati drugim testom. Najveća osjetljivost detekcije ovom metodom moţe se oĉekivati ako se koriste svjeţe pripremljeni ekstrakti uzoraka. MeĊutim, ova se metoda moţe primjenjivati i na ekstraktima koji su bili pohranjeni sa glicerolom na temperaturi od – 68 do – 86 °C. Za pozitivnu kontrolu pripremite decimalna razrjeĊenja suspenzije od 106 CFU/ml virulentnog soja biovara 2, R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Kako bi se sprijeĉila svaka mogućnost kontaminacije, pozitivne kontrole pripremite potpuno odvojeno od uzoraka koje ćete ispitivati. Za svaku novopripremljenu seriju selektivne hranjive podloge treba, prije nego se upotrijebi za testiranje rutinskih uzoraka, provjeriti da li je prikladna za rast patogena. Kontrolni materijal testirajte na isti naĉin kao i uzorke. 4.1.1. Primijenite odgovarajuću tehniku nanošenja razrjeĊenja kako biste osigurali da su sve populacije saprofitnih bakterija dovoljno razrijeĊene. Nanesite 50 – 100 µl ekstrakta uzorka po podlozi i po svakom razrjeĊenju. 4.1.2. Inkubirajte podloge na 28 °C. Oĉitajte podloge nakon 48 sati, a nakon toga svaki dan u periodu do šest dana. Tipiĉne kolonije R. solanacearum na hranjivoj podlozi SMSA mlijeĉno-bijele su boje, pljosnate, nepravilnog oblika i tekuće, a nakon tri dana inkubacije sredina im postaje ruţiĉasta do krvavo-crvena sa unutrašnjim prugama ili spiralama. Napomena: Na ovoj hranjivoj podlozi ponekad rastu i netipiĉne kolonije R. solanacearum. One mogu biti malene, okrugle, potpuno crvene boje i netekuće ili samo djelimiĉno tekuće te ih je, stoga, teško razlikovati od kolonija saprofitnih bakterija. 4.1.3. Vjerovatne kolonije R. solanacearum, nakon što ste ih nanijeli ili razrijedili i precijepili na uobiĉajenu hranjivu podlogu, proĉistite kako biste dobili pojedinaĉne izdvojene kolonije (vidi Dodatak 2). 4.1.4. Kulture se kratko vrijeme mogu ĉuvati u sterilnoj vodi (pH 6 do 8, bez hlora) na sobnoj temperaturi u tami ili duţe vrijeme u prikladnom krioprotektoru na temperaturi od – 68 do – 86 °C ili liofilizirane. 4.1.5. Identificirajte vjerovatne kulture (vidi Odjeljak VI.B) i provedite test patogenosti (vidi Odjeljak VI.C). Tumaĉenje rezultata selektivne izolacije Selektivna izolacija je negativna ako se nakon šest dana ne uoĉavaju nikakve bakterijske kolonije ili ako se ne pronaĊu sumnjive kolonije tipiĉne za R. solanacearum, pod uslovom da se ne sumnja na inhibiciju zbog konkurencije ili antagonizma drugih bakterija i da su tipiĉne kolonije R. solanacearum pronaĊene u pozitivnim kontrolama. Selektivna izolacija je pozitivna ako se izdvoje sumnjive kolonije R. solanacearum. 4.2. Postupak obogaćivanja Upotrijebite validirani medij za obogaćivanje kao što je modificirani Wilbrink tekući medij (vidi Dodatak 2). Ovaj se postupak moţe primijeniti za selektivno povećanje populacije R. solanacearum u ekstraktima uzoraka te da se poveća osjetljivost detekcije. Ovim se postupkom, takoĊer, djelotvorno razrjeĊuju inhibitori PCR reakcije (1:100). MeĊutim, treba napomenuti da obogaćivanje R. solanacearum moţe biti neuspješno zbog kompeticije ili antagonizma saprofitnih organizama koji se ĉesto istovremeno obogaćuju. Zbog toga moţe biti teško izdvojiti R. solanacearum iz kultura obogaćenih u tekućem mediju. Pored toga, obzirom da se populacije serološki srodnih saprofita mogu povećati, preporuĉuje se upotreba specifiĉnih monoklonskih antitijela umjesto poliklonskih antitijela ako će se provesti ELISA test. 4.2.1. Za obogaćivanje za PCR test prenesite 100 µl ekstrakta uzorka u 10 ml tekućeg medija za obogaćivanje (Dodatak 2) koji je prethodno podijeljen u alikvote u epruvete ili boĉice bez DNK. Za obogaćivanje za ELISA test mogu se koristiti veći udjeli ekstrakta uzorka u tekućem mediju (npr. 100 µl u 1,0 ml tekućeg medija za obogaćivanje). 4.2.2. Inkubirajte 72 sata na temperaturi od 27 do 30 °C sa ili bez protresivanja, sa labavim ĉepom da se omogući prozraĉivanje. 4.2.3. Dobro promiješajte prije korištenja u ELISA ili PCR testovima. 4.2.4. Sa obogaćenim tekućim medijem postupajte isto kao i sa uzorcima u prije opisanim testovima. Napomena: Ako oĉekujete da će obogaćivanje R. solanacearum biti onemogućeno zbog velikih populacija odreĊenih konkurentnih saprofitnih bakterija, bolje rezultate ćete moţda dobiti ako ekstrakte uzoraka obogatite prije centrifugiranja ili drugih postupaka koncentriranja. 5. IF Test načelo Upotreba IF testa kao osnovnog testa provjere preporuĉuje se zbog njegove dokazane dosljednosti pri postizanju zahtijevanih pragova detekcije. Kada se IF test koristi kao glavni test provjere i ako je IF oĉitanje pozitivno, mora se provesti izolacija, PCR test ili FISH test kao drugi test provjere. Kada se IF test koristi kao drugi test provjere i IF oĉitanje je pozitivno, potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu toka kako bi se dovršila analiza. Napomena: Koristite validirani izvor antitijela za R. solanacearum Preporuĉuje se da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se definira kao najveće razrjeĊenje kod kog dolazi do optimalne reakcije pri testiranju suspenzije koja sadrţi 10 5 do 10 6 ćelija po ml homolognog soja bakterije R. solanacearum uz korištenje fluorescein izotiocijanat (FITC) konjugiranih antitijela prema preporukama proizvoĊaĉa. Svi validirani poliklonski serumi imali su IF titar najmanje 1:2000. Tokom testiranja, treba koristiti antitijela u radnim razrjeĊenjima koja su blizu ili jednaka titru.Test treba provesti na svjeţe pripremljenim ekstraktima uzoraka. On se, po potrebi, moţe uspješno provesti i na ekstraktima koji su bili pohranjeni na temperaturi od – 68 do – 86 °C sa dodatkom glicerola. Glicerol se moţe ukloniti dodavanjem 1 ml pufera za talog (Dodatak 4), ponovnim 15-minutnim centrifugiranjem na 7000 g i resuspendiranjem u jednakom volumenu pufera za talog. To je rijetko potrebno, naroĉito ako su uzorci plamenom fiksirani na stakalca. Za pozitivnu kontrolu pripremite odvojena stakalca sa homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije R. solanacearum suspendiranim u ekstraktu krompira kako je navedeno u Dodatku 3B te, po izboru, u puferu. Kao sliĉnu kontrolu na istom stakalcu trebalo bi, po mogućnosti, koristiti prirodno zaraţeno tkivo (odrţavano liofilizacijom ili zamrzavanjem na –16 do – 24°C). Za negativnu kontrolu mogu se upotrijebiti alikvoti ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju na R. solanacearum pokazali negativan rezultat. U Dodatku 3. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu. Koristite predmetna stakalca sa više otvora, po mogućnosti sa 10 otvora promjera najmanje 6 mm. Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke. 5.1. Pripremite stakalca za testiranje prema jednom od slijedećih postupaka: (i) Za suspenzije taloga sa relativno malo skroba: U prvi otvor pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za otvore promjera 6 mm – za veće otvore povećajte volumen) razrjeĊenja od 1/100 resuspendiranog taloga krompira. Potom u ostale otvore u istom redu pipetom odmjerite sliĉni volumen nerazrijeĊene suspenzije (1/1) taloga. Drugi red se moţe koristiti za duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na slici 1. (ii) Za ostale suspenzije taloga: Pripremite decimalna razrjeĊenja (1/10, 1/100) resuspendiranog taloga u puferu za talog. U jedan red otvora pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za otvore promjera 6 mm – za veće otvore povećajte volumen) resuspendiranog taloga i svakog razrjeĊenja. Drugi se red moţe koristiti kao duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na slici 2. 5.2. Ostavite da se kapljice osuše na sobnoj temperaturi ili ih zagrijavajte do temperature od 40 do 45 °C. Fiksirajte bakterijske ćelije na stakalce bilo zagrijavanjem (15 minuta na 60 °C), provlaĉenjem kroz plamen, 95 %-tnim etanolom ili prema posebnim uputama dobavljaĉa antitijela. Prije daljnjih testiranja, fiksirana se stakalca mogu, po potrebi, kratko vrijeme (najviše do tri mjeseca) ĉuvati zamrznuta u suhom spremniku. 5.3. IF postupak (i) U skladu sa postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod 5.1.(i): Pripremite niz dvostrukih razrjeĊenja antitijela. Prvi otvor mora imati 1/2 titra (T/2), a ostale 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i dvostruki titar (2T). (ii) U skladu sa postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod 5.1.(ii): Pripremite radno razrjeĊenje antitijela u IF puferu. Radno razrjeĊenje utiĉe na specifiĉnost. Slika1. Priprema stakalca u skladu sa stavovima 5.1.(i) i 5.3.(i) RazrjeĊenja resuspendiranog taloga. Slika 1. Priprema stakalca u skladu sa tačkama 5.1.(i) i 5.3.(i) Razrjeđenja rastvorenog taloga 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 □ razrjeđenja rastvorenog taloga (T = titar) T/2 T/4 T/2 T 2T □ dvostruka razrjeđenja seruma/antitijela Uzorak 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Slika 2. Priprema stakalaca u skladu sa tačkama 5.1. (ii) i 5.3.(ii) Radna razrjeđenja seruma/antitijela 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 □ decimalna razrjeđenja rastvorenog taloga Uzorak 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Slika 2. Priprema stakalca u skladu sa stavovima 5.1.(ii) i 5.3.(ii) Radna razrjeĊenja seruma/antitijela. 5.3.1. Posloţite stakalca na navlaţeni upijajući papir. Svaki otvor potpuno prekrijte razrjeĊenjem antitijela. Volumen antitijela koji se stavlja u pojedini otvor mora biti jednak volumenu stavljenog ekstrakta. Slijedite slijedeći postupak ako nema posebnih uputa dobavljaĉa antitijela: 5.3.2. Inkubirajte stakalca na vlaţnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25 °C). 