Rulebook on implementation of systematic control and measures to prevent penetration and spreading and to control potato ring rot caused by bacteria Clavibacter michigensis. (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al

515 Na osnovu ~lana 9. stav (3), ~lana 10. stav (5), ~lana 12. stav (3), ~lana 41. stav (4) i ~lana 60. stav (5) Zakona o za{titi zdravlja bilja ("Slu`beni glasnik BiH", broj 23/03), Ministarstvo vanjske trgovine i ekonomskih odnosa Bosne i Hercegovine, na prijedlog Uprave Bosne i Hercegovine za za{titu zdravlja bilja, donosi PRAVILNIK O PROVO\ENJU SISTEMSKE KONTROLE I PREDUZIMANJU MJERA U CILJU SPRJE^AVANJA UNO[ENJA, [IRENJA I KONTROLE PRSTENASTE TRULE@I KRTOLA KROMPIRA KOJU UZROKUJE BAKTERIJA CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL. ^lan 1. (Predmet) Ovim Pravilnikom se propisuje na~in provo|enja sistemske kontrole koja se provodi u svrhu utvr|ivanja prisustva i odre|ivanja rasprostranjenosti bakterije Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., uzro~nika prstenaste trule`i krtola krompira (u daljnjem tekstu: {tetni organizam), sprje~avanje pojave i {irenja i, ukoliko se utvrdi, sprje~avanje {irenja i kontrola u cilju iskorjenjivanja, kao i {ema testiranja za dijagnosticiranje, detekciju i identifikaciju {tetnog organizma. ^lan 2. (Definicije) Izrazi upotrijebljeni u Zakonu o za{titi zdravlja bilja ("Slu`beni glasnik BiH", broj 23/03), (u daljnjem tekstu: Zakon), upotrebljavaju se i u ovom Pravilniku, a specifi~ni izrazi upotrijebljeni u ovom Pravilniku imaju slijede}e zna~enje: a) prostorije - bilo koje zgrade, zemlji{te, prijevozna sredstva ili drugi objekti koje upotrebljava isti proizvo|a~; b) jedinica za{ti}ene proizvodnje usjeva - odnosi se na rasadnike, staklenike, plastenike, plasti~ne tunele i tople lijehe za biljke; c) mjesto proizvodnje - zna~i polje ili vi{e polja ili jedinica za{ti}ene proizvodnje usjeva koji funkcioniraju kao jedinstvena proizvodna ili poljoprivredna jedinica; d) godina rasta - zna~i period od 12 mjeseci koji po~inje kada klimatski uslovi u izvjesnim oblastima dozvoljavaju po~etak proizvodnje krompira; e) sezona proizvodnje - odnosi se na period od sadnje biljaka ili krtola do njihovog skladi{tenja; f) fitosanitarne slu`be - nadle`ni organi u entitetima i Br~ko Distriktu Bosne i Hercegovine; g) ovla{tena laboratorija - laboratorija koja je osposobljena za testiranje ovog {tetnog organizma i koja je dobila ovla{tenje u skladu sa ~lanom 68. stav (1) Zakona; h) stru~no ovla{teno lice - lice koje obavlja poslove po ovla{tenju iz ~lana 68. stav (6) Zakona. ^lan 3. (Sistemska kontrola) (1) Uprava Bosne i Hercegovine za za{titu zdravlja bilja (u daljnjem tekstu: Uprava), u saradnji sa nadle`nim organima entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine, propisuje godi{nji program sistemske kontrole za potvr|ivanje odsustva ili prisustva {tetnog organizama na osnovu jasnih nau~nih i statisti~kih principa i biologije {tetnog organizma. (2) Ove sistemske kontrole vr{e fitosanitarne inspekcije entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine i ovla{tene laboratorije. ^lan 4. (Na~in vr{enja sistemske kontrole) (1) Prisustvo {tetnog organizma se utvr|uje provjerom krtola krompira (u daljnjem tekstu: krtole), i gdje je to primjenjivo, biljki krompira (Solanum tuberosum L.), (u daljnjem tekstu: biljke). (2) Pri pregledu krtola fitosanitarni inspektor uzima uzorke sjemenskog krompira i krompira koji nije namijenjen sadnji (u daljnjem tekstu: merkantilni krompir), prvenstveno iz partija koje se nalaze u skladi{tima i dostavlja ih u ovla{tenu laboratoriju radi testiranja. U slu~aju potrebe fitosanitarni inspektor mo`e uzeti i dodatne uzorke krtola kako bi obavio vizuelni pregled prerezanih krtola. (3) Za ovaj pregled, u slu~aju kontrole biljaka, fitosanitarni inspektor uzima uzorke krtola ili biljaka i {alje ih u ovla{tenu laboratoriju radi testiranja. (4) Laboratorijsko testiranje iz st. (2) i (3) ovog ~lana provodi se u skladu sa postupkom iz Priloga II koji je sastavni dio ovog Pravilnika, (u daljnjem tekstu: propisani postupak). (5) Broj, porijeklo, dinamika i vrijeme uzimanja uzoraka se utvr|uje godi{njim programom koji je propisan u ~lanu 3. stav (1) ovog Pravilnika. (6) Godi{njim programom sistemske kontrole odre|uje se finansiranje, na nivou entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine, kao i dr`avnom nivou, laboratorijskih uzoraka po zahtjevu fitosanitarnih inspektora bilo da su nalazi pozitivni ili negativni. (7) Uprava, u saradnji sa nadle`nim organima entiteta i Br~ko Distrikta Bosne i Hercegovine, propisuje uslove u pogledu opremljenosti i osposobljenosti za testiranje ovog {tetnog organizma i izdaje ovla{tenja. ^lan 5. (Izvje{tavanje u slu~aju zaraze ili sumnje na zarazu) Ukoliko vlasnik ili bilo koje lice koje posumnja na prisustvo {tetnog organizma na krompiru koji raste ili koji je izva|en, uskladi{ten ili se nalazi u prodaji, obavezno je bez odlaganja izvijestiti nadle`nog fitosanitarnog inspektora. ^lan 6. (Postupanje sa uzorcima) (1) Tokom izvo|enja godi{njeg sistemskog nadzora i u slu~aju sumnje na prisustvo {tetnog organizma, fitosanitarni inspektor uzima uzorke krtola ili biljaka i {alje ih u ovla{tenu laboratoriju na testiranje. (2) U slu~aju sumnje na prisustvo {tetnog organizma, sve koli~ine ili po{iljke iz kojih su uzeti uzorci ostaju pod kontrolom fitosanitarnog inspektora. Ukoliko se radi o uvoznoj po{iljci primjenjuju se odredbe Pravilnika o mjerama za sprje~avanje uno{enja, {irenja i suzbijanja {tetnih organizama na bilju, biljnim proizvodima i reguliranim objektima sve dok se ne saznaju rezultati imunofluorescentnog testa, kao dijela propisanog postupka ili drugih odgovaraju}ih testiranja. (3) U slu~aju sumnje na postojanje {tetnog organizma za koji je identificiran pozitivan imunofluorescentni test, ovla{tena laboratorija zadr`ava i prikladno konzervira krompir, dok se ne zavr{i laboratorijsko testiranje za: a) sve krtole ili biljke koje su uzete kao uzorci; b) sve preostale ekstrakte i dodatno pripremljene imunofluorescentne slajdove ili bilo koji drugi relevantni materijal biljke koji je kori{ten u laboratorijskim testiranjima. ^lan 7. (Sumnja na zarazu) (1) Na zarazu {tetnim organizmom sumnja se: a) ako su uo~eni simptomi bolesti ili; b) ako je rezultat imunofluorescentnog ili nekog drugog brzog testa provjere sukladan s propisanim postupkom pozitivan. (2) Da bi se potvrdila ili opovrgnula sumnja na zarazu {tetnim organizmom, fitosanitarni inspektor odmah uzima uzorak i dostavlja ga ovla{tenoj laboratoriji. (3) Do dobijanja kona~nih rezultata laboratorijskog testiranja iz stava (2) ovog ~lana fitosanitarni inspektor rje{enjem nare|uje slijede}e mjere: a) zabranjuje prijevoz/prijenos i promet biljaka svih proizvoda, koli~ina ili po{iljki odakle su uzeti uzorci. U slu~aju uvozne po{iljke primjenjuju se odredbe Pravilnika o mjerama za sprje~avanje uno{enja, {irenja i suzbijanja {tetnih organizama na bilju, biljnim proizvodima i reguliranim objektima; b) odre|uje druge mjere koje je propisala Uprava u cilju utvr|ivanja porijekla sumnjive pojave; c) odre|uje odgovaraju}e dodatne preventivne mjere koje je propisala Uprava, na osnovu nivoa procijenjenog rizika, u cilju sprje~avanja {irenja {tetnog organizma. Ove mjere mogu obuhvatiti zvani~nu kontrolu i ograni~enja preno{enja svih ostalih krtola krompira ili biljaka unutar ili izvan mjesta koja su povezana sa sumnjivom pojavom. ^lan 8. (^uvanje dokaznog materijala) U slu~aju sumnje na pojavu {tetnog organizma, do dobijanja kona~nog rezultata laboratorijskog testiranja provedenog u skladu sa propisanim postupkom, ovla{tena laboratorija obavezna je zadr`ati i na primjeren na~in ~uvati: a) sve uzorkovane krtole i, kada je to mogu}e, sve uzorkovane biljke; b) sav preostali ekstrakt i dodatno pripremljen materijal za brze testove provjere, npr. stakalca za imunofluorescenciju i; c) svu pripadaju}u dokumentaciju. ^lan 9. (Postupak u slu~aju potvr|ene zaraze) (1) Ako se prilikom zvani~nog laboratorijskog testiranja iz ~lana 4. stav (4) ovog Pravilnika, u uzorku krtola, biljaka ili dijelova biljaka potvrdi prisustvo {tetnog organizma, Uprava, u saradnji sa fitosanitarnim slu`bama ima obavezu da: a) ozna~i kao zara`ene krtole ili biljke, po{iljke ili partije, ma{ine, prijevozna sredstva, skladi{ta ili njegove dijelove ili bilo koje druge objekte i predmete uklju~uju}i materijale za pakiranje iz kojih je uzet uzorak, kao i, gdje je to prakti~no, mjesta proizvodnje i polja sa kojih su krtole ili biljke izva|ene; b) odredi obim mogu}e zaraze; c) odredi obim potvr|ene zaraze i; d) odredi podru~je mogu}eg {irenja {tetnog organizma. (2) Na osnovu obima potvr|ene zaraze, obima mogu}e zaraze i podru~ja mogu}eg {irenja organizma, Uprava, u saradnji sa fitosanitarnom slu`bom, po hitnom postupku odre|uje posebno regulirano podru~je u kojem se provode mjere propisane ovim Pravilnikom. ^lan 10. (Obim mogu}e zaraze) Uprava, u saradnji sa fitosanitarnim slu`bama, na osnovu podataka zasnovanih na nau~nim principima i biologiji {tetnog organizma, kao i podataka o sistemu proizvodnje, marketinga i prerade, utvr|uje obim mogu}e zaraze, na osnovu informacija o mogu}em kontakatu krtola s utvr|enom zarazom prije i poslije njihovog va|enja ili tokom njihove proizvodnje, uzimaju}i u obzir: a) krtole ili biljke koji su rasle na mjestu proizvodnje koje je ozna~eno kao zara`eno; b) mjesto(a) proizvodnje ili prostorije koje imaju neku vezu sa proizvodnjom krtola ili biljaka koje su ozna~ene kao zara`ene, uklju~uju}i i ona koja dijele proizvodnu opremu i/ili ure|aje, bilo kakve ma{ine, prijevozna sredstva, posude, skladi{ta ili njihove jedinice, ili bilo koje druge objekte uklju~uju}i materijal za pakiranje; c) krtole ili biljke proizvedene na mjestu(ima) navedenim u ta~ki b) ovog ~lana, ili su se nalazili na tim mjestu(ima) proizvodnje u vrijeme dok su krtole ili biljke koje su ozna~ene kao zara`ene bile prisutne u prostorijama ili na mjestima proizvodnje navedenim u ta~ki a) ovog ~lana; d) centralna skladi{ta u kojima se skladi{ti ili dora|uje krompir sa mjesta proizvodnje navedenim u t~. a), b) i c) ovog ~lana; e) bilo koju ma{inu, prijevozno sredstvo, posudu, skladi{te ili njihove jedinice i bilo koje objekte, uklju~uju}i materijal za pakiranje, koji su mogli do}i u dodir sa krtolama ili biljkama koje su ozna~ene kao zara`ene, u toku prethodnog perioda od 12 mjeseci ili koliko je to potrebno; f) sve krtole ili biljke koje su bile uskladi{tene ili u kontaktu s nekim od objekata ili predmeta iz ta~ke e) ovog ~lana, prije ~i{}enja i dezinfekcije tih objekata i predmeta; g) krtole ili biljke koje se smatraju vjerovatno zara`enima zbog istog klonskog porijekla s krtolama ili biljkama koje su ozna~ene kao zara`ene, iako su rezultati testiranja provedeni u skladu sa propisanim postupkom negativni. Kada je potrebno, mo`e se provesti i test sortnosti da bi se provjerio identitet zara`enih i klonski srodnih krtola ili biljaka krompira i; h) mjesta proizvodnje krtola ili biljaka iz ta~ke g) ovoga ~lana. ^lan 11. (Testiranje klonski srodnog krompira) (1) Partije krompira koje su istog klonskog porijekla s krtolama ili biljkama koje su ozna~ene kao zara`ene u skladu sa ~lanom 4. stav (4) ovog Pravilnika, podlije`u obaveznom laboratorijskom testiranju u skladu sa propisanim postupkom. (2) Fitosanitarni inspektor na osnovu podataka dobijenih od Uprave odre|uje testiranje onolikog broja uzoraka krtola ili biljaka koliko je potrebno da bi se odredio mogu}i primarni izvor zaraze i obim mogu}e zaraze, pri ~emu redoslijed testiranja ovisi od stepena opasnosti. (3) Nakon dobijanja rezultata laboratorijskog testiranja iz stava (1) ovog ~lana, Uprava, u saradnji sa fitosanitarnom slu`bom, provodi dalje utvr|ivanje obima potvr|ene zaraze i obima mogu}e zaraze, te posebno reguliranog podru~ja. Fitosanitani inspektor obilje`ava posebno regulirano podru~je. ^lan 12. (Mjere i postupci sa zara`enim krompirom) (1) Sadnja krtola koje su ozna~ene kao zara`ene u skladu sa ~lanom 9. stav (1) ovog Pravilnika nije dopu{tena, ve} se one kao i zara`ene biljke moraju, pod nadzorom fitosanitarnog inspektora: a) uni{titi ili; b) upotrijebiti kao hrana za `ivotinje nakon odgovaraju}e termi~ke obrade koja ne ostavlja nikakvu mogu}nost pre`ivljavanja {tetnog organizma ili; c) odlo`iti na slu`beno odobrenom mjestu za zbrinjavanje otpada, za koje je utvr|eno da ne postoji opasnost od nekontroliranog {irenja {tetnog organizma u okoli{, na primjer cije|enjem kroz pore tla do poljoprivrednog zemlji{ta ili; d) spaliti ili; e) industrijski preraditi, pod uslovom da se direktno i odmah dopreme do mjesta prerade, na kojem mora postojati slu`beno odobrena oprema za zbrinjavanje otpada, ~ijim je kori{tenjem otklonjena opasnost od {irenja {tetnog organizma, i na kojem postoji sistem za ~i{}enje i dezinfekciju barem onih prijevoznih sredstava koja napu{taju mjesto prerade ili; f) podvrgnuti drugim mjerama, pod uslovom da nema opasnosti od {irenja {tetnog organizma. (2) Sav preostali otpad koji je nastao kao rezultat provedbe mjera iz stava (1) ovog ~lana, mora