5.3.3. Otresite kapljice sa svakog stakalca i paţljivo ih isperite IF puferom. Potopite ih 5 minuta u IF pufer-Tween (Dodatak 4) i nakon toga u IF pufer. Pazite da ne doĊe do stvaranja aerosola ili prijenosa kapljica jer bi to moglo dovesti do unakrsne kontaminacije. Stakalca paţljivo osušite upijajućim papirom. 5.3.4. Posloţite stakalca na navlaţeni upijajući papir. Otvore prekrijte razrijeĊenim FITC konjugatom koji se koristi za odreĊivanje titra. Volumen konjugata nanesenog na otvore mora biti jednak volumenu nanesenog antitijela. 5.3.5. Inkubirajte stakalca na vlaţnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25 °C). 5.3.6. Otresite kapljice konjugata sa stakalca. Isperite i operite kako je prethodno opisano (5.3.3). Paţljivo osušite. 5.3.7. Na svaki otvor pipetom nanesite 5-10 µl 0,1 M glicerola sa fosfatnim puferom (Dodatak 4) ili sredstvo protiv izbljeĊivanja koje je dostupno na trţištu te stavite pokrovno stakalce. 5.4. Očitavanje IF testa 5.4.1. Pregledajte pripremljena stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom sa odgovarajućim filterima za ekscitaciju FITC-a, uz uljnu imerziju i povećanje od 500-1000 x. Pregledajte svaki otvor preko dva meĊusobno okomita promjera i duţ vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj ćelija ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja. Najprije pregledajte stakalce sa pozitivnom kontrolom. Ćelije moraju snaţno fluorescirati i moraju biti potpuno obojene na utvrĊenom titru antitijela ili radnog razrjeĊenja. U sluĉaju da kod obojenosti doĊe do odstupanja, IF test se mora ponoviti (Odjeljak VI.A.5). 5.4.2. Pregledajte da li su u otvorima vidljive jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije za bakteriju R. solanacearum Intenzitet fluorescencije mora biti jednak kao i kod pozitivnog kontrolnog soja pri jednakom razrjeĊenju antitijela. Ćelije sa nepotpunim obojenjem ili sa slabom fluorescencijom moraju se zanemariti. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Moţe se sumnjati ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne ćelije zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne ćelije pronaĊene (izvan otvora) na površini stakalca. 5.4.3. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifiĉnost testa imunofluorescencije. U koncentriranom ekstraktu jezgri pupaka ili dijelova stabljika mogu se nalaziti populacije fluorescirajućih ćelija netipiĉne morfologije i saprofitne bakterije sa kojima dolazi do unakrsne reakcije i koje su po veliĉini i morfologiji sliĉne bakteriji R. solanacearum. 5.4.4. U obzir uzmite samo fluorescirajuće ćelije tipiĉne veliĉine i morfologije u titru ili radnom razrjeĊenju antitijela kako je opisan u stavu 5.3. 5.4.5. Tumaĉenje oĉitanja IF testa (i) Ako naĊete jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije, odredite prosjeĉan broj tipiĉnih ćelija po mikroskopskom vidnom polju i izraĉunajte broj tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 5). Oĉitanje IF testa je pozitivno za uzorke koji imaju najmanje 5 x 10 3 tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga. Uzorak se smatra potencijalno kontaminiranim i potrebno je daljnje testiranje. (ii) Oĉitanje IF testa je negativno za uzorke koji imaju manje od 5 x 10 3 ćelija po ml resuspendiranog taloga te se uzorak smatra negativnim. Nije potrebno daljnje testiranje. 6. PCR Testovi Naĉela Kada se PCR test koristi kao glavni test provjere i rezultat je pozitivan, mora se provesti IF test ili izolacija kao drugi obavezni test provjere. Kada se PCR test koristi kao drugi test provjere i rezultat je pozitivan, za postavljanje konaĉne dijagnoze potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu. Korištenje ove metode kao glavnog testa provjere preporuĉuje se samo ako ste struĉno osposobljeni. Napomena: Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10 3 do 10 4 ćelija bakterije R. solanacearum po ml, koje su dodate ekstraktima uzoraka koji su u prethodnim testiranjima dali negativan rezultat. Kako bi se postigao najveći stepen osjetljivosti i specifiĉnosti u svim laboratorijama, mogu biti potrebni eksperimenti za optimizaciju metode. Koristite validirane reagense i protokole za PCR (vidi Dodatak 6). Poţeljno je odabrati metodu sa internom kontrolom. Preduzmite odgovarajuće mjere opreza kako biste izbjegli kontaminaciju uzorka ciljnom DNK. Da bi se sprijeĉila kontaminacija ciljnom DNK, PCR test trebali bi obavljati iskusni struĉnjaci, u specijaliziranim laboratorijama za molekularnu biologiju. Negativne kontrole (za ekstrakciju DNK i PCR postupak) treba uvijek obraditi kao zadnje uzorke u postupku kako bi se vidjelo da li je došlo do prijenosa DNK. U PCR test treba ukljuĉiti slijedeće negativne kontrole: – ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na R. solanacearum bio negativan – pufer korišten za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka – reakcijsku smjesu za PCR treba ukljuĉiti slijedeće pozitivne kontrole: – alikvote resuspendiranih taloga u koje je dodata bakterija R. solanacearum (za pripremu vidi Dodatak 3B). – suspenziju u vodi od 10 6 ćelija/ml bakterije R. solanacearum virulentnog izolata (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 3 B). – ako je moguće, u PCR testu upotrijebite i DNK ekstrahiranu iz pozitivnih kontrolnih uzoraka. Da bi se izbjegla moguća kontaminacija, pozitivne kontrole pripremite prostorno odvojeno od uzoraka za testiranje. Ekstrakti uzoraka moraju sadrţavati što je moguće manje tla. Ako namjeravate primjenjivati PCR protokole, u nekim bi sluĉajevima bilo preporuĉljivo oprati krtole prije pripreme ekstrakta. U Dodatku 3. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni materijali koji se mogu koristiti u ovim testovima. 6.1. Metode pročišćavanja DNK Koristite uzorke za pozitivnu i negativnu kontrolu kako je gore opisano (vidi Dodatak 3). Testirajte kontrolni materijal na isti naĉin kao i uzorke. Postoje razliĉite metode za proĉišćavanje ciljne DNK iz kompleksnih uzoraka, kojima se uklanjaju inhibitori PCR reakcije i drugih enzimskih reakcija te se u ekstraktu uzorka koncentrira ciljna DNK. Slijedeća je metoda optimizirana za korištenje sa validiranim PCR metodama koje su navedene u Dodatku 6. a) Metoda prema Pastriku (2000) 1) Pipetom odmjerite 220 µl pufera za lizu [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf epruvetu od 1,5 ml. 2) Dodajte 100 µl ekstrakta uzorka i stavite u blok za zagrijavanje ili vodeni kupelj na 95 °C 10 minuta. 3) Stavite epruvetu na led 5 minuta. 4) Dodajte 80 µl osnovnog rastvora lizozima (50 mg lizozima na ml u 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) te inkubirajte 30 minuta na 37 °C.5) Dodajte 220 µl Easy DNA® rastvora A (Invitrogen), dobro promiješajte na vrtloţnoj mješalici i inkubirajte 30 minuta na 65 °C. 5) Dodajte 100 µl Easy DNA® rastvora B (Invitrogen), snaţno miješajte na vrtloţnoj mješalici sve dok precipitat ne bude slobodno kruţio po epruveti i dok uzorak ne bude jednoliko viskozan. 6) Dodajte 500 µl hloroforma te miješajte na vrtloţnoj mješalici dok se viskoznost ne smanji i smjesa postane homogena. 7) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4 °C da se odijele faze i stvori interfaza. 8) Gornju fazu prenesite u novu Eppendorf epruvetu. 9) Dodajte 1 ml 100 %-tnog etanola (– 20 °C), kratko promiješajte na vrtloţnoj mješalici i inkubirajte na ledu 10 minuta. 10) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4 °C te uklonite etanol iz taloga. 11) Dodajte 500 µl 80 %-tnog etanola (– 20 °C) te promiješajte okretanjem epruvete. 12) Centrifugirajte na 15000 g 10 minuta na 4 °C, saĉuvajte talog, a etanol uklonite. 13) Ostavite talog da se suši na vazduhu ili u vakuumskoj centrifugi (DNA speed vac). 14) Resuspendirajte talog u 100 µl sterilne ultra ĉiste vode i ostavite na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta. 15) Pohranite na – 20 °C dok ne bude potrebno za PCR. 16) Centrifugiranjem izdvojite mogući bijeli precipitat te za PCR upotrijebite 5 µl supernatanta koji sadrţi DNK. (b) Druge metode Mogu se primijeniti druge metode ekstrakcije DNK, npr. Qiagen DNeasy Plant Kit, ako su dokazano jednako djelotvorne u proĉišćavanju DNK iz kontrolnih uzoraka koji sadrţe 10 3 do 10 4 patogenih ćelija po ml. 6.2. PCR 6.2.1. Pripremite kalupe za testiranje i kontrolu za PCR prema validiranim protokolima (Odjeljak VI.A.6). Pripremite jedno decimalno razrjeĊenje ekstrakta DNK iz uzorka (1:10 u ultra ĉistoj vodi). 6.2.2. U nekontaminiranom prostoru pripremite odgovarajuću reakcijsku smjesu za PCR prema objavljenim protokolima (Dodatak 6). Preporuĉuje se da, ako je moguće, koristite protokol za multipleks PCR koji ukljuĉuje i unutarašnju kontrolu. 6.2.3. Prema protokolu za PCR (Dodatak 6) dodajte 2-5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske smjese u sterilne epruvete za PCR. 6.2.4. Ukljuĉite i uzorak za negativnu kontrolu koji sadrţi samo reakcijsku smjesu za PCR te, umjesto uzorka, dodajte isti izvor ultra ĉiste vode koji je korišten za pripremu reakcijske smjese za PCR. 6.2.5. Stavite epruvete u ureĊaj za PCR (thermal cycler) koji je korišten u preliminarnom testiranju te pokrenite optimizirani PCR program (Dodatak 6). 6.3. Analiza PCR produkata 6.3.1. Elektroforezom u agaroznom gelu razdvojite umnoţene PCR produkte. Najmanje 12 µl reakcijske smjese umnoţene DNK iz svakog uzorka, pomiješane sa 3 µl pufera za nanošenje (Dodatak 6), nanesite u 2,0 %-tni (w/v) agarozni gel u tris-acetat EDTA puferu (TAE) (Dodatak 6), uz napon od 5 do 8 V po cm. Upotrijebite odgovarajući DNK standard, npr. 100 bp ljestvicu. 6.3.2. Obojite elektroforetske pruge DNK u gelu etidijevim bromidom (0,5 mg/l) 30 do 60 minuta preduzimajući pri tome odgovarajuće mjere opreza za rad sa ovim mutagenom. 6.3.3. Obojeni gel pregledajte na kratkotalasnom UV transiluminatoru (λ = 302 nm) i traţite umnoţene fragmente oĉekivane duţine (Dodatak 6) te ih dokumentirajte. 6.3.4. Za svaki novi nalaz/sluĉaj provjerite autentiĉnost umnoţenog PCR produkta analizom restrikcijskim enzimima preostale umnoţene DNK uzorka i to inkubacijom pri optimalnoj temperaturi i u optimalnom vremenu sa odgovarajućim enzimom i puferom (vidi Dodatak 6). Pocijepane fragmente razdvojite elektroforezom u agaroznom gelu kako je gore navedeno te nakon bojenja etidijevim bromidom na UV transiluminatoru posmatrajte karakteristiĉni restrikcijski obrazac i uporedite ga sa pozitivnom kontrolom prije i poslije cijepanja. Tumaĉenje rezultata PCR testa PCR test je negativan ako u testiranom uzorku nije vidljiv PCR produkt oĉekivane duţine koji je specifiĉan za bakteriju R. solanacearum, ali je vidljiv u svim pozitivnim kontrolnim uzorcima (kod multipleks PCR -a sa poĉetnicama za unutrašnju kontrolu koje su specifiĉne za biljku domaćina: u testiranom uzorku se mora umnoţiti drugi produkt PCR -a oĉekivane veliĉine). PCR test je pozitivan ako je vidljiv PCR produkt koji je specifiĉan za bakteriju R. solanacearum i koji je oĉekivane duţine i restrikcijskog obrasca, pod uslovom da nije umnoţen u nijednom uzorku negativne kontrole. Pouzdanu potvrdu pozitivnog rezultata moţete dobiti i ponavljanjem testa sa drugim parom poĉetnica (Dodatak 6). Napomena: Moţe se sumnjati da je došlo do inhibicije PCR reakcije ako se iz uzorka pozitivne kontrole koji sadrţi R. solanacearum u vodi dobije oĉekivani produkt, a iz pozitivnih kontrola sa R. solanacearum u ekstraktu krompira dobiju negativni rezultati. U multipleks PCR protokolima sa unutrašnjim kontrolama, inhibicija reakcije je indicirana ako nije dobijen niti jedan od dva produkta. Ako se iz jedne ili više negativnih kontrola dobije oĉekivani produkt, moţe se sumnjati da je došlo do kontaminacije. 7. FISH test načelo Kada se FISH test koristi kao prvi test provjere i ako se njim dobije pozitivan rezultat, mora se provesti IF test ili izolacija kao drugi obavezni test provjere. Ako se FISH test koristi kao drugi test provjere i ako se njime dobije pozitivan rezultat, za postavljanje konaĉne dijagnoze treba obaviti daljnje testiranje prema dijagramu. Napomena: Koristite validirane oligo-probe specifiĉne za bakteriju R. solanacearum (vidi Dodatak 7). Preliminarna testiranja ovom metodom trebaju omogućiti ponovljivu detekciju najmanje 10 3 do 10 4 ćelije bakterije R. Solanacearum po ml koje su dodate ekstraktima uzoraka koji su u ranijim testiranjima bili negativni. Slijedeći je postupak najbolje provesti na svjeţe pripremljenim ekstraktima uzoraka, ali se moţe uspješno primijeniti i na ekstraktu uzorka koji je bio pohranjeni sa glicerolom na temperaturi od – 16 do – 24 °C ili od – 68 do – 86 °C. Za negativnu kontrolu upotrijebite alikvote ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju na R. solanacearum bili negativni. Za pozitivnu kontrolu pripremite suspenzije koje sadrţe 10 5 do 10 6 ćelija/ml 0,01 M fosfatnog pufera (PB) bakterije R. solanacearum biovar 2 (npr. soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 3) iz kulture stare 3 – 5 dana. Pripremite odvojena stakalca za pozitivnu kontrolu sa homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije R. solanacearum suspendiranim u ekstraktu krompira kako je navedeno u Dodatku 3B. Korištenje eubakterijske oligo-probe obiljeţene FITC -om omogućava kontrolu procesa hibridizacije jer će se obojiti sve eubakterije koje su prisutne u uzorku. U Dodatku 3A. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu. Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke. 7.1. Fiksiranje ekstrakta krompira Slijedeći protokol se zasniva na Wullings i sur. (1998): 7.1.1. Pripremite rastvor za fiksiranje (vidi Dodatak 7). 7.1.2. Pipetom odmjerite 100 µl svakog ekstrakta uzorka u Eppendorf epruvetu te centrifugirajte 7 minuta na 7000 g. 7.1.3. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 200 µl fiksativa pripremljenog prije najviše 24 sata. Promiješajte na vrtloţnoj mješalici i inkubirajte jedan sat u hladnjaku. 7.1.4. Centrifugirajte 7 minuta na 7000 g, uklonite supernatant te resuspendirajte talog u 75 µl 0,01 M PB (vidi Dodatak 7). 7.1.5. U otvore ĉistog stakalca nanesite 16 µl fiksiranih suspenzija kako je prikazano na slici 7.1. Na svako stakalce nanesite nerazrijeĊena dva razliĉita uzorka i upotrijebite 10 µl za pripremanje razrjeĊenja 1:100 (u 0,01 M PB). Preostali fiksirani rastvor uzorka (49 µl) moţete pohraniti na – 20 °C nakon dodavanja jednog volumena 96 %-tnog etanola. Ako FISH test trebate ponoviti, centrifugiranjem uklonite etanol i dodajte jednaki volumen 0,01 PB (promiješati na vrtloţnoj mješalici). Slika 7.1. Prikaz stakalca za FISH test Uzorak 1 Prazno Prazno Prazno Uzorak 2 ○ ○ ○ ○ ○ Otvor 1 Otvor 2 Otvor Otvor Otvor Uzorak 1 Prazno Prazno Prazno Uzorak 2 ○ ○ ○ ○ ○ Otvor Otvor Otvor Otvor Otvor Pokrovno stakalce 1 Pokrovno stakalce 2 7.1.6. Stakalca osušite na zraku (ili u sušioniku na 37 °C) te ih fiksirajte provlaĉenjem kroz plamen. Na ovom koraku se postupak moţe prekinuti i nastaviti hibridizaciju slijedeći dan. Stakalca se trebaju pohraniti na sobnoj temperaturi u suhom prostoru bez prašine. 7.2. Hibridizacija 7.2.1. Dehidrirajte ćelije uzastopnim jednominutnim uranjanjem u 50 %-tni, 80 %-tni i 90 % tni etanol. Stakalca postavite na drţaĉ i osušite na zraku. 7.2.2. Pripremite vlaţnu komoru za inkubaciju tako što ćete dno hermetiĉke kutije prekriti upijajućim ili filter papirom namoĉenim u 1x hybmix (Dodatak 7). Kutiju prethodno inkubirajte u hibridizacijskoj pećnici najmanje 10 minuta na 45 °C. 7.2.3. Nanesite po 10 µl otopine za hibridizaciju (Dodatak 7) u osam otvora (otvori 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 i 10; vidi sliku 7.1.) svakog stakalca, a dva središnja otvora (3 i 8) ostavite prazna. 7.2.4. Prva i zadnja ĉetiri otvora pokrijte pokrovnim stakalcem (24 x 24 mm) pazeći pri tome da u otvorima ne ostane zraka. Stavite stakalca u prethodno zagrijanu vlaţnu komoru i hibridizirajte pet sati u pećnici na 45 °C u tami. 7.2.5. Pripremite tri posude sa 1 L Milli Q vode (za upotrebu u molekularnoj biologiji), 1 L 1x hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q vode) i 1 L 1/8x hybmix (42 ml 3X hybmix i 958 ml Milli Q vode). Svaku posudu prethodno inkubirajte u vodenoj kupelji na 45 °C. 7.2.6. Skinite pokrovna stakalca, a predmetna stakalca stavite na drţaĉ. 7.2.7. Višak probe isperite inkubiranjem 15 minuta na 45 °C u posudi sa 1x hybmixa. 7.2.8. Prenesite drţaĉ stakalaca u otopinu za pranje (1/8x hybmix) i inkubirajte još 15 minuta. 7.2.9. Stakalca nakratko uronite u Milli Q vodu te ih stavite na filter papir. Višak vlage uklonite tako što ćete površinu lagano pokriti filter papirom. U svaki otvor pipetom nanesite 5 do 10 µl zaštitnog rastvora protiv izbljeĊivanja (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ili ekvivalentna) te cijelo predmetno stakalce pokrijte velikim pokrovnim stakalcem (24 x 60 mm). 7.3. Očitavanje FISH testa 7.3.1. Stakalca odmah pregledajte epifluorescentnim mikroskopom uz uljnu imerziju, sa povećanjem od 630 ili 1000 x. Sa filterom prikladnim za fluorescein-izotiocijanat (FITC), eubakterijske ćelije (ukljuĉujući većinu gram negativnih ćelija) u uzorku vide se kao fluorescentno zelene. Upotrebom filtera za tetrametilrodamin-5-izotiocijanat ćelije bakterije R. solanacearum, obojene sa Cy 3, vide se kao fluorescentno crvene. Uporedite morfologiju ćelije sa morfologijom pozitivnih kontrola. Ćelije moraju biti jasno flourescentne i u cijelosti obojene. Ako doĊe do odstupanja u obojenosti, FISH test (Odjeljak VI.A.7) se mora ponoviti. Pregledajte svaki otvor duţ dva meĊusobno okomita promjera i duţ vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj ćelija ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja. 7.3.2. Pregledajte da li su u otvorima vidljive jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije za bakteriju R. solanacearum Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji nego na vrsti pozitivne kontrole. Ćelije koje nisu u potpunosti obojene ili su slabe fluorescencije ne smiju se uzeti u obzir. 7.3.3. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Moţe se sumnjati ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne ćelije zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne ćelije pronaĊene (izvan otvora) na površini stakalca. 7.3.4. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifiĉnost FISH testa. U koncentriranom ekstraktu jezgri pupaka i dijelova stabljika mogu se pojaviti, iako rjeĊe nego kod IF testa, populacije fluorescirajućih ćelija netipiĉe morfologije i saprofitne bakterije koje su po veliĉini i morfologiji sliĉne bakteriji R. solanacearum. 7.3.5. U obzir uzmite samo fluorescirajuće ćelije tipiĉne veliĉine i morfologije. 