biti zbrinut u skladu sa slu`beno odobrenim postupkom u skladu sa ~lanom 13. ovog Pravilnika. ^lan 13. (Mjere i postupci sa mogu}e zara`enim krompirom) (1) Krtole ili biljke ozna~ene kao mogu}e zara`ene {tetnim organizmom u skladu sa ~lanom 7. ovog Pravilnika se ne smiju saditi, nego se pod kontrolom fitosanitarnog inspektora moraju: a) koristiti kao merkantilni krompir namijenjen za potro{nju, pri ~emu mora biti pakiran na mjestima koja raspola`u odgovaraju}om opremom za zbrinjavanje otpada, na na~in da je spreman za neposrednu dostavu i upotrebu bez naknadnog prepakiranja. Sa sjemenskim krompirom dozvoljeno je rukovati na tim istim mjestima samo ako se radi odvojeno ili nakon ~i{}enja i dezinfekcije ili; b) koristiti kao merkantilni krompir namijenjen za industrijsku preradu, uz direktnu i brzu dostavu do pogona za preradu, koji mora raspolagati odgovaraju}om opremom za zbrinjavanje otpada i opremom za ~i{}enje i dezinfekciju barem onih prijevoznih sredstava koja napu{taju mjesto prerade ili; c) koristiti u druge svrhe ili raspolagati na neki drugi slu`beno odobren na~in, pod uslovom da nema opasnosti od {irenja {tetnog organizma. (2) Mjere navedene u stavu (1) ovog ~lana se tako|er primijenjuju na krtole istog klonskog porijekla i biljke, bez obzira na rezultate testiranja, navedene u ~lanu 11. ovog Pravilnika. ^lan 14. (^i{}enje i dezinfekcija) (1) Fitosanitarni inspektor donosi rje{enje kojim se nare|uje da se svaka ma{ina, prijevozno sredstvo, posuda, skladi{te ili njihove jedinice ili bilo koji drugi objekti ozna~eni kao zara`eni u skladu sa ~lanom 8. ovog Pravilnika moraju ili uni{titi ili o~istiti i dezinficirati primjenom odgovaraju}ih postupaka kojima se otklanja opasnost od {irenja {tetnog organizma. (2) Nakon izvr{ene dezinfekcije, objekti i predmeti iz stava (1) ovoga ~lana vi{e se ne smatraju zara`enima. ^lan 15. (Postupci zbrinjavanja otpada) (1) Slu`beno odobreni postupak zbrinjavanja otpada nastalog u procesu industrijske prerade iz ~lana 13. ovog Pravilnika mora se izvr{iti tako da se izbjegne svaka opasnost od {irenja {tetnog organizma: a) otpaci krompira (uklju~uju}i odba~eni krompir i koru) i svi drugi kruti otpaci koji su vezani za krompir (uklju~uju}i zemlju, kamenje i druge ostatke) moraju se odstraniti na slijede}i na~in: 1) odlo`iti na za to slu`beno odobrenom mjestu, na kojem ne postoji opasnost od nekontroliranog {irenja {tetnog organizma u okoli{u, na primjer cije|enjem kroz pore do poljoprivrednog zemlji{ta. Otpaci se prevoze direktno do odre|enog mjesta u zatvorenom prijevoznom sredstvu tako da ne postoji opasnost od gubitka otpada ili; 2) spaliti ili; 3) primijeniti neke druge mjere za koje je utvr|eno da ne postoji opasnost od {irenja {tetnog organizma. b) teku}i otpad nastao u preradi, a koji sadr`i raspr{ene krute ~estice, mora se prije uklanjanja filtrirati ili obraditi postupkom sedimentacije radi odstranjivanja krutih ~estica. Krute ~estice se nakon toga uklanjaju na na~in naveden u ta~ki a) ovog stava. Teku}i dio otpada se mora: 1) u cijelosti prije odstranjivanja zagrijati na temperaturu od najmanje 60°C u trajanju od najmanje 30 minuta ili; 2) odstraniti pod slu`benim nadzorom na neki drugi slu`beno odobren na~in koji onemogu}ava da otpaci do|u na bilo koji na~in u dodir s poljoprivrednim zemlji{tem. (2) Postupci propisani u stavu (1) ovog ~lana primijenjuju se i na otpad koji nastaje tokom rukovanja, odstranjivanja i prerade zara`enih partija. ^lan 16. (Mjere u posebno reguliranom podru~ju) U posebno reguliranom podru~ju odre|enom u skladu sa ~lanom 9. stav (2) ovog Pravilnika, fitosanitarni inspektor nare|uje provo|enje mjera navedenih u Prilogu I koji je sastavni dio ovog Pravilnika. ^lan 17. (Postupak sa sjemenskim krompirom) (1) Sjemenski krompir mora poticati direktno od materijala dobijenog prema zvani~no odobrenom programu kontrole i za koji slu`benim laboratorijskim testiranjem provedenim u skladu sa propisanim postupkom utvr|eno da nije zara`en {tetnim organizmom. (2) Pomenuta testiranja se obavljaju: a) u slu~ajevima u kojima zaraza ugro`ava proizvodnju sjemenskog krompira na biljkama iz po~etne faze klonske selekcije; b) u ostalim slu~ajevima, ili na biljkama iz po~etne faze klonske selekcije, ili na reprezentativnim uzorcima osnovnog sjemena krompira, odnosno ranijih generacija u lancu vegetativnog razmno`avanja. ^lan 18. (Zabrana posjedovanja i kori{tenja {tetnog organizma) Zabranjeno je posjedovanje i bilo kakvo kori{tenje {tetnog organizma. ^lan 19. (Izuzeci od propisanih mjera) Uprava }e dozvoliti izuzetke u pogledu provo|enja mjera propisanih ~l. 12., 13., 14., 16. i 18. ovog Pravilnika u eksperimentalne, nau~ne svrhe ili selekcijski rad, pod uslovom da se tim osigura nadzor nad {tetnim organizmom i da nema opasnosti od njegovog {irenja ^lan 20. (Vo|enje evidencije) Uprava vodi evidenciju koja uklju~uje dokumentirane dokaze o obimu potvr|ene zaraze, obimu mogu}e zaraze i o podru~ju mogu}eg {irenja, sa slijede}im informacijama: a) datum kada je zaraza potvr|ena; b) opis elemenata koji su doveli do odluke da se proglasi zaraza i podru~je mogu}eg {irenja {tetnog organizma, uklju~uju}i i podatke o uzimanju uzoraka i o laboratorijskom nalazu; c) za bilo koju koli~inu ili po{iljku krompira ozna~enu kao zara`enu, podatke o fitosanitarnom certifikatu, uvjerenje o zdravstvenom stanju u slu~aju doma}e proizvodnje krompira, i kada je mogu}e podatke o biljnom paso{u, registarskom broju proizvo|a~a, zbirnim skladi{tima i dispe~erskim centrima; d) informacije o identificiranim ili mogu}im izvorima zaraze; e) pojedinosti o obimu ozna~ene zaraze, uklju~uju}i broj mjesta proizvodnje i broj partija s nazivom sorte, a kada se radi o sjemenskom krompiru, i o njegovoj kategoriji; f) pojedinosti o posebno reguliranom podru~ju, uklju~uju}i broj mjesta proizvodnje koja nisu ozna~ena kao zara`ena, ali su uklju~ena u posebno regulirano podru~je. ^lan 21. (Dodatne i stro`ije mjere) (1) Uprava mo`e propisati dodatne ili stro`ije mjere koje su potrebne u cilju borbe protiv {tetnog organizma ili sprje~avanja njegovog {irenja. (2) Dodatne mjere iz stava (1) ovog ~lana mogu uklju~ivati i zahtjev da se sadi samo onaj sjemenski krompir koji ima zvani~ni certifikat. (3) U slu~ajevima kada proizvo|a~ ima ovla{tenje da koristi na svom vlastitom imanju sjemenski krompir koji je dobijen iz vlastite proizvodnje, kao i u drugim slu~ajevima kada se sadi vlastito proizveden sjemenski krompir, njegova upotreba se dozvoljava samo ukoliko je krompir zvani~no pregledan i ukoliko je utvr|eno da zadovoljava zdravstvene standarde ^lan 22. (Fitosanitarni inspektor) Do uspostave fitosanitarnog inspektora posao fitosanitarnog inspektora u Republici Srpskoj obavljaju republi~ki poljoprivredni inspektori, a u Federaciji Bosne i Hercegovine, posao fitosanitarnog inspektora obavljaju poljoprivredni inspektori. ^lan 23. (Stupanje na snagu) Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Slu`benom glasniku BiH", a primjenjuje se od 01. januara 2010. godine. Broj 07-01-02-7175-2/09 30. septembra 2009. godine Sarajevo Ministar Mladen Zirojevi}, s. r. PRILOG I Mjere koje nareĊuje fitosanitarni inspektor i koje se provode u posebno reguliranom podruĉju uspostavljenom u skladu sa ĉlanom 6. stav (2) ovog Pravilnika su slijedeće: I. NA MJESTIMA PROIZVODNJE KOJA SU OZNAĈENA KAO ZARAŢENA: 1. Na polju koje je oznaĉeno kao zaraţeno: 1.1.1. u iduće, najmanje tri vegetacijske godine nakon godine u kojoj je utvrĊena zaraza: obavezno je uklanjanje samoniklih biljaka krompira i drugih biljaka domaćina štetnog organizma, i zabranjena je sadnja krtola i biljaka te sjetva sjemena krompira u botaniĉkom smislu kao i sjetva i sadnja drugih biljaka domaćina štetnog organizma ili usjeva za koje je utvrĊeno da omogućavaju širenje štetnog organizma, 1.1.2. u prvoj sezoni proizvodnje krompira koja slijedi nakon perioda iz podtaĉke 1.1.1., pod uslovom da na polju najmanje dvije uzastopne vegetacijske godine prije sadnje tokom provoĊenja sistemskog istraţivanja nisu naĊene samonikle biljke krompira i druge biljke domaćini, dopušta se proizvodnja iskljuĉivo merkantilnog krompira, uz testiranje krtola u skladu sa propisanim postupkom; 1.1.3. u sezoni proizvodnje krompira koja slijedi nakon one iz podtaĉke 1.1.2., dopušta se, uz odgovarajući plodored, koji mora biti najmanje dvogodišnji za proizvodnju sjemenskog krompira, proizvodnja sjemenskog ili merkantilnog krompira, uz provoĊenje sistemskog istraţivanja iz ĉlana 3. ovog Pravilnika; ili 1.2.1. tokom ĉetiri vegetacijske godine koje slijede nakon godine u kojoj je zaraza utvrĊena: – provode se mjere uklanjanja samoniklih biljaka krompira i drugih samoniklih biljaka domaćina štetnog organizma, i – polje se odrţava na ugaru ili kao trajni pašnjak s intenzivnom ispašom ili ĉestom niskom košnjom, 1.2.2. u prvoj sezoni proizvodnje krompira koja slijedi nakon perioda iz podtaĉke 1.2.1., pod uslovom da tokom provoĊenja sistemskog istraţivanja u najmanje dvije uzastopne vegetacijske godine prije sadnje na polju nisu naĊene samonikle biljke krompira i druge samonikle biljke domaćini, dopušta se proizvodnja sjemenskog ili merkantilnog krompira, uz testiranje izvaĊenih krtola u skladu sa propisanim postupkom. 2. Na ostalim poljima unutar zaraţenog mjesta proizvodnje pod uslovom da je fitosanitarni inspektor utvrdio da je otklonjena opasnost od samoniklih biljaka krompira te drugih biljaka domaćina štetnog organizma: 2.1. u vegetacijskoj godini koja slijedi nakon godine u kojoj je zaraza utvrĊena: – zabranjuje se sadnja krtola i biljaka krompira, te sjetva sjemena krompira u botaniĉkom smislu ili drugih samoniklih biljaka domaćina štetnog organizma, ili se – dopušta sadnja certificiranog sjemenskog krompira namijenjenog iskljuĉivo proizvodnji merkantilnog krompira, 2.2. u drugoj vegetacijskoj godini koja slijedi nakon godine u kojoj je zaraza utvrĊena, dopušta se sadnja samo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira za koji je sluţbenim testiranjem potvrĊeno da nije zaraţen štetnim organizmom i da je proizveden pod struĉnim nadzorom na mjestima proizvodnje koja nisu oznaĉena kao zaraţena, za sjemensku ili merkantilnu proizvodnju, 2.3. najmanje još u trećoj vegetacijskoj godini koja slijedi nakon godine u kojoj je utvrĊena zaraza dopušta se sadnja samo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira proizvedenog pod struĉnim nadzorom iz certificiranog sjemenskog krompira, za sjemensku ili merkantilnu proizvodnju, 2.4. u svakoj vegetacijskoj godini iz podtaĉke 2.1., 2.2. i 2.3. ove taĉke preduzimaju se mjere uklanjanja samoniklih biljaka krompira i drugih biljaka domaćina štetnog organizma ako su prisutne i provodi se sluţbeno testiranje izvaĊenog krompira sa svakog polja u skladu sa propisanim postupkom. 3. Odmah nakon utvrĊivanja zaraze štetnim organizmom i nakon slijedeće vegetacijske godine, sve mašine, oprema i skladišni prostori na mjestu proizvodnje koji su se koristili u proizvodnji krompira moraju se oĉistiti i dezinficirati primjenom odgovarajućih postupaka u skladu sa ĉlanom 12. ovog Pravilnika. 4. U zaštićenim prostorima namijenjenim proizvodnji bilja gdje je moguća potpuna zamjena supstrata za uzgoj: – zabranjuje se sadnja krtola i biljaka krompira te sjetva sjemena krompira u botaniĉkom smislu, sve dok se u tom zaštićenom prostoru, pod nadzorom fitosanitarnog inspektora, ne provedu mjere uništavanja štetnog organizma i ukloni sav biljni materijal koji potiĉe od biljaka domaćina, pri ĉemu se, kao minimalna mjera, obavezno provodi potpuna zamjena supstrata za uzgoj te ĉišćenje i dezinfekcija proizvodne jedinice i cjelokupne opreme, i sve dok nakon toga fitosanitarni inspektor ne odobri proizvodnju krompira, i – dopušta se sadnja iskljuĉivo certificiranog sjemenskog krompira ili mini-krtola ili mikro biljaka dobijenih iz kulture biljnog tkiva, koje potiĉu iz testiranih izvora. II. U ĈITAVOM POSEBNO REGULIRANOM PODRUĈJU, PORED MJERA NAVEDENIH U GLAVI I. OVOGA PRILOGA: 1. Odmah nakon utvrĊivanja zaraze fitosanitarni inspektor nareĊuje, prema potrebi, ĉišćenje i dezinfekciju svih mašina, opreme i skladišnih prostora koji su se koristili na takvim posjedima u proizvodnji krompira primjenom odgovarajućih postupaka u skladu sa ĉlanom 12. ovog Pravilnika. 2. Odmah i tokom najmanje tri vegetacijske godina koje slijede iza one u kojoj je zaraza utvrĊena, fitosanitarni inspektor: – nadzire posjede na kojima se uzgajaju, skladište, nalaze ili doraĊuju krtole krompira, ukljuĉujući i posjede s kojih i na kojima su se koristile mašine za obavljanje radnji vezanih za nabrojene djelatnosti, – unutar cijelog posebno reguliranog podruĉja nareĊuje sadnju iskljuĉivo certificiranog sjemenskog krompira ili sjemenskog krompira proizvedenog pod struĉnim nadzorom, i testiranje nakon vaĊenja onog sjemenskog krompira koji je uzgojen na mjestima proizvodnje koja se smatraju vjerovatno zaraţenima, u skladu sa ĉlanom 7. ovog Pravilnika, – nareĊuje da se na svim posjedima unutar tog podruĉja s proizvedenim sjemenskim krompirom postupa odvojeno od merkantilnog krompira, ili da se obavi ĉišćenje i dezinfekcija izmeĊu postupanja sa sjemenskim i merkantilnim krompirom, – provodi sistemsko istraţivanje iz ĉlana 3. ovog Pravilnika. 