7.3.6. Tumaĉenje rezultata FISH testa (i) Rezultati FISH testa smatraju se valjanim ako se primjenom FITC filtera opaze zeleno fluorescirajuće ćelije ĉija je veliĉina i morfologija tipiĉna za bakteriju R. solanacearum i ako se primjenom filtera za rodamin opaze crveno fluorescirajuće ćelije, i to u svim pozitivnim kontrolama i niti jednoj negativnoj kontroli. Ako se pronaĊu jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije, odredite prosjeĉni broj tipiĉnih ćelija po mikroskopskom vidnom polju i izraĉunajte broj tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Uzorci sa najmanje 5 x 10 3 tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga smatraju se potencijalno kontaminiranim. Potrebni su daljnji testovi. Uzorci sa manje od 5 x 10 3 tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga smatraju se negativnim. (ii) FISH Test je negativan ako se primjenom filtera za rodamin ne uoĉe snaţno fluorescirajuće crvene ćelije ĉija je veliĉina i morfologija tipiĉna za bakteriju R. solanacearum, pod uslovom da se primjenom filtera za rodamin uoĉe tipiĉne snaţno fluorescirajuće crvene ćelije u preparatima pozitivne kontrole. 8. ELISA Testovi Naĉelo Zbog relativno niske osjetljivosti, ELISA se moţe primijeniti samo kao neobavezni dodatni test pored IF, PCR ili FISH testova. Ako se primjenjuje DAS ELISA, obavezno je prethodno obogaćivanje ekstrakta i upotreba monoklonskih antitijela. Obogaćivanje uzoraka prije primjene ELISA testa moţe biti korisno u svrhu povećanja osjetljivosti testa, ali moţe biti i neuspješno zbog kompeticije ostalih organizama u uzorku. Napomena: Koristite validirani izvor antitijela za R. solanacearum Preporuĉljivo je da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se definira kao najveće razrjeĊenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri testiranju suspenzije koja sadrţi 10 5 do 10 6 ćelija/ml homolognog soja bakterije R. solanacearum uz korištenje odgovarajućih konjugata sekundarnih antitijela prema preporukama proizvoĊaĉa. Tokom testiranja, treba koristiti antitijela u radnim razrjeĊenjima koja su blizu ili jednaka titru formulacije dostupne na trţištu. Odredite titar antitijela na suspenziji od 10 5 do 10 6 ćelija po ml homolognog soja bakterije R. solanacearum. Za negativnu kontrolu koristite ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na R. solanacearum bio negativan i suspenziju bakterije, sa kojom ne dolazi do unakrsne reakcije, u fosfatnom puferu sa dodatkom soli (PBS). Za pozitivnu kontrolu koristite alikvote ekstrakta uzorka koji je u ranijem testiranju bio negativan, pomiješane sa 10 3 do 10 4 ćelija/ml bakterije R. solanacearum biovar 2 (npr. soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 2A i B). Za poreĊenje rezultata na svakoj mikrotitarskoj ploĉi koristite standardnu suspenziju od 10 5 do 10 6 ćelija/ml bakterije R. solanacearum u PBS-u. Pobrinite se da pozitivne kontrole na mikrotitarskoj ploĉi budu dobro odvojene od uzoraka koji se testiraju. U Dodatku 3A. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu. Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke. Validirana su dva protokola za ELISA test. (a) INDIREKTNA ELISA (Robinson Smith i sur., 1995) 1) Upotrijebite alikvote od 100 do 200 µl ekstrakta uzorka. (Zagrijavanjem ĉetiri minute na 100 °C u vodenoj kupelji ili bloku za zagrijavanje u nekim se sluĉajevima mogu smanjiti nespecifiĉni rezultati). 2) Dodajte jednaki volumen pufera za oblaganje dvostruke jaĉine (Dodatak 4) i promiješajte na vrtloţnoj mješalici. 3) Nanesite alikvote od 100 µl u svaki od najmanje dva otvora na mikrotitarskoj ploĉi (npr. Nunc-Polysorp ili ekvivalentna) i inkubirajte jedan sat na 37 °C ili preko noći na 4 °C. 4) Uklonite ekstrakte iz otvora. Isperite otvore tri puta rastvorom PBS-Tween (Dodatak 4), a zadnju otopinu za ispiranje ostavite u otvorima najmanje pet minuta. 5) Pripremite odgovarajuće razrjeĊenje antitijela za R. solanacearum u blokirajućem puferu (Dodatak 4). Za validirana antitijela koja su dostupna na trţištu koristite preporuĉena razrjeĊenja (obiĉno dvostruka koncentracija titra). 6) Dodajte 100 µl u svaki otvor i inkubirajte jedan sat na 37 °C. 7) Uklonite rastvor antitijela iz otvora i operite otvore kao prije (korak 4). 8) Pripremite odgovarajuće razrjeĊenje sekundarnih antitijela-konjugata alkalne fosfataze u blokirajućem puferu. Dodajte 100 µl u svaki otvor i inkubirajte jedan sat na 37 °C. 9) Uklonite konjugat antitijela iz otvora i operite otvore kao prije (korak 4). 10) U svaki otvor dodajte 100 µl rastvora supstrata alkalne fosfataze (Dodatak 4), inkubirajte u tami na sobnoj temperaturi i oĉitavajte apsorbanciju pri 405 nm u pravilnim razmacima tokom 90 minuta. (b) DASI ELISA 1) Pripremite odgovarajuće razrjeĊenje poliklonskih imunoglobulina za bakteriju R. solanacearum u puferu za oblaganje pH 9,6 (Dodatak 4). Nanesite 200 µl u svaki otvor. Inkubirajte ĉetiri do pet sati na 37 °C ili 16 sati na 4 °C. 2) Otvorite isperite tri puta rastvorom PBS-Tween (Dodatak 4). U najmanje dva otvora nanesite 190 µl ekstrakta uzorka. Na svakoj ploĉi dodajte pozitivnu i negativnu kontrolu, i to svaku u po dva otvora. Inkubirajte 16 sati na 4 °C. 3) Otvore isperite tri puta rastvorom PBS-Tween (Dodatak 4). 4) Pripremite odgovarajuće razrjeĊenje monoklonskih antitijela specifiĉnih za bakteriju R. solanacearum u PBS -u (Dodatak 4) koji sadrţi i 0,5 % goveĊeg serumskog albumina (BSA) te nanesite 190 µl u svaki otvor. Inkubirajte dva sata na 37 °C. 5) Otvore i isperite tri puta rastvorom PBS-Tween (Dodatak 4). 6) Pripremite odgovarajuće razrjeĊenje antimišjih imunoglobulina konjugiranih sa alkalnom fosfatazom u PBS -u. Nanesite 190 µl u svaki otvor. Inkubirajte dva sata na 37 °C. 7) otvore isperite tri puta otopinom PBS-Tween (Dodatak 4). 8) Pripremite otopinu supstrata alkalne fosfataze koja sadrţi 1 mg p-nitrofenil fosfata fosfata po ml pufera supstrata (Dodatak 4). Nanesite 200 µl u svaki otvor. Inkubirajte u tami na sobnoj temperaturi i oĉitavajte apsorbanciju pri 405 nm u pravilnim razmacima tokom 90 minuta. Tumaĉenje rezultata ELISA testova ELISA test je negativan ako je prosjeĉna optiĉka gustoća (OD) u otvorima sa duplikatom uzorka < 2x OD u otvoru sa negativnom kontrolom ekstrakta uzorka, pod uslovom da su sve vrijednosti OD pozitivnih kontrola iznad 1,0 (nakon 90 minuta inkubacije sa supstratom) i da su veće od dvostruke vrijednosti OD dobijene za negativne ekstrakte uzorka. ELISA test je pozitivan ako je prosjeĉna optiĉka gustoća (OD) u otvorima sa duplikatom uzorka > 2x OD u otvoru sa negativnom kontrolom ekstrakta uzorka, pod uslovom da su vrijednosti OD za sve otvore sa negativnom kontrolom < 2x OD u otvorima sa pozitivnom kontrolom. Ako se u ELISA testu oĉitaju negativni rezultati u otvorima sa pozitivnom kontrolom, to ukazuje da test nije pravilno proveden ili da je došlo do inhibicije. Ako se u ELISA testu oĉitaju pozitivni rezultati u otvorima sa negativnom kontrolom, to ukazuje da je došlo do unakrsne kontaminacije ili do nespecifiĉnog vezanja antitijela. 9. Biotest Napomena: Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10 3 do 10 4 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije R. solanacearum po ml, a koje su dodate ekstraktima uzoraka koji su u ranijem testiranju bili negativni. [za pripremu vidi Dodatak 3]. Najveća osjetljivost detekcije moţe se oĉekivati ako se koriste svjeţe pripremljeni ekstrakti uzoraka te optimalni uslovima rasta. MeĊutim, ova se metoda moţe uspješno primijeniti i sa ekstraktima koji su bili pohranjeni sa glicerolom na temperaturi od – 68 do – 86 °C. Slijedeći se protokol zasniva na Janse (1988): 9.1. Za svaki uzorak koristite 10 biljaka osjetljivog kultivara paradajza (npr. Moneymaker ili drugi kultivar za koji je u laboratoriji utvrĊeno da je jednako osjetljiv) u fazi trećeg pravog lista. Za pojedinosti o uzgoju, vidi Dodatak 8. Moguće je upotrijebiti i patlidţane (npr. kultivar Black Beauty ili kultivar ekvivalentne osjetljivosti), ali samo biljke u fazi 2-3 lista do potpunog razvoja trećeg pravog lista. Pokazalo se da su kod patlidţana simptomi slabiji i da se sporije razvijaju. Preporuĉuje se, stoga, po mogućnosti koristiti sadnice paradajza. 9.2. 100 µl ekstrakta uzorka rasporedite na testne biljke. 9.2.1. Inokulacija injekcijom. Inokulirajte stabljike neposredno iznad supki injekcijom sa potkoţnom iglom (najmanje 23G). Uzorak rasporedite na testne biljke. 9.2.2. Inokulacija zarezivanjem. Drţeći biljku meĊu prstima, pipetom nanesite kapljicu (oko 5-10 µl) resuspendoiranog taloga na stabljiku izmeĊu supki i prvog lista. Sterilnim skalpelom napravite dijagonalni rez, dug oko 1 cm i dubok oko 2/3 debljine stabljike, poĉevši od nanešene kapljice resuspendiranog taloga. Ĉvrsto zatvorite rez sterilnim vazelinom iz injekcije. 9.3. Koristeći istu metodu, inokulirajte pet biljaka suspenzijom u vodi od 10 5 do 10 6 ćelija/ml pripremljenom iz 48-satne kulture virulentnog soja biovara 2, bakterije R. solanacearum za pozitivnu kontrolu, a puferom za talog za negativnu kontrolu (Dodatak 4). Kako ne bi došlo do unakrsne kontaminacije, odvojite biljke za pozitivnu i negativnu kontrolu od ostalih biljaka. 9.4. Testne biljke uzgajajte u karantinskim uslovima do ĉetiri sedmice na temperaturi od 25 do 30 °C i uz visoku relativnu vlaţnost te ih primjereno zalijevajte pazeći da ne doĊe do zasićenja vodom ili venuća zbog nedostatka vode. Kako ne bi došlo do kontaminacije, biljke za pozitivnu i negativnu kontrolu uzgajajte na jasno odvojenim policama u stakleniku ili komori za uzgoj ili, ako je prostor ograniĉen, osigurajte da pojedini postupci budu jasno odvojeni. Ako se biljke za razliĉite uzorke moraju inkubirati jedne blizu drugih, odvojite ih prikladnim zaslonima. Kod prihrane, zalijevanja, pregledavanja i svakog drugog postupka sa biljkama dobro pazite da ne doĊe do unakrsne kontaminacije. Od kljuĉne je vaţnosti da u staklenicima i komorama za uzgoj ne bude nikakvih insekata jer oni mogu prenijeti bakteriju sa uzorka na uzorak. Pratite javljaju li se simptomi venuća, epinastije, kloroze i/ili zaostajanja u rastu. 9.5. Iz inficiranih biljaka izolirajte (Odjeljak II.3) i identificirajte proĉišćene kulture vjerovatne bakterije R. solanacearum (Odjeljak VI.B). 9.6. Ako se nakon tri sedmice ne uoĉe nikakvi simptomi, obavite IF/PCR test /izolaciju na sastavljenom uzorku dijelova stabljike dugih 1 cm, uzetih iznad mjesta inokulacije, sa svake testne biljke. Ako test bude pozitivan, primijenite metodu nasaĊivanja razrjeĊenja na selektivnu podlogu (odjeljak 4.1.) 9.7. Identificirajte sve proĉišćene kulture vjerovatne bakterije R. solanacearum (Odjeljak VI.B). Tumaĉenje rezultata biotesta Rezultati biotesta su valjani ako biljke pozitivne kontrole pokazuju tipiĉne simptome, ako se iz tih biljaka moţe ponovo izdvojiti bakterija, i ako se na negativnim kontrolama ne pronaĊu nikakvi simptomi. Biotest je negativan ako testne biljke nisu zaraţene bakterijom R. solanacearum, pod uslovom da je bakterija R. solanacearum detektirana u pozitivnim kontrolama. Biotest je pozitivan ako su testne biljke zaraţene bakterijom R. solanacearum. B. TESTOVI ZA IDENTIFIKACIJU Identificirajte ĉiste kulture vjerovatnih izolata bakterije R. solanacearum pomoću najmanje dva od slijedećih testova koja se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima. Prema potrebi, u svaki test ukljuĉite poznate referentne sojeve (vidi Dodatak 3). 1. Nutritivni i enzimatski testovi za identifikaciju Odredite slijedeće fenotipske osobine koje su sistemno prisutne ili odsutne kod bakterije R. solanacearum, prema metodama iz Lelliot i Stead (1987), Klement i sur. (1990), Schaad (2001). Test Oĉekivani rezultat Stvaranje fluorescentnog pigmenta – Inkluzije poli-β-hidroksibutirata + Oksidacijski/fermentacijski (O/F) test O+/F– Aktivnost katalaze + Test oksidaze po Kovacu + Redukcija nitrata + Iskorištavanje citrata + Rast na 40 °C – Rast u 1 % NaCl + Rast u 2 % NaCl – Aktivnost arginin-dihidrolaze – Likvefikacija ţelatine – Hidroliza skroba – Hidroliza eskulina – Stvaranje levana – 2. IF test 2.1. Pripremite suspenziju od oko 10 6 ćelija/ml u puferu za IF (Dodatak 4). 2.2. Pripremite niz dvostrukih razrjeĊenja odgovarajućeg seruma 2.3. Provedite IF test (Odjeljak VI.A.5). 2.4. IF test je pozitivan ako je IF titar kulture jednak onom pozitivne kontrole. 3. ELISA test Napomena: Ako primjenjujete samo 2 identifikacijska testa, ne primjenjujte drugi serološki test uz ovaj. 3.1. Pripremite suspenziju od oko 10 8 ćelija/ml u 1x PBC (Dodatak 4). 3.2. Provedite odgovarajući postupak ELISA sa monoklonskim antitijelima specifiĉnim za bakteriju R. solanacearum. 3.3. ELISA test je pozitivan ako je ELISA vrijednost oĉitanja kulture jednaka najmanje polovini vrijednosti pozitivne kontrole. 4. PCR testovi 4.1. Pripremite suspenziju od oko 10 6 ćelija/ml u sterilnoj vodi namijenjenoj upotrebi u molekularnoj biologiji. 4.2. Zagrijte 100 µl ćelijske suspenzije u zatvorenim epruvetama u bloku za zagrijavanje ili vreloj vodenoj kupelji ĉetiri minute na 100 °C. Uzorci se mogu potom, do upotrebe, pohraniti na – 16 do – 24 °C. 4.3. Primijenite odgovarajuće PCR postupke kako biste umnoţili fragmente specifiĉne za R. solanacearum [npr. Seal i sur. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik i sur. (2002), Boudazin i sur. (1999), Opina i sur. (1997), Weller i sur. (1999)]. 4.4. Smatra se da je R. solanacearum identificirana ako su umnoţeni PCR produkti iste duţine i imaju iste polimorfizme duţine restrikcijskim fragmenata kao i soj pozitivne kontrole. 5. FISH test 5.1. Pripremite suspenziju od oko 10 6 ćelija/ml u ultra ĉistoj vodi. 5.2. Primijenite postupak FISH (Odjeljak VI.A.7.) sa najmanje dvije oligo-probe specifiĉne za R. solanacearum (Dodatak 7). 5.3. FISH test je pozitivan ako se i kod kulture i kod pozitivne kontrole dobiju iste reakcije. 6. Profiliranje masnih kiselina (FAP) 6.1. Uzgajajte kulturu 48 sati na 28 °C na triptikaza-soja-agaru (Oxoid). 6.2. Primijenite odgovarajući FAP postupak (Janse, 1991; Stead, 1992). 6.3. FAP test je pozitivan ako je profil vjerovatne kulture identiĉan profilu pozitivne kontrole. Prisutnost karakteristiĉnih masnih kiselina 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH te odsutnost 16:0 3OH u velikoj mjeri ukazuje na Ralstonia sp. 7. Metode karakterizacije soja Kod svakog novog sluĉaja izolacije R. solanacearum preporuĉuje se da se obavi karakterizacija soja jednom od slijedećih metoda. Prema potrebi, u svaki korišteni test ukljuĉite poznate referentne sojeve (vidi Dodatak 3). 7.1. OdreĊivanje biovara R. solanacearum se dijeli na biovare na osnovu sposobnosti iskorištavanja i/ili oksidacije tri disaharida i tri heksozna alkohola (Hayward, 1964 i Hayward i sur., 1990). Hranjivi mediji za odreĊivanje biovara opisani su u Dodatku 2. Test se moţe uspješno obaviti inokulacijom medija ĉistim kulturama izolata R. solanacearum te inkubiranjem na 28 °C. Ako se medij rasporedi u 96 sterilnih otvora na ploĉi za uzgoj ćelija (200 µl po otvoru), u roku od 72 sata moţe se uoĉiti promjena boje od maslinasto-zelene na ţutu, što znaĉi da je rezultat testa pozitivan. Biovar 1 2 3 4 5 Iskorištavanje: Maltoza – + + – + Laktoza – + + – + D (+) celobioza – + + – + Manitol – – + + + Sorbitol – – + + – Dulcitol – – + + – Biovar 2 se dijeli na podfenotipove pomoću dodatnih testova. Biovar 2A (proširen u cijelom svijetu) Biovar 2A (u Ĉileu i Kolumbiji) Biovar 2T (u tropskim podruĉjima) Iskorištavanje trehaloze – + + Iskorištavanje mezo-inozitola + – + Iskorištavanje D-riboze – – + Pektolitiĉka aktivnost ( 1 ) slaba slaba visoka ( 1 ) Vidi Lelliot i Stead (1987) 7.2. Genomski otisak prsta Molekularna diferencijacija sojeva u kompleksu R. solanacearum moţe se postići primjenom nekoliko metoda, ukljuĉujući slijedeće: 7.2.1. Analiza polimorfizma duţine restrikcijskih fragmenata (RFLP) (Cook i sur., 1989). 7.2.2. PCR ponavljajućih slijedova, korištenjem poĉetnica REP, BOX i ERIC (Louws i sur., 1995, Smith i sur., 1995). 7.2.3. Analiza polimorfizma duţine umnoţenih fragmenata (AFLP) (Van der Wolf i sur., 1998). 7.3. PCR metode Specifiĉne PCR poĉetnice (Pastrik i sur., 2002; vidi Dodatak 6) mogu se upotrijebiti za diferencijaciju sojeva koji pripadaju grupi 1 (biovari 3, 4 i 5) i grupi 2 (biovari 1, 2A i 2T) bakterije R. solanacearum, kako je prvobitno bilo utvrĊeno metodom RFLP (Cook i sur., 1989) i sekvenciranjem 16S rDNK (Taghavi i sur., 1996). C. TEST POTVRDE Test patogenosti mora se provesti kao konaĉna potvrda dijagnoze R. solanacearum i za ocjenu virulentnosti kultura identificiranih kao R. solanacearum. 1) Pripremite inokulum od oko 10 6 ćelija/ml iz 24 do 48 sati stare kulture izolata koji namjeravate testirati te odgovarajući pozitivni kontrolni soj bakterije R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 3). 2) Inokulirajte 5 do 10 sadnica osjetljivih paradajz ili patlidţana u fazi trećeg pravog lista (vidi Odjeljak VI.A.9). 3) Inkubirajte do dvije sedmice na 25 do 28 °C i uz visoku relativnu vlaţnost te ih primjereno zalijevajte pazeći da ne doĊe do zasićenja vodom ili venuća zbog nedostatka vode. Kod ĉistih bi se kultura trebalo pojaviti tipiĉno venuće u roku od 14 dana. Ako nakon ovog perioda simptomi nisu prisutni, ne moţe se potvrditi da je kultura patogeni oblik bakterije R. solanacearum. 4) Pratite javljaju li se simptomi venuća i/ili epinastije, kloroze i zaostajanja u rastu. 5) Iz biljaka sa simptomima izdvojite dio stabljike oko 2 cm iznad mjesta inokulacije. Smrvite i suspendirajte u manjem volumenu sterilne destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 4). Izolaciju iz suspenzije izvedite razmazom razrjeĊenja na prikladnu hranjivu podlogu, po mogućnosti selektivnu (Dodatak 2), inkubirajte 48 do 72 sati na 28 °C te pratite rast kolonija tipiĉnih za R. solanacearum. Dodatak 1.Laboratorije ukljuĉene u optimizaciju i validaciju protokola Laboratorija (1) Mjesto Drţava Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Beĉ i Linz Austrija Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgija Plantedirektoratet Lyngby Danska Central Science Laboratory York Engleska Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Škotska Laboratoire national de la protection des végétaux, unité de bactériologie Angers Francuska Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre Le Rheu Francuska Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Njemaĉka Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Njemaĉka State Laboratory Dublin Irska Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali Bologna Italija Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari Verona Italija Nederlandse Algemene Keuringsdienst Emmeloord Nizozemska Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nizozemska Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisabon Portugal Centro Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Španija Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Valencia Španija Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala Švedska (1) Nauĉnici za vezu Dodatak 2. Podloge za izolaciju i uzgoj bakterije R. solanacearum (a) Uobiĉajene hranjive podloge Hranjivi agar (NA) Hranjivi agar (Difco) 23,0 g Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Agar sa kvascem, peptonom i glukozom (YPGA) Ekstrakt kvasca (Difco) 5,0 g Bacto pepton (Difco) 5,0 g D (+) glukoza (monohidrat) 10,0 g Bacto agar (Difco) 15,0 g Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Agar sa saharozom i peptonom (SPA) Saharoza 20,0 g Bacto pepton (Difco) 5,0 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Bacto agar (Difco) 15,0 g Destilirana voda 1,0 L pH 7,2 – 7,4 Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Kelmanova tetrazolium-podloga Casamino kiseline (Difco) 1,0 g Bacto pepton (Difco) 10,0 g Dekstroza 5,0 g Bacto agar (Difco) 15,0 g Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Ohladite na 50 °C i dodajte otopinu 2,3,5-trifenil-tetrazolium-hlorida (Sigma), steriliziranu filtriranjem, kako biste dobili konaĉnu koncentraciju od 50 mg/l. (b) Validirane selektivne hranjive podloge SMSA podloga (Englebrecht, 1994, izmjene prema Elphinstone i sur., 1996) Osnovna podloga Casamino kiseline (Difco) 1,0 g Bacto pepton (Difci) 10,0 g Glicerol 5,0 ml Bacto agar (Difco); vidi napomenu 2 15,0 g Destilirana voda 1,0 L Rastopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Ohladite na 50 °C i dodajte osnovne vodene rastvore slijedećih sastojaka, sterilizirane filtriranjem, kako biste dobili predviĊene konaĉne koncentracije: Kristal violet (Sigma) 5 mg na L Polimiksin-B-sulfat (Sigma P-1004) 600 000 U (oko 100 mg) na L Bacitracil (Sigma B-0125) 1 250 U (oko 25 mg) na L Hloramfenikol (Sigma C-3175) 5 mg na L Penicilin-G (Cigma P-3032) 825 U (oko 0,5 mg) na L 2,3,5-trifenil-tetrazolium-hlorid (Sigma) 50 mg na L Napomena: 1. Reagensi drugaĉiji od gore navedenih mogu uticati na rast bakterije R. solanacearum. 2. Umjesto Bacto agara (Difco) moţe se koristiti Oxoid agar br. 1. U tom će sluĉaju R. solanacearum. sporije rasti, ali se moţe smanjiti i rast konkurentnih saprofita. Za formiranje tipiĉnih kolonija bakterije R. solanacearum. moţda će trebati 1 do 2 dana više, a crveno obojenje moţe biti svjetlije i difuznije nego na Bacto agaru. 3. Povećanjem koncentracije bacitracina na 2500 U/L mogu se smanjiti populacije konkurentnih bakterija, a da se ne utiĉe na rast bakterije R. solanacearum. Pohranite hranjivu podlogu i osnovni rastvor antibiotika na 4 °C na tamno mjesto i upotrijebite u roku od jednog mjeseca. Prije upotrebe, sa podloga moramo ukloniti površinsku kondenzaciju. Podloge ne smijete pretjerano osušiti. Nakon pripremanja svake nove serije hranjive podloge, treba obaviti kontrolu kvaliteta tako što se nasadi suspenzija referentne kulture R. solanacearum (vidi Dodatak 3) i prati hoće li doći do stvaranja tipiĉnih kolonija nakon dva do pet dana inkubacije na 28 °C. (c) Validirani mediji za obogaćivanje SMSA tekući medij (Elphinstone i sur., 1996) Pripremite kao za selektivnu podlogu SMSA sa agarom, ali izostavite Bacto agar i 2,3,5 trifenil-tetrazol-hlorid. Modificirani Wilbrink tekući medij (Caruso i sur., 2002) Saharoza 10 g Proteoza pepton 5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,25 g NaNO3 0,25 g Destilirana voda 1 L Sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta te ohladite na 50 °C. Dodajte osnovne rastvore antibiotika kao za SMSA tekući medij. Dodatak 3. A. Standardizirani kontrolni materijali dostupni na trţištu (a) Bakterijski izolati. Preporuĉuje se korištenje slijedećih bakterijskih izolata kao standardnog referentnog materijala bilo za pozitivne kontrole (Tablica 1) ili tokom optimizacije testova u svrhu izbjegavanja unakrsnih reakcija (Tablica 2). Svi su sojevi dostupni na trţištu i mogu se nabaviti kod: 1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK 2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Nizozemska 3. Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA – Station de phytobactériologie, Angers, Francuska Tablica 1. SMT popis referentnih izolata bakterije R. solanacearum Oznaka NCPPB Br. SMT Ostale oznake Drţava porijekla Biovar NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egipat 2 NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Turska 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Engleska 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Kipar 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Švedska 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Belgija 2 NCPPB 4156* 71 * PD 2762, CFBP 3857 Nizozemska 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Francuska 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS55 Portugal 2 NCPPB 4160 69 IVIA –1632-2 Španija 2 NCPPB 4161 76 B3B Njemaĉka 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 SAD 1 NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Kostarika 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Kolumbija 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brazil 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Peru 3 NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a Australija 3 NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Šri Lanka 4 NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Filipini 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Kina 5 * Upotrebljavati kao standardni referentni soj bakterije R. solanacearum biovar 2 (rasa 3) Napomena: Autentiĉnost gore navedenih sojeva moţe se garantirati samo ako su oni dobijeni iz autentiĉne zbirke kultura. Tablica 2. SMT popis referentnih serološki ili genetski srodnih bakterija za upotrebu pri optimizaciji testova detekcije. Oznaka NCPPB Br. SMT Ostale oznake Identifikacija NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa ( 1 ) NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis ( 1 ) NCPPB 4164 – CFBP 2227 Burkholderia cepacia ( 2 ) NCPPB 4165 – CFBP 2459 Ralstonia pickettii ( 2 ) NCPPB 4166 58 CFBP 3567 CSL Pr1150 Ralstonia pickettii ( 1 ) NCPPB 4167 60 CFBP 4618 PD 2778 Ralstonia sp. ( 1 ) NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis ( 1 ) NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli ( 1 ) NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia ( 1 ) NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae ( 1 ) NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii ( 1 ) NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) NCPPB 4168 61 CFBP 4619 IPO S339 Enterobacter sp. ( 1 ) NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. ( 1 ) NCPPB 4170 63 CFBP 4621 IPO S306 Ochrobactrum anthropi ( 1 ) ( 2 ) NCPPB 4171 64 CFBP 4622 IPO 1693 Curtobacterium sp. ( 1 ) ( 2 ) NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp. ( 1 ) NCPPB 4173 – PD 2318 Aureobacterium sp. ( 2 ) NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. ( 1 ) ( 2 ) ( 1 ) Soj koji u serološkim testovima (IF i/ili ELISA) moţe unakrsno reagirati sa poliklonskim serumima. ( 2 ) Soj od kojeg se u nekim laboratorijima moţe umnoţiti PCR produkt duţine sliĉne duţini koja se oĉekuje pri upotrebi specifiĉnih poĉetnica OLI-1 i Y-2 (vidi Dodatak 6). ( 3 ) U većini testova mogao bi unakrsno reagirati, ali je poznato da se javlja samo na bananama u Indoneziji. (b) Standardizirani kontrolni materijali dostupni na trţištu. Dolje navedeni standardni kontrolni materijal moţe se dobiti iz zbirke kultura NCPPB. Liofilizirane granule ekstrakta krompira iz 200 zdravih krtola krompira kao negativna kontrola za sve testove. Liofilizirane granule ekstrakta krompira iz 200 zdravih krtola krompira sa 10 3 do 10 4 i 10 4 do 10 6 ćelija R. solanacearum biovar 2 (soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) kao pozitivna kontrola za serološke i PCR testove. Obzirom da liofilizacija utiĉe na vijabilnost ćelija, one nisu prikladne kao standardna kontrola za izolaciju ili biotestove. Formalinom fiksirane suspenzije bakterije R. solanacearum biovar 2 (soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) sa 10 6 ćelija/ml kao pozitivna kontrola za serološke testove. B. Pripremanje pozitivnih i negativnih kontrola za osnovne testove provjere (PCR/IF i FISH) Uzgojite 48-satnu kulturu virulentne vrste R. solanacearum rasa 3/biovar 2 (npr. soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na osnovnoj SMSA podlozi i suspendirajte u 10 mM fosfatnom puferu da dobijete gustoću ćelija od oko 2 x 10 8 cfu/ml. Ovo je obiĉno blago zamućena suspenzija optiĉke gustine 0,15 na 600 nm. Izreţite jezgre pupaka iz 200 krtola krompira sorte sa bijelom korom za koje je poznato da nisu zaraţeni bakterijom R. Solanacearum. Obradite jezgre pupaka uobiĉajenom metodom i resuspenduirajte talog u 10 ml. Napunite 10 sterilnih mikroepruveta od 1,5 ml s 900 µl resuspendiranog taloga. U prvu mikroepruvetu dodajte 100 µl suspenzije R. Solanacearum. Promiješajte na vrtloţnoj mješalici. U slijedećih pet mikroepruveta pripremite decimalna razrjeĊenja. Ovih šest mikroepruveta sa kontaminiranim ekstraktom koristite za pozitivnu kontrolu. Ĉetiri mikroepruvete sa nekontaminiranim ekstraktom koristite za negativnu kontrolu. U skladu sa tim, oznaĉite mikroepruvete. Pripremite alikvote od 100 µl u mikroepruvetama od 1,5 ml tako da dobijete devet kopija svakog kontrolnog uzorka. Do upotrebe ih pohranite na – 16 do – 24 °C. Prisutnost i koliĉinu R. Solanacearum u kontrolnim uzorcima potvrdite najprije IF testom. Za PCR test, obavite ekstrakciju DNK na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje. Za IF i FISH testove, obavite testove na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje. Kod IF, FISH i PCR testova, R. Solanacearum se mora detektirati u najmanje 10 6 i 10 4 ćelija/ml pozitivnih kontrola i niti u jednoj negativnoj kontroli. Dodatak 4 Puferi za postupke testiranja Upošteno: Neotvoreni sterilni puferi mogu se pohraniti do godinu dana. 1. Puferi za postupak ekstrakcije 1.1. Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0) Ovaj se pufer koristi za ekstrakciju bakterije iz biljnog tkiva homogenizacijom ili tresenjem. Na2HPO4 (bezvodni) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destilirana voda 1,00 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121 °C. Mogu biti korisni i slijedeći dodatni sastojci: Svrha Koliĉina (na litru) Pahuljice Lubrol deflokulant (*) 0,5 g DC silikon protiv pjenjenja sredstvo protiv pjenjenja (*) 1,0 ml Tetranatrijev pirofosfat antoksidans 1,0 g Polivinilpirolidon 40000 (PVP-40) vezanje PCR inhibitora 50 g (*) Upotrebljavati za metodu ekstrakcije homogeniziranjem 1.2. Pufer za talog (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2) Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeĊivanje ekstrakta jezgri pupaka krtola krompira nakon koncentriranja u talog centrifugiranjem. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121 °C. 2. Puferi za IF test 2.1. IF pufer (10 mM fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2). Ovaj se pufer koristi za razrjeĊivanje antitijela Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121 °C. 2.2. IF pufer Tween. Ovaj pufer se koristi za pranje stakalaca. IF puferu dodajte 0,1 % Tween 20. 2.3. Glicerol s fosfatnim puferom, pH 7,6 Ovaj se pufer koristi kao teĉnost za prekrivanje jaţica u IF testu kako bi se pojaĉala fluorescencija. Na2HPO4·12H2O 3,2 g NaH2PO4·2H2O 0,15 g Glicerol 50 ml Destilirana voda 100 ml Pokrivne rastvore protiv izbljeĊivanja dostupne su na trţištu, npr. Vectashield® (Vector Laboratories) ili Citifluor® (Leica).3. Puferi za nedirektni ELISA test 3.1. Pufer za oblaganje dvostruke jaĉine, pH 9,6 Na2CO3 6,36 g NaHCO3 11,72 g Destilirana voda 1,00 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121°C. Moţe se dodati natrijev sulfit (0,2 %) kao antioksidans ako je potrebno sprijeĉiti stvaranje oksidiranih aromatskih spojeva. 3.2. 10X fosfatni pufer sa dodatkom soli (PBS), pH 7,4 NaCl 80,0 g KH2PO4 2,0 g Na2HPO4·12H2O 29,0 g KCl 2,0 g Destilirana voda 1,0 L 3.3. . PBS-Tween 10X PBS 100 ml 10 % Tween 20 5 ml Destilirana voda 895 ml 3.4. Blokirajući (za antitijela) pufer (mora biti svjeţe pripremljen) 10X PBS 10,0 ml Polivinilpirolidon-44000 (PVP-44) 2,0 g 10 % Tween 20 0,5 ml Mlijeko u prahu 0,5 g Destilirana voda dopunite do 100 ml 3.5. Otopina supstrata alkalne fosfataze, pH 9,8 Dietanolamin 97 ml Destilirana voda 800 ml Pomiješajte i podesite pH na 9,8 koncentriranom HCl Dopunite destiliranom vodom do jedne litre. Dodajte 0,2 g MgCl2. Rastopite dvije tablete supstrata fosfataze od 5 miligrama (Sigma) na 15 ml rastvora 4. Puferi za DASI ELISA test 4.1. Pufer za oblaganje, pH 9,6 Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g Destilirana voda 1 000 ml Otopite sastojke i podesite pH na 9,6. 4.2. 10X fosfatni pufer sa dodatkom soli (PBS), pH 7,2 do 7,4 NaCl 80,0 g NaH2PO4·2H2O 4,0 g Na2HPO4·12H2O 27,0 g Destilirana voda 1 000 ml 4.3. PBS-Tween 10X PBS 50 ml 10 % Tween 20 5 ml Destilirana voda 950 ml 4.4. Pufer supstrata, pH 9,8 Dietanolamin 100 ml Destilirana voda 900 ml Pomiješajte i podesite pH na 9,8 koncentriranom HCl. Dodatak 5 OdreĊivanje stepena kontaminacije u IF i FISH testovima 1. Odredite srednji broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po vidnom polju (c). 2. Izraĉunajte broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po otvoru mikroskopskog stakalca (C). C = c × S/s gdje je S = površina otvora stakalca sa više otvora i s = površina polja objektiva s = πi2/4G2K2 gdje je i = koeficijent polja (ovisi o vrsti okulara i iznosi od 8 do 24) K = koeficijent tubusa (1 ili 1,25) G = povećanje objektiva (100x, 40 x itd.) 3. Izraĉunajte broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (N). N = C × 1000/y × F gdje je y = koliĉina resuspendiranog taloga u svakom otvoru F = faktor razrjeĊenja resuspendiranog taloga Dodatak 6 Validirani protokoli i reagensi za PCR Napomena: Preliminarna testiranja trebaju omogućiti ponovljivu detekciju 10 3 do 10 4 ćelija bakterije R. solanacearum po ml ekstrakta uzorka. Preliminarna testiranja ne smiju dati laţno pozitivne rezultate kod odreĊenih odabranih bakterijskih sojeva (vidi Dodatak 3). 1. Protokol za PCR prema Seal i sur. (1993) 1.1. Oligonukleotidne poĉetnice Uzvodna poĉetnica OLI-1 5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’ Nizvodna poĉetnica Y-2 5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’ Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum = 288 bp. 1.2. Reakcijska smjesa za PCR Reagens Koliĉina po reakciji Konaĉna koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 17,65 µl 10X PCR pufer ( 1 ) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1X (1,5 mM MgCl2) dNTP smjesa (20 mM) 0,25 µl 0,2 mM Poĉetnica OLI-1 (20 µM) 1,25 µl 1µM Poĉetnica Y-2 (20 µM) 1,25 µl 1µM Taq polimeraza (5U/µl) ( 1 ) 0,1 µl 0,5 U Volumen uzorka 2,0 µl Ukupni volumen 25 µl ( 1 ) Metoda je bila validirana Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL 1.3. Uslovi za PCR reakciju Provedite slijedeći program: 1 ciklus od: (i) 2 minute na 96 °C (denaturacija kalupa DNK) 35 ciklusa od: (ii) 20 sekundi na 94 °C (denaturacija kalupa DNK) (iii) 20 sekundi na 68 °C (sparivanje poĉetnica i kalupa) (iv) 30 sekundi na 72 °C (produţavanje kopije) 1 ciklus od: (v) 10 minuta na 72 °C (završno produţivanje) (vi) drţati na 4 °C Napomena: Ovaj je program optimiziran za korištenje sa ureĊajem za PCR (thermal cycler) Perkin Elmer 9600. Za rad sa drugim modelima ureĊaja moţda će trebati prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv). 1.4. Analiza produkta umnoţavanja restrikcijskim enzimima PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristiĉni obrazac polimorfizma duţine restrikcijskih fragmenata sa enzimom Ava II nakon inkubacije na 37 °C. 2. Protokol za PCR prema Pastrik i Maiss (2000) 2.1. Oligonukleotidne poĉetnice Uzvodna poĉetnica Ps-1 5’- agt cga acg gca gcg ggg g -3’ Nizvodna poĉetnica Ps-2 5’- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3’ Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum = 553 bp. 2.2. Reakcijska smjesa za PCR Reagens Koliĉina po reakciji Konaĉna koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 16,025 µl 10X PCR pufer ( 1 ) 2,5 µl 1X (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-NTP smjesa (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Poĉetnica Ps-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Poĉetnica Ps-2 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Taq polimeraza (5U/µl) ( 1 ) 0,1 µl 0,5 U Volumen uzorka 5,0 µl Ukupni volumen 25,0 µl (1) Metoda je bila validirana Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. Napomena: Prvobitno optimizirano za ureĊaj (thermo cycler) MJ Research PTC 200 s Gibco Taq polimerazom. Pri istim koncentracijama moţe se koristiti i Perkin Elmer AmpliTaq i pufer 2.3. Uslovi za PCR reakciju Provedite slijedeći program: 1 ciklus od: (i) 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) 35 ciklusa od: (ii) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) (iii) 30 sekundi na 68 °C (sparivanje poĉetnica i kalupa) (iv) 45 sekundi na 72 °C (produţavanje kopije) 1 ciklus od: (v) 5 minuta na 72 °C (konaĉno produţivanje) (vi) drţanje na 4 °C Napomena: Ovaj je program optimiziran za korištenje sa ureĊajem za PCR (thermal cycler) MJ Research PTC 200. Za rad sa drugim modelima ureĊaja moţda će trebati prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv). 2.4. Analiza produkta umnoţavanja restrikcijskim enzimima PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristiĉni obrazac polimorfizma duţine restrikcijskih fragmenata sa enzimom Taq I nakon inkubacije od 30 minuta na 65 °C. Restrikcijski fragmenti dobijeni iz fragmenta specifiĉnog za R. solanacearum veliki su 457 bp i 96 bp. 3. Protokol za multipleks PCR s unutrašnjom PCR kontrolom (Pastrik i sur., 2002) 3.1. Oligonukleotidne poĉetnice Uzvodna poĉetnica RS-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3' Nizvodna poĉetnica RS-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3' Uzvodna poĉetnica NS-5-F 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3' Nizvodna poĉetnica NS-6-R 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3' Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum = 718 bp (par poĉetnica RS). Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz unutrašnje PCR kontrole 18S rRNA = 310 bp (par poĉetnica NS). 3.2. Reakcijska smjesa za PCR Reagens Koliĉina po Konaĉna reakciji koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 12,625 µl 10X PCR pufer (1) (15 Mm MgCl2) 2,5 µl 1X (15 Mm MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-NTP smjesa (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Poĉetnica RS-1-F (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM Poĉetnica RS-1-R (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM Poĉetnica NS-5-F (10 µM) ( 2 ) 0,15 µl 0,06 µM Poĉetnica NS-6-R (10 µM) ( 2 ) 0,15 µl 0,06 µM Taq polimeraza (5U/µl) ( 1 ) 0,2 µl 1,0 U Volumen uzorka 5,0 µl Ukupni volumen 25,0 µl (1) Metoda je bila validirana Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL (2) Koncentracije poĉetnica NS-5-F i NS-6-R bile su optimizirane za ekstrakciju jezgri pupaka metodom homogenizacije i proĉišćavanjem DNK prema Pastriku (2000) (vidi Odjeljak VI.A.6.1.a). Ako se ekstrakcija obavlja tresenjem ili ako se primjenjuju druge metode izdvajanja DNK, trebat će ponovo optimizirati koncentracije reagensa. 