3. U sluĉaju potrebe, ministar moţe narediti zamjenu svih zaliha sjemenskog krompira u odgovarajućem vremenskom periodu. PRILOG II. ŠEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU UZROČNIKA PRSTENASTE TRULEŽI KRTOLA KROMPIRA, BAKTERIJE Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. PODRUČJE PRIMJENE ŠEME TESTIRANJA Prikazana šema testiranja opisuje razliĉite postupke za: − dijagnosticiranje prstenaste truleţi u krtolama i biljkama krompira; − detekciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (u daljem tekstu: C. m. ssp. sepedonicus) u uzorcima krtola i biljaka krompira; − identifikaciju bakterije C. m. ssp. sepedonicus. OPĆA NAČELA Optimizirani protokoli za pojedine metode, validirani reagensi i pojedinosti za pripremu materijala za testiranje i kontrolnih materijala navedeni su u Dodacima. Popis laboratorija koje su uĉestvovale u optimizaciji i validaciji protokola nalazi se u Dodatku 1. Obzirom da protokoli ukljuĉuju detekciju karantinskog organizma i da podrazumijevaju upotrebu ţivih kultura C. m. ssp. sepedonicus kao kontrolnih materijala, postupci će se morati izvoditi u primjerenim karantinskim uslovima s odgovarajućom opremom za zbrinjavanje otpada te prema uslovima dozvole koju izdaju nadleţna tijela za biljni karantin. Parametri testiranja moraju osigurati dosljednu i ponovljivu detekciju onih nivoa prisustva C. m. ssp. sepedonicus prema propisanim pragovima detekcije za pojedine metode. Precizna priprema pozitivnih kontrola je nuţna. Testiranje u skladu sa potrebnim pragovima detekcije podrazumijeva pravilno postavljanje, odrţavanje i kalibriranje opreme, paţljivo pohranjivanje i rukovanje reagensima te preduzimanje mjera za sprjeĉavanje kontaminacije meĊu uzorcima, npr. razdvajanje pozitivnih kontrola od uzoraka za testiranje. Moraju se primijeniti standardi kontrole kvalitete kako bi se izbjegle administrativne i druge pogreške, posebno pri oznaĉavanju uzoraka i voĊenju dokumentacije. Sumnja na zarazu, kao što je navedeno u ĉlanu 4. stav (1) Pravilnika o provoĊenju sistemskog istraţivanja i mjera za sprjeĉavanje širenja i suzbijanje prstenaste truleţi krtola krompira koju prouzrokuje bakterija C. m. ssp. sepedonicus (u daljnjem tekstu: Pravilnik), podrazumijeva pozitivan rezultat testa za dijagnosticiranje ili testa provjere provedenog na uzorku kao što je prikazano u dijagramima toka. Ako je rezultat prvog testa provjere (IF ili PCR/FISH) pozitivan, tada se sumnja na zarazu bakterijom C. m. ssp. sepedonicus i mora se provesti drugi test provjere. Ako je rezultat drugog testa provjere pozitivan, tada je sumnja potvrĊena i testiranje se mora nastaviti prema šemi testiranja. Ako je rezultat drugog testa provjere negativan, tada se smatra da uzorak nije zaraţen bakterijom C. m. ssp. sepedonicus. Dakle, pozitivan rezultat IF testa, kao što je navedeno u ĉlanu 6. stav (2) definiramo kao pozitivno oĉitanje IF testa koje je potrebno potvrditi drugim testom provjere (PCR/FISH). PotvrĊena zaraza, kao što je navedeno u ĉlanu 8. stav (2) Pravilnika, podrazumijeva izolaciju i identifikaciju ĉiste kulture C. m. ssp. sepedonicus, te potvrdu patogenosti. 1. PRIKAZ DIJAGRAMA TOKA 1.1. Šema za detekciju i dijagnosticiranje uzročnika prstenaste truleži u krtolama i biljkama krompira sa simptomima prstenaste truleži Postupak testiranja je namijenjen za krtole i biljke krompira sa simptomima tipiĉnim za ili koji pobuĊuju sumnju na prstenastu truleţ. Postupak ukljuĉuje brzi test provjere, izolaciju patogena iz zaraţenog provodnog tkiva na dijagnostiĉkoj hranjivoj podlozi i u sluĉaju pozitivnog rezultata, identifikaciju ĉiste kulture kao bakterije C. m. ssp. sepedonicus. BRZI DIJAGNOSTIČKI TESTOVI( 2 ) OSNOVNA IZOLACIJA ( 3 ) Kolonije tipične morfologije ( 4 ) C.m.subsp.sepedonicus nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 5 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 6 ) TEST PATOGENOSTI ( 7 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao C.m.subsp.sepedonicus NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Uzorak je zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Krtola(i) krompira ili biljaka(e) krompira sa simptomima za koje se sumnja da su uzročnici prstenaste truleži ( 1 ) (1) Opis simptoma naveden je u Dijelu 2. (2) Prikladni testovi su: – IF test (Dio 4), – PCR test (Dio 6), – FISH test (Dio 5). (3) Iako je izolacija patogena iz biljnog materijala s tipiĉnim simptomima metodom razrjeĊivanja i zasijavanja na hranjivu podlogu jednostavna, uzgoj moţe biti neuspješan iz uzoraka u naprednom stadiju infekcije. Saprofitske bakterije koje rastu na oboljelom tkivu mogu prerasti ili inhibirati razvoj patogena na hranjivoj podlozi. Stoga se preporuĉuje korištenje neselektivne i selektivne hranjive podloge, najbolje MTNA (Odjeljak 8) ili biotest (Odjeljak 7). (4) Opis tipiĉne morfologije kolonije C. m. ssp. sepedonicus naveden je u Dijelu 8. (5) Ako je rezultat izolacije negativan, ali su simptomi bolesti tipiĉni, tada je potrebno ponoviti postupak izolacije. (6) Pouzdana identifikacija ĉiste kulture C. m. ssp. sepedonicus postiţe se provoĊenjem testova navedenih u Dijelu 9. (7) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10. 1.2. Šema detekcije i identifikacije bakterije C. m. ssp. sepedonicus u uzorcima krtola krompira bez simptoma Naĉelo Postupak testiranja namijenjen je za detekciju skrivene zaraze u krtolama krompira. Pozitivan rezultat iz najmanje dva testa provjere, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, mora se dopuniti izolacijom patogena, nakon kojeg slijedi, u sluĉaju izolacije tipiĉnih kolonija, potvrda ĉiste kulture kao C. m. ssp. sepedonicus. Pozitivan rezultat samo jednog od testova provjere nije dovoljan da bi se uzorak smatrao vjerovatno zaraţenim. Testovi provjere i izolacija moraju omogućiti prag detekcije 10 3 do 10 4 ćelija/ml resuspendiranog taloga, ukljuĉenog kao pozitivna kontrola u svakoj seriji testova. GLAVNI TESTOVI PROVJERE ( 3 ) IF test( 4 ) / PCR test ( 5 ) / FISH test( 6 ) Kolonije tipične morfologije ( 9 ) C.m.subsp.sepedonicus nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 10 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 11 ) TEST PATOGENOSTI ( 12 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao C.m.subsp.sepedonicus NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Uzorak je zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Uzorak krtola ( 1 ) Ekstrakcija i koncentriranje patogena ( 2 ) Prvi test provjere ( 3 ) Negativno Pozitivno C.m.subsp.sepedonicus nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum SELEKTIVNA IZOLACIJA ( 7 ) i/ili biotest ( 8 ) Drugi test provjere ( 3 ) Negativno Pozitivno C.m.subsp.sepedonicus nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum (1) Standardna veliĉina uzoraka je 200 krtola, iako se postupak moţe provesti i na manjim uzorcima ako nije na raspolaganju 200 krtola. (2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Dijelu 3.1. (3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji su zasnovani na razliĉitim biološkim naĉelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj uzorak negativan. U sluĉaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni. (4) Test imunofluorescencije (IF). Uvijek koristite poliklonska antitijela za IF provjeru, dodatna monoklonska antitijela mogu omogućiti veću specifiĉnost (vidi Dio 4). (5) PCR test. Koristite validirane reagense i protokole za PCR (vidi Dio 6). (6) FISH test. Koristite validirane reagense i protokole (vidi Dio 5). (7) Selektivna izolacija. Korištenje MTNA ili NCP-88 hranjivih podloga i 1/100 razrijeĊenja resuspendiranog taloga je u mnogim sluĉajevima prikladna metoda za direktnu izolaciju C. m. ssp. sepedonicus. Tipiĉne kolonije mogu se dobiti 3 do 10 dana nakon zasijavanja na hranjivu podlogu. Patogen se tada moţe preĉistiti i identificirati. Kako bi se u cijelosti iskoristile mogućnosti testa, potrebna je paţljiva priprema i uklanjanje kore sa pupĉanog dijela krtole kako bi se izbjegle sekundarne bakterije s krtola krompira, koje na hranjivoj podlozi konkuriraju bakteriji C. m. ssp. sepedonicus. i mogu prerasti u patogena. Ako izolacija na hranjivoj podlozi ne uspije, mora se napraviti iz biljaka koje su korištene u biotestu (vidi Dio 8). (8) Biotest se koristi za izolaciju bakterije C. m. ssp. sepedonicus iz macerata vještaĉki inokuliranog patlidţana (Solanum melongena). Test zahtijeva optimalne uslove inkubacije kao što je navedeno u ovoj metodi. Bakterije koje inhibiraju bakteriju C. m. ssp. sepedonicus na MTNA ili NCP-88 hranjivim podlogama najvjerovatnije neće smetati u ovom testu (vidi Dio 7). (9) Tipiĉna morfologija kolonije opisana je u Dijelu 8. (10) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije iz istog resuspendiranog taloga ili ponovite uzimanje provodnog tkiva iz baznog dijela blizu stolona krtola iz istog uzorka te, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke. (11) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura C. m. ssp. sepedonicus postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Dijelu 9. (12) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10. 1.3. Šema za detekciju i identifikaciju bakterije C. m. ssp. sepedonicus u uzorcima biljaka krompira bez simptoma (1) Za preporuĉene veliĉine uzoraka vidi Dio 3.2. (2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Dijelu 3.2. (3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, GLAVNI TESTOVI PROVJERE ( 3 ) selektivna izolacija ( 4 ) / IF test( 5 ) / PCR test ( 6 ) / FISH test( 7 )/ neobavezan pomoćni test: biotest ( 8 ) Svi testovi dali negativan rezultat Kolonije tipične morfologije ( 4 ) nakon izolacije C.m.subsp.sepedonicus nije detektirana uzorak nije zaražen bakerijom R. solanacearum NE ( 9 ) DA Pročistiti presijavanjem IDENTIFIKACIJSKI TESTOVI ( 10 ) TEST PATOGENOSTI ( 11 ) Oba testa potvrđuju čistu kulturu kao C.m.subsp.sepedonicus NE DA Uzorak nije zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Uzorak je zaražen bakterijom C.m.subsp.sepedonicus Uzorak dijelova stabljike ( 1 ) Ekstrakcija i koncentriranje patogena ( 2 ) smatra se da je taj uzorak negativan. U sluĉaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni. (4) Selektivna izolacija i tipiĉna morfologija kolonije opisani su u Dijelu 8. (5) IF test opisan je u Dijelu 4. (6) PCR testovi opisani su u Dijelu 6. (7) FISH test opisan je u Dijelu 5. (8) Biotest opisan je u Dijelu 7. (9) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije i, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke. (10) Pouzdana identifikacija ĉistih kultura C. m. ssp. sepedonicus postiţe se provoĊenjem testova opisanih u Dijelu 9. (11) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10. 2. VIZUELNI PREGLED ZA OTKRIVANJE SIMPTOMA PRSTENASTE TRULEŽI 2.1. Biljke krompira U evropskim klimatskim uslovima simptomi se rijetko pronalaze u polju i to ĉesto tek na kraju sezone. Osim toga, simptomi su ĉesto prikriveni ili se mogu zamijeniti s drugim bolestima, starenjem ili mehaniĉkim oštećenjima. Stoga moţemo vrlo lako previdjeti simptome prilikom pregleda u polju. Simptomi venuća vrlo su razliĉiti od onih smeĊe truleţi; venuće je obiĉno polagano i u poĉetku ograniĉeno na rubove listova. Mladi zaraţeni listovi ĉesto nastavljaju rasti, iako manje u zaraţenim dijelovima, te su listovi neobiĉnog oblika. Listovi zbog blokade provodnog tkiva u donjem dijelu stabljike ĉesto imaju hlorotiĉne, ţuto-naranĉaste dijelove izmeĊu lisnih ţila. Zaraţeni listići, listovi, ĉak i stabljike mogu vremenom odumrijeti. Ĉesto su listovi i krtole samo manje veliĉine. Povremeno su biljke zakrţljale. 2.2. Krtole krompira Najraniji simptomi su lagana staklenost ili prozirnost tkiva bez omekšanja oko provodnog sistema, posebno u blizini pupĉanog dijela krtole. Provodni prsten na pupĉanom dijelu krtole moţe biti malo tamnije boje od uobiĉajene. Prvi lako uoĉljiv simptom je ţućkasta boja provodnog prstena, a kada se krtola njeţno stisne, iz ţila izlaze male koliĉine sirastog materijala. Taj iscjedak sadrţi milijone bakterija. Provodno tkivo moţe posmeĊiti i simptomi na krtolu u ovom stadiju sliĉni su simptomima smeĊe truleţi koju uzrokuje Ralstonia solanacearum. U poĉetku, ti simptomi mogu biti ograniĉeni na jedan dio provodnog prstena, ne nuţno blizu pupĉanog dijela krtole, i mogu se postupno proširiti na cijeli prsten. Kako infekcija napreduje, dolazi do propadanja provodnog tkiva; vanjska i unutrašnja kora se mogu razdvojiti. U naprednim stadijima infekcije, na površini krtola pojavljuju se pukotine, koje su ĉesto crvenkasto-smeĊe po rubovima. Nedavno se u Evropi pojavilo nekoliko sluĉajeva u kojima je središte krtole truhnulo istovremeno s provodnim prstenom što je dovelo do sekundarnog napada i unutrašnjim stvaranjem šupljina i nekroza. Sekundarni napad gljiva ili bakterija moţe prikriti simptome i moţe biti teško, ĉak nemoguće, razlikovati uznapredovale simptome prstenaste truleţi od drugih truleţi krtola. Mogući su netipiĉni simptomi. 3. PRIPREMA UZORKA 3.1. Krtole krompira Napomena: − Standardna veliĉina uzorka je 200 krtola po testu. Intenzivnije uzorkovanje zahtijeva testiranje više uzoraka iste veliĉine. Veći broj krtola u uzorku dovodi do inhibicije ili će oteţati tumaĉenje rezultata. MeĊutim, postupak se moţe prikladno primijeniti za uzorke s manje od 200 krtola, kada je na raspolaganju manje krtola. − Validacija svih metoda za detekciju, koje su opisane u daljnjem tekstu, zasniva se na testiranju uzoraka od 200 krtola. − ekstrakt krompira koji je opisan u daljnjem tekstu moţe se koristiti i za detekciju uzroĉnika smeĊe truleţi krompira, bakterije Ralstonia solanacearum. Neobavezna obrada krtola prije pripreme uzorka Operite krtole. Upotrijebite prikladna dezinfekcijska sredstva (spojeve hlora kada će se provesti PCR test kako bi se uklonila moguća DNK patogena) i deterdţente izmeĊu svakog uzorka. Osušite krtole na zraku. Postupak pranja je posebno koristan (ali ne obavezan) za uzorke s previše tla i ako će se provesti PCR test ili direktna izolacija. 3.1.1. Ĉistim i dezinficiranim skalpelom ili noţem uklonite koru na krajevima pupĉanog dijela krtole tako da provodno tkivo bude vidljivo. Paţljivo izreţite mali isjeĉak provodnog tkiva na kraju pupĉanog dijela krtole (u daljem tekstu: isjeĉak) pazeći da zahvatite što manje okolnog, neprovodnog tkiva. Napomena: Odvojite sve krtole s mogućim simptomima prstenaste truleţi i testirajte posebno. Ako prilikom odstranjivanja isjeĉka opazite moguće simptome prstenaste truleţi, krtole treba vizuelno pregledati nakon što se prereţe blizu pupka. Svaku prerezanu krtolu s mogućim simptomima treba ostaviti na sobnoj temperaturi dva dana da suberizira i pohraniti u karantinskim uslovima (na 4 do 10°C) sve dok se ne dovrše svi testovi. Sve krtole u uzorku (ukljuĉujući one sa sumnjivim simptomima) trebaju se ĉuvati u skladu s ĉlanom 8. Pravilnika. 3.1.2. Stavite isjeĉke u neupotrijebljene posude za jednokratnu upotrebu koje se mogu zatvoriti i/ili hermetiĉki zatvoriti (ako su posude već upotrebljavane, moraju se temeljito oĉistiti i dezinficirati spojevima hlora). Poţeljno ih je odmah obraditi. Ako to nije moguće, ĉuvajte ih u posudi bez dodatka pufera, najduţe 72 sata u hladnjaku ili najduţe 24 sata na sobnoj temperaturi. Sušenje i suberizacija isjeĉka, kao i rast saprofita tokom pohrane mogu ometati detekciju bakterije uzroĉnika prstenaste truleţi. 3.1.3. Obradite isjeĉke jednim od slijedećih postupaka: (a) dodati dovoljnu koliĉinu (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3) da pokrije isjeĉke i tresti na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min) ĉetiri sata na temperaturi ispod 24°C ili 16 do 24 sata uz hlaĊenje, ili (b) homogenizirajte isjeĉke s dovoljnom koliĉinom (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3), bilo u miješalici (npr. Waring ili Ultra Thurax) bilo drobljenjem u dobro zatvorenoj vrećici za maceraciju za jednokratnu upotrebu (npr. vrećice Stomacher ili Bioreba od ĉvrstog politena, 150 mm x 250 mm, sterilizirane zraĉenjem) koristeći gumeni ĉekić ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Napomena: Ako se uzorci homogeniziraju u miješalici, postoji velika opasnost od njihove unakrsne kontaminacije. Preduzmite mjere opreza kako biste sprijeĉili nastajanje aerosola ili razlijevanje tokom postupka ekstrakcije. Pobrinite se da za svaki uzorak upotrijebite svjeţe sterilizirane noţiće i posude miješalice. Ako će se provesti PCR test, sprijeĉite prijenos DNK na spremnike ili drobilicu. Za PCR test preporuĉuje se drobljenje u vrećicama za jednokratnu upotrebu i korištenje epruveta za jednokratnu upotrebu. 3.1.4. Odlijte supernatant. Ako je previše mutan, razbistrite ga sporim centrifugiranjem (na najviše 180 g 10 minuta na temperaturi od 4 do 10°C) ili vakuumskom filtracijom (40 do 100 µm), i dodatno isperite filtar ekstrakcijskim puferom (oko 10 ml) (Dodatak 3). 3.1.5. Koncentrirajte bakterijsku frakciju centrifugiranjem na 7 000 g 15 minuta (ili 10 000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10°C te odlijte supernatant pazeći pri tom da se ne pomiješa talog. 3.1.6. Resuspendirajte talog u 1,5 ml pufera za talog (Dodatak 3). Upotrijebite 500 µl za testiranje na C. m. ssp. sepedonicus, 500 µl za Ralstonia solanacearum i 500 µl kao referentni materijal. Dodajte sterilni glicerol konaĉnoj koncentraciji od 10 do 25% (v/v) 500 µl referentnog alikvota i preostalom testnom alikvotu, promiješajte i uskladištite na temperaturi od –16 do –24 °C (mjesecima) ili na –68 do –86 °C (mjesecima). Testne alikvote ĉuvajte na 4 do 10°C tokom testiranja. Ne preporuĉuje se višekratno zamrzavanje i otapanje. Ako je potreban transport ekstrakta, osigurajte dostavu u prijenosnome hladnjaku u roku od 24 do 48 sati. 3.1.7. Sve pozitivne kontrole i uzorci C. m. ssp. sepedonicus moraju se odvojeno pripremiti i obraditi kako bi se izbjegla kontaminacija. To vrijedi za stakalca za imunofluorescenciju, kao i za sve ostale testove. 3.2. Biljke krompira Napomena: Za detekciju latentnih populacija bakterije Ralstonia solanacearum preporuĉuje se testiranje sastavljenih uzoraka. Postupak se moţe prikladno primijeniti na sastavljene uzorke s najviše 200 dijelova stabljika. (Ako se provodi sistemski nadzor, on se mora zasnivati na statistiĉki reprezentativnom uzorku biljne populacije koja se ispituje). 3.2.1. Ĉistim dezinficiranim noţem ili vrtlarskim makazama odreţite dio dug 1 do 2 cm s donjeg dijela svake stabljike, odmah iznad površine tla. Kratko dezinficirajte dijelove stabljika 70% etanolom i odmah posušite papirnatim ubrusom. Stavite dijelove stabljika u zatvorenu sterilnu posudu prema jednom od slijedećih postupaka: 3.2.2. Obradite dijelove stabljika pomoću jednog od slijedećih postupaka: (a) prekrijte ih dovoljnom koliĉinom (pribliţno 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3) i tresite na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min) ĉetiri sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlaĊenje, ili (b) odmah obradite drobljenjem u ĉvrstoj vrećici za maceraciju (npr. Stomacher ili Bioreba) s odgovarajućom koliĉinom ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) koristeći gumeni ĉekić ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Ako to nije moguće, dijelove stabljika ĉuvajte u hladnjaku najduţe 72 sata ili na sobnoj temperaturi najduţe 24 sata. 3.2.3. Nakon 15 minuta taloţenja, izlijte supernatant. 3.2.4. Dodatno bistrenje ekstrakta ili koncentriranje bakterijske frakcije obiĉno nije potrebno, ali se moţe postići filtriranjem i/ili centrifugiranjem kako je opisano u dijelu 3.1.4 do 3.1.6. 3.2.5. Podijelite ĉisti ili koncentrirani ekstrakt uzorka na dva jednaka dijela. Jednu polovinu ĉuvajte na temperaturi od 4 do 10°C tokom testiranja, a drugu polovinu pohranite s 10 25% (v/v) sterilnog glicerola na temperaturi od –16 do –24°C (sedmicama) ili na –68 do –86 °C (mjesecima) u sluĉaju da je potrebno daljnje testiranje. 4. IF TEST Naĉelo Upotreba IF testa kao glavnog testa provjere preporuĉuje se zbog njegove dokazane dosljednosti pri postizanju zahtijevanih pragova detekcije. Kada se IF test koristi kao glavni test provjere i ako je IF oĉitanje pozitivno, mora se provesti PCR test ili FISH test kao drugi test provjere. Kada se IF test koristi kao drugi test provjere i IF oĉitanje je pozitivno, potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu toka kako bi se dovršila analiza. Napomena: Uvijek koristite poliklonska antitijela kada se IF test koristi kao glavni test provjere. U sluĉaju pozitivnog IF oĉitanja s poliklonskim antitijelima, daljnja provjera uzorka s monoklonskim antitijelima moţe omogućiti veću specifiĉnost, ali moţe biti manje osjetljiva. Upotrijebite antitijela na referentni soj C. m. ssp. sepedonicus. Preporuĉuje se da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se definira kao najveće razrijeĊenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri testiranju suspenzije koja sadrţi 10⁵ do 10⁶ ćelija po ml homolognog soja C. m. ssp. sepedonicus uz korištenje fluorescein-izotiocijanat (FITC) konjugiranih antitijela u skladu s preporukama proizvoĊaĉa. NerazrijeĊena poliklonska i monoklonska antitijela trebaju imati IF titar najmanje 1:2000. Tokom testiranja treba koristiti radna razrijeĊenja antitijela, koja su blizu ili jednaka titru. Koristite validirana antitijela. Test treba provesti na svjeţe pripremljenim ekstraktima uzoraka. On se, po potrebi, moţe uspješno provesti i na ekstraktima koji su bili pohranjeni na temperaturi od – 68 do – 86°C s dodatkom glicerola. Glicerol se moţe ukloniti dodavanjem 1 ml pufera za talog (Dodatak 4), ponovnim 15-minutnim centrifugiranjem na 7000 g i resuspendiranjem u jednakom volumenu pufera za talog. To je rijetko potrebno, naroĉito ako su uzorci plamenom fiksirani na stakalca (vidi 2.2). Za pozitivnu kontrolu pripremite odvojena stakalca s homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije C. m. ssp. sepedonicus, suspendiranim u ekstraktu krompira kako je navedeno u Dodatku 2, ili po izboru u puferu. Kao sliĉnu kontrolu na istom stakalcu trebalo bi, po mogućnosti, koristiti prirodno zaraţeno tkivo (odrţavano liofilizacijom ili zamrzavanjem na –16 do – 24°C). Za negativnu kontrolu mogu se upotrijebiti alikvoti ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju pokazali negativan rezultat. Koristite predmetna stakalca sa više otvora, po mogućnosti s 10 otvora promjera najmanje 6 mm. Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke. 4.1. Pripremite stakalca za testiranje prema jednom od slijedećih postupaka: (i) Za taloge s relativno malo skroba: U prvi otvor pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za otvore promjera 6 mm – za veće otvore povećajte volumen) razrjeĊenja od 1/100 resuspendiranog taloga krompira. Potom u ostale otvore u istom redu pipetom odmjerite sliĉni volumen nerazrijeĊene suspenzije (1/1) taloga. Drugi se red moţe koristiti za duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na slici 1. (ii) Za ostale suspenzije taloga: Pripremite decimalna razrjeĊenja (1/10, 1/100) resuspendiranog taloga u puferu za talog. U jedan red otvora pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za otvore promjera 6 mm – za veće otvore povećajte volumen) resuspendiranog taloga i svakog razrjeĊenja. Drugi se red moţe koristiti kao duplikat istog ili za drugi uzorak kao što je prikazano na slici 2. 4.2. Ostavite da se kapljice osuše na sobnoj temperaturi ili ih zagrijavajte do temperature od 40 do 45°C. Fiksirajte bakterijske ćelije na stakalce bilo zagrijavanjem (15 minuta na 60°C), provlaĉenjem kroz plamen, 95%-tnim etanolom ili prema posebnim uputama dobavljaĉa antitijela. Prije daljnjih testiranja, fiksirana se stakalca mogu, po potrebi, kratko vrijeme (najviše do tri mjeseca) ĉuvati zamrznuta u suhom spremniku. 4.3. IF postupak: (i) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisano pod 4.1(i): Pripremite niz dvostrukih razrjeĊenja antitijela u IF puferu. Prvi otvor mora imati 1/2 titra (T/2), a ostali 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i dvostruki titar (2T). (ii) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisano pod 4.1(ii): Pripremite radno razrjeĊenje antitijela u IF puferu. Radno razrjeĊenje utiĉe na specifiĉnost. Slika 1. Priprema stakalca u skladu sa tačkama 4.1.(i) i 4.3.(i) Razrjeđenja rastvorenog taloga 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 □ razrjeđenja rastvorenog taloga (T = titar) T/2 T/4 T/2 T 2T □ dvostruka razrjeđenja seruma/antitijela Uzorak 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Slika 2. Priprema stakalaca u skladu sa tačkama 4.1. (ii) i 4.3.(ii) Radna razrjeđenja seruma/antitijela 1/1 1/10 1/100 prazno prazno □ decimalna razrjeđenja rastvorenog taloga Uzorak 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 4.3.1. Posloţite stakalca na navlaţeni upijajući papir. Svaki otvor potpuno prekrijte razrjeĊenjem antitijela. Volumen antitijela koji se stavlja u pojedini otvor mora biti jednak volumenu stavljenog ekstrakta. Slijedite slijedeći postupak ako nema posebnih uputa dobavljaĉa antitijela: 4.3.2. Inkubirajte stakalca na vlaţnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25°C). 4.3.3. Otresite kapljice sa svakog stakalca i paţljivo ih isperite IF puferom. Potopite ih 5 minuta u IF pufer-Tween (Dodatak 3) i nakon toga u IF pufer. Pazite da ne doĊe do stvaranja aerosola ili prijenosa kapljica jer bi to moglo dovesti do unakrsne kontaminacije. Stakalca paţljivo osušite upijajućim papirom. 4.3.4. Posloţite stakalca na navlaţeni upijajući papir. Otvore prekrijte razrijeĊenim FITC konjugatom koji se koristi za odreĊivanje titra. Volumen konjugata nanesenog na otvore mora biti jednak volumenu nanesenog antitijela. 4.3.5. Inkubirajte stakalca na vlaţnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25°C). 4.3.6. Otresite kapljice konjugata sa stakalca. Isperite i operite kako je prethodno opisano (4.3.3). Paţljivo osušite. 4.3.7. Na svaki otvor pipetom nanesite 5-10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim puferom (Dodatak 3) ili sredstvo protiv izbljeĊivanja koje je dostupno na trţištu te stavite pokrovno stakalce. 