3.3. Uslovi za reakciju PCR Provedite slijedeći program: 1 ciklus od: (i) 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) 35 ciklusa od: (ii) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) (iii) 30 sekundi na 58 °C (sparivanje poĉetnica i kalupa) (iv) 45 sekundi na 72 °C (produţivanje kopije) 1 ciklus od: (v) 5 minuta na 72 °C (konaĉno produţivanje) (vi) drţanje na 4 °C Napomena: Ovaj je program optimiziran za korištenje sa ureĊajem za PCR (thermal cycler) MJ Research PTC 200. Za rad sa drugim modelima ureĊaja moţda će trebati prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv). 3.4. Analiza produkta umnoţavanja restrikcijskim enzimom PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristiĉni obrazac polimorfizma duţine restrikcijskih fragmenata sa enzimom Bsm I ili izoshizomerom (npr. Mva 1269 I) nakon inkubacije od 30 minuta na 65 °C. 4. Protokol za biovar specifičan PCR (Pastrik i sur. 2001) 4.1. Oligonukleotidne poĉetnice Uzvodna poĉetnica Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3' Nizvodna poĉetnica Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3' Nizvodna poĉetnica Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3' Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum: sa Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp sa Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp 4.2. Reakcijska smjesa za PCR(a) Specifiĉni PCR za biovar 1/2 Reagens Koliĉina po reakciji Konaĉna koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 12,925 µl 10X PCR pufer ( 1 ) 2,5 µl 1X (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-NTP smjesa (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Poĉetnica Rs-1-F (10 µM) 2 µl 0,8 µM Poĉetnica Rs-1-R (10 µM) 2 µl 0,8 µM Taq polimeraza (5U/µl) 0,2 µl 1,0 U (1) Volumen uzorka 5,0 µl Ukupni volumen 25,0 µl (1) Metode su validirane Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL (b) Specifiĉni PCR za biovar 3/4/5 Reagens Koliĉina po reakciji Konaĉna koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 14,925µl 10X PCR pufer (1) 2,5 µl 1X (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-nTP smjesa (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Poĉetnica Rs-1-F (10 µM) 1 µl 0,4 µM Poĉetnica Rs-3-R (10 µM) 1 µl 0,4 µM Taq polimeraza (5U/µl) ( 1 ) 0,2 µl 1,0 U Volumen uzorka 5,0 µl Ukupni volumen 25,0 µl (1) Metode su validirane Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL 4.3. Uslovi za reakciju PCR. Provedite slijedeći program za specifiĉne reakcije za biovar 1/2 i biovar 3/4/5: 1 ciklus od: (i) 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) 35 ciklusa od: (ii) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) (iii) 30 sekundi na 58 °C (sparivanje poĉetnica i kalupa) (iv) 45 sekundi na 72 °C (produţivanje kopije) 1 ciklus od: (v) 5 minuta na 72 °C (konaĉno produţivanje) (vi) drţanje na 4 °C Napomena: Ovaj je program optimiziran za korištenje s ureĊajem za PCR (thermal cycler) MJ Research PTC 200. Za rad sa drugim modelima ureĊaja moţda će trebati prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv). 4.4. Analiza produkta umnoţavanja restrikcijskim enzimom PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije R. solanacearum sa poĉetnicama Rs-1-F i Rs 1-R daju karakteristiĉni obrazac polimorfizma duţine restrikcijskih fragmenata sa enzimom Bsm I ili izoshizomerom (npr. Mva 1269 I) nakon inkubacije od 30 minuta na 65 °C. PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije R. solanacearum sa poĉetnicama Rs-1-F i RS-3-R nemaju mjesta restrikcije. 5. Priprema pufera za nanošenje 5.1. Bromfenol plavilo (10%-tna osnovna otopina) Bromfenol plavilo 5 g Destilirana voda (bidestilirana) 50 ml 5.2. Pufer za nanošenje Glicerol (86 %) 3,5 ml Bromfenol plavo (5,1) 300 µl Destilirana voda (bidestilirana) 6,2 ml 6. 10X tris-acetatni EDTA (TAE), pH 8,0 Tris pufer 48,40 g Ledena sirćetna kiselina 11,42 ml pufer EDTA (dinatrijeva so) 3,72 g Destilirana voda 1,00 L Prije upotrebe razrijedite do 1X. Dostupan je i na trţištu (npr. Invitrogen ili ekvivalentni). Dodatak 7 Validirani reagensi za FISH test 1. Oligo-probe Proba OLI-1-CY3 specifiĉna za R. solanacearum: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3' Nespecifiĉna eubakterijska proba EUB-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt -3' 2. Otopina za fiksiranje (UPOZORENJE! OTOPINA ZA FIKSIRANJE SADRŢI PARAFORMALDEHID KOJI JE TOKSIĈAN. NOSITE RUKAVICE I NE UDIŠITE GA. PREPORUĈUJE SE RADITI U DIGESTORU.) (i) Zagrijte 9 ml vode za molekularnu biologiju (npr. ultra ĉiste vode) na oko 60 °C i dodajte 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se otapa nakon što dodate 5 kapi 1N NaOH i promiješate na magnetskoj mješalici. (ii) Podesite pH na 7,0 dodajući 1 ml 0,1M fosfatnog pufera (PB; pH 7,0) i 5 kapi 1N HCl. Indikatorskim papirom provjerite vrijednost pH i ako je potrebno podesite je pomoću HCl ili NaOH. (UPOZORENJE! U OTOPINAMA SA PARAFORMALDEHIDOM NE UPOTREBLJAVAJTE pH-METAR.) (iii) Profiltrirajte otopinu kroz membranski filter od 0,22 µm te je do daljnje upotrebe pohranite na 4 °C i zaštitite od prašine. 3. 3X Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (sterilizirana filtriranjem i u autoklavu) 15 mM Po potrebi razrijedite do 1X. 4. Otopina za hibridizaciju 1X Hybmix Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 % Formamid 30 % Proba EUB 338 5 ng/μl Proba OLI-1 ili OLI-2 5 ng/μl Pripremite koliĉine otopine za hibridizaciju prema izraĉunima u Tablici 1. Za svako stakalce (sa 2 razliĉita uzorka u duplikatu) treba 90 μl otopine za hibridizaciju. VAŢNO: FORMAMID JE VEOMA TOKSIĈAN I ZATO NOSITE RUKAVICE I PREDUZMITE POTREBNE MJERE OPREZA! Tablica 1. Predloţene koliĉine za pripremanje smjese za hibridizaciju Broj stakalaca 1 4 6 8 10 Sterilna ultra ĉista voda 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0 3 x hybmix 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0 1 % SDS 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0 Formamid 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0 Proba EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Proba OLI-1 ili OLI-2 (100 ng/μl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Ukupni volumen (μl) 90,0 360,0 540,0 720,0 900,0 Napomena: Sve otopine koje sadrţe oligo-probe osjetljive na svjetlost pohranite u tami na – 20 °C. Zaštitite ih od direktne sunĉeve svjetlosti ili elektriĉnog svjetla tokom upotrebe. 5. 0,1M fosfatni pufer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Destilirana voda 1,00 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta. Dodatak 8 Uzgoj patlidţana i paradajza Sjeme paradajza (Lycopersicon esculentum) i patlidţana (Solanum melongena) posijte u pasterizirani kompost za sjeme. Sadnice presadite u pasterizirani kompost za lonĉanice nakon što se supke u cijelosti razviju (10 do 14 dana). Prije inokulacije, paradajza i patlidţane treba uzgajati u stakleniku pod slijedećim uslovima: Duţina dana 14 sati ili prirodna duţina dana ako je veća.Temperatura dnevna: 21 do 24 °C noćna: 14 do 18 °C. Osjetljiva vrsta paradajza » Moneymaker «. Osjetljiva vrsta patlidţana » Black Beauty «. Dobavljaĉi POPIS LITERATURE: 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. 2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. 3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. 4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J. L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. 5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. 6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. 7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. 8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. 9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269 280. 10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. 11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343 351. 12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. 13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. 14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. 15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. 16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne i sur., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. 17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. 18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. 19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. 20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. 21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. 22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. 23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. 24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. 25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. 26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. 27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. 28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. 29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. 30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.