4.4. Oĉitavanje IF testa: 4.4.1. Pregledajte pripremljena stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s odgovarajućim filtrima za ekscitaciju FITC-a, uz uljnu imerziju i povećanje od 500-1000 x. Pregledajte svaki otvor preko dva meĊusobno okomita promjera i duţ vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj ćelija ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja. Najprije pregledajte stakalce s pozitivnom kontrolom. Ćelije moraju snaţno fluorescirati i moraju biti potpuno obojene na utvrĊenom titru antitijela ili radnog razrjeĊenja. U sluĉaju da kod obojenosti doĊe do odstupanja, IF test se mora ponoviti (Dio 4). 4.4.2. Pregledajte da li su u otvorama vidljive jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus. Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji kao i kod pozitivnog kontrolnog soja pri jednakom razrjeĊenju antitijela. Ćelije s nepotpunim obojenjem ili sa slabom fluorescencijom moraju se zanemariti. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se moţe ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne ćelije zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne ćelije pronaĊene (izvan otvora) na površini stakalca. 4.4.3. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifiĉnost testa imunofluorescencije. U koncentriranom ekstraktu isjeĉaka krompira ili dijelova stabljika mogu se nalaziti populacije fluorescirajućih ćelija netipiĉne morfologije i saprofitne bakterije s kojima dolazi do unakrsne reakcije i koje su po veliĉini i morfologiji sliĉne bakteriji C. m. ssp. sepedonicus. 4.4.4. U obzir uzmite samo fluorescirajuće ćelije tipiĉne veliĉine i morfologije u titru ili radnom razrjeĊenju antitijela kako je opisan u taĉki u 4.3. 4.4.5. Tumaĉenje oĉitanja IF testa: (i) Ako naĊete jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije, odredite prosjeĉni broj tipiĉnih ćelija po mikroskopskom vidnom polju i izraĉunajte broj tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Oĉitanje IF testa je pozitivno za uzorke koji imaju najmanje 5 x 10³ tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga. Uzorak se smatra potencijalno kontaminiranim i potrebno je daljnje testiranje. (ii) Oĉitanje IF testa je negativno za uzorke koji imaju manje od 5 x 10³ ćelija po ml resuspendiranog taloga te se uzorak smatra negativnim. Nije potrebno daljnje testiranje. 5. FISH TEST Naĉelo Kada se FISH test koristi kao prvi test provjere i ako se njime dobije pozitivan rezultat, mora se provesti IF test kao drugi obavezni test provjere. Ako se FISH test koristi kao drugi test provjere i ako se njim dobije pozitivan rezultat, za postavljanje konaĉne dijagnoze treba obaviti daljnje testiranje prema dijagramu. Napomena: Koristite validirane oligo-probe specifiĉne za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus (Dodatak 7). Preliminarna testiranja ovom metodom trebaju omogućiti ponovljivu detekciju najmanje 10 3 do 10 4 ćelija bakterije C. m. ssp. sepedonicus po ml koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijim testiranjima bili negativni. Slijedeći je postupak najbolje provesti na svjeţe pripremljenim ekstraktima uzoraka, ali se moţe uspješno primijeniti i na ekstraktu uzorka koji je bio pohranjen s glicerolom na temperaturi od –16 do –24°C ili od –68 do –86°C. Za negativnu kontrolu upotrijebite alikvote ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju na prisustvo C. m. ssp. sepedonicus bili negativni. Za pozitivnu kontrolu pripremite suspenzije koje sadrţe 10⁵ do 10⁶ ćelija/ml 0,01 M fosfatnog pufera (PB) bakterije C. m. ssp. sepedonicus (npr. soj NCPPB 4053, ili PD 406) iz kulture stare 3-5 dana (za pripremu vidi Dodatak 2). Pripremite odvojena stakalca za pozitivnu kontrolu s homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije C. m. ssp. sepedonicus, suspendiranim u ekstraktu krompira, kao što je navedeno u Dodatku 2. Korištenje eubakterijske oligo-probe obiljeţene FITC-om omogućava kontrolu procesa hibridizacije jer će se obojiti sve eubakterije koje su prisutne u uzorku. Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke. 5.1. Fiksiranje ekstrakta krompira Slijedeći protokol zasniva se na Wullings i sar., (1998.): 5.1.1. Pripremite otopinu za fiksiranje (vidi Dodatak 7.). 5.1.2. Pipetom odmjerite 100 µl svakog ekstrakta uzorka u Eppendorf tubu te centrifugirajte 8 minuta na 7000 g. 5.1.3. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 500 µl fiksativa pripremljenog prije najviše 24 sata. Promiješajte na vortex miješalici i inkubirajte jedan sat u hladnjaku. Alternativni fiksativ je 96% etanol. Pri tome je potrebno resuspendirati talog iz koraka 5.1.2 u 50 µl 0,01M PB i 50 µl 96 % etanola. Promiješajte na vortex miješalici i inkubirajte na 4°C 30 do 60 minuta. 5.1.4. Centrifugirajte 8 minuta na 7000 g, uklonite supernatant te resuspendirajte talog u 75 µl 0,01M PB (vidi Dodatak 3). 5.1.5. U otvore ĉistog stakalca nanesite 16 µl fiksiranih suspenzija kako je prikazano na slici 3. Na svako stakalce nanesite nerazrijeĊena dva razliĉita uzorka i upotrijebite 10 µl za pripremanje razrjeĊenja 1:100 (u 0,01 M PB). Preostalu fiksiranu otopinu uzorka (49 µl) moţete pohraniti na –20°C nakon dodavanja jednog volumena 96%-tnog etanola. Ako FISH test trebate ponoviti, centrifugiranjem uklonite etanol i dodajte jednaki volumen 0,01 PB (promiješati na vortex miješalici). Slika 3. Prikaz stakalca za FISH test Uzorak 1 Prazno Prazno Prazno Uzorak 2 ○ ○ ○ ○ ○ Otvor 1 Otvor 2 Otvor Otvor Otvor Uzorak 1 Prazno Prazno Prazno Uzorak 2 ○ ○ ○ ○ ○ Otvor Otvor Otvor Otvor Otvor Pokrovno stakalce 1 Pokrovno stakalce 2 5.1.6. Stakalca osušite na zraku (ili u sušioniku na 37 °C) te ih fiksirajte provlaĉenjem kroz plamen. Na ovom se koraku postupak moţe prekinuti i nastaviti slijedeći dan. Stakalca se trebaju pohraniti na sobnoj temperaturi u suhom prostoru bez prašine. 5.2. Predhibridizacija i hibridizacija 5.2.1. Pripremite otopinu lizozima koja sadrţi 10 mg lizozima (Sigma L–6876) u 10 ml pufera (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Ta se otopina moţe pohraniti, ali se smije samo jednom odmrznuti i otopiti. Dobro prekrijte svaki uzorak s pribliţno 50 µl otopine lizozima i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim samo jednom umoĉite objektna stakalca u demineraliziranu vodu i paţljivo osušite filter papirom. Alternativno umjesto lizozima dodajte 50 µl 40 do 400 µg ml –1 proteinaze K u puferu (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) na svaki otvor i inkubirajte na 37°C 30 minuta. 5.2.2. Dehidrirajte ćelije uzastopnim jednominutnim uranjanjem u 50%-tni, 80%-tni i 90%-tni etanol. Stakalca postavite na drţaĉ i osušite na zraku. 5.2.3. Pripremite vlaţnu komoru za inkubaciju tako što ćete dno hermetiĉke kutije prekriti upijajućim ili filter papirom namoĉenim u 1x hybmix (Dodatak 7). Kutiju prethodno inkubirajte u hibridizacijskoj pećnici na 55°C najmanje 10 minuta. 5.2.4. Pripremite 45 µl hibridizacijske otopine po stakalcu (Dodatak 7) i prethodno inkubirajte pet minuta na 55°C. 5.2.5. Stavite stakalca na grijaću podlogu na 45°C i nanesite po 10 µl hibridizacione otopine na svaki od ĉetiri otvora. 5.2.6. Stavite dva pokrovna stakalca (24×24 mm) na svako stakalce pazeći pri tom da u otvorima ne ostane zraka. Stavite stakalca u prethodno zagrijanu vlaţnu komoru i hibridizirajte preko noći u pećnici na 55°C. 5.2.7. Pripremite tri posude sa 1 l ultra ĉiste vode, 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml ultra ĉiste vode) i 1 l 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix i 833 ml ultra ĉiste vode). Svaku posudu prethodno inkubirajte u vodenom kupatilu pri 55°C. 5.2.8. Skinite pokrovna stakalca, a predmetna stakalca stavite na drţaĉ. 5.2.9. Višak probe isperite inkubiranjem 15 minuta na 55°C u posudi s 1x hybmixa. 5.2.10. Prenesite drţaĉ stakalaca u otopinu za pranje (1/2 x hybmix) i inkubirajte još 15 minuta. 5.2.11. Stakalca nakratko uronite u ultra ĉistu vodu te ih stavite na filtеr papir. Višak vlage uklonite tako što ćete površinu lagano pokriti filter papirom. U svaki otvor pipetom nanesite 5 do 10 µl zaštitne otopine protiv izbljeĊivanja (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ili ekvivalentna) te cijelo predmetno stakalce pokrijte velikim pokrovnim stakalcem (24 x 60 mm). 5.3. Oĉitavanje FISH testa 5.3.1. Stakalca odmah pregledajte epifluorescentnim mikroskopom uz uljnu imerziju, s povećanjem od 630 ili 1000 x. S filterom prikladnim za fluorescein-izotiocijanat (FITC), eubakterijske ćelije (ukljuĉujući većinu gram negativnih ćelija) u uzorku vide se kao fluorescentno zelene. Upotrebom filtra za tetrametilrodamin-5-izotiocijanat ćelije bakterije C. m. ssp. sepedonicus, obojene s Cy 3, vide se kao fluorescentno crvene. Usporedite morfologiju ćelije s morfologijom pozitivnih kontrola. Ćelije moraju biti jasno flourescentne i u cijelosti obojene. Ako doĊe do odstupanja u obojenosti, FISH test (Dio 9.4) se mora ponoviti. Pregledajte svaki otvor duţ dva meĊusobno vertikalna promjera i duţ vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj ćelija ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja. 5.3.2. Pregledajte da li su u otvorama vidljive jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus (vidi mreţnu stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji nego na soju pozitivne kontrole. Ćelije koje nisu u potpunosti obojene ili su slabe fluorescencije ne smiju se uzeti u obzir. 5.3.3. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se moţe ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne ćelije zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne ćelije pronaĊene (izvan otvora) na površini stakalca. 5.3.4. Postoji nekoliko problema vezanih za specifiĉnosti FISH testa. U koncentriranom ekstraktu isjeĉaka krompira i dijelova stabljika mogu se pojaviti, iako rjeĊe nego kod IF testa, populacije fluorescirajućih ćelija netipiĉe morfologije i saprofitne bakterije koje su po veliĉini i morfologiji sliĉne bakteriji C. m. ssp. sepedonicus. 5.3.5. U obzir uzmite samo fluorescirajuće ćelije tipiĉne veliĉine i morfologije, vidi 5.3.2. 5.3.6. Tumaĉenje rezultata FISH testa: (i) Rezultati FISH testa smatraju se valjanim ako se primjenom FITC filtra opaze zeleno fluorescirajuće ćelije ĉija je veliĉina i morfologija tipiĉna za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus i ako se primjenom filtra za rodamin opaze crveno fluorescirajuće ćelije, i to u svim pozitivnim kontrolama i niti jednoj negativnoj kontroli. Ako se pronaĊu jasno fluorescirajuće ćelije karakteristiĉne morfologije, odredite prosjeĉni broj tipiĉnih ćelija po mikroskopskom vidnom polju i izraĉunajte broj tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Uzorci s najmanje 5 x 10³ tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga smatraju se potencijalno kontaminiranima. Potrebni su dalji testovi. Uzorci s manje od 5 x 10³ tipiĉnih ćelija po ml resuspendiranog taloga smatraju se negativnima. (ii) FISH Test je negativan ako se primjenom filtra za rodamin ne uoĉe snaţno fluorescirajuće crvene ćelije ĉija je veliĉina i morfologija tipiĉna za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus, pod uslovom da se primjenom filtra za rodamin uoĉe tipiĉne snaţno fluorescirajuće crvene ćelije u preparatima pozitivne kontrole. 6. PCR TEST Naĉela Kada se PCR test koristi kao glavni test provjere i rezultat je pozitivan, mora se provesti IF test izolacija kao drugi obavezni test provjere. Kada se PCR test koristi kao drugi test provjere i rezultat je pozitivan, za postavljanje konaĉne dijagnoze potrebno je daljnije testiranje prema dijagramu. Korištenje ove metode kao glavnog testa provjere preporuĉuje se samo ako ste struĉno osposobljeni. Napomena: Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10 4 ćelija bakterije C. m. ssp. sepedonicus po ml, koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u prethodnim testiranjima dali negativni rezultat. Kako bi se postigao najveći stepen osjetljivosti i specifiĉnosti u svim laboratorijama, mogu biti potrebni ogledi za optimizaciju metode. Koristite validirane reagense i protokole za PCR. Poţeljno je odabrati metodu s internom kontrolom. Preduzmite odgovarajuće mjere opreza kako biste izbjegli kontaminaciju uzorka ciljnom DNK. Da bi se sprijeĉila kontaminacija ciljnom DNK, PCR test treba da obavljaju iskusni struĉnjaci, u specijaliziranim laboratorijama za molekularnu biologiju. Negativne kontrole (za ekstrakciju DNK i PCR postupak) treba uvijek obraditi kao zadnje uzorke u postupku kako bi se vidjelo je li došlo do prijenosa DNK. U PCR test treba ukljuĉiti slijedeće negativne kontrole: 1) ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na C. m. ssp. sepedonicus bio negativan, 2) pufer korišten za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka, 3) reakcijsku smjesu za PCR. U PCR test treba ukljuĉiti i slijedeće pozitivne kontrole: 4) alikvote resuspendiranih taloga u koje je dodana bakterija C. m. ssp. sepedonicus (za pripremu vidi Dodatak 2), 5) suspenziju u vodi od 10 6 ćelija po ml C. m. ssp. sepedonicus virulentnog izolata (npr. NCPPB 2140 ili NCPPB 4053), 6) ako je moguće, u PCR testu upotrijebite i DNK ekstrahiranu iz ranijih pozitivnih kontrolnih uzoraka. Da bi se izbjegla moguća kontaminacija, pozitivne kontrole pripremite prostorno odvojeno od uzoraka za testiranje. Ekstrakti uzoraka moraju sadrţavati što je moguće manje tla. Ako namjeravate primjenjivati PCR protokole, u nekim bi sluĉajevima, stoga, bilo preporuĉljivo oprati krtole prije pripreme ekstrakta. 6.1. Metode prečišćavanja DNK Koristite uzorke za pozitivnu i negativnu kontrolu kako je gore opisano. Pripremite kontrolni materijal na jednaki naĉin kao i uzorke. Postoje razliĉite metode za preĉišćavanje ciljne DNK iz kompleksnih uzoraka, kojima se uklanjaju inhibitori PCR reakcije i drugih enzimskih reakcija te se u ekstraktu uzorka koncentrira ciljna DNK. Slijedeća je metoda optimizirana za korištenje s validiranom PCR metodom koja je navedena u Dodatku 6. 6.1.(a) Metoda prema Pastriku (2000) 1) Pipetom odmjerite 220 µl pufera za lizu [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf tubu (u daljem tekstu: tubu) od 1,5 ml. 2) Dodajte 100 µl ekstrakta uzorka i stavite u blok za zagrijavanje ili vodeno kupatilo na 95°C 10 minuta. 3) Stavite tube na led na pet minuta. 4) Dodajte 80 µl osnovne otopine lizozima (50 mg lizozima po ml u 10 mM Tris HCl, pH 8,0) i inkubirajte na 37°C 30 minuta. 5) Dodajte 220 µl Easy DNA® otopine A (Invitrogen), dobro promiješajte na vortex miješalici i inkubirajte na 65°C 30 minuta. 6) Dodajte 100 µl Easy DNA® otopine B (Invitrogen), snaţno miješajte na vortex miješalici sve dok precipitat ne bude slobodno kruţio po tubi i dok uzorak ne bude jednoliko viskozan. 7) Dodajte 500 µl hloroforma te miješajte na vortex miješalici dok se viskoznost ne smanji i smjesa postane homogena. 8) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4°C da se odijele faze i stvori interfaza. 9) Prenesite gornju fazu u novu Eppendorfovu tubu. 10) Dodajte 1 ml 100% etanola (–20°C), kratko promiješajte na vortex miješalici i inkubirajte na ledu 10 minuta. 11) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4°C te uklonite etanol. 12) Dodajte 500 µl 80% etanola (–20°C) i promiješajte okretanjem tube. 13) Centrifugirajte na 15000 g 10 minuta na 4°C, saĉuvajte talog, a etanol uklonite. 14) Ostavite talog da se suši na zraku ili u vakuumskoj centrifugi (DNA speed vac). 15) Resuspendirajte talog u 100 µl sterilne ultra ĉiste vode i ostavite na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta. 16) Ĉuvajte na –20°C sve dok nije potreban za PCR. 17) Centrifugiranjem izdvojite mogući bijeli precipitat te za PCR upotrijebite 5 µl supernatanta koji sadrţi DNK. 6.1.(b) Druge metode Mogu se primijeniti druge metode za ekstrakciju DNK (npr. Qiagen DNeasy Plant Kit) ako su dokazano jednako djelotvorne u preĉišćavanju DNK iz kontrolnih uzoraka koji sadrţe 10³ do 10 4 patogenih ćelija po ml. 6.2. PCR 6.2.1. Pripremite test i kontrolne uzorke za PCR prema validiranim protokolima (Dodatak 6). Pripremite jedno decimalno razrjeĊenje ekstrakta DNK iz uzorka (1:10 u ultra ĉistoj vodi). 6.2.2. U nekontaminiranom prostoru pripremite odgovarajuću reakcijsku smjesu za PCR prema objavljenim protokolima (Dodatak 6). Validirani protokol za multipleks PCR ukljuĉuje unutrašnju kontrolu. 6.2.3. Dodajte 5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske smjese u sterilne tube za PCR. 6.2.4. Ukljuĉite i uzorak za negativnu kontrolu koji sadrţi samo reakcijsku smjesu za PCR te, umjesto uzorka, dodajte isti izvor ultra ĉiste vode koji je korišten za pripremu reakcijske smjese za PCR. 6.2.5. Stavite tube u ureĊaj za PCR (thermal cycler) koji je korišten u preliminarnom testiranju te pokrenite optimizirani PCR program (Dodatak 6). 6.3. Analiza PCR produkata 6.3.1. Elektroforezom u agaroznom gelu razdvojite umnoţene PCR produkte. Najmanje 12 µl reakcijske smjese umnoţene DNK iz svakog uzorka, pomiješane s 3 µl pufera za nanošenje (Dodatak 6), nanesite u 2%-tni (w/v) agarozni gel u tris-acetat EDTA puferu (TAE) (Dodatak 6), uz napon od 5 do 8 V po cm. Upotrijebite odgovarajući DNK duţinski standard, npr. 100 bp. 6.3.2. Obojite elektroforetske pruge DNK u gelu etidijum bromidom (0,5 mg/l) 30 do 45 minuta preduzimajući pri tome odgovarajuće mjere opreza za rad s ovim mutagenom. 6.3.3. Obojeni gel pregledajte na kratkotalasnom UV transiluminatoru (npr. λ = 302 nm) i traţite umnoţene fragmente oĉekivane duţine (Dodatak 6) te ih dokumentirajte. 6.3.4. Za svaki novi nalaz/sluĉaj provjerite autentiĉnost umnoţenog PCR produkta analizom restrikcijskim enzimima preostale umnoţene DNK uzorka i to inkubacijom pri optimalnoj temperaturi i u optimalnom vremenu s odgovarajućim enzimom i puferom (vidi Dodatak 6). Pocijepane fragmente razdvojite elektroforezom u agaroznom gelu kako je gore navedeno te nakon bojenja etidijum bromidom na UV transilumintoru posmatrajte karakteristiĉni restrikcijski obrazac i usporedite ga s pozitivnom kontrolom prije i poslije cijepanja. Tumačenje rezultata PCR testa: PCR test je negativan ako u testiranom uzorku nije vidljiv PCR produkt oĉekivane duţine koji je specifiĉan za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus, ali je vidljiv u svim pozitivnim kontrolnim uzorcima (kod multipleks PCR-a s prajmerama za unutrašnju kontrolu koje su specifiĉne za biljku domaćina: u testiranom se uzorku mora umnoţiti drugi produkt PCR-a oĉekivane veliĉine). PCR test je pozitivan ako je vidljiv PCR produkt koji je specifiĉan za bakteriju C. m. ssp. sepedonicus i koji je oĉekivane duţine i restrikcijskog obrasca, pod uslovom da nije umnoţen u nijednom uzorku negativne kontrole. Pouzdanu potvrdu pozitivnog rezultata moţete dobiti i ponavljanjem testa s drugim parom prajmera (Dio 9.3). Napomena: Moţe se sumnjati da je došlo do inhibicije PCR reakcije ako se iz uzorka pozitivne kontrole koji sadrţi C. m. ssp. sepedonicus u vodi dobije oĉekivani produkt, a iz pozitivnih kontrola s C. m. ssp. sepedonicus u ekstraktu krompira dobiju negativni rezultati. U multipleks PCR protokolima s unutrašnjim kontrolama, inhibicija reakcije je indicirana ako nije dobijen niti jedan od dva produkta. Ako se iz jedne ili više negativnih kontrola dobije oĉekivani produkt, moţe se sumnjati da je došlo do kontaminacije. 7. BIOTEST Napomena: Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10 4 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije C. m. ssp. sepedonicus po ml, a koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijem testiranju bili negativni (za pripremu vidi Dodatak 2). Najveća osjetljivost detekcije moţe se oĉekivati ako se koriste svjeţe pripremljeni ekstrakti uzoraka te optimalni uslovi rasta. MeĊutim, ova se metoda moţe uspješno primijeniti i s ekstraktima koji su bili pohranjeni s glicerolom na temperaturi od –68 do –86°C. Neke sorte patlidţana su odliĉne kao selektivni medijum za rast C. m. ssp. sepedonicus, ĉak i kad nema simptoma, a ujedno su i odliĉne kao domaćini za test potvrde. Uslovi rasta trebaju biti optimalni kako bi se smanjio rizik od laţno negativnih rezultata. Za detalje o uzgoju vidi Dodatak 8. 7.1. Na patlidţane rasporedite sav preostali alikvot resuspendiranog taloga ostavljen za testiranje iz dijela 3.1.6 ili 3.2.5 jednom od metoda koje su navedene niţe u tekstu (7.3 ili 7.4). Koristite samo biljke u stadiju dva do tri prava lista, do potpune razvijenosti trećeg pravog lista. Kako bi se u potpunosti iskoristio resuspendirani talog te osigurala djelotvorna inokulacija, za postupke navedene niţe u tekstu bit će potrebno 15 do 25 biljaka patlidţana po jednom uzorku. 7.2. Nemojte zalijevati patlidţane jedan do dva dana prije inokulacije kako bi se smanjio turgor. 7.3. Inokulacija zarezivanjem 7.3.1. Drţeći biljku meĊu prstima, pipetom nanesite kapljicu (oko 5-10 µl) resuspendiranog taloga na stabljiku izmeĊu kotiledona i prvog lista. 7.3.2. Sterilnim skalpelom napravite dijagonalni rez, dug oko 1 cm i dubok oko 2/3 debljine stabljike, poĉevši od nanešene kapljice resuspendiranog taloga. 7.3.3. Ĉvrsto zatvorite rez sterilnim vazelinom iz štrcaljke. 7.4. Inokulacija injekcijom Inokulirajte stabljike patlidţana neposredno iznad kotiledona injekcijom s potkoţnom iglom (najmanje 23G). Uzorak rasporedite na testne patlidţane. 7.5. Za pozitivnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka suspenzijom u vodi od 10 5 do 10 6 ćelija po ml poznate kulture C. m. ssp. sepedonicus i, kada je moguće, ekstraktom prirodno zaraţenih tkiva krtola (vidi Dio 4) istom metodom inokulacije (7.3 ili 7.4). 7.6. Za negativnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka sterilnim puferom za talog istom metodom inokulacije (7.3 ili 7.4). 7.7. Uzgajajte biljke u karantinskim prostorijama do ĉetiri sedmice na 18 do 24°C, uz dovoljnu koliĉinu svjetla i visoku vlagu (70 do 80%) i primjereno zalijevajte kako bi sprijeĉili nakupljanje vode ili uvenuće zbog nedostatka vode. Ćelije C. m. ssp. sepedonicus ugibaju na temperaturama iznad 30°C, a optimalna temperatura je 21°C. Kako bi izbjegli unakrsnu kontaminaciju, biljke pozitivne i negativne kontrole uzgajajte na jasno odvojenim stolovima u stakleniku ili policama u komori za rast ili, u sluĉaju da je prostor ograniĉen, pobrinite se da su strogo odvojene izmeĊu pojedinih postupaka. Ako se biljke za razliĉite uzorke moraju uzgajati blizu jedna drugoj, razdvojite ih prikladnim zaslonima. Kod prihrane, zalijevanja, pregledavanja i svakog drugog postupka s biljkama dobro pazite da ne doĊe do unakrsne kontaminacije. Od kljuĉne je vaţnosti da u staklenicima i komorama za uzgoj ne bude nikakvih insekata jer oni mogu prenijeti bakteriju s uzorka na uzorak. 7.8. Nakon jedne sedmice redovno provjeravajte pojavu simptoma. Prebrojite biljke koje pokazuju simptome. C. m. ssp. sepedonicus uzrokuje venuće lišća kod patlidţana koje moţe poĉeti kao uvelost rubova ili izmeĊu ţila listova. Uvenulo tkivo moţe u poĉetku izgledati tamnozeleno ili prošarano, ali postaje blijedo prije nego što postane nekrotiĉno. Uvenulost izmeĊu lisnih ţila ĉesto izgleda masno, kao da su natopljeni vodom. Nekrotiĉno tkivo ĉesto ima svjetloţuti rub. Biljke ne ugibaju uvijek; što je period prije nego što se simptomi razviju duţe, to je veća mogućnost preţivljavanja. Biljke mogu prerasti zarazu. Mlade biljke patlidţana mnogo su osjetljivije na niske koncentracije C. m. ssp. sepedonicus nego starije biljke; zbog toga se koriste biljke u ili neposredno prije faze tri prava lista. Uvenuće moţe biti uzrokovano populacijama drugih bakterija ili gljiva koje su prisutne u ekstraktu tkiva krtola. To su: Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora ssp. carotovora i Erwinia carotovora ssp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kao i širok spektar saprofitnih bakterija. Posebno Erwinia chrysanthemi moţe uzrokovati simptome na listovima i venuće koje je vrlo sliĉno simptomima koje prouzrokuje C. m. ssp. sepedonicus. Jedina razlika je crnjenje stabljika u sluĉaju infekcija bakterijom Erwinia chrysanthemi. Druga venuća mogu se razlikovati od onih koje uzrokuje C. m. ssp. sepedonicus zato što cijeli listovi ili cijele biljke vrlo brzo venu. Moţe se pripremiti i bojenje po Gramu: time će se razluĉiti C. m. ssp. sepedonicus od Erwinia spp. 7.9. Ĉim primijetite simptome kod patlidţana, potrebno je ponovo izvršiti izolaciju, koristeći dijelove uvenulog tkiva lišća ili tkiva stabljike (vidi 3.1.3 za maceraciju tkiva). Površinski dezinficirajte lišće i stabljike patlidţana tako da ih obrišete 70%-tnim etanolom. Provedite IF ili PCR test na soku patlidţana i izolirajte na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj podlozi (vidi Dio 8). Moţe se pripremiti i bojenje po Gramu (Dodatak 9). Identificirajte preĉišćene kulture za koje se pretpostavlja da su C. m. ssp. sepedonicus i potvrdite patogenost (vidi Dio 9 i 10). 7.10. U odreĊenim okolnostima, posebno kad uslovi za rast nisu optimalni, moguće je da C. m. ssp. sepedonicus postoji kao latentna infekcija u patlidţanima ĉak i nakon perioda inkubacije do 4 sedmice. Ako se simptomi ne primijete nakon 4 sedmice, provedite IF/PCR test na sastavljenom uzorku dijelova stabljike od 1 cm svake testne biljke, uzetih iznad mjesta inokulacije. Ako je test pozitivan, potrebno je provesti ponovnu izolaciju na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj podlozi, prema postupku iz Dijela 8. Identificirajte preĉišćene kulture za koje se pretpostavlja da su C. m. ssp. sepedonicus i potvrdite patogenost (vidi Dio 9 i 10). Tumačenje rezultata biotesta Rezultati biotesta su prihvatljivi ako biljke pozitivne kontrole pokazuju tipiĉne simptome, ako se iz tih biljaka moţe ponovo izdvojiti bakterija, i ako se na negativnim kontrolama ne pronaĊu nikakvi simptomi. Biotest je negativan ako testne biljke nisu zaraţene bakterijom C. m. ssp. sepedonicus, pod uslovom da je bakterija C. m. ssp. sepedonicus detektirana u pozitivnim kontrolama. Biotest je pozitivan ako su testne biljke zaraţene bakterijom C. m. ssp. sepedonicus. 8. IZOLACIJA C. m. ssp. sepedonicus Napomena: Dijagnoza se moţe potvrditi samo ako se C. m. ssp. sepedonicus izolira i zatim identificira (vidi Dio 9), te ako se potvrdi patogenost (Dio 10). Iako je C. m. ssp. sepedonicus fastidiozna bakterija, moţe se izolirati iz tkiva sa ispoljenim simptomima. MeĊutim, mogu ga prerasti brzo rastuće saprofitne bakterije te su stoga izolacije direktno iz ekstrakta tkiva krtola ili stabljike teške (Dio 3.1.6 ili 3.2.5). Selektivnom hranjivom podlogom i prikladno razrijeĊenom otopinom resuspendiranog taloga iz isjeĉaka ili stabljika krompira moguća je direktna izolacija C. m. ssp. sepedonicus. Izolacije je potrebno izvršiti iz svih krtola ili dijelova stabljike krompira sa simptomima te iz vještaĉki inokuliranih biljaka patlidţana kod kojih nisu primijećeni simptomi ali je IF/PCR test iz sastavljenog uzorka bio pozitivan (vidi Dio 7.10). Maceriranje stabljika patlidţana treba se, prema potrebi, provoditi kao što je navedeno u Dijelu 3.1.3. Za pozitivne kontrole, pripremite decimalna razrijeĊenja suspenzije 10⁶ cfu po ml C. m. ssp. sepedonicus (npr. NCPPB 4053 ili PD 406). Kako bi izbjegli svaku mogućnost kontaminacije, pripremite pozitivne kontrole potpuno odvojeno od uzoraka koji se testiraju. Za svaku svjeţe pripremljenu seriju selektivne hranjive podloge potrebno je provjeriti njenu prikladnost za rast patogena prije nego što se upotrijebi za testiranje rutinskih uzoraka. Testirajte kontrolni materijal na isti naĉin kao i uzorak ili uzorke. 8.1. Uzgoj na selektiranoj hranjivoj podlozi 8.1.1. Iz 100 µl alikvota iz uzorka resuspendiranog taloga krompira ili biljnog soka patlidţana pripremite decimalna razrjeĊenja u puferu za talog (Dodatak 3). 8.1.2. Izolacija iz nerazrijeĊenog resuspendiranog taloga krompira obiĉno ne uspije zbog teškog uzgoja C. m. ssp. sepedonicus i kompeticije saprofita. Obzirom da je bakterija obiĉno prisutna u visokim populacijama u zaraţenom tkivu, saprofiti se obiĉno mogu odstraniti razrjeĊivanjem, dok patogen ostaje. Stoga se preporuĉuje razmazati 100 µl iz svakog uzorka (kod upotrebe Petri kutija promjera 90 mm – prilagodite koliĉinu za Petri kutije drugih veliĉina), 1/100 do 1/10000 razrijeĊene suspenzije na hranjivu podlogu MTNA ili na NCP-88 (Dodatak 5), tehnikom razmaza. Napomena: Alternativna strategija je da razmaţete poĉetni alikvot po 100 µl resuspendiranog taloga krompira na prvu podlogu, a zatim istim štapićem napravite razmaz na drugu podlogu, pri ĉemu na drugu podlogu nanosite ostatke ekstrakta s prve podloge. Na kraju to ponovite s trećom podlogom, ĉime dobijate sliĉan efekt razrjeĊenja. 8.1.3. Inkubirajte podloge u mraku pri 21 do 23°C. 8.1.4. Prva provjera podloga i procjena kolonija sliĉnih C. m. ssp. sepedonicus, u poreĊenju s kontrolnim podlogama, je nakon 3 dana, a daljnje procjene nakon 5, 7, te eventualno 10 dana. 8.2. Prečišćavanje sumnjivih kolonija Napomena: Kolonije sliĉne C. m. ssp. sepedonicus treba precijepiti na hranjivu podlogu YGM ako će se koristiti za inokulaciju patlidţana i/ili daljnju identifikaciju; to se treba uĉiniti prije nego podloge postanu previše zaraštene, odnosno najbolje nakon tri do pet dana. 8.2.1. Razmaţite kolonije sliĉne C. m. ssp. sepedonicus na jednu od slijedećih hranjivih podloga: (sastavi su navedeni u Dodatku 5): − hranjivi agar s dodatkom dekstroze (koristi se samo za precjepljivanje) − agar s dodatkom kvasca, peptona i glukoze, − agar s dodatkom ekstrakta kvasca i mineralnih soli. Inkubirajte na 21°C do 24°C do 10 dana. C. m. ssp. sepedonicus sporo raste, obiĉno stvara kremaste, kupolaste kolonije sa šiljatim vrhom unutar 10 dana. 8.2.2. Ponovno razmaţite kako bi postigli ĉistoću. Stopa rasta se poboljšava presijavanjem. Tipiĉne kolonije su kremasto-bijele ili poput slonovaĉe, ponekad ţute, zaokruţene, glatke, povišene, konveksno-kupolaste, sluzavo-tekuće, s cijelim rubovima i obiĉno 1 do 3 mm u promjeru. Jednostavno bojenje po Gramu (Dodatak 9) moţe pomoći pri odabiru kolonija za daljnje testiranje. 8.2.3. Identificirajte vjerovatne kulture (vidi Dio 9) i provedite test patogenosti (vidi Dio 10). 9. IDENTIFIKACIJA Identificirajte ĉiste kulture izolata za koje se prepostavlja da su C. m. ssp. sepedonicus upotrebom najmanje dva od slijedećih testova koja se zasnivaju na razliĉitim biološkim naĉelima. Ukljuĉite poznate referentne sojeve za svaki test. 9.1. Nutritivni i enzimatski testovi za identifikaciju Odredite slijedeća fenotipska svojstva koja su univerzalno prisutna ili odsutna kod bakterije C. m. ssp. sepedonicus, prema metodama iz Lelliott i Stead (1987), Klement i sar. (1990), Schaad (2001), nepoznati autor (1987). Sve se hranjive podloge trebaju inkubirati na 21°C i pregledati nakon šest dana. Ako ne doĊe do rasta, inkubirajte do 20 dana. U sve testove treba ukljuĉiti poznati kontrolni izolat C. m. ssp. sepedonicus. Nutritivni i fiziološki testovi trebaju se provesti koristeći kulture s hranjivog agara. Morfološka poreĊenja trebaju se napraviti iz kultura na hranjivom agaru s dodatkom dekstroze. Testovi Očekivani rezultati Test oksidacije/fermentacije (O/F) inertan ili slabo oksidativan Aktivnost oksidaze – Rast na 37 °C – Aktivnost ureaze – Hidroliza eskulina + Hidroliza skroba – ili slaba Tolerancija 7% otopine NaCl – Stvaranje indola – Aktivnost katalaze + Stvaranje H2S – Iskorištavanje citrata – Likvefikacija ţelatine – Kiselina iz glicerola – Kiselina iz laktoze – ili slaba Kiselina iz ramnoze – Kiselina iz salicina – Bojenje po Gramu (Dodatak 9) + 9.2. IF test (a) Pripremite suspenziju od pribliţno 10 6 ćelija po ml u IF puferu (Dodatak 3). (b) Pripremite dvostruka razrjeĊenja otopine prikladnog antiseruma. (c) Primijenite IF postupak (Dio 4). (d) IF test je pozitivan ako je IF titar kulture jednak titru pozitivne kontrole. 9.3. PCR test (a) Pripremite suspenziju od pribliţno 10 6 ćelija po ml u ultra ĉistoj vodi. (b) Zagrijte 100 µl ćelijske suspenzije u zatvorenim tubama u bloku za zagrijavanje ili vrelom vodenom kupatilu ĉetiri minute pri 100°C. Prema potrebi, dodavanje svjeţe pripremljenog NaOH do konaĉne koncentracije 0,05M moţe pomoći liziji ćelija. Uzorci se mogu potom, do upotrebe, pohraniti na –16 do –24°C. (c) Upotrijebite prikladne PCR postupke za umnoţavanje specifiĉnih fragmenata C. m. ssp. sepedonicus (npr. Pastrik, 2000; vidi Dodatak 4; Li i de Boer, 1995; Mills i sar., 1997; Pastrik i Rainey, 1999; Schaad i sar., 1999.) (d) IdentifikacijaC. m. ssp. sepedonicusje pozitivna ako su PCR produkti iste veliĉine i imaju istu duţinu restrikcijskih fragmenata polimorfizma kao i pozitivni kontrolni soj. 9.4. Test FISH (a) Pripremite suspenziju od pribliţno 10 6 ćelija po ml u ultra ĉistoj vodi. (b) Primijenite FISH postupak (Dio 5). (c) FISH test je pozitivan ako su postignute iste reakcije iz kulture i pozitivne kontrole. 9.5. Profiliranje masnih kiselina (FAP) (a) Uzgajajte kulturu na triptikaza-sojinom-agaru (Oxoid) 72 sata pri 21°C (+/– 1°C). (b) Primijenite prikladan FAP postupak (Janse, 1991; Stead, 1992). (c) FAP test je pozitivan ako je profil testiranog izolata identiĉan profilu pozitivne kontrole. Prisutnost karakteristiĉnih masnih kiselina: 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 i 17:0 Anteiso, u velikoj mjeri ukazuje na C. m. ssp. sepedonicus. Drugi rodovi kao što su Curtobacterium, Arthrobacter i Micrococcus takoĊer imaju neke od ovih kiselina, ali 15:1 Anteiso A je rijetka kiselina u tim bakterijama, ali se pojavljuje u svim bakterijama iz roda Clavibacter izmeĊu 1 do 5%. Kod C. m. ssp. sepedonicus vrijednost je obiĉno oko 5%. 9.6. BOX-PCR (a) Pripremite suspenziju od pribliţno 10 6 ćelija po ml u ultra ĉistoj vodi. (b) Primijenite test u skladu s postupkom (Smith i sar., 2001). 10. TEST POTVRDE Test patogenosti mora se provesti kao konaĉna potvrda dijagnoze C. m. ssp. sepedonicus i za procjenu virulentnosti kultura identificiranih kao C. m. ssp. sepedonicus: 10.1. Pripremite inokulum od pribliţno 10 6 ćelija po ml iz trodnevnih kultura izolata koji se testira i prikladan izolat pozitivne kontrole C. m. ssp. sepedonicus. 10.2. Inokulirajte stabljike 5 do 10 mladih biljaka patlidţana u fazi 3 prava lista (Dio 7.3 ili 7.4). 10.3. Inkubirajte inokulirane biljke patlidţana pri 18 do 24°C uz dovoljnu koliĉinu svjetla i visoku relativnu vlagu te prikladno zalijevajte kako bi izbjegli nakupljanje vode ili stres od suše (Dio 7.7). Kod ĉistih kultura, tipiĉno bi se venuće trebalo pojaviti u roku od dvije sedmice, ali biljke koje ne pokazuju simptome (vidi Dio 7.8) nakon tog vremena trebaju se inkubirati do tri sedmice na temperaturama koje su povoljne za rast patlidţana, ali ne više od 25°C (Dodatak 8). Ako simptomi nisu prisutni ni nakon tri sedmice, kultura se ne moţe potvrditi kao patogeni oblik C. m. ssp. sepedonicus. 10.4. Izolirajte patogena iz biljaka sa simptomima tako da odstranite dio stabljike 2 cm iznad mjesta inokulacije. Usitnite i suspendirajte u maloj koliĉini sterilne destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 3). Izolirajte bakterije iz suspenzije razmazom na MTNA i YPGA (Dodatak 5), inkubirajte tri do pet dana pri 21 do 23°C i pregledajte jesu li se razvile tipiĉne kolonije bakterije C. m. ssp. sepedonicus. Dodatak 1 Laboratorije koje su uključene u optimizaciju i validaciju protokola Laboratorija 1 Lokacija Drţava Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Beĉ i Linz Austrija Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgija Plantedirektoratet Lyngby Danska Central Science Laboratory York Engleska Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Škotska Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Francuska Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francuska Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Njemaĉka Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Njemaĉka State Laboratory Dublin Irska Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Holandija Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Ås Norveška Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisbon Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovenija Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Španija 1 Za kontakt sa nauĉnicima vidi mreţnu stranicu Dodatak 2 Priprema pozitivnih i negativnih kontrola za osnovne testove provjere, PCR/IF i FISH − Uzgojite ĉistu kulturu virulentnog soja bakterije C. m. ssp. sepedonicus starosti 72 sata (NCPPB 4053 ili PD 406) na MTNA osnovnoj hranjivoj podlozi i suspendirajte u 10 mM fosfatnom puferu da dobijete gustoću ćelija od pribliţno 1 do 2 × 10 8 cfu po ml. To je obiĉno slabo mutna suspenzija optiĉke gustoće od 0,20 pri 600 nm. − Izvadite isjeĉke iz 200 krtola krompira sorte s bijelom korom za koje je poznato da nisu zaraţeni bakterijom C. m. ssp. sepedonicus. − Obradite isjeĉke uobiĉajenom metodom i resuspendirajte talog u 10 ml. − Pripremite 10 sterilnih mikrotuba od 1,5 ml s 900 µl resuspendiranog taloga. − U prvu mikrotubu dodajte 100 µl suspenzije C. m. ssp. sepedonicus. Promiješajte na vortex miješalici. − U slijedećih pet mikrotuba pripremite decimalna razrjeĊenja. − Ovih šest mikrotuba s kontaminiranim ekstraktom koristite za pozitivnu kontrolu. Ĉetiri mikrotube s nekontaminiranim ekstraktom koristite za negativnu kontrolu. U skladu s tim, oznaĉite mikrotube. − Pripremite alikvote od 100 µl u mikrotubama od 1,5 ml tako da dobijete devet kopija svakog kontrolnog uzorka. Do upotrebe ih pohranite na –16 do –24°C. − Prisutnost i koliĉinu C. m. ssp. sepedonicus u kontrolnim uzorcima potvrdite najprije IF testom. − Za PCR test, obavite ekstrakciju DNK na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje. − Za IF i FISH testove, obavite testove na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje. − Kod IF, FISH i PCR testova, bakterija C. m. ssp. sepedonicus se mora detektirati u najmanje 10⁶ i 10⁴ ćelija/ml pozitivnih kontrola i niti u jednoj negativnoj kontroli. Dodatak 3 Puferi za postupke testiranja Napomena: Neotvoreni sterilizirani puferi mogu se ĉuvati do jedne godine. 1. Puferi za postupak ekstrakcije 1.1. Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0) Ovaj se pufer koristi za ekstrakciju bakterije iz biljnih tkiva homogenizacijom ili tresenjem. − Na2HPO4 (bezvodni) 4,26 g − KH2PO4 2,72 g − Destilirana voda 1 l Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. Mogu biti korisni i slijedeći dodatni sastojci: Namjena Koliĉina (po l) Pahuljice Lubrol Deflokulant* 0,5 g DC silikon protiv pjenjenja sredstvo protiv pjenjenja * 1,0 ml Tetranatrijev pirofosfat Antioksidans 1,0 g Polivinilpirolidon 40000 (PVP-40) Vezanje PCR inhibitora 50 g *Za upotrebu kod metode ekstrakcije homogenizacijom 1.2. Pufer za talog (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2) Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeĊivanje ekstrakta isjeĉaka krtola krompira, nakon koncentriranja u talog centrifugiranjem. − Na2HPO4x12H2O 2,7 g − NaH2PO4x2H2O 0,4 g − Destilirana voda 1 l Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. 2. Puferi za IF test 2.1. IF pufer (10 mM fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2) Ovaj se pufer koristi za razrjeĊivanje antitijela. − Na2HPO4x12H2O 2,7 g − NaH2PO4x.2H2O 0,4 g − NaCl 8,0 g − Destilirana voda 1.0 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. 2.2. IF pufer – Tween Ovaj se pufer koristi za ispiranje stakalca. IF puferu dodajte 0,1% Tween 20. 2.3. Glicerol s fosfatnim puferom, pH 7,6 Ovaj se pufer koristi kao tekućina za prekrivanje otvora u IF testu kako bi se pojaĉala fluorescencija. − Na2HPO4x12H2O 3,2 g − NaH2PO4x2H2O 0,15 g − Glicerol 50 ml − Destilirana voda 100 ml Pokrivne otopine protiv izblijeĊivanja dostupne su na trţištu, npr. Vectashield® (Vector Laboratories) ili Citifluor® (Leica). Dodatak 4 OdreĎivanje stepena kontaminacije u IF i FISH testovima 1. Odredite srednji broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po vidnom polju (c) 2. Izraĉunajte broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po otvoru mikroskopskog stakalca (C) C = c × S/s gdje je S = površina otvora stakalca sa više otvora, i s = površina polja objektiva. s = πi2/4G2K2 gdje je i = koeficijent polja (varira od 8 do 24 ovisno o tipu okulara) K = koeficijent tubusa (1 ili 1,25) G = povećanje objektiva (100x, 40x itd.). 3. Izraĉunajte broj tipiĉnih fluorescentnih ćelija po ml resuspendiranog taloga (N) N = C × 1000/y × F gdje je y = volumen resuspendiranog taloga na svakom oknu, i F = faktor razrjeĊenja resuspendiranog taloga. Dodatak 5 Hranjive podloge za izolaciju i uzgoj C. m. ssp. sepedonicus (a) Opće hranjive podloge Hranjivi agar (NA) − Hranjivi agar (Difco) 23,0 g − Destilirana voda 1,0 L − Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. Hranjivi agar s dekstrozom (NDA) − Difco bacto hranjivi agar koji sadrţi 1% D(+) glukoze (monohidrata). Sterilizirajte u autoklavu pri 115°C 20 minuta. Agar s kvascem, peptonom i glukozom (YPGA) − Ekstrakt kvasca (Difco) 5,0 g − Bacto pepton (Difco) 5,0 g − D(+) glukoza (monohidrat) 10,0 g − Agar Bacto (Difco) 15,0 g − Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. Agar s ekstraktom kvasca i mineralnim solima (YGM) − Bacto ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g − D(+) glukoza (monohidrat) 2,5 g − K2HPO4 0,25 g − KH2HPO4 0,25 g − MgSO4x7H2O 0,1 g − MnSO4xH2O 0,015 g − NaCl 0,05 g − FeSO4.7H2O 0,005 g − Bacto agar (Difco) 18 g − Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke i sterilirajte 0,5 litara volumena hranjive podloge u autoklavu pri 121°C 15 minuta. (b) Validirane selektivne hranjive podloge MTNA Osim ako nije drugaĉije navedeno, svi sastojci su iz BDH. − Ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g − Manitol 2,5 g − K2HPO4 0,25 g − KH2PO4 0,25 g − NaCl 0,05 g − MgSO4x7H2O 0,1 g − MnSO4xH2O 0,015 g − FeSO4x7H2O 0,005 g − Agar (Oxoid br. 1) 16,0 g − Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (pri 121°C 15 minuta) i hlaĊenja na 50°C, dodajte antibiotike: trimetoprim 0,06 g, nalidiksiĉnu kiselinu 0,002 g, amfotericin B 0,01 g. Osnovne otopine antibiotika: trimetoprim (Sigma) i nalidiksiĉna kiselina (Sigma) (oboje na 5 mg/ml), u 96%-tnom metanolu, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) u dimetilsulfoksidu. Osnovne otopine su sterilirane filtriranjem. Napomena: Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se ĉuva u hladnjaku. NCP-88 − Hranjivi agar (Difco) 23 g − Ekstrakt kvasca (Difco) 2 g − D-manitol 5 g − K2HPO4 2 g − KH2PO4 0,5 g − MgSO4.7H2O 0,25 g − Destilirana voda 1,0 L Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (na 121°C 15 minuta) i hlaĊenja na 50°C, dodajte slijedeće antibiotike: Polimiksin B sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidiksiĉnu kiselinu (Sigma) 0,008 g, Cikloheksimid (Sigma) 0,2 g. Pripremite osnovne otopine antibiotika: nalidiksiĉna kiselina u 0,01 M NaOH, cikloheksimid u 50% etanolu, polimiksin B sulfat u destiliranoj vodi. Osnovne otopine su sterilirane filtriranjem. Napomena: Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se ĉuva u hladnjaku. Dodatak 6 Validirani protokoli i reagensi za PCR Napomena: Preliminarna testiranja trebaju omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10 4 ćelija bakterije C. m. ssp. sepedonicus po ml ekstrakta uzorka. Preliminarna testiranja ne smiju dati laţno pozitivne rezultate kod odreĊenih odabranih bakterijskih sojeva. 1. Protokol za multipleks PCR s unutarnjom PCR kontrolom (Pastrik, 2000) 1.1. Oligonukleotidni prajmeri − Uzvodni prajmer PSA-1 5´- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3´ − Nizvodni prajmer PSA-R 5´- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3´ − Uzvodni prajmer NS-7-F 5´- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3´ − Nizvodni prajmer NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ Oĉekivana duţina umnoţenog produkta ciljane DNK C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (par prajmera PSA). Oĉekivana duţina umnoţenog produkta iz 18S rRNA unutrašnje kontrole = 377 bp (par prajmera NS). 1.2. Reakcijska smjesa za PCR Reagens Koliĉina po reakciji Konaĉna koncentracija Sterilna ultra ĉista voda 15,725 µl 10x PCR pufer 1 (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % Smjesa d-NTP (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Prajmera PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Prajmera PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Prajmera NS-7-F (10 µM) 2 0,1 µl 0,04 µM Prajmera NS-8-R (10 µM) 2 0,1 µl 0,04 µM Taq polimeraza (5 U/µl) 1 0,2 µl 1,0 U Volumen uzorka 5,0 µl Ukupni volumen 25,0 µl 1 Metoda je bila validirana Taq polimerazom iz Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL. 2 Koncentracija prajmera NS-7 F i NS-8-R je bila optimizirana za ekstrakciju jezgre pupka krompira metodom homogenizacije i preĉišćavanja DNK prema Pastriku (2000) (vidi dio 6.1.a i 6.2). Ponovna optimizacija koncentracija reagensa bit će potrebna ako se upotrijebi ekstrakcija tresenjem ili druga metoda izolacije DNK. 1.3. Uslovi PCR reakcije Izvedite slijedeći program: − 1 ciklus: (i) 3 minute pri 95°C (denaturacija ciljane DNK) − 10 ciklusa: (ii) 1 minutu pri 95°C (denaturacija ciljane DNK) − (iii) 1 minuta pri 64°C (sparivanje prajmera i ciljane DNK) − (iv) 1 minuta pri 72°C (produţivanje kopije) − 25 ciklusa: (v) 30 sekundi pri 95°C (denaturacija ciljane DNK) − (vi) 30 sekundi pri 62°C (sparivanje prajmera i ciljane) − (vii) 1 minuta pri 72°C (produţivanje kopije) − 1 ciklus: (viii) 5 minuta pri 72°C (konaĉno produţivanje) − (ix) drţati pri 4°C. Napomena: Ovaj je program optimiziran za upotrebu s ureĊajem za PCR MJ Research PTC 200. Kod upotrebe s drugim modelima vjerovatno će biti potrebno prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) (iv), (v), (vi) i (vii). 1.4. Analiza produkta umnoţavanja restrikcijskim enzimom PCR produkti umnoţeni iz DNK bakterije C. m. ssp. sepedonicus daju karakteristiĉni obrazac duţine restrikcijskih fragmenata polimorfizma s enzimom Bgl II nakon inkubacije pri 37°C 30 minuta. Restrikcijski fragmenti dobijeni iz specifiĉnoga fragmenta C. m. ssp. sepedonicus su veliĉine 282 bp i 220 bp. 2. Priprema pufera za nanošenje 2.1. Bromfenol plavilo (10%-tna osnovna otopina) − Bromfenol plavilo 5 g − Destilirana voda (bidestilirana) 50 ml 2.2. Pufer za nanošenje − Glicerol (86%) 3,5 ml − Bromfenol plavilo (5.1) 300 µl − Destilirana voda (bidestilirana) 6,2 ml − 10x Tris acetatni EDTA pufer (TAE), pH 8,0 − Tris pufer 48,4 g − Ledena sirćetna kiselina 11,42 ml − EDTA (dinatrijeva so) 3,72 g − Destilirana voda 1,00 L Razrijedite do 1× prije upotrebe. Dostupan je i na trţištu (npr. Invitrogen ili jednakovrijedan). Dodatak 7 Validirani reagensi za FISH test 1. Oligo-probe Specifiĉna proba za Cms CMS-CY3-01: 5´- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3´ Nespecifiĉna eubakterijska proba EUB-338-FITC: 5´- gct gcc tcc cgt agg agt -3´ 2. Otopina za fiksiranje (UPOZORENJE! OTOPINA ZA FIKSIRANJE SADRŢI PARAFORMALDEHID KOJI JE TOKSIĈAN. NOSITE RUKAVICE I NE UDIŠITE GA. PREPORUĈUJE SE RADITI U DIGESTORU.) (i) Zagrijte 9 ml vode za molekularnu biologiju (npr. ultra ĉiste vode) na oko 60 °C i dodajte 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se otapa nakon što dodate 5 kapi 1N NaOH i promiješate na magnetskoj miješalici. (ii) Podesite pH na 7,0 dodajući 1 ml 0,1M fosfatnog pufera (PB; pH 7,0) i 5 kapi 1N HCl. Indikatorskim papirom provjerite vrijednost pH i ako je potrebno podesite je pomoću HCl ili NaOH. (UPOZORENJE! U OTOPINAMA S PARAFORMALDEHIDOM NE UPOTREBLJAVAJTE pH METAR) (iii) Profiltrirajte otopinu kroz membranski filter od 0,22 µm te je do daljnje upotrebe pohranite na 4°C i zaštitite od prašine. (iv) Napomena: Alternativna otopina za fiksiranje: 96%-tni etanol. 3. 3x Hybmix − NaCl 2,7 M − Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) − EDTA (sterilizirana filtriranjem i u autoklavu) 15 mM Razrijedite do 1x prema potrebi. 4. Otopina za hibridizaciju − 1x Hybmix − Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 % − Proba EUB 338 5 ng/μl − Proba CMSCY301 5 ng/μl Pripremite koliĉine otopine za hibridizaciju prema izraĉunima u tab. 1. Za svako stakalce (s 2 razliĉita uzorka u duplikatu) treba 90 μl otopine za hibridizaciju. Tab. 1: Predloţene koliĉine za pripremanje smjese za hibridizaciju 2 stakalca 8 stakalca Sterilna ultra ĉista voda 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Proba EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Proba CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Ukupni volumen (μl) 90,0 360,0 Napomena: Pohranite sve otopine koje sadrţe oligo-probe osjetljive na svjetlost u mraku pri –20°C. Zaštitite od direktne sunĉeve svjetlosti ili elektriĉne rasvjete tokom upotrebe. 5. 0,1M fosfatni pufer, pH 7,0 − Na2HPO4 8,52 g − KH2PO4 5,44 g − Destilirana voda 1,00 L Otopite sastojke, provjerite pH i sterilirajte u autoklavu pri 121°C 15 minuta. Dodatak 8 Uzgoj patlidžana Posijte sjeme patlidţana (Solanum melongena) u pasteriziranom kompostu za sjeme. Presadite sadnice s potpuno razvijenim kotiledonima (10 do 14 dana) u pasteriziran kompost za lonĉanice. Patlidţani se trebaju uzgajati u stakleniku pod slijedećim uslovima: − Duţina dana: 14 sati ili prirodna duţina dana, ako je duţa; − Temperatura: – dan: 21 do 24°C, – noć: 15°C. − Osjetljive sorte patlidţana: – »Black Beauty«, – »Long Tom«, – »Rima«, – »Balsas« Dodatak 9 Postupak bojenja po Gramu (Huckerova modifikacija) (Doetsch, 1981) Rastvor kristal violeta – Otopite 2 g kristal violeta u 20 ml 95%-tnog etanola. – Otopite 0,8 g amonij-oksalata u 80 ml destilirane vode. Pomiješajte dvije otopine. Rastvor Lugola Jod 1 g Kalij-jodid 2 g Destilirana voda 300 ml Usitnite zajedno koristeći tuĉak i avan. Dodajte vodi i promućkajte da se otopi u zatvorenoj posudi. Rastvor safranina za protubojenje Osnovna otopina: Safranin O 2,5 g 95%-tni etanol 100 ml Promiješajte i pohranite. Razrijedite: 1:10 da bi dobili radnu otopinu. Postupak bojenja 1. Pripremite razmaze, posušite na zraku i fiksirajte zagrijavanjem. 2. Prelijte stakalce rastvorom kristal violeta jednu minutu. 3. Kratko isperite tekućom vodom. 4. Prelijte rastvorom Lugola jednu minutu. 5. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom. 6. Uklonite boju 95%-tnim etanolom, koji se dodaje kap po kap, dok se sva boja ne ukloni ili uronite razmaz na 30 sekundi i lagano tresite. 7. Isperite tekućom vodom i posušite filter-papirom. 8. Prelijte rastvorom safranina 10 sekundi. 9. Isperite tekućom vodom i posušite filter-papirom. Gram pozitivne bakterije se oboje ljubiĉasto-plavo; Gram negativne bakterije se oboje ruţiĉasto-crveno. LITERATURA 1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11288 EN, 21 str. 2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218. 3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152. 4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23. 5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26. 6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. 7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, str. 1-10. 8. Jansing, H. and K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601. 9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703. 10. Klement Z.; Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 str. 11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118. 12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic Pseudomonads. J. appl. Bact., 29, 470-489. 13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101 106. 14. Li, X. and S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842. 15. Mills, D., Russell, B., W. and J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853-861. 16. Pastrik, K.-H. and R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687-693. 17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165. 18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 str. 19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095–1100. 20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. — 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 str. 21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore. 22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748. 23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481 527. 24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. 25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. and A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